ES2663594T3 - Expresión de proteínas de mamífero en Pseudomonas fluorescens - Google Patents

Abstract

Un método para producir una proteína recombinante de mamífero en una célula huésped de Pseudomonas fluorescens que comprende: transformar una célula huésped con un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante de mamífero; cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión de la proteína recombinante de mamífero, en el que la proteína recombinante de mamífero está presente en la célula huésped en una forma soluble o insoluble; y en el que la proteína recombinante de mamífero está operativamente unida a una secuencia de codificación líder de secreción periplásmica que dirige la proteína al periplasma; y en el que la proteína se expresa a un mayor nivel cuando se compara con un nivel de expresión de la proteína en condiciones sustancialmente comparables en un sistema de expresión de E. coli.

Description

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Descripción detallada de la invención

Proceso para producir proteínas recombinantes de mamífero

La invención proporciona procesos y organismos Pseudomonas fluorescens transformados que producen proteínas recombinantes de mamífero.

En una realización, la invención proporciona un proceso para producir proteínas recombinantes de mamífero produciendo las proteínas en un organismo P. fluorescens y aislando la proteína producida. La proteína puede aislarse después de la expresión mediante técnicas conocidas en el arte, que incluyen, entre otras, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, afinidad de anticuerpos, exclusión por tamaño o cualquier otro método que elimine una porción sustancial de los restos celulares de la proteína. En una subrealización, el proceso proporciona una proteína sustancialmente purificada. La proteína aislada puede tener una actividad similar a la de la proteína nativa de la que se deriva. La proteína puede aislarse en un estado o conformación correctamente plegada, aproximándose a la de la proteína nativa, o puede renaturalizarse o modificarse adicionalmente para ponerla en una conformación plegada correctamente. En una subrealización, la proteína se deriva de una proteína humana, o se humaniza. Una proteína "humanizada" es típicamente una proteína quimérica de tipo mamífero que está parcialmente compuesta por una secuencia de proteína derivada de humanos. La humanización es particularmente útil en la producción de anticuerpos y el desarrollo de anticuerpos humanizados se ha descrito ampliamente, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 6.800.738.

En una realización, la expresión de la proteína por la célula huésped es seguida por el aislamiento de la proteína. En otra realización, la proteína del péptido se purifica. En una realización alternativa, la proteína se purifica después del aislamiento de la proteína. Opcionalmente, la proteína aislada o purificada puede renaturalizarse o replegarse para producir proteínas activas.

El primer aspecto de la invención proporciona un proceso para producir una proteína de mamífero en un organismo P. fluorescens en el que la proteína se produce a un nivel o concentración más alta que en un organismo E. coli. La idoneidad de los organismos P. fluorescens para la producción de alto nivel de proteínas de mamífero fue inesperada con base a la falta de éxito en la producción de tales proteínas en estos organismos en la técnica anterior. Los presentes inventores han descubierto que estos organismos son de hecho capaces de altos niveles de producción de proteínas de mamífero, y típicamente expresan proteínas con mayor rendimiento o en niveles más altos que E. coli cuando se prueban en los ensayos correspondientes. En otra realización, la invención proporciona un proceso para producir proteínas de mamífero en un organismo P. fluorescens en un cultivo por lotes que produce mayores cantidades de proteína por litro que un lote correspondiente de organismos E. coli recombinantes.

En algunas realizaciones, se proporcionan procesos que incluyen la producción de proteínas recombinantes de múltiples subunidades de mamífero, incluidos humanos, en forma activa en P. fluorescens; la producción de proteínas recombinantes transportadoras de sangre de mamífero, incluyendo proteínas transportadoras de sangre humana tales como transferrina y albúmina en P. fluorescens; la producción de enzimas de mamífero recombinantes, que incluyen enzimas de mamífero recombinantes en forma activa en P. fluorescens; la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, que incluyen anticuerpos de una sola cadena y fragmentos Fab en P. fluorescens, y la producción de factores de transcripción recombinantes de mamífero, incluidos humanos, en P. fluorescens.

En una realización, la proteína recombinante de mamífero se produce como un multímero, o en un precursor concatemérico, por ejemplo, en forma de al menos dos unidades pequeñas de péptido (1-15 aminoácidos) en tándem. En una realización alternativa, la proteína recombinante de mamífero no se produce como un multímero, o en precursores concateméricos, sino que se produce como un polipéptido de una sola cadena.

Cribado de biomoléculas

Como se describe en el presente documento, los organismos P. fluorescens se pueden usar en un proceso de cribado de bibliotecas de biomoléculas de mamífero para identificar al menos una que exhiba una actividad o propiedad deseada. Las células de P. fluorescens pueden transformarse con varios ácidos nucleicos derivados de mamífero para los que se desea realizar pruebas, produciendo una biblioteca de células huésped transformadas. Tras la expresión, se producen los polipéptidos codificados por al menos algunos de los ácidos nucleicos para analizar ya sea en el citoplasma o después de la recuperación de la célula. Los ejemplos de actividades y propiedades para las que se pueden realizar pruebas incluyen: nivel de expresión del polipéptido; estabilidad del polipéptido; y actividades y propiedades biocatalíticas. Ejemplos ilustrativos de actividades y propiedades biocatalíticas incluyen: actividad enzimática; interacciones/unión a proteínas; estabilización de proteínas; uso de sustrato; formación de productos; condiciones de reacción, tales como pH, salinidad o temperatura de reacción; parámetros biocatalíticos para una reacción catalizada dada, tales como Km y Vmáx; y el comportamiento de estabilidad, tal como la termoestabilidad y la vida media de los biocatalizadores. Los resultados de la prueba obtenidos se pueden usar para un miembro o miembros seleccionados de la biblioteca para un mayor desarrollo.

Expresión de la proteína

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Un aspecto clave de esta invención es la expresión de altos niveles de proteínas recombinantes de mamífero, por ejemplo, de humano, en un intervalo de entre 1 y 75 por ciento de proteína celular total (% de pct) por expresión en organismos P. fluorescens. Las proteínas expresadas son solubles o insolubles mientras están en la célula d P. fluorescens. Dichos niveles elevados de proteínas recombinantes solubles o insolubles de mamífero pueden ser una mejora con respecto a los sistemas de expresión de proteínas de mamífero conocidos previamente. En particular, altos niveles de proteínas de mamífero recuperadas en reacciones de fermentación a gran escala típicamente no son posibles con técnicas conocidas.

El método del primer aspecto de la invención permite niveles de expresión de proteínas de mamífero que superan los encontrados en sistemas de expresión de E. coli. En una realización, la concentración de proteína recombinante en cada célula es mayor que la encontrada en E. coli en ensayos comparativos. En una realización, el nivel de proteína recombinante en comparación con la proteína celular total medida en el sistema de expresión de P. fluorescens es más alto que el de la misma proteína recombinante expresada en E. coli. En otra realización, el nivel o cantidad de proteína soluble en el sistema de expresión de P. fluorescens descrito aquí es más alto que el nivel o la cantidad de proteína recombinante soluble en un sistema de expresión comparable de E. coli. En otra realización, la cantidad total de proteína activa es mayor que la cantidad derivada de un sistema de expresión de E. coli. En una realización separada, el nivel de proteína activa recombinante en comparación con la proteína celular total medida en el sistema de expresión de P. fluorescens es más alto que el de la misma proteína recombinante expresada en E. coli. En una realización, el nivel, concentración o cantidad de proteína expresada en P. fluorescens es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o más, el nivel, concentración o cantidad de proteína recombinante expresada en E. coli en ensayos comparables.

Uno de los beneficios de P. fluorescens como un sistema de expresión es que las células se pueden cultivar en cultivos a gran escala sin afectar negativamente su capacidad para la producción de proteínas. Esta capacidad excede la que se encuentra en otros sistemas bacterianos, tales como E. coli. En otra realización, el proceso incluye producir proteínas de mamífero en cultivos por lotes en los que la proteína recombinante se produce a un nivel total más alto en P. fluorescens que en cultivos por lotes de E. coli. En otra realización más, la invención proporciona un proceso de producción de proteínas de mamífero en un organismo P. fluorescens en un cultivo por lotes que produce mayores cantidades de proteína por litro que un lote correspondiente de organismos E. coli recombinantes.

La invención generalmente proporciona procesos y organismos P. fluorescens transformados que proporcionan niveles de expresión de 1-75% de proteína celular total (pct) de proteínas recombinantes de mamífero solubles o insolubles. Las proteínas recombinantes de mamífero expresadas en la célula se pueden expresar en una forma activa. En otras realizaciones, el P. fluorescens proporciona al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70 o 75% de pct de proteínas recombinantes de mamífero.

Estas proteínas pueden ser solubles, y cuando son solubles, pueden estar presentes en el citoplasma o periplasma de la célula durante la producción. Las proteínas solubles se liberan fácilmente de la célula mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, ruptura de la membrana celular por presión (es decir, el método de prensa "francés"), o por degradación mediante lisozima de la membrana celular. Las células típicamente también pueden lisarse usando detergentes, tales como detergentes no iónicos. Las proteínas que son solubles se pueden estabilizar aún más ajustando los componentes del regulador, tales como el pH del regulador, las concentraciones de sal o los componentes de proteínas adicionales (por ejemplo, en complejos de múltiples subunidades). Las proteínas solubles se pueden aislar

o purificar a partir de otras proteínas y restos celulares mediante, por ejemplo, centrifugación y/o cromatografía tales como de exclusión por tamaño, intercambio aniónico o catiónico, o cromatografía de afinidad.

Las proteínas también pueden ser insolubles. Las proteínas insolubles se encuentran típicamente en los cuerpos de inclusión en el citoplasma, pero también a menudo en el periplasma. No todas las proteínas insolubles están en cuerpos de inclusión, y también se pueden encontrar en agregados de membrana, como pequeños agregados de proteínas o en cualquier otra forma insoluble en el citoplasma o periplasma. Las proteínas insolubles se pueden renaturalizar típicamente usando, por ejemplo, agentes reductores tales como urea o clorhidrato de guanidina. Las proteínas insolubles o agregados proteicos se pueden aislar, por ejemplo, mediante centrifugación y/o cromatografía tal como cromatografía de exclusión por tamaño. Las proteínas en agregados insolubles pueden separarse típicamente por solubilización de los agregados usando, por ejemplo, micelas o micelas inversas como se divulga en Vinogradov, et al. (2003) Anal Biochem. 15; 320 (2): 234-8.

En una realización particular, la célula huésped de Pseudomonas puede tener un nivel de expresión de péptido, polipéptido, proteína o fragmento de los mismos recombinante de mamífero de al menos 1% de pct y una densidad celular de al menos 40 g/L, cuando se cultiva (es decir, dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 4ºC hasta aproximadamente 55ºC, inclusive) en un medio de sales minerales. En una realización particular, el sistema de expresión tendrá una proteína recombinante de péptido, incluyendo proteína recombinante de mamífero, nivel de expresión de al menos 5% de pct y una densidad celular de al menos 40 g/L, cuando crezca (es decir, dentro de un intervalo de temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 55ºC, inclusive) en un medio de sales minerales a una escala de fermentación de al menos 10 litros.

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Los niveles de expresión se pueden medir mediante técnicas estándar conocidas en el arte. En una realización, la cantidad de proteína (en gramos) se compara con la cantidad en gramos de proteína celular total en una muestra dada. En otra realización, la medición es un nivel de proteína recombinante por litro. En otra realización, el nivel o cantidad puede medirse en comparación con un estándar conocido, tal como un control de BSA. El nivel o cantidad de proteína recombinante se puede medir, por ejemplo, analizando la absorción de luz de una proteína purificada, midiendo la afinidad de un marcador para la proteína (tal como la afinidad de un anticuerpo) y comparándola con un estándar conocido, o midiendo el nivel de actividad en comparación con un estándar conocido (tal como una cantidad conocida de proteína activa purificada).

Se ha encontrado que, en ciertas situaciones, no se requieren condiciones o agentes promotores de enlaces disulfuro adicionales para recuperar polipéptidos objetivo que contienen enlaces disulfuro en forma soluble activa, cuando se usa una bacteria Pseudomonas fluorescens como célula huésped de expresión. Por lo tanto, en una realización, el péptido, polipéptido, proteína o fragmento transgénico contiene al menos un enlace disulfuro intramolecular en su estado nativo. En otras realizaciones, la proteína puede contener hasta 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 o más enlaces disulfuro en su estado nativo.

En algunas realizaciones, la proteína se expresa o se encuentra en el periplasma de la célula durante la producción antes de la purificación o el aislamiento. La proteína se secreta en el periplasma fusionándose a una secuencia de secreción de señal apropiada. En una realización, la secuencia señal es una secuencia señal que es nativa del genoma de P. fluorescens. En realizaciones específicas, la secuencia señal es una proteína de unión a fosfato, un péptido señal de secreción de proteína de unión a Lys-Arg-Orn (LAObp o KRObp), un péptido señal de secreción de Porina E (OpreE) de la membrana externa, un péptido señal de secreción de azurina, un péptido señal de secreción de proteína de unión al hierro (III) (Fe(III)pb), o un péptido señal de secreción de lipoproteína B (LprB).

En una realización, el péptido, polipéptido, proteína recombinante o fragmento de los mismos tiene una conformación intramolecular plegada en su estado activo. P. fluorescens típicamente produce proteínas de mamífero más eficientemente en la conformación correctamente plegada. En una realización, más del 50% del péptido, polipéptido, proteína o fragmento de los mismos transgénico expresado producido puede producirse como péptidos, polipéptidos, proteínas individuales o fragmentos de los mismos en forma soluble activa o insoluble, pero renaturalizable en el citoplasma o periplasma. En otra realización, aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la proteína expresada se obtiene o se puede renaturalizar en forma activa.

Definiciones

A lo largo de esta memoria descriptiva, el término "proteína" se usa para incluir cualquier concatámero o polímero de aminoácidos. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente e incluyen polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como también polímeros de aminoácidos de origen natural.

El término "aislado" se refiere a ácido nucleico, proteína o péptido que está sustancialmente o esencialmente libre de otros componentes materiales que normalmente lo acompañan tal como se encuentran en su estado nativo cuando están en una célula, por ejemplo, en otros componentes celulares.

El término "purificado" o "sustancialmente purificado" se usa para indicar que la proteína se separa de otros componentes celulares y se separa de otras proteínas y péptidos encontrados en la célula que no están en un complejo nativo con la proteína. En realizaciones particulares, las proteínas purificadas tienen una pureza aprobada para uso terapéutico o veterinario según se define mediante las directrices estándar de cGMP o aprobadas por la FDA.

El término "porcentaje de proteína celular total" ("pct") significa la cantidad de proteína en la célula huésped como un porcentaje de proteína celular agregada. Alternativamente, el término significa una medida de la fracción de proteína celular total que representa la cantidad relativa de una proteína dada expresada por la célula.

El término "unido operativamente" se refiere a cualquier configuración en la que los elementos reguladores transcripcionales y de traducción están unidos covalentemente a la secuencia codificante en tal o tales disposición o disposiciones, con respecto a la secuencia codificante, que en y por acción de la célula huésped, los elementos reguladores pueden dirigir la expresión de la secuencia de codificación.

Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" pretende incluir o designar a cualquier animal en la clase Mammalia que incluye mamíferos humanos o no humanos, tales como, pero sin limitación, porcinos, ovinos, bovinos, roedores, ungulados, cerdos, marranos, ovejas, corderos, cabras, ganado, ciervos, mulas, caballos, monos, simios, perros, gatos, ratas y ratones.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína recombinante de mamífero" o péptido incluye proteínas derivadas de una secuencia de proteína de mamífero nativa o derivadas o generadas a partir de una secuencia de ácido nucleico nativa de mamífero. Dichas proteínas recombinantes pueden producirse a partir de una secuencia de ácido nucleico que se corresponde sustancialmente con el ARNm nativo de mamífero o ADNc sustancialmente

correspondiente, o fragmentos de los mismos. La secuencia puede ajustarse en consecuencia con base en el uso de codones de células huésped específicas tal como se conoce en la técnica.

La frase "sustancialmente correspondiente" en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos se refiere a los

5 residuos en las dos secuencias que tienen al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de identidad cuando se alinean para correspondencia máxima sobre un dominio de la proteína, medida usando un algoritmo conocido en la técnica. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante algoritmos conocidos en la técnica (por ejemplo, Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman & Wunsch (1970)

J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.

10 215: 403-410 (BLAST)), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspección. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para información de biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

15 El término "fragmento" significa una porción o secuencia parcial de una secuencia de un nucleótido, proteína o péptido.

Como se usa en el presente documento, el término "soluble" significa que la proteína no se precipita por centrifugación a una gravedad entre aproximadamente 5.000x y 20.000x cuando se centrifuga durante 10-30 minutos en un regulador bajo condiciones fisiológicas. Las proteínas solubles no son parte de un cuerpo de inclusión u otra masa precipitada.

20 Como se usa en el presente documento, el término "insoluble" significa que la proteína puede precipitarse por centrifugación a una gravedad de entre 5.000x y 20.000x cuando se centrifuga durante 10-30 minutos en un regulador en condiciones fisiológicas. Las proteínas insolubles pueden ser parte de un cuerpo de inclusión u otra masa precipitada.

25 El término "cuerpo de inclusión" pretende incluir cualquier cuerpo intracelular contenido dentro de una célula en el que se haya secuestrado un agregado de proteínas.

Como se usa en el presente documento, el término "homólogo" significa o bien i) una proteína que tiene una secuencia

30 de aminoácidos que al menos es 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 98% similar a la secuencia de una proteína original dada y que conserva una función deseada de la proteína original o ii) un ácido nucleico que tiene una secuencia que es al menos 70, 75, 80, 5, 90, 95 o 98% similar a la secuencia de un ácido nucleico dado y que conserva una función deseada de la secuencia de ácido nucleico original. En todas las realizaciones de esta invención y divulgación, cualquier proteína, péptido o ácido nucleico divulgado puede ser sustituido con una proteína, péptido o ácido nucleico homólogo o

35 sustancialmente homólogo que retiene una función deseada. En todas las realizaciones de esta invención y divulgación, cuando se divulga cualquier ácido nucleico, se debe suponer que la invención también incluye todos los ácidos nucleicos que se hibridan con el ácido nucleico divulgado.

En una realización no limitante, la secuencia de aminoácidos no idéntica del polipéptido homólogo puede ser

40 aminoácidos que son miembros de cualquiera de los 15 grupos conservadores o semiconservadores que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Grupos similares de sustitución de aminoácidos

Grupos conservadores (8)

Grupos semiconservadores (7)

Arg, Lys

Arg, Lys, His

Asp, Glu

Asn, Asp, Glu, Gln

Asn, Gln

Ile, Leu, Val

Ile, Leu, Val, Met, Phe

Ala, Gly

Ala, Gly, Pro, Ser, Thr

Ser, Thr

Ser, Thr, Tyr

Phe, Tyr

Phe, Trp, Tyr

Cys (no cistina), Ser

Cys (no cistina), Ser, Thr

45 Tipos de proteínas de mamífero producidas

En general, la proteína recombinante de mamífero puede ser cualquier proteína de mamífero de la que se conoce una secuencia de aminoácidos o cualquier proteína putativa de mamífero o derivada de mamífero para la que se deduce una secuencia de aminoácidos. Las proteínas se pueden seleccionar del grupo que consiste en una proteína de

50 múltiples subunidades, una proteína transportadora de sangre, una enzima, un anticuerpo de longitud completa, un fragmento de anticuerpo o un factor de transcripción.

La secuencia de aminoácidos de la proteína puede alterarse para ajustarse a las cualidades deseadas, tales como para asegurar ciertos tipos de interacciones. La secuencia puede, por ejemplo, ajustarse para reducir la inmunorreactividad, 55 o para aumentar la absorción, reducir la excreción o bien, mejorar la biodisponibilidad en un organismo tal como un

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globulina humana, globulina bovina, globulina de conejo, globulina de rata, globulina de ratón, globulina de oveja, globulina de mono, globulinas de unión a esteroides y globulina fusionada a un polipéptido terapéuticamente activo.

En una realización adicional, se proporciona la producción de una insulina en P. fluorescens, que comprende

5 transformar una célula huésped de P. fluorescens con un vector de expresión que contiene ácido nucleico y elementos reguladores para la expresión de la insulina, cultivando la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de la insulina y opcionalmente aislando la proteína. En una realización adicional, la insulina puede aislarse y purificarse después de la producción de insulina por la célula huésped. La insulina expresada se selecciona del grupo que consiste en insulina humana, insulina bovina, insulina de ratón, insulina de rata, insulina porcina, insulina de mono e insulina

10 fusionada a un polipéptido terapéuticamente activo. El número de acceso para los genes de insulina humana es J00265, y para el gen de insulina humana sintética, el número de acceso es J02547.

El ADN de longitud completa para la producción de proteínas sanguíneas recombinantes o ADN truncado que codifica el lóbulo del terminal amino o del terminal carboxilo de proteínas sanguíneas o una porción del mismo puede obtenerse a

15 partir de fuentes disponibles o puede sintetizarse de acuerdo con las secuencias conocidas mediante procedimientos estándar.

Tabla 2. Secuencias de proteínas sanguíneas expresadas por el sistema de la presente divulgación.

Secuencia de aminoácidos de albúmina de suero humano

SEQ. ID. No: 1 (Lawn, et al. (1981) Nuc. Ac. Rsch. 9(22):6103-6114)

Secuencia de aminoácido de transferrina

SEQ. ID. No: 2 (Strausberg (2002) PNAS, 99:16899-16903)

Secuencia de ADNc de insulina humana

SEQ. ID. No: 3

20 Producción de enzimas

En una realización de la presente invención, se proporciona la producción de enzimas o cofactores recombinantes de mamífero por una célula huésped de la especie Pseudomonas fluorescens. En otra realización, se proporciona una célula huésped de la especie de Pseudomonas que se ha transformado para expresar una enzima o cofactor

25 recombinante de mamífero.

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plásmido que una secuencia de codificación de la cadena ligera. En una realización alternativa, las secuencias de cadena pesada y ligera se encuentran en una secuencia policistrónica dentro de un único plásmido, o codificadas en el genoma del huésped.

5 En otra realización, se proporciona un proceso para producir un anticuerpo funcional o fragmento del mismo en una célula huésped transformada con dos unidades de traducción separadas que codifican respectivamente las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En una realización, el proceso incluye: a) cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para que la cadena ligera y la cadena pesada se expresen de forma secuencial, separando así temporalmente la producción de las cadenas ligera y pesada; y b) permitir el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada

10 para formar el anticuerpo funcional o fragmento del mismo.

En una realización adicional, el sistema de expresión de Pseudomonas fluorescens puede expresar fragmentos Fab terapéuticos humanos de una sola cadena, o anticuerpos de cadena completa o porciones de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, F(ab')2-cremallera de leucina, Fv, dsFv, anticuerpo anti-CD18, anticuerpos

15 quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o los descritos en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3 -Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos.

Anticuerpo

Antígeno objetivo Tipo de producto Isotipo Indicación

5G1.1

Complemento (C5) Humanizado IgG Artritis reumatoide

5G1.1

Complemento (C5) Humanizado IgG SLE

5G1.1

Complemento (C5) Humanizado IgG Nefritis

5G1.1-SC

Complemento (C5) Humanizado ScFv Derivación cardiopulmonar

5G1.1-SC

Complemento (C5) Humanizado ScFv Infarto de miocardio

5G1.1-SC

Complemento (C5) Humanizado ScFv Angioplastia

ABX-CBL

CBL Humano imagen9 GvHD

ABX-CBL

CD147 Murino IgG Rechazo de aloinjerto

ABX-IL8

IL-8 Humano IgG2 Psoriasis

AD-159

gp120 Humanizado imagen10 HIV

AD-439

gp120 Humanizado imagen11 HIV

Antegren

VLA-4 Humanizado IgG Esclerosis múltiple

Anti-CD 11a

CD11a Humanizado IgG1 Psoriasis

Anti-CD 18

CD18 Humanizado Fab'2 Infarto de miocardio

Anti-LFAl

CD18 Murino Fab'2 Rechazo de aloinjerto

Anti-VEGF

VEGF Humanizado IgG1 Cancer (general)

Antova

CD40L Humanizado IgG Rechazo de aloinjerto

Antova

CD40L Humanizado IgG SLE

BEC2

anti-Id Murino IgG Pulmón

BIRR-1

ICAM-1 Murino IgG2a Accidente cerebrovascular

BTI-322

CD2 Rata IgG GvHD

C225

EGFR Quimérico IgG Cabeza + Cuello

CAT-152

TGF-beta 2 Humano imagen12 Cirugía de glaucoma

Anticuerpo

Antígeno objetivo Tipo de producto Isotipo Indicación

CDP571

TNF-alfa Humanizado IgG4 Enfermedad de Crohn

CDP571

TNF-alfa Humanizado IgG4 Artritis reumatoide

CDP850

E-selectina Humanizado imagen13 Psoriasis

Corsevin M

Factor VII Quimérico imagen14 Anticoagulante

D2E7

TNF-alfa Humano imagen15 Artritis reumatoide

Herceptina

Her2/neu Humanizado IgG1 Cáncer de mama metastásico

HNK20

F gp Murino IgA RSV

Hu23F2G

CD11/18 Humanizado imagen16 Esclerosis múltiple

Hu23F2G

CD11/18 Humanizado IgG Accidente cerebrovascular

IC14

CD14 --- imagen17 Choque tóxico

ICM3

ICAM-3 Humanizado imagen18 Psoriasis

IDEC-114

CD80 Primatizado imagen19 Psoriasis

IDEC-131

CD40L Humanizado imagen20 SLE

IDEC-131

CD40L Humanizado imagen21 Esclerosis múltiple

IDEC-151

CD4 Primatizado IgG1 Artritis reumatoide

IDEC-152

CD23 Primatizado imagen22 Asma/Alergia

Infliximab

TNF-alfa Quimérico IgG1 Artritis reumatoide

Infliximab

TNF-alfa Quimérico IgG1 Enfermedad de Crohn

LDP-01

beta2-integrina Humanizado IgG Accidente cerebrovascular

LDP-01

beta2-integrina Humanizado IgG Rechazo de aloinjerto

LDP-02

alfa4beta7 Humanizado imagen23 Colitis ulcerosa

LDP-03/Campath1H

CD52 Humanizado IgG1 CLL

Lym-1

HLA DR Quimérico imagen24 NHL

LympoCide

CD22 Humanizado imagen25 NHL

MAK-195F

TNF alfa Murino Fab'2 Choque tóxico

MDX-33

CD64 (FcR) Humano imagen26 Trastornos hematológicos autoinmunes

MDX-CD4

CD4 Humano IgG Artritis reumatoide

MEDI-500

TCR alfa beta Murino IgM GvHD

MEDI-507

CD2 Humanizado imagen27 Psoriasis

MEDI-507

CD2 Humanizado imagen28 GvHD

OKT4A

CD4 Humanizado IgG Rechazo de aloinjerto

OrthoClone OKT4A

CD4 Humanizado IgG Enfermedad autoinmune

OrthoClone/anti-CD3 OKT3

CD3 Murino mIgG2 a Rechazo de aloinjerto

Ostavir

Hep B Humano imagen29 Hep B

OvaRex

CA 125 Murino imagen30 Ovario

Panorex 17-1A

EpCAM Murino IgG2a Colorrectal

Anticuerpo

Antígeno objetivo Tipo de producto Isotipo Indicación

PRO542

gp120 Humanizado imagen31 HIV

Protovir

CMV Humanizado IgG1 CMV

RepPro/Abc iximab

gpIIbIIIa Quimérico Fab Complicaciones de angioplastia coronaria

rhuMab-E25

IgE Humanizado IgG1 Asma/Alergia

Rituxan

CD20 Quimérico IgG1 NHL

SB-240563

IL5 Humanizado imagen32 Asma/Alergia

SB-240683

IL-4 Humanizado imagen33 Asma/Alergia

SCH55700

IL-5 Humanizado imagen34 Asma/Alergia

Simulect

CD25 Quimérico IgG1 Rechazo de aloinjerto

SMART a-CD3

CD3 Humanizado imagen35 Enfermedad autoinmune

SMART a-CD3

CD3 Humanizado imagen36 Rechazo de aloinjerto

SMART a-CD3

CD3 Humanizado IgG Psoriasis

SMART M195

CD33 Humanizado IgG AML

SMART 1D10

HLA ---- imagen37 NHL

Synagis

F gp Humanizado IgG1 RSV (Pediátrico)

Vitaxin

VNRintegrina Humanizado imagen38 Sarcoma

Zenapax

CD25 Humanizado IgG1 Rechazo de aloinjerto

Producción de factores transcripcionales

En una realización de la presente invención, se proporciona la producción de factores de transcripción recombinantes

5 de mamífero por una célula huésped de la especie Pseudomonas fluorescens. En una realización, después de la expresión de la proteína, puede aislarse la proteína. En otra realización, puede purificarse la proteína. Opcionalmente, la proteína puede renaturalizarse para producir una proteína activa. En otra realización, se proporciona una célula huésped de la especie Pseudomonas fluorescens que se ha transformado para expresar un factor de transcripción recombinante de mamífero.

10 Los factores de transcripción adecuados para la inserción en los sistemas de expresión de la presente invención incluyen los de la familia de hélice-giro-hélice y los miembros de la familia Pac, así como otras familias de factores de transcripción conocidas en la técnica. Los miembros de estas familias, adecuados para uso con la presente invención, incluyen mamíferos y homólogos de mamíferos y análogos de: reguladores transcripcionales; factores de transcripción

15 de la familia ASNC tales como ASNC_trans_reg, reguladores transcripcionales putativos; proteínas reguladoras bacterianas de la familia luxR; factores de transcripción de hélice-giro-hélice reguladores bacterianos; proteínas reguladoras bacterianas de la familia arsR; factores de transcripción del dominio hélice-giro-hélice, especialmente la familia rpiR; factores de transcripción de proteínas reguladoras bacterianas, factores de transcripción hélice-giro-hélice reguladores bacterianos; factores de transcripción de dominio de unión a ADN; familia MarR de factores de

20 transcripción; la familia ROK de factores de transcripción; la familia MerR de proteínas reguladoras; factores de transcripción del represor de arginina; factores transcripcionales de firmicute; factores de transcripción reguladores de absorción férrica; factores de transcripción sigma; factores de transcripción del receptor regulador de respuesta; factores de transcripción de la proteína atenuante de unión al ARN de triptófano; factores de transcripción putativos de dominio de unión a azúcar; factores de transcripción del dominio PRD; factores de transcripción de la proteína reguladora del

25 nitrógeno; reguladores negativos de la competencia genética, tales como MecA; factores de transcripción del regulador transcripcional negativo; factores de transcripción del regulador transcripcional bacteriano; factores de transcripción sensibles a glicerol-3-fosfato; factores de transcripción represores dependientes de hierro; y numerosos factores de transcripción reguladores transcripcionales específicos de la especie.

30 Los factores de transcripción expresados por la especie de Pseudomonas fluorescens se pueden utilizar para aplicaciones de diagnóstico, terapéuticas y de investigación.

Preparación del vector

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correspondiente también será parte de un sistema de expresión de acuerdo con la presente invención. Los ejemplos de proteínas reguladoras del promotor incluyen: proteínas activadoras, por ejemplo, proteína activadora del catabolito de E. coli, proteína MalT; activadores transcripcionales de la familia AraC; proteínas represoras, por ejemplo, proteínas LacI de E. coli; y proteínas reguladoras de doble función, por ejemplo, proteína NagC de E. coli. En la técnica se conocen muchos pares de proteína regulados del promotor/promotor-regulador-proteína.

Las proteínas reguladoras del promotor interactúan con un compuesto efector, es decir, un compuesto que se asocia reversible o irreversiblemente con la proteína reguladora para permitir que la proteína se libere o se una al menos a una región reguladora de la transcripción del ADN del gen que está bajo el control del promotor, permitiendo o bloqueando de ese modo la acción de una enzima transcriptasa para iniciar la transcripción del gen. Los compuestos efectores se clasifican como inductores o correpresores, y estos compuestos incluyen compuestos efectores nativos y compuestos inductores gratuitos. En la técnica se conocen muchos tríos regulados de promotor/promotor-proteína reguladora/compuesto efector. Aunque puede usarse un compuesto efector en todo el cultivo o fermentación celular, en una realización en la que se usa un promotor regulado, después del crecimiento de una cantidad o densidad deseada de biomasa de la célula huésped, se agrega un compuesto efector apropiado al cultivo para que directamente o indirectamente de como resultado la expresión del gen o los genes objetivo deseados.

A modo de ejemplo, cuando se utiliza un promotor de la familia lac, el gen lacI también puede estar presente en el sistema. El gen lacI, que es (normalmente) un gen expresado constitutivamente, codifica la proteína represora Lac (proteína LacI) que se une al operador lac de estos promotores. Por lo tanto, cuando se utiliza un promotor de la familia lac, el gen lαcl también se puede incluir y expresar en el sistema de expresión. En el caso de los miembros de la familia del promotor lac, por ejemplo, el promotor tac, el compuesto efector es un inductor, tal como un inductor gratuito como IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, también denominado "isopropiltiogalactósido").

Otros elementos

Se pueden incluir otros elementos reguladores en una construcción de expresión. Tales elementos incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, secuencias potenciadoras de la transcripción, secuencias potenciadoras de la traducción, otros promotores, activadores, señales de inicio y parada de la traducción, terminadores de la transcripción, reguladores cistrónicos, reguladores policistrónicos, secuencias marcadoras, tales como las "etiquetas" de secuencia de nucleótidos y secuencias codificantes de péptidos "etiqueta", lo que facilita la identificación, separación, purificación o aislamiento de un polipéptido expresado.

Como mínimo, un gen que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención puede incluir, además de la secuencia codificante de la proteína de mamífero, los siguientes elementos reguladores ligados operativamente a los mismos: un promotor, un sitio de unión a ribosoma (RBS), un terminador de transcripción, inicio de traducción y señales de parada. Se pueden obtener RBS útiles de cualquiera de las especies útiles como células huésped en sistemas de expresión, tales como las de la célula huésped seleccionada. Se conocen muchos RBS específicos y una variedad de RBS consenso, por ejemplo, los descritos y referenciados por D. Frishman et al. (1999) Gene 234 (2): 257 -65; y B.E. Suzek et al. (2001) Bioinformatics 17 (12): 1123-30. Además, pueden usarse RBS nativos o sintéticos, por ejemplo, los descritos en: el documento EP 0207459 (RBS sintéticos); O. Ikehata et al. (1989) Eur. J. Biochem. 181 (3): 563-70 (secuencia de RBS nativa de AAGGAAG). Otros ejemplos de métodos, vectores y elementos de traducción y transcripción, y otros elementos útiles en la presente invención se divulgan, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.055.294 y 5.128.130 de Gilroy et al.; 5.281.532 de RammLer et al.; 4.695.455 y 4.861.595 de Barnes et al.; 4.755.465 de Gray et al.; y 5.169.760 de Wilcox.

Vectores

La transcripción del ADN que codifica las enzimas de la presente invención mediante Pseudomonas aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector o plásmido. Los potenciadores típicos son elementos de ADN que actúan en cis, habitualmente de aproximadamente 10 a 300 pb de tamaño que actúan sobre el promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen diversos potenciadores de Pseudomonas, tal como se divulga en otra parte del presente documento.

Generalmente, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped de Pseudomonas, por ejemplo, los genes de resistencia libres de antibiótico de P. fluorescens y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural secuencia abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican las enzimas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción, y, en una realización, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la enzima traducida. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una enzima de fusión que incluye un péptido de identificación en el terminal N que imparte características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Vectores de expresión útiles para usar con P. fluorescens en la expresión de enzimas se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de la

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traducción adecuadas en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si se desea, proporcionar la amplificación dentro del huésped.

Los vectores son conocidos en la técnica como útiles para expresar proteínas recombinantes en células huésped, y cualquiera de estos puede usarse para expresar los genes de acuerdo con la presente invención. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos y vectores de expresión en fagos. Los ejemplos de vectores plasmídicos útiles incluyen, pero sin limitación, los plásmidos de expresión pBBR1MCS, pDSK519, pKT240, pML122, pPS10, RK2, RK6, pRO1600 y RSF1010. Otros ejemplos de tales vectores útiles incluyen los descritos por, por ejemplo, N. Hayase (1994) Appl. Envir. Microbiol. 60(9): 3336-42; A.A. Lushnikov et al. (1985) Basic Life Sci. 30: 657-62; S. Graupner & W. Wackernagel (2000) Biomolec. Eng. 17(1): 11-16; H.P. Schweizer (2001) Curr. Opin. Biotech. 12(5): 439-45; M. Bagdasarian & K.N. Timmis (1982) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96: 47-67; T. Ishii et al., (1994) FEMS Microbiol. Lett. 116(3): 307-13; I.N. Olekhnovich & Y.K. Fomichev (1994) Gene 140(1): 63-65; M. Tsuda & T. Nakazawa (1993) Gene 136(1-2): 257-62; C. Nieto et al. (1990) Gene 87(1): 145-49; J.D. Jones & N. Gutterson (1987) Gene 61(3): 299306; M. Bagdasarian et al., (1981) Gene 16(1-3): 237-47; H.P. Schweizer et al., (2001) Genet. Eng. (NY) 23: 69-81; P. Mukhopadhyay et al., (1990) J. Bact. 172(1): 477-80; D.O. Wood et al., (1981) J. Bact. 145(3): 1448-51; y R. Holtwick et al., (2001) Microbiology 147(Pt 2): 337-44.

Otros ejemplos de vectores de expresión que pueden ser útiles en células huésped de Pseudomonas incluyen los enumerados en la Tabla 5 como derivados de los replicones indicados.

Tabla 5. Algunos ejemplos de vectores de expresión útiles

Replicón

Vectores

pPS10

pCN39, pCN51

RSF1010

pKT261-3

pMMB66EH

pEB8

pPLGN1

pMYC1050

RK2/RP1

pRK415

pJB653

pRO1600

pUCP

pBSP

El plásmido de expresión, RSF1010, es descrito, por ejemplo, por F. Heffron et al. (1975) Proc. Nat'L Acad. Sci. USA 72 (9): 3623 -27, y por K. Nagahari y K. Sakaguchi (1978) J. Bact. 133 (3): 1527-29. El plásmido RSF1010 y sus derivados son vectores particularmente útiles en la presente invención. Ejemplos de derivados útiles de RSF1010, que son conocidos en la técnica, incluyen, por ejemplo, PKT212, pKT214, pKT231 y plásmidos relacionados, y pMYC1050 y plásmidos relacionados (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos 5.527.883 y 5.840.554 de Thompson et al.), tales como, por ejemplo, pMYC1803. El plásmido pMYC1803 se deriva del plásmido pTJS260 basado en RSF1010 (véase la patente de Estados Unidos No. 5.169.760 de Wilcox), que porta un marcador regulado de resistencia a tetraciclina y los loci de replicación y movilización del plásmido RSF1010. Otros ejemplos de vectores útiles incluyen los descritos en la patente de los Estados Unidos No. 4.680.264 de Puhler et al.

En una realización, se usa un plásmido de expresión como el vector de expresión. En otra realización, RSF1010 o un derivado del mismo se usa como el vector de expresión. En aún otra realización, se usa pMYC1050 o un derivado del mismo, o pMYC1803 o un derivado del mismo, como el vector de expresión.

El plásmido se puede mantener en la célula huésped mediante el uso de un gen marcador de selección, también presente en el plásmido. Este puede ser un gen o genes de resistencia a antibióticos, en cuyo caso se añadirán el o los antibióticos correspondientes al medio de fermentación, o cualquier otro tipo de gen marcador de selección conocido como útil en la técnica, por ejemplo, un gen restaurador de prototrofia en cuyo caso el plásmido se usará en una célula huésped que es auxotrófica para el rasgo correspondiente, por ejemplo, un rasgo biocatalítico tal como una biosíntesis de aminoácidos o un rasgo de biosíntesis de nucleótidos o un rasgo de utilización de fuente de carbono.

La amplia información de secuencia requerida para la genética molecular y las técnicas de ingeniería genética está ampliamente disponible públicamente. El acceso a secuencias completas de nucleótidos de mamífero, así como de secuencias de ADNc de genes humanos, secuencias de aminoácidos y genomas se puede obtener del GenBank en la

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acidovorans y Comamonas testosteroni, respectivamente; y Pseudomonas nigrifaciens (ATCC 19375) y Pseudomonas piscicida (ATCC 15057) han sido reclasificados, respectivamente, como Pseudoalteromonas nigrifaciens y Pseudoalteromonas piscicida. El "Subgrupo 1 de Proteobacterias Gram negativas" también incluye Proteobacterias clasificadas como pertenecientes a cualquiera de las familias: Pseudomonadaceae, Azotobacteraceae (ahora a menudo llamada por el sinónimo, el "grupo Azotobacter" de Pseudomonadaceae), Rhizobiaceae y Methylomonadaceae (ahora a menudo llamado por el sinónimo, "Methylococcaceae"). En consecuencia, además de los otros géneros descritos en la presente memoria, otros géneros Proteobacterianos que caen dentro del "Subgrupo 1 de Proteobacterias Gram negativas" incluyen: 1) bacterias del grupo Azotobacter del género Azorhizophilus; 2) bacterias de la familia Pseudomonadaceae de los géneros Cellvibrio, Oligella y Teredinibacter; 3) bacterias de la familia Rhizobiaceae de los géneros Chelatobacter, Ensifer, Liberibacter (también llamado "Candidatus Liberibacter") y Sinorhizobium; y 4) bacterias de la familia Methylococcaceae de los géneros Metilobacter, Methylocaldum, Methylomicrobium, Methylosarcina y Methylosphaera.

También se divulga aquí una célula huésped seleccionada del "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram negativas". El "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram negativas" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros (con el número total de cepas depositadas catalogadas en catálogo, públicamente disponibles, indicadas entre paréntesis, todas depositadas en ATCC, excepto que se indique lo contrario): Acidomonas (2); Acetobacter (93); Gluconobacter (37); Brevundimonas (23); Beijerinckia (13); Derxia (2); Brucella (4); Agrobacterium (79); Chelatobacter

(2) Ensifer (3); Rhizobium (144); Sinorhizobium (24); Blastomonas (1); Sphingomonas (27) Alcaligenes ( 88); Bordetella (43); Burkholderia (73); Ralstonia (33); Acidovorax (20) Hydrogenophaga (9); Zoogloea (9); Methylobacter (2); Methylocaldum (1 en NCIMB); Methylococcus (2); Methylomicrobium (2); Methylomonas (9); Metylosarcina (1) Methylosphaera; Azomonas (9); Azorhizophilus (5); Azotobacter (64); Cellvibrio (3); Oligella (5); Pseudomonas (1139); Francisella (4); Xanthomonas (229); Stenotrophomonas (50); y Oceanimonas (4).

Los ejemplos de especies de células huésped del "Subgrupo 2 de Proteobacterias Gram negativas" incluyen, pero no se limitan a, las siguientes bacterias (con la ATCC u otros números de depósito de ejemplos de cepas de las mismas mostradas entre paréntesis): Acidomonas methanolica (ATCC 43581); Acetobacter aceti (ATCC 15973); Gluconobacter oxydans (ATCC 19357); Brevundimonas diminuta (ATCC 11568); Beijerinckia indica (ATCC 9039 y ATCC 19361); Derxia gummosa (ATCC 15994); Brucella melitensis (ATCC 23456), Brucella abortus (ATCC 23448); Agrobacterium tumefaciens (ATCC 23308), Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358), Agrobacterium rhizogenes (ATCC 11325); Chelatobacter heintzii (ATCC 29600); Ensifer adhaerens (ATCC 33212); Rhizobium leguminosarum (ATCC 10004); Sinorhizobium fredii ( ATCC 35423); Blastomonas natatoria (ATCC 35951); Sphingomonas paucimobilis (ATCC 29837); Alcaligenes faecalis (ATCC 8750); Bordetella pertussis (ATCC 9797); Burkholderia cepacia (ATCC 25416); Ralstonia pickettii (ATCC 27511); Acidovorax facilis (ATCC 11228); Hydrogenophaga flava (ATC C 33667); Zoogloea ramigera (ATCC 19544); Methylobacter luteus (ATCC 49878); Methylocaldum grecile (NCIMB 11912); Methylococcus capsulatus (ATCC 19069); Methylomicrobium agile (ATCC 35068); Methylomonas methanica (ATCC 35067); Methylosarcina fibrata (ATCC 700909); Methylosphaera hansonii (ACAM 549); Azomonas agilis (ATCC 7494); Azorhizophilus paspali (ATCC 23833); Azotobacter chroococcum (ATCC 9043); Cellvibrio mixtus (UQM 2601); Oligella urethralis (ATCC 17960); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145); ), Pseudomonas fluorescens (ATCC 35858), Francisella tularensis (ATCC 6223), Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637), Xanthomonas campestris (ATCC 33913); y Oceanomanas doudoroffii (ATCC 27123).

También se divulga aquí una célula huésped seleccionada del "Subgrupo 3 de Proteobacterias Gram negativas". El "Subgrupo 3 de Proteobacterias Gram negativas" se define como el grupo de las Proteobacterias de los siguientes géneros: Brevundimonas; Agrobacterium; Rhizobium; Sinorhizobium; Blastomonas; Sphingomonas; Alcaligenes; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Metilomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas y Oceanimonas.

También se divulga aquí una célula huésped seleccionada del "Subgrupo 4 de Proteobacterias Gram negativas". El "Subgrupo 4 de Proteobacterias Gram negativas" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros:

Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Metilomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas.

También se divulga aquí, una célula huésped seleccionada del "Subgrupo 5 de Proteobacterias Gram negativas". El "Subgrupo 5 de Proteobacterias Gram negativas" se define como el grupo de las Proteobacterias de los siguientes géneros: Methylobacter; Methylocaldum; Methylococcus; Metilomicrobium; Methylomonas; Methylosarcina; Methylosphaera; Azomonas; Azorhizophilus; Azotobacter; Cellvibrio; Oligella; Pseudomonas; Teredinibacter; Francisella; Stenotrophomonas; Xanthomonas; y Oceanimonas.

La célula huésped se puede seleccionar del "Subgrupo 6 de Proteobacterias Gram negativas". El "Subgrupo 6 de Proteobacterias Gram negativas" se define como el grupo de Proteobacterias de los siguientes géneros:

Brevundimonas; Blastomonas; Sphingomonas; Burkholderia; Ralstonia; Acidovorax; Hydrogenophaga; Azomonas;

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una célula que no se divide y/o no se amplía se mantiene metabólicamente, siendo este último el uso de sinónimos con el término "mantenimiento".

Densidad celular

Una ventaja adicional al usar P. fluorescens en la expresión de proteínas recombinantes de mamífero incluye la capacidad de P. fluorescens para ser cultivada con alta densidad celular en comparación con E. coli u otros sistemas de expresión bacteriana. Para este fin, los sistemas de expresión de P. fluorescens de acuerdo con la presente invención pueden proporcionar una densidad celular de aproximadamente 20 g/L o más. Los sistemas de expresión de P. fluorescens de acuerdo con la presente invención también pueden proporcionar una densidad celular de al menos aproximadamente 70 g/L, tal como se establece en términos de biomasa por volumen, midiéndose la biomasa como peso de células secas.

En una realización, la densidad celular será de al menos 20 g/L. En otra realización, la densidad celular será de al menos 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L, 40 g/L, 45 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 100 g/L, 110 g/L, 120 g/L, 130 g/L, 140 g/L, o al menos 150 g/L.

En otras realizaciones, la densidad celular en la inducción estará entre 20 g/L y 150 g/L; 20 g/L y 120 g/L; 20 g/L y 80 g/L; 25 g/L y 80 g/L; 30 g/L y 80 g/L; 35 g/L y 80 g/L; 40 g/L y 80 g/L; 45 g/L y 80 g/L; 50 g/L y 80 g/L; 50 g/L y 75 g/L; 50 g/L y 70 g/L; 40 g/L y 80 g/L.

Aislamiento y purificación

Las proteínas de esta invención se pueden aislar purificadas hasta una pureza sustancial mediante técnicas estándar bien conocidas en la técnica, que incluyen, entre otras, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio catiónico o aniónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía de níquel, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de fase inversa, cromatografía de lectina, electroforesis preparativa, solubilización con detergente, precipitación selectiva con sustancias tales como cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación, y otros. Por ejemplo, las proteínas que tienen propiedades de adhesión molecular establecidas pueden fusionarse reversiblemente con un ligando. Con el ligando apropiado, la proteína puede adsorberse selectivamente en una columna de purificación y luego liberarse de la columna en una forma relativamente pura. La proteína fusionada se remueve luego por actividad enzimática. Además, puede purificarse la proteína utilizando columnas de inmunoafinidad o columnas de Ni-NTA. Las técnicas generales se divulgan adicionalmente, por ejemplo, en R. Scopes (1982) Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: N.Y.; Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Academic Press; la patente de Estados Unidos No. 4,511,503; S. Roe (2001) Protein Purification Techniques: A Practical Approach, Oxford Press; D. Bollag, et al. (1996) Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc.; AK Patra et al. (2000) Protein Expr Purif, 18(2): 182-92; y R. Mukhija, et al. (1995) Gene 165(2): 303-6. Véase también, por ejemplo, Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification," Methods in Enzymology vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, et al. (1996 y los suplementos periódicos) Current Protocols in Protein Science, Wiley/Greene, NY; y la literatura del fabricante sobre el uso de productos de purificación de proteína, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, Calif. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión a segmentos apropiados, por ejemplo, a una secuencia FLAG o un equivalente que puede fusionarse a través de una secuencia extraíble con proteasa. Véase también, por ejemplo: Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, NY; y Crowe, et al. (1992) QIAexpress: el sistema de purificación de proteínas y expresión de alto nivel QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Calif.

La detección de la proteína expresada se logra por métodos conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayos, técnicas de transferencia Western o inmunoprecipitación.

La enzima producida y expresada en forma recombinante puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante numerosos procedimientos, por ejemplo, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación final, según sea necesario.

Ciertas proteínas expresadas en esta invención pueden formar agregados insolubles ("cuerpos de inclusión"). Varios protocolos son adecuados para la purificación de proteínas de cuerpos de inclusión. Por ejemplo, la purificación de cuerpos de inclusión implica típicamente la extracción, separación y/o purificación de cuerpos de inclusión mediante la ruptura de las células huésped, por ejemplo, mediante incubación en un regulador de TRIS/HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, DTT 1 mM, ATP 0,1 mM y PMSF 1 mM. La suspensión celular generalmente se lisa usando 2-3 pasadas a través de una prensa francesa. La suspensión celular también puede homogeneizarse usando un Polytron (Brinkman Instruments) o sonicarse en hielo. Los métodos alternativos de lisis de bacterias son evidentes para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J., EF Fritsch y T. Maniatis, eds. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring. Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biology).

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A menos que se especifique lo contrario, todas las cepas usadas para todas las pruebas de expresión de Pseudomonas se basaron en P. fluorescens cepa MB101. Se usaron las cepas JM109 (Promega), XL2 Blue (Stratagene) o Top 10 (Invitrogen) de E. coli para la clonación general. Para los estudios de expresión en E. coli, se usó BL21 (DE3) Gold. Las cepas de P. fluorescens se cultivaron en medio LB o en sales mínimas complementados con 15 μg/mL de tetraciclina y 30 μg/mL de kanamicina según fuera necesario a 30ºC. Las cepas de E. coli se cultivaron en LB suplementado con 30 ug/mL de kanamicina y/o 15 ug/mL de cloranfenicol, o 15 ug/mL de tetraciclina según fuera necesario a 37ºC. Las células se indujeron con IPTG 0,3 mM después de la fase de crecimiento.

Detección de la actividad de la proteína (ensayo ELISA)

Las placas se recubrieron añadiendo 200 μL de la solución de β-galactosidasa a razón de 10 μg/mL en PBS (pH 7,6) a cada pozo de la placa de microtitulación. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 16 horas, luego se lavaron 3 veces con 200 μL de PBS + Tween-20 al 0,1% (PBS-T). El anticuerpo primario se diluyó en PBS con leche en polvo sin grasa al 2% (p/v). Se añadieron 200 µL del anticuerpo diluido a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron luego 4 veces con 200 μL de PBS-T. El anticuerpo secundario también se diluyó en PBS con leche en polvo sin grasa al 2% (p/v) y se añadieron 200 μL a cada pozo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5-2 horas. Las placas se lavaron 4 veces con PBS-T. Se usa un anticuerpo terciario para detectar los anticuerpos scFv: anticuerpo antirratón de oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA cat. # A5324). A cada pozo deseado se añadieron 200 μL de solución de anticuerpo diluido (o PBS-T) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Las placas se lavaron 4 veces con PBS-T. A cada pozo se añadieron 200 μL del sustrato de pNPP Sigma Fast recién preparado (catálogo Sigma #R-2770). Después de 30 minutos, se detuvo la reacción añadiendo 50 μL de NaOH 3 M a cada pozo y se leyó la absorbancia a 405 nm.

Fermentación

El inóculo para el cultivo del fermentador para P. fluorescens es generado mediante la inoculación de un matraz de agitación que contiene 600 mL de un medio químicamente definido suplementado con extracto de levadura y dextrosa. La tetraciclina se agrega típicamente para asegurar el mantenimiento del plásmido recombinante en el cultivo iniciador durante su incubación durante la noche, así como también en el fermentador. El cultivo del matraz de agitación se transfiere asépticamente a un fermentador de 20 L que contiene un medio definido químicamente diseñado para soportar una alta biomasa, sin suplementación con extracto de levadura. El oxígeno se mantiene a un nivel positivo en el cultivo líquido mediante la regulación del flujo de aire en el fermentador y la velocidad de mezcla del agitador; el pH se mantiene a más de 6,0 mediante la adición de amoníaco acuoso. El proceso de fermentación de alta densidad en lotes alimentados se divide en una fase de crecimiento inicial de aproximadamente 24 horas y una fase de expresión génica (inducción) en la que se agrega un inductor para iniciar la expresión génica recombinante. La glucosa, en forma de jarabe de maíz, se alimenta durante todo el proceso de fermentación en concentraciones limitadas. La densidad de células objetivo para iniciar la fase de inducción es típicamente de 150 unidades OD a 575 nm. La fase de inducción de la fermentación normalmente se deja durante aproximadamente 45 a 55 horas. Durante esta fase, las muestras se retiran del fermentador para diversos análisis para determinar el nivel de expresión del gen objetivo, la densidad celular, etc.

Para cada experimento de fermentación para E. coli, una reserva de glicerol congelado se retira del almacenamiento a 80ºC, se descongela y se diluye antes de inocular un matraz de agitación que contiene 600 mL de caldo LB suplementado con kanamicina. El cultivo del matraz de agitación se incuba a 37ºC con agitación a 300 rpm durante la noche y luego se transfiere asépticamente a un fermentador de 20 L que contiene medio complejo. La temperatura en el fermentador se mantiene a 37ºC, pH 7 mediante la adición de amoníaco acuoso y ácido fosfórico, y oxígeno disuelto a más del 20%. Después de una breve fase inicial del lote, el glicerol se alimenta en cantidades cada vez mayores para mantener el exceso de carbono. Cuando la densidad celular alcanza 24-28 unidades de OD a 600 nm, la expresión recombinante se efectúa mediante la adición de un inductor, tal como isopropil-tiogalactósido (IPTG). La fase de inducción de la fermentación típicamente continúa durante aproximadamente 3 a 5 horas a medida que el fermentador alcanza la capacidad volumétrica o cuando la velocidad de crecimiento comienza a disminuir significativamente. Durante esta fase, las muestras se retiran del fermentador para diversos análisis para determinar el nivel de expresión del gen objetivo, la densidad celular, etc.

Fraccionamiento de células y análisis SDS-PAGE

Las muestras se normalizan a A575 = 30, y se sedimenta 1 mL de cultivo normalizado. Las células se resuspenden en 1 mL de regulador de lisis (base Tris 50 mM, NaCl 200 mM, 5% de glicerol v/v, sal disódica de EDTA 20 mM, Triton X-100 al 0,5% v/v, DTT 1 mM). Se agrega un cóctel inhibidor de proteasa específico para lisados bacterianos (Sigma # P8465) a una concentración 1X. Las células resuspendidas se añaden a un tubo de micrófuga de tapa de rosca de 2 mL, lleno aproximadamente 3/4 partes con perlas de vidrio de 0,1 mm, y las células se lisan mecánicamente usando 4 incubaciones de 1 minuto en un molino de bolas BioSpec en la configuración más alta. Las células se mantienen en hielo entre las incubaciones. Aproximadamente 100 μL de solución de células lisadas se retiran de las perlas, se transfieren a un nuevo tubo y se sedimentan. El sobrenadante (fracción soluble) se remueve a un nuevo tubo. El sedimento (fracción insoluble) se resuspende en un volumen igual (100 µL) de regulador de lisis más inhibidor de

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proteasa. Se añaden 5 μL de cada muestra a 5 μL de regulador de carga 2X LDS (Invitrogen) y se cargan en un gel Bis-Tris NuPAGE al 4-12% o 10% (Invitrogen) y se procesan en regulador 1X MES o 1X MOPS como se indica.

Ejemplo 1: Expresión de scFV en el citoplasma

Los fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFV) encuentran un mayor uso como agentes de diagnóstico y terapéuticos. Estas proteínas relativamente pequeñas se obtienen fusionando genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas variables de una inmunoglobulina.

Clonación de Gall3 scFv

Se usó el gen Gall3 scFv (número de acceso del GenBank AF238290), clonado en el vector de presentación en fago pCANTAB6, (véase P Martineau et al. (1998) J. Mol. Biol. 280 (1): 117-27) como plantilla para amplificar un producto de 774 pares de bases, que posteriormente se clonó en el vector pCR2.1 TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). El gen scFv se escindió del vector TOPO con enzimas de restricción SpeI y SalI (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.) y se clonó en los sitios SpeI y XhoI del vector pMYC1803 de P. fluorescens, secuencia abajo del promotor Ptac, para producir pDOW1117. Los plásmidos resultantes se electroporaron en P. fluorescens. El gen Gall3 se clonó en el vector de expresión pET24d+ (Novagen, Madison, WI, EE.UU.), después de una amplificación tal que los sitios SalI y NcoI flanqueaban la secuencia codificante. Los productos de PCR se digirieron con SalI y NcoI y se clonaron en los mismos sitios del vector pET24d+ secuencia abajo del promotor T7. La construcción recién formada se usó luego para transformar células competentes XL2 Blue. Una vez que se confirmó la secuencia, la construcción de ADN se usó para transformar BL21 (DE3) Gold (Stratagene, San Diego, CA, EE.UU.) para la expresión.

Expresión de un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en E. coli y P. fluorescens

Las moléculas de scFv se expresaron tanto en E. coli como en P. fluorescens, entre ellos un scFv con actividad de unión al anticuerpo de cadena sencilla ga113 de proteína β-galactosidasa de E. coli (P. Martineau et al., " Expression of an antibody fragment at high levels in the bacterial cytoplasm", J. Mol. Biol. 280 (1): 117-27 (1998)). P. fluorescens expresó aproximadamente seis veces más proteína que E. coli durante fermentación de 20 L, con 3,1 g/L de rendimiento en P. fluorescens y 0,5 g/L de rendimiento en E. coli como se determinó por SDS-PAGE y densitometría (véase la Tabla 8). P. fluorescens expresó aproximadamente el 96% de proteína soluble, mientras que E. coli expresa solo el 48% de proteína soluble.

Tabla 8: Resumen de fermentación de Gal13 (* en comparación con los estándares de BSA)

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E. coli P. fluorescens Pf/Ec

Tiempo de fermentación (h)

8-9 70 8

Título máximo de hGH (*g/L)

0,4 (85% cv) 3,1 (24% cv) 8

Biomasa seca (g/L)

ND (30) 59 (2)

hGH/biomasa (% p/p)

(1) 5 (5)

El material purificado de ambos sistemas de expresión se encontró que era activo en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) como se muestra en la Figura 2. El material también se purificó a partir de la fracción soluble solo de volúmenes de lisado iguales a partir de lisados de ambas cepas usando cromatografía de afinidad. Finalmente, la recuperación volumétrica general para el proceso de P. fluorescens es aproximadamente 20 veces más eficiente que para E. coli, 1,34 g/L frente a 0,07 g/L.

Ejemplo 2: Expresión de γ-IFN humano en el citoplasma

Clonación de interferón gamma humano

Se amplificó el interferón gamma humano (hu-γIFN, acceso del GenBank X13274) a partir de una biblioteca de ADNc de bazo humano (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU., catálogo # 10425-015) de manera que carecía de la señal de secreción nativa, con el terminal N del γ-IFN recombinante que comienza como Met-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro como se describe en PW Gray et al. (1982) Nature 298: 859-63. El producto resultante se clonó en el vector pCR2.1 TOPO y se confirmó la secuencia. El gen hu-γIFN se escindió del vector TOPO con las enzimas de restricción SpeI y XhoI y se clonó en los mismos sitios de pMYC1803. En una reacción separada, el hu-γIFN se amplificó de manera tal que los sitios AflIII y XhoI flanqueaban esa secuencia codificante. El fragmento resultante se clonó en el vector TOPO-TA (Invitrogen) y se transformó en células JM109 competentes de E. coli (Promega, Madison, WI, EE.UU.). El gen se aisló por digestión con AflIII y XhoI (New England Biolabs), se clonó en los sitios NcoI y XhoI de pET24d+ (Novagen, Madison, WI, EE.UU.) secuencia abajo del promotor T7, y se transformó en JM109. Un clon positivo se transformó en células BL21 de E. coli (DE3) (Novagen) para evaluar la expresión.

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Purificación de interferón gamma humano

La pasta celular congelada de lo cultivos de P. fluorescens se descongeló y se resuspendió en regulador de lisis (fosfato de potasio 50 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 50 mM, EDTA 10 mM (ácido etilendiaminotetraacético, número de catálogo BPII8-500, Fisher Scientific, Springfield, NJ, EE.UU.), PMSF 1 mM (fluoruro de fenilmetilsulfonilo, número de catálogo P-7626, Sigma, St. Louis, MO), ditiotreitol 1 mM (número de catálogo D-0632, Sigma), y benzamidina 1 mM (número de catálogo B-6506, Sigma)) en una proporción de aproximadamente 1 gramo de pasta de células por 2 mL de regulador de lisis. Las células se rompieron mediante tres pasadas a través de un microfluidizador (modelo 110Y, Microfluidics Corporation, Newton, MA, EE.UU.). Los restos celulares y las células intactas se eliminaron mediante centrifugación (durante 60 min a 23.708 x g y 4ºC usando una centrífuga Beckman Coulter, modelo JA 25.50, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE.UU.). El sobrenadante resultante (extractos libres de células) se clarificó añadiendo tierra de diatomeas al 10% p/v (producto Celite, World Minerals, Inc., Goleta, CA, EE.UU.) y pasando el resultado a través de un filtro de papel (Whatman 1, número de catálogo 1001-150, Whatman Paper Ltd., Maidstone, Kent, Reino Unido) con filtración al vacío.

Se aplicaron extractos celulares clarificados a una columna de cromatografía de 3,2 cm x 13,5 cm de SP-Sepharose FAST FLOW (material de perlas de agarosa entrecruzado al 6%; número de catálogo 17-0709-10, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE.UU.) equilibrado en regulador A, a un caudal de 0,5 mL/min. La composición del Regulador A fue: HEPES 50 mM, pH 7,8 (es decir, N-(2-hidroxietil)piperazina)N'-(ácido 2-etanosulfónico), de Fisher Scientific, número de catálogo BP-310-100), NaCl 50 mM, EDTA 1 mM y 0,02% de azida sódica (número de catálogo 71289, Sigma Chemical Co.). Después de la carga, la columna se lavó con 3 volúmenes de columna (volumen de columna = 108 mL) de regulador A y 5 volúmenes de columna de regulador A que contenía NaCl 0,4 M. La columna se desarrolló adicionalmente aplicando un gradiente de 0,4 M a 1 M de NaCl en el mismo regulador a un caudal de 2 mL/min para un total de 7 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían IFN-γ puro se combinaron luego y se dializaron frente a 1X PBS (solución salina regulada con fosfato, pH 7,2) a 4ºC. La proteína se concentró por ultrafiltración (usando una membrana de ultrafiltración YM30, catálogo No. 13722, de Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), luego se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a 80ºC.

Expresión del interferón γ humano en E. coli y P. fluorescens

El interferón γ humano se produce comercialmente mediante fermentación de E. coli que expresa el gen γ-IFN. La proteína se expresa citoplasmáticamente en una forma insoluble e inactiva. Para producir el polipéptido recombinante como un ingrediente farmacéutico activo, el interferón debe recuperarse, solubilizarse, replegarse y luego purificarse. Todas estas operaciones unitarias aumentan en gran medida el costo de los bienes (COG) para esta proteína. Se usó una biblioteca de ADNc de bazo humano como plantilla para amplificar el ADNc de γIFN sin la secuencia señal nativa y se clonó en vectores de expresión de E. coli y P. fluorescens. La construcción de P. fluorescens produjo ~ 4 g/L de proteína γIFN durante una reacción de fermentación típica de 20 L. SDS-PAGE y un análisis Western de fracciones solubles e insolubles muestran que la mayoría de la proteína (95%) está presente en la fracción soluble. La Figura 1 muestra que hu-γ-IFN purificado a partir de la fracción soluble de muestras de P. fluorescens muestra actividad comparable a un estándar disponible comercialmente. La Figura 5 y la Tabla 9 muestran una comparación de la expresión de γ-IFN entre sistemas de expresión de E. coli y P. fluorescens.

Tabla 9: Resumen de fermentación de γ-IFN (* en comparación con los estándares de BSA)

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E. coli P. fluorescens Pf/Ec

Tiempo de Fermentación (h)

7-9 55 6

Título máximo de hGH (*g/L)

3,9 4,5 1,5

Biomasa seca (g/L)

∼22 100 4,5

hGH/biomasa (% p/p)

∼17,7 4,5 0,25

Ensayo de actividad de interferón gamma humano

Líneas celulares y medios: Se obtuvieron células Hela (catálogo no. CCL-2) y virus de encefalomiocarditis (ECMV, catálogo no. VR-129B) de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células HeLa se mantuvieron en medio esencial modificado de Eagle (Cellgro EMEM, Mediatech, Herdon, VA, EE.UU.) con suero bovino fetal al 10% (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37ºC/5% de CO2.

La actividad de hu-γIFN purificada se ensayó usando un ensayo de inhibición viral como se describió previamente (JA Lewis (1987) en Lymphokines and Interferons: A Practical Approach MJ Clemens y colaboradores (eds.) (IRL Press Ltd, Oxford, Inglaterra). Brevemente, las células HeLa se sembraron en una placa de microtitulación de 96 pozos a razón de 3 x 104 por pozo. Después de 24 horas, se añadió hu-γIFN purificado de P. fluorescens, o hu-γIFN recombinante de E. coli (de R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.), por triplicado a los pozos a razón de 0, 0,01 o 0,05 ng por pozo. Después de preincubar las células con hu-γIFN durante 24 horas, se añadió ECMV en diluciones variables a conjuntos

de pozos por triplicado. Se incubaron las células durante 5 días, después de lo cual se midió la viabilidad celular usando un ELISA de proliferación celular que monitoriza la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (catálogo no. 1647229, Roche Molecular Biochemicals, Inobjetivopolis, IN, EE.UU.). Los resultados se expresan como unidades de absorbancia, con una mayor absorbancia resultante de la presencia de un mayor número de células que se dividen

5 activamente (vivas).

Ejemplo 3: Expresión de hGH en el citoplasma

Los cebadores se diseñaron para amplificar la hormona de crecimiento humana (hGH) a partir de bibliotecas de ADNc

10 humano. Para este estudio, se amplificó hGH utilizando AmpliTaq polimerasa (Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando el plásmido anterior como plantilla y cebadores ELVIrev y hgh-sig, con un perfil de ciclo de PCR de 95ºC durante 2 minutos (95ºC durante 60 segundos, 42ºC durante 120 segundos, 72ºC durante 3 minutos) 25X. El producto resultante se purificó usando el kit de purificación de ADN por PCR Wizard (Promega), se digirió con enzimas de restricción SpeI y XhoI (New England Biolabs) y se clonó en los mismos sitios de pMYC1803

15 (véase la Figura 3). Se corrigió una mutación encontrada en la hGH amplificada usando el cebador hgh-sigcorr con ELVIrev y repitiendo los procedimientos de PCR y clonación.

Cebadores utilizados para clonar hGH.

hGH-sig

HGH-sigcorr

ELVIfor

ELVIrev

AGAGACTCGAGTCATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC

20 Purificación de hGH

Después de la fermentación de 20 L, se purificó la hGH a partir de la fracción insoluble de células de E. coli y P. fluorescens, excepto porque que durante la elución de DEAE FF se usó un gradiente de NaCl de 0 a 0,5 M en lugar de una etapa de NaCl 0,25M.

25 Expresión de la hormona del crecimiento humana en E. coli frente a P. fluorescens.

El ADNc que codifica la hormona del crecimiento humana se amplificó a partir de una biblioteca de ADNc de pituitaria humana. La secuencia nativa de señal de secreción se eliminó, y se manipuló una metionina del terminal N en las 30 construcciones para la expresión microbiana. Para la expresión de E. coli, se transformó el vector pET25 que contenía el gen de hGH en BL21 (DE3), que contiene un gen de polimerasa T7 integrado necesario para la transcripción de hGH. Se llevaron a cabo estudios de expresión de P. fluorescens en la cepa MB214, que contiene un gen lacI integrado para controlar la expresión del promotor Ptac. Ambos sistemas de expresión se evaluaron a escala de fermentación de 20 L. Como se muestra en la Tabla 10, P. fluorescens (Pf) superó a E. coli (EC) en la cantidad de proteína producida por

35 gramo de biomasa seca (1,6X como mucho).

Tabla 10: Resumen de la fermentación de hGH (* comparado con los estándares de BSA)

E. coli

P. fluorescens Pf/Ec

Tiempo de Fermentación (h)

7-9 55 6

Título máximo de hGH (*g/L)

2,6 (23% de cv) 7,3 (5% de cv) 3

Biomasa seca (g/L)

37 66 2

hGH/biomasa (% p/p)

7 11 1,6

El fraccionamiento celular y el análisis SDS-PAGE muestran que la hGH se encuentra en la fracción insoluble en ambos

40 sistemas de expresión (Figura 4). Sorprendentemente, se purificó aproximadamente 7 veces más monómero de hGH a partir de P. fluorescens, comparado con E. coli, a pesar de una diferencia de solo 1,6X en la producción de proteína por gramo de biomasa seca.

Tabla 11: Comparación de la purificación de hGH a partir de E. coli y P. fluorescens

Porción de 1.62-1.75 L de P. fluorescens que contiene rh-GH

Biomasa húmeda (g húmedo)

Monómero purificado (mg) Dímero purificado (mg)

Soluble

mínima NA NA

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Ejemplo 4: Expresión de proteínas en el periplasma

5 Caracterización de péptidos señal de secreción

Se descubrieron péptidos señal de secreción de Pseudomonas fluorescens mediante la formación y expresión de fusiones de ADN genómico de secuencia de codificación de fosfatasa alcalina (phoA) y se describen con más detalle en la solicitud de patente de Estados Unidos No. 10/996.007, presentada el 22 de noviembre de 2004. Seis de las fusiones

10 expresadas se caracterizaron adicionalmente de la siguiente manera.

El sitio de escisión para las secuencias señal para los genes secretados identificados como fusiones phoA se dedujo por comparación con proteínas homólogas de otras Pseudomonas, mediante el programa SPScan (Menne et al., 2000). El sitio de segmentación de la lipoproteína putativa se dedujo por comparación con los motivos señal de peptidasa II; la 15 señal de peptidasa II escinde específicamente las secuencias señal de las lipoproteínas. Los seis péptidos señal fueron analizados utilizando SignalP (un programa de software para el análisis de péptidos señal putativos; disponible en el Centro para Análisis de Secuencia Biológica de la Universidad Técnica de Dinamarca, en http: //www.cbs.dtu.dklservices/SignalP/). Véase también, Nielson et al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6. En algunos casos, se usó una fuente suplementaria para caracterizar adicionalmente la identidad del péptido señal. Esta

20 información está presente en la Tabla 12.

Tabla 12. Identidades de péptidos de señal de secreción

Identidad

Secuencia putativa de aminoácidos

Precursor EI de purina putativa, OprE

Proteína putativa que se une a fosfato

Lys Leu Lys Arg Leu Met Ala Ala Met Thr Phe Val Ala Ala Gly

Azurina putativa

Precursor de lipoproteína B periplasmática putativa

Ile Lys Arg Asn Leu Leu Val Met Gly Leu Ala Val Leu Leu Ser

Proteína putativa que se une a Lys-Arg-Orn

Proteína putativa que se une a Fe(III)

Análisis Western de las proteínas de fusión phoA para detectar proteínas de fusión

25 Para analizar si se produjeron las proteínas de fusión, se llevó a cabo un análisis Western con anticuerpo para fosfatasa alcalina en cultivos separados por centrifugación en una fracción de células completas (citoplasma y periplasma) y una fracción de caldo libre de células. De las cinco cepas para las que se determinó el sitio de inserción, cuatro (azurina putativa, proteína putativa de unión a fosfato, lipoproteína B periplasmática putativa, proteína putativa que se une a Fe

30 (III)) produjeron una proteína de fusión del tamaño esperado, y una (proteína OprE putativa) produjo una proteína de aproximadamente 40 kD más pequeña que la prevista, y una (proteína putativa que se une a Lys-Arg-Orn) produjo una proteína aproximadamente 20 kD más pequeña que la prevista.

Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa a 40 V durante 35 una hora usando el módulo de transferencia Xcell SureLockMR Mini-Cell y XCell IIMR (Invitrogen). Los experimentos de

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55

65

transferencia Western se realizaron usando las instrucciones proporcionadas por el kit SuperSignal West HisProbeMR (Pierce).

Construcción, expresión y caracterización de una fusión pbp-hGH

El líder de secreción de proteína que se une a P. fluorescens se fusionó al terminal N del dominio maduro del gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) y se ensayó su expresión y secreción.

La región de codificación de la secuencia señal pbp se amplificó por PCR a partir de un clon de la secuencia señal pbp de P. fluorescens como molde, usando sig_pbp para los cebadores (gctctagaggaggtaacttatgaaactgaaacg) y pbp_hgh (gggaatggttgggaaggccaccgcgttggc), luego se purificó en gel. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de oligonucleótido que contiene el péptido señal pbp CDS y la secuencia de codificación para el extremo 5' del dominio maduro de hGH.

Se amplificó por PCR un ADNc que codifica la hormona de crecimiento humana a partir de una biblioteca de ADNc de pituitaria humana (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando los cebadores ELVIfor (agagaactagtaaaagagagaaatccatggctacagg ctcccggacgtcc) y ELVIrev (agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccac), que se diseñaron para amplificar solo el dominio maduro de hGH y se clonaron en pMYC1 803/SpeI XhoI, formando pDOW2400. El gen hGH maduro se amplificó a partir de pDOW2400, utilizando los cebadores pbp_hgh_revcomp (gccaacgcggtggccttcccaaccattccc) y hgh_rev (agagactcgagtcattagaagc cacagctgccctccacagagcggcac), luego se purificaron con columnas Strataprep (Stratagene) para eliminar los cebadores y otros componentes de la reacción. Para obtener el polinucleótido que codifica la fusión pbp-hGH, las dos reacciones de PCR se combinaron y se amplificaron de nuevo con sig_pbp for y hgh_rev para unir las dos piezas. El fragmento esperado de 681 pb se purificó con Strataprep como se indicó anteriormente, se digirió la restricción con XbaI y XhoI y se ligó a pDOW1269/XhoI SpeI desfosforilado para formar pDOW 1323-10, colocando pbphGH bajo el control del promotor tac en un vector análogo a pMYC1803, pero con un marcador seleccionable por pyrF en lugar de un gen marcador de resistencia a tetraciclina tetR. La mezcla de ligación se transformó en MB101 pyrF proC lacIQ1. Los insertos fueron secuenciados por The Dow Chemical Company usando el método descrito anteriormente. La secuencia de ADN y de aminoácidos de esta fusión se presenta en (Figura 10) y (Figura 11), respectivamente.

Las cepas resultantes se analizaron primero en la escala del matraz de agitación. Las bandas inducidas del tamaño esperado para procesado y no procesado (22,2 kDa y 24,5 kDa, respectivamente) se detectaron mediante SDS-PAGE. Aproximadamente la mitad de la proteína se procesó (lo que indica la localización en el periplasma), y de la mitad procesada, aproximadamente la mitad estaba en la fracción soluble y la otra mitad en la fracción insoluble. Los estudios de expresión se ampliaron hasta biorreactores de 20 L. La densitometría de los geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie mostró que el 18% de la hGH total producida fue procesada y soluble. La cepa produjo 3,2 g/L de todas las formas de hGH; la procesada y soluble fue 0,6 g/L.

Construcción, expresión y caracterización de la fusión pbp-scFv

La secuencia señal putativa de 24 aminoácidos de proteína de unión a fosfato (es decir, que incluye Metl) se fusionó al marco de lectura abierto del gen gal2 scFv (gal2) en la posición del aminoácido +2 (Ala). Véase la Figura 8 y la Figura 9. La secuencia señal parece ser procesada, lo que indica secreción en el periplasma. Además, hay secreción en el caldo, en el que se detectó la proteína en el sobrenadante del cultivo libre de células. Sorprendentemente, la fusión con la secuencia señal de proteína de unión a fosfato parece mejorar la expresión de gal2 scFv en P. fluorescens. Sin la señal de secreción fusionada en el terminal amino, la expresión de gal2 scFv no era detectable.

Clonación de Gal2

La PCR se realizó usando cebadores sig_pbp para (arriba) y pbp_gal2SOE rev (ctgcacctgggcggccaccgcgtt), que contiene un complemento inverso de pbp_gal2SOE para (aacgcggtggccgcceaggtgcag) y usando un plásmido que codifica el péptido señal de secreción pbp de P. fluorescens como plantilla. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de oligonucleótido que contiene la secuencia de codificación del péptido señal pbp (CDS) y un CDS para el extremo 5' del anticuerpo de cadena sencilla de gal2 (scAb o scFv).

Se realizó la PCR usando los cebadores pbp_gal2SOE para y scFv2rev (acgcgtcgacttattaatggtgatgatggtgatgtgcggccg cacgtttgatc), y usando un polinucleótido que codifica gal2 como plantilla. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de polinucleótido que contiene un CDS que codifica el extremo 3' del péptido señal de pbp y el marco de lectura abierto (ORE) que codifica gal2.

Los productos de reacción se purificaron. Se usaron aproximadamente 15 ng de cada uno como ADN "plantilla" en una reacción de PCR adicional usando cebadores sig_pbp_for y scFv2rev. Esto dio como resultado la producción de un fragmento de ácido nucleico con el péptido señal CDS fusionado a la secuencia codificante de gal2.

El aminoácido -I predicho de la secuencia de señal (que es el último aminoácido antes del sitio de escisión propuesto) se fusionó con el aminoácido +2 del gal2 scFv (Ala). La fusión resultante se clonó en el vector de P. fluorescens pMYC1803 bajo el control del promotor Ptac para producir el plásmido y pDOW1123 (pbp:gal2). El plásmido se

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2