ES2662359T3 - Derivados de hidrobenzamida como inhibidores de la Hsp90 - Google Patents

Abstract

Una combinación que comprende una sal de adición ácida de un compuesto de la Fórmula (1) **(Ver fórmula)** que es una sal de lactato y uno o más agentes terapéuticos diferentes.

Description

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abajo. Este compuesto puede referirse por conveniencia en esta solicitud como Compuesto 1 o el compuesto de la fórmula (1).

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Sumario de la invención

La invención proporciona la sal de ácido láctico ácido (en especial la sal de L-lactato), y formas cristalinas de la misma, del compuesto de la fórmula (1), que presentan actividad inhibidora o moduladora de Hsp90 y que serán útiles en la prevención o tratamiento de estados o condiciones de la enfermedad mediada por Hsp90. La solicitud divulga además nuevos procedimientos para preparar el compuesto de la fórmula (1) y sus sales de adición ácida (particularmente la sal de L-lactato) y análogos de los mismos, e intermediarios químicos. Además se incluyen dentro del alcance de la invención los usos terapéuticos de la sal.

Preferencias y Definiciones Generales

En esta especificación, los términos "compuestos de la invención" o "compuesto de la invención", a menos que el contexto indique otra cosa, se refieren colectivamente a (a) la sal de adición ácida del compuesto (1) que es la sal de lactato (particularmente la salde L-lactato), y (b) las formas cristalinas de la sal de adición ácida del compuesto de fórmula (1) que es la sal de lactato (particularmente la sal de L-lactato).

En esta especificación, los términos "combinaciones de la invención" o "combinación de la invención", a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere a (a) combinaciones de la sal de adición ácida del compuesto (1) que es la sal de lactato (particularmente la sal de L-lactato), y uno o más agentes terapéuticos diferentes, y (b) combinaciones de las formas cristalinas de la sal de adición ácida del compuesto (1) que es la sal de lactato (particularmente la sal de L-lactato), y uno o más agentes terapéuticos diferentes.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" y los términos relacionados "tratar" y "tratando" se refieren al tratamiento profiláctico o preventivo así como al tratamiento curativo o paliativo del dolor. Así, el término abarca situaciones donde el dolor ya está siendo experimentado por un sujeto o paciente, así como situaciones donde el dolor no está siendo experimentado en el presente pero se espera que surja. El término "tratamiento", "tratar", "tratando" y términos relacionados abarcan además la reducción o prevención completa y parcial del dolor. Así, por ejemplo, los compuestos de la invención pueden prevenir el dolor existente de agravarse, o reducirlo o incluso eliminar el dolor. Cuando se usa en un sentido profiláctico, los compuestos pueden prevenir cualquier dolor en desarrollo o pueden disminuir el grado de dolor que se puede desarrollar.

Como se usa en la presente, el término "modulación" según se aplica a la actividad de la proteína de choque térmico Hsp90, pretende definir un cambio en el nivel de actividad biológica de la proteína de choque térmico. Así, la modulación abarca los cambios fisiológicos que producen un aumento o disminución en la actividad competente de la proteína de choque térmico. En el último caso, la modulación se puede describir como "inhibición". La modulación puede surgir directa o indirectamente, y puede mediarse por cualquier mecanismo y en cualquier nivel fisiológico, incluyendo por ejemplo, en el nivel de la expresión génica (incluyendo por ejemplo, transcripción, traducción y/o modificación post-traduccional), en el nivel de la expresión de genes que codifican elementos reguladores que actúan directa o indirectamente sobre los niveles de actividad de la proteína de choque térmico. Así, la modulación puede implicar la expresión elevada/suprimida, o sobre o sub-expresión de la proteína de choque térmico, incluyendo la amplificación génica (es decir, múltiples copias de genes) y/o expresión aumentada o disminuida por un efecto transcripcional, así como hiper-(o hipo-) actividad y (des)activación de la proteína de choque térmico (incluyendo (des)activación) por mutación(es). Los términos "modulado", "modulación" y "modular" son interpretados en consecuencia.

Como se usa en la presente, el término "mediado", como se usa por ejemplo con relación a la proteína de choque térmico según se describe en la presente (y aplica por ejemplo a diversos procesos fisiológicos, enfermedades,

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estados, condiciones, terapias, tratamientos o intervenciones) pretende funcionar limitadamente tal que los diversos procesos fisiológicos, enfermedades, estados, condiciones, terapias, tratamientos o intervenciones en los que el término se aplica sean aquellos donde la proteína de choque térmico Hsp90 desempeña un papel biológico. En los casos donde el término se aplica a una enfermedad, estado o condición, el papel biológico desempeñado por la proteína de choque térmico Hsp90 puede ser directo o indirecto, puede ser necesario y/o suficiente para la manifestación de los síntomas de la enfermedad, estado o condición (o su etiología o progresión). Así, la actividad de la proteína de choque térmico Hsp90 (y, particularmente, los niveles aberrantes de la actividad de la proteína de choque térmico Hsp90, por ejemplo sobre-expresión de Hsp90) no tiene necesariamente que ser la causa proximal de la enfermedad, estado o condición: más bien, se contempla que las enfermedades, estados o condiciones mediados por la proteína de choque térmico Hsp90, incluyen aquellas que tienen etiologías multifactoriales y progresiones complejas en las que la Hsp90 sólo está parcialmente involucrada. En los casos donde se aplica el término al tratamiento, prevención o intervención (por ejemplo, en los "tratamientos mediados por Hsp90" y "profilaxis mediada por Hsp90" de la invención), el papel desempeñado por la Hsp90 puede ser directo o indirecto, y puede ser necesario y/o suficiente para el funcionamiento del tratamiento, profilaxis o resultado de la intervención. Así, un estado o condición de la enfermedad mediada por la Hsp90 incluye el desarrollo de resistencia a cualquier fármaco o tratamiento contra el cáncer (en particular incluyendo resistencia a uno o más de los inhibidores de la señalización descritos en la presente).

Como se usa en la presente, el término "modulación" como se aplica a la actividad de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) pretende definir un cambio en el nivel de actividad biológica de la quinasa(s). Así, la modulación abarca los cambios fisiológicos que producen un aumento o disminución en la actividad competente de la quinasa. En último caso, la modulación puede ser descrita como "inhibición". La modulación puede surgir directa o indirectamente, y puede mediarse por cualquier mecanismo y en cualquier nivel fisiológico, incluyendo por ejemplo, en el nivel de la expresión génica (incluyendo por ejemplo, transcripción, traducción y/o modificación posttraduccional), en el nivel de la expresión de genes que codifican elementos reguladores que actúan directa o indirectamente sobre los niveles de actividad de la proteína quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5), o en el nivel de actividad de la enzima (por ejemplo, quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) (por ejemplo, por mecanismos alostéricos, inhibición competitiva, inactivación del sitio activo, interrupción de las vías de retroalimentación inhibidora etc.). Así, la modulación puede implicar la expresión elevada/suprimida, o sobre o sub-expresión de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5), incluyendo la amplificación génica (es decir, múltiples copias de genes) y/o expresión aumentada o disminuida por un efecto transcripcional, así como hiper-(o hipo-) actividad y (des)activación de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) incluyendo (des)activación) por mutación(es). Los términos "modulado", "modulación" y "modular" son interpretados en consecuencia.

Como se usa en la presente, el término "mediado", como se usa por ejemplo, en conjunto con la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) como se describe en la presente (y aplica por ejemplo a diversos procesos fisiológicos, enfermedades, estados, condiciones, terapias, tratamientos o intervenciones) pretende funcionar limitadamente tal que los diversos procesos fisiológicos, enfermedades, estados, condiciones, terapias, tratamientos

o intervenciones en los que el término se aplica sean aquellos donde la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) desempeña un papel biológico. En los casos donde el término se aplica a una enfermedad, estado o condición, el papel biológico desempeñado por la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) puede ser directo o indirecto, puede ser necesario y/o suficiente para la manifestación de los síntomas de la enfermedad, estado o condición (o su etiología o progresión). Así, la actividad de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5) (y particularmente los niveles aberrantes de actividad de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5), por ejemplo, la sobre-expresión de la quinasa 5 dependiente de ciclina (CDK5)) no tiene necesariamente que ser la causa proximal de la enfermedad, estado o condición: más bien, se contempla que las enfermedades, estados o condiciones mediadas por CDK5, incluyen aquellas que tienen etiologías multifactoriales y progresiones complejas en las que CDK5 sólo está parcialmente involucrada. En los casos donde se aplica el término al tratamiento, profilaxis o intervención (por ejemplo, en los "tratamientos mediados por CDK5" de la invención), el papel desempeñado por CDK5 puede ser directo o indirectamente, y puede ser necesario y/o suficiente para el funcionamiento del tratamiento, profilaxis o resultado de la intervención.

El término "intervención" es un término de la materia usado en la presente para definir cualquier agencia que produce un cambio fisiológico en cualquier nivel. Así, la intervención puede comprender la inducción o represión de cualquier proceso fisiológico, evento, vía bioquímica o evento celular/bioquímico. Las intervenciones de la invención típicamente producen (o contribuyen a) la terapia, tratamiento o profilaxis de una enfermedad o condición.

Como se usa en la presente, el término "combinación" como se aplica a dos o más compuestos y/o agentes (referido además en la presente como los componentes), pretende definir el material en el que dos o más que compuestos/agentes se asocian. Los términos "combinado" y "combinar" en este contexto son interpretados en consecuencia.

La asociación de dos o más compuestos/agentes en una combinación puede ser física o no física. Los ejemplos de compuestos/agentes combinados físicamente asociados incluyen:

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composiciones (por ejemplo formulaciones unitarias) que comprenden dos o más compuestos/agentes en la mezcla (por ejemplo dentro de la misma dosis unitaria);

●

composiciones que comprenden el material en el que dos o más compuestos/agentes están químicamente/físicamente vinculados (por ejemplo por entrecruzamiento, aglomeración molecular o unión a una porción de vehículo común);

●

composiciones que comprenden material en el que dos o más compuestos/agentes están químicamente/físicamente co-empaquetados (por ejemplo, partículas dispuestas en o dentro de vesículas lípidicas (por ejemplo micro-o nanopartículas) o emulsión en gotas);

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kits farmacéuticos, paquetes farmacéuticos o paquetes para el paciente en el que dos o más compuestos/agentes están co-empaquetados o co-presentados (por ejemplo, como parte de una matriz de dosis unitarias);

Los ejemplos de compuestos/agentes combinados no-físicamente asociados incluyen:

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material (por ejemplo una formulación no-unitaria) que comprende al menos uno de dos o más compuestos/agentes juntos con las instrucciones para la asociación extemporánea de al menos un compuesto para formar una asociación física de dos o más compuestos/agentes;

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material (por ejemplo una formulación no-unitaria) que comprende al menos uno de dos o más compuestos/agentes juntos con las instrucciones para la terapia de combinación con dos o más compuestos/agentes;

●

material que comprende al menos uno de dos o más compuestos/agentes juntos con las instrucciones para la administración de una población de pacientes en la que el otro(s) de dos o más compuestos/agentes ha sido (o está siendo) administrado;

●

material que comprenden al menos uno de dos o más compuestos/agentes en una cantidad o en una forma específicamente adaptada para su uso en conjunto con el otro(s) de dos o más compuestos/agentes.

Como se usa en la presente, el término "en conjunto" puede referirse a los compuestos/agentes que se administran como parte del mismo régimen de tratamiento completo. Como tal, la dosificación de cada uno de dos o más compuestos/agentes puede diferir: cada una se puede administrar al mismo tiempo o en momentos diferentes. Por lo tanto, se apreciará que los compuestos/agentes de la combinación se pueden administrar de forma secuencial (por ejemplo, antes o después) o simultáneamente, ya sea en la misma formulación farmacéutica (es decir, juntos), o en diferentes formulaciones farmacéuticas (es decir, por separado). Simultáneamente en la misma formulación es como una formulación unitaria mientras que simultáneamente en diferentes formulaciones farmacéuticas no es unitaria. Las dosificaciones de cada uno de dos o más compuestos/agentes en una terapia de combinación puede diferir además de la vía de administración.

Como se usa en la presente, el término "kit farmacéutico" define una matriz de uno o más dosis unitarias de una composición farmacéutica junto con los medios de dosificación (por ejemplo dispositivo de medición) y/o medios de suministro (por ejemplo inhalador o jeringa), opcionalmente todos contenidos en el embalaje común externo. En los kits farmacéuticos que comprenden una combinación de dos o más compuestos/agentes, los compuestos/agentes individuales pueden ser formulaciones unitarias o no-unitarias. La(s) dosis unitaria(s) puede estar contenida dentro de un empaque plástico transparente. El kit farmacéutico puede comprender además opcionalmente las instrucciones para el uso.

Como se usa en la presente, el término "paquete farmacéutico" define una matriz de una o más dosis unitarias de una composición farmacéutica, opcionalmente contenidas dentro de un paquete común externo. En los paquetes farmacéuticos que comprenden una combinación de dos o más compuestos/agentes, los compuestos/agentes individuales pueden ser formulaciones unitarias o no-unitarias. La(s) dosis unitaria(s) puede estar contenida dentro de un empaque plástico transparente. El paquete farmacéutico puede comprender además opcionalmente las instrucciones para el uso.

Como se usa en la presente, el término "paquete para el paciente" define un paquete, recetado a un paciente, que contiene las composiciones farmacéuticas para el curso completo de tratamiento. Los paquetes para pacientes contienen usualmente uno o más empaque(s) plástico transparente. Los paquetes para el paciente tienen una ventaja sobre las recetas tradicionales, donde un farmacéutico divide un suministro del paciente de un producto farmacéutico a partir de un suministro a granel, en la que el paciente siempre tiene acceso al prospecto contenido en el paquete para el paciente, normalmente ausente en las recetas del paciente. La inclusión de un prospecto ha demostrado mejorar el cumplimiento del paciente con las instrucciones del médico

Sales de adición ácidas

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que es es una sal de lactato en forma sustancialmente cristalina y uno o más agentes terapéuticos diferentes.

En una realización, la forma cristalina se selecciona de:

FL1: caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 16.81, y

FL2: caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 22.34.

Por "sustancialmente cristalino" se entiende que la sal de lactato de un compuesto de fórmula (1) son de 50% a 100% cristalinos, y más particularmente la sal de lactato de un compuesto de la fórmula (1) pueden ser al menos 50% cristalinos, o al menos 60% cristalinos, o al menos 70% cristalinos, o al menos 80% cristalinos, o al menos 90% cristalinos, o al menos 95% cristalinos, o al menos 98% cristalinos, o al menos 99% cristalinos, o al menos 99.5% cristalinos, o al menos 99.9% cristalinos, por ejemplo 100% cristalinos.

Con mayor preferencia la sal de lactato de un compuesto de la fórmula (1) son aquellas (o pueden ser seleccionados del grupo que consiste de aquellos) que son 95% a 100 % cristalinos, por ejemplo al menos 98% cristalinos, o al menos 99% cristalinos, o al menos 99.5% cristalinos, o al menos 99.6% cristalinos o al menos 99.7% cristalinos o al menos 99.8% cristalinos o al menos 99.9% cristalinos, por ejemplo 100% cristalinos.

Las formas cristalinas de la invención, en el estado sólido, pueden ser solvatadas (por ejemplo hidratadas) o no solvatadas (por ejemplo, anhidras).

En una realización, las formas cristalinas son no solvatadas (por ejemplo, anhidras).

El término "anhidro" como se usa en la presente no excluye la posibilidad de la presencia de alguna agua en o en la sal (por ejemplo, un cristal de la sal). Por ejemplo, puede haber algo de agua presente en la superficie de la sal (por ejemplo, cristal de sal), o cantidades menores dentro del cuerpo de la sal (por ejemplo, cristal). Típicamente, una forma anhidra contiene menos de 0.4 moléculas de agua por molécula de compuesto, y contiene con mayor preferencia menos de 0.1 moléculas de agua por molécula de compuesto, por ejemplo 0 moléculas de agua.

En otra forma realización, las formas cristalinas son solvatadas. Donde las formas cristalinas son hidratados, pueden contener, por ejemplo, hasta tres moléculas de agua de cristalización, más usualmente hasta dos moléculas de agua, por ejemplo, una molécula de agua o dos moléculas de agua. Los hidratos no estequiométricos se pueden formar además en el cual el número de moléculas de agua presente es menor que uno o de lo contrario, es un número no entero. Por ejemplo, donde hay menos de una molécula de agua presente, puede haber, por ejemplo 0.4,

o 0.5, o 0.6, o 0.7, o 0.8, o 0.9 moléculas de agua presente por molécula del compuesto.

Otros solvatos incluyen alcoholatos tales como etanolatos e isopropanolatos.

Las formas cristalinas descritas en la presente, los cristales individuales de los mismos y sus estructuras cristalinas forman además aspectos de la invención.

Las formas cristalinas y sus estructuras cristalinas se puede caracterizar usando una serie de técnicas, que incluyen cristalografía de rayos X de un cristal sencillo, difracción de polvo de rayos X (XRPD), calorimetría diferencial de barrido (DSC) y espectroscopía de infrarrojos, por ejemplo, espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR). El comportamiento de los cristales en las condiciones de humedad variable se puede analizar por los estudios de sorción gravimétrica de vapor y además por XRPD.

La determinación de la estructura cristalina de un compuesto puede realizarse por cristalografía de rayos X la que puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos convencionales, tales como los descritos en la presente y en Fundamentals of Crystallography, C. Giacovazzo, H. L. Monaco, D. Viterbo, F. Scordari, G. Gilli, G. Zanotti y M. Catti, (International Union of Crystallography/Oxford University Press, 1992 ISBN 78-4 (p/b), 9-2 (h/b)). Esta técnica involucra el análisis e interpretación de la difracción de rayos X de un cristal sencillo.

Alternativamente, la estructura cristalina de un compuesto puede ser analizada por la técnica en estado sólido de difracción de polvo de rayos X (XRPD). La XRPD puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos convencionales tales como los descritos en la presente y en Introduction to X-ray Powder Diffraction, Ron Jenkins y Robert L. Snyder (John Wiley & Sons, Nueva York, 1996). La presencia de picos definidos (en contraposición al ruido de fondo aleatorio) en un difractograma de XRPD indica que el compuesto tiene un grado de cristalinidad.

Un patrón de polvo de rayos X del compuesto se caracteriza por el ángulo de difracción (2θ) y los parámetros de espaciado interplanar (d) de un espectro de difracción de rayos-X. Estos están relacionados por la ecuación de Bragg, nλ=2d Sin θ, (donde n=1; λ=longitud de onda del cátodo usado; d=separador interplanar; y θ=ángulo de difracción). En la presente, los separadores interplanares, el ángulo de difracción y el patrón completo son importantes para la identificación del cristal en la difracción de polvo de rayos X, debido a las características de los datos. La intensidad relativa no se debe interpretar estrictamente, dado que puede variarse en función de la dirección del crecimiento del cristal, tamaños de partícula y condiciones de medición. Además, los ángulos de difracción usualmente promedian los que coinciden en el intervalo de 2θ±0.2°. Los picos promedian los picos máximos e incluyen picos no más grande que la mitad de los ángulos de difracción distintos a los indicados anteriormente.

El compuesto de la fórmula (1) y sus sales de adición ácida existen en una serie de formas cristalinas diferentes y estas se describen con más detalles a continuación y se caracterizan en los ejemplos.

Formas cristalinas de la base libre de (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil,-1,3-dihidroisoindol-2-il]-metanona (ejemplos comparativos)

Se encontró que la base libre del compuesto de la fórmula (1) existe en al menos seis formas cristalinas diferentes de las cuales tres (las formas designadas en la presente como FB1, FB2 y FB5) son inestables en el aire, y tres (las formas designadas en la presente como FB3, FB4 y FB6) son estables en el aire. Las características de las formas cristalinas de la base libre se describen en el Ejemplo 6A más abajo.

Forma FB1

Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción pico (2θ/°) a 5.52.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) de 15.21, 16.11, 16.72,

18.21 y 20.29.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) de 9.44, 11.05, 11.99, 17.09, 19.23, 19.73, 21.09 y 26.72.

Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 1 en la presente.

En otro aspecto, se proporciona un método para preparar la forma cristalina FB1, el método comprende disolver (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en n-butanol para formar una solución saturada y después añadir di(isopropilo) éter para precipitar la forma cristalina FB1.

La forma de cristal FB1 es inestable en el aire y se convierte a la forma FB3 (ver más abajo) en la que se queda.

En consecuencia, se proporciona un método para la preparación de la forma cristalina FB3 como se define en la presente, el método comprende exponer la forma FB1 al aire por un periodo suficiente para permitir que tenga lugar la transformación a FB3.

Forma FB2

Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción pico (2θ/°) a 5.35.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 14.68, 17.00, 18.61,

19.86 y 20.15.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 6.73, 10.40, 10.67, 18.26, 18.87, 19.24, 21.13, 21.44 y 26.86.

Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 2 en la presente.

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Se proporciona un método para preparar la forma cristalina FB2, el método comprende disolver (2,4-dihidroxi-5isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en THF para formar una solución saturada y después añadir acetato de isopropilo para precipitar la forma cristalina FB2.

La forma de cristal FB2 es además inestable en el aire y se convierte a la forma FB3 (ver más abajo) en la que se queda.

En consecuencia, se proporciona un método para la preparación de la forma cristalina FB3 como se define en la presente, el método comprende exponer la forma FB2 al aire por un periodo suficiente para permitir que tenga lugar la transformación a FB3.

Forma FB3

Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 6.05.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 12.15, 13.60, 15.77, 17.82, 18.89, 19.64, 20.20 y 20.93.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 7.87, 9.15, 10.22, 16.62, 17.16, 22.19, 23.33 y 24.53.

Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 3 en la presente.

La Forma FB3 es estable en el aire a 40 °C y con 75% humedad relativa por al menos un mes y es por lo tanto adecuada para usar en composiciones farmacéuticas sólidas. En consecuencia, en otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica sólida que comprende 2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3dihidro-isoindol-2-il]-metanona base libre en forma cristalina FB3 como se define en la presente.

Forma FB4

Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 6.29.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 8.91, 9.96, 14.11, 16.11, 17.11, 18.48, 19.91, 21.57, 22.46, 23.59 y 24.88.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 12.62, 17.40, 17.88, 19.33, 20.35 y 27.25.

Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 4 en la presente.

A partir de los estudios de cristalografía de rayos X, se encontró que la forma FB4 tiene una estructura cristalina que pertenece al grupo espacial tetragonal P42/n y tiene parámetros de la red cristalina a 293 K a=b=28.2, c=6.0 Å, α = β = γ = 90°. El diagrama de empaque del cristal se muestra en la Figura 5.

En consecuencia, se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropilfenil)-[5-(4-metilo-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2il]-metanona base libre la cual es cristalina y:

(a)

tiene una estructura cristalina como se expone en la Figura 5; y/o

(b)

tiene una estructura cristalina definida por las coordenadas en la Tabla 5 en la presente; y/o

(c)

tiene parámetros de la red cristalina a 293 K a=b=28.2, c=6.0 Å, α = β = γ = 90°; y/o

(d)

tiene una estructura cristalina que pertenece a un grupo espacial tetragonal tal como P42/n.

La forma cristalina FB4 es un dihidrato estable y puede usarse para la preparación de composiciones farmacéuticas sólidas. En consecuencia, se proporciona una composición farmacéutica sólida que comprende 2,4-dihidroxi-5isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona base libre en forma cristalina FB4 como se define en la presente.

Se proporciona un método para preparar la forma cristalina FB4, el método comprende disolver (2,4-dihidroxi-5isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en etanol para formar una solución saturada y después añadir di(isopropilo) éter para precipitar la forma cristalina FB4.

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Forma FB5

Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 7.12. Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 9.71, 10.14, 13.73,

16.58, 18.71, 19.46, 20.15 y 22.35.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 11.50, 14.60, 15.34, 16.94, 21.97, 23.43 y 26.36. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 6 en la presente. Se proporciona un método para preparar la forma cristalina FB5, el método comprende disolver (2,4-dihidroxi-5

isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona en isopropanol para formar una solución saturada y después añadir acetato de isopropilo para precipitar la forma cristalina FB5.

Forma FB6 En otra realización, la invención proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidroisoindol-2-il]-metanona en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 18.66.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 9.09, 9.68, 16.08, 16.46, 16.94, 18.13, 20.05 y 22.48. Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 4.60 y 26.53.

Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 7 en la presente. Formas cristalinas de las sales formadas entre (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3dihidro-isoindol-2-il]-metanona y ácido clorhídrico (ejemplos comparativos)

Se encontró que las sales de ácido clorhídrico del compuesto de la fórmula (1) existen en al menos cinco formas cristalinas diferentes de las cuales una (la forma designada en la presente como FH3) es estable en el aire, y cuatro (las formas designadas en la presente como FH1, FH2, FH4 y FH5) son inestables en el aire.

Forma FH1 Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal

de hidrocloruro en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 7.34. Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 5.59, 7.99, 10.33,

14.32, 15.29, 18.59 y 25.32.

Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 11.70, 13.95, 14.72, 16.37, 16.82, 19.99, 20.40, 20.82, 21.26, 22.57, 23.01, 24.60, 25.82, 27.10, 28.27 y 28.78. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 8 en la presente. Se proporciona un método para preparar la forma cristalina FH1, el método comprende añadir acetato de etilo/HCI y

metanol a la base libre de 2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]metanona para dar una solución y después eliminar los solventes para dejar la sal de di-hidrocloruro.

Forma FH2 Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal de hidrocloruro en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a 3.40.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 6.81, 9.03, 11.84, 15.70, 16.10, 18.13, 20.84, 23.19, 23.94, 24.78 y 25.65.

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Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal de sulfato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a

5.43.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 10.30, 11.24, 14.26, 14.91, 16.41, 17.53, 18.38, 18.61, 19.01, 19.92, 21.77, 22.67, 24.23 y 25.36. Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 4.81, 12.94,

13.98, 15.62, 19.38, 20.27, 20.71, 21.19, 23.79, 27.38 y 28.82. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 19 en la presente. La Forma FS3 puede prepararse dejando que la forma FS1 se seque por 2 días al aire. Forma FS4 Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal

de sulfato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a

7.48.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 7.16, 7.97, 8.82, 9.09, 9.37, 10.45, 11.77, 14.36, 16.21, 16.99, 17.28, 17.59, 18.90, 23.13, 23.68 y 23.96. Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 4.64, 8.42,

13.25, 13.54, 15.03, 17.96, 19.43, 19.83, 21.36, 24.77, 25.64, 26.19, 26.73, 27.20, 27.76 y 28.64. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 20 en la presente. La Forma FS4 puede prepararse incubando la forma FS2 por varias semanas a 40°C y 75% RH. Forma FS5 Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal

de sulfato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a

7.99.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 7.11, 9.33, 9.57, 10.45, 11.64, 13.27, 14.28, 15.60, 16.98, 17.65, 18.01, 18.80, 23.21, 23.51, 23.92, 25.06 y 26.24. Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 4.70, 14.65,

15.12, 19.32, 19.83, 21.08, 24.30, 27.28 y 28.67. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 21 en la presente. La Forma FS5 puede prepararse dejando que la forma FS2 se seque al aire. Forma FS6 Se proporciona (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona sal

de sulfato en una forma cristalina caracterizada por un patrón de XRPD con un ángulo de difracción (2θ/°) pico a

4.82.

Preferiblemente, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 9.98, 14.45, 15.38, 16.97, 18.18, 20.23, 20.93 y 22.29. Con mayor preferencia, el patrón de XRPD exhibe además picos en los ángulos de difracción (2θ/°) a 11.35, 12.92,

17.52, 19.42, 21.31, 21.66, 21.89, 22.84, 23.04, 23.94, 24.51, 25.26 y 29.18. Con la máxima preferencia, el patrón de XRPD es sustancialmente como se muestra en la Figura 22 en la presente. La Forma FS6 puede prepararse preparando una solución saturada de la sal 1:1 (ver anteriormente) en DMF y

después añadir tolueno para precipitar la forma FS6. Usos farmacéuticos de las sales de adición ácida y formas cristalinas del Compuesto (1) En otros aspectos, la invención proporciona la combinación para usar:

5

10

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20

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35

40

45

●

en medicina

●

como un inhibidor de Hsp90; o

●

en el tratamiento de una enfermedad o condición que comprende o surge a partir del crecimiento anormal de la célula en un mamífero; o

●

en un método para inhibir la Hsp90, el método comprende poner en contacto la Hsp90 con la combinación; o

●

para usar en el tratamiento de trastornos proliferativos seleccionados de un carcinoma de vejiga, mama, colon, riñón, epidermis, hígado, pulmón, esófago, vesícula, ovario, páncreas, estómago, útero, tiroides, próstata sistema gastrointestinal, o piel; un tumor hematopoyético de linaje linfoide; a un tumor hematopoyético de linaje mieloide; cáncer folicular de tiroides; un tumor de origen mesenquimal; un tumor del sistema nervioso central o periférico; melanoma; seminoma; teratocarcinoma; osteosarcoma; xerodermia pigmentosa; keratoacantoma; cáncer folicular de tiroides; o sarcoma de Kaposi; o

●

en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngico, protozoárico o parasítico, distinto de un estado de enfermedad o condición debido al Plasmodium falciparum; o

●

en la fabricación de un medicamento para la coadministración con un agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente anti-parasítico, preferiblemente un agente anti-fúngico, para prevenir, reducir o invertir el desarrollo de resistencia al agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente anti-parasítico; o

●

en un método para prevenir o reducir el desarrollo de resistencia al agente anti-fúngico en un paciente, el método comprende administrar al paciente una combinación de un agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente antiparasítico y la combinación; o

●

en la fabricación de un medicamento para usar en la reducción o eliminación del dolor en un paciente que padece de dolor; o

●

en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una cualquiera o más de nocicepción, dolor somático, dolor visceral, dolor agudo, dolor crónico, hiperalgesia, alodinia, dolor post operativo, dolor debido a hipersensibilidad, dolor de cabeza, dolor inflamatorio, dolor neurológico, dolor musculoesquelético, dolor relacionado con cáncer o dolor vascular; o

●

en un método para prevenir o reducir el daño neuronal en un paciente que padece de apoplejía, el método comprende administrar al paciente una cantidad neuroprotectora efectiva de la combinación; o

●

en la fabricación de un medicamento para la prevención o reducción del riesgo de apoplejía en pacientes con riesgo de apoplejía; o

●

en la profilaxis o tratamiento de una infección viral o enfermedad viral; o

●

para usar en bloquear o inhibir la replicación viral en un organismo huésped; o

●

en un método para bloquear o inhibir la replicación viral en un organismo huésped, el método comprende administrar al organismo huésped la combinación; o

●

en un método para: (i) sensibilizar las células malignas a un fármaco anticancerígeno; (ii) aliviar o reducir la incidencia de resistencia a un fármaco anticancerígeno; (iii) revertir la resistencia a un fármaco anticancerígeno; (iv) potenciar la actividad de un fármaco anticancerígeno; (v) retardar o prevenir la aparición de la resistencia a un fármaco anticancerígeno, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación; o

●

en un método para el tratamiento de un cáncer el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación, el método se caracteriza por la ausencia de resistencia al fármaco; o

●

en un método para la profilaxis o tratamiento o alivio o reducción de la incidencia de un estado de enfermedad o condición mediada por Hsp90 en un sujeto que se somete a tratamiento con un agente terapéutico, el método comprende administrar al sujeto la combinación, en donde estado de enfermedad o condición mediada por Hsp90 es el desarrollo de resistencia a dicho agente terapéutico; o

●

en un método para: (i) sensibilizar las células malignas a un agente contra el cáncer ; (ii) aliviar o reducir la incidencia de resistencia a un agente contra el cáncer; (iii) revertir la resistencia a un agente contra el cáncer; (iv) potenciar la actividad de un agente contra el cáncer; (v) retardar o prevenir la aparición de la resistencia a un agente

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El proceso anterior puede usarse para preparar un compuesto de fórmula (1) o sus homólogos etilo, propilo y butilo. Preferiblemente el proceso se usa para preparar los compuestos en donde R1 es metilo o etilo. En una realización, R1 es metilo, es decir el proceso se usa para preparar el compuesto de la fórmula (1). En otra realización, R1 es etilo. Los compuestos de la fórmula (3) pueden prepararse por la reacción de un compuesto de la fórmula (3a):

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con un reactivo de Wittig u otro reactivo adecuado para convertir el grupo -C(=O)-CH3 en un grupo -C(=CH2)-CH3. Por ejemplo, el compuesto de acetofenona (3a) puede reaccionar con el reactivo de Wittig MePPh3Br en presencia de una base tal como butil litio o terc-butóxido de potasio en THF para dar un compuesto de la fórmula (3) en donde

10 A-B es C=CH2.

Así, en otro aspecto, la invención divulga un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (3) como se define en la presente, el proceso comprende la reacción de un compuesto de la fórmula (3a) como se definió anteriormente con un reactivo de Wittig u otro reactivo adecuado para convertir el grupo -C(=O)-CH3 en un grupo C(=CH2)-CH3.

15 Como alternativa, y con mayor preferencia, los compuestos de la formula (3) pueden prepararse por la reacción de un ácido benzoico sustituido de la fórmula (4) más abajo, o una forma activada o derivado del mismo, con un isoindolina de la fórmula (5) más abajo.

En consecuencia, en otro aspecto, la invención divulga un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (3) como se define en la presente, el proceso comprende:

20 (a-i) la reacción de un compuesto de la fórmula (4), o una forma activada o derivado del mismo con un compuesto de la fórmula (5):

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bajo condiciones de formación de amida.

La invención divulga además un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (2) como se define en 25 la presente, el proceso comprende:

(a-i) la reacción de un compuesto de la fórmula (4) como se define en la presente, o una forma activada o derivado del mismo con un compuesto de la fórmula (5) como se define en la presente, bajo condiciones de formación de amida para dar un compuesto de la fórmula (3); y

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35

El material de partida para el Esquema 1 es metil éster del ácido 2,4-dihidroxibenzoico (11) el cual es monoacetilado por la reacción con anhídrido acético en presencia de N,N-dimetilo-4-aminopiridina para dar el di-éster (12). La conversión del di-éster (12) a la acetofenona sustituida (13) se logra reaccionando el compuesto (12) con ácido trifluorometanosulfónico y opcionalmente cloruro de acetilo para dar la acetofenona (13). La acetofenona (13) se trata con bromuro de bencilo en presencia de una base tal como carbonato potásico para dar el compuesto de dibencilo (14) el cual reacciona después con el reactivo de Wittig MePPh3Br en presencia de una base tal como butil litio o terc-butóxido de potasio en THF para dar el compuesto de isopropenil (15). La hidrólisis del éster al ácido carboxílico (16) es típicamente llevada a cabo por tratamiento con un hidróxido de metales alcalinos acuoso tal como hidróxido de sodio potasio. La reacción de hidrólisis puede llevarse a cabo usando un cosolvente orgánico tal como un alcohol (por ejemplo, metanol) y la mezcla de reacción se calienta típicamente a una temperatura no extrema, por ejemplo, hasta aproximadamente 50-90°C.

Los compuestos de la fórmula (4) donde A-B es CH-CH3 pueden prepararse como se describe en el Esquema 1 excepto que el compuesto de isopropenil (15) se reduce al compuesto isopropilo correspondiente por hidrogenación catalítica, y el compuesto dihidroxi resultante es después re-bencilado por reacción con bromuro de bencilo en presencia de una base como se describió anteriormente.

La secuencia de reacción ilustrada en el Esquema 1 anteriormente da lugar a rendimientos que son significativamente mejores que los rendimientos en las etapas correspondientes en el Esquema 4 de PCT/GB2006/001382 y hacen uso de los reactivos y condiciones que son más adecuadas para la síntesis a escala de fabricación. Además, y lo más importante desde la perspectiva de síntesis a gran escala, la secuencia de reacción mostrada en el Esquema 1 evita la necesidad de purificación cromatográfica.

En consecuencia, la invención divulga un proceso ("Proceso Intermedio A") para la preparación de un compuesto de la fórmula (13):

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cuyo proceso comprende:

(i) la reacción de un compuesto de la Fórmula (11):

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con (a) anhídrido acético en presencia de 4-dimetilaminopiridina (típicamente con calor, por ejemplo, a una temperatura de hasta aproximadamente 60 °), seguido por (b) ácido trifluorometanosulfónico y opcionalmente cloruro de acetilo (típicamente a temperatura ambiente); o

(ii) la reacción de un compuesto de la fórmula (11) con cloruro de acetilo en presencia de una resina de intercambio de iones catiónicos tal como la resina Amberlyst™ 15.

El Proceso Intermedio A da rendimientos del compuesto (13) que son mejores que los rendimientos descritos para el proceso correspondiente en PCT/GB2006/001382.

La invención divulga además un proceso ("Proceso Intermedio B") para la preparación de un compuesto de la fórmula (15):

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y

(b) someter el compuesto de la fórmula (9) a hidrogenación catalítica para eliminar los grupos protectores PG y, cuando R4' es C2-5 alquenilo, reducir el grupo R4' a C2-5 alquilo;

5 y después de eso, donde el compuesto de la fórmula (6) se prepara en forma de una base libre, opcionalmente convertir la base libre en una sal de adición ácida.

La invención divulga además un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula (9) como se define en la presente, el proceso comprende:

(a-ii) la reacción de un compuesto de la fórmula (7) como se define en la presente, con un compuesto de la fórmula 10 (8) como se define en la presente, en presencia de un catalizador de metal de transición.

La reacción del compuesto de la fórmula (7) con el compuesto de la fórmula (8) es un ejemplo de una cicloadición 2+2+2 (ver la revisión de C. P. Dell, J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1998, 3873-3905 y las referencias en la misma). La reacción se lleva a cabo típicamente en un solvente inerte tal como tolueno, con calentamiento (por ejemplo a

15 una temperatura en el intervalo de temperatura ambiente a 100 °C) en presencia de un catalizador de metal de transición. Un catalizador preferido es el catalizador de Wilkinson -clorotris (trifenilfosfina) rodio (RhCI(PPh3)3).

En una realización particular, el compuesto de la fórmula (8) es un compuesto de la fórmula (8a):

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en donde R1 es como se define en la presente, y preferiblemente es metilo o etilo.

20 El compuesto de la fórmula (8a) puede prepararse reaccionando bromuro de propargilo con un compuesto de la fórmula (22) (ver Esquema 2) en un solvente polar tal como acetona en presencia de una base como carbonato potásico.

En una realización, R1 es metilo, es decir el proceso se usa para preparar el compuesto de la fórmula (1).

En otra realización, R1 es etilo.

25 En las fórmulas (7) y (9), R4' se selecciona de los grupos hidrógeno, halógeno, C1-5 alquilo, C2-5 alquenilo y C3-4 cicloalquilo. En una realización preferida, R4' es isopropilo o isopropenilo, y más particularmente es isopropenilo.

Actividad biológica y Usos Terapéuticos

La sal de lactato del compuesto de fórmula (1) es un inhibidor de Hsp90 y por consiguiente será beneficioso en el tratamiento de un amplio espectro de trastornos proliferativos cuando se usa en combinación con uno o más agentes 30 terapéuticos diferentes. Los ejemplos de tales trastornos proliferativos no se limitan a, pero pueden seleccionarse de un carcinoma, por ejemplo, un carcinoma de la vejiga, mama, colon (por ejemplo, carcinomas colorrectales tales como adenocarcinoma de colon y adenoma de colon), riñón, epidermis, hígado, pulmón, por ejemplo,

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de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La resistencia adquirida a los inhibidores de la tirosina quinasa está en algunos casos mediada por una segunda mutación, T790M. Los antibióticos de ansamicina, tal como geldanamicina, inhiben potentemente la proteína 90 de choque térmico (Hsp90), promoviendo la degradación mediada por ubiquitina de quinasas oncogénicas que requieren de la chaperona para el plegamiento conformacional adecuado. La exposición de líneas celulares EGFR-mutantes a geldanamicina indujo una marcada reducción de fosfo-Akt y ciclina D1, así como apoptosis. Estos datos sugieren que la activación mutacional de EGFR está asociada con la dependencia de Hsp90 para la estabilidad y la inhibición de Hsp90 puede representar una nueva estrategia para el tratamiento de NSCLC EGFR-mutante.

Leucemia mieloide crónica

La proteína aberrante BCR-Abl se forma a través de una translocación cromosómica y los resultados en un dominio de Abl quinasa constitutivamente activo. Este evento de translocación mostró ser causal para CML. P210BcrAbl es una proteína cliente conocida para Hsp90. El tratamiento de la línea de células K562 para BCR-Abl con inhibidor de hsp90 indujo apoptosis. El inhibidor Gleevec de Bcr-Abl ® induce además apoptosis en células K562; sin embargo las células K562 resistentes a Gleevec® mantienen aún sensibilidad hacia los inhibidores de la Hsp90 (Gorre y otros 2002, Blood 100: 3041-3044).

Cáncer de próstata dependiente del receptor de andrógeno

La quinasa receptor de andrógeno es una proteína cliente de la Hsp90. La terapia de reemplazo de hormona se adopta generalmente cuando la cirugía no resuelve el cáncer. El cáncer puede volverse refractario a la manipulación de la hormona a través de mutación del receptor. La regulación de la Hsp90 puede ser viable aún después de la mutación.

Lo mismo puede aplicarse a los cánceres de mama dependientes de estrógeno.

Leucemia mieloide aguda dependiente de Flt3

La duplicación interna del receptor tirosina quinasa Flt3 conduce a su activación constitutiva y oncogénesis. Estas duplicaciones internas se observan en el 20% de todos los casos informados de AML y son una indicación de mal pronóstico. Al igual que la activación de la quinasa ABL en CML, este representa otro ejemplo de una sola lesión genética que da lugar a una enfermedad maligna. Se prevé que los inhibidores de la Hsp90 sean de beneficio clínico para esos pacientes ya que Flt3 es una proteína cliente de Hsp90 (Bali y otros, 2004 Cancer Res. 64(10):3645-52).

Melanoma asociado con la mutación de Braf

Braf codifica para una serina/treonina quinasa que está mutada en 70% de todos los melanomas. El 80% de estos representan una sola mutación puntual de V599E que confiere elevada actividad quinasa a BRAF. Esta mutación es además transformadora en células NIH3T3 (Bignell y otros, 2002 Nature. 417(6892):949-54).

Mieloma múltiple

El inhibidor de Hsp90 17-AAG inhibe potentemente la proliferación de líneas celulares de mieloma múltiple refractario y sensible a bortezomib. Los niveles de superficie celular de IGF-1R y IL-6R se disminuyeron además en las células MM-1 tratadas con 17-aag (Mitsiades y otros, Blood 107:1092-1100, 2006). La estimulación autocrina de células de mieloma múltiple, así como la estimulación paracrina de las células estromales de médula ósea con IL-6 se disminuye además a través de la regulación negativa de IKK cliente de Hsp90.

Mieloma múltiple refractario a Velcade

Los compuestos inhibidores de Hsp90 que son la sal de lactato del compuesto de la fórmula (1) (particularmente el L-lactato) y formas cristalinas de este pueden usarse en el tratamiento de tipos de tumores refractarios a velcade que incluyen el tratamiento con segunda línea de pacientes de linfoma de células del manto, linfoma no-Hodgkin indolente, carcinoma Bronquioloalveolar en la etapa IIIB y IV, cáncer de pulmón de células no pequeñas avanzado, cánceres de mama, próstata y ovario y linfoma no Hodgkin.

Tumores del estroma gastrointestinal (GIST)

La enfermedad particularmente la enfermedad de GIST depende de la activación del factor de crecimiento o sobreexpresión (por ejemplo c-kit)

Otras condiciones o trastornos para los que un inhibidor de la Hsp90 puede ser de beneficio clínico incluyen, pero sin limitarse a:

Trastornos neurodegenerativos

La enfermedad de Huntington (HD) es un trastorno neurodegenerativo progresivo sin tratamiento efectivo La inhibición GA de la Hsp90 y la sobre regulación de las Hsp resultante son efectivas en la prevención de la agregación de la proteína de Huntington en las células neuronales. (Sittler y otros, 2001, Human Molecular Genetics, Vol. 10, núm. 12 1307-1315). La sobre-regulación de HSP puede ser además de beneficio clínico en otras enfermedades de plegamiento erróneo de proteínas, por ejemplo, CJD y la de Alzheimer.

Enfermedad inflamatoria, que incluye artritis reumatoide, Asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y enfermedad inflamatoria intestinal

GA mostró que disocia HSF-1 de Hsp90 conduciendo a la activación y translocación nuclear de HSF-1. Posteriormente HSF-1 actúa como un factor de transcripción para inducir HSP90 y Hsp70. La inducción de la Hsp70 implicó la resolución de la inflamación en un modelo murino de edema inducido ( lanaro y otros, 2004 Human Molecular Genetics, 2001, Vol. 10, núm. 12 1307-1315). Además, el tratamiento con GA inhibió la activación de quinasa IkappaB (IKK) por TNF-a o PMA. IkBa es un regulador de Nf-kB y Ap-1. (Broemer y otros 2004). AP-1 y NFkB es un factor de transcripción importante que conduce a la generación de citoquinas pro-inflamatorias (Yeo y otros, 2004 Biochem Biophys Res Commun. 30; 320(3):816-24). La estabilidad de los transcritos de citoquinas proinflamatorias se regula además a través de la inhibición de MapK p38 (Wax y otros, 2003. Rheumatism Vol. 48, No. 2, págs. 541-550).

Ateroesclerosis

Se conoce que las células inflamatorias e inmunes juegan un papel central en la iniciación y progresión de la aterosclerosis humana (Riganò y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci., 2007, 1107:1-10) y se ha propuesto que Hsp90 actúa como un autoantígeno en la aterosclerosis carotídea. Riganò y otros encontró anticuerpos específicos y células contra Hsp90 en el suero del 60% de los pacientes evaluados que sufrían de placas ateroscleróticas de carótida, pero no anticuerpos específicos y células T contra Hsp90 en el suero de pacientes sanos. Por lo tanto, los compuestos inhibidores de Hsp90 que son la sal de lactato del compuesto de fórmula (1) (particularmente el Llactato) y formas cristalinas de este deberían ser útiles en el tratamiento o prevención de la aterosclerosis.

Enfermedad asociada a la angiogénesis, que incluye pero sin limitarse a: angiogénesis tumoral, psoriasis, artritis reumatoide, y retinopatía diabética

La inducción de la angiogénesis es regulada por las proteínas clientes de Hsp90 eNOS y Akt en las células endoteliales (Sun y Liao, 2004 Arterioscler Thromb Vase Biol. 24(12):2238-44). La supresión del factor inducible por hipoxia (HIF)-1a puede deteriorar además el crecimiento, angiogénesis y maduración del vaso de tumores gástricos en un modelo murino. (Stoeltzing y otros, 2004 J Natl Cancer Inst; 96:946-956.).

Diabetes tipo I y tipo II

La inhibición de la Hsp90 tiene un efecto profundo en la señalización de Akt así como los e-nos. Estos son dos reguladores principales de la apoptosis inducida de células endoteliales en la diabetes tipo I inducida por la glucosa alta (Lin y otros, 2005 J Cell Biochem. 1; 94(1):194-201) y el desarrollo de la hipertensión en la diabetes tipo II (Kobayashi y otros, 2004 Hypertension. 44(6):956-62.).

Inmunosupresión y transplante

La inhibición de la Hsp90 mostró regular negativamente Lck, una tirosina quinasa específica de células T necesaria para su activación. (Yorgin y otros, 2000 J Immunol. 15; 164(6):2915-23.)

Enfermedad cardiaca

La isquemia cardiaca es la causa más común de muerte en el mundo occidental. Las Hsp, y sobre todo la Hsp70 (inducida por tratamiento con radicicol) mostraron actividad cardioprotectora en cardiomiocitos de ratas (Griffin y otros, 2004). La inhibición de la Hsp90 resulta en la liberación de HSF-1 del complejo chaperona y su posterior activación de los genes Hsp. La inhibición de la Hsp90 conduce además a la regulación negativa de HIF-1, que está involucrado en la patogénesis de la enfermedad isquémica del corazón y accidente cerebrovascular.

Enfermedad infecciosa

La NS2/3 proteasa de la Hepatitis C viral es una proteína cliente de la Hsp90 y la actividad de Hsp90 es requerida para la replicación y procesamiento viral (Whitney y otros, 2001. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 20;98(24):13931-5.).

Enfermedad parasitaria

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de la apoplejía.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método para la profilaxis o tratamiento de la apoplejía en un paciente tal como un mamífero (por ejemplo, humano), cuyo método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar como un agente neuroprotector.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método para prevenir o reducir el daño neuronal en un paciente que sufre de apoplejía, cuyo método comprende administrar al paciente una cantidad neuroprotectora efectiva de la combinación.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la prevención o reducción del riesgo de apoplejía en pacientes con riesgo de apoplejía, por ejemplo un paciente que exhibe uno cualquiera o más factores de riesgo seleccionados de inflamación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial, diabetes, hiperlipidemia y fibrilación auricular.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para la prevención o reducción del riesgo de apoplejía en pacientes con riesgo de apoplejía, por ejemplo un paciente que exhibe uno cualquiera o más factores de riesgo seleccionados de inflamación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial, diabetes, hiperlipidemia y fibrilación auricular.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método para la prevención o reducción del riesgo de apoplejía en pacientes con riesgo de apoplejía, por ejemplo un paciente que exhibe uno cualquiera o más factores de riesgo seleccionados de inflamación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial, diabetes, hiperlipidemia y fibrilación auricular, cuyo método comprende administrar al paciente una cantidad terapéutica efectiva de la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por una quinasa 5 dependiente de ciclina.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por una quinasa 5 dependiente de ciclina.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por una quinasa 5 dependiente de ciclina, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método para aliviar o reducir la incidencia de un estado de enfermedad o condición mediada por una quinasa 5 dependiente de ciclina, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad neurodegenerativa.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición caracterizada por niveles elevados de cdk5

o p35.

■ Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad neurodegenerativa.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición caracterizada por niveles elevados de cdk5 o p35.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método de profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, cuyo método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método de profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición mediada por cdk5 o p35, dicho estado de enfermedad o condición es distinto de la enfermedad neurodegenerativa, cuyo método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método de profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición caracterizada por niveles elevados de cdk5 o p35, cuyo método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de una neuropatía, tal como una neuropatía periférica, distinta de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de una neuropatía, tal como una neuropatía periférica, distinta de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en un método de profilaxis o tratamiento de una neuropatía, tal como una neuropatía periférica, distinta de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington o enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, cuyo método comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva de la combinación.

Actividad anti-fúngica, antiprotozoo, anti-viral y anti-parasítica

Las combinaciones de la presente invención tienen actividad antifúngica, actividad antiprotozoo y actividad antiparasítica.

En particular, la combinación es útil en el tratamiento de la infección por hongos patogénicos, protozoos y parásitos donde la infección por el patógeno se asocia normalmente con una respuesta de anticuerpo a HSP90.

En una realización, la invención proporciona combinaciones como se define en la presente para usar como agentes anti-fúngicos.

Los ejemplos de hongos incluyen los que son patógenos del hombre y otros animales, por ejemplo:

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especies de Candida tales como Candida albicans y Candida tropicalis;

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especies de Cryptococcus tales como Cryptococcus neoformans y Cryptococcal meningitis;

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especies de Aspergillus tales como Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus y Aspergillus niger,

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especies de Microsporum tales como Microsporum canis y Microsporum gypseum;

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especies de Epidermophyton;

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especies de Trichophyton tales como Trichophyton equinum, Trichophyton mentagrophytes y Trichophyton rubrum;

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Epidermophyton floccosum;

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Exophiala werneckii;

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especies de Fusarium tal como Fusarium solani;

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Sporothrix schenckii;

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especies de Penicillium tal como Penicillium rubrum;

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especies de Altermaria;

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Ceratocystis pilifera;

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Chrysosporium pruinosum;

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especies de Helminthsporium;

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Paecilomyces variotti;

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levaduras, por ejemplo, especies de Saccharomyces cerevisiae y Pityrosporum tales como Pityrosporum orbiculare y Pityrosporum ovale;

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especies de Histoplasma tal comoHistoplasma capsulatum;

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especies de Coccidiodes;

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especies de Paracoccidioides; y

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especies de Blastomyces.

En otra realización, la invención proporciona las combinaciones como se define en la presente para usar como agentes antiprotozoo. Los ejemplos de protozoos incluyen:

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Trypanosoma cruzi;

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especies de Leishmania; por ejemplo el complejo L. donovani (L. donovani, L. infantum, y L. chagasi); el complejo

L.

mexicana (3 especies principales -L. mexicana, L. amazonensis, y L. venezuelensis); L. tropica; L. major, L. aethiopica; y los subgéneros Viannia con cuatro especies principales (L. (V.) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (V.) panamensis, y L. (V.) peruviana);

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Toxoplasma gondii; y

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Trichomonas vaginalis.

En una realización adicional, la invención proporciona compuestos de la fórmula (I) y subgrupos de los mismos como se define en la presente para usar como agentes anti-parasíticos. Ejemplos de parásitos incluyen gusanos parasíticos tales como:

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lombrices parasíticas tales como Ascaris lumbricoides;

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platelmintos parasíticos tales como los gusanos tremátodos parasíticos, por ejemplo, Schistosoma mansoni La invención proporciona además entre otros:

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, protozoárica o parasítica (distinta de un estado de enfermedad o condición debido a Plasmodium falciparum), por ejemplo un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, protozoárica o parasítica (distinta de un estado de enfermedad o condición debido a Plasmodium falciparum), por ejemplo, un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90.

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Una combinación de la invención para usar en un método para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, protozoárica o parasítica (distinta de un estado de enfermedad o condición debido a Plasmodium falciparum), por ejemplo, un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, por ejemplo, un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, por ejemplo, un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90.

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Una combinación de la invención para usar en un método para la profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad o condición fúngica, por ejemplo, un estado de enfermedad o condición caracterizada por una respuesta del anticuerpo a Hsp90, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesite la combinación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para usar en prevenir, detener o revertir la infección de un animal (tal como un mamífero, por ejemplo un humano) por hongos patógenos.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para prevenir, detener o revertir la infección de un animal (tal como un mamífero, por ejemplo un humano) por hongos patógenos.

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Una combinación de la invención para usar en un método para prevenir, detener o revertir la infección de un animal (tal como un mamífero, por ejemplo un humano) por hongos patógenos, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combiación.

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Una combinación de la invención como se define en la presente para cualquiera de los usos y métodos que se exponen anteriormente, y como se describe en otras partes en la presente.

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El uso de una combinación de la invención como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para la profilaxis o tratamiento de cualquiera de los estados de enfermedad o condiciones descritas en la presente.

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Una combinación de la invención como se define en la presente con un agente terapéutico adicional que es un agente antifúngico (por ejemplo un agente antifúngico azol).

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Una combinación farmacéutica que comprende una combinación de la invención que incluye un agente terapéutico adicional que es un compuesto auxiliar que es un agente antifúngico (por ejemplo un agente antifúngico azol).

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Una combinación de la invención como se define en la presente en la que el agente terapéutico adicional es un agente antifúngico, un agente antiprotozoario o un agente antiparasitario para usar en prevenir, reducir o revertir el desarrollo de resistencia a un agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente anti-parasítico (preferiblemente un agente anti-fúngico).

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Una combinación de la invención en la que el agente terapéutico adicional un agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente anti-parasítico (preferiblemente un agente anti-fúngico) para usar en un método de prevenir o reducir el desarrollo de resistencia a un agente anti-fúngico, agente antiprotozoo o agente anti-parasítico en un paciente (por ejemplo, un paciente humano), cuyo método comprende administrar al paciente la combinación.

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Una combinación de la invención para usar en un método para la profilaxis o tratamiento (o alivio o reducción de la incidencia) de un estado de enfermedad o condición mediada por Hsp90, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita una combinación de un compuesto de la invención como se define en la presente con un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico, en donde el estado de enfermedad o condición mediada por Hsp90 es el desarrollo de resistencia al fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico.

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Una combinación de la invención para usar en un método para: (i) sensibilizar las células fúngicas, protozoáricas o parasíticas a un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico; (ii) aliviar o reducir la incidencia de resistencia a un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico; (iii) revertir la resistencia a un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico; (iv) potenciar la actividad de un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico; (v) retardar o prevenir la aparición de la resistencia a un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita una combinación de un compuesto de la invención como se define en la presente en donde el agente terapéutico adicional es el dicho fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o antiparasítico.

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Una combinación de la invención para usar en un método para el tratamiento de una enfermedad o condición fúngica, protozoárica o parasítica, el método comprende administrar a un sujeto que lo necesita la combinación de un compuesto de la invención en donde el agente terapéutico adicional es un fármaco anti-fúngico, antiprotozoo o anti-parasítico, el método se caracteriza por la ausencia de resistencia al fármaco.

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La candidiasis de órgano invasiva o profunda (por ejemplo, fungemia, endocarditis y endoftalmitis).

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Infecciones Crytpococcal tales como Cryptococcal meningitis.

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Histoplasmosis.

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Blastomycosis, una infección fúngica de los pulmones y ocasionalmente de la piel.

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Infecciones Fúngicas Invasivas en pacientes con sistemas inmunes debilitados o bajo tratamiento con fármacos contra el cáncer o contra-AID, por ejemplo, la Candidiasis Invasiva y Aspergillosis Invasiva.

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La Aspergillosis tal como Aspergillosis Alérgica Broncopulmonar.

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Aspergilloma.

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Infecciones Intertrigo (infecciones fúngicas que ocurren en los pliegues de la piel por ejemplo los dedos de pies o manos, en el área de la axila o en el área de la ingle).

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Maduramycosis (invasión fúngica de los tejidos del pie, conocido además como pie de madura).

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Coccidioidomycosis.

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Mucormycosis.

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Blastomycosis

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Geotrichosis.

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Chromoblastomycosis.

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Conidiosporosis.

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Histoplasmosis.

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Rhinosporidosis.

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Nocaidiosis.

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Para-actinomycosis.

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Penicilliosis.

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Monoliasis.

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Sporotrichosis.

Las infecciones fúngicas de particular interés son Candidiasis y Aspergillosis.

Los compuestos de la invención tienen además actividad anti-protozoo y actividad anti-parasítica. La actividad antiprotozoo de las combinaciones de la presente invención puede evaluarse por métodos convencionales, por ejemplo determinando la concentración inhibidora mínima (m.i.c.) o 50 % del nivel de inhibición (IC50).

Los ejemplos de enfermedades o condiciones parasíticas o por protozoos para el que las combinaciones de la invención pueden resultar ser útiles incluyen:

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La enfermedad de Chagas ((tripanosomiasis) -una infección causada por el parásito Trypanosoma cruzi.

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Ascariasis -una enfermedad humana causada por el ascaris lumbricoides parasítico Ascaris lumbricoides.

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Leishmaniasis -una enfermedad causada por parásitos del género Leishmania

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Toxoplasmosis -una enfermedad parasítica causada por el protozoo Toxoplasma gondii.

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Esquistosomiasis (bilharzia) -una enfermedad causada por el parásito Schistoma mansoni.

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Trichomoniasis -una enfermedad de transmisión sexual causada por el protozoo parasítico Trichomonas vaginalis.

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Virus Herpes simplex (HSV), por ejemplo, HSV-1 que causa ampollas febriles (herpes labial), gingivoestomatitis, queratitis por herpes, eczema herpético y encefalitis HSV) y HSV-2 que causa lesiones genitales, infecciones neonatales, meningitis por HSV, proctitis por HSV;

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Virus Varicella zoster (VZV), que causa la varicela, síndrome de varicela congénita y herpes;

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Epstein-Barr (EBV), que causa la mononucleosis infecciosa, linfoma de Burkitt y cáncer de nasofaringe;

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Citomegalovirus (CMV), por ejemplo citomegalovirus humano (HCMV);

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Virus Herpes humano 6 (HHV-6), que causa roséola infantil o exantema súbito

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Virus herpes humano 8 (HHV-8) o sarcoma de Kaposi asociado al virus herpes (KSHV), que se encuentra en la saliva de muchos pacientes con SIDA y asociado con sarcoma de Kaposi;

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Papovaviridae tales como el virus del polioma y virus del papiloma humano (HPV) ;

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Parvovirus;

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Poxvirus tal como virus Variola (virus de la viruela humana);

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Rhabdovirus tales como virus de la rabia y virus de la estomatitis vesicular (VSV); y

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Retrovirus tal como virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) que es responsable del síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA); y el virus linfotrópico T humano (HTLV).

Las infecciones virales particulares contra las que las combinación de la invención pueden ser usados incluyen virus herpes, virus pox, virus de Epstein-Barr, virus Sindbis, adenovirus, VIH (para la prevención del desarrollo del SIDA en individuos infectados con VIH), virus HPV, HCV y HCMV.

La infección viral puede ser distinta de una infección con virus de la hepatitis C (HCV).

La actividad de las combinaciones de la invención como agentes para bloquear o prevenir la replicación viral en los organismos huésped o células huésped puede determinarse de acuerdo con procedimientos estándar bien conocidos por la persona con experiencia en la materia.

Las combinaciones de la invención pueden incluir agentes anti-virales tales como aciclovir, ganciclovir, oseltamavir (Tamiflu®) y zanamavir (Relenza ®), amantadina, rimantadina, adefovir dipivoxil, interferones (por ejemplo, interferón alfa-2b e interferón alfa-2a pegilado), lamivudina, entecavir, ribavirina, famciclovir, valcicylovir, valaciclovir, azidotimidina (AZT -Retrovir ®), atazanavir, fosamprenavir, lamivudina, lamivudina + abacavir, tenofovir disoproxil fumarato, tenofovir disoproxil fumarato + emtricitabina, tipranavir, nelfinavir, indinavir, raltegravir, ritonavir, lopinavir + ritonavir, darunavir, amprenavir, enfuvirtida, saquinavir, hidroxiurea, VGV-1 y vacunas anti-virales.

En consecuencia, la invención proporciona además:

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Una combinación de la invención como se define en la presente en donde el agente terapéutico adicional es un agente antiviral.

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Una composición farmacéutica que comprende una combinación de la invención como se define en la presente en donde el agente terapéutico adicional es es un agente antiviral.

Formulaciones farmacéuticas

Mientras sea posible que el compuesto activo se administre solo, es preferible presentarlo como una composición farmacéutica (por ejemplo formulación) que comprende al menos un compuesto activo de la invención junto con uno

o más portadores, adyuvantes, excipientes, diluyentes, rellenos, tampones, estabilizantes, conservantes, lubricantes, u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por aquellos con experiencia en la materia y opcionalmente otros agentes terapéuticos o profilácticos, por ejemplo, agentes que reducen o alivian algunos de los efectos secundarios asociados con la quimioterapia. Los ejemplos particulares de tales agentes incluyen agentes antieméticos y agentes que previenen o reducen la duración de la neutropenia asociada a la quimioterapia y previenen las complicaciones que surgen de los niveles reducidos de glóbulos rojos o glóbulos blancos de la sangre, por ejemplo, eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), y factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF).

Así, la presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas, como se definió anteriormente, y métodos de preparación de una composición farmacéutica que comprende mezclar al menos un compuesto activo,

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como definido anteriormente, junto con uno o más portadores, excipientes, tampones, adyuvantes, estabilizantes, u otros materiales farmacéuticamente aceptables, como se describe en la presente.

El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente refiere a los compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico razonable, adecuados para usar en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, ser humano) sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, de acuerdo con una relación razonable de beneficio/riesgo. Cada portador, excipiente, etc. debe ser además "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes de la formulación.

En consecuencia, en un aspecto adicional, la invención proporciona el compuesto de la invención como se define en la presente y particularmente compuestos de las fórmulas (10) y (1) y y sus formas cristalinas y salinas como se define en la presente en la forma de composiciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en cualquier forma adecuada para la administración oral, parenteral, tópica, intranasal, oftálmica, ótica, rectal, intravaginal o transdérmica. Cuando las composiciones son pretendidas para administración parenteral, se pueden formular para la administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea o para el suministro directo en un órgano o tejido diana mediante inyección, infusión u otros medios de suministro. El suministro puede ser por inyección en bolo, infusión a corto plazo o infusión a largo plazo puede ser a través de suministro pasivo o a través del uso de una bomba de infusión adecuada.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección acuosas y no acuosas estériles que contienen agentes anti-oxidantes, tampones, bacteriostáticos, co-solventes, mezclas de solventes orgánicos, agentes de formación de complejos de ciclodextrina, agentes emulsionantes (para formar y estabilizar las formulaciones de emulsión), componentes de liposoma para formar liposomas, polímeros gelificables para la formación de geles poliméricos, protectores de la liofilización y combinaciones de agentes, entre otros, para estabilizar el ingrediente activo en una forma soluble y producir la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral pueden tomar además la forma de suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes (R.

G. Strickly, Solubilizing Excipients in oral and injectable formulations, Pharmaceutical Research, Vol 21(2) 2004, págs. 201-230).

Una molécula de fármaco que es ionizable puede solubilizarse a la concentración deseada por ajuste del pH si el pKa del fármaco está suficientemente lejos del valor de pH de la formulación. El intervalo de pH aceptable es 2-12 para la administración intravenosa e intramuscular, pero en la vía subcutánea el intervalo es pH 2.7-9.0. El pH de la solución es controlado por la forma salina del fármaco, ácidos/bases fuertes tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, o por soluciones de tampones incluyen pero sin limitarse a soluciones tampón formadas de glicina, citrato, acetato, maleato, succinato, histidina, fosfato, tris(hidroximetil)-aminometano-(TRIS), o carbonato.

La combinación de una solución acuosa y un solvente/agente tensioactivo orgánico soluble en agua (es decir, un cosolvente) se usa con frecuencia en formulaciones inyectables. Los solventes y agentes tensioactivos orgánicos solubles en agua usados en las formulaciones inyectables incluyen pero sin limitarse a propilenglicol, etanol, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, glicerina, dimetilacetamida (DMA), N-metil-2-pirrolidona (NMP; Pharmasolve), dimetilsulfóxido (DMSO), Solutol HS 15, Cremophor EL, Cremophor RH 60, y polisorbato 80. Tales formulaciones pueden generalmente, pero no siempre, diluirse antes de la inyección.

Propilenglicol, PEG 300, etanol, Cremophor EL, Cremophor RH 60, y polisorbato 80 son los solventes y agentes tensioactivos completamente orgánicos miscibles en agua usados en las formulaciones inyectables comercialmente disponibles y pueden usarse en combinaciones entre sí Las formulaciones orgánicas resultantes son diluidas generalmente, al menos 2-veces antes del bolo IV o infusión IV.

Como alternativa la solubilidad del agua aumentada puede lograrse a través de la formación de complejos moleculares con ciclodextrinas.

Los liposomas son vesículas esféricas cerradas compuestas de membranas de bicapa lipídica externa y un núcleo interno acuoso y con un diámetro total de <100 µm. En dependencia del nivel de hidrofobicidad, los fármacos moderadamente hidrofóbicos pueden solubilizarse por liposomas si el fármaco es encapsulado o intercalado dentro del liposoma. Los fármacos hidrofóbicos pueden solubilizarse por liposomas si la molécula de fármaco se vuelve una parte integral de la membrana de bicapa lípidica, y en este caso, el fármaco hidrofóbico es disuelto en la porción lipídica de la bicapa lipídica. Una formulación de liposomas típica contiene agua con fosfolípido a 5-20 mg/ml, un isotonicificador, un tampón de pH 5-8, y opcionalmente colesterol.

Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo frascos y ámpulas selladas, y pueden almacenarse en una condición seca por congelación (liofilizada) que requiere solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones inmediatamente antes del uso.

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Antes de la administración de un compuesto, un paciente puede ser seleccionado para determinar si una enfermedad o condición de la cual el paciente está o podría sufrir es una que podría ser susceptible al tratamiento con un compuesto que tiene actividad contra la Hsp90.

Por ejemplo, una muestra biológica que se toma de un paciente se puede analizar para determinar si una condición

o enfermedad, tal como el cáncer, que el paciente está o podría padecer es una que se caracteriza por una anomalía genética o expresión anormal de la proteína, lo que conduce a la mutación o sobre-activación de una proteína cliente de Hsp90. Ejemplos de tales anormalidades que resultan en la activación de las proteínas cliente de Hsp90 incluyen; translocación de Bcr-ABL, duplicación interna de Flt-3 y mutación de Braf, o sobre-expresión de ErbB2.

Así, el paciente puede someterse a una prueba de diagnóstico para detectar un marcador característico de la sobre regulación. El término diagnóstico incluye seleccionar. Por marcador incluimos marcadores genéticos que incluyen, por ejemplo, la medición de la composición del ADN para identificar mutaciones Braf, BCR-abl y Flt3 u otras proteínas clientes afectadas El término marcador incluye además proteínas tales como ErbB2, incluyendo los niveles

o concentraciones de la proteína o algunos fragmentos o producto de degradación y para las enzimas la actividad enzimática. Los niveles de proteína (por ejemplo, fosforilada o no) y ARNm de las proteínas mencionadas pueden evaluarse además para caracterizar un cambio en la actividad. Por ejemplo, el nivel de AKT fosforilada puede ser un indicador de la sensibilidad a los inhibidores de HSP90

Las pruebas de diagnóstico se conducen típicamente sobre una muestra biológica seleccionada de, por ejemplo, muestras de biopsias tumorales, muestras de sangre (aislamiento y enriquecimiento de células tumorales caladas), biopsias de heces, esputo, análisis cromosómico, fluido pleural, fluido peritoneal, lanzas o biopsia bucal o a partir de orina

El proceso de selección involucrará típicamente la secuenciación directa, análisis de micromatriz de oligonucleótidos

o proteínas, análisis proteómico por espectrometría de masas, técnicas o detección inmunohistoquímica usando un anticuerpo específico.

Los métodos de identificación y análisis de mutaciones y sobre regulación de proteínas son bien conocidos por una persona con experiencia en la materia. Los métodos de selección pueden incluir, pero sin limitarse a, métodos estándares tales como reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), hibridación in situ o inmunoelectrotransferencia.

En la selección por RT-PCR, el nivel de ARNm en el tumor se evalúa creando una copia de ADNc del ARNm seguido por la amplificación del ADNc por PCR. Los métodos de amplificación por PCR, la selección de cebadores y condiciones para la amplificación, son conocidos por una persona con experiencia en la materia. Las manipulaciones del ácido nucleico y PCR se llevan a cabo por métodos estándares, por ejemplo como se describe en Ausubel, F.M. y otros, ediciones. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc., o Innis, M.A. y otros, ediciones. PCR Protocols: a guide to methods and applications, 1990, Academic Press, San Diego. Las reacciones y manipulaciones que involucran ácidos nucleicos y técnicas se describen en Sambrook y otros, 2001, 3ra Edición, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Como alternativa un kit comercialmente disponible para RT-PCR (por ejemplo, Roche Molecular Biochemicals,) puede ser usado, o la metodología como se expone en las patentes de Estados Unidos 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659, 5,272,057, 5,882,864, y 6,218,529 y se incorporan en la presente como referencia.

Un ejemplo de una técnica de hibridación in situ para evaluar la expresión de ARNm podría ser la hibridación in situ con fluorescencia (FISH) (ver Angerer, 1987 Meth. Enzymol., 152: 649).

Generalmente, la hibridación in situ comprende las siguientes etapas principales: (1) fijación del tejido que se analiza, (2) tratamiento de prehibridación de la muestra para aumentar la accesibilidad del ácido nucleico objetivo, y para reducir la unión no específica, (3) hibridación de la mezcla de ácidos nucleicos a los ácidos nucleicos en el tejido o estructura biológica, (4) lavados post-hibridación para eliminar los fragmentos de ácido nucleico no unido en la hibridación, y (5) detección de los fragmentos de ácido nucleico hibridados. Las sondas usadas en tales aplicaciones se marcan típicamente, por ejemplo, con radioisótopos o indicadores fluorescentes. Las sondas preferidas son suficientemente largas, por ejemplo, de aproximadamente 50, 100, o 200 nucleótidos a aproximadamente 1000 o más nucleótidos, para permitir la hibridación específica con los ácido(s) nucleico(s) objetivo(s) en condiciones rigurosas. Las sondas FISH comercialmente disponibles existen además para la detección citogenética de reordenamientos cromosómicos, que pueden ser usados para detectar translocaciones Bcr-Abl y Flt3 dentro de las poblaciones de células de leucemia. Los métodos estándares para llevar a cabo la FISH se describen en Ausubel, F.M. y otros, eds. Current Protocols in Molecular Biology, 2004, John Wiley & Sons Inc y Fluorescence In Situ Hybridization: Technical Overview por John M. S. Bartlett en Molecular Diagnosis of Cancer, Methods and Protocols, 2da edición; ISBN: 1-59259-760-2; marzo 2004, págs. 077-088; Series: Methods in Molecular Medicine.

Los métodos para los perfiles de expresión génica se describen por (DePrimo y otros, BMC Cancer 2003, 3:3). En resumen, el protocolo es como sigue: el ADNc de doble cadena se sintetiza a partir del ARN total usando un

oligómero (dT) 24 para la síntesis de la primera cadena cebadora de ADNc, seguido por la síntesis de la segunda cadena de ADNc con cebadores hexámeros aleatorios. El ADNc de doble cadena se usa como un molde para la transcripción in vitro de ARNc usando ribonucleótidos biotinilados. El ARNc se fragmenta químicamente de acuerdo con los protocolos descritos por Affymetrix (Santa Clara, California, Estados Unidos), y después se hibridan durante

5 la noche en las Matrices del Genoma Humano.

Como alternativa, los productos proteicos expresados a partir de los ARNm pueden ensayarse por inmunohistoquímica de muestras tumorales, inmunoensayo en fase sólida con placas de microtitulación, transferencia de Western, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS de 2-dimensiones, ELISA, citometría de flujo y otros métodos conocidos en la materia para la detección de proteínas específicas. Los métodos de detección

10 podrían incluir el uso de anticuerpos específicos al sitio. Las personas con experiencia en la materia reconocerán todas esas técnicas bien conocidas para la detección del "cromosoma filadelfia" indicativo de la translocación BCR-ABL.

Por lo tanto, todas esas técnicas pueden usarse además para identificar tumores particularmente adecuados para el tratamiento con los compuestos de la invención.

15 Ejemplos

La invención será ahora ilustrada, pero no limitada, con referencia a realizaciones específicas descritas en los siguientes ejemplos.

En los ejemplos, se pueden usar las siguientes abreviaturas.

AcOH

Ácido acético

Boc

tert-butiloxicarbonilo

Bn

bencil

CDI

1,1-carbonildiimidazol

DMAW90

Mezcla de solventes: DCM: MeOH, AcOH, H2O (90:18:3:2)

DMAW120

Mezcla de solventes: DCM: MeOH, AcOH, H2O (120:18:3:2)

DMAW240

Mezcla de solventes: DCM: MeOH, AcOH, H2O (240:20:3:2)

DCM

Diclorometano

DMF

dimetilformamida

DMSO

sulfóxido de dimetilo

EDC

1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)-carbodiimida

Et3N

trietilamina

EtOAc

Acetato de etilo

Et2O

éter dietílico

h

hora(s)

HOAT

1-hidroxiazabenzotriazol

HOBt

1-hidroxibenzotriazol

MeCN

acetonitrilo

MeOH

Metanol

min.

minutos

Ms

mesilo

MsO

Mesilato

E. P.

éter de petróleo

PG

Grupo protector

t.a.

temperatura ambiente

SiO2

sílice

TBTU

N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio tetrafluoroborato

THF

Tetrahidrofurano

Los espectros de resonancia magnética de protones (1H RMN) se registraron en un instrumento Bruker AV400 que opera a 400.13 MHz, en DMSO-d6 o MeOH-d4 (como se indica) a 27 °C, a menos que se indique de cualquier otra forma y se reportan como sigue: desplazamiento químico δ/ppm (número de protones, multiplicidad donde

5 s=singulete, d=doblete, t=triplete, q=cuartete, m=multiplete, br=bamplio). El solvente prótico residual se usó como la referencia interna.

En los ejemplos, los compuestos preparados se caracterizaron por cromatografía líquida y espectroscopia de masa usando las condiciones del sistema y de operación establecidas más abajo. Donde los átomos con diferentes isótopos están presentes y una masa sencilla citada, la masa citada para el compuesto es la masa monoisotópica

10 (es decir, 35Cl; 79Br etc.). Se usaron diferentes sistemas, como se describe más abajo, y estos se equiparon con, y se establecieron para correrse bajo condiciones de operación muy similares. Las condiciones de operación usadas se describen además más abajo.

Descripción del sistema:

Sistema 1 (sistema analítico):

Sistema HPLC:

Waters 2795

Detector del espectro de masa :

Micromass Platform LC

Detector PDA:

Waters 2996 PDA

Sistema 2 (sistema preparativo y analítico):

Sistema HPLC:

Sistema Waters Fractionlynx

imagen36

Temperatura fuente:

120°C

Intervalo de exploración:

125-800 amu

Modo de ionización:

ElectroSpray Positivo, Negativo o Positivo & Negativo

Condiciones MS (Agilent systems):

Voltaje capilar:

4000 V (3500 V en ES Negativo)

Fragmentador/Ganancia:

150/1

Temp gas de secado/flujo:

350 °C/13.0 lmin-1

Presión del nebulizador:

50 psig

Intervalo de exploración:

125-800 amu

Modo de ionización:

ElectroSpray Positivo o Negativo

Los materiales de partida para cada uno de los ejemplos se encuentran comercialmente disponibles a menos que se especifique de cualquier otra forma. Ejemplo 1 Etapa 1 Metil éster del ácido 4-acetoxi-2-hidroxi-benzoico

imagen37

Resorcinol metil éster (50 g, 0.298 mol) y N,N-dimetil-4-aminopiridina (0.27 g, 0.0022 mol, 0.74 % en moles) se añadieron a tolueno 0.2 l seguido por anhídrido acético (30 ml, 0.318 mol). La solución se calentó hasta 50 °C por 2h. El solvente se eliminó por evaporación a 50 °C hasta un pequeño volumen y el residuo se azeotropizó once con tolueno. Al aceite residual se añadió inmediatamente tolueno (100 ml) mientras aún estaba caliente y la solución se

15 usó para la Etapa 2 sin purificación adicional.

Etapa 2

Metil éster del ácido 5-acetil-2,4-dihidroxi-benzoico

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5

10

15

20

25

30

35

40

Bromuro de bencilo (70 ml, 0.59 mol) se añadió a una mezcla agitada de metil 5-acetil-2,4-dihidroxibenzoato (60.7 g,

0.29 mol) y carbonato de potasio anhidro (87.8 g, 0.64 mol) en acetonitrilo (800 ml) y la mezcla se agitó y se mantuvo a reflujo por 16 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente la mezcla se vertió en agua (3 l) y se agitó vigorosamente por 2 horas. Los sólidos se recogieron por filtración, se enjuagaron con agua (2 l), se succionaron secos a presión reducida y se secaron hasta una masa constante en un horno de vacío a 60°C toda la noche para proporcionar metil 5-acetil-2,4-bis-benciloxibenzoato (112.1 g, 99%) como un sólido color crema. 1H RMN (DMSO-d6) 8.21 (1H, s), 7.55 (4H, m), 7.43 (4H, m), 7.37 (2H, m), 7.04 (1H, s), 5.38 (4H, s), 3.79 (3H, s), 2.48 (3H, s). MS: [M+H]+ 391.

Etapa 5

Metil éster del ácido 2,4-bis-benciloxi-5-isopropenil-benzoico

imagen39

Se añadió terc-butóxido de potasio (29.1 g, 0.26 mol) a una suspensión agitada de bromuro de metiltrifenilfosfonio

(92.8 g, 0.26 mol) en tetrahidrofurano anhidro (1 l) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por 10 minutos con lo cual se añadió metil 5-acetil-2,4-bis-benciloxibenzoato (78.0 g, 0.2 mol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente por unos 30 minutos adicionales. Metanol (100 ml) se añadió para apagar el iluro de fósforo en exceso y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar un aceite color naranja que cristalizó en reposo. El residuo se recristalizó a partir de metanol (330 ml). Los sólidos se recogieron mediante filtración por succión, se lavaron con metanol (50 ml) y se succionaron secos a presión reducida para proporcionar metil 2,4-bis-benciloxi-5-isopropenilbenzoato como agujas de color amarillo pálido. El licor madre depositó una segunda cosecha de material después de reposar toda la noche (rendimiento combinado : 56.55 g, 73%) 1H RMN (DMSO-d6) 7.59 (1H, s), 7.52 (2H, d), 7.64-7.32 (8H, m), 6.97 (1H, s), 5.28 (2H, s), 5.22 (2H, s), 5.09 (1H, s), 5.04 (1H, s), 3.76 (3H, s), 2.02 (3H, s). MS: [M+H]+ 389.

Una cosecha adicional del éster pudiera obtenerse como sigue. Los residuos de la cristalización se evaporaron hasta secarse al vacío y el sólido aceitoso se trató con 5% acetato de etilo en heptano (250 ml). Acetato de etilo se añadió en pequeñas porciones a la mezcla agitada vigorosamente hasta que el residuo depositó una gran cantidad de óxido de trifenilfosfina sólido. Los sólidos se eliminaron por filtración y el filtrado se evaporó hasta secarse al vacío para proporcionar un aceite color naranja. La recristalización a partir de metanol (como se describió anteriormente) proporcionó más metil 2,4-bis-benciloxi-5-isopropenil-benzoato como un sólido cristalino de color amarillo pálido (rendimiento total 85-90%).

Etapa 6

Ácido 2,4-bis-benciloxi-5-isopropenil-benzoico

imagen40

Hidróxido de potasio (10.96 g, 0.19 mmol) se añadió a una suspensión agitada de metil 2,4-bis-benciloxi-5isopropenil-benzoato (61.0 g, 0.16 mol) en metanol (750 ml) y agua (250 ml) y la mezcla se agitó y se mantuvo a reflujo por 16 horas. Después de enfriar, el solvente orgánico se eliminó al vacío y la mezcla se acidificó hasta pH 2

o por debajo por la adición de 2M ácido clorhídrico (200 ml). La mezcla se diluyó con agua (2 l) y se extrajo con acetato de etilo (2 l), la capa orgánica se separó y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar ácido 2,4-bisbenciloxi-5-isopropenil-benzoico (58.8 g, 100%) como un sólido incoloro. 1H RMN (DMSO-d6) 7.52 (2H, d), 7.47-7.29 (9H, m), 6.82 (1H, s), 5.20 (2H, s), 5.17 (2H, s), 5.06 (1H, s), 5.04 (1H, s), 2.03 (3H, s). MS: [M+H]+ 375.

Etapa 7

imagen41

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5

10

15

20

25

30

35

(NB. El producto en esta etapa es sensible al aire y se oscurece al contacto con el oxígeno. La solución de DMF se usó inmediatamente pero puede almacenarse mediante desgasificación y alamacenamiento bajo una atmósfera de N2)

Etapa 12

(2,4-Bis-benciloxi-5-isopropenil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona

imagen43

Una solución del resorcinol ácido (Etapa 6, 23.7 g, 63.4 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (10.21 g,66.7 mmol) se disolvieron en DMF (92 ml) y a esta solución se añadió N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida hidrocloruro (12.8 g, 66.8 mmol). La solución se agitó a t.a. por 40 min y esta solución se añadió a la solución de la amina de la Etapa 11 (66.8 mmol) junto con los lavados de DMF (5 ml). La solución se desgasificó y la solución se agitó a t.a. por 16 h. A la solución se añadió 10% K2CO3 (500 ml) y EtOAc (500 ml) y la fase orgánica se lavó secuencialmente con 10% K2CO3 (500 ml), agua (4 x 100 ml) y salmuera saturada (200 ml). La solución se evaporó hasta un pequeño volumen y se añadió 20% EtOAc en heptano (250 ml) y se almacenó a 0°C. El sólido que se había formado se eliminó por filtración, se lavó con heptano dos veces y se secó al vacío para dar el compuesto del título 35.05 g (94.4 %). 1H RMN (400 MHz, Me-d3-OD): 7.49-7.10 (m, 14H), 6.86 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.17 (d, J = 2.5 Hz, 4H), 5.09 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 4.88 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.54 (d, J = 16.0 Hz, 2H), 2.50 (s, 7H), 2.28 (d, J = 7.6 Hz, 3H), 2.11 (s, 3H).

Etapa 13

(2,4-Dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona

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El producto de la Etapa 12 (4.7 g) se disolvió en 1:1 MeOH/agua (98 ml) y después de purgar con N2 se añadieron 10% Pd/C y K2CO3 (2.38g, 17.2 mmol) y la suspensión se hidrogenó por 16 h bajo una atmósfera de H2. La solución se filtró y el solvente se evaporó. Al residuo se añadió 2M-HCl acuoso (40 ml) y la solución se lavó con 1:1 EtOAc/petrol (40 ml x 2) y después el pH se ajustó a pH 8.5 por la adición de NaOH y se añadió EtOAc (50 ml). La solución se calentó hasta 60 °C y la fase acuosa se eliminó. La fase orgánica caliente se lavó con agua (30 ml) y después se evaporó hasta un pequeño volumen (aprox. 5 ml) y se dejó reposar a t.a. 16h con siembra. Al material cristalino se añadió 1:1 EtOAc/ petrol (10 ml) y la mezcla se filtró y se secó para dar el compuesto del título como la base libre 1.76 g 1H RMN (400 MHz, Me-d3-OD): 7.29 (s, 3H), 7.19 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 4.91 (s, 4H), 3.56 (s, 2H), 3.28-3.15 (m, 1H), 2.53 (s, 8H), 2.31 (s, 3H), 1.23 (d, J = 6.9 Hz, 7H).

Etapa opcional 14

Purificación de (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona

En algunos lotes del producto, el compuesto del título (X = H en la fórmula) puede contener pequeñas cantidades de la impureza 2,4-dihidroxi-5-(2-hidroxiprop-2-il)-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona (X = OH en la fórmula). Las impurezas pueden eliminarse por el siguiente método.

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sodio, la capa orgánica se separó y el solvente se eliminó al vacío para proporcionar el producto el cual se obtuvo puro o se purificó por cromatografía de columna en sílice (eluyendo con mezclas de acetato de etilo en éter de petróleo o metanol en acetato de etilo como sea apropiado). MS: [M+H]+ 450

4B. Síntesis de 1-etil-4-prop-2-inil-piperazina

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A la 1-etilpiperazina (2.33 g, 20.2 mmol) y K2CO3 (2.79 g, 20.2 mmol) en acetona (27 ml) se añadió bromuro de propargilo (2.00 g, 13.5 mmol) en forma de gotas a 0 °C bajo N2. La reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La reacción se filtró y las sales se lavaron con una pequeña cantidad de acetona. Los filtrados se

10 combinaron y se evaporaron gradualmente hasta la concentración. El residuo se tomó en EtOAc y se lavó con agua. La fase acuosa se extrajo nuevamente con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. El producto se filtró y se evaporó hasta secarse para dejar un aceite color naranja pálido.

4C. Síntesis de (2,4-bis-benciloxi-5-isopropenil-fenil)-[5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona

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El compuesto del título se preparó usando el método del Ejemplo 5B excepto que la purificación se llevó a cabo usando cromatografía de columna en lugar de formación de sal. MS: [M+H]+ 602.

4D. Síntesis de (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona

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La hidrogenación de (2,4-bis-benciloxi-5-isopropenil-fenil)-[5-(4-etil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]metanona usando el método descrito en el Ejemplo 1 Etapa 13 excepto que se cambiaron los procedimientos de tratamiento final y purificación. Así, después de la hidrogenación, el catalizador se filtró y el filtrado se evaporó. Se añadieron agua y EtOAc al producto y la capa acuosa se neutralizó. El producto se extrajo después con EtOAc (x3).

25 Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. La solución resultante se filtró y se evaporó hasta secarse para dejar un sólido/aceite amarillo pálido. El producto se purificó por cromatografía de columna (elución en gradiente 100% DCM a 10 % MeOH en DCM) para producir el producto como un sólido amarillo pálido. MS: [M+H]+ 424.

Ejemplo 5

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Actividad anti-proliferativa

Las actividades anti-proliferativas de los compuestos de la invención pueden determinarse midiendo la capacidad de los compuestos para inhibir el crecimiento celular en un número de líneas celulares tal como la línea celular HCT116 de cáncer de colon humano La inhibición del crecimiento celular se midió usando el ensayo Alamar Blue (Nociari, M.5 M, Shalev, A., Benias, P., Russo, C. Journal of Immunological Methods 1998, 213, 157-167). El método se basa en la capacidad de las células viables para reducir la resazurina a su producto fluorescente resorufina. Para cada ensayo de proliferación, las células se colocaron en placas de 96 pocillos y se dejaron recuperar por 16 horas antes de la adición de los compuestos inhibidores por otras 72 horas. Al fina del período de incubación se añadió 10% (v/v) de Alamar Blue y se incubó por otras 6 horas antes de la determinación del producto fluorescente a 535nM

10 ex/590nM em. En el caso del ensayo celular no proliferativo, las células se mantuvieron en confluencia por 96 horas antes de la adición de los compuestos inhibidores por otras 72 horas. El número de células viables se determinó por el ensayo Alamar Blue como antes. Las líneas celulares pueden obtenerse a partir de la ECACC (Colección Europea de Cultivos célula).

El compuesto (1) tiene un valor IC50 de menos de 0.1 micromolar contra la línea celular HCT116.

15 La actividad anti-proliferativa de (2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2il]-metanona sal de L-lactato se probó en ensayos contra cien líneas celulares por Oncodesign (Dijon, Francia). Los valores IC50 contra cada línea celular se exponen en la tabla más abajo y las figuras en la tabla se refieren a las concentraciones nanomolares. Los compuestos se probaron hasta una concentración de 10,000 nanomolares.

N°

Líneas celulares Concentración del compuesto de prueba (nanomolar)

Sangre

1

ARH-77 >10000

2

BV-173 73

3

CCRF-CEM 107

4

CCRF-CEM/VLB >10000

5

Daudi 136

6

EHEB > 10000

7

HL-60 389

8

HL-60/R10 847

9

K-562 147

10

K-562/Gleevec 175

11

KCL-22 24

12

KG-1 > 10000

13

LAMA-84 1098

14

MC90 93

15

NAMALWA 93

16

OCI-Aml2 > 10000

17

Raji 881

18

Ramos 46

19

RPMI 8226 10

20

RPMI 8226/Dox40 213

21

SUP-B15 37

22

U-937 104

CEREBRO

23

CGL-1 > 10000

24

CGL-3 75

25

CGL-9 161

MAMA

26

CAMA-1 imagen55 22

27

Evsa-T imagen56 168

28

HCC1954 imagen57

28

29

MCF-7 imagen58 >10000

30

MCF-7/ras imagen59 166

31

MDA-MB-435 imagen60 122

32

MDA-MB-435S imagen61 26

33

ZR-75-1 imagen62 131

COLON

34

DLD-1 imagen63 56

35

HCT 116 imagen64 38

36

HCT-15 imagen65 >10000

37

LoVo imagen66 51

38

LS 174T imagen67 159

TEJIDO CONECTIVO

39

imagen68 SW-872 imagen69 >10000

CABEZA y CUELLO

0

imagen70 BB30-HNSCC imagen71 273

41

imagen72 BB49-HNSCC imagen73 146

42

imagen74 FaDu imagen75 29

43

imagen76 KB imagen77 48

44

imagen78 KB3 imagen79 48

45

imagen80 LB1617-HNSCC imagen81 139

46

imagen82 LB771-HNSCC imagen83 391

RIÑÓN

47

imagen84 A-498 imagen85 267

48

imagen86 BB64-RCC imagen87 >10000

49

imagen88 BB65-RCC imagen89 1251

50

imagen90 Caki-1 imagen91 > 10000

51

imagen92 LB1047-RCC imagen93 58

52

imagen94 LB996-RCC imagen95 158

HÍGADO

53

imagen96 Hep 3B2.1-7 imagen97 95

54

imagen98 SK-HEP-1 imagen99 > 10000

PULMÓN

55

A-427 130

56

Calu-1 270

57

imagen100 Calu-3 >10000

58

imagen101 Calu-6 32

59

imagen102 LB11-SCLC/OC1 17

60

imagen103 LB12-SCLC/OC2 52

61

imagen104 LB13-SCLC/OC3 21

62

imagen105 LB37-NSCLC 63

63

imagen106 LB61-NSCLC >10000

64

imagen107 NCI-H1299 587

65

imagen108 NCI-H460 118

66

imagen109 NCI-H520 98

67

imagen110 NCI-H596 84

68

imagen111 NCI-H69 162

69

imagen112 NCI-H82 >10000

70

imagen113 SK-MES-1 270

imagen114

imagen115 imagen116

OVARIO

71

Caov-3 94

72

IGROV-1 109

73

IGROV-1/CDDP 147

74

NIH:OVCAR-3 45

75

NIH:OVCAR-3/CPT20 >10000

76

PA-1 > 10000

PÁNCREAS

77

BxPC-3 196

78

Capan-2 144

79

PANC-1 327

PRÓSTATA

80

DU 145 85

81

LNCaP-FGC 78

PIEL

82

A-375 1481

83

A-375-SM 340

84

A-431 3799

85

BB74-MEL 162

86

CMEL-5 130

87

Hs 294T 219

88

LB1319-MEL 35

89

MALME-3M 157

90

SK-MEL-2 138

91

SK-MEL-5 185

92

UZG4-MEL 180

ESTÓMAGO

93

AGS 66

94

Hs 746T 34

95

KATO III 162

TIROIDES

96

imagen117 FTC-238 26

VEJIGA URINARIA

imagen118

5

10

15

20

25

30

(ix) 2% Formulación de gel tópico

imagen119

% p/p

Compuesto

2.00

Hidroxipropil metil celulosa (Methocel F4M)

2.50

Óxido de polietileno (Polyox WSR -205)

0.25

Propilenglicol

10.00

Metilparaben

0.15

Propilparaben

0.05

Agua purificada para

100.00

Ejemplo 10

Estudios de la estructura del cristal

El compuesto de la Fórmula (1) y sus sales existen en un número de diferentes formas cristalinas. Estas se han identificado y caracterizado usando los métodos descritos más abajo.

Métodos generales

Metodología de difracción de cristal simple

Los datos cristalográficos se recogieron a temperatura ambiente (20 °C) usando radiación sincrotrón (λ = 0.775 Å) a partir de un beamline ESRF ID23.1 equipado con ϕ goniómetro y un detector CCD Quantum 315 de ADSC. Las imágenes se recogieron en dos escáneres ϕ con ϕ=0-180° y Δϕ=1°, uno con alta dosis de radiación y uno con baja dosis. La distancia del detector al cristal fue 110 mm. La recogida de los datos se controló por el software ProDC y las imágenes se procesaron y escalaron por Dtrek.

Las estructuras cristalinas se resolvieron usando métodos directos implementados en SHELXS-97 y se refinaron por SHELXL-97. Los átomos de hidrógeno se generaron en motivos geométricos mientras que la localización del heteroátomo unido a los átomos de hidrógeno se confirmó por inspección de mapas de diferencia Fo-Fc. Los parámetros de posición y térmicos de los átomos de hidrógeno se restringieron para tomarse en los átomos no de hidrógeno correspondientes. El movimiento térmico de los átomos no de hidrógeno se modeló por factores térmicos anisótropos.

Metodología de difracción de polvo

Las muestras para recogida de datos de difracción de polvo de rayos X (XRPD) se trituraron gradualmente por un mortero de mármol y se cargaron en un capilar cristalográfico (de Hampton Research, Tipo cuarzo o vidrio 10, 0.4 o

0.7 mm de diámetro). Los patrones de difracción se recogieron a temperatura ambiente usando radiación CuKα (λ = 1.5418 Å) a partir de un ánodo rotativo Rigaku RU3HR, óptica confocal ósmica azul, goniómetro ¼ c y un detector de placa de imágenes Rigaku HTC. Se recogieron imágenes en 2D mientras rotaba el eje ϕ con un detector para la distancia del cristal de 250 mm. La recogida de los datos se controló por el software CrystalClear y las imágenes 2D se convirtieron a un gráfico de 1D (2θ vs. Intensdad) por Datasqueeze (intensidad promediada sobre el ángulo azimutal 0<χ<360° para intervalo 2θ 3-30° en etapas de 0.02°). En casa se usó el programa AstexXRPD para la manipulación y visualización de patrones XRPD 1D.

Determinación de la estequiometría de la sal por experimentos de valoración

En los siguientes ejemplos, que se relacionan con las sales y se da la estequiometría de la sal, la estequiometría se determinó usando el siguiente método de valoración.

Una solución (solución KCl/HCl) de 150 mM KCI y 20 mM HCl se preparó fresca para cada lote de los experimentos de valoración. Una alícuota de 1 ml de la solución se valoró y la curva de valoración potenciométrica así producida se usó como la curva control. Todas las valoraciones se realizaron a 25°C y con 300 mM KOH en etapas de 2 µl usando un pH metro Mettler Toledo MP220. Las lecturas del potencial de electrodo para 4 tampones estándar se 5 registraron antes y después del lote diario de medición. Las muestras de las sales del Compuesto (1) de (1-3 mg) se disolvieron en 1 ml de solución KCl/HCl y se evaluaron con agitación vigorosa usando un pequeño agitador magnético. Los potenciales del electrodo registrados se convirtieron en valores de pH usando una curva de calibración de 4 tampones estándar. Los datos de valoración de la muestra y control se procesaron para producir un gráfico Bjerrum en el intervalo de pH 2-12. El método de análisis y cálculo del gráfico de Bjerrum se describe en la

10 revisión "Physicochemical Profiling (Solubility, Permeability and Charge State)", A. Avdeef (Current Topics in Medicinal Chemistry 2001, p277-351).

La estequiometría de las sales del Compuesto (1) se dedujo a partir del nH (número de protones a pH=2) de partida, (es decir, la base libre inicia con -2 protones, la mono-sal con -1 protones (Compuesto (1)+ ácido-)), mientras que las sales dobles (Compuesto (1)2+ ácido2-o Compuesto (1)2+ 2* ácido-) inician a nH=0.

15 10A. Formas de sal de base libre (ejemplo comparativo)

(A-i) Forma cristalina de base libre FB1

Una solución saturada del Compuesto (1) en 1-butanol se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente un volumen 4x de di(isopropil) éter dio la forma cristalina FB1. Los análisis XRPD de la muestra fresca dio el patrón mostrado en la Figura 1 y los picos principales enumerados en la Tabla 1 más abajo.

20 Después de secar al aire por tres días, se obtuvo un nuevo patrón de XRPD que mostró que la forma cristalina FB1 se había convertido completamente en la forma cristalina FB3.

Tabla 1 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Forma FB1

2θ/°

d/Å l/%

5.52

15.99 100

9.44

9.36 5

11.05

8.00 6

11.99

7.38 4

15.21

5.82 16

16.11

5.50 16

16.72

5.30 11

17.09

5.18 8

18.21

4.87 19

19.23

4.61 6

19.73

4.50 9

20.29

4.37 16

21.09

4.21 5

2θ/°

d/Å l/%

26.72

3.33 3

(A-ii) Forma cristalina de base libre FB2

Una solución saturada del Compuesto (1) en THF se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente un volumen 4x de acetato de isopropilo da la forma cristalina FB2. El patrón de XRPD de una muestra fresca de la forma FB2 se muestra en la Figura 2 y los picos principales en el patrón de XRPD se enumeran en la Tabla 2 más abajo. La muestra se secó al aire por 3 días después de lo cual se obtuvo un nuevo patrón de XRPD: esto demostró que la forma cristalina FB2 cambió a la forma cristalina FB3.

Tabla 2. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) forma cristalina FB2

2θ/°

d/Å l%

5.35

16.49 100

6.73

13.13 2

10.40

8.50 3

10.67

8.28 4

14.68

6.03 13

17.00

5.24 11

18.26

4.85 8

18.61

4.76 10

18.87

4.70 8

19.24

4.61 7

19.86

4.47 18

20.15

4.40 16

21.13

4.20 9

21.44

4.14 7

26.86

3.32 3

10 (A-iii) Forma cristalina de base libre FB3

La forma cristalina FB3 se obtuvo a partir de las formas FB1 y FB2 como se describió anteriormente o por evaporación de una solución de la base libre. El patrón de XRPD para la forma cristalina FB3 se muestra en la Figura 3 y los picos principales se enumeran en la Tabla 3 más abajo. Se encontró que la forma cristalina FB3 era estable al aire y a 40°C y 75 % HR por al menos un mes.

Tabla 3. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) forma cristalina FB3

2θ/°

d/Å l/%

6.05

14.59 100

7.87

11.22 9

9.15

9.66 7

10.22

8.65 3

12.15

7.28 11

13.60

6.50 14

15.77

5.62 17

16.62

5.33 4

17.16

5.16 7

17.82

4.97 11

18.89

4.69 22

19.64

4.52 12

20.20

4.39 21

20.93

4.24 10

22.19

4.00 5

23.33

3.81 6

24.53

3.63 5

5 (A-iv) Forma cristalina de base libre FB4

La forma cristalina FB4 se observó en los experimentos de precipitación de soluciones de etanol del Compuesto (1). El análisis de rayos X del cristal simple mostró que la forma cristalina es un dihidrato. Una solución saturada del Compuesto (1) en etanol se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente un volumen 4x de isopropil éter dio la forma cristalina FB4 la que se encontró que era estable al aire. El patrón de

10 XRPD de la forma FB4 se muestra en la Figura 4 y los picos principales se enumeran en la Tabla 4 más abajo. Las coordenadas del átomo y diagrama de empaque del cristal están en la Figura 5 y Tabla 5.

Tabla 4. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) forma cristalina FB4 Tabla 5 Parámetros y coordenadas de la célula unitaria en formato cif para la estructura del cristal del Compuesto (1) forma cristalina FB4

2θ/°

d/Å l/%

6.29

14.04 100

8.91

9.92 12

9.96

8.87 14

12.62

7.01 4

14.11

6.27 16

16.11

5.50 14

17.11

5.18 10

17.40

5.09 5

17.88

4.96 8

18.48

4.80 17

19.33

4.59 4

19.91

4.46 10

20.35

4.36 8

21.57

4.12 23

22.46

3.95 13

23.59

3.77 14

24.88

3.58 17

27.25

3.27 9

grupo espacial: P42 /n

célula unitaria a 293K donde a, b & c tienen 5% s.u.:

a=b=28.2

c=6.0

alfa=beta=gamma=90

imagen120

imagen121

Coordenadas en formato cif :

imagen122

imagen123

loop_

_atom_site_label

_atom_site_type_symbol

_atom_site_fract_x

_atom_site_fract_y

_atom_site_fract_z

_atom_site_U_iso_or_equiv

_atom_site_adp_type

_atom_site_occupancy

_atom_site_symmetry_multiplicity

_atom_site_calc_flag

_atom_site_refinement_flags

_atom_site_disorder_assembly

_atom_site_disorder_group

C1 C 0.60531(14) 0.59657(13) 0.3978(7) 0.0816(11) Uani 1 1 d ...

H1A H 0.6390 0.5959 0.3641 0.098 Uiso 1 1 calc . . .

H1B H 0.6000 0.6175 0.5237 0.098 Uiso 1 1 calc . . .

N2 N 0.58709(11) 0.54841(11) 0.4433(6) 0.0845(10) Uani 1 1 d ...

C3 C 0.55080(14) 0.53422(15) 0.2788(8) 0.0924(13) Uani 1 1 d ...

H3A H 0.5207 0.5275 0.3505 0.111 Uiso 1 1 calc . . .

H3B H 0.5608 0.5065 0.1955 0.111 Uiso 1 1 calc . . .

C4 C 0.54727(14) 0.57663(14) 0.1322(7) 0.0838(11) Uani 1 1 d ...

C5 C 0.57724(14) 0.61201(14) 0.2011(7) 0.0801(11) Uani 1 1 d ...

C6 C 0.51860(15) 0.58333(16) -0.0535(8) 0.0921(13) Uani 1 1 d ...

H6 H 0.4985 0.5592 -0.1007 0.111 Uiso 1 1 calc . . .

C7 C 0.52000(15) 0.62568(18) -0.1672(8) 0.0926(13) Uani 1 1 d ...

C8 C 0.54951(17) 0.66174(16) -0.0895(8) 0.0966(13) Uani 1 1 d ...

H8 H 0.5497 0.6908 -0.1625 0.116 Uiso 1 1 calc . . .

C9 C 0.57843(16) 0.65525(16) 0.0930(8) 0.0935(13) Uani 1 1 d ...

H9 H 0.5983 0.6794 0.1423 0.112 Uiso 1 1 calc . . .

C10 C 0.49149(17) 0.63467(19) -0.3746(8) 0.1025(14) Uani 1 1 d ..

H10A H 0.5120 0.6491 -0.4853 0.123 Uiso 1 1 calc . . .

H10B H 0.4808 0.6045 -0.4336 0.123 Uiso 1 1 calc . . .

N11 N 0.44995(12) 0.66545(12) -0.3408(6) 0.0847(10) Uani 1 1 d ..

C12 C 0.41355(16) 0.64016(16) -0.2169(7) 0.0928(12) Uani 1 1 d ..

H12A H 0.4257 0.6319 -0.0708 0.111 Uiso 1 1 calc . . .

H12B H 0.4056 0.6110 -0.2941 0.111 Uiso 1 1 calc . . .

C13 C 0.36951(16) 0.67000(18) -0.1912(8) 0.1005(14) Uani 1 1 d ..

H13A H 0.3458 0.6524 -0.1081 0.121 Uiso 1 1 calc . . .

H13B H 0.3771 0.6985 -0.1080 0.121 Uiso 1 1 calc . . .

N14 N 0.35044(13) 0.68296(14) -0.4066(6) 0.0961(11) Uani 1 1 d ..

C15 C 0.38701(19) 0.70846(17) -0.5299(7) 0.1001(14) Uani 1 1 d ..

imagen124

H15A H 0.3953 0.7373 -0.4509 0.120 Uiso 1 1 calc . . .

H15B H 0.3749 0.7173 -0.6753 0.120 Uiso 1 1 calc . . . C16 C 0.43006(17) 0.67828(18) -0.5565(7) 0.0987(14) Uani 1 1 d ..

H16A H 0.4218 0.6497 -0.6376 0.118 Uiso 1 1 calc . . .

H16B H 0.4537 0.6954 -0.6425 0.118 Uiso 1 1 calc . . .

C17 C 0.3076(2) 0.7126(2) -0.3808(11) 0.137(2) Uani 1 1 d ...

H17A H 0.2836 0.6950 -0.3029 0.206 Uiso 1 1 calc . . .

H17B H 0.2959 0.7215 -0.5250 0.206 Uiso 1 1 calc . . .

H17C H 0.3154 0.7407 -0.2978 0.206 Uiso 1 1 calc . . .

C18 C 0.59855(15) 0.51789(15) 0.6047(8) 0.0896(12) Uani 1 1 d ...

019 0 0.57503(11) 0.47935(11) 0.6072(6) 0.1109(11) Uani 1 1 d ...

C20 C 0.63596(13) 0.52545(13) 0.7750(7) 0.0818(11) Uani 1 1 d ...

C21 C 0.64335(16) 0.48917(15) 0.9312(8) 0.0920(13) Uani 1 1 d ...

C22 C 0.67703(18) 0.49413(16) 1.0959(8) 0.0986(14) Uani 1 1 d . . .

H22 H 0.6811 0.4701 1.2002 0.118 Uiso 1 1 calc . . .

C23 C 0.70497(16) 0.53453(15) 1.1082(8) 0.0907(12) Uani 1 1 d . . .

C24 C 0.70021(15) 0.57066(15) 0.9542(8) 0.0877(12) Uani 1 1 d . B .

C25 C 0.66614(15) 0.56535(14) 0.7956(8) 0.0889(12) Uani 1 1 d . . .

H25 H 0.6624 0.5898 0.6929 0.107 Uiso 1 1 calc . . .

026 0 0.61807(14) 0.44835(11) 0.9277(7) 0.1192(12) Uani 1 1 d . . .

H26 H 0.5962 0.4508 0.8383 0.179 Uiso 1 1 calc R ..

027 O 0.73840(13) 0.53982(12) 1.2687(6) 0.1135(11) Uani 1 1 d . . .

H27 H 0.7403 0.5153 1.3418 0.170 Uiso 1 1 calc R ..

C28 C 0.73311(18) 0.61386(17) 0.9614(10) 0.1084(16) Uani 1 1 d . .

H28 H 0.7646 0.6017 1.0009 0.130 Uiso 1 1 calc . A 1

C29 C 0.7389(2) 0.6388(2) 0.7301(12) 0.107(3) Uani 0.775(12) 1 d P B 1

H29A H 0.7600 0.6654 0.7448 0.160 Uiso 0.78 1 calc P B 1

H29B H 0.7085 0.6497 0.6790 0.160 Uiso 0.78 1 calc P B 1

H29C H 0.7518 0.6167 0.6246 0.160 Uiso 0.78 1 calc P B 1

C30 C 0.7207(3) 0.6487(3) 1.1347(14) 0.120(3) Uani 0.775(12) 1 d P B 1

H30A H 0.7434 0.6741 1.1332 0.180 Uiso 0.78 1 calc P B 1

H30B H 0.7211 0.6336 1.2778 0.180 Uiso 0.78 1 calc P B 1

H30C H 0.6896 0.6612 1.1060 0.180 Uiso 0.78 1 calc P B 1

C29 C 0.6972(10) 0.6587(7) 0.927(11) 0.22(3) Uani 0.225(12) 1 d P B 2

C30 C 0.7740(7) 0.6111(12) 0.913(5) 0.147(13) Uani 0.225(12) 1 d P B 2

O1W O 0.75198(14) 0.46640(15) 1.5369(7) 0.1195(12) Uani 1 1 d D ..

H1W1 H 0.7317(14) 0.4461(18) 1.565(11) 0.16(3) Uiso 1 1 d D ..

H2W1 H 0.7750 0.4600 1.6200 0.220 Uiso 1 1 d D ..

02W O 0.31342(14) 0.60501(17) 0.3540(9) 0.1423(15) Uani 1 1 d D ..

H1W2 H 0.337(2) 0.595(3) 0.285(14) 0.220 Uiso 1 1 d D ..

H2W2 H 0.324(3) 0.629(2) 0.424(13) 0.220 Uiso 1 1 d D ..

(A-v) Forma cristalina de base libre FB5

La Forma FB5 es una forma inestable que se observó solamente en los experimentos de cristalización que involucran soluciones de isopropanol del Compuesto (1). La forma FB5 se transformó en FB6 al aire. Sin desear

5 estar atados por ninguna teoría, se cree que FB5 es un solvato de isopropanol.

La forma FB5 se formó preparando una solución saturada del Compuesto (1) en isopropanol a temperatura ambiente seguido por una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de acetato de isopropilo. El patrón de XRPD de una muestra fresca se muestra en la Figura 6 y los picos principales se enumeran en la Tabla 6 más abajo. Una muestra de FB5 se secó en aire por 2 días después de lo cual el análisis XRPD mostró conversión a la forma FB6.

10

Tabla 6 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) FB5

2θ/°

d/Å l/%

7.12

12.41 100

9.71

9.10 14

10.14

8.72 17

11.50

7.69 4

13.73

6.45 16

14.60

6.06 5

15.34

5.77 4

16.58

5.34 21

2θ/°

d/Å l/%

16.94

5.23 6

18.71

4.74 32

19.46

4.56 48

20.15

4.40 13

21.97

4.04 6

22.35

3.97 14

23.43

3.79 9

26.36

3.38 8

(A-vi) Forma cristalina de base libre FB6

La forma FB6 se observó solamente como un producto del envejecimiento de la forma FB5. La forma FB6 es estable en el aire. El patrón de XRPD de una muestra de la forma FB6 que se preparó dejando secar la forma FB5 por 2 días al aire se muestra en la Figura 7. Una lista de los picos principales se expone en la Tabla 7 más abajo.

Tabla 7 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) forma FB6

2θ/°

d/Å l/%

4.60

19.21 4

9.09

9.72 14

9.68

9.13 25

16.08

5.51 25

16.46

5.38 28

16.94

5.23 14

18.13

4.89 23

18.66

4.75 100

20.05

4.42 31

22.48

3.95 10

26.53

3.36 9

10B. Compuesto (1) Hidrocloruro 1:2 formas cristalinas de la sal (ejemplos comparativo)

(B-i) Compuesto (1) hidrocloruro -Forma FH1

EtOAc/HCl se añadió a 2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]metanona y después MeOH hasta que se formó una solución. El solvente se evaporó y se evaporó nuevamente con tolueno y después con MeOH hasta secarse, para producir 2,4-dihidroxi-5-isopropil-fenil)-[5-(4-metil-piperazin-1ilmetil)-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-metanona como la sal de di-HCl. Esta forma es muy higroscópica y se disuelve en la humedad del aire. El patrón de XRPD se muestra en la Figura 8 y los picos principales se exponen en la Tabla 8 más abajo.

Tabla 8 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) forma hidrocloruro -FH1

2θ/°

d/Å l/%

5.59

15.79 16

7.34

12.04 100

7.99

11.05 19

10.33

8.56 11

11.70

7.56 3

13.95

6.34 4

14.32

6.18 10

14.72

6.01 4

15.29

5.79 11

16.37

5.41 4

16.82

5.27 8

18.59

4.77 10

19.99

4.44 3

20.40

4.35 4

20.82

4.26 2

21.26

4.18 4

22.57

3.94 3

23.01

3.86 1

24.60

3.62 6

2θ/°

d/Å l/%

25.32

3.51 20

25.82

3.45 6

27.10

3.29 4

28.27

3.15 7

28.78

3.10 7

(B-ii) Compuesto (1) hidrocloruro -Forma FH2

La forma FH2 se observó en experimentos de precipitación con soluciones DMSO o DMF de la forma FH1. Esta forma se transforma en el aire en la forma FH3. Una solución saturada de la forma FH1 (B-i) en DMF se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de acetona dio la forma FH2. El patrón de XRPD de una muestra fresca de la forma FH2 se muestra en la Figura 9 y los picos principales se enumeran en la Tabla 9 más abajo. Una muestra de la forma FH2 se secó al aire por 2 días después de lo cual el análisis XRPD mostró que había ocurrido la conversión a la forma FH3.

Tabla 9 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) hidrocloruro forma FH2

2θ/°

d/Å l/%

3.40

25.99 100

6.04

14.62 3

6.81

12.97 81

9.03

9.78 29

11.84

7.47 20

13.01

6.80 3

13.69

6.46 4

15.70

5.64 10

16.10

5.50 31

16.59

5.34 8

17.17

5.16 4

18.13

4.89 14

20.84

4.26 23

2θ/°

d/Å l/%

21.39

4.15 6

21.87

4.06 8

23.19

3.83 13

23.94

3.71 14

24.78

3.59 6

25.65

3.47 18

25.97

3.43 6

26.94

3.31 5

27.59

3.23 3

28.06

3.18 5

29.53

3.02 6

(B-iii) Compuesto (1) hidrocloruro -Forma FH3

La forma FH3 se observó en experimentos de precipitación con soluciones etanol o isopropanol de la forma FH1 así como en la degradación de la forma FH2. La forma FH3 es estable al aire y a 40°C y 75 % HR por al menos un mes. La preparación de la forma FH3 se describe en el Ejemplo 3 anterior. El patrón de XRPD para la forma FH3 se muestra en la Figura 10 y los picos principales se enumeran en la Tabla 10.

Tabla 10 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) hidrocloruro Forma FH3

2θ/°

d/Å l/%

5.83

15.15 5

9.35

9.45 100

10.40

8.50 89

10.78

8.20 19

11.35

7.79 11

11.71

7.55 16

12.51

7.07 48

13.35

6.63 10

2θ/°

d/Å l/%

13.81

6.41 17

14.10

6.27 5

14.78

5.99 42

17.18

5.16 8

17.65

5.02 9

18.74

4.73 51

19.09

4.65 35

19.46

4.56 13

20.11

4.41 8

21.18

4.19 18

21.68

4.10 28

22.32

3.98 76

23.07

3.85 28

23.71

3.75 16

24.86

3.58 96

25.14

3.54 45

26.49

3.36 5

27.03

3.30 8

28.09

3.17 14

28.70

3.11 16

29.02

3.07 29

29.52

3.02 17

(B-iv) Compuesto (1) hidrocloruro -Forma FH4

La forma FH4 se observó solamente en un experimento precipitación (DMF/dioxano). Esta forma es inestable y se desintegra al aire. Una solución saturada de la forma FH1 en DMF se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de 1,4-dioxano dio la forma FH4. El patrón de XRPD de una muestra fresca de FH4 se muestra en la Figura 11 y los picos principales se enumeran en la Tabla 11 más abajo. La muestra se desintegró al aire.

Tabla 11 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) hidrocloruro -Forma FH4

2θ/°

d/Å l/%

7.04

12.55 31

9.89

8.93 10

11.62

7.61 100

12.30

7.19 10

13.27

6.67 8

14.14

6.26 14

15.54

5.70 57

16.06

5.51 17

16.68

5.31 34

17.99

4.93 13

18.54

4.78 26

19.24

4.61 19

20.73

4.28 43

22.26

3.99 28

22.94

3.87 27

23.36

3.81 13

23.77

3.74 35

24.63

3.61 12

25.07

3.55 36

25.72

3.46 8

26.91

3.31 15

27.63

3.23 11

imagen125

2θ/°

d/Å l/%

15.21

5.82 4

16.21

5.46 6

16.81

5.27 100

17.22

5.15 45

18.65

4.75 23

19.52

4.54 33

19.82

4.48 34

20.49

4.33 7

20.76

4.27 13

21.13

4.20 17

22.02

4.03 12

22.33

3.98 44

22.84

3.89 40

23.09

3.85 25

23.94

3.71 14

25.19

3.53 7

26.41

3.37 14

26.95

3.31 5

27.81

3.21 14

(C-ii) Compuesto (1) L-Lactato -Forma FL2

La forma FL2 se observó en experimentos de precipitación de soluciones de metanol de la forma FL1. El análisis de rayos X del cristal simple mostró que la forma FL2 está hidratada. Esta es nominalmente un tri-hidrato debido a que 5 hay 3 posiciones de agua en el cristal en la unidad asimétrica, pero no están ocupadas 100% a temperatura ambiente y humedad del laboratorio. Una solución saturada de la forma FL1 en metanol: agua 9:1 se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de acetona dio la forma FL2 la cual es estable al aire. El patrón de XRPD para la forma FL2 se muestra en la Figura 14 y los picos principales se enumeran en la Tabla 14 más abajo. Un diagrama de empaque del cristal se muestra en la Figura 15 y las

10 coordenadas del átomo se enumeran en la Tabla 15 más abajo.

Tabla 14 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) sal de lactato -forma FL2

2θ/°

d/Å l/%

8.03

11.00 29

10.71

8.26 53

11.98

7.38 90

13.13

6.74 49

15.39

5.75 29

16.09

5.50 32

16.61

5.33 42

17.26

5.13 37

18.17

4.88 20

18.82

4.71 56

20.40

4.35 40

21.01

4.22 49

21.53

4.12 27

22.34

3.98 100

22.56

3.94 73

23.71

3.75 82

24.30

3.66 8

24.65

3.61 12

26.56

3.35 13

27.70

3.22 21

28.29

3.15 16

Tabla 15 Parámetros y coordenadas de la célula unitaria en formato cif para la estructura del cristal del Compuesto

(1) sal de lactato -forma FL2

grupo espacial: P21

célula unitaria a 293K donde a, b, c & β tienen 5% s.u.:

a=5.8

b=16.6

c=14.9

beta=98

alfa=gamma=90

Coordenadas en formato cif :

loop_

_atom_site_label

_atom_site_type_symbol

_atom_site_fract_x

_atom_site_fract_y

_atom_site_fract_z

_atom_site_U_iso_or_equiv

_atom_site_adp_type

_atom_site_occupancy

_atom_site_symmetry_multiplicity

_atom_site_calc_flag

_atom_site_refinement_flags

_atom_site_disorder_assembly

_atom_site_disorder_group

C1 C -0.643(2) 1.1037(6) 0.6763(7) 0.097(3) Uani 1 1 d . . .

H1A H -0.6995 1.0577 0.6395 0.117 Uiso 1 1 calc . . .

H1B H -0.5231 1.1308 0.6484 0.117 Uiso 1 1 calc . . .

N2 N -0.5563(16) 1.0791(5) 0.7694(6) 0.096(2) Uani 1 1 d . . .

C3 C -0.692(3) 1.1148(8) 0.8352(8) 0.124(4) Uani 1 1 d . . .

H3A H -0.7713 1.0734 0.8651 0.148 Uiso 1 1 calc . . .

H3B H -0.5925 1.1454 0.8805 0.148 Uiso 1 1 calc . . .

C4 C -0.8553(19) 1.1667(7) 0.7825(7) 0.094(3) Uani 1 1 d . . .

C5 C -0.8393(19) 1.1609(6) 0.6900(7) 0.092(3) Uani 1 1 d . . .

C6 C -1.036(3) 1.2141(8) 0.8083(8) 0.110(3) Uani 1 1 d . . .

H6 H -1.0636 1.2139 0.8682 0.132 Uiso 1 1 calc . . .

C7 C -1.172(2) 1.2611(8) 0.7456(8) 0.105(3) Uani 1 1 d . . .

C8 C -1.145(2) 1.2560(8) 0.6564(9) 0.111(3) Uani 1 1 d . . .

H8 H -1.2387 1.2867 0.6138 0.133 Uiso 1 1 calc . . .

C9 C -0.979(2) 1.2053(9) 0.6287(7) 0.109(3) Uani 1 1 d . . .

H9 H -0.9640 1.2017 0.5677 0.130 Uiso 1 1 calc . . .

C10 C -1.3561(18) 1.3173(8) 0.7739(9) 0.106(3) Uani 1 1 d . . .

H10A H -1.4455 1.3402 0.7202 0.127 Uiso 1 1 calc . . .

H10B H -1.4617 1.2864 0.8055 0.127 Uiso 1 1 calc . . .

N11 N -1.2550(14) 1.3836(6) 0.8332(6) 0.096(2) Uani 1 1 d ...

C12 C -1.1136(17) 1.4353(6) 0.7839(7) 0.091(3) Uani 1 1 d ...

H12A H -1.2098 1.4591 0.7324 0.109 Uiso 1 1 calc . . .

H12B H -0.9935 1.4035 0.7615 0.109 Uiso 1 1 calc . . .

C13 C -1.0015(17) 1.5021(7) 0.8462(8) 0.100(3) Uani 1 1 d ...

H13A H -0.8991 1.4783 0.8961 0.121 Uiso 1 1 calc . . .

H13B H -0.9092 1.5368 0.8128 0.121 Uiso 1 1 calc . . .

N14 N -1.1853(15) 1.5509(5) 0.8822(6) 0.094(2) Uani 1 1 d ...

H14 H -1.2741 1.5755 0.8352 0.113 Uiso 1 1 calc . . .

C15 C -1.3350(18) 1.4966(7) 0.9279(7) 0.095(3) Uani 1 1 d ...

H15A H -1.4599 1.5276 0.9479 0.114 Uiso 1 1 calc . . .

H15B H -1.2441 1.4730 0.9808 0.114 Uiso 1 1 calc . . .

C16 C -1.4358(17) 1.4308(7) 0.8658(8) 0.098(3) Uani 1 1 d ...

H16A H -1.5310 1.3959 0.8977 0.117 Uiso 1 1 calc . . .

H16B H -1.5346 1.4542 0.8148 0.117 Uiso 1 1 calc . . .

C17 C -1.068(2) 1.6140(9) 0.9439(9) 0.119(4) Uani 1 1 d ...

H17A H -1.1835 1.6447 0.9694 0.178 Uiso 1 1 calc . . .

H17B H -0.9807 1.6492 0.9103 0.178 Uiso 1 1 calc . . .

H17C H -0.9658 1.5886 0.9916 0.178 Uiso 1 1 calc . . .

C18 C -0.382(2) 1.0287(9) 0.7999(8) 0.113(4) Uani 1 1 d ...

019 0 -0.345(2) 1.0216(8) 0.8837(6) 0.156(4) Uani 1 1 d ...

C20 C -0.228(2) 0.9847(6) 0.7418(7) 0.096(3) Uani 1 1 d ...

C21 C -0.069(3) 0.9286(9) 0.7863(9) 0.119(4) Uani 1 1 d ...

C22 C 0.064(2) 0.8867(9) 0.7367(9) 0.114(4) Uani 1 1 d ...

H22 H 0.1812 0.8547 0.7669 0.137 Uiso 1 1 calc . . .

C23 C 0.038(2) 0.8879(7) 0.6447(8) 0.097(3) Uani 1 1 d ...

C24 C -0.1201(18) 0.9425(7) 0.5972(8) 0.096(3) Uani 1 1 d. B .

C25 C -0.253(2) 0.9882(7) 0.6463(8) 0.100(3) Uani 1 1 d ...

H25 H -0.3632 1.0228 0.6160 0.120 Uiso 1 1 calc . . .

O26 O -0.036(2) 0.9229(9) 0.8775(6) 0.169(5) Uani 1 1 d ...

H26 H -0.1427 0.9456 0.8980 0.253 Uiso 1 1 calc R ..

O27 O 0.1658(15) 0.8404(5) 0.5948(6) 0.118(3) Uani 1 1 d ...

H27 H 0.2091 0.7999 0.6238 0.176 Uiso 1 1 calc R ..

C28 C -0.141(4) 0.9478(11) 0.4948(10) 0.138(6) Uani 1 1 d ...

H28 H -0.0894 0.8953 0.4750 0.166 Uiso 1 1 calc . A 1

C29 C -0.029(11) 1.004(4) 0.449(3) 0.24(3) Uani 0.58(6) 1 d P B 1

H29A H -0.0741 0.9976 0.3847 0.363 Uiso 0.58 1 calc P B 1

H29B H 0.1361 0.9972 0.4628 0.363 Uiso 0.58 1 calc P B 1

H29C H -0.0703 1.0575 0.4662 0.363 Uiso 0.58 1 calc P B 1

C30 C -0.417(7) 0.950(3) 0.4621(19) 0.159(19) Uani 0.58(6) 1 d P B 1

H30A H -0.4911 0.9083 0.4918 0.239 Uiso 0.58 1 calc P B 1

H30B H -0.4462 0.9424 0.3978 0.239 Uiso 0.58 1 calc P B 1

H30C H -0.4773 1.0016 0.4772 0.239 Uiso 0.58 1 calc P B 1

C29 C -0.156(11) 1.040(2) 0.465(2) 0.14(2) Uani 0.42(6) 1 d P B 2

H29D H -0.0071 1.0655 0.4814 0.215 Uiso 0.42 1 calc P B 2

H29E H -0.2703 1.0675 0.4943 0.215 Uiso 0.42 1 calc P B 2

H29F H -0.1983 1.0438 0.4003 0.215 Uiso 0.42 1 calc P B 2

C30 C -0.295(12) 0.897(4) 0.446(2) 0.150(19) Uani 0.42(6) 1 d P B 2

H30D H -0.3403 0.9185 0.3870 0.224 Uiso 0.42 1 calc P B 2

H30E H -0.4300 0.8910 0.4766 0.224 Uiso 0.42 1 calc P B 2

H30F H -0.2234 0.8451 0.4418 0.224 Uiso 0.42 1 calc P B 2

O1L O -1.5549(12) 1.6174(6) 0.7786(6) 0.124(3) Uani 1 1 d ...

O2L O -1.7419(12) 1.7087(6) 0.6890(7) 0.125(3) Uani 1 1 d ...

C1L C -1.5569(17) 1.6742(7) 0.7238(8) 0.098(3) Uani 1 1 d ...

C2L C -1.3365(17) 1.6989(8) 0.6926(9) 0.108(4) Uani 1 1 d ...

H2L H -1.3065 1.7549 0.7117 0.129 Uiso 1 1 calc . . .

C3L C -1.355(2) 1.6971(12) 0.5917(11) 0.143(5) Uani 1 1 d . . .

H3L1 H -1.2130 1.7162 0.5734 0.214 Uiso 1 1 calc . . .

H3L2 H -1.4813 1.7312 0.5662 0.214 Uiso 1 1 calc . . .

H3L3 H -1.3842 1.6429 0.5706 0.214 Uiso 1 1 calc . . .

O3L O -1.1538(13) 1.6538(7) 0.7316(8) 0.150(4) Uani 1 1 d ...

H3L H -1.0243 1.6711 0.7191 0.224 Uiso 1 1 d ...

O1W O -0.448(6) 1.237(6) 1.045(2) 0.45(5) Uani 0.78(6) 1 d P ..

O2W O 0.021(15) 0.8037(17) 0.9990(19) 0.74(7) Uani 1 1 d ...

O3W O -0.35(3) 0.773(9) 0.953(15) 0.77(8) Uani 0.22(6) 1 d P ..

(C-iii) Compuesto (1) L-Lactato -Forma FL3

La forma FL3 se observó en experimentos de precipitación de soluciones de THF de la forma FL1. La forma FL3 se transforma al aire en la forma FL1. Una solución saturada de la forma FL1 en THF se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de heptano dio la forma FL3. El patrón de XRPD de una muestra fresca de la forma FL3 se muestra en la Figura 16 y los picos principales se enumeran en la Tabla 16 más abajo. Una muestra de FL3 se secó al aire por 2 días después de lo cual el análisis XRPD mostró que había ocurrido la conversión a la forma FL1.

Tabla 16. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) sal de lactato -forma FL3

2θ/°

d/Å l/%

5.53

15.98 100

8.36

10.56 5

11.07

7.98 41

13.16

6.72 12

13.85

6.39 8

16.69

5.31 39

17.17

5.16 21

18.00

4.92 49

18.49

4.80 11

19.28

4.60 14

19.79

4.48 5

20.34

4.36 7

21.05

4.22 21

21.47

4.14 7

21.93

4.05 4

2θ/°

d/Å l/%

22.47

3.95 16

22.84

3.89 23

24.56

3.62 4

26.28

3.39 6

27.06

3.29 3

27.47

3.24 3

29.11

3.07 6

10D. Compuesto (1) formas cristalinas de la sal 1:1 sulfato (ejemplo comparativo)

(D-i) Compuesto (1) Sulfato -Forma FS1

La forma FS1 se observó en experimentos de cristalización que involucran acetonitrilo como el precipitante. Es inestable en el aire y se transforma en la forma FS3. Una solución saturada de la 1:1 sal del Compuesto (1) (preparada disolviendo el Compuesto (1) en H2SO4 y evaporando hasta secarse) en agua se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de acetonitrilo dio la forma FS1. El patrón de XRPD para FS1 se muestra en la Figura 17 y los picos principales se enumeran en la Tabla 17.

Tabla 17. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS1

2θ/°

d/Å l/%

4.79

18.45 100

10.02

8.82 28

10.68

8.28 3

11.28

7.84 10

12.89

6.86 6

14.38

6.15 34

15.27

5.80 12

16.91

5.24 17

17.64

5.02 7

18.29

4.85 11

18.86

4.70 3

2θ/°

d/Å l/%

19.28

4.60 4

20.12

4.41 10

20.82

4.26 8

21.21

4.19 3

21.76

4.08 10

22.32

3.98 13

22.89

3.88 7

23.83

3.73 5

24.22

3.67 3

24.42

3.64 3

25.13

3.54 8

29.04

3.07 8

Compuesto (1) Sulfato -Forma FS2

La forma FS2 es inestable en el aire y se transforma en la forma FS5. Si se mantiene a 40 °C y 75% HR, la forma FS2 se transforma a la forma FS4. El Compuesto (1) se disolvió en 1 mol equivalente de H2SO4 concentrado, precipitado con aproximadamente 4 volúmenes de acetonitrilo y la masa cristalina que se formó se filtró. El patrón de XRPD para FS2 se muestra en la Figura 18 y los picos principales se enumeran en la Tabla 18.

Tabla 18 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS2

2θ/°

d/Å l/%

4.17

21.20 2

7.03

12.57 24

7.43

11.89 100

8.09

10.92 11

8.67

10.19 90

9.27

9.54 17

9.65

9.16 19

2θ/°

d/Å l/%

10.41

8.49 7

10.98

8.05 6

11.76

7.52 31

12.53

7.06 5

13.84

6.40 26

14.55

6.08 8

15.39

5.75 16

16.24

5.45 4

16.89

5.25 7

17.50

5.06 26

18.05

4.91 17

18.93

4.68 16

19.47

4.56 16

23.20

3.83 24

24.21

3.67 19

25.21

3.53 10

25.75

3.46 14

26.62

3.35 13

27.67

3.22 13

Tabla 19 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS3

Compuesto (1) Sulfato -Forma FS3

La forma FS3 es una forma estable que se observó como producto de la forma FS1 Después del envejecimiento al aire y la transformación de la forma FS6 en un medio ambiente tibio y húmedo (40°C, 75% HR). El patrón de XRPD de una muestra de la forma FS3 que se preparó secar la forma FS1 por 2 días al aire se muestra en la Figura 19 y los picos principales se enumeran en la Tabla 19.

imagen126

2θ/°

d/Å l/%

4.81

18.36 17

5.43

16.25 100

10.30

8.58 48

11.24

7.87 24

12.94

6.84 5

13.98

6.33 7

14.26

6.21 26

14.91

5.94 33

15.62

5.67 12

16.41

5.40 56

17.53

5.05 26

18.38

4.82 28

18.61

4.76 40

19.01

4.66 22

19.38

4.58 10

19.92

4.45 30

20.27

4.38 13

20.71

4.28 6

21.19

4.19 9

21.77

4.08 31

22.67

3.92 20

23.79

3.74 19

24.23

3.67 27

25.36

3.51 21

2θ/°

d/Å l/%

27.38

3.25 6

28.82

3.09 9

Compuesto (1) Sulfato -Forma FS4

La forma FS4 es una forma estable que se observó solamente como un producto de la transformación de la forma FS2 en un medio ambiente tibio y húmedo (40°C, 75%RH). Un patrón de XRPD de una muestra de la forma FS4 que se preparó al incubar la forma FS2 por varias semanas a 40°C y 75% HR se muestra en la Figura 20 y los picos principales se enumeran en la Tabla 20.

Tabla 20. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS4

2θ/°

d/Å l/%

4.64

19.03 4

7.16

12.34 39

7.48

11.80 100

7.97

11.08 29

8.42

10.49 13

8.82

10.02 34

9.09

9.73 29

9.37

9.43 35

10.45

8.46 30

11.77

7.51 53

13.25

6.68 17

13.54

6.54 16

14.36

6.16 24

15.03

5.89 13

16.21

5.46 21

16.99

5.22 33

17.28

5.13 31

2θ/°

d/Å l/%

17.59

5.04 30

17.96

4.93 19

18.90

4.69 24

19.43

4.57 10

19.83

4.47 8

21.36

4.16 12

23.13

3.84 31

23.68

3.75 28

23.96

3.71 32

24.77

3.59 18

25.64

3.47 17

26.19

3.40 14

26.73

3.33 13

27.20

3.28 11

27.76

3.21 17

28.64

3.11 9

Tabla 21. Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS5

Compuesto (1) Sulfato -Forma FS5

La forma FS53 es una forma estable que se observó como un producto del envejecimiento de la forma FS2 al aire y la transformación de la forma FS4 en un medio ambiente seco (20°C, 11% HR). El patrón de XRPD de una muestra de la forma FS5 que se preparó dejando secar la forma FS2 por 2 días al aire se muestra en la Figura 21 y los picos principales se enumeran en la Tabla 21.

2θ/°

d/Å l/%

4.70

18.80 19

7.11

12.42 56

7.99

11.05 100

2θ/°

d/Å l/%

9.33

9.47 42

9.57

9.23 29

10.45

8.46 54

11.64

7.60 30

13.27

6.67 62

14.28

6.20 20

14.65

6.04 13

15.12

5.86 14

15.60

5.67 24

16.98

5.22 88

17.65

5.02 22

18.01

4.92 35

18.80

4.72 48

19.32

4.59 17

19.83

4.47 13

21.08

4.21 18

23.21

3.83 39

23.51

3.78 23

23.92

3.72 36

24.30

3.66 19

25.06

3.55 22

26.24

3.39 37

27.28

3.27 13

28.67

3.11 18

Compuesto (1) sulfato -Forma FS6

La forma FS6 se identificó en un número de experimentos de cristalización diferentes durante el tamizaje de la forma. Es estable al aire pero, en un medio ambiente tibio y húmedo (40°C, 75% HR), se transforma en la forma FS3.

Una solución saturada de la 1:1 sal de sulfato del Compuesto (1) (preparada disolviendo el Compuesto (1) en H2SO4 y evaporando hasta secarse) en DMF se preparó a temperatura ambiente. Una precipitación lenta con aproximadamente 4 volúmenes de tolueno dio la forma FS6. El patrón de XRPD para FS6 se muestra en la Figura 22 y los picos principales se enumeran en la Tabla 22.

Tabla 22 Picos XRPD principales para el Compuesto (1) Sulfato -Forma FS6

2θ/°

d/Å l/%

4.82

18.32 100

9.98

8.86 32

11.35

7.79 9

12.92

6.85 4

14.45

6.13 36

15.38

5.76 17

16.97

5.22 19

17.52

5.06 7

18.18

4.87 15

19.42

4.57 9

20.23

4.39 16

20.93

4.24 13

21.31

4.17 5

21.66

4.10 5

21.89

4.06 7

22.29

3.98 17

22.84

3.89 8

23.04

3.86 6

23.94

3.71 4

imagen127

La hiperalgesia mecánica puede ser examinada en un modelo de rata de dolor neuropático inducido por ligadura parcial del nervio ciático izquierdo. Aproximadamente 14 días después de la cirugía los umbrales de retiro mecánico de las dos patas ligada (ipsilateral) y no ligada (contralateral) se midieron antes de (predosis) y después de 10 minutos a 6 horas después de la administración del fármaco o vehículo. La reversión de la hiperalgesia en cada punto de tiempo se calculó de acuerdo con la fórmula:

imagen128

Todos los experimentos se realizaron usando grupos de 6 animales. Las concentraciones de la materia prima de los fármacos se disolvieron en agua destilada y se realizaron diluciones posteriores en 0.9% salina para la administración subcutánea en un volumen de 4 mlkg-1. Todos los fármacos se guardaron en viales plásticos y se

10 mantuvieron en la oscuridad.

Los análisis estadísticos se realizaron en las lecturas del umbral de retiro (g) usando ANOVA con mediciones repetidas seguido por la prueba HSD de Tukey. Eficacia se refiere a la máxima reversión de la hiperalgesia observada a las dosis usadas.

(iii) Probar los efectos de los compuestos de la fórmula (0) un modelo de dolor por cáncer de hueso en rata

15 A ratas hembra adultas se administran inyecciones intra-tibia de células de carcinoma de glándula mamaria de rata MRMZ-1 (3 µl, 107 células/ml). Los animales típicamente desarrollaron gradualmente hiperalgesia mecánica, alodinia mecánica (sensibilidad de la piel a estímulos no dañinos) y preservación de la pata trasera, comenzando el día 1214 después de la inyección de las células. Un compuesto de la fórmula (0) (por ejemplo a una dosis de 10 y 30 µg/kg s.c.) se administró 3 veces a la semana desde el día de la inyección de las células, y se determinó la extesión de la

20 inhibición de la preservación de la pata trasera y la alodinia mecánica en comparación con los controles tratados con el vehículo.

Equivalentes

Los ejemplos anteriores se presentan con el propósito de ilustrar la invención y no deben contruirse como impositivos de ninguna limitación del alcance de la invención.

25

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2