ES2661981T3

ES2661981T3 - Procedimiento de producción de una proteína

Info

Publication number: ES2661981T3
Application number: ES11848424.5T
Authority: ES
Inventors: Koichi Kawakami; Megumi Kurokawa; Keina Yamaguchi; Risa Ogawa; Masayoshi Tsukahara; Yoko Hayashi
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd; Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Current assignee: Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems; Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2010-12-15
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2018-04-04
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: BR112013014949B1; CN103261414A; RU2598255C2; JP6087148B2; PT2653540T; US20120196327A1; KR20140012035A; RU2013132448A; TR201802431T4; SG191124A1; TWI617664B; CA2820151A1; AU2011342161C1; EP2653540A1; US9102971B2; DK2653540T3; EP2653540A4; CA2820151C; CN107312796A; AU2011342161A1

Abstract

Procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende introducir en una célula de CHO en suspensión: (a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o (b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o (c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2; permitir que una transposasa actúe sobre las secuencias de transposón integrando así los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO para obtener una célula de CHO que expresa el anticuerpo; y cultivar en suspensión la célula de CHO.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de producción de una proteína.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para integrar un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de una célula de mamífero, que comprende introducir por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión, y un procedimiento para producir la proteína que comprende cultivar en suspensión una célula de mamífero en suspensión que produce la proteína, una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico.

Antecedentes de la técnica

La producción de proteínas exógenas mediante técnicas de ADN recombinante se utiliza en diversas industrias, tales como la industria farmacéutica y la industria alimentaria. En la mayoría de casos, se lleva a cabo la producción de proteínas recombinantes mediante la introducción de un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés en un hospedador, tal como Escherichia coli, levadura, célula de insecto, célula vegetal y célula animal, la selección de un transformante en el que se integra el vector de expresión en el cromosoma, y el cultivo adicional de la línea celular transformadas bajo condiciones de cultivo apropiados.

Sin embargo, con el fin de desarrollar un hospedador que pueda producir una proteína exógena eficientemente, resulta necesario seleccionar una célula hospedadora que presente una buena productividad de cada proteína de interés, de manera que se desea una innovación técnica adicional de las técnicas de producción de proteínas exógenas para cada huésped.

En los sistemas bacterianos, tales como Escherichia coli, y en los sistemas de levaduras, los cuales son diferentes de las células animales, las modificaciones postraduccionales, tales como la modificación de las cadenas sacáridas, resultan difíciles de conseguir en muchos casos y de esta manera provocan un problema en la producción de una proteína que presente su actividad.

Debido a que la proteína producida se somete a una modificación postraduccional, tal como la fosforilación y la adición de cadenas sacáridas en el sistema de insecto, dicho sistema presenta el mérito de que puede expresarse la proteína que presenta su actividad fisiológica original.

Sin embargo, debido a que la estructura de cadenas sacáridas de la proteína secretada es diferente de la de las células derivadas de mamíferos, la antigenicidad y similares se tornan problemáticas al aplicar la proteína al uso farmacéutico.

Además, debido a que se utiliza un virus recombinante en el sistema de células de insecto al introducir un gen exógeno, existe el problema de que su inactivación y contención del virus resultan necesarios desde el punto de vista de la seguridad.

En el sistema de células animales, pueden llevarse a cabo modificaciones postraduccionales, tales como la fosforilación, la adición de cadenas sacáridas y el pliegue, en proteínas derivadas de animales superiores, incluyendo el ser humano, de manera más similar a las producidas en el cuerpo in vivo. Dichas modificaciones postraduccionales exactas resultan necesarias para recrear la actividad fisiológica que presenta originalmente una proteína en su proteína recombinante, y habitualmente se aplica un sistema de producción de proteínas en el que se utiliza una célula de mamífero como huésped a productos farmacéuticos y similares que requieren dicha actividad fisiológica.

Sin embargo, un sistema de expresión de proteínas en el que se utiliza una célula de mamífero como huésped presenta generalmente una productividad baja y también provoca un problema de estabilidad de los genes introducidos en muchos casos. La mejora de la productividad de una proteína utilizando una célula de mamífero en cultivo como huésped no sólo resulta muy importante para producir medicamentos destinados al tratamiento, agentes diagnósticos y similares, sino que también contribuye en gran medida a la investigación y al desarrollo de los mismos. De esta manera, resulta urgente desarrollar un sistema de expresión génica que posibilite la fácil obtención de una línea celular de elevada productividad utilizando una célula de mamífero en cultivo, en particular una célula de ovario de hámster chino (célula CHO), a modo de huésped.

Un transposón es un elemento genético transponible que puede desplazarse de un locus a otro locus en el

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cromosoma. Un transposón es una herramienta potente para el estudio en biología molecular y genética y se utiliza con un propósito, tal como la mutagénesis, la captura génica y la preparación de individuos transgénicos, en insectos o nemátodos (por ejemplo Drosophila melanogaster o Caenorhabditis elegans) y plantas. Sin embargo, se ha desarrollado dicha técnica para los animales vertebrados, incluyendo las células de mamífero.

Sin embargo, en los últimos años se ha informado de transposones que también presentan actividades en los animales vertebrados y se ha demostrado que algunos de ellos presentan una actividad en las células de mamífero, tales como las células derivadas de ratón y del ser humano. Entre los ejemplos típicos se incluyen los transposones Tol1 (referencia de patente n° 1) y Tol2 (referencia no de patente n° 1) que se clonan a partir de un medaka (afanio), Sleeping Beauty reconstruido a partir de un transposón no autónomo existente en genoma de peces Onchorhynchus (referencia no de patente n° 2), un transposón artificial Frog Prince (referencia no de patente n° 3) que se deriva de la rana y el transposón piggyBac (referencia no de patente n° 4) que se deriva de insectos.

Dichos transposones de ADN han sido utilizados para la mutagénesis, la captura génica, la preparación de individuos transgénicos, la expresión de proteínas resistentes a fármacos y similares, como herramienta de introducción génica para producir un nuevo fenotipo en un genoma de una célula de mamífero (referencias no de patente n° 5 a n° 12).

En el caso de los insectos, se ha estudiado un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en el cromosoma del gusano de la seda utilizando el transposón piggyBac derivado de un insecto lepidóptero para expresar la proteína codificada por dicho gen exógeno y se ha dado a conocer un procedimiento de producción de proteínas utilizando las técnicas anteriormente indicadas (referencia de patente n° 2).

Sin embargo, debido a que la proteína de interés no se expresa a niveles suficientes y se produce en todo el cuerpo del gusano de la seda, provoca un problema económico debido a la necesidad de una técnica avanzada de purificación para recuperar la proteína exógena expresada en una forma altamente purificada a partir del líquido corporal, incluyendo una gran cantidad de proteínas contaminadas.

Además, es conocido un ejemplo en el que se expresa una proteína relacionada con la resistencia a G418 en una célula de mamífero utilizando el transposón Tol2 derivado de medaka (referencias no de patente n° 12 y n° 13).

En el caso de la producción de un fármaco de proteínas para el uso médico utilizando una célula en cultivo derivada de mamífero, resulta importante que un componente de origen animal no se encuentre contenido durante su procedimiento de producción con el fin de evitar la contaminación inesperada por un virus desconocido o polipéptido patogénico. La célula de CHO se utiliza más frecuentemente como célula animal para la producción de un fármaco de proteínas y gracias a los estudios realizados en los últimos años, también se ha establecido una línea de células de CHO en suspensión capaz de cultivar en un medio seguro que no utiliza un suero componente de origen animal. Sin embargo, la productividad de una línea celular en la que se ha introducido un gen bajo condiciones libres de suero o libres de proteínas se encuentra limitada a la mitad de la de la línea celular en la que un gen ha sido introducido bajo las condiciones de utilización de suero (literatura no de patente n° 14). Se demuestra que la transducción génica bajo condiciones libres de suero o libres de proteínas resulta técnicamente difícil.

En general se introduce un marcador seleccionable para cribar una célula que expresa una proteína de interés en el mismo vector de expresión génica. Lo anterior se basa en la hipótesis de que existe una región en la que un gen existente en el genoma se expresa fácilmente y una región en la que un gen presente en el genoma prácticamente no se expresa (denominados 'efectos de posición', literatura no de patente n° 15) y de que la proteína de interés también se expresa al expresarse el marcador seleccionable.

Por otra parte, en el caso de que una proteína de interés comprenda dos o más polipéptidos, tal como un anticuerpo y similares, es conocido además que cada polipéptido se expresa utilizando diferentes vectores. En el caso de un anticuerpo, se ha demostrado que la productividad es más alta en el caso de que la expresión de la cadena pesada del anticuerpo sea más elevada que la expresión de la cadena ligera (literatura no de patentes n° 16). Debido a que se predice que las expresiones de las cadenas pesada y ligera sean constantes en el mismo vector, resulta posible obtener una línea celular que expresa las cadenas pesada y ligera utilizando diferentes vectores con el fin de obtener una productividad elevada. Sin embargo, en el caso de que se exprese una proteína utilizando dos o más vectores diferentes, también resultan necesarios dos o más genes marcadores seleccionables.

Como medio para superar lo anterior, se informa de un caso en el que un gen dhfr originalmente consistente en una cadena polipeptídica se dividió en dos cadenas polipeptídicas y una de ellas se dispuso en un vector de expresión de cadena pesada y la otra se dispuso en un vector de expresión de cadena ligera (literatura no de patentes n° 17).

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Sin embargo, la célula indicada en la literatura no de patentes n° 17 es una célula de CHO que es dependiente del componente proteína añadido al medio y, tal como se ha indicado anteriormente, existe la posibilidad de que la eficiencia de introducción génica sea elevada, diferente del caso de la introducción génica bajo condiciones libres de suero o libres de proteínas. Se predice que la selección de una célula de alta productividad seguirá resultando difícil al introducir un gen bajo condiciones libres de suero o libres de proteínas con elevada seguridad y libres del peligro de infección vírica y similares.

[Listado de referencias!

[Literatura de patentesl

[Literatura de patentes n° 1] Documento n° WO 2008/072540.

[Literatura de patentes n° 2] Solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 2001-532188. [Literatura no de patentes!

[Literatura no de patentes n° 1] Nature 383:30, 1996.

[Literatura no de patentes n° 2] Cell 91, 501-510 (1997)

[Literatura no de patentes n° 3] Nucleic Acids Res, 31,6873-6881 (2003)

[Literatura no de patentes n° 4] Insect Mol.Biol.5, 141-151 (1996)

[Literatura no de patentes n° 5] Genetics.166, 895-899 (2004)

[Literatura no de patentes n° 6] PLoS Genet, 2, e169 (2006)

[Literatura no de patentes n° 7] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10769-10773 (1998)

[Literatura no de patentes n° 8] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6759-6764 (2001)

[Literatura no de patentes n° 9] Nature 436,221-22 6 (2005)

[Literatura no de patentes n° 10] Nucleic Acids Res., 31, 6873-6881 (2003)

[Literatura no de patentes n° 11] Nucleic Acids Res., 35, e87 (2007)

[Literatura no de patentes n° 12] Proc Natl. Acad Sci. USA, 103, 15008-15013 (2006)

[Literatura no de patentes n° 13] Plos Genetics, 2,1715-1724(2006)

[Literatura no de patentes n° 14] Biotech. Bioeng. 96, 1118-1126 (2007)

[Literatura no de patentes n° 15] Nature Biotech. 22, 1393-1398 (2004)

[Literatura no de patentes n° 16] Biotech. Bioeng. 96, 337-348 (2007)

[Literatura no de patentes n° 17] Biotech. Bioeng. 84,439-444 (2003)

Exposición de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Con el fin de producir y analizar una proteína de interés, resulta necesario seleccionar una línea celular que exprese establemente y a nivel elevado una proteína de interés utilizando una célula de cultivo derivada de mamífero. Sin embargo, la preparación y cultivo de la célula que produce la proteína de interés requiere considerable esfuerzo y tiempo.

Además, aunque es conocida la expresión de una proteína de interés en una célula de mamífero utilizando una secuencia de transposón, no se conoce la preparación de una célula que pueda expresar a nivel elevado una proteína de interés y que de esta manera pueda utilizarse como sistema de producción de proteínas mediante la utilización de una secuencia de transposón, no se conoce un procedimiento de preparación de una célula de mamífero que pueda producir a nivel elevado una proteína de interés mediante la utilización de una secuencia de transposón y no se conoce un procedimiento de producción de una proteína utilizando la célula.

Tal como se ha indicado anteriormente, existe la necesidad de expresar una proteína de interés en gran cantidad mediante el establecimiento de un sistema de producción de proteínas que pueda producir a nivel elevado la proteína de interés utilizando un cultivo celular de mamífero de manera eficiente y en un corto periodo de tiempo. Además, se ha deseado el establecimiento de una célula productora que no requiera ningún componente de origen animal entre la introducción génica y el establecimiento de la célula productora.

De esta manera, los objetivos de la invención son proporcionar una célula capaz de expresar a nivel elevado una proteína de interés que pueda establecerse eficientemente y un procedimiento para producir la proteína de interés utilizando la célula.

Medios para resolver los problemas

Con el fin de resolver los problemas anteriormente indicados, los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos y han encontrado como resultado que puede producirse eficientemente una proteína de interés mediante la introducción de por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de

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transposón en ambos extremos del fragmento génico en una célula de mamífero en suspensión y la integración del fragmento génico insertado entre un par (dos) de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero. Además, se ha encontrado que la proteína de interés puede producirse eficientemente mediante la utilización de la célula y de esta manera se ha llevado a cabo la invención.

Específicamente, la invención se refiere a lo siguiente:

1. Un procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende introducir en una célula de CHO en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2, permitiendo que actúe una transposasa sobre las secuencias de transposón, integrando de esta manera los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO con el fin de obtener una célula de CHO que expresa el anticuerpo y cultivando en suspensión la célula de CHO.

2. Un procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende las etapas (A) a (C) a continuación:

(A) introducir simultáneamente en una célula de CHO en suspensión:

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un AND codificante de una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2, y un vector de expresión que comprende un ADN que codifica una transposasa que

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reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma,

(B) obtener una célula de CHO en suspensión que expresa el anticuerpo mediante la expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión que se introduce en la célula de cHo en suspensión en la etapa (A) para integrar los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO, y

(C) cultivar en suspensión la célula de CHO en suspensión que expresa el anticuerpo obtenido en la etapa (B) para producir el anticuerpo,

3. Un procedimiento para obtener una célula de CHO en suspensión que expresa un anticuerpo, que comprende introducir en una célula de CHO en suspensión:

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de

nucleótidos de Tol2, y que permite que actúe una transposasas sobre las secuencias de transposón,

integrando de esta manera los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO.

4. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 3, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol2 son las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID n° 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 3.

5. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 3, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol1 son las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID n° 14 y las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEC ID n° 15.

6. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 5, anteriormente, en el que la célula de CHO en suspensión es una célula capaz de sobrevivir y proliferar en un medio libre de suero.

7. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 6, anteriormente, en el que la célula de CHO en suspensión es una célula de CHO adaptada para el cultivo en suspensión.

8. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 7, anteriormente, en el que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.

9. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 8, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a la cicloheximida.

10. El procedimiento descrito en el ítem 9, anteriormente, en el que el gen de resistencia a la cicloheximida es un gen codificante de un mutante de la proteína ribosómica humana L36.

11. El procedimiento descrito en cualquiera de los ítems 1 a 10, anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral, un antígeno relacionado con una alergia o inflamación, un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular, un antígeno que se relaciona con una enfermedad autoinmunitaria o un antígeno que relaciona con una infección bacteriana.

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12. Una célula de CHO en suspensión que presenta un cromosoma en el que se ha integrado:

(a) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

nucleótidos de Tol2 y que produce el anticuerpo y es capaz de sobrevivir y proliferar en un medio libre de

suero.

13. La célula de CHO indicada en el ítem 12, anteriormente, en le que la célula de CHO en suspensión es una célula de CHO adaptada para el cultivo en suspensión.

14. La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 12 y 13, anteriormente, en el que la célula de CHO es cualquier célula seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.

15. La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 12 a 14, anteriormente, en el que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a la cicloheximida.

16. La célula de CHO indicada en el ítem 15, anteriormente, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen codificante de un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.

17. La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 12 a 16, anteriormente, en el que el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral, un antígeno relacionado con una alergia o inflamación, un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular, un antígeno que se relaciona con una enfermedad autoinmunitaria o un antígeno que relaciona con una infección bacteriana.

18. La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 12 a 17, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol2 son la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 3.

19. La célula de CHO indicada en cualquiera de los ítems 12 a 17, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol1 son la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 14 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 15.

20. Utilización en un procedimiento para producir un anticuerpo de:

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento

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en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2.

21. La utilización indicada en el ítem 20, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol2 son la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 2 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 3, y

22. La utilización indicada en el ítem 20, anteriormente, en el que las secuencias de nucleótidos de Tol1 son las secuencias de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 14 y la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID n° 15.

Efecto de la invención

Según el procedimiento de producción de proteínas de la invención, puede producirse eficientemente una proteína de interés mediante la utilización de una célula de mamífero en suspensión. Además, la célula de la presente invención puede utilizarse como célula de producción para producir una proteína recombinante o un polipéptido recombinante con una elevada eficacia.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra una ilustración esquemática de un vector transposón para expresar un anticuerpo anti-M2 de influenza humano. Tol2-L representa un transposón Tol2 de extremo izquierdo (SEC ID n° 2), Tol2-R representa un transposón Tol2 de extremo derecho (SEC ID n° 3), CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano y CHX-r representa un gen de resistencia a la cicloheximida.

[Figura 2] La figura 2 muestra una ilustración esquemática de un vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano. CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano y CHX-r representa un gen de resistencia a cicloheximida.

[Figura 3] La figura 3 muestra una ilustración esquemática de un vector de expresión de transposasa Tol2. CAGGS representa un promotor de CAGGS; poliA representa un sitio de poliadenilación, y ADNc de TPasa representa un ADNc de la transposasa Tol2.

[Figura 4] La figura 4 muestra el resultado de examinar el nivel de expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humano en una suspensión de células de CHO-K1 y células de CHO-K1 adhesivas al utilizar un vector de transposón Tol2 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humano. La figura 4A representa el resultado de una suspensión de células de CHO-K1 y la figura 4B representa el resultado de células de CHO-K1 adhesivas. En ambas figuras, la ordenada muestra el nivel de producción de anticuerpo (pg/ml) y la abscisa muestra el número de clones transgénicos de cada célula.

[Figura 5] La figura 5 muestra una ilustración esquemática de un vector de transposón Tol1 para expresar el anticuerpo anti-M2 de influenza humana. Tol1-L representa un transposón Tol1 en el extremo izquierdo (SEC ID n° 14), Tol1-R representa un transposón Tol1 del extremo derecho (SEC ID n° 15); CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un ADNc de cadena H de anticuerpo humano; Lc representa un ADNc de cadena L de anticuerpo humano, y CHX-r representa un gen de resistencia a la cicloheximida.

[Figura 6] La figura 6 muestra una ilustración esquemática de un vector de expresión de la transposasa Tol1. CAGGS presenta un promotor CAGGS; poliA representa un sitio de poliadenilación y ADNc de TPasa representa un ADNc de la transposasa Tol1.

[Figura 7] La figura 7 muestra el resultado de examinar el nivel de expresión de un anticuerpo anti-M2 de influenza humano en una suspensión de células de CHO-K1 al utilizar un vector de transposón Tol1 para la expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza. La ordenada muestra el nivel de producción de anticuerpos

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(pg/ml) y la abscisa muestra el número de clones transgénicos de cada célula.

[Figura 8] La figura 8 muestra una ilustración esquemática de un vector transposón para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano. Tol2-L representa un transposón Tol2 de extremo izquierdo (SEC ID n° 2); Tol2-R representa un transposón Tol2 de extremo derecho (SEC ID n° 3); Pmo representa un promotor del virus de la leucemia murina de Moloney; poliA representa un sitio de poliadenilación y Hc representa un ADNc de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano (SEC ID n° 18).

[Figura 9] La figura 9 muestra una ilustración esquemática de un vector transposón para expresar cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano. Tol2-L representa un transposón Tol2 de extremo izquierdo (SEC ID n° 2); Tol2-R representa un transposón Tol2 de extremo derecho (SEC ID n° 3); CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación y Lc representa un ADNc de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano (SEC ID n° 2l).

[Figura 10] La figura 10 muestra una ilustración esquemática de un vector transposón para la expresión de un gen de resistencia a la cicloheximida. Tol2-L representa un transposón Tol2 de extremo izquierdo (SEC ID n° 2); Tol2-R representa un transposón Tol2 de extremo derecho (SEC ID n° 3); CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación y CHX-r representa un gen de resistencia a la cicloheximida (SEC ID n° 7).

[Figura 11] La figura 11 muestra el nivel de producción de anticuerpo anti-TNFa humano al introducir génicamente en una célula de CHO-K1 el vector en tándem TNFa-CHX o vector TNFaH-CHX y vector TNFaL. La ordenada muestra la concentración del anticuerpo (pg/ml) que es producida en el medio; el gráfico de control se indica como Control y el gráfico de ensayo se indica como Exp.

[Figura 12] La figura 12 muestra el nivel de producción de anticuerpo anti-CD20 humano al introducir génicamente en una célula de CHO-K1 el vector en tándem CD20-CHX o vector CH20H-CHX y vector CD20L. La ordenada muestra la concentración del anticuerpo (pg/ml) que se produce en el medio; el gráfico de control se indica como Control y el gráfico de ensayo se indica como Exp.

[Figura 13] La figura 13 muestra la estructura del vector A de expresión de anticuerpo. En la figura 13, Tol2-L representa un fragmento de ADN que comprende la secuencia de Tol2-L (SEC ID n° 2) y Tol2-R representa un fragmento de ADN que comprende la secuencia de Tol2-R (SEC ID n° 3); CMV representa un promotor del CMV; poliA representa un sitio de poliadenilación; Hc representa un gen de cadena pesada de anticuerpo de CD98; Lc representa un gen de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano; SO representa un promotor del SV40; SV representa un sitio de poliadenilación del SV40 y Neo-r representa un gen de resistencia a la neomicina.

Formas de realización para poner en práctica la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende introducir por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, en una célula de mamífero en suspensión; integrar el fragmento génico insertado entre un par (dos) de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero con el fin de obtener una célula de mamífero en suspensión que expresa dicha proteína de interés y cultivar en suspensión la célula de mamífero.

Los ejemplos del procedimiento para la producción de una proteína de interés en la presente invención (en adelante denominados procedimiento de la presente invención) comprenden un procedimiento para la producción de una proteína de interés, que comprende las etapas (A) a (C) siguientes.

(A) una etapa de introducción simultánea de los vectores de expresión (a) y (b) siguientes en una célula de mamífero en suspensión:

(a) por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón al interior de un cromosoma,

(B) una etapa de expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión (b) que se introduce en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (a) para integrar el fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero con el fin de obtener

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una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés y

(C)una etapa de cultivo en suspensión de la célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés obtenida en la etapa (B) con el fin de producir la proteína de interés.

Además, la presente invención se refiere a una célula de mamífero en suspensión, en la que se introduce por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión, con el fin de integrar el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en el cromosoma, y que produce la proteína de interés.

En la presente invención, la proteína de interés es una proteína que comprende uno o más polipéptidos, y según el procedimiento de la invención, puede llevar a cabo la expresión de la proteína de interés.

El vector o vectores de expresión que comprenden un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico se refiere a una o dos o más especies del vector de expresión. En particular, con el fin de expresar una proteína de interés que comprende dos o más polipéptidos, resulta necesario utilizar dos o más vectores que comprenden un fragmento génico que incluye un aDn que codifica los polipéptidos respectivos y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico.

Más particularmente, la proteína de interés anteriormente indicada que comprende dos o más polipéptidos es un anticuerpo. La cadena H y la cadena L del anticuerpo pueden expresarse utilizando un vector de expresión o pueden expresarse utilizando dos vectores de expresión: un vector que expresa la cadena H y un vector que expresa la cadena L, respectivamente.

Según el procedimiento de la presente invención, puede producirse una proteína de interés utilizando una célula de mamífero en suspensión que produce la proteína de interés, en la que un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón se integra en el cromosoma, mediante la introducción del vector de expresión que comprende un fragmento génico que incluye un ADN que codifica la proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico.

El gen marcador seleccionable que debe utilizarse como índice de inserción génica puede integrarse en el mismo vector como el vector de expresión que comprende el ADN que codifica la proteína de interés o puede integrarse en un vector diferente.

Es decir, por lo menos uno de los vectores de expresión que comprenden un fragmento génico que incluye un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico puede utilizarse como el vector de expresión que comprende un fragmento génico que incluye un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico.

Adicionalmente, además del vector de expresión que comprende un fragmento génico que incluye un ADN que codifica la proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, puede introducirse adicionalmente en una célula de mamífero un vector de expresión que comprende un fragmento génico que incluye un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico.

Específicamente, entre los ejemplos del procedimiento para producir una proteína de interés de la presente invención se incluye un procedimiento que comprende las etapas (A) a (C) a continuación:

(A) una etapa de introducción simultánea de los vectores de expresión (a) y (b) a continuación en una célula de mamífero en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y que presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma,

(B) una etapa de expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión (b) que se ha introducido en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A) con el fin de integrar el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero y obtener una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés, y

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Además, entre los ejemplos del procedimiento para producir una proteína de interés de la presente invención se incluye un procedimiento que comprende las etapas (A) a (C) a continuación:

(A) una etapa de introducción simultánea de los vectores de expresión (a), (b) y (c), a continuación, en una célula de mamífero en suspensión:

(a) por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b) un vector de expresión que comprende un marcador seleccionable y un par de secuencias de transposón en ambos extremos del marcador seleccionable,

(c) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y que presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón al interior de un cromosoma,

(B) una etapa de expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión (c) que se introduce en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A) para integrar el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero y obtener una célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés, y

(C) una etapa de cultivo en suspensión de la célula de mamífero en suspensión que expresa la proteína de interés obtenido en la etapa (B) para producir la proteína de interés.

La presente invención se refiere a una célula de mamífero en suspensión, en la que se introduce por lo menos un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un aDn que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un marcador seleccionable y un par de secuencias de transposón en ambos extremos del marcador seleccionable, para integrar el fragmento génico y el marcador seleccionable insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma, y que produce una proteína de interés.

Además, la presente invención se refiere a una célula de mamífero en suspensión en la que se introduce un vector de expresión de proteína que comprende un fragmento génico que comprende un aDn que codifica una proteína de interés y un marcador seleccionable, y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, a fin de integrar el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma, y que produce una proteína de interés.

Además, entre los ejemplos de la célula de mamífero en suspensión que produce una proteína de interés de la presente invención se incluyen una célula de mamífero en suspensión en la que un vector de expresión (a) que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y un gen marcador seleccionable y que comprende además secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector (b) que comprende un ADN que codifica una transposasa (una transferasa) que reconoce las secuencias de transposón y que presenta actividad de transferencia del fragmento génico insertado entre un par de las secuencias de transposón en un cromosoma para integrar el fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en el cromosoma se introducen simultáneamente y producen la proteína de interés.

Según la presente invención, el número de vectores de expresión que comprende un fragmento génico que incluye un ADN que codifica la proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, que debe introducirse en una célula de mamífero en suspensión, no se encuentra particularmente limitado con la condición de que la expresión y producción de la proteína de interés puedan ser llevadas a cabo por la célula de mamífero, y entre los ejemplos se incluye preferentemente 1 a 20 especies de vectores de expresión, más preferentemente pueden indicarse 2 a 10 especies de vectores de expresión y, por ejemplo, resultan preferentes 3 a 8 especies de vectores de expresión, 4 a 7 especies de vectores de expresión, 1 a 6 especies de vectores de expresión, 1 a 5 especies de vectores de expresión, 1 a 4 especies de vectores de expresión y 1 a 3 especies de vectores de expresión.

Además, entre los ejemplos de la puesta en práctica de la presente invención se incluye un procedimiento para incrementar la integración de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma de la célula de mamífero, mediante la introducción simultánea en la célula de mamífero en suspensión de por lo menos uno de entre (a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de

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transposón en ambos extremos del fragmento génico y (b) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa capaz de reconocer las secuencias de transposón y que presenta la actividad de introducir el fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón en un cromosoma, un procedimiento para integrar un ADN que codifica una proteína de interés en un cromosoma de la célula de mamífero a una frecuencia elevada y una célula de mamífero en suspensión que se obtiene mediante dichos procedimientos y que puede producir una proteína de interés.

El término "transposón" en la presente memoria es un elemento genético transponible y se refiere a una unidad génica que se desplaza dentro de un cromosoma o de un cromosoma a otro cromosoma (transposición) manteniendo simultáneamente una determinada estructura.

El transposón comprende secuencias de transposón repetitivas (también denominadas secuencias repetidas invertidas (secuencias RI) o secuencias repetidas invertidas terminales (secuencias RIT)) que se sitúa en la misma dirección o en dirección inversa en ambos extremos de una unidad génica y una secuencia de nucleótidos codificante de una transposasa que reconoce la secuencia de transposón para introducir un gen existente entre las secuencias de transposón.

La transposasa traducida a partir del transposón puede introducir un ADN mediante el reconocimiento de secuencias de transposón de ambos extremos del transposón, extrayendo el fragmento de ADN insertado entre un par de secuencias de transposón e insertando el fragmento en el sitio en que debe introducirse.

La expresión "secuencia de transposón" en la presente memoria se refiere a la secuencia de nucleótidos de un transposón reconocido por una transposasa y que presenta el mismo significado que la secuencia RI o la secuencia RIT. Un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos puede comprender una fracción repetida imperfecta con la condición de que pueda introducirse (insertarse en otra posición del genoma) mediante la actividad de una transposasa y exista una secuencia de transposón específica de una transposasa.

Como secuencia de transposón que debe utilizarse en la invención, se utiliza una secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones de tipo ADN naturales o artificiales que pueden ser reconocidos por una transposasa y transponerse en células de mamífero.

Las secuencias de nucleótidos derivadas de un transposón de tipo ADN son las secuencias de nucleótidos de Tol1 o las secuencias de nucleótidos de Tol2 derivadas del pez medaka.

En particular, entre ellos, las secuencias de nucleótidos derivadas del transposón Tol2 derivado del pez medaka que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 6 y el transposón Tol2 derivada del pez medaka que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 13 resultan preferidas.

Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2 se incluyen la secuencia de nucleótidos entre las posiciones 1 y 2.229 y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 4.148 a 4.682 en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en la SEC ID n° 6 del Listado de secuencias.

Como secuencia de nucleótidos derivada de un par de transposones Tol2, la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (SEC ID n° 2) (en adelante denominada "secuencia Tol2-L") y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 2.285 a 2.788 (SEC ID n° 3) (en adelante denominada "secuencia Tol2-R") de la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 mostrada en la SEC ID n° 1 del Listado de secuencias resultan más preferentes.

Como secuencia de transposón derivada de un par de transposones Tol1, entre los ejemplos se incluye la secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 157 y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1.748 a 1.855 en la secuencia de nucleótidos del transposón Tol1 mostrada en la SEC ID n° 13 del Listado de secuencias.

Como secuencia de transposón derivada de un par de transposones Tol1, la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (SEC ID n° 14) (en adelante denominada "secuencia Tol1-L") y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1.351 a 1.855 (SEC ID n° 15) (en adelante denominada "secuencia Tol1-R") de la secuencia de nucleótidos del transposón Tol1 mostrada en la SEC ID n° 13 del Listado de secuencias resultan preferentes.

Entre los ejemplos de la secuencia de transposón que debe utilizarse en la invención se incluyen secuencias de transposón en las que las reacciones de transposición se controlan mediante la utilización de una secuencia parcial de una secuencia de transposón derivada del transposón anteriormente indicado, mediante el ajuste de la longitud de la secuencia de nucleótidos y mediante la modificación de la secuencia de nucleótidos mediante adición, deleción o sustitución.

Como procedimiento para producir la proteína de interés de la presente invención, entre los ejemplos se incluye además un procedimiento en el que se produce por lo menos una de las proteínas de interés utilizando por lo menos dos secuencias de transposón y por lo menos dos transposasas.

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Específicamente, entre los ejemplos se incluye un procedimiento de producción de proteínas que comprende las etapas de introducir un vector que comprende un ADN que codifica una primera proteína de interés insertada entre dos secuencias de transposón Tol1, un vector que comprende un ADN que codifica una segunda proteína de interés insertada entre dos secuencias de transposón Tol2, un vector de expresión de transposasa Tol1 y un vector de expresión de transposasa Tol2, simultáneamente o en orden dentro del cromosoma de la célula de mamífero, obteniendo de esta manera una célula de mamífero que produce las dos proteínas de interés.

Además, la primera proteína de interés y la segunda proteína de interés pueden ser iguales y la productividad de la proteína de interés también puede mejorarse mediante el incremento del número de copias del gen que debe introducirse en la célula.

Con respecto al control de la reacción de transposición de un transposón, la reacción de transposición puede acelerarse o suprimirse mediante la aceleración o supresión del reconocimiento de la secuencia de transposón por una transposasa, respectivamente. Además, con respecto a la reacción de transposición del transposón, la reacción de transposición puede potenciarse mediante acortamiento de la longitud de la secuencia de nucleótidos insertada entre un par (dos) de las secuencias de transposón y la reacción de transposición puede reducirse mediante el alargamiento de la longitud. Por lo tanto, en el caso de que se exprese y se prepare una proteína de interés que comprenda una pluralidad de proteínas, las proteínas de interés pueden prepararse mediante la inserción de ADN que codifica cada proteína en un vector de expresión diferente, integrando el ADN en el cromosoma de la célula hospedadora y preparando una célula de mamífero en suspensión que sea capaz de preparar la proteína de interés con el fin de producir la proteína de interés mediante la utilización de la célula.

El término "transposasa" en la presente memoria se refiere a un enzima que reconoce secuencias de nucleótidos que presentan secuencias de transposón y que transfieren un fragmento génico existente entre las secuencias de nucleótidos en un cromosoma o de un cromosoma a otro cromosoma.

Entre los ejemplos de la transposasa se incluyen los enzimas derivados de Tol1 y Tol2, los cuales se derivan del pez medaka, Sleeping Beauty (SB) reconstruido a partir de un transposón no autónomo existente en el genoma de un pez Onchorhynchus, Sleeping Beauty 11 (SB11), el transposón artificial Frog Prince (FP), que se deriva de la rana, y el transposón PiggyBac (PB), que se deriva de un insecto.

Como transposasa, puede utilizarse un enzima nativo y puede utilizarse cualquier transposasa en la que se haya sustituido, eliminado, insertado y/o añadido una parte de sus aminoácidos, con la condición de que se mantenga la misma actividad de transposición que la transposasa. Mediante el control de la actividad enzimática de la transposasa puede controlarse la reacción de transposición del ADN existente entre las secuencias del transposón.

Con el fin de analizar si presenta o no una actividad de transposición similar a la de la transposasa, puede medirse mediante el sistema de análisis de 2 componentes dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 235575/2003.

En particular, si un elemento Tol2 no autónomo puede transferirse e insertarse en un cromosoma de la célula de mamífero o no mediante la actividad de una transposasa puede analizarse mediante la utilización separada de un plásmido que comprende un transposón Tol2 con eliminación de transposasa Tol2 (transposón no autónomo derivado de Tol2) y un plásmido que comprende la transposasa Tol2.

La expresión "transposón no autónomo" en la presente memoria se refiere a un transposón que ha perdido una transposasa existente dentro del transposón y, por lo tanto, no puede llevarse a cabo su transposición autónoma. El transposón no autónomo puede transferir el ADN insertado entre las secuencias de transposón desde el transposón no autónomo hasta el interior del cromosoma de la célula hospedadora, al permitir que una proteína transposasa, un ARNm codificante de la proteína transposasa o un ADN que codifica la proteína transposasa, se encuentren presentes simultáneamente en la célula.

El gen de transposasa se refiere a un gen codificante de una transposasa. Con el fin de mejorar su eficiencia de expresión en una célula de mamífero, una secuencia que ajusta un espacio entre la secuencia de consenso de Kozak (Kozak M., Nucleic Acids Res. 12:857-872, 1984) o una secuencia de unión a ribosoma, una secuencia de Shine-Dalgarno y el codón de inicio, a una distancia apropiada (por ejemplo entre 6 y 18 bases) puede conectarse a un sitio cadena arriba del codón de inicio de traducción ATG del gen.

Según el procedimiento de la invención, con el fin de integrar un fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés en por lo menos un vector de expresión en el cromosoma de una célula hospedadora, un vector de expresión que comprende el fragmento génico que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico se introduce en la célula hospedadora, y se permite la acción de una transposasa sobre las secuencias de transposón comprendidas en el vector de expresión que se ha introducido en la célula.

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Con el fin de permitir que actúe una transposasa sobre las secuencias de transposón comprendidas en el vector de expresión que se ha introducido en la célula, la transposasa puede ser inyectada en la célula, o puede introducirse un vector de expresión que comprende un ADN que codifica por lo menos una proteína de interés o un ADN que codifica una proteína de interés, en la célula hospedadora junto con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la proteína de interés y un gen marcador seleccionable. Además, mediante la introducción de un aRn codificante de un gen de transposasa en la célula hospedadora puede expresarse la transposasa en la célula.

El vector de expresión no se encuentra particularmente limitado. Puede utilizarse cualquier vector de expresión mediante la selección opcional de entre los vectores de expresión conocidos por el experto en la materia, dependiendo de la célula hospedadora en la que se introduce un vector de expresión que comprende un gen de transposasa, y similares.

En el caso de que se produzca mediante el procedimiento de la invención una proteína de interés que comprende dos o más polipéptidos o dos o más proteínas de interés, puede prepararse una célula productora de proteína en la que se integra un ADN que codifica cada proteína en un cromosoma de la célula hospedadora, mediante la inserción del ADN que codifica cada proteína en el mismo vector de expresión o insertando el ADN en vectores de expresión diferentes respectivos e introduciendo los vectores de expresión en una célula hospedadora.

La transposasa puede insertarse en un vector de expresión para expresarse junto con la proteína de interés o puede insertarse en un vector diferente del vector de expresión. La transposasa puede dejarse que actúe transitoriamente o puede dejarse actuar continuamente, aunque preferentemente se deja que la transposasa actúe transitoriamente con el fin de preparar la célula para la producción estable.

Como procedimiento para permitir que la transposasa actúe transitoriamente, entre los ejemplos se incluyen un procedimiento que comprende preparar un vector de expresión que comprende un ADN que codifica la transposasa y un vector de expresión que comprende un ADN que codifica una proteína de interés, seguido de la introducción de ambos plásmidos de expresión simultáneamente en la célula hospedadora.

La expresión "vector de expresión" en la presente memoria se refiere a un vector de expresión para la utilización en la introducción en una célula de mamífero y la expresión de una proteína de interés. El vector de expresión utilizado en la invención presenta una estructura en la que se encuentra presente por lo menos un par de secuencias de transposón en ambos lados de un casete de expresión.

La expresión "casete de expresión" en la presente memoria se refiere a una secuencia de nucleótidos que presenta una región de control de la expresión génica necesaria para expresar una proteína de interés y una secuencia codificante de la proteína de interés. Entre los ejemplos de la región de control de la expresión génica se incluyen un intensificador, un promotor y un terminador. El casete de expresión puede incluir un gen marcador seleccionable.

Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de gen TI (temprano inmediato) del citomegalovirus (CMV), el promotor temprano de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor metalotioneína, un promotor de choque térmico, el promotor SRa, el virus de la leucemia murina de Moloney, un intensificador y similares. Además, puede utilizarse el intensificador del gen TI del CMV humano junto con el promotor.

El "gen marcador seleccionable" se refiere a otro gen marcador opcional que puede utilizarse para distinguir una célula en la que se ha introducido un vector plásmido respecto de una célula que no presenta el vector.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable se incluyen un gen de resistencia a fármaco (un gen de resistencia a la neomicina, un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la blasticidina, un gen de resistencia a la zeocina, un gen de resistencia a la higromicina y un gen de resistencia a la cicloheximida (solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 262879/2002), genes marcadores de fluorescencia y bioluminiscencia (tales como la proteína fluorescente verde, PFV) y similares.

En la invención, el marcador seleccionable preferente es un gen de resistencia a fármaco y un marcador seleccionable particularmente preferente es un gen de resistencia a la cicloheximida. Además, la propiedad de resistencia a fármaco y la propiedad de luminiscencia de la proteína marcadora seleccionable también pueden modificarse mediante la preparación de una variante con aminoácidos modificados mediante la modificación genética del gen marcador seleccionable o mediante el control de la transcripción o traducción del gen marcador seleccionable (por ejemplo, la modificación de un promotor, la modificación de un codón de aminoácidos y similares). Además, también puede seleccionarse células en las que se ha introducido un gen marcador seleccionable que presentan diferentes niveles de resistencia a fármaco mediante el ajuste de la concentración

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del fármaco.

Para el control de la propiedad de resistencia a fármaco y la propiedad de luminiscencia de la proteína marcadora seleccionable, resulta preferente utilizar un gen marcador seleccionable atenuado. El gen marcador seleccionable atenuado es un gen marcador seleccionable que se modifica de manera que se reduce la actividad de la proteína codificada por el gen marcador seleccionable dentro de la célula.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable que se modifica de manera que la actividad en la célula sea baja se incluyen: (A) un gen marcador seleccionable en el que se modifica la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por un gen marcador seleccionable de manera que se reduce la actividad de la proteína en la célula, y (B) un gen marcador seleccionable en el que se modifica una secuencia de nucleótidos que controla la expresión del gen marcador seleccionable o se modifica una secuencia de nucleótidos dentro del ORF (marco de lectura abierto, por el inglés 'Open Reading Frame') de manera que se reduce la expresión del gen marcador seleccionable.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable en el que se ha modificado la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada por el gen marcador seleccionable de manera que la actividad de la proteína en la célula se haya reducido se incluyen el gen de resistencia a la neomicina descrito por Sauter et al. [Biotech. Bioeng. 89:530-538, 2005] o Chen et al. [Journal of Immunological Methods 295:49-56, 2004].

Entre los ejemplos del procedimiento para reducir el nivel de expresión de una proteína en la célula mediante la modificación de una secuencia de nucleótidos que controla la expresión del gen marcador seleccionable se incluyen un procedimiento para modificar la secuencia del promotor, la secuencia de terminador, la secuencia de intensificador, la secuencia de consenso de Kozak o la secuencia de Shine-Dalgarno, que controla la expresión del gen marcador seleccionable. Más específicamente entre los ejemplos se incluye un procedimiento en el que una secuencia de promotor que controla la expresión de un gen marcador seleccionable es sustituida por una secuencia de promotor más débil.

Entre los ejemplos del procedimiento para reducir el nivel de expresión de la proteína en la célula mediante la modificación de una secuencia de nucleótidos en el ORF de un gen marcador seleccionable se incluyen un procedimiento en el que un codón en el ORF es sustituido por un codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso de codones en la célula.

Entre los ejemplos del gen marcador seleccionable atenuado de la invención se incluyen un marcador seleccionable en el que el codón anteriormente indicado en el ORF del gen es sustituido por un codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso de codones en la célula.

En las células de diversas especies biológicas, el codón sinónimo que presenta una frecuencia todavía más baja de uso entre cada codón sinónimo puede seleccionarse basándose en la literatura y bases de datos conocidos y similares.

Entre los ejemplos de dicha sustitución por un codón sinónimo que presenta una frecuencia más baja de uso, específicamente en el caso de una célula HO, se incluyen la sustitución del codón de la leucina por TTA, la sustitución del codón de la arginina por CGA o CGT, la sustitución del codón de la alanina por GCG, la sustitución del codón de la valina por GTA, la sustitución del codón de la serina por TCG, la sustitución del codón de la isoleucina por ATA, la sustitución del codón de la treonina por ACG, la sustitución del codón de la prolina por CCG, la sustitución del codón del ácido glutámico por GAA, la sustitución del codón de la tirosina por TAT, la sustitución del codón de la lisina por AAA, la sustitución del codón de la fenilalanina por TTT, la sustitución del codón de la histidina por CAT, la sustitución del codón de la glutamina por CAA, la sustitución del codón de la asparagina por AAT, la sustitución del codón del ácido aspártico por GAT, la sustitución del codón de la cisteína por TGT y la sustitución del codón de la glicina por GGT.

En un gen marcador seleccionable atenuado, el número de codones que debe introducirse en comparación con el gen marcador seleccionable antes de la modificación no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que pueda obtenerse eficientemente una célula productora de proteínas, aunque resulta preferente sustituir los codones correspondientes a 20 o más residuos aminoácidos.

En un gen marcador seleccionable atenuado, el número de bases que debe modificarse en comparación con el gen marcador seleccionable antes de la modificación no se encuentra particularmente limitado, aunque resulta preferente modificar 10% o más de la secuencia de nucleótidos codificante del gen marcador seleccionable.

Además, en un gen marcador seleccionable atenuado, los residuos aminoácidos codificados por los codones que deben sustituirse no se encuentran particularmente limitados, aunque entre los ejemplos preferentes se incluyen leucina, alanina, serina y valina.

En el caso de un gen marcador seleccionable atenuado los codones correspondientes a la leucina son

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sustituidos sin particular limitación, aunque resulta preferente sustituir los codones que corresponden a 70% o más de los residuos de leucina de los codones respecto al total de residuos de leucina contenidos en el gen marcador seleccionable.

Además, en el caso de un gen marcador seleccionable atenuado en el que se sustituyan los codones que corresponden a alanina sin particular limitación, resulta preferente sustituir los codones que corresponden a 70% o más de los residuos de alanina de los codones respecto al total de residuos de alanina contenidos en el gen marcador seleccionable.

Entre los ejemplos específicos del gen marcador seleccionable atenuado obtenido mediante dicha modificación en la que se sustituyen codones por codones sinónimos con una frecuencia más baja de uso se incluyen un gen de resistencia a la neomicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 37, 38 o 39, un gen de resistencia a puromicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 41, 43 o 44, un gen de resistencia a zeocina que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 45 o 46 y un gen de resistencia a higromicina que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 47 o 48.

Además, resulta posible atenuar un gen marcador seleccionable también mediante el incremento considerable de la concentración de un fármaco en comparación con la concentración utilizada convencionalmente al seleccionar una célula resistencia al fármaco en la preparación de una célula productora de anticuerpos o mediante la realización de una administración adicional antes de que el gen de resistencia a fármaco metabolice y degrade el fármaco.

La cicloheximida (en adelante en ocasiones denominada CHX) es un inhibidor de la síntesis de proteínas y entre los ejemplos de utilización de un gen de resistencia a CHX como gen marcador seleccionable se incluyen casos conocidos de levadura [Kondo K., J. Bacteriol. 177(24):7171-7177, 1995] y células animales (documento n° JP-A- 2002-262879).

En el caso de las células animales, se ha revelado que un transformante que expresa una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 7 del LISTADO DE SECUENCAIS en la que la prolina en la posición 54 de la subunidad L36a de la proteína ribosómica humana codificada por la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 5 del LISTADO DE SECUENCIAS es sustituida por glutamina, proporciona resistencia a la cicloheximida. Además, entre los ejemplos del marcador de resistencia a la cicloheximida se incluye la subunidad L44 de la proteína ribosómica humana mutante en la que la prolina en la posición 54 de la subunidad L44 de la proteína ribosómica humana es sustituida por glutamina.

El procedimiento para introducir el vector de expresión de proteínas anteriormente indicado que comprende una secuencia de transposón, una secuencia de transposón, un vector plásmido para expresar una transposasa o ARN no se encuentra particularmente limitado. Entre los ejemplos se incluyen la transfección con fosfato de calcio, la electroporación, un procedimiento de liposomas, un procedimiento de pistola génica, la lipofección y similares.

Entre los ejemplos del procedimiento para introducir directamente una transposasa en forma de una proteína se incluyen una técnica de microinyección o suministro a una célula mediante endocitosis. La introducción génica puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en Shin Idenshi Kogaku Handbook (New Genetic Engineering Handbook), editado por Masami Muramatsu y Tadashi Yamamoto, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897063737.

La célula hospedadora es una célula de mamífero en suspensión. La célula de mamífero es una célula de CHO, ovárica de hámster chino (Journal of Experimental Medicine 108, 945, 1958; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 601275, 1968; Genetics 55:513, 1968; Chromosoma 41:129, 1973; Methods in Cell Science 18:115, 1996; Radiation Research 148:260, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. 60:1275, 1968; Cell 6:121, 1975; Molecular Cell Genetics, apéndices I y II (páginas 883 a 900)). Entre los ejemplos de las células de CHO en suspensión se incluyen CHO/DG44, CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), DUKXB11 (ATCC n° CCL-9096), Pro-5 (ATCC n° CCL-1781), CHO-S (Life Technologies, n° de cat. 11619), Pro-3 y la línea celular subclonal de las células de CHO.

Adicionalmente, la célula hospedadora anteriormente indicada también puede utilizarse en el procedimiento de producción de proteínas de la invención mediante la modificación de la célula de manera que resulte adecuada para la producción de proteínas, debido a la modificación del ADN cromosómico, la introducción de un gen exógeno y similares.

Además, con el fin de controlar la estructura de la cadena sacárida unida a la proteína de interés que debe producirse, también pueden utilizarse como célula hospedadora, Lec13 con resistencia adquirida a lectina [Somatic Cell and Molecular Genetics 12:55, 1986] y una célula de CHO de la que se ha delecionado el gen de a1,6-fucosiltransferasa (documentos n° WO2005/35586 y n° WO2002/31140), una célula deficiente en GDP-

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mañosa 4,6-deshidratasa (GDM) y una célula deficiente en proteína Fx.

En la presente invención, la proteína de interés es una proteína compleja que consiste en dos o más polipéptidos. Además, proteína y polipéptido son sinónimos en la invención pero una molécula de proteína con un peso molecular relativamente bajo o una proteína que constituye una proteína compleja puede definirse en ocasiones como un polipéptido.

La proteína de interés en la invención es un anticuerpo. En particular, entre los ejemplos de la proteína de interés se incluyen un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal.

El anticuerpo es una molécula que comprende un polipéptido cadena pesada (cadena H) de anticuerpo y dos polipéptidos cadena ligera (cadena L) de anticuerpo, y como subclase se conocen las subclases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Además, IgG se clasifica en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

El anticuerpo IgG es una molécula heterotetramérica que consiste en dos polipéptidos cadena H y dos polipéptidos cadena L. Cada una de las cadenas H y de las cadenas L consiste en una región variable (V) que se relaciona con la unión de antígenos y una región constante (C), y cada una de ellas se denomina VH, CH, VL o CL, respectivamente. La región CH se clasifica adicionalmente en regiones CH1, CH2 y CH3, y las regiones CH2 y CH3 se denominan, en combinación, región Fc o simplemente Fc.

El anticuerpo incluye un anticuerpo monoclonal que reacciona con un único epítopo, un anticuerpo policlonal que reacciona con dos o más epítopos y un anticuerpo recombinante.

El anticuerpo monoclonal es un anticuerpo que es secretado por células productoras de anticuerpos de un solo clon y reconoce únicamente un epítopo (también denominado determinante antigénico) y la secuencia de aminoácidos (la estructura primaria) que constituye un anticuerpo monoclonal es uniforme.

El anticuerpo policlonal es una mezcla de anticuerpos monoclonales y puede reaccionar con dos o más epítopos.

Entre los ejemplos del anticuerpo recombinante se incluyen un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, una proteína de fusión de Fc, un anticuerpo con modificación de aminoácidos de Fc y un anticuerpo multivalente y un fragmento parcial de los mismos. Un anticuerpo con modificación de aminoácidos puede presentar una modificación de aminoácido en una región variable o en una región constante y la actividad del anticuerpo se encuentra controlada.

El anticuerpo multivalente incluye un anticuerpo multivalente que reacciona con dos o más epítopos diferentes en un antígeno, un anticuerpo multivalente que reacciona con dos o más antígenos diferentes, y similares, pero puede incluir cualquier anticuerpo multivalente. Además, el anticuerpo multivalente puede ser cualquier anticuerpo multivalente que presente cualquier estructura con la condición de que conserve la actividad de unión al antígeno (documentos n° WO2001/77342, patente n° US 7.612.181 y documento n° WO2009/131239).

Según el procedimiento de producción de la presente invención, puede expresarse y producirse cualquiera de entre la proteína de interés y/o el péptido de interés anteriormente indicados.

Entre los ejemplos de la célula en la que se introduce un ADN que codifica por lo menos una proteína de interés de la presente invención se incluye una célula productora de anticuerpos preparada mediante las etapas (A) y (B) a continuación.

En la etapa (A) se introducen simultáneamente una combinación de vector de expresión seleccionado de entre

(a) a (c) a continuación o vector de expresión (d) y vector de expresión (e) en una célula de mamífero en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que

comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que comprende

además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una

cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que

comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y

que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

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(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, y

(d) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H y una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(e) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre el par de secuencias de transposón al interior de un cromosoma, y

la Etapa (B), en la que se selecciona una célula de mamífero en suspensión que expresa un anticuerpo en la que los genes de la cadena H, cadena L y marcador seleccionable anteriormente indicados que se han insertado entre un par de secuencias de transposón, se integran en un cromosoma de la célula de mamífero anteriormente indicada mediante la expresión transitoria de la transposasa del vector de expresión (e) que se ha introducido en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A).

Entre los ejemplos del procedimiento para producir un anticuerpo de la presente invención se incluye un procedimiento para producir una proteína de interés, que comprende las etapas (A) a (C) a continuación.

(a) a (c), a continuación, o vector de expresión (d) y vector de expresión (e), en una célula de mamífero en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que además comprende un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, y

(e) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposición al interior de un cromosoma,

En la etapa (B) se obtiene una célula de mamífero en suspensión que expresa un anticuerpo en el que los genes de la cadena H, cadena L y marcador seleccionable anteriormente indicados que han sido insertados entre un par de secuencias de transposón se integran en un cromosoma de la célula de mamífero anteriormente indicada mediante la expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión 8e) que ha sido introducido en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A), y

en la etapa C, se produce el anticuerpo mediante el cultivo en suspensión de una célula de mamífero obtenida en la etapa (B), que expresa un anticuerpo.

Además, la presente invención incluye un procedimiento para producir una línea celular que presenta una elevada productividad de anticuerpos y un procedimiento para el cribado de la línea celular que comprende las etapas (A) y (B) a continuación.

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En la etapa (A), se introduce simultáneamente una combinación de vector de expresión seleccionado de entre (a) a (c), a continuación, o vector de expresión (d) y vector de expresión (e) en una célula de mamífero en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un AND codificante de una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(e) un vector que comprende un ADN que codifica una transposasa que reconoce las secuencias de transposón y presenta actividad de transferencia de un fragmento génico insertado entre un par de secuencias de transposón al interior de un cromosoma, y

en la etapa (B), se selecciona una célula de mamífero en suspensión de expresión elevada de un anticuerpo en la que los genes de la cadena H, cadena L y marcador seleccionable anteriormente indicados que están insertados entre un par de secuencias de transposón, se integran en un cromosoma de la célula de mamífero anteriormente indicada mediante la expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión (e) que ha introducido en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A).

Además, la presente invención incluye un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende las etapas (A), (B) y (C) a continuación.

En la etapa (A) se introduce simultáneamente una combinación de vector de expresión seleccionado de entre (a) a (c) a continuación o vector de expresión (d) y vector de expresión (e) en una célula de mamífero en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

(d) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una

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cadena H y una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que comprende además un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en la etapa (B), se obtiene una célula de mamífero en suspensión que expresa un anticuerpo en el que los genes de la cadena H, la cadena L y el marcador seleccionable anteriormente indicados que han sido insertados entre un par de secuencias de transposón, se insertan en un cromosoma de la célula de mamífero anteriormente indicada mediante la expresión transitoria de la transposasa a partir del vector de expresión (e) que ha sido introducido en la célula de mamífero en suspensión en la etapa (A), y

en la etapa (C) se produce el anticuerpo mediante el cultivo en suspensión de una célula de mamífero en suspensión obtenida en la etapa (B) que expresa un anticuerpo.

Entre los ejemplos de la célula de mamífero en la que se ha introducido un ADN que codifica por lo menos una proteína de interés de la presente invención se incluye una célula productora de anticuerpos policlonales en la que se han introducido varios genes de anticuerpo diferentes, una célula productora de una molécula de complejo y similares.

Entre los ejemplos de una célula productora de anticuerpos policlonales se incluye una célula en la que se han introducido por lo menos dos o más genes de anticuerpo monoclonal diferentes, una célula en la que se han introducido genes de varios anticuerpos monoclonales contra varios antígenos, una célula que ha sido inmunizada con un antígeno y en la que se ha introducido una biblioteca génica de un anticuerpo no humano, una célula en la que se ha introducido una biblioteca génica de un anticuerpo derivado de un paciente, y similares.

La célula productora de una molécula compleja puede ser cualquier célula con la condición de que se hayan introducido los ADN codificantes de las proteínas respectivas que se coexpresan en una célula para formar una molécula compleja. Entre los ejemplos específicos se incluyen una célula cotransfectada con FcyRIII (CD16) y cadena y común, una célula en la que se coexpresan el receptor de Fc neonatal (FcRn) y la macroglobulina p2, una célula cotransfectada con CD98 y LATI (documento n° WO2007/114496) y similares.

El anticuerpo que se produce mediante el procedimiento de producción de anticuerpos de la presente invención puede ser cualquier anticuerpo y entre los ejemplos se incluye un anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una alergia o inflamación, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular, un anticuerpo que reconoce un antígeno que se relaciona con enfermedades autoinmunitarias, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con la infección vírica o bacteriana y similares.

Entre los ejemplos del antígeno de tipo tumoral se incluyen CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, ligando de CD40 (CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD55, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD98, CD105, CD134, CD137, CD138, CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, adrenomedulina, proteína 4 de tipo angiopoyetina (ARP4), aurora, B7-H1, B7-DC, integlina, antígeno 2 del estroma de la médula ósea (BST2), CA125, CA19.9, anhidrasa carbónica 9 (CA9), cadherina, receptor de quimiocina cc (CCR) 4, CCR7, antígeno carcinoembrionario (CEA), receptor 1 del factor de crecimiento fibroblástico rico en cisteína (CFR-1), c-Met, c-Myc, colágeno, CTA, factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), CTLA-4, citoqueratina-18, DF3, E-cadherina, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), EGFRvlII, EGFR2 (HER2), EGFR3 (HER3), EGFR4 (HER4), endoglina, molécula de adhesión de las células epiteliales (EpCAM), receptor endotelial de la proteína C (EPCR), efrina, receptor de la efrina (Eph), EphA2, endoteliasa-2 (ET2), FAM3D, proteína activadora de los fibroblastos (FAP), homólogo 1 de receptor de Fc (FcRHI), ferritina, factor-8 de crecimiento fibroblástico (FGF-8), receptor del FGF8, FGF básico (bFGF), receptor de bFGF, receptor de FGF (FGFR) 3, FGFR4, FLT1, fLt3, receptor de folato, homólogo 10 de Frizzled (FZD10), receptor 4 de Frizzled (FZD-4), G250, receptor de G-CSF, gangliósido (tal como GD2, GD3, GM2 y GM3), globo H, gp75, gp88, GPR-9-6, heparanasa I, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), receptor de HGF, antígeno HLA (tal como HLA-DR), HM1.24, glóbulo de grasa láctea humana (HMfG), hRs7, proteína 90 de choque térmico (hsp90), epítopo idiotipo, factor de crecimiento similar a insulina (IGF), receptor de IGF (IGFR), interleucina (tal como IL-6 e IL-15), receptor de interleucina (tal como IL-6R e IL-15R), integrina, receptor inmunológico 4 asociado a la traslocación (IRTA-4), calicreína 1, KDR, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KS1/4, lamp-1, lamp-2, laminina-5, Lewis y, sialil-Lewis x, receptor de linfotoxina-beta (LTBR), LUNX, proteoglicano condroitín- sulfato asociado al melanoma (MCSP), mesotelina, MICA, receptor de tipo II de la sustancia inhibidora mulleriana (MISIIR), mucina, molécula de adhesión de células neurales (NCAM), Necl-5, Notchl, osteopontina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de PDGF, factor plaquetario 4 (PF-4), fosfatidilserina, antígeno específico de la próstata (PSA), antígeno de las células madre prostáticas (PSCA), antígeno

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membranario específico de la próstata (PSMA), proteína/péptido relacionado con la hormona paratiroidea (PTHrP), activador receptor del ligando de NF-kappaB (RANKl), receptor de motilidad mediada por el ácido hialurónico (RHAMM), ROBO1, SART3, semaforina 4b (SEMA4B), inhibidor secretorio de proteasa de leucocitos (SLPI), SM5-1, esfingosina-1-fosfato, glucoproteína-72 asociada a tumor (TAG-72), receptor de transferrina (TfR), TGF-beta, Thy-1, Tie-1, receptor de Tie2, dominio de inmunoglobulina de células T y dominio-1 de mucina (TIM-1), factor tisular humano (hTF), antígeno Tn, factor de necrosis tumoral (TNF), antígeno de Thomsen- Friedenreich (antígeno TF), receptor de TNF, ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL), receptor de TRAIL (tal como DR4 y DR5), sistema ASC de transporte de aminoácidos 2 (ASCT2), trkC, TROP-2, receptor Fn14 de TWEAK, colagenasa de tipo IV, receptor de uroquinasa, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), receptor de VEGF (tal como VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3), vimentina, VLA-4 y similares, y anticuerpos contra los antígenos anteriormente indicados.

Adicionalmente, entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral se incluyen [AntiCancer Res. 13:331, 1993], anticuerpo anti-GD3 [Cancer Immunol. Immunother. 36:260, 1993], anticuerpo anti-GM2 [Cancer Res. 54:1511, 1994], anticuerpo anti-CD52 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992], anticuerpo anti-MAGE [British J. Cancer 83:493, 2000], anticuerpo anti-HM1.24 [Molecular Immunol. 36:387, 1999], anticuerpo relacionado con la hormona anti-paratiroidea (PTHrP) [Cancer 88:2909, 2000], anticuerpo anti- bFGF, anticuerpo anti-FGF-8 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9911, 1989], anticuerpo anti-bFGFR, anticuerpo anti- FGFRl (documento n° WO2005/037235), anticuerpo anti-FGF-8R [J.Biol. Chem. 265:16455, 1990], anticuerpo anti-IGF [J. Neurosci. Res., 40:647, 1995], anticuerpo anti-IGF-IR [j. Neurosci. Res. 40:647, 1995], anticuerpo anti-PSMA [J. Urology 160:2396, 1998], anticuerpo anti-VEGF [Cancer Res. 57:4593, 1997, Avastin®], anticuerpo anti-VEGFR [Oncogene 19:2138, 2000; documento n° WO96/30046], anticuerpo anti-CD20 [Curr. Opin. Oncol. 10:548, 1998; US5, 736, 137, Rituxan®, Ocrelizumab, Ofatumumab], anticuerpo anti-EGFR (Erbitux®, Vectivix®), anticuerpo anti-HER2 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; US5, 725, 856, Herceptin®, Pertuzumab), anticuerpo anti-HER3 (documento n° US2008/0124345), anticuerpo c-Met (US6, 468, 529), anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-EGFR (documento n° WO96/402010), anticuerpo anti-Apo-2R (documento n° WO98/51793), anticuerpo anti-ASCT2 (documento n° W02010/008075), anticuerpo anti-CEA [Cancer Res. 55 (23 supl.):5935s- 5945s, 1995], anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD20 con modificación de aminoácidos (Immunology 115:4393, 2010), anticuerpo anti-EpCAM, anticuerpo anti-A33, anticuerpo anti-receptor del folato (MRAb-003) y similares.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una alergia o con la inflamación se incluyen el anticuerpo anti-interleucina-6 [Immunol. Rev. 127:5, 1992], el anticuerpo anti-receptor de interleucina- 6 [Molecular Immunol. 31:371, 1994], anticuerpo anti-interleuquina-5 [Immunol. Rev. 127:5, 1992], anticuerpo anti-receptor de interleucina-5, anticuerpo anti-interleucina-4 [Cytokine 3:562, 1991], anticuerpo anti-receptor de interleucina-4 [J. Immunol. Meth. 217:41, 1998], anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral [Hybridoma 13:183, 1994], anticuerpo anti-receptor de factor de necrosis tumoral [Molecular Pharmacol. 58:237, 2000], anticuerpo anti-CCR4 [Nature 400:776, 1999], anticuerpo anti-quimiocina [Peri et al., J. Immuno. Meth. 174:249-257, 1994], anticuerpo anti-receptor de quimiocina [J. Exp. Med. 186:1373, 1997] y similares. Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular se incluye anticuerpo anti- GpIIb/IIIa [J. Immunol. 152:2968, 1994], anticuerpo anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas [Science 253:1129, 1991], anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas [J. Biol. Chem. 272:17400, 1997], anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea [Circulation 101:1158, 2000], anticuerpo anti- IgE, anticuerpo anti-aVp3, anticuerpo anti-a4p7 y similares.

Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una infección vírica o bacteriana se incluye el anticuerpo anti-gp120 [Structure 8:385, 2000], anticuerpo anti-CD4 [J. Rheumatology 25:2065, 1998], anticuerpo anti-CCR5, anticuerpo anti-verotoxina [J. Clin. Microbiol. 37:396, 1999], anticuerpo anti-M2 (documento n° JP2003-235575) y similares.

La actividad efectora de un anticuerpo monoclonal producido mediante el procedimiento de la presente invención puede controlarse mediante diversos procedimientos. Entre los ejemplos de los procedimientos conocidos se incluye un procedimiento para controlar la cantidad de fucosa (en adelante denominada "fucosa nuclear") que se encuentra unida a N-acetilglucosamina (GlcNAc) mediante enlace a1,6 en un extremo reductor de una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo que se encuentra unida a asparagina (Asn) en la posición 297 de una región Fc de un anticuerpo (documentos n° WO2005/035586, n° WO2002/31140 y n° WO00/61739), un procedimiento para controlar una actividad efectora mediante la modificación de uno o más residuos aminoácidos de una región Fc del anticuerpo y similares. La actividad efectora del anticuerpo monoclonal producido mediante el procedimiento de la presente invención puede controlarse mediante la utilización de cualquiera de los procedimientos.

La expresión "actividad efectora" se refiere a una actividad dependiente de anticuerpos que resulta inducida por una región Fc de un anticuerpo. Como actividad efectora, se conoce la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (actividad ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC), la fagocitosis dependiente de anticuerpos (actividad ADP) por células fagocíticas, tales como macrófagos o células dendríticas, y similares.

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Además, mediante el control del contenido de fucosa nuclear de una cadena sacárida unida a N de tipo complejo de un anticuerpo monoclonal que es producido mediante el procedimiento de la presente invención, puede incrementarse o reducirse una actividad efectora del anticuerpo.

Como procedimiento para la reducción del contenido de fucosa que se encuentra unido a una cadena sacárida unida a N de tipo complejo unida a la región Fc del anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que la fucosa no se encuentra unida mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula de CHO que es deficiente en un gen codificante de a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que no se encuentra unido la fucosa presenta una elevada actividad de ADCC.

Por otra parte, como procedimiento para incrementar el contenido de fucosa que se encuentra unida a una cadena sacárida unida mediante N de tipo complejo unida a Fc de un anticuerpo, puede obtenerse un anticuerpo al que se encuentra unido la fucosa mediante la expresión de un anticuerpo utilizando una célula hospedadora en la que se ha introducido un gen codificante de a1,6-fucosiltransferasa. El anticuerpo al que se encuentra unido la fucosa presenta una actividad de ADCC más baja que el anticuerpo al que no se encuentra unido la fucosa.

Además, mediante la modificación de uno o más residuos aminoácidos en una región Fc de un anticuerpo, puede incrementarse o reducirse la actividad de ADCC o de CDC. Por ejemplo, puede incrementarse la actividad de CDC de un anticuerpo mediante la utilización de la secuencia de aminoácidos de la región Fc del anticuerpo descrito en el documento n° US2007/0148165.

Además, la actividad de ADCC o la actividad de CDC de un anticuerpo puede incrementarse o reducirse realizando las modificaciones de aminoácidos indicadas en las patentes US n° 6.737.056, n° 7.297.775 o n° 7.317.091.

La expresión "célula de mamífero en suspensión" en la presente invención se refiere a una célula que no se adhiere a un anclaje de cultivo celular recubierto para facilitar la adhesión de las células en cultivo, tal como microperlas, un recipiente de cultivo para el cultivo de tejidos (también denominado cultivo tisular o recipiente de cultivo de adhesión y similares) y similares, y puede sobrevivir y crecer bajo suspensión en la solución de cultivo.

Con la condición de que la célula no se adhiere al anclaje de cultivo celular, la célula puede sobrevivir y crecer en un estado unicelular en la solución de cultivo o sobrevivir y crecer en un estado de masa de células formado por agregación de dos o más células.

Además, como célula de mamífero en suspensión que debe utilizarse en la presente invención, resulta preferente una célula que pueda sobrevivir y crecer en un medio libre de suero que no contenga suero de feto bovino (en adelante denominado FCS) y similares, bajo suspensión en la solución de cultivo sin adherencia al anclaje de cultivo celular, y resulta más preferente una célula de mamífero que pueda sobrevivir y crecer bajo suspensión en un medio libre de proteínas que no contenga proteínas.

El recipiente de cultivo para el cultivo de tejidos puede ser cualquiera, tal como un matraz, una placa Petri y similares, con la condición de que se encuentre recubierto para el cultivo de adhesión. En particular, por ejemplo, puede confirmarse que es o no es una célula de mamífero en suspensión utilizando un matraz de cultivo tisular disponible comercialmente (fabricado por Greiner), un matraz de cultivo de adhesión (fabricado por Sumitomo Bakelite) y similares.

Como célula de mamífero en suspensión que debe utilizarse en la presente invención, puede utilizarse una célula de CHO preparada mediante la adaptación adicional de una célula de CHO que originalmente presenta una propiedad de suspensión al cultivo en suspensión, o una célula de CHO en suspensión preparada mediante la adaptación de una célula de CHO adhesiva a las condiciones de cultivo en suspensión.

Entre los ejemplos de la célula que originalmente presenta una propiedad de suspensión se incluye la célula de CHO-S (preparada por Invitrogen).

La "célula de mamífero en suspensión preparada mediante la adaptación de una célula de mamífero adhesiva a las condiciones de cultivo en suspensión" puede prepararse mediante el procedimiento descrito en Mol. Biotechnol. 15(3):249-57, 2000, o mediante el procedimiento mostrado a continuación, y puede prepararse mediante el establecimiento de una célula que muestra una propiedad de proliferación y una propiedad de supervivencia similares a las anteriores a la adaptación del cultivo en suspensión o superiores a las anteriores a la adaptación al cultivo en suspensión (J. Biotechnol. 130(3):282-90, 2007).

La expresión "similar a las anteriores a la adaptación al cultivo en suspensión" se refiere a que la proporción de supervivencia, la tasa de proliferación (tiempo de duplicación) y similares de la célula adaptada al cultivo en suspensión son sustancialmente iguales a las de la célula antes de la adaptación del cultivo en suspensión.

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En la presente invención, entre los ejemplos del procedimiento para adaptar una célula de mamífero adhesiva a las condiciones de cultivo en suspensión se incluye el procedimiento siguiente. El contenido en suero de un medio que contiene suero se reduce a 1710 y el subcultivo se repite a una densidad relativamente elevada de células. En el momento en que la célula de mamífero es capaz de sobrevivir y proliferar, se reduce adicionalmente el contenido de suero y se repite el subcultivo. Mediante este procedimiento puede prepararse una célula de mamífero en suspensión que puede sobrevivir y proliferar bajo condiciones libres de suero.

Además, también puede prepararse una célula de mamífero en suspensión mediante un procedimiento que comprende el cultivo con la adición de un surfactante no iónico apropiado, tal como Pluronic-F68 o similar, en la solución de cultivo.

En la presente invención, como propiedad que presenta la célula de mamífero en suspensión, se lleva a cabo el cultivo en suspensión bajo la condición de 2x105 células/ml y después la densidad celular tras el cultivo durante 3 o 4 días preferentemente es de 5x105 células/ml o superior, más preferentemente de 8x105 células/ml o superior, particularmente preferentemente es de 1x106 células/ml o superior, más preferentemente de 1,5x106 células/ml o superior.

Además, el tiempo de duplicación de la célula de mamífero en suspensión de la presente invención preferentemente es de 48 horas o inferior, más preferentemente de 24 horas o inferior, particularmente preferentemente de 18 horas o inferior, más preferentemente de 11 horas o inferior.

Entre los ejemplos del medio para el cultivo en suspensión se incluye medio disponible comercialmente, tal como medio CD-CHO (Invitrogen), medio EX-CELL 325-PF (SAFC Biosciences), medio SFM4CHO (HyClone) y similares. Además, también puede obtenerse mediante la mezcla de sacáridos, aminoácidos y similares, los cuales resultan necesarios para el cultivo de las células de mamífero.

La célula de mamífero en suspensión puede cultivarse utilizando un recipiente de cultivo que puede utilizarse para el cultivo en suspensión bajo condiciones de cultivo que permiten el cultivo en suspensión. Entre los ejemplos del recipiente de cultivo se incluyen una placa de 96 pocillos para el cultivo celular en suspensión (fabricada por Corning), un matraz T (fabricado por Becton Dickinson), un matraz cónico (fabricado por Corning) y similares.

Con respecto a las condiciones de cultivo puede, por ejemplo, cultivarse en estático en una atmósfera de 5% de CO2 a una temperatura de cultivo de 37°C. También puede utilizarse un equipo de cultivo de agitación, tal como equipo de cultivo para el uso exclusivo en el cultivo en suspensión, por ejemplo Wave Bioreactor (fabricado por GE Healthcare Biosciences).

Con respecto a las condiciones de cultivo en suspensión para una célula de mamífero en suspensión utilizando el equipo Wave Bioreactor, la célula puede cultivarse mediante el procedimiento descrito en la página inicial de GE Healthcare Bioscience
http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/cellcult/wave_03_16.pdf.

Además del cultivo de agitación, también puede realizarse el cultivo mediante un equipo de rotación-agitación, tal como un biorreactor. El cultivo con un biorreactor puede llevarse a cabo mediante el procedimiento descrito en Cytotechnology 52:199-207, 2006, y similares.

En la presente invención, en el caso de que se utilice una línea celular diferente de las células de mamífero en suspensión, puede utilizarse cualquier línea celular con la condición de que sea una línea celular de mamífero adaptada al cultivo en suspensión mediante el procedimiento anteriormente indicado y sea una línea celular que pueda utilizarse en el procedimiento de producción de proteínas de la presente invención.

La purificación de la proteína de interés producida mediante la célula de mamífero en suspensión se lleva a cabo mediante la separación de la proteína de interés respecto de impurezas aparte de la proteína de interés en una solución de cultivo u homogeneizado celular que contiene la proteína de interés. Entre los ejemplos del procedimiento de separación se incluyen la centrifugación, la diálisis, la precipitación con sulfato amónico, la cromatografía de columna, la filtración y similares. La separación puede llevarse a cabo basándose en la diferencia en propiedades físicoquímicas de la proteína de interés y de las impurezas o de diferencias en su avidez para el portador de columna mismo.

Como procedimiento para la purificación de la proteína de interés, la purificación se lleva a cabo mediante el procedimiento descrito en Protein Experimentation Note (el primer volumen) - Extraction, Separation and Expression of Recombinant Protein (traducción de un libro de texto escrito en japonés) (editado por Masato Okada y Kaori Miyazaki, publicado por Yodo-sha, ISBN 9784897069180) y similares.

La presente invención ha sido descrita anteriormente mostrando formas de realización preferentes de la misma en aras de una fácil comprensión. A continuación en la presente memoria se describe adicionalmente la presente

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invención basándose específicamente en ejemplos, aunque las explicaciones anteriormente indicadas y los ejemplos siguientes se proporcionan meramente a título ejemplar y no se proporcionan con fines limitativos de la invención. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, el alcance de la invención no se encuentra limitado a las formas de realización y ejemplos que se describen específicamente en la presente memoria, sino que se encuentra limitado únicamente por las reivindicaciones.

Se llevaron a cabo diversas técnicas experimentales relacionadas con la recombinación descritas a continuación, tales como la clonación y similares, de acuerdo con las técnicas de ingeniería genética descritas en Molecular Cloning, 2a edición, editada por J. Sambrook, E.F. Frisch y T. Maniatis, Current Protocols in Molecular Biology, editado por Frederick M. Ausubel et al., publicado por Current Protocols, y similares.

Ejemplos

[Ejemplo 1]

Preparación de vector transposón para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano

Se utilizó como vector plásmido para la expresión de proteínas un plásmido que comprendía un casete de expresión génica para células de mamífero que comprendía un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertado entre un par de secuencias de transposón Tol2.

Cada ADN de los genes utilizados se sintetizó química y artificialmente basándose en una secuencia de nucleótidos conocida u obtenida mediante la preparación de cebadores para ambas secuencias terminales y después llevar a cabo la PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Con el fin de llevar a cabo la manipulación génica poseriormente, se añadió un sitio de restricción para un enzima de restricción al extremo del cebador.

En la secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 1) del transposón Tol2 no autónomo dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 235575/2003, se utilizó la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (secuencia Tol2-L) (SEC ID n° 2) y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 2.285 a 2.788 (secuencia Tol2-R) (SEC ID n° 3) como las secuencias de transposón.

Cada fragmento de ADN sintético que comprende un par de secuencias de transposón (fabricados por TAKARA BIO INC.) se preparó mediante el procedimiento siguiente. Se preparó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en la que se unió una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción NruI a ambos extremos, 3' y 5', de la secuencia Tol2-R. A continuación, se preparó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en la que se unió una secuencia de reconocimiento del enzima de restricción FseI al extremo 5'-terminal de la secuencia Tol2-L y se unió un sitio de enzima de restricción AscI al extremo 3'-terminal de la misma.

A continuación, los fragmentos de ADN preparados de esta manera que comprendía secuencia Tol2-R y secuencia Tol2-L se insertaron en un vector de expresión N5LG1_M2_Z3 (documento n° WO2006/061723) que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante de una secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-M2 de influenza humano Z3G1.

Se utilizó el vector N5LG1_M2_Z3 (documento n° WO2006/061723) en que se había insertado una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 9) codificante de la cadena H (SEC ID n° 10) y una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 11) codificante de la cadena L (SEC ID n° 12) del anticuerpo anti-M2 de influenza humano Z3G1 (ATCC depósito n° PTA-5968, depositado el 13 de marzo de 2004, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) bajo el control del intensificador/promotor del CMV a modo de casete de expresión génica de anticuerpo.

El fragmento de ADN que comprendía la secuencia Tol2-R se insertó en el sitio de enzima de restricción NruI en el lado 5'-terminal de un fragmento génico que comprendía el casete de expresión génica de anticuerpo y un gen marcador seleccionable en el vector N5LG1_M2_Z3. A continuación, se insertó el fragmento de ADN que comprendía la secuencia Tol2-L en los sitios de restricción de enzima FseI y AscI situados en el lado 3'-terminal.

Además, se construyó un vector transposón para la expresión de un anticuerpo anti-M2 de influenza humano (figura 1) mediante la inserción de un casete de expresión de gen de resistencia a la cicloheximida en el que se conectó una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 5) codificante de un gen de resistencia a la cicloheximida (un gen en el que la prolina en la posición 54 de la proteína ribosómica humana L36a se había sustituido por glutamina) bajo el control de intensificador/promotor del CMV en el sitio de reconocimiento FseI del vector N5LG1_M2_Z3 conectado con la secuencia de transposón Tol2.

Por otra parte, un vector que no comprendía secuencias de transposón se denominó vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano y se utilizó a modo de vector de control (figura 2).

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Preparación de vector de expresión de transposasa

Se expresó la transposasa utilizando un vector de expresión independiente del vector de expresión del anticuerpo de interés. Es decir, se insertó un gen que era codificante de una transposasa Tol2 derivada de pez medaka (SEC ID n° 4) cadena abajo del promotor CAGGS de un vector pCAGGS (Gene 108:193-200, 1991) con el fin de preparar un vector de expresión de transposasa Tol2 (en adelante denominado vector Tol2) (figura 3).

[Ejemplo 3]

Preparación de transformante utilizando células animales de mamífero

(1) Preparación de células de CHO en suspensión

Una célula de CHO adherente que había sido cultivado en medio a-MEM (Invitrogen) que contenía 10% de suero (FCS) se desprendió mediante un tratamiento de tripsina y después se recuperó, seguido del cultivo bajo agitación a 37°C en un incubador con 5% de CO2 utilizando el medio a-MEM fresco que contenía 10% de FCS. Varios días después, se confirmó el crecimiento de estas células y después se llevó a cabo el cultivo de agitación mediante la inoculación de las mismas en medio a-MEM que contenía 5% de FCS a una densidad de 2x105 células/ml, seguido del cultivo bajo agitación.

Varios días adicionales después, se llevó a cabo de manera similar la inoculación utilizando medio a-MEM que contenía 5% de FCS. Finalmente, se preparó una célula adaptada al cultivo en suspensión mediante subcultivo repetido y cultivo bajo agitación utilizando el medio a-MEM libre de suero, confirmando que las células presentaban la misma capacidad de crecimiento que con el cultivo en presencia de suero.

(2) Preparación de células de CHO productoras de anticuerpo

Como vector de expresión, se utilizó el vector transposón para la expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humano preparado en los Ejemplos 1 y 2 (en adelante denominado vector transposón) y el vector de Tol2 pCAGGS-T2TP (figura 3, Kawakami K. y Noda T., Genetics 166:895-899, 2004). Además, a modo de control se utilizó vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano que no presentaba secuencias de transposón.

Mediante la introducción de los vectores de expresión anteriormente indicados en las células de CHO-K1 (American Type Culture Collection, n° de cat. CCL-61) o HEK293 (Invitrogen, células FreeStyle 293F) adaptadas al cultivo en suspensión, se compararon las frecuencias de obtención de clones resistentes a cicloheximida.

Cada célula (4x106 células) se suspendió en 400 pl de PBS y el vector transposón para la expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humano (10 pg) y el vector Tol2 (25 pg) se cotransfectaron directamente en forma de ADN circular mediante electroporación. En este aspecto, con el fin de expresar la transposasa Tol2 transitoriamente, se introdujo el vector Tol2 directamente en forma de ADN circular con el fin de evitar su integración en el cromosoma del hospedador.

Además, a modo de control, se linealizó el vector de expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humano (10 pg) mediante un enzima de restricción y después se introdujo en cada célula, de acuerdo con el procedimiento estándar de introducción génica mediante electroporación.

La electroporación se llevó a cabo utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricada por Bio-Rad) utilizando un electroporador (Gene Pulser Xcell System (fabricado por Bio-Rad)) bajo condiciones de 300 V de voltaje, 500 pF de capacidad electrostática y temperatura ambiente.

Tras la introducción génica mediante electroporación, se sembró cada célula en tres placas de 96 pocillos y se cultivó en un incubador de CO2 durante 3 días utilizando el medio EX-CELL 325-PF fabricado por sAfC Biosciences para las células de CHO y el medio FreeStyle-293 (fabricado por Invitrogen) para las células HEK293.

A continuación, desde el día de intercambio del medio el 4° día desde la introducción génica, se añadieron 3 pg/ml de cicloheximida al medio de manera que se cultivasen las células en presencia de cicloheximida, seguido del cultivo durante 3 semanas, llevando a cabo el intercambio del medio cada semana.

Tras el cultivo durante 3 semanas, se identificaron y contaron los pocillos en los que se observaban colonias resistentes a cicloheximida. Se muestran los resultados en las Tablas 1 y 2.

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Tabla 1. Comparación de los números de células resistentes a cicloheximida (células CHO)

: Vector transposón Vector convencional

Ensayo 1: 155 / 288 0 / 288

Ensayo 2: 100 / 288 0 / 288

Ensayo 3: 94 / 288 0 / 288

Tabla 2. Comparación de los números de células resistentes a cicloheximida (células HEK293)

: Vector transposón Vector convencional

Ensayo 1: 0 / 288 0 / 288

Ensayo 2: 0 / 288 0 / 288

Ensayo 3: 0 / 288 0 / 288

Tal como se muestra en la Tabla 1, se introdujo en las células de CHO-K1 en suspensión el vector transposón de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano o el vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano. Como resultado, no se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida a partir de las células en las que se había introducido el vector de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano, tal como en otras líneas celulares, aunque se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida a partir de las células en las que se había introducido el vector transposón para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano a alta frecuencia.

Por otra parte, tal como se muestra en la Tabla 2, no se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida al introducir en las células HEK293, vector transposón para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humana o vector de expresión anticuerpo anti-M2 de influenza humana.

Basándose en dichos resultados, se encontró que el gen codificante de una proteína de interés y un gen de resistencia a cicloheximida insertados entre un par de secuencias de transposón se habían introducido eficientemente en el cromosoma de la célula hospedadora en la célula de mamífero en suspensión.

(3) Examen de la producción de anticuerpos en células de CHO en suspensión y células de CHO adherentes

Con el fin de examinar la eficiencia de producción de anticuerpos en células de CHO en suspensión o en células de CHO adherentes, se examinaron las cantidades de anticuerpos producidos por cada línea celular. Como célula de CHO en suspensión, se utilizó una célula de CHO-K1 en suspensión adaptada para el cultivo en suspensión. Además, como célula de CHO adherente, se utilizó una célula de CHO-K1 adherente antes de la adaptación al cultivo en suspensión.

El vector transposón de expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano (10 |jg) y el vector Tol2 (25 |jg) se introdujeron en las células de CHO-K1 en suspensión y en las células de CHO-K1 adherentes mediante electroporación, respectivamente. Después, se inocularon las células de CHO-K1 en suspensión y las células de CHO-K1 adherentes en tres placas de 96 pocillos para cada célula.

Se utilizó un medio para las células en suspensión (EX-CELL 325-PF, fabricado por SAFC Biosciences) para las células de CHO-K1 en suspensión y se utilizó el medio a-MEM que contenía 10% de suero para las células de CHO-K1 adherentes. Se cultivó cada célula en un incubador de CO2 durante 3 días. Desde el día del intercambio de medio el 4° día desde la electroporación, se añadieron 3 jg/ml de cicloheximida al medio de manera que se cultivasen las células en presencia de cicloheximida y las células se cultivaron adicionalmente durante 3 semanas. En este caso, se intercambió el medio cada semana.

Para las células de CHO-K1 en suspensión, se sembraron 1x106 células en una placa de 6 pocillos, seguido del cultivo bajo agitación en un incubador de CO2 durante 3 días y se midió la cantidad de proteínas anticuerpo mediante HPLC utilizando el sobrenadante de cultivo.

Para las células de CHO-K1 adherentes, se intercambió el medio al alcanzar las células la confluencia en una placa de 6 pocillos (2x106 células) y tras el cultivo estático durante 3 días, se midió la cantidad de proteínas anticuerpo mediante HPLC utilizando el sobrenadante de cultivo.

Se midió la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo de acuerdo con el procedimiento descrito en Yeast Res. 7:1307-1316, 2007. Se muestran los resultados en la figura 4.

Tal como se muestra en la figura 4A, se obtuvo un gran número de células que mostraba un nivel de expresión de anticuerpos marcadamente elevado al utilizar células de CHO-K1 adaptadas al cultivo en suspensión. Por otra parte, tal como se muestra en la figura 4B, sólo se utilizaron células que mostraban un nivel de expresión igual al límite de detección de HPLC (5 jg/ml) o inferior al utilizar células de CHO-K1 adherentes.

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Basándose en estos resultados, se encontró que, para expresar una proteína de interés utilizando un vector transposón, la proteína de interés pudo expresarse a nivel elevado al utilizar células de mamífero en suspensión.

Además, se encontró a partir de los resultados de los Ejemplos 1 a 3 que el procedimiento de la invención podía utilizarse como nuevo procedimiento para la producción de una proteína de interés, mediante la preparación eficiente de una célula productora que podía expresar a nivel elevado un gen exógeno utilizando una célula de mamífero en suspensión adaptada al cultivo en suspensión.

[Ejemplo 4]

Preparación de células de expresión de anticuerpos utilizando transposón Tol1 y preparación de anticuerpos

(1) Preparación de vector de transposón Tol1 para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano

De la misma manera que en el Ejemplo 1, se utilizó un plásmido que comprendía un casete de expresión génica para las células de mamífero, que comprendía un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertados entre un par de secuencias de transposón Tol1, como vector plásmido de expresión de proteína.

Se sintetizó químicamente cada ADN de los genes utilizados basándose en la información de secuencia conocida u obtenida mediante la preparación de cebadores de ambas secuencias terminales y se llevó a cabo una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Para la manipulación génica que debía realizarse posteriormente, se añadió un sitio para la digestión con enzima de restricción al extremo del cebador.

En la secuencia de nucleótido del transposón Tol1 no autónomo representada por la SEC ID n° 13 en el Listado de secuencias (documento n° WO2008/072540), se utilizó la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (secuencia Tol1-L) (SEC ID n° 14) y la secuencia de nucleótidos en las posiciones 1.351 a 1.855 (secuencia Tol1-R) (SEC ID n° 15) como secuencias de transposón.

Cada uno de los fragmentos de ADN sintéticos que comprendía un par de secuencias de transposón mediante el procedimiento siguiente. Un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos en el que una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción NruI se conectó tanto el extremo 5'-terminal como al extremo 3'-terminal de la secuencia Tol1-R. A continuación, un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos con una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción Fsel se conectó con el extremo 5'-terminal de la secuencia Tol1-L y un sitio de enzima de restricción AscI se conectó con el extremo 3'- terminal de la misma.

A continuación, los fragmentos de ADN preparados de esta manera que comprendía la secuencia Tol1-R y la secuencia Tol1-L se insertaron en el vector de expresión N5LG1_M2_Z3. El fragmento de ADN que comprendía la secuencia Tol1-R se insertó en el sitio de enzima de restricción NruI, presente en el lado 5'-terminal de un fragmento génico que comprende el casete de expresión génica de anticuerpo y un gen marcador seleccionable en el vector N5LG1_M2_Z3, y el fragmento de aDn que comprendía la secuencia Tol1-L se insertó en los sitios de enzima de restricción FseI y AscI en el lado 3'-terminal.

Además, se construyó el vector del transposón Tol1 para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano (figura 5) mediante la inserción de un casete de expresión de gen de resistencia a cicloheximida en el que se conectó un gen de resistencia a cicloheximida (un gen en el que la prolina de la posición 54 en la proteína ribosómica humana L36a había mutado en glutamina) bajo el control del intensificador/promotor del cMv en el sitio de reconocimiento FseI del vector N5LG1_M2_Z3 conectado con la secuencia del transposón Tol1.

(2) Preparación de vector de expresión de transposasa To1-L

La transposasa se expresó utilizando un vector de expresión independiente del vector de expresión del anticuerpo de interés. Es decir, un casete de expresión de gen de transposasa Tol1 en el que un fragmento de ADN que codifica una transposasa Tol1 derivada de pez medaka (SEC ID n° 17) comprendía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 16 se conectó bajo el control del intensificador/promotor del CMV en pBluescriptII Sk (+) (fabricado por Stratagene) y se utilizó como vector de expresión de la transposasa Tol1 pTol1ase (figura 6).

(3) Preparación de células de CHO que producen anticuerpo

Utilizando los vectores de expresión preparados en (1) a (3), anteriormente, se examinó la eficiencia de introducción del vector de expresión por el transposón Tol1 de la misma manera que en el Ejemplo 3. Se muestra el resultado en la Tabla 3.

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Vector de transposón Tol1

Ensayo 1: 133/192

Ensayo 2: 67 / 192

Ensayo 3: 122/192

Tal como se muestra en la Tabla 3, al introducir el vector de transposón Tol1 para la expresión del anticuerpo anti-M2 de influenza humano en células de CHO-K1 en suspensión, se obtuvieron transformantes resistentes a cicloheximida a una frecuencia elevada tal como en el Ejemplo 3 en el que se había introducido el vector de transposón Tol2 para la expresión de anticuerpo anti-M2 de influenza humano.

Se encontró, basándose en los resultados, que el gen de anticuerpo y el gen de resistencia a cicloheximida insertados entre un par de secuencias de transposón resultan transducidos eficientemente al interior del cromosoma de la célula hospedadora, es decir la célula de mamífero en suspensión, también en el caso de la utilización del transposón Tol1.

(4) Examen de la producción de anticuerpos en células de CHO en suspensión

Se examinó la eficiencia de producción de anticuerpos de las células de CHO en suspensión utilizando el transposón Tol1 de la misma manera que en el Ejemplo 3(3).

La concentración de anticuerpos en el sobrenadante de cultivo se midió de acuerdo con el procedimiento descrito en FEMS Yeast Res. 7:1307-1316, 2007. Se muestran los resultados en la figura 7.

Tal como se muestra en la figura 7, también se obtuvo un gran número de células que mostraba un nivel de expresión de anticuerpos marcadamente elevado en el caso de la utilización del transposón Tol1. A partir de este resultado, se encontró que, de manera similar al caso de utilización de la secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol2, también podía obtenerse una célula de mamífero en suspensión capaz de expresar a nivel elevado la proteína de interés al utilizar una secuencia de nucleótidos derivada del transposón Tol1 como secuencia de transposón.

[Ejemplo 5] Preparación de anticuerpos anti-CD98 humanos

(1) Preparación de vector transposón de expresión de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano y vector transposón de expresión de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano

Con el fin de preparar un anticuerpo qanti-CD98 humano que presenta la cadena H y la cadena L de la región variable presentadas por las secuencias de aminoácidos sEc ID n° 20 y n° 23, respectivamente, las secuencias e aminoácidos de las cadenas H y L se prepararon mediante la conexión de la secuencia de aminoácidos de la región constante del anticuerpo IgG1 humano con cada región variable de anticuerpo.

Mediante la utilización de las secuencias integradas en un vector (N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L) dado a conocer en la patente japonesa n° 4324637 como secuencias génicas (SEC ID n° 18 y n° 21, respectivamente) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD98 humano y la región variable de cadena ligera a la que se había conectado una secuencia de señal, y utilizando una secuencia de transposón y un promotor similares a los utilizados en el Ejemplo 1, se construyó respectivamente un vector transposón de expresión de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano (en adelante, denominado vector CD98H) y un vector transposón de expresión de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano (en adelante denominado vector CD98L) (figs. 8 y 9).

El fragmento de ADN que debía utilizarse se sintetizó químicamente de manera artificial basándose en la secuencia conocida convencionalmente u obtenido mediante la preparación de cebadores de ambas secuencias terminales y llevando a cabo la PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Se unió un sitio de digestión con enzima de restricción a un extremo de cada cebador para las últimas operaciones de recombinación génica.

(2) Preparación de vector transposón de expresión gen de resistencia a cicloheximida

Se construyó un vector transposón de expresión de gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector CHX) mediante la conexión de la secuencia codificante de un gen de resistencia a cicloheximida (SEC ID n° 7) bajo el control del intensificador/promotor del CMV descrito en el Ejemplo 1 e insertando un par de secuencias de transposón (Tol-2R, Tol2-R) en ambos extremos del casete de expresión de gen de resistencia a cicloheximida (figura 10).

El fragmento de ADN que debía utilizarse se sintetizó químicamente de manera artificial basándose en la

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secuencia convencionalmente conocida o se obtuvo mediante la preparación de cebadores de ambas secuencias terminales y realizando después una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada como molde. Se unió un sitio de digestión con enzima de restricción a un extremo de cada cebador para las últimas operaciones de recombinación génica.

(3) Preparación de células de CHO que producen anticuerpo anti-CD98 humano

Se introdujo el vector CD98H (figura 8), el vector CD98L (figura 9) y el vector CHX (figura 10) preparados en (1) y

(2) anteriormente indicados y el vector de Tol2 (figura 3) preparado en el Ejemplo 2, en células de CHO-K1 que se adaptó al cultivo en suspensión y se comparó el número de células que aparecían que eran capaces de expresar a nivel elevado el anticuerpo.

En el diseño experimental, se suspendieron 4x106 células de CHO-K1 en 400 pl de PBS y se cotransfectaron directamente el vector CD98H (10 pg), el vector CD98L (10 pg), el vector CHX (10 pg) y el vector de Tol2 (10 pg) en forma de ADN circular mediante electroporación. Con el fin de expresar la transposasa Tol1 transitoriamente y para evitar la integración en el cromosoma huésped, se introdujo directamente el vector de Tol2 en forma de ADN circular. La electroporación se llevó a cabo utilizando un electroporador (sistema Gene Pulser Xcell, fabricado por Bio-Rad) bajo condiciones de voltaje de 300 V, capacidad electrostática de 500 pF y temperatura ambiente y utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricado por Bio-Rad).

Además, en el diseño experimental, se linealizó cada uno de los vectores CD98H (10 pg), CD98L (10 pg) y CHX (10 pg) utilizando un enzima de restricción Pcil (Takara Bio Inc.) y después se llevó a cabo la electroporación de la misma manera que anteriormente.

Tras la introducción génica mediante electroporación, las células en cada cubeta se suspendieron en medio CD OptiCHO complementado con 0,5% de hidrolizado de soja (en adelante denominado medio 0.5CD), se inocularon en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 4 días en un incubador de CO2. A continuación, desde el intercambio de medio 5 días después de la introducción génica, se llevó a cabo el cultivo en presencia de cicloheximida utilizando el medio 0.5CD complementado con 3 pg/ml de cicloheximida (C4859, Sigma-Aldrich) seguido del cultivo durante 4 semanas, realizando el intercambio de medio a intervalos de una semana.

Tras 4 semanas de cultivo, se determinó la expresión del anticuerpo mediante un procedimiento de tipo sándwich (LENCEtm, Perkin-Elmer Corp.) utilizando fReT (transferencia de energía por resonancia fluorescente). Con respecto a las células con nivel alto de expresión de anticuerpo, se contaron los clones que expresaban el anticuerpo a una concentración en el sobrenadante de cultivo de 5,0 pg/ml o superior como células expresantes de anticuerpo; se muestran los resultados en la Tabla 4.

ÍTabla 41

: Diseño de control Diseño experimental

Placa 1: 10/96 29/96

Placa 1: 20/96 49/96

Tal como se muestra en la Tabla 4, se encontró un gran número de células de expresión de anticuerpo anti- CD98 humano en el diseño experimento, en el que se cotransfectó vector de Tol2 en las células de CHO-K1 en suspensión con vector transposón de expresión de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano, vector transposón de expresión de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano y vector de gen de resistencia a cicloheximida mientras que las células de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano no se encontraron en el diseño experimental en el que no se cotransfectó vector de Tol2 a pesar de convertir los vectores en cadenas lineales.

[Ejemplo 6] Producción de anticuerpo anti-CD98 humano

(1) Preparación de vector transposón de expresión que comprende fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano, fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano y gen de resistencia a cicloheximida

Se construyó un vector transposón de expresión que contenía fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano, fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano y gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector en tándem CD98-CHX) utilizando ADN sintético y un procedimiento de PCR de la misma manera que anteriormente, mediante la conexión del vector transposón de expresión de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano preparado en el Ejemplo 5(1) con el casete génico de expresión de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98 humano preparado en el Ejemplo 5(1) y el casete génico de resistencia a la cicloheximida preparado en el Ejemplo 5(2).

(2) Preparación de vector transposón de expresión que comprende fragmento génico de cadena pesada de

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anticuerpo anti-CD98 humano y gen de resistencia a cicloheximida

Se construyó un vector transposón de expresión que comprendía fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano y gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector transposón de expresión CD98H-CHX) utilizando ADN sintético y un procedimiento de PCR de la misma manera que anteriormente, mediante la conexión del vector transposón de expresión de cadena pesada de anticuerpo anti- CD98 humano preparado en el Ejemplo 5(1) con el casete génico de resistencia a cicloheximida preparado en el Ejemplo 5(2).

(3) Preparación de células de CHO productoras de anticuerpo anti-CD98 humano

Mediante la utilización de los vectores transposón de expresión preparados en los Ejemplos 5(1) y (2) anteriormente y los Ejemplos 6(1) y (2), anteriormente, se comparó la presencia de células capaces de expresar a nivel elevado anticuerpo anti-CD98 con el caso de transferencia génica de cadenas H y L de anticuerpo anti- CD98 humano utilizando el mismo vector de expresión (diseño de control), en el caso de transferencia génica de cadena H o L de gen de anticuerpo anti-CD98 humano o de resistencia a cicloheximida, respectivamente, utilizando diferentes vectores de expresión (diseño experimental 1) y con el caso de transferencia génica de cadena H o L utilizando diferentes vectores de expresión (diseño experimental 2).

En el diseño experimental 1, se suspendieron 4x106 células de CHO-K1 en 400 pl de PBS y se cotransfectaron directamente vector CD98H (10 pg), vector CD98L (10 pg), vector CHX (10 pg) y vector de Tol2 (10 pg) como ADN circular mediante electroporación.

En el diseño experimental, se suspendieron 4x106 células de CHO-K1 en 400 pl de PBS y se cotransfectaron directamente vector CD98H-CHX (10 pg), vector CD98L (10 pg) y vector de Tol2 (10 pg) como ADN circular mediante electroporación.

En el diseño experimental, se suspendieron 4x106 células de CHO-K1 en 400 pl de PBS y se cotransfectaron directamente vector en tándem CD98H-CHX (10 pg) y vector de Tol2 (20 pg) como ADN circular mediante electroporación. Además, en todos los ensayos, con el fin de expresar transposasa Tol2 transitoriamente y evitar la integración en el cromosoma del huésped, se introdujo el vector de Tol2 directamente en forma de ADN circular.

En el procedimiento a continuación, se confirmó la presencia de células productoras de anticuerpo de la misma manera que en el Ejemplo 5(3). Con respecto a las células productoras de anticuerpos, se contaron como células expresantes de anticuerpo los clones en los que la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo era de 3,0 pg/ml o superior. Se muestran los resultados en la Tabla 5.

ÍTabla 51

: Diseño de control Diseño experimental 1 Diseño experimental 2

Placa 1: 18/96 82/96 95/96

Placa 2: 21/96 85/96 96/96

Total: 39/192 167/192 191/192

En el diseño experimental 1 en el que se había introducido vector CD98H, vector CD98L y vector CHX y en el diseño experimental 2 en el que se había introducido vector CD98H y CD98L, se incrementó marcadamente la incidencia de células capaces de expresar a nivel elevado el anticuerpo anti-CD98 humano.

Los resultados anteriormente proporcionados demuestran que las células que presentan una productividad elevada de anticuerpo pueden obtenerse y producirse fácilmente al cotransfectar diferentes vectores de expresión en los que se han insertado, respectivamente, el gen de cadena pesada de anticuerpo y el gen de cadena ligera de anticuerpo entre las secuencias de transposón, en las células de CHO en suspensión, en comparación con el caso en que un vector de expresión preparado mediante la integración del gen de cadena pesada de anticuerpo y el gen de cadena ligera de anticuerpo en el mismo vector de expresión se introduce en las células de CHO en suspensión. Además, se reveló a partir de los resultados del diseño experimental 1 y del diseño experimental 2 que incluso en el caso de que fuesen dos o más los vectores que debían introducirse, resultaba suficiente un gen de resistencia a fármaco (gen marcador seleccionable). Además, se reveló que el gen de resistencia a fármaco puede encontrarse presente en un vector de expresión en el que se ha integrado el gen de cadena pesada de anticuerpo o en un vector independiente diferente.

Los resultados anteriormente proporcionados demuestran que un vector transposón resulta eficaz como medio para introducir eficientemente genes situados en dos o más vectores en una suspensión de células de mamífero, lo que resultaba difícil de conseguir convencionalmente. Además, se demuestra que para el propósito de conseguir una productividad elevada de una proteína que comprende más de un polipéptido o de más de una proteína, resulta eficaz introducir polipéptidos y proteínas utilizando diferentes vectores transposones.

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(4) Cultivo de células de CHO que producen anticuerpo anti-CD98 humano

Se seleccionaron las tres líneas celulares que presentaban la productividad más elevada de anticuerpos de entre las células en las que se había introducido el vector en tándem CD98-CHX obtenido en el Ejemplo 6(3) anteriormente indicado y se compararon los niveles de expresión de anticuerpos de las células en las que se había introducido el vector CD98H-CHX y el vector CD98L. A continuación se proporciona la información de los ensayos.

La célula de CHO-K1 obtenida en el Ejemplo 683) se seleccionó basándose en la resistencia a la cicloheximida y que también expresaba el anticuerpo anti-CD98; se expandió el cultivo utilizando una placa de 96 pocillos, una placa de 24 pocillos y una placa de 6 pocillos (Corning Glassworks), en este orden. Tras expandir los cultivos, se midió la concentración de anticuerpo en cada sobrenadante de cultivo y se seleccionaron las tres líneas celulares de CHO con los niveles más elevados de expresión de anticuerpo anti-CD98. A continuación, cada una de las tres líneas celulares seleccionadas de esta manera se suspendió en 3 ml de medio CD al 0,5% (Invitrogen), es decir medio 0.5 CD, hasta una densidad de 2x105 células/ml y se cultivaron en un agitador durante 5 días en una atmósfera a 37°C y con 5% de CO2 utilizando una placa de 6 pocillos. Se determinó la cantidad de anticuerpo en el medio tras 5 días de cultivo, mediante HPLC (Waters Associates, Inc.). Se muestran los resultados en la Tabla 6.

ÍTabla 61

Células derivadas de diseño de control Células derivadas de diseño experimental 2

Nivel de expresión

de anticuerpo 70 67 41 196 87 67

(mg/l)___________________________________________________________________________________

Tal como se muestra en la Tabla 6, las células de CHO-K1 cotransfectadas con vector CD98H y vector CD98L presentaba un nivel elevado de producción de anticuerpos en comparación con las células de CHO-K1 en las que se había introducido vector en tándem CD98-CHX.

Los resultados anteriores demuestran que no sólo puede obtenerse y producirse fácilmente una línea celular de alta producción de anticuerpos sino que también las células obtenidas de esta manera presentan una elevada productividad de anticuerpos, al cotransfectar en las células de CHO en suspensión diferentes vectores de expresión en los que se han insertado el gen de cadena pesada de anticuerpo y el gen de cadena ligera de anticuerpo, respectivamente, entre un par de secuencias de transposón.

[Ejemplo 7] Producción de anticuerpo anti-factor alfa de necrosis tumoral (TNFa) humano

(1) Preparación de vector transposón de expresión que contiene un fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo de TNFa, fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo de TNFa y gen de resistencia a cicloheximida

Con el fin de preparar anticuerpo anti-TNFa humano con la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26 y SEC ID n° 29, se construyó un fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano, un fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano y un vector transposón de expresión de gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector en tándem TNFa-CHX) mediante la sustitución de los fragmentos génicos de VH y VL del vector transposón de expresión que comprendía el fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano y el fragmento génico de cadena ligera y el gen de resistencia a cicloheximida preparados en el Ejemplo 6(1) (vector en tándem CD98-CHX) por VH y Vl derivados del anticuerpo anti-TNFa humano, respectivamente.

Se prepararon las secuencias del gen de cadena pesada del anticuerpo anti-TNFa humano y del gen de la cadena ligera utilizando un ADN sintético, mediante la preparación de secuencias de aminoácidos (SEC ID n° 26 y n° 29) en las que se había conectado una secuencia de señal a las secuencias de aminoácidos (SEC ID n° 25 y n° 28) de la subunidad de región variable de cadena pesada o de la subunidad de región variable de cadena ligera de Adalimumab (recombinante), descrito en las figs. 1 y 2, respectivamente, del informe de inspección de HUMIRA® 40 mg para inyección subcutánea (Agencia de Dispositivos Farmacéuticos y Médicos, 14 de febrero de 2008) y se determinaron las secuencias de nucleótidos de manera que las secuencias de aminoácidos no cambiasen (SEC ID n° 24 y n° 27). Para las manipulaciones génicas posteriores se añadió un sitio de digestión con enzima de restricción al extremo de las secuencias artificiales.

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(2) Preparación de vector transposón de expresión que comprende fragmento de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano y gen de resistencia a cicloheximida

Se construyó un vector transposón de expresión que contenía fragmento de cadena pesada de anticuerpo anti- TNFa humano y gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector TNFaH-CHX) mediante la modificación de una región de fragmento génico de VH del vector transposón de expresión que contenía fragmento de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98 humano y gen de resistencia a cicloheximida (vector CD98H-CHX) preparado en el Ejemplo 6(2) en un fragmento génico de VH de anticuerpo anti-TNFa humano. Como gen de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano, se utilizó una secuencia de la misma secuencia mostrada en dicho ítem 81).

(3) Preparación de vector transposón de vector de gen de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano

Se construyó un vector transposón de expresión de gen de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano (en adelante denominado vector CD98L) mediante la modificación de la región génica de la cadena ligera del vector transposón de expresión de gen de cadena ligera del anticuerpo anti-CD98 humano en el Ejemplo 6(1) en cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano. Como gen de VL del anticuerpo anti-TNFa humano, se utilizó la misma secuencia que la mostrada en dicho ítem (1).

(4) Preparación de células de CHO que producen anticuerpo anti-TNFa humano

Con el fin de preparar células de CHO-K1 que produjesen anticuerpo anti-TNFa humano, se introdujo el vector en tándem TNFa-CHX (20 |jg) preparado en (1) indicado anteriormente y el vector de expresión de la transposasa Tol2 (vector Tol2) (10 jg) preparado en el Ejemplo 2, en células de CHO-K1 adaptadas para el cultivo en suspensión preparada en el Ejemplo 3 (diseño de control).

De la misma manera, se cotransfectaron directamente en la forma de ADN circular (diseño experimental) el vector TNFaH-CHX (10 jg), el vector TNFaL (10 jg) y el vector Tol2 (10 jg) preparados en el Ejemplo 2, en células de CHO-K1 adaptadas para el cultivo en suspensión preparadas en el Ejemplo 3 (diseño de control). Se comparó la presencia de células capaces de expresar a nivel elevado el anticuerpo llevando a cabo la introducción génica, el cultivo celular y similares de la misma manera que en el Ejemplo 6, excepto en que el cultivo de las células con introducción génica se llevó a cabo en cinco placas de 96 pocillos. Con respecto a las células con una elevada productividad de anticuerpos, se contaron como células expresantes de anticuerpo los clones en los que la concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo era de 3,0 jg/ml o superior. Se muestran los resultados en la Tabla 7.

ÍTabla 71

Diseño de control Diseño experimental

Número de pocillos en los que se expresa el anticuerpo

Placa 1: 20/96 83/96

Placa 2: 22/96 76/96

Placa 3: 21/96 82/96

Placa 4: 20/96 79/96

Placa 5: 27/96 81/96

Total: 110/480 401/480

Tal como se muestra en la Tabla 7, tal como en el caso de las células productoras de anticuerpo anti-CD98 humano preparadas en el Ejemplo 6, las células de CHO-K1 cotransfectadas con vector TNFaH-CHX y vector TNFaL mostraron una presencia aproximadamente 4 veces superior de células en las que se expresaba a nivel elevado el anticuerpo anti-TNFa humano, en comparación con células de CHO-K1 en las que se había introducido vector en tándem TNFa-CHX.

Dicho resultado muestra que, respecto a cualquier anticuerpo, puede obtenerse y producirse fácilmente una línea celular con una elevada productividad de anticuerpos mediante la cotransfección del gen de cadena pesada de anticuerpo y el gen de cadena ligera de anticuerpo, los cuales son insertados, respectivamente, entre un par de secuencias de transposón introducidas en diferentes vectores de expresión en las células de CHO en suspensión.

(5) Cultivo de células de CHO que producen anticuerpo anti-TNFa humano

Las células seleccionadas basándose en la resistencia a la cicloheximida a partir de las células en las que se había introducido vector en tándem TNFa-CHX obtenidas en (4) indicado anteriormente y las células que habían sido cotransfectadas con vector TNFaH-CHX y vector TNFaL, y que también expresaban el anticuerpo anti-TNFa humano, se seleccionaron y se expandieron en cultivo en placa de 96 pocillos, placa de 24 pocillos y placa de 6 pocillos, en ese orden. Con respecto a las 4 líneas celulares de células en las que se había introducido vector en

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tándem TNFa-CHX que pudieron expandirse en cultivo y 52 líneas celulares que habían sido cotransfectadas con vector TNFaH-CHX y vector TNFaL, estas células fueron cultivadas de la misma manera que en el Ejemplo 6(4), excepto en que el periodo de cultivo fue de 7 días, y se midieron los niveles de expresión de los anticuerpos. Se muestran los resultados en la figura 11.

Como resultado, las células de CHO-K1 que habían sido cotransfectadas con vector TNFaH-CHX y vector TNFaL mostraron una productividad de anticuerpos aproximadamente 2,4 veces superior a la de las células de CHO-K1 en las que se había introducido el vector en tándem TNFa-CHX.

Dicho resultado muestra que, tal como en el caso del Ejemplo 6(4), no sólo pueden obtenerse y producirse células que presentan una elevada productividad de anticuerpo sino que las células obtenidas de esta manera presentan una elevada productividad de anticuerpos al cotransfectarlas en células de CHO en suspensión con diferentes vectores de expresión en los que se ha insertado el gen de cadena pesada de anticuerpo y el gen de cadena ligera de anticuerpo entre un par de secuencias de transposón.

[Ejemplo 8] Producción de anticuerpo anti-CD20 humano

(1) Preparación de vector transposón de expresión que comprende fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano, fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 humano y gen de resistencia a cicloheximida

Con el fin de preparar un anticuerpo anti-CD20 humano que comprendía VH y VL representado por las secuencias de aminoácidos de SEC ID n° 32 y n° 35, respectivamente, se construyó un vector transposón de expresión que comprendía un fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano, un fragmento génico de cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 humano y un gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector en tándem CD98-CHX) mediante la sustitución de las regiones génicas de VH y VL de anticuerpo del vector en tándem CD98-CHX preparado en el Ejemplo 6(1) por VH y VL, respectivamente, derivados de anticuerpo anti-CD20 humano.

Se prepararon las secuencias génicas de la región VH y la región VL de anticuerpo anti-CD20 humano utilizando un ADN sintético, mediante la preparación de la secuencia de nucleótidos indicada en GenBank n° de acceso AR000013 y las secuencias de aminoácidos (SEC ID n° 31 y n° 34, respectivamente) en las que una secuencia de señal había sido conectada con las secuencias de aminoácidos (SEC ID n° 32 y n° 35, respectivamente) de la VH y la VL del rituximab, indicado en la hoja adjunta del informe de inspección del Rituxan® para inyección 10 mg/ml (informado por el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud, n° 3395, 28 de agosto de 2003) y se determinaron las secuencias de nucleótidos de manera que las secuencias de aminoácidos no cambiasen (SEC ID n° 30 y n° 33). Para estas últimas manipulaciones génicas, se añadió un sitio de digestión con enzima de restricción al extremo de las secuencias artificiales.

(2) Preparación de vector transposón de expresión que comprende fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano y gen de resistencia a cicloheximida

Se construyó un vector transposón de expresión que comprendía fragmento génico de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano y gen de resistencia a cicloheximida (en adelante denominado vector CD20H- CHX) mediante la modificación de la región génica de VH de anticuerpo del vector CD98H-CHX preparado en el Ejemplo 6(2) en una VH derivada de anticuerpo anti-CD20 humano. Como gen de la cadena pesada del anticuerpo anti-CD20 humano, se utilizó la misma secuencia que la mostrada en (1), anteriormente indicado.

(3) Preparación de vector transposón de expresión de gen de cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 humano

Se construyó un vector transposón de expresión de gen de cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 humano (en adelante denominado vector CD20L) mediante la modificación de las regiones génicas de VL del anticuerpo anti- CD98 humano preparado en el Ejemplo 6(1) en la VL derivada de anticuerpo anti-CD20 humano. Como genes de cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-CD20 humano, se utilizaron las mismas secuencias que las mostradas en (1), anteriormente indicado.

(4) Preparación de células de CHO que producen anticuerpo anti-CD20 humano

Con el fin de preparar células de CHO-K1 que produjesen anticuerpo anti-CD20 humano, se introdujeron en las células de CHO-K1 adaptadas para el cultivo en suspensión preparadas en el Ejemplo 3(1) (diseño de control) el vector en tándem CD20-CHX preparado en (1), anteriormente indicado, y el vector de expresión de la transposasa Tol2 (vector Tol2) preparado en el Ejemplo 2.

De la misma manera, el vector CD20H-CHX (10 |jg) y el vector CD20L (10 |jg) preparados en (2) y (3), anteriormente, se cotransfectaron en células de CHO-K1 junto con el vector Tol2 (10 jg) (diseño experimental). Se comparó la presencia de células capaces de expresar a nivel elevado el anticuerpo mediante la realización de

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la introducción génica, el cultivo celular y similares de la misma manera que en el Ejemplo 6, excepto en que el cultivo de las células con introducción génica se llevó a cabo en cinco placas de 96 pocillos. Además, se consideraron pocillos expresantes de anticuerpos las concentraciones de anticuerpos de 3,0 |jg/ml o superior. Se muestran los resultados en la Tabla 8.

ÍTabla 81

Diseño de control Diseño experimental

Número de pocillos en los que se expresa el anticuerpo

Placa 1: 2/96 4/96

Placa 2: 2/96 9/96

Placa 3: 4/96 4/96

Placa 4: 1/96 8/96

Placa 5: 2/96 5/96

Total: 11/480 30/480

Como resultado, las células de CHO-K1 que habían sido cotransfectadas con vector CD20-H-CHX y vector CD20L mostraron 3 veces más células con nivel alto de expresión de anticuerpo anti-CD20 humano que las células de CHO-K1 en las que se había introducido el vector en tándem CD20-CHX.

Dicho resultado es similar al resultado de anticuerpo anti-CD98 humano y anticuerpo anti-TNFa humano del Ejemplo 6(3) o del Ejemplo 7(3) y muestra que la línea celular productora de un nivel elevado de anticuerpos puede obtenerse y producirse con facilidad para cada caso de anticuerpo al cotransfectar células de CHO en suspensión con vectores de expresión diferentes en los que se han integrado gen de cadena pesada de anticuerpo y gen de cadena ligera de anticuerpo, respectivamente, entre secuencias de transposón.

(5) Cultivo de células de CHO que producen anticuerpo anti-CD20 humano

Las células que habían sido seleccionadas basándose en la resistencia a la cicloheximida a partir de las células en las que se había introducido el vector en tándem CD20-CHX obtenidas en (3), anteriormente, y las células que habían sido cotransfectadas con el vector CD20H-CHX y el vector CD20L, y que también expresaban el anticuerpo anti-CD20 humano, se seleccionaron y expandieron en cultivo utilizando una placa de 96 pocillos, una placa de 24 pocillos y una placa de 6 pocillos, en ese orden. Con respecto a las 4 líneas celulares del diseño de control, las células que pudieron expandirse en cultivo y las 50 líneas celulares del diseño experimental, se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 6(4), excepto en que el periodo de cultivo era de 7 días, y se midieron sus niveles de expresión de anticuerpos. Se muestran los resultados en la figura 12.

Tal como se muestra en la figura 12, se reveló que las células de CHO-K1 que habían sido cotransfectadas con vector CD20H-CHX y vector CD20L presentaban una productividad de anticuerpos aproximadamente 1,6 veces superior que las células de CHO-K1 en las que se había introducido el vector en tándem CD20-CHX.

Dicho resultado es similar al resultado de anticuerpo anti-CD98 humano y anticuerpo anti-TNFa humano del Ejemplo 6(4) o del Ejemplo 7(5) y muestra que no sólo puede obtenerse y producirse con facilidad una línea celular productora de un nivel elevado de anticuerpos para cada caso de anticuerpo al cotransfectar células de CHO en suspensión con vectores de expresión diferentes en los que se han integrado gen de cadena pesada de anticuerpo y gen de cadena ligera de anticuerpo, respectivamente, entre secuencias de transposón, sino también las células obtenidas de esta manera presentan una elevada productividad de anticuerpos.

[Ejemplo 9] Preparación de un vector transposón que expresa gen de resistencia a la neomicina y anticuerpo anti-CD98 humano

(1) Preparación de un vector transposón que expresa gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y anticuerpo anti-CD98 humano

Se utilizó un plásmido que comprendía un casete de expresión génica para el uso en células de mamífero que comprendía un gen de anticuerpo humano arbitrario y un gen marcador de resistencia a fármaco insertados entre un par de secuencias de nucleótidos derivadas de Tol2 como vector plásmido para la expresión de proteínas.

El ADN del gen que debía utilizarse se obtuvo llevando a cabo una síntesis química de modo artificial basándose en la secuencia de nucleótidos conocida convencionalmente o mediante la preparación de cebadores de las dos secuencias terminales y llevando a cabo de esta manera una PCR utilizando una fuente de ADN apropiada. Para las manipulaciones génicas posteriores, se añadió un sitio de digestión con enzima de restricción al extremo del cebador.

En la secuencia de nucleótidos del transposón Tol2 no autónomo (SEC ID n° 1) dada a conocer en el documento n° JP-A-2003-235575, se utilizó una secuencia de nucleótidos en las posiciones 1 a 200 (secuencia Tol2-L) (SEC

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ID n° 2) y una secuencia de nucleótidos en las posiciones 2.285 a 2.788 (secuencia Tol2-R) (SEC ID n° 3) como las secuencias de transposón.

Se sintetizó un fragmento de ADN que comprendía la secuencia Tol2-R y la secuencia Tol2-L.

Se preparó un fragmento de ADN que incluía una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 18) que codificaba la cadena H del anticuerpo bajo el control del promotor del CMV, amplificado basándose en el vector N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L del anticuerpo anti-CD98 humano (patente japonesa n° 4324637), como casete génico de la cadena pesada del anticuerpo y se amplificó un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos (SEC ID n° 21) que codificaba la cadena ligera de anticuerpo bajo el control del promotor del SV40, amplificada basándose en el vector N5KG1-Val C2IgG1NS/I117L del anticuerpo anti-CD98 humano, como casete génico de la cadena ligera del anticuerpo.

Como casete génico de resistencia a la neomicina, se preparó un fragmento de ADN que comprendía un ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante de un gen de resistencia a la neomicina bajo el control del promotor del SV40 (un ADN que codifica una neomicina fosfotransferasa que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 36 y GenBank n° de acceso U47120.2).

Se preparó un vector A de expresión del anticuerpo anti-CD98 mediante la conexión del casete de expresión génica de la cadena pesada del anticuerpo anteriormente indicado, el casete de expresión génica de la cadena ligera del anticuerpo y el casete de expresión génica de resistencia a la neomicina y conectando adicionalmente sus dos extremos con un fragmento de ADN que comprendía una secuencia Tol2-R y un fragmento de ADN que comprendía una secuencia Tol2-L (figura 13).

(2) Preparación de vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprende un gen 1 de resistencia a neomicina de tipo modificado

Se preparó un vector transposón B de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que se había sustituido el gen de resistencia a neomicina del vector transposón A de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en (1) que comprendía un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje por un gen 1 de resistencia a neomicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 37.

El gen 1 de resistencia a neomicina de tipo modificado codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y fue modificada para que presentase una secuencia de nucleótidos en la que 167 bases correspondientes a 22% de la secuencia completa fuesen modificados. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, se modificaron los codones correspondientes a 25 residuos de leucina para que fuesen TTA.

(3) Preparación de vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprende un gen 2 de resistencia a neomicina de tipo modificado

Un vector transposón C de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector transposón A de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en (1) que

comprende un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje fue sustituido por un gen 2 de resistencia a

neomicina de tipo modificado que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 38.

El gen 2 de resistencia a neomicina de tipo modificado codificado por una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y que presentaba una secuencia de nucleótidos en la que las 180 bases correspondientes a 23% del total habían sido modificados. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, los codones correspondientes a 28 residuos de leucina se modificaron para ser TTA.

(4) Preparación de vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que presenta un gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado

Un vector transposón D de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector transposón A de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en (1) que

comprende un gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje fue sustituido por un gen 3 de resistencia a

neomicina de tipo modificado que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 39.

El gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que 203 bases, correspondientes a 26% del total, habían sido modificados. Específicamente, de entre el total de 32 residuos de leucina, los codones correspondientes a 30 residuos de leucina se modificaron para ser TTA.

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[Ejemplo 10] Producción de anticuerpos por células de CHO productoras de anticuerpos que expresan un gen de resistencia a neomicina de tipo modificado

Se prepararon las células A a D productoras de anticuerpos mediante la introducción en cada célula de los vectores transposones A a D de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano preparados en los Ejemplos 9(1) a

(4) en las células de CHO-K1 en suspensión junto con el vector pCAGGS-T2TP, que expresaba una transposasa Tol2 que comprendía la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 40 [Kwakami K. y Noda T., Genetics 166:895-899, 2004].

La introducción de vectores en las células de CHO en suspensión se llevó a cabo mediante la suspensión de las células de CHO (4x106 células) en 400 pl de tampón PBS y cotransfectando el vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano (10 pg) y el vector de expresión de transposasa Tol2 pCAGGS-T2TP (20 pg) directamente en forma de ADN circular mediante electroporación.

En dicho caso también se introdujo el vector de expresión de transposasa Tol2 directamente como ADN circular con el fin de expresar transitoriamente la transposasa Tol2.

Además, como control que no utilizaba transposasa Tol2, el vector transposón D de expresión del anticuerpo anti-CD98 humano (10 pg) del Ejemplo 19(4) se linealizó utilizando el enzima de restricción Pcil (TARA BIO INC.) y después se introdujo en las células de CHO-K1 en suspensión mediante electroporación.

La electroporación se llevó a cabo utilizando un electroporador [sistema Gene Pulser Xcell (fabricado por Bio- Rad)] bajo condiciones de voltaje de 300 V, capacidad electrostática de 500 pF y a temperatura ambiente, utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricada por Bio-Rad).

Tras la introducción génica mediante electroporación, las células en cada cubeta fueron inoculadas en una placa de 96 pocillos y cultivadas durante 3 días en un incubador de CO2 utilizando medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con hidrolizado de soja al 5%.

A continuación, a partir del intercambio de medio 4 días después de la introducción génica, se llevó a cabo el cultivo en presencia de G418 (Geneticin®, Invitrogen), mediante la adición de G418 hasta proporcionar una concentración final de 500 pg/ml, y se llevó a cabo el cultivo durante 3 semanas cambiando el medio a intervalos de una semana.

Tras el cultivo, se determinó la expresión del anticuerpo utilizando el ensayo LANCE® (Perkin-Elmer Corp.) mediante un procedimiento de tipo sándwich al que se aplicó FRET (transferencia de energía mediante resonancia de fluorescencia). Se muestran los resultados en la Tabla 9.

[Tabla 9]

: Células productoras de anticuerpos

: A (tipo salvaje) B (tipo modificado 1) C (tipo modificado 2) D (tipo modificado 3) Células de control

Nivel de expresión de anticuerpos (mg/l) de células que mostraban la expresión máxima: 0,5 2,0 1,6 5,1 -

Nivel de expresión medio de anticuerpos (mg/l) de las 10 células superiores: 0,5 0,7 0,7 1,7 -

Tal como se muestra en la Tabla 9, los niveles de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano de las células B a D que expresaban los genes de resistencia a neomicina de tipo modificado eran superiores a los de la célula A, que expresaba el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje.

En particular, en el caso de la célula D productora de anticuerpo anti-CD98 humano, que expresa el gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado, se obtuvo una línea celular que mostraba un nivel de expresión 10 veces más elevado que el de la célula A productora de anticuerpo anti-CD98 humano, que expresa el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje.

Además, ni siquiera utilizando el gen 3 de resistencia a neomicina de tipo modificado, resultó posible obtener una célula que expresase el anticuerpo anti-CD98 humano a partir de células de control en las que no se había cotransfectado el vector de expresión de transposasa Tol2 a pesar de haber linealizado el vector.

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[Ejemplo 11] Preparación de vector transposón que expresa gen de resistencia a puromicina y anticuerpo anti-CD98 humano

(1) Preparación de vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprende gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado

Se preparó un vector transposón E de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector transposón A de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en el ejemplo 9(1) que comprendía el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje, se había sustituido por un gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado consistente en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 41.

El gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificada codificaba una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje que consistía en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 42 (un gen de puromicín-N-acetiltransferasa que consiste en la secuencia de nucleótidos dada a conocer en GenBank n° de acceso U07648.1) y presentaba una secuencia de nucleótidos en la que 17 bases, correspondientes a 3% del total de bases, habían sido modificadas. Específicamente, de entre el total de 28 residuos de alanina contenidos en el gen de resistencia a puromicina, los codones correspondientes a 17 residuos de alanina habían sido modificados a GCG mediante la modificación y, junto con los codones que ya eran GCG en el tipo salvaje, los codones que correspondían a todos los residuos de alanina se modificaron a GCG.

(2) Preparación de vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprende gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado

Se preparó un vector transposón F de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano en el que el gen de resistencia a neomicina del vector transposón A de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano obtenido en el Ejemplo 9(1) que comprendía el gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje se había sustituido por un gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado que comprendía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 43. El gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado codifica una secuencia de aminoácidos idéntica a la del gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje y presenta una secuencia de nucleótidos en la que 79 bases correspondientes a 14% del total de bases han sido modificadas. Específicamente, además de la modificación de codones que corresponden a los residuos de alanina del gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado, se modificaron los codones correspondientes a los residuos de leucina para que fuesen TTA, y los codones correspondientes a los residuos de valina se modificaron para que fuesen GTA y el codón de la serina se modificó para que fuese TCG.

[Ejemplo 12] Producción de anticuerpos por células de CHO productoras de anticuerpos que expresan gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado

Se prepararon las células E y F productoras de anticuerpos mediante la introducción de vector transposón E de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano del Ejemplo 11(1) que comprendía el gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado, el vector transposón F de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano del Ejemplo 11(2) que comprendía el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado y el vector de expresión de la transposasa Tol2 pCAGGS-T2TP en células de CHO-K1 en suspensión.

La introducción de los vectores en las células en suspensión se llevó a cabo mediante la suspensión de células de CHO en suspensión (4x10 6 células) en 400 pl de tampón PBS y la cotransfección del vector transposón de expresión de anticuerpo anti-CD98 humano que comprendía el gen de resistencia a puromicina de tipo modificado en forma de ADN circular (10 pg) y pCAGGS-T2TP (20 pg) directamente mediante electroporación.

En dicho caso, el vector de expresión de la transposasa Tol2 pCAGGS-T2TP también se introdujo directamente en forma de ADN circular con el fin de expresar transitoriamente la transposasa Tol2.

La electroporación se llevó a cabo utilizando un electroporador [sistema Gene Pulser Xcell (fabricado por Bio- Rad)] bajo las condiciones de voltaje de 300 V, capacidad electrostática de 500 pF y temperatura ambiente y utilizando una cubeta de 4 mm de anchura de hueco (fabricada por Bio-Rad).

Tras la introducción génica mediante electroporación, se inocularon las células de cada cubeta en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 3 días en un incubador de CO2 utilizando medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con hidrolizado de soja al 5%.

A continuación, desde el intercambio de medio 2 días después de la introducción génica, se llevó a cabo el cultivo durante 4 semanas, añadiendo simultáneamente puromicina (P9620, Sigma-Aldrich), proporcionando una concentración final de 5 pg/ml y realizando el intercambio de medio por el medio que contenía puromicina a intervalos de una semana.

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Tras el cultivo, se determinó el nivel de expresión de anticuerpos utilizando el ensayo LANCE® (Perkin-Elmer Corp.) mediante un procedimiento de tipo sándwich al que se aplicó FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia). Se muestran los resultados en la Tabla 2.

ÍTabla 101

: Células productoras de anticuerpos

: E (Modificación 1) F (Modificación 2)

Nivel de expresión de anticuerpos (mg/l) de las células que mostraban la expresión máxima: 1,0 2,2

Nivel medio de expresión de anticuerpos (mg/l) de las 10 células superiores: 0,7 1,6

Tal como se muestra en la Tabla 10, la célula F productora de anticuerpos que expresaba el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificada mostraba una productividad de anticuerpos dos veces superior o más a la de la célula E productora de anticuerpos que expresa el gen 1 de resistencia a puromicina de tipo modificado.

[Ejemplo 13] Producción de anticuerpos por célula productora de anticuerpos que expresa gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado

La célula F productora de anticuerpos obtenida en el Ejemplo 12 que expresa el gen 2 de resistencia a puromicina de tipo modificado se cultivó en un matraz cónico para producir anticuerpo anti-CD98 humano.

Específicamente, la célula F productora de anticuerpos se expandió en cultivo utilizando una placa de 96 pocillos, una placa de 24 pocillos y una placa de 6 pocillos, en este orden. Se seleccionaron dos líneas celulares de la célula F productora de anticuerpos en la que se había incrementado suficientemente el número de células (línea celular 1 y línea celular 2) y cada una de ellas se suspendió en 35 ml del medio CD OptiCHO (Invitrogen) complementado con hidrolizado de soja al 5%, proporcionando una densidad celular de 2x105 células/ml y se cultivaron durante 1 semana en un agitador utilizando un matraz cónico de 125 ml de capacidad (con tapón acodado, Corning Glassworks) en una atmósfera a 37°C y con 5% de CO2, produciendo de esta manera el anticuerpo anti-CD98 humano.

Se determinó la cantidad de anticuerpo en el medio tras el cultivo mediante HPLC (Waters Associates, Inc.). Se muestran los resultados en la Tabla 11.

ÍTabla 111

: Línea celular 1 Línea celular 2

Nivel de expresión de anticuerpos (mg/l): 15,6 14,8

Los resultados anteriormente proporcionados muestran que en las células de CHO en suspensión, el gen de anticuerpo insertado entre un par de secuencias de transposón y el gen de resistencia a fármaco de tipo modificado son introducidos eficientemente en el cromosoma del huésped y también resultan eficaces para la selección de una célula de elevado nivel de expresión. Además, se ha encontrado que la célula obtenida de esta manera puede expandirse en cultivo y que resulta posible la producción de la proteína de interés bajo condiciones de cultivo en suspensión.

Mediante el procedimiento de producción de la proteína de la presente invención puede producirse eficientemente una proteína de interés utilizando una célula de mamífero en suspensión. La célula de la presente invención puede utilizarse como célula productora de anticuerpos para la producción de una proteína recombinante.

ÍListado de secuencias!

SEC ID n° 1 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de transposón no autónomo Tol2

SEC ID n° 2 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de Tol2-L

SEC ID n° 3 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de Tol2-R

SEC ID n° 7 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a la

cicloheximida

SEC ID n° 8 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de proteína codificante de gen de resistencia a la cicloheximida

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SEC ID n° 9 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de cadena H del anticuerpo M2Z3

SEC ID n° 10 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de la cadena H del anticuerpo M2Z3

SEC ID n° 11 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de cadena L del anticuerpo M2Z3

SEC ID n° 12 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de cadena L del anticuerpo M2Z3

SEC ID n° 13 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de Tol1 no autónomo

SEC ID n° 14 - Descripción de secuencia artificial: secuencia Tol1-L

SEC ID n° 15 - Descripción de secuencia artificial: secuencia Tol1-R

SEC ID n° 18 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de la región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 19 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada del anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 20 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 21 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 22 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 23 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-CD98

SEC ID n° 24 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano

SEC ID n° 25 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano

SEC ID n° 26 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-TNFa humano

SEC ID n° 27 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa

SEC ID n° 28 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano

SEC ID n° 29 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-TNFa humano

SEC ID n° 30 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 31 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 32 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 33 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos codificante de región variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 34 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 35 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera

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de anticuerpo anti-CD20 humano

SEC ID n° 36 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a neomicina de tipo salvaje

SEC ID n° 37 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de Gen de resistencia a neomicina de tipo modificado

SEC ID n° 38 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a neomicina de tipo modificado

SEC ID n° 39 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a neomicina de tipo modificado

SEC ID n° 41 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a puromicina de tipo modificado

SEC ID n° 42 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a puromicina de tipo salvaje

SEC ID n° 43 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a puromicina de tipo modificado

SEC ID n° 44 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a puromicina de tipo modificado

SEC ID n° 45 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a zeocina de tipo modificado

SEC ID n° 46 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a zeocina de tipo modificado

SEC ID n° 47 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a higromicina de tipo modificado

SEC ID n° 48 - Descripción de secuencia artificial: secuencia de nucleótidos de gen de resistencia a higromicina de tipo modificado

Listado de secuencias

<110> Inter-University Research Institute Corporation Research Organization of Information and Systems Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

<120> Procedimiento de producción de una proteína

<130> W503694

<150> JP2010-279849

<151> 2010-12-15

<160> 48

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 <211> 2788 <212>ADN <213> Artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: transposón no autólogo <400> 1

Claims

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1. Procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende introducir en una célula de CHO en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2; permitir que una transposasa actúe sobre las secuencias de transposón integrando así los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO para obtener una célula de CHO que expresa el anticuerpo; y cultivar en suspensión la célula de CHO.
2. Procedimiento para producir un anticuerpo, que comprende las etapas (A) a (C) siguientes:

(A) introducir simultáneamente en una célula de CHO en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de

nucleótidos de Tol2, y un vector de expresión que comprende un ADN que codifica una transposasa que

reconoce las secuencias de transposón y presenta una actividad de transferencia de un fragmento génico

insertado entre un par de secuencias de transposón en un cromosoma;

(B) obtener una célula de CHO en suspensión que expresa el anticuerpo expresando de manera transitoria la transposasa a partir del vector de expresión que se introduce en la célula de CHO en suspensión en la etapa (A) para integrar los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO; y

(C) cultivar en suspensión la célula de CHO en suspensión que expresa el anticuerpo obtenido en la etapa (B) para producir el anticuerpo.

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3. Procedimiento para obtener una célula de CHO en suspensión que expresa un anticuerpo, que comprende introducir en una célula de CHO en suspensión:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en el que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2; y permitir que una transposasa actúe sobre las secuencias de transposón integrando así los fragmentos génicos en un cromosoma de la célula de CHO.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(i) las secuencias de nucleótidos de Tol2 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 2 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 3, o

(ii) las secuencias de nucleótidos de Tol1 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 14 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 15.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a cicloheximida.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen que codifica un mutante de la proteína ribosómica humana L36.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

(a) la célula de CHO en suspensión es una célula que puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero; y/o

(b) la célula de CHO en suspensión es una célula de CHO adaptada para el cultivo en suspensión; y/o

(c) el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con tumores, un antígeno relacionado con una alergia o inflamación, un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular, un antígeno que se relaciona con una enfermedad autoinmunitaria o un antígeno relacionado con una infección bacteriana.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula de CHO es por lo menos una seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.
9. Célula de CHO en suspensión que presenta un cromosoma en el que se integra:

(a) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del

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fragmento génico y un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y que presenta un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en la que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de nucleótidos de Tol2; y que produce el anticuerpo y puede sobrevivir y proliferar en un medio sin suero.
10. Célula de CHO según la reivindicación 9, en la que el gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a cicloheximida.
11. Célula de CHO según la reivindicación 10, en el que el gen de resistencia a cicloheximida es un gen que codifica un mutante de la proteína ribosómica humana L36a.
12. Célula de CHO según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que:

(a) la célula de CHO en suspensión es una célula de CHO adaptada al cultivo en suspensión, y/o

(b) el anticuerpo es un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con tumores, un antígeno relacionado con una alergia o inflamación, un antígeno relacionado con una enfermedad cardiovascular, un antígeno que se relaciona con una enfermedad autoinmunitaria o un antígeno relacionado con una infección bacteriana.
13. Célula de CHO según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que la célula de CHO es cualquiera seleccionada de entre CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 y CHO-S.
14. Utilización, en un procedimiento para producir un anticuerpo, de:

(a) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(b) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico, o

(c) un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena L de un anticuerpo y un gen marcador seleccionable y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico y un vector de expresión que comprende un fragmento génico que comprende un ADN que codifica una cadena H de un anticuerpo y comprende asimismo un par de secuencias de transposón en ambos extremos del fragmento génico,

en la que cada par de secuencias de transposón son secuencias de nucleótidos de Tol1 o secuencias de

nucleótidos de Tol2.
15. Célula de CHO según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 o utilización según la reivindicación 14, en la que:

(a) las secuencias de nucleótidos de Tol2 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 2 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 3, o

(b) las secuencias de nucleótidos de Tol1 son la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 14 y la secuencia de nucleótidos representada en SEC ID n°: 15.

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Cantidad de producción de anticuerpos (pg/ml)

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Nivel de expresión (pg/ml)

Fig.7

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Número de células

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