ES2657679T3

ES2657679T3 - Modulación del factor de expresión 11

Info

Publication number: ES2657679T3
Application number: ES09821293.9T
Authority: ES
Inventors: Susan M. Freier; Brett P. Monia; Hong Zhang; Chenguang Zhao; Jeffrey R. Crosby; Andrew M. Siwkowski
Original assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2018-03-06
Anticipated expiration: 2029-10-15
Also published as: CA2740785A1; AU2017202862B2; CN104212799A; BRPI0920263B1; HRP20171969T1; RU2014134408A; LT2379084T; IL212267A0; WO2010045509A3; JP2012505660A; JP6397517B2; NZ592203A; WO2010045509A2; BRPI0920263A2; US20170035798A1; MX2011004097A; KR20170101324A; CY1119909T1; CA2966011A1; JP2015211685A

Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 18 a 24 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de bases nucleotídicas que comprende una porción de al menos 8 bases nucleotídicas contiguas 100 % complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 1275 a 1318 de SEQ ID NO: 1, en el que la secuencia de bases nucleotídicas del oligonucleótido modificado es 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 11, y en la que el compuesto es capaz de inhibir la expresión del factor 11 humano11.

Description

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Se divulga en el presente documento el uso un inhibidor específico del Factor 11 como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra posteriormente un

5 agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.

En el presente documento se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en la presente, en donde el kit comprende:

i) un inhibidor específico de Factor 11 como se describe en el presente documento; y, como alternativa

(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.

Un kit de la divulgación puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar una complicación tromboembólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación como

15 se describe en el presente documento.

En el presente documento se divulgan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del Factor 11 es cualquiera de las secuencias indicadas en el número de acceso en GENBANK NM_000128.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), número de acceso en GENBANK NT_022792,17, truncado de 19598000 a 19624000, (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2), número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 6), exones 1-15 número de acceso en GENBANK NM_028066,1 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 274).

25 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado. El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos.

El compuesto de la divulgación puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. 1El compuesto puede comprender un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas 100% complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1.

En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende

35 una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 656 a 676 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar al menos un 80 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3).

45 En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 665 a 687 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar

55 al menos un 50 % de inhibición de los niveles de ARNm humano determinados usando un método de ensayo RT-PCR, opcionalmente en células HepG2 (por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3)-

En el presente documento se describe un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que comprende una secuencia de bases nucleotídicas complementaria a al menos una porción de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o 20 bases nucleotídicas contiguas complementarias a una porción de igual longitud de bases nucleotídicas 675 a 704 de la SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas al menos 8 0%, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % complementarias a una porción de igual longitud de SEQ ID 65 NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede comprender una secuencia de bases nucleotídicas 100 % complementaria a una porción de igual longitud de SEQ ID NO: 1. Dicho oligonucleótido modificado puede alcanzar

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(i): un segmento separador que consiste en desoxinucleósidos unidos;

(ii): un segmento del ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos;

(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido

5 de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.

En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado del compuesto comprende:

(i): un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos;

(ii): un segmento del ala en 5' que consiste en cinco nucleósidos unidos;

(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en cinco nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace

15 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.

(i): un segmento separador que consiste en catorce desoxinucleósidos unidos;

(ii): un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos;

(iii) un segmento de ala 3’ que consiste en tres nucleósidos unidos, en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3’ y en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un 2'-O-metoxietil-azúcar; y en el que cada enlace internucleosídico es un

25 enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5metilcitosina.

(i): un segmento separador que consiste en trece desoxinucleósidos unidos;

(ii): un segmento del ala en 5' que consiste en dos nucleósidos unidos;

35 internucleosídico es un enlace fosforotioato. En algunas de tales realizaciones, cada citosina en el oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.

En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste

45 en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se divulga una composición que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 12 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 241 a 269 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

55 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 241.

En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las SEQ ID NO: 15 a 269.

65 En el presente documento se divulgan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto que

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oligomérico puede ser "antisentido" de un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de sufrir hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se

5 escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de estass realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.

Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener una longitud de 12 a 30 subunidades. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 12 a 30 subunidades unidas. El compuesto antisentido puede ser de 8 a 80, de 12 a 50, de 15 a 30, de 18 a 24, de 19 a 22 o 20 subunidades unidas. Los compuestos antisentido pueden ser 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59,

15 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades unidas de longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. El compuesto antisentido puede ser un oligonucleótido antisentido y las subunidades unidas pueden ser nucleótidos.

Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5’ (truncamiento en 5’), o, alternativamente, del extremo 3’ (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 puede tener dos subunidades delecionadas del extremo 5’ o, alternativamente, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Como alternativa, los nucleósidos delecionados se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido

25 delecionado del extremo 5’ y un nucleósido eliminado del extremo 3'.

Cuando está presente una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede localizarse en el extremo 5’ o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5’(adición en 5') o, como alternativa, al extremo 3’(adición en 3’), del compuesto antisentido. Como alternativa, las subunidades añadidas se pueden dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunida añadida al extremo 5’ y una subunidad añadida al extremo 3'.

35 Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases apareadas erróneamente sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se analizó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 bases nucleotídicas de longitud su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 bases nucleotídicas de longitud con 8 u 11 apareamientos erróneos de bases cerca de los extremos de los los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los los oligonucleótidos antisentido que no contenían apareamientos erróneos. De un modo similar, se consiguió una escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 bases nucleotídicas, incluidos aquéllos con 1 o 3 apareamientos erróneos.

45 Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463–471, March 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 apareamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.

Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) analizaron en una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleotídicas en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 bases nucleotídicas compuesos por la secuencia de dos o trees de los oligonucleótidos antisentido en táncem, respectivamente, su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleoitídicas pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los

55 oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 bases nucleotídicas.

Motivos de compuestos antisentido

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como potenciación de la actividad inhibidora, afinidad de unión incrementada por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.

Los compuestos antisentido quiméricos normalmente contienen al menos una región modificada de modo que

65 confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una actividad inhibidora incrementada. Una

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segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa ARNasa H celular, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.

Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un

5 gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de ARNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento separador generalmente sirve como sustrato para la escisión con endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden, en algunas realizaciones, incluir β-D-ribonucleósidos, β-Ddesoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2’ (tales nucleósidos modificados en 2’ pueden incluir 2'-MOE y 2'-O-CH3, entre otros), y los nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un puente 4'-(CH2) n-O-2', donde n = 1 o n = 2). Preferiblemente, cada región

15 distinta comprende restos de azúcar uniformes. El motivo de ala-separador-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", en el que "X" representa la longitud de la región del ala en 5’, "Y" representa la longitud de la región separadora y "Z" representa la longitud de la región del ala en 3’. Como se usa en el presente documento , un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el segmento separador se coloca inmediatamente adyacente a cada uno del segmento de ala en 5’ y el segmento de ala en 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el segmento de ala en 5’ y el segmento separadir o el segmento separador y el segmento de ala en 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo de gapmer. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En una realización preferida, Y está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleótidos. Por lo tanto, los gapmeros de la presente invención incluyen,

25 pero no se limitan a, por ejemplo 5–10–5, 4–8–4, 4–12–3, 4–12–4, 3–14–3, 2–13–5, 2–16–2, 1–18–1, 3–10–3, 2– 10–2, 1–10–1, 2–8–2, 5–8–5, o 6–8–6.

En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido tiene un motivo de "wingmer" que tiene una configuración de alaseparador o separador-ala, es decir, una configuración X-Y o Y-Z como se ha descritito anteriormente para la configuración de gapmer. Por lo tanto, las configuraciones de las alas de la presente invención incluyen, entre otras, por ejemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8 o 6-8.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-10-5.

35 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 3-14-3.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 2-13-5.

En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 5-8-5.

45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del Factor 11 poseen un motivo gapmer 6-8-6.

En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del factor 11 tiene un ensanchado por separador.

En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de catorce 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre segmentos de ala de tres nucleósidos modificados químicamente. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química

55 comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.

En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido ensanchado por separador dirigido a un ácido nucleico del Factor 11 tiene un segmento separador de trece 2'-desoxirribonucleótidos posicionados inmediatamente adyacentes a y entre un segmento de ala en 5’ de dos nucleósidos modificados químicamente y un segmento de ala en 3' de cinco nucleósidos químicamente modificados. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende una modificación de 2'-azúcar. En otra realización, la modificación química comprende una modificación de 2'–MOE azúcar.

Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos

65 Las secuencias de nucleótidos que codifican el Factor 11 incluyen, sin limitación, las siguientes: N.º de acceso en

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documento y un ácido nucleico del Factor 11. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre bases nucleotídicas complementarias de las moléculas de ácido nucleico.

5 La hibridación se puede producir en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.

Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico del Factor 11.

Complementariedad

Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de

15 bases nucleotídicas del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las bases nucleotídicas correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del Factor 11).

Las bases nucleotídicas no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico del Factor 11 se pueden tolerar a condición de que el compuesto antisentido permanezca capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico del Factor 11 de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, apareamiento erróneo o estructura en horquilla).

25 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios de un ácido nucleico del Factor 11, una región diana, segmento diana, o una porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana puede determinarse usando métodos rutinarios. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido son complementarias de una región diana, y, por lo tanto, hibridarán específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las bases nucleotídicas no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con bases nucleotídicas complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con bases nucleotídicas complementarias.

35 Como tal, un compuesto antisentido que tiene una longitud de 18 bases nucleotídicas que tiene 4 (cuatro) bases nucleotídicas no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana, tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).

45 En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100 % complementarios) de un ácido nucleico diana, o una parte específica de los mismos. Por ejemplo, el compuesto antisentido puede ser completamente complementario de un ácido nucleico del Factor 11, o una región diana, o un segmento diana o una secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "completamente complementario" significa que cada base nucleotídica de un compuesto antisentido es capaz de aparear bases precisas con las bases nucleotídicas correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 bases nucleotídicas es completamente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas, siempre que haya una porción correspondiente de 20 bases nucleotídicas del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria

55 del compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del primero y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 bases nucleotídicas de un compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas puede ser "completamente complementaria" de una secuencia diana que tiene una longitud de 400 bases nucleotídicas. La porción de 20 bases nucleotídicas del oligonucleótido de 30 bases nucleotídicas es completamente complementaria de la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 bases nucleotídicas correspondiente en la que cada base nucleotídica es complementaria de la porción de 20 bases nucleotídicas del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 bases nucleotídicas completo puede o no ser completamente complementario de la secuencia diana, dependiendo de si las 10 bases nucleotídicas restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.

65 La ubicación de una base nucleotídica no complementaria puede estar en el extremo 5’o en el extremo 3' del

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Tabla 1

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55

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 1

ID del oligo: Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia % de inhibición SEQ ID NO

412187: 38 57 TTCAAACAAGTGACATACAC 21 15

412188: 96 115 TGAGAGAATTGCTTGCTTTC 21 16

412189: 106 125 AAATATACCTTGAGAGAATT 8 17

412190: 116 135 AGTATGTCAGAAATATACCT 24 18

412191: 126 145 TTAAAATCTTAGTATGTCAG 14 19

412192: 146 165 CAGCATATTTGTGAAAGTCG 44 20

412193: 222 241 TGTGTAGGAAATGGTCACTT 38 21

412194: 286 305 TGCAATTCTTAATAAGGGTG 80 22

412195: 321 340 AAATCATCCTGAAAAGACCT 22 23

412196: 331 350 TGATATAAGAAAATCATCCT 25 24

412197: 376 395 ACACATTCACCAGAAACTGA 45 25

412198: 550 569 TTCAGGACACAAGTAAACCA 21 26

412199: 583 602 TTCACTCTTGGCAGTGTTTC 66 27

412200: 612 631 AAGAATACCCAGAAATCGCT 59 28

412201: 622 641 CATTGCTTGAAAGAATACCC 66 29

412202: 632 651 TTGGTGTGAGCATTGCTTGA 65 30

412203: 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 91 31

412204: 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 74 32

412205: 686 705 GTTTATGCCCTTCATGTCTA 69 33

412206: 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 34

412207: 764 783 CGTGAAAAAGTGGCAGTGGA 64 35

412208: 811 830 AGACAAATGTTACGATGCTC 73 36

412209: 821 840 GTGCTTCAGTAGACAAATGT 91 37

412210: 896 915 TGCACAGGATTTCAGTGAAA 73 38

412211: 906 925 GATTAGAAAGTGCACAGGAT 64 39

412212: 1018 1037 CCGGGATGATGAGTGCAGAT 88 40

412213: 1028 1047 AAACAAGCAACCGGGATGAT 71 41

412214: 1048 1067 TCCTGGGAAAAGAAGGTAAA 58 42

412215: 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 81 43

412216: 1077 1096 AAAGATTTCTTTGAGATTCT 43 44

412217: 1105 1124 AATCCACTCTCAGATGTTTT 47 45

412218: 1146 1165 AACCAGAAAGAGCTTTGCTC 27 46

412219: 1188 1207 GGCAGAACACTGGGATGCTG 56 47

412220: 1204 1223 TGGTAAAATGAAGAATGGCA 58 48

412221: 1214 1233 ATCAGTGTCATGGTAAAATG 48 49

412222: 1241 1263 AACAATATCCAGTTCTTCTC 5 50

412223: 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 51

412224: 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 52

412225: 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 53

412226: 1371 1390 TTGAAGAAAGCTTTAAGTAA 17 54

412227: 1391 1410 AGTATTTTAGTTGGAGATCC 75 55

412228: 1425 1444 ATGTGTATCCAGAGATGCCT 71 56

412229: 1456 1475 GTACACTCATTATCCATTTT 64 57

412230: 1466 1485 GATTTTGGTGGTACACTCAT 52 58

412231: 1476 1495 TCCTGGGCTTGATTTTGGTG 74 59

412232: 1513 1532 GGCCACTCACCACGAACAGA 80 60

412233: 1555 1574 TGTCTCTGAGTGGGTGAGGT 64 61

412234: 1583 1602 GTTTCCAATGATGGAGCCTC 60 62

412235: 1593 1612 ATATCCACTGGTTTCCAATG 57 63

412236: 1618 1637 CCATAGAAACAGTGAGCGGC 72 64

412237: 1628 1647 TGACTCTACCCCATAGAAAC 48 65

412238: 1642 1661 CGCAAAATCTTAGGTGACTC 71 66

412239: 1673 1692 TTCAGATTGATTTAAAATGC 43 67

412240: 1705 1724 TGAACCCCAAAGAAAGATGT 32 68

412241: 1715 1734 TATTATTTCTTGAACCCCAA 41 69

412242: 1765 1784 AACAAGGCAATATCATACCC 49 70

412243: 1775 1794 TTCCAGTTTCAACAAGGCAA 70 71

31

(continúa)

15

25

35

45

55

412244: 1822 1841 GAAGGCAGGCATATGGGTCG 53 72

412245: 1936 1955 GTCACTAAGGGTATCTTGGC 75 73

412246: 1992 2011 AGATCATCTTATGGGTTATT 68 74

412247: 2002 2021 TAGCCGGCACAGATCATCTT 75 75

412248: 2082 2101 CCAGATGCCAGACCTCATTG 53 76

412249: 2195 2214 CATTCACACTGCTTGAGTTT 55 77

412250: 2268 2287 TGGCACAGTGAACTCAACAC 63 78

412251: 2326 2345 CTAGCATTTTCTTACAAACA 58 79

412252: 2450 2469 TTATGGTAATTCTTGGACTC 39 80

412253: 2460 2479 AAATATTGCCTTATGGTAAT 20 81

412254: 2485 2504 TATCTGCCTATATAGTAATC 16 82

412255: 2510 2529 GCCACTACTTGGTTATTTTC 38 83

412256: 2564 2583 AACAAATCTATTTATGGTGG 39 84

412257: 2622 2641 CTGCAAAATGGTGAAGACTG 57 85

412258: 2632 2651 GTGTAGATTCCTGCAAAATG 44 86

412259: 2882 2901 TTTTCAGGAAAGTGTATCTT 37 87

412260: 2892 2911 CACAAATCATTTTTCAGGAA 27 88

412261: 2925 2944 TCCCAAGATATTTTAAATAA 3 89

412262: 3168 3187 AATGAGATAAATATTTGCAC 34 90

412263: 3224 3243 TGAAAGCTATGTGGTGACAA 33 91

412264: 3259 3278 CACACTTGATGAATTGTATA 27 92

413460: 101 120 TACCTTGAGAGAATTGCTTG 40 93

413461: 111 130 GTCAGAAATATACCTTGAGA 39 94

413462: 121 140 ATCTTAGTATGTCAGAAATA 12 95

413463: 381 400 GAGTCACACATTCACCAGAA 74 96

413464: 627 646 GTGAGCATTGCTTGAAAGAA 42 97

413465: 637 656 CTTATTTGGTGTGAGCATTG 80 98

413466: 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 79 99

413467: 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 91 100

413468: 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 84 101

413469: 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 84 102

413470: 692 711 GTTATAGTTTATGCCCTTCA 72 103

413471: 816 835 TCAGTAGACAAATGTTACGA 67 104

413472: 826 845 TGGGTGTGCTTCAGTAGACA 99 105

413473: 911 930 AGCCAGATTAGAAAGTGCAC 80 106

413474: 1023 1042 AGCAACCGGGATGATGAGTG 84 107

413475: 1053 1072 GCCATTCCTGGGAAAAGAAG 80 108

413476: 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 88 109

413477: 1151 1170 ACTGAAACCAGAAAGAGCTT 54 110

413478: 1193 1212 AGAATGGCAGAACACTGGGA 53 111

413479: 1209 1228 TGTCATGGTAAAATGAAGAA 40 112

413480: 1219 1238 AAGAAATCAGTGTCATGGTA 71 113

413481: 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 86 114

413482: 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 85 115

413483: 1300 1319 AACTGGCAGCGGACGGCATT 78 116

413484: 1430 1449 CCTTAATGTGTATCCAGAGA 74 117

413485: 1461 1480 TGGTGGTACACTCATTATCC 68 118

413486: 1471 1490 GGCTTGATTTTGGTGGTACA 83 119

413487: 1481 1500 AACGATCCTGGGCTTGATTT 57 120

413488: 1560 1579 ACAGGTGTCTCTGAGTGGGT 49 121

413489: 1588 1607 CACTGGTTTCCAATGATGGA 68 122

413490: 1623 1642 CTACCCCATAGAAACAGTGA 57 123

413491: 1633 1652 TTAGGTGACTCTACCCCATA 73 124

413492: 1647 1666 AGACACGCAAAATCTTAGGT 68 125

413493: 1710 1729 TTTCTTGAACCCCAAAGAAA 65 126

413494: 1780 1799 GTGGTTTCCAGTTTCAACAA 70 127

413495: 1921 1940 TTGGCTTTCTGGAGAGTATT 58 128

413496: 1997 2016 GGCACAGATCATCTTATGGG 72 129

413497: 2627 2646 GATTCCTGCAAAATGGTGAA 39 130

413498: 2637 2656 GCAGAGTGTAGATTCCTGCA 60 131

413499: 2887 2906 ATCATTTTTCAGGAAAGTGT 52 132

32

Tabla 2

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25

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45

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos que tienen alas 5–10–5 MOE y separación de desoxi dirigida a la SEQ ID NO: 2

413500: 1658 1677 GTGAGACAAATCAAGACTTC 15 133

413501: 2159 2178 TTAGTTTACTGACACTAAGA 23 134

413502: 2593 2612 CTGCTTTATGAAAAACCAAC 22 135

413503: 3325 3344 ATACCTAGTACAATGTAAAT 29 136

413504: 3548 3567 GGCTTGTGTGTGGTCAATAT 54 137

413505: 5054 5073 TGGGAAAGCTTTCAATATTC 57 138

413506: 6474 6493 ATGGAATTGTGCTTATGAGT 57 139

413507: 7590 7609 TTTCAAGCTCAGGATGGGAA 55 140

413508: 7905 7924 GTTGGTAAAATGCAACCAAA 64 141

413509: 8163 8182 TCAGGACACAAGTAAACCTG 66 142

413510: 9197 9216 TGCAAGCTGGAAATAAAAGC 17 143

413511: 9621 9640 TGCCAATTTAAAAGTGTAGC 43 144

413512: 9800 9819 ATATTTCAAAATCCAGTATG 39 145

413513: 9919 9938 TTCTGAATATACAAATTAAT 27 146

413514: 9951 9970 TTTACTATGAAAATCTAAAT 5 147

413515: 11049 11068 GGTATCCTGAGTGAGATCTA 36 148

413516: 11269 11288 CCAGCTATCAGGAAAATTCC 50 149

413517: 12165 12184 AAAGCTATTGGAGACTCAGA 51 150

413518: 12584 12603 ATGGAATCTCTTCATTTCAT 49 151

413519: 12728 12747 ATGGAGACATTCATTTCCAC 59 152

413520: 13284 13303 GCTCTGAGAGTTCCAATTCA 52 153

413521: 14504 14523 CTGGGAAGGTGAATTTTTAG 62 154

413522: 14771 14790 TCAAGAGTCTTCATGCTACC 42 155

413523: 15206 15225 TCAGTTTACCTGGGATGCTG 61 156

413524: 15670 15689 GACATTATACTCACCATTAT 7 157

413525: 15905 15924 GTATAAATGTGTCAAATTAA 43 158

413526: 16482 16501 GTAAAGTTTTACCTTAACCT 47 159

413527: 17298 17317 CCATAATGAAGAAGGAAGGG 52 160

413528: 17757 17776 TTAAGTTACATTGTAGACCA 48 161

413529: 18204 18223 TGTGTGGGTCCTGAAATTCT 52 162

413530: 18981 19000 ATCTTGTAATTACACACCCC 27 163

413531: 19174 19193 GTACACTCTGCAACAGAAGC 47 164

413532: 19604 19623 AGGGAATAACATGAAGGCCC 32 165

413533: 20936 20955 ATCCAGTTCACCATTGGAGA 48 166

413534: 21441 21460 TTTTCCAGAAGAGACTCTTC 31 167

413535: 21785 21804 GTCACATTTAAAATTTCCAA 41 168

413536: 23422 23441 TTAATATACTGCAGAGAACC 37 169

413537: 25893 25912 AGAAATATCCCCAGACAGAG 16 170

Example 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2

Doce gapmer, exhibiendo más del 84 por ciento o más de inhibición in vitro del factor 11 humano se analizaron a diversas dosis en célu+las HepG2 Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con 9.375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM, y concentraciones 150 nM de

55 oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 3. Conjunto de sonda de cebador de Factor 11 humano RTS 2966 (secuencia directa: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 3; secuencia inversa: TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 4; secuencia de la sonda: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, , incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 5) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 3, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

65

33

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Tabla 4

15

25

35

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55

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 656 a 704 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

Nº ISIS: Target Start Site Target Stop Site Sequence (5' to 3') % inhibition Motif SEQ ID No.

*412203: 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 97 5–10–5 31

*413467: 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 92 5–10–5 100

*413468: 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 83 5–10–5 101

*413469: 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 86 5–10–5 102

416868: 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 93 3–14–3 31

416945: 656 675 AATGTCTTTGTTGCAAGCGC 94 2–13–5 31

416806: 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 5–10–5 171

416869: 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 81 3–14–3 171

416946: 657 676 AAATGTCTTTGTTGCAAGCG 86 2–13–5 171

416807: 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 51 5–10–5 172

416870: 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 76 3–14–3 172

416947: 658 677 TAAATGTCTTTGTTGCAAGC 62 2–13–5 172

416808: 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 55 5–10–5 173

416871: 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 28 3–14–3 173

416948: 659 678 ATAAATGTCTTTGTTGCAAG 62 2–13–5 173

416809: 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 86 5–10–5 174

416872: 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 20 3–14–3 174

416949: 660 679 CATAAATGTCTTTGTTGCAA 64 2–13–5 174

416873: 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 51 3–14–3 99

416950: 661 680 ACATAAATGTCTTTGTTGCA 71 2–13–5 99

416810: 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 68 5–10–5 175

416874: 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 49 3–14–3 175

416951: 662 681 CACATAAATGTCTTTGTTGC 48 2–13–5 175

416811: 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 84 5–10–5 176

416875: 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 75 3–14–3 176

416952: 663 682 CCACATAAATGTCTTTGTTG 51 2–13–5 176

416812: 664 68 TCCACATAAATGTCTTTGTT 59 5–10–5 177

416876: 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 37 3–14–3 177

416953: 664 683 TCCACATAAATGTCTTTGTT 45 2–13–5 177

416813: 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 70 5–10–5 178

416877: 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 51 3–14–3 178

416954: 665 684 GTCCACATAAATGTCTTTGT 61 2–13–5 178

416878: 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 95 3–14–3 100

416955: 666 685 GGTCCACATAAATGTCTTTG 75 2–13–5 100

416814: 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 83 5–10–5 179

416879: 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 92 3–14–3 179

416956: 667 686 AGGTCCACATAAATGTCTTT 61 2–13–5 179

416815: 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 63 5–10–5 180

416880: 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 66 3–14–3 180

416957: 668 687 TAGGTCCACATAAATGTCTT 59 2–13–5 180

416816: 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 79 5–10–5 181

416881: 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 81 3–14–3 181

416958: 669 688 CTAGGTCCACATAAATGTCT 43 2–13–5 181

416817: 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 74 5–10–5 182

416882: 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 60 3–14–3 182

416959: 670 689 TCTAGGTCCACATAAATGTC 25 2–13–5 182

416883: 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 82 3–14–3 101

416960: 671 690 GTCTAGGTCCACATAAATGT 60 2–13–5 101

416818: 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 76 5–10–5 183

416884: 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 69 3–14–3 183

416961: 672 691 TGTCTAGGTCCACATAAATG 40 2–13–5 183

416819: 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 56 5–10–5 184

416885: 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 67 3–14–3 184

416962: 673 692 ATGTCTAGGTCCACATAAAT 77 2–13–5 184

416820: 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 77 5–10–5 185

416886: 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 74 3–14–3 185

416963: 674 693 CATGTCTAGGTCCACATAAA 48 2–13–5 185

35

(continúa)

5

15

25

35

416821: 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 84 5–10–5 186

416964: 675 694 TCATGTCTAGGTCCACATAA 69 2–13–5 186

412204: 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 5–10–5 32

416888: 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 76 3–14–3 32

416965: 676 695 TTCATGTCTAGGTCCACATA 53 2–13–5 32

416822: 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 76 5–10–5 187

416889: 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 60 3–14–3 187

416966: 677 696 CTTCATGTCTAGGTCCACAT 64 2–13–5 187

416823: 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 77 5–10–5 188

416890: 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 87 3–14–3 188

416967: 678 697 CCTTCATGTCTAGGTCCACA 75 2–13–5 188

416824: 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 64 5–10–5 189

416891: 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 81 3–14–3 189

416968: 679 698 CCCTTCATGTCTAGGTCCAC 73 2–13–5 189

416825: 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 92 5–10–5 190

416892: 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 100 3–14–3 190

416969: 680 699 GCCCTTCATGTCTAGGTCCA 80 2–13–5 190

416893: 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 90 3–14–3 102

416970: 681 700 TGCCCTTCATGTCTAGGTCC 88 2–13–5 102

416826: 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 94 5–10–5 191

416894: 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 85 3–14–3 191

416971: 682 701 ATGCCCTTCATGTCTAGGTC 83 2–13–5 191

416827: 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 93 5–10–5 192

416895: 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 95 3–14–3 192

416972: 683 702 TATGCCCTTCATGTCTAGGT 90 2–13–5 192

416828: 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 87 5–10–5 193

416896: 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 95 3–14–3 193

416973: 684 703 TTATGCCCTTCATGTCTAGG 92 2–13–5 193

416829: 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 72 5–10–5 194

416897: 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 66 3–14–3 194

416974: 685 704 TTTATGCCCTTCATGTCTAG 73 2–13–5 194

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 5 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 5 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20

45 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 5 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

Como se muestra en la Tabla 5, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5

55 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 738 y termina en la parada diana. el sitio 762 (es decir, las bases nucleotídicas 738-762) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 45 % de inhibición del ARNm del Factor 11. La mayoría de los gapmeros exhiben al menos 60 % de inhibición. Varios de los gapmer exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977 y 416980. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 412206, 416831 y 416900.

65

36

Tabla 5

5

15

25

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 738 a 762 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

Nº ISIS: Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % de inhibición Motivo SEQ ID No.

*412206: 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 93 5–10–5 34

416898: 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 88 3–14–3 34

416975: 738 757 CCGTGCATCTTTCTTGGCAT 87 2–13–5 34

416830: 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 81 5–10–5 195

416899: 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 86 3–14–3 195

416976: 739 758 TCCGTGCATCTTTCTTGGCA 83 2–13–5 195

416831: 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 91 5–10–5 196

416900: 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 90 3–14–3 196

416977: 740 759 ATCCGTGCATCTTTCTTGGC 82 2–13–5 196

416832: 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 79 5–10–5 197

416901: 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 65 3–14–3 197

416978: 741 760 CATCCGTGCATCTTTCTTGG 76 2–13–5 197

416833: 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 65 5–10–5 198

416902: 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 46 3–14–3 198

416979: 742 761 TCATCCGTGCATCTTTCTTG 63 2–13–5 198

416834: 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 58 5–10–5 199

416903: 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 88 3–14–3 199

416980: 743 762 GTCATCCGTGCATCTTTCTT 87 2–13–5 199

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 6 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 6 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el

35 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 6 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

45 Como se muestra en la Tabla 6, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1018 y termina en la parada diana. el sitio 1042 (es decir, las bases nucleotídicas 1018-1042) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 80 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413474, 416837, 416838, 416904, 416907 y 416908.

55

37

Tabla 6

5

15

25

35

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1018 a 1042 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

Nº ISIS: Sitio de inicio diana Sitio de terminación diana Secuencia (5’ a 3’) % % de inhibición Motivo SEQ ID No.

*41221 2: 1018 1037 89 5–10–5 40

416904: 1018 1037 90 3–14–3 40

416981: 1018 1037 imagen26 87 2–13–5 40

416835: 1019 1038 83 5–10–5 200

416905: 1019 1038 85 3–14–3 200

416982: 1019 1038 84 2–13–5 200

416836: 1020 1039 89 5–10–5 201

416906: 1020 1039 88 3–14–3 201

416983: 1020 1039 imagen27 86 2–13–5 201

416837: 1021 1040 90 5–10–5 202

416907: 1021 1040 90 3–14–3 202

416984: 1021 1040 89 2–13–5 202

416838: 1022 1041 94 5–10–5 203

416908: 1022 1041 98 3–14–3 203

416985: 1022 1041 88 2–13–5 203

413474: 1023 1042 93 5–10–5 107

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 7 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. El primer gapmer enumerado en la Tabla 7 es el gapmer original (véase la Tabla 3) a partir del cual los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designa con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'45 desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el

55 gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 7 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

Como se muestra en la Tabla 7, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5 MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1062 y termina en la parada diana. el sitio 1091 (es decir, las bases nucleotídicas 1062-1091) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 20 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 50 % de inhibición, inlcuyendo: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995. Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 80 % de inhibición: 412215, 65 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993, and 416994. Los siguientes números

38

de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917 y 416993.

Tabla 7

15

25

35

45

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1062 a 1091 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

*413476: 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109

412215: 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 82 5–10–5 43

416909: 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 78 3–14–3 43

416986: 1062 1081 ATTCTTTGGGCCATTCCTGG 88 2–13–5 43

416839: 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 89 5–10–5 204

416910: 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 90 3–14–3 204

416987: 1063 1082 GATTCTTTGGGCCATTCCTG 80 2–13–5 204

416840: 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 85 5–10–5 205

416911: 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 90 3–14–3 205

416988: 1064 1083 AGATTCTTTGGGCCATTCCT 76 2–13–5 205

416841: 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 87 5–10–5 206

416912: 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 92 3–14–3 206

416989: 1065 1084 GAGATTCTTTGGGCCATTCC 88 2–13–5 206

416842: 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 94 5–10–5 207

416913: 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 93 3–14–3 207

416990: 1066 1085 TGAGATTCTTTGGGCCATTC 76 2–13–5 207

413476: 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 93 5–10–5 109

416914: 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 3–14–3 109

416991: 1067 1086 TTGAGATTCTTTGGGCCATT 87 2–13–5 109

416843: 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 89 5–10–5 208

416915: 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 79 3–14–3 208

416992: 1068 1087 TTTGAGATTCTTTGGGCCAT 84 2–13–5 208

416844: 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 90 5–10–5 209

416916: 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 3–14–3 209

416993: 1069 1088 CTTTGAGATTCTTTGGGCCA 91 2–13–5 209

416845: 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 86 5–10–5 210

416917: 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 92 3–14–3 210

416994: 1070 1089 TCTTTGAGATTCTTTGGGCC 83 2–13–5 210

416846: 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 72 5–10–5 211

416918: 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 63 3–14–3 211

416995: 1071 1090 TTCTTTGAGATTCTTTGGGC 64 2–13–5 211

416847: 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 50 5–10–5 212

416919: 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 27 3–14–3 212

416996: 1072 1091 TTTCTTTGAGATTCTTTGGG 22 2–13–5 212

Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en la Tabla 8 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE y 2-13-5 MOE. Los primeros gapmeros enumerados en la Tabla 8 son los gapmeros originales (véase la Tabla 3) a partir de los cuales los gapmeros restantes se diseñaron a través de microwalk y se designaron con un asterisco. Los gapmeros 5-10-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 10 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 5 nucleótidos cada una. Los gapmeros 3-14-3 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el

55 segmento separador central está compuesto por 14 2'-desoxinucleótidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5’ y 3') por alas que comprenden 3 nucleótidos cada una. Los gapmeros 2-13-5 tienen una longitud de 20 nucleótidos, en los que el segmento separador central está compuesto por 13 2'-desoxinucleótidos. El separador central está flanqueado en el extremo 5’con un ala que comprende 2 nucleótidos y en el extremo 3' con un ala que comprende 5 nucleótidos. Para cada uno de los motivos (5-10-5, 3-14-3 y 2-13-5), cada nucleótido en el segmento de ala en 5’ y cada nucleótido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmer son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los residuos de citidina a lo largo de cada gapmer son 5-metilcitidinas. El "sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5’al al que se dirige el gapmer.. El "sitio de terminación diana" indica el nucleótido más 3’al al que se dirige el gapmer.. Cada gapmer enumerado en la Tabla 8 está dirigido a la SEQ ID NO: 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

65 Como se muestra en la Tabla 8, todos los gapmeros 5-10-5 MOE, los gapmeros 3-14-3 MOE y los gapmeros 2-13-5

39

MOE dirigidos a la región diana que comienza en el sitio de inicio diana 1275 y termina en la parada diana. el sitio 1318 (es decir, las bases nucleotídicas 1275-1318) de la SEQ ID NO: muestra al menos un 70 % de inhibición del ARNm del Factor 11. Muchos de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, inlcuyendo: 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 5 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019, y 417020. The Los siguientes números de ISIS exhibieron al menos 90 % de inhibición: : 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854, y 416859.

15 Tabla 8

25

35

45

55

Inhibición de los niveles de ARNm del Factor 11 humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a las bases nucleotídicas 1275 a 1318 de la SEC ID Nº: 1 (N.º de acceso en GENBANK NM_000128.3) 1 (n.º de acceso en GENBANK NM_000128,3).

*412223: 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 85 5–10–5 51

*412224: 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 93 5–10–5 52

*413482: 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 89 5–10–5 115

*412225: 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 86 5–10–5 53

416920: 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 88 3–14–3 51

416997: 1275 1294 ACAGTTTCTGGCAGGCCTCG 84 2–13–5 51

416848: 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 86 5–10–5 213

416921: 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 3–14–3 213

416998: 1276 1295 CACAGTTTCTGGCAGGCCTC 88 2–13–5 213

416849: 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 88 5–10–5 214

416922: 1277 1294 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 94 3–14–3 214

416999: 1277 1296 GCACAGTTTCTGGCAGGCCT 92 2–13–5 214

416850: 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 93 5–10–5 215

416923: 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 96 3–14–3 215

417000: 1278 1297 TGCACAGTTTCTGGCAGGCC 89 2–13–5 215

416851: 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 88 5–10–5 216

416924: 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 96 3–14–3 216

417001: 1279 1298 GTGCACAGTTTCTGGCAGGC 83 2–13–5 216

416925: 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 98 3–14–3 114

417002: 1280 1299 GGTGCACAGTTTCTGGCAGG 92 2–13–5 114

416852: 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 84 5–10–5 217

416926: 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 93 3–14–3 217

417003: 1281 1300 TGGTGCACAGTTTCTGGCAG 89 2–13–5 217

416853: 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 91 5–10–5 218

416927: 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 87 3–14–3 218

417004: 1282 1301 TTGGTGCACAGTTTCTGGCA 86 2–13–5 218

416854: 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 90 5–10–5 219

416928: 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 91 3–14–3 219

417005: 1283 1302 ATTGGTGCACAGTTTCTGGC 79 2–13–5 219

416855: 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 87 5–10–5 220

416929: 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 83 3–14–3 220

417006: 1284 1303 CATTGGTGCACAGTTTCTGG 81 2–13–5 220

416930: 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 87 3–14–3 52

417007: 1285 1304 GCATTGGTGCACAGTTTCTG 82 2–13–5 52

416856: 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 95 5–10–5 221

416931: 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 96 3–14–3 221

417008: 1286 1305 GGCATTGGTGCACAGTTTCT 82 2–13–5 221

416857: 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 5–10–5 222

416932: 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 92 3–14–3 222

417009: 1287 1306 CGGCATTGGTGCACAGTTTC 85 2–13–5 222

40

(continúa)

5

15

25

35

416858: 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 93 5–10–5 223

416933: 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 92 3–14–3 223

417010: 1288 1307 ACGGCATTGGTGCACAGTTT 81 2–13–5 223

416859: 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 5–10–5 224

416934: 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 90 3–14–3 224

417011: 1289 1308 GACGGCATTGGTGCACAGTT 86 2–13–5 224

416935: 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 92 3–14–3 115

417012: 1290 1309 GGACGGCATTGGTGCACAGT 72 2–13–5 115

416860: 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 88 5–10–5 225

416936: 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 89 3–14–3 225

417013: 1291 1310 CGGACGGCATTGGTGCACAG 86 2–13–5 225

416861: 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 92 5–10–5 226

416937: 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 93 3–14–3 226

417014: 1292 1311 GCGGACGGCATTGGTGCACA 87 2–13–5 226

416862: 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 5–10–5 227

416938: 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 90 3–14–3 227

417015: 1293 1312 AGCGGACGGCATTGGTGCAC 87 2–13–5 227

416863: 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 83 5–10–5 228

416939: 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 88 3–14–3 228

417016: 1294 1313 CAGCGGACGGCATTGGTGCA 85 2–13–5 228

416940: 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 92 3–14–3 53

417017: 1295 1314 GCAGCGGACGGCATTGGTGC 82 2–13–5 53

416864: 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 93 5–10–5 229

416941: 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 95 3–14–3 229

417018: 1296 1315 GGCAGCGGACGGCATTGGTG 82 2–13–5 229

416865: 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 88 5–10–5 230

416942: 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 85 3–14–3 230

417019: 1297 1316 TGGCAGCGGACGGCATTGGT 84 2–13–5 230

416866: 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 88 5–10–5 231

416943: 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 92 3–14–3 231

417020: 1298 1317 CTGGCAGCGGACGGCATTGG 84 2–13–5 231

416867: 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 5–10–5 232

416944: 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 83 3–14–3 232

417021: 1299 1318 ACTGGCAGCGGACGGCATTG 74 2–13–5 232

Example 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2

Gapmeros del Ejemplo 3 (véanse las Tablas 4, 5, 6, 7 y 8), que exhiben inhibición in vitro del factor 11 humano, se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 10.000 células por

45 pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectina con concentraciones de 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 9. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 9, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

55

41

Tabla 9

5

15

25

35

Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con lipofectin

9,375 nM: 18,75 nM 37,5 nM 75 nM Motif IC50 (nM) SEQ ID No.

412203: 33 40 62 74 5–10–5 24 31

412206: 24 47 69 86 5–10–5 21 34

413467: 35 51 62 69 5–10–5 20 100

413474: 29 44 57 67 5–10–5 28 107

413476: 24 58 62 77 5–10–5 21 109

416825: 23 52 73 92 5–10–5 20 190

416826: 8 36 58 84 5–10–5 29 191

416827: 31 42 62 77 5–10–5 23 192

416838: 31 51 64 86 5–10–5 19 203

416842: 18 33 62 71 5–10–5 31 207

416850: 4 30 67 84 5–10–5 29 215

416856: 21 45 58 74 5–10–5 27 221

416858: 0 28 54 82 5–10–5 33 223

416864: 18 43 62 78 5–10–5 26 229

416878: 22 34 60 82 5–10–5 27 100

416892: 16 50 70 85 3–14–3 23 190

416895: 39 57 66 71 3–14–3 15 192

416896: 22 39 57 81 3–14–3 27 193

416908: 36 57 67 76 3–14–3 16 203

416922: 14 25 49 75 3–14–3 36 214

416923: 36 47 60 67 3–14–3 23 215

416924: 25 38 56 59 3–14–3 36 216

416925: 13 38 59 75 3–14–3 30 114

416926: 31 43 63 82 3–14–3 22 217

416931: 44 39 57 71 3–14–3 22 221

416941: 33 54 63 78 3–14–3 19 229

416945: 34 45 62 65 2–13–5 24 31

416969: 17 39 61 76 2–13–5 28 190

416972: 32 40 60 69 2–13–5 26 192

416973: 60 75 85 87 2–13–5 3 193

416984: 26 50 62 81 2–13–5 22 202

416985: 17 30 47 57 2–13–5 49 203

416989: 18 41 62 83 2–13–5 26 206

416993: 15 37 50 68 2–13–5 36 209

416999: 24 37 55 73 2–13–5 30 214

417000: 35 47 58 70 2–13–5 23 215

417002: 35 52 67 70 2–13–5 19 114

417003: 26 44 60 56 2–13–5 33 217

45 Los gapmeros también se transfectaron mediante electroporación y se midió su inhibición dependiente de la dosis del ARNm del Factor 11 humano. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,7 μM, 2,2 μM, 6,7 μM y 20 μM, como se especifica en la Tabla 10. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 10, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera

55 dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.

42

Tabla 10

5

15

25

35

45

Inhibición antisentido dependiente de la dosis del factor 11 humano en células HepG2 a través de la transfección de oligonucleótidos con electroporación

0,7 µM: 2,2 µM 6,7 µM 20 µM CI50 (µM SEQ ID No.

412203: 11 60 70 91 2,7 31

412206: 22 39 81 94 2,7 34

413467: 5 31 65 89 4,2 100

413474: 0 5 52 81 6,9 107

413476: 40 69 88 93 0,9 109

416825: 27 74 92 98 1,3 190

416826: 2 47 86 82 3,2 191

416827: 37 68 87 92 1,1 192

416838: 5 30 55 83 5,1 203

416842: 0 10 66 92 5,0 207

416850: 14 25 81 91 3,4 215

416856: 0 29 47 93 5,1 221

416858: 5 20 56 86 5,3 223

416864: 32 65 78 90 1,4 229

416878: 1 26 75 85 4,3 100

416892: 14 52 82 92 2,5 190

416895: 0 62 70 91 3,0 192

416896: 12 35 81 89 3,2 193

416908: 7 58 74 89 2,8 203

416922: 35 51 77 91 1,7 214

416923: 15 30 60 90 4,0 215

416924: 22 40 63 70 4,1 216

416925: 0 40 76 80 3,9 114

416926: 47 71 91 94 0,6 217

416931: 7 24 60 82 5,1 221

416941: 16 38 79 89 3,0 229

416945: 48 70 81 88 0,6 31

416969: 25 34 86 92 2,5 190

416972: 25 30 48 88 4,3 192

416973: 20 48 86 93 2,3 193

416984: 43 54 88 90 1,1 202

416985: 12 48 45 69 5,8 203

416989: 32 65 88 94 1,3 206

416993: 22 48 87 92 2,2 209

416999: 20 42 77 88 2,8 214

417000: 46 73 76 89 0,6 215

417002: 32 38 82 91 2,2 114

417003: 0 34 75 89 3,9 217

Ejemplo 5: Selección y confirmación de la inhibición de antisentido dependiente de la dosis eficaz del Factor 11 humano en células HepG2

Se seleccionaron gapmeros que exhibían una inhibición significativa dependiente de la dosis del Factor 11 humano en el Ejemplo 4 y se analizaron a diversas dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de

10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo de lipofectin con concentraciones de 9,34 nM, 4,69 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM, y 75 nM del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 11. Después 55 de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y los niveles de ARNm del Factor 11 humano se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador Factor 11 humano, RTS 2966, se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm del factor 11 se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición del factor 11 humano respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 11, los niveles de A.RNm del Factor 11 se redujeron de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido en comparación con el control.

65

43

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comienza en el sitio de inicio 1275 diana y termina en el sitio de detención diana 1317 (es decir, bases nucleotídicas 1275-1317) de SEQ ID NO: 1 exhibieron al menos 60 % inhibición del ARNm del Factor 11. De manera similar, todos los gapmeros re-evaluados de las Tablas 1 y 8 exhibieron al menos 60 % de inhibición.

Varios de los gapmeros exhiben al menos 70 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542, y 445543.

Varios de los gapmeros exhiben al menos 80 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541, y 445542.

Varios de los gapmeros exhiben al menos 90 % de inhibición, incluyendo números ISIS: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 y 445531.

Tabla 44

Nº ISIS: Sitio de inicio humano Sitio de terminación humano Secuencia (5' a 3') Porcentaje de inhibición Motivo SEC Nº ID Sitio de inicio en mono rhesus Sitio de terminación en mono rhesus

*416850: 1278 1297 91 5–10– 5 215 1277 1296

*416858: 1288 1307 90 5–10– 5 223 1287 1306

416825: 680 699 90 5–10– 5 190 679 698

412206: 738 757 91 5–10– 5 34 737 756

412223: 1275 1294 62 5–10– 5 51 1274 1293

445493: 1275 1294 69 6–8–6 51 1274 1293

445518: 1275 1292 imagen48 75 5–8–5 242 1274 1291

416848: 1276 1295 87 5–10– 5 213 1275 1294

445494: 1276 1295 85 6–8–6 213 1275 1294

445519: 1276 1293 81 5–8–5 243 1275 1292

416849: 1277 1296 88 5–10– 5 214 1276 1295

445495: 1277 1296 imagen49 89 6–8–6 214 1276 1295

445520: 1277 1294 82 5–8–5 244 1276 1293

445496: 1278 1297 87 6–8–6 215 1277 1296

445521: 1278 1295 87 5–8–5 245 1277 1294

64 (continúa)

416851: 1279 1298 89 5–10–5 216 1278 1297

445497: 1279 1298 81 6–8–6 216 1278 1297

445522: 1279 1296 91 5–8–5 246 1278 1295

413481: 1280 1299 82 5–10–5 114 1279 1298

445498: 1280 1299 83 6–8–6 114 1279 1298

445523: 1280 1297 73 5–8–5 267 1279 1296

416852: 1281 1300 87 5–10–5 217 1280 1299

445499: 1281 1300 75 6–8–6 217 1280 1299

445524: 1281 1298 75 5–8–5 247 1280 1297

416853: 1282 1301 84 5–10–5 218 1281 1300

445500: 1282 1301 81 6–8–6 218 1281 1300

445525: 1282 1299 85 5–8–5 248 1281 1298

416854: 1283 1302 86 5–10–5 219 1282 1301

445501: 1283 1302 83 6–8–6 219 1282 1301

445526: 1283 1300 81 5–8–5 249 1282 1299

416855: 1284 1303 85 5–10–5 220 1283 1302

445502: 1284 1303 83 6–8–6 220 1283 1302

445527: 1284 1301 70 5–8–5 250 1283 1300

412224: 1285 1304 84 5–10–5 52 1284 1303

445503: 1285 1304 89 6–8–6 52 1284 1303

445528: 1285 1302 73 5–8–5 251 1284 1301

416856: 1286 1305 84 5–10–5 221 1285 1304

445504: 1286 1305 87 6–8–6 221 1285 1304

445529: 1286 1303 85 5–8–5 252 1285 1302

416857: 1287 1306 91 5–10–5 222 1286 1305

445505: 1287 1306 89 6–8–6 222 1286 1305

445530: 1287 1304 83 5–8–5 253 1286 1303

445506: 1288 1307 86 6–8–6 223 1287 1306

65 (continúa)

445531: 1288 1305 90 5–8–5 254 1287 1304

416859: 1289 1308 85 5–10–5 224 1288 1307

445507: 1289 1308 85 6–8–6 224 1288 1307

445532: 1289 1306 89 5–8–5 255 1288 1305

413482: 1290 1309 88 5–10–5 115 1289 1308

445508: 1290 1309 81 6–8–6 115 1289 1308

445533: 1290 1307 87 5–8–5 256 1289 1306

416860: 1291 1310 89 5–10–5 225 1290 1309

445509: 1291 1310 84 6–8–6 225 1290 1309

445534: 1291 1308 82 5–8–5 257 1290 1307

416861: 1292 1311 90 5–10–5 226 1291 1310

445510: 1292 1311 88 6–8–6 226 1291 1310

445535: 1292 1309 83 5–8–5 258 1291 1308

416862: 1293 1312 89 5–10–5 227 1292 1311

445511: 1293 1312 77 6–8–6 227 1292 1311

445536: 1293 1310 82 5–8–5 259 1292 1309

416863: 1294 1313 86 5–10–5 228 1293 1312

445512: 1294 1313 79 6–8–6 228 1293 1312

445537: 1294 1311 78 5–8–5 260 1293 1310

412225: 1295 1314 86 5–10–5 53 1294 1313

445513: 1295 1314 85 6–8–6 53 1294 1313

445538: 1295 1312 80 5–8–5 261 1294 1311

416864: 1296 1315 88 5–10–5 229 1295 1314

445514: 1296 1315 81 6–8–6 229 1295 1314

445539: 1296 1313 imagen50 79 5–8–5 262 1295 1312

416865: 1297 1316 86 5–10–5 230 1296 1315

445515: 1297 1316 75 6–8–6 230 1296 1315

445540: 1297 1314 74 5–8–5 263 1296 1313

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Tabla 80

Cambio en el peso corporal y de los órganos de ratones CD1 después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido

Hígado (%): Riñón (%) Bazo (%) Peso corporal (g)

PBS: 5 1,5 0,3 7

ISIS 416850: 6 1,6 0,4 12

ISIS 416858: 7 1,6 0,6 12

ISIS 416864: 5 1,6 0,3 12

ISIS 412223: 6 1,5 0,4 12

ISIS 412224: 6 1,6 0,5 10

ISIS 412225: 6 1,5 0,4 10

ISIS 413481: 6 1,5 0,5 9

ISIS 413482: 6 1,6 0,5 11

ISIS 416848: 6 1,5 0,4 11

ISIS 416849: 8 1,5 0,4 8

ISIS 416851: 7 1,5 0,5 11

ISIS 416852: 6 1,5 0,4 10

ISIS 416853: 8 1,5 0,7 13

ISIS 416854: 7 1,2 0,4 13

ISIS 416855: 8 1,4 0,6 12

ISIS 416856: 6 1,4 0,4 10

ISIS 416857: 7 1,6 0,5 10

ISIS 416859: 6 1,5 0,4 10

ISIS 416860: 6 1,4 0,4 10

ISIS 416861: 5 1,3 0,4 9

ISIS 416862: 6 1,5 0,4 10

ISIS 416863: 5 1,5 0,4 9

ISIS 416865: 6 1,5 0,4 8

ISIS 416866: 5 1,6 0,4 10

ISIS 416867: 5 1,4 0,4 9

Función hepática

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron las concentraciones plasmáticas de transaminasas usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Las mediciones de alanina transaminasa (ALT) y aspartato transaminasa (AST) se expresan en UI/l y los resultados se presentan en la Tabla 81. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de ALT/AST por encima de siete veces de control fueron seleccionado para más estudios. Los niveles plasmáticos de bilirrubina, colesterol y albúmina también se midieron usando el mismo analizador químico clínico y se presentan en la Tabla 81 expresados en mg/dl. Aquellos oligonucleótidos antisentido que no afectaron un aumento en los niveles de bilirrubina más del doble de los niveles de control por tratamiento con oligonucleótidos antisentido se seleccionaron para estudios adicionales.

Tabla 81

Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el hígado de ratones CD1

ALT (UI/l): AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl) Albúmina (mg/dl) Colesterol (mg/dl)

PBS: 32 68 0,25 3,7 135

ISIS 416850: 75 99 0,21 3,5 142

ISIS 416858: 640 547 0,28 4,4 181

ISIS 416864: 36 67 0,19 2,6 152

ISIS 412223: 60 125 0,20 3,0 117

ISIS 412224: 214 183 0,19 3,4 114

ISIS 412225: 40 69 0,23 3,3 128

ISIS 413481: 85 143 0,18 3,2 153

ISIS 413482: 54 77 0,24 3,0 138

ISIS 416848: 153 153 0,19 3,1 151

ISIS 416849: 1056 582 0,22 2,5 109

ISIS 416851: 47 76 0,19 3,1 106

ISIS 416852: 49 91 0,16 4,9 125

82

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% y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.

Tabla 83

Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre factores hematológicos en ratones CD1

RBC (106/µl): Hemoglobina (g/dl) HCT ( %) WBC (103/µl)

PBS: 10 15 51 7

ISIS 416850: 10 15 49 5

ISIS 416858: 9 14 50 8

ISIS 416864: 10 15 52 5

ISIS 412223: 9 15 48 7

ISIS 412224: 10 15 50 9

ISIS 412225: 9 15 50 7

ISIS 413481: 9 13 45 7

ISIS 413482: 10 15 50 8

ISIS 416848: 9 14 47 7

ISIS 416849: 9 14 48 9

ISIS 416851: 9 14 47 6

ISIS 416852: 9 14 49 5

ISIS 416853: 11 17 56 8

ISIS 416854: 9 13 43 12

ISIS 416855: 9 14 50 6

ISIS 416856: 9 14 47 5

ISIS 416857: 10 15 53 6

ISIS 416859: 10 15 49 6

ISIS 416860: 10 15 51 7

ISIS 416861: 9 14 48 7

ISIS 416862: 9 14 49 6

ISIS 416863: 9 14 48 7

ISIS 416865: 9 14 50 7

ISIS 416866: 9 15 51 6

ISIS 416867: 10 14 47 8

Tabla 84

Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre el recuento de células sanguíneas ratones CD1

Neutrófilos (células/μl): Linfocitos (células/μl) Monocitos (células/μl) Plaquetas (103/µl)

PBS: 1023 6082 205 940

ISIS 416850: 1144 4004 156 916

ISIS 416858: 2229 5480 248 782

ISIS 416864: 973 3921 141 750

ISIS 412223: 1756 4599 200 862

ISIS 412224: 2107 6284 195 647

ISIS 412225: 1547 4969 293 574

ISIS 413481: 1904 4329 204 841

ISIS 413482: 1958 5584 275 818

ISIS 416848: 1264 5268 180 953

ISIS 416849: 1522 6967 253 744

ISIS 416851: 1619 4162 194 984

ISIS 416852: 1241 3646 189 903

ISIS 416853: 2040 5184 225 801

ISIS 416854: 2082 9375 455 1060

ISIS 416855: 1443 4236 263 784

ISIS 416856: 1292 3622 151 753

ISIS 416857: 1334 3697 215 603

ISIS 416859: 1561 4363 229 826

ISIS 416860: 1291 4889 161 937

ISIS 416861: 1122 5119 219 836

ISIS 416862: 1118 4445 174 1007

ISIS 416863: 1330 5617 226 1131

ISIS 416865: 1227 5148 315 872

ISIS 416866: 1201 4621 211 1045

ISIS 416867: 1404 6078 188 1006

84

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Función renal

Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron las concentraciones plasmáticas de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina usando un analizador automático de química clínica (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 88, expresados en mg/dl. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de dos veces el aumento en los niveles de BUN en comparación con el control de PBS se seleccionaron para estudios posteriores. La proteína urinaria total y la proporción de proteína urinaria a creatinina en muestras totales de orina después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó y también se presenta en la Tabla 88. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron más de cinco veces el aumento de las proporciones proteína/creatinina en la orina al control PBS fueron seleccionados para estudios adicionales.

Tabla 88

Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre marcadores metabólicos en el riñón de ratas Sprague-Dawley

BUN (mg/dl): Creatinina (mg/dl) Proteína total en orina (mg/dl) Relación proteína en orina/creatinina

PBS: 19 38 60 1,7

ISIS 412223: 24 46 224 4,6

ISIS 412224: 24 44 171 3,8

ISIS 412225: 23 58 209 4,0

ISIS 413481: 26 45 148 3,6

ISIS 413482: 23 34 157 4,8

ISIS 416848: 26 64 231 3,9

ISIS 416851: 24 70 286 4,0

ISIS 416852: 25 60 189 3,0

ISIS 416856: 23 48 128 2,7

ISIS 416859: 24 44 144 3,3

ISIS 416860: 23 58 242 4,6

ISIS 416861: 22 39 205 5,1

ISIS 416863: 29 73 269 3,8

ISIS 416866: 22 85 486 6,2

ISIS 416867: 22 70 217 3,1

Ensayos hematológicos

La sangre obtenida de todos los grupos de ratas se envió a Antech Diagnostics para mediciones de hematocrito (HCT), así como mediciones de varias células sanguíneas, como WBC (neutrófilos y linfocitos), glóbulos rojos y plaquetas, y el contenido total de hemoglobina. Los resultados se presentan en las Tablas 89 y 90. Esos oligonucleótidos antisentido que no afectaron a una disminución en el recuento de plaquetas de más del 50 % y un aumento en el recuento de monocitos de más de tres veces se seleccionaron para estudios adicionales.

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Tabla 168

Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de citocinas/quimiocinas (pg/ml) en monos cynomolgus el día 55

IL–1β: IL–6 IFN–γ TNF–α IL–8 MIP–1α MCP–1 MIP–1β RANTES

PBS: 453 3 232 191 68 21 237 34 775

ISIS 416850: 106 1 19 16 620 17 887 50 27503

ISIS 449409: 181 0 25 8 254 17 507 47 8958

ISIS 445522: 341 2 83 18 100 22 592 63 16154

ISIS 449710: 286 2 176 26 348 27 474 53 22656

ISIS 449707: 97 1 24 16 48 12 264 49 1193

ISIS 449711: 146 7 22 31 110 17 469 91 3029

ISIS 449708: 131 0 18 17 85 23 409 128 4561

ISIS 416858: 28 1 9 15 167 11 512 47 5925

ISIS 445531: 155 1 15 16 293 12 339 84 5935

Ejemplo 47: Determinación de la viscosidad de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano

5 La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido dirigidos al factor 11 humano se midió con el objetivo de seleccionar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad superior a 40 cP a una concentración de 165-185 mg/ml.

10 Se pesaron oligonucleótidos de ISIS (32 -35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 \ mu l de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50ºC. Parte de (75 μL) la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del microcomponedor se ajustó a 250ºC y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 μL) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 mL de agua para lectura UV a 260 nM a 850C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 169.

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Tabla 169

Viscosidad y concentración de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al Factor 11 humano

Nº ISIS: Viscosidad (cP) Concentración (mg/ml)

412223: 8 163

412224: 98 186

412225: > 100 162

413481: 23 144

413482: 16. 172

416848: 6 158

416850: 67 152

416851: 26 187

416852: 29 169

416856: 18 175

416858: 10 166

416859: 10 161

416860: > 100 154

416861: 14 110

416863: 9 165

416866: > 100 166

416867: 8 168

445498: 21 157

445504: 20 139

445505: 9 155

445509: > 100 167

445513: 34 167

445522: 63 173

445522: 58 174

445530: 25 177

445531: 15 155

445531: 20 179

449707: 7 166

449708: 9 188

449709: 65 171

449710: 7 186

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Claims

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