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ES2657547T3 - Emulsiones aceite en agua que contienen ácidos nucleicos - Google Patents

Emulsiones aceite en agua que contienen ácidos nucleicos Download PDF

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ES2657547T3
ES2657547T3 ES12738311.5T ES12738311T ES2657547T3 ES 2657547 T3 ES2657547 T3 ES 2657547T3 ES 12738311 T ES12738311 T ES 12738311T ES 2657547 T3 ES2657547 T3 ES 2657547T3
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Spain
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virus
rna
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approximately
emulsion
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Luis Brito
Michelle CHAN
Andrew Geall
Derek O'hagan
Manmohan Singh
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Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una emulsión aceite en agua catiónica inmunogénica que comprende partículas en emulsión que contienen un núcleo de aceite que está en fase líquida a 25°C y un lípido catiónico, y una molécula de ácido nucleico que forma complejos con las partículas en emulsión, en la que el lípido catiónico es DOTAP, DOTMA, DOEPC, DSTAP, DODAC o DODAP, y la concentración del lípido catiónico en la emulsión aceite en agua es desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml, en la que la molécula de ácido nucleico es un ARN autorreplicante que codifica un antígeno, y en la que el diámetro promedio de las partículas en emulsión es desde 80 nm hasta 180 nm y la N/P de la emulsión es al menos 4:1, en la que N/P se refiere a la cantidad en moles de átomos de nitrógeno protonables en el lípido catiónico dividido por la cantidad en moles de fosfatos en la molécula de ARN; con la condición de que la molécula de ácido nucleico no codifique la fosfatasa alcalina secretada, y la condición adicional de que la molécula de ácido nucleico no sea un ARN codificado por el plásmido A317, cuya secuencia se muestra en la SEQ ID NO:1.

Description

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La emulsión puede comprender cualquier combinación de estos lípidos catiónicos con otros lípidos catiónicos descritos en la presente memoria.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DOTAP y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DOTAP, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DOTMA y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DOTMA, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22,5 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DOEPC y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DOEPC, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 1,9 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22,5 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DSTAP y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DSTAP, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 1,9 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22,5 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DODAC y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DODAC, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 1,9 mg/ml; aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22,5 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml etc.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DODAP y la emulsión aceite en agua catiónica comprende desde 1,6 mg/ml hasta 25 mg/ml de DODAP, por ejemplo desde aproximadamente 1,7 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 1,7 mg/ml, aproximadamente 1,8 mg/ml, aproximadamente 1,9 mg/ml, aproximadamente 2,0 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 22,5 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml etc.
En algunos casos, puede ser deseable utilizar un lípido catiónico que es soluble en el núcleo de aceite. Por ejemplo, el DOTAP, DOEPC, DODAC, y DOTMA son solubles en escualeno o escualano. En otros casos, puede ser deseable utilizar un lípido catiónico que no es soluble en el núcleo de aceite. Por ejemplo, el DDA y DSTAP no son solubles en escualeno. Está dentro del conocimiento en la técnica determinar si un lípido particular es soluble o insoluble en aceite y elegir una combinación de aceite y lípido adecuado de acuerdo con lo anterior. Por ejemplo, la solubilidad se puede predecir sobre la base de las estructuras del lípido y aceite (por ejemplo, la solubilidad de un lípido se puede determinar por la estructura de su cola). Por ejemplo, los lípidos que tienen una o dos cadenas de ácido graso insaturado (por ejemplo, colas oleoilo), tales como DOTAP, DOEPC, DODAC, DOTMA, son solubles en escualeno o escualano; mientras que los lípidos que tienen cadenas de ácidos grasos saturados (por ejemplo, colas estearoilo) no son solubles en escualeno. Alternativamente, la solubilidad se puede determinar de acuerdo con la cantidad de lípido que se disuelve en una cantidad dada del aceite para formar una solución saturada.
Como se señaló anteriormente, la concentración de un lípido descrito anteriormente se determina con base en la cantidad inicial del lípido que se utiliza para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica que la concentración real del aceite en el producto final (por ejemplo, una emulsión esterilizada empacada que está lista para la administración) puede ser ligeramente inferior, a veces hasta aproximadamente 20 %.
C. Componentes Adicionales
Las emulsiones aceite en agua catiónicas descritas en la presente memoria pueden comprender además componentes adicionales. Por ejemplo, las emulsiones pueden comprender componentes que pueden promover la formación de partículas, mejorar la formación de complejos entre las moléculas de ácido nucleico y las partículas catiónicas, o aumentar la estabilidad de la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, para evitar la degradación de una molécula de ARN). Si se desea, la emulsión aceite en agua catiónica puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos.
Tensioactivos
En ciertas realizaciones, las partículas de la emulsión aceite en agua catiónica comprenden además un tensioactivo.
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Se ha utilizado una cantidad sustancial de tensioactivos en las ciencias farmacéuticas. Estos incluyen materiales de origen natural tales como gomas de árboles, proteína vegetal, polímeros con base en azúcar, tales como alginatos y celulosa, y similares. Ciertos oxipolímeros o polímeros que tienen un hidróxido u otro sustituyente hidrófilo sobre la estructura principal de carbono tienen actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, alcohol polivinílico, y compuestos mono-y poli-funcionales a base de éter de glicol. Los compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga forman un tercer grupo sustancial de agentes emulsionantes y agentes de suspensión que podría ser utilizado en esta invención.
Ejemplos específicos de tensioactivos adecuados incluyen los siguientes:
1.
Jabones solubles en agua, tales como sales de sodio, potasio, amonio y alcanol-amonio de ácidos grasos superiores (C10-C22), en particular jabones de sodio y potasio de sebo y coco.
2.
Tensioactivos no jabonosos sintéticos aniónicos, que pueden estar representados por las sales solubles en agua de productos de reacción de ácido sulfúrico orgánico que tienen en su estructura molecular un radical alquilo que contiene de aproximadamente 8 a 22 átomos de carbono y un radical seleccionado del grupo que consiste de radicales éster de ácido sulfónico y ácido sulfúrico. Ejemplos de estos son los sulfatos de sodio o potasio de alquilo, derivados de aceite de sebo o de coco; sulfonatos de sodio o potasio de alquil benceno; sulfonatos de sodio alquil gliceril éter; sulfonatos y sulfatos de monoglicéridos de ácido graso de aceite de coco de sodio; sales de sodio o potasio de ésteres de ácido sulfúrico del producto de reacción de un mol de un alcohol graso superior y aproximadamente 1 a 6 moles de óxido de etileno; sulfonatos de éter de sodio o potasio alquil fenol de óxido de etileno, con 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula y en los que los radicales alquilo contienen de 8 a 12 átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos esterificados con ácido isetiónico y neutralizados con hidróxido de sodio; sales de sodio o potasio de amida de ácido graso de un taururo de metilo; y sales de sodio y potasio de α-olefinas C10-C24 sulfonadas con SO3.
3.
Tensioactivos sintéticos no iónicos elaborados por condensación de grupos de óxido de alquileno con un compuesto hidrófobo orgánico. Los grupos hidrófobos típicos incluyen los productos de condensación de óxido de propileno con propilenglicol, alquilfenoles, producto de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes alifáticos que tienen de 8 a 22 átomos de carbono, y amidas de ácidos grasos.
4.
Tensioactivos no iónicos, tales como óxidos de amina, óxidos de fosfina y sulfóxidos, que tienen características semipolares. Ejemplos específicos de óxidos de amina terciaria de cadena larga incluyen óxido de dimetildodecilamina y bis-(2-hidroxietil)dodecilamina. Los ejemplos específicos de óxidos de fosfina se encuentran en la Patente de Estados Unidos. No. 3,304,263, emitida el 14 de febrero de 1967, e incluye óxido de dimetildodecilfosfina y óxido de dimetil-(2hidroxidodecil)fosfina.
5.
Sulfóxidos de cadena larga, que incluyen aquellos correspondientes a la fórmula R1-SO-R2 en la que R1 y R2 son radicales alquilo sustituidos o no sustituidos, el primero contiene desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 28 átomos de carbono, mientras que R2 contiene de 1 a 3 átomos de carbono. Ejemplos específicos de estos sulfóxidos incluyen sulfóxido de metil dodecil y sulfóxido de 3-hidroxi tridecilo metilo.
6.
Tensioactivos sintéticos anfolíticos, tales como 3-dodecilaminopropionato de sodio y 3-dodecilaminopropano sulfonato de sodio.
7.
Tensioactivos de ión bipolar sintéticos, tales como 3-(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)propano-1-sulfonato y 3(N,N-dimetil-N-hexadecilamonio)-2-hidroxi propano-1-sulfonato.
Adicionalmente, se pueden utilizar todos los siguientes tipos de tensioactivos en una composición de la presente invención: (a) jabones (es decir, sales alcalinas) de ácidos grasos, ácidos de colofonia, y aceite de resina; (b) sulfonatos de areno alquilo; (c) sulfatos de alquilo, que incluyen tensioactivos con grupos hidrófobos, tanto de cadena ramificada como de cadena lineal, así como grupos sulfato primarios y secundarios; (d) sulfatos y sulfonatos que contienen un enlace intermedio entre los grupos hidrófobos e hidrófilos, tales como las tauridas de metilo aciladas grasas y los monoglicéridos grasos sulfatados; (e) ésteres de ácidos de cadena larga de polietilenglicol, especialmente los ésteres de aceite de resina; (f) éteres de polietilenglicol de alquilfenoles; (g) éteres de polietilenglicol de alcoholes de cadena larga y mercaptanos; y (h) dietanolamidas de acilo graso. Dado que los tensioactivos se pueden clasificar en más de una manera, una serie de clases de tensioactivos se expone en este párrafo se superpone con clases de tensioactivos previamente descritas.
Existe una serie de tensioactivos diseñados específicamente para y comúnmente utilizados en situaciones biológicas. Dichos tensioactivos se dividen en cuatro tipos básicos: aniónicos, catiónicos, de ión bipolar (anfóteros) y no iónicos. Ejemplos de tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, perfluorooctanoato (PFOA o PFO), perfluorooctanosulfonato (PFOS), sales de sulfato de alquilo, tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) o lauril sulfato de amonio, lauril sulfato de sodio (también conocido como sulfato de lauril éter de sodio, SLES), sulfonato de alquil benceno, y sales de ácidos grasos. Tensioactivos catiónicos de ejemplo incluyen, por ejemplo, sales de alquiltrimetilamonio tales como bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB, o bromuro de hexadecil trimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilada (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT). (Anfóteros) Ejemplos de tensioactivos de ión bipolar incluyen, por ejemplo, dodecil betaína,
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(MePEG-NH2), glicol-tresilato de monometoxipolietileno (MePEG-TRES), y monometoxipolietileno glicol-imidazolilcarbonil (MePEG-IM). Adicionalmente, el ácido monometoxipolietilenoglicol-acético (MePEG-CH2COOH), es particularmente útil para preparar los conjugados de PEG-lípido que incluyen, por ejemplo, conjugados de PEG-DAA.
5 Preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 daltons (por ejemplo, PEG1000, PEG2000, PEG3000, PEG4000, PEG5000). El PEG se puede sustituir opcionalmente con un grupo alquilo, alcoxi, acilo o arilo. El PEG se puede conjugar directamente con el lípido o se puede unir al lípido mediante un grupo funcional de unión. Se puede utilizar cualquier grupo funcional de unión adecuado para acoplar el PEG a un lípido que incluye, por ejemplo, grupos funcionales de unión que no contienen éster y grupos funcionales
10 de unión que contienen éster.
En realizaciones de ejemplo, los PEG2000PE, PEG5000PE, PEG1000DMG, PEG2000DMG, PEG3000DMG, o una combinación de los mismos, se utiliza como un tensioactivo. En ciertas realizaciones de ejemplo, la emulsión aceite en agua contiene desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 80 mg/ml de PEG2000PE, PEG5000PE, PEG1000DMG, PEG2000DMG, o PEG3000DMG.
15 Fosfolípidos
En ciertas realizaciones, las partículas de la emulsión aceite en agua catiónica comprende adicionalmente un fosfolípido.
Los fosfolípidos son ésteres de ácidos grasos en los que el componente alcohólico de la molécula contiene un grupo fosfato. Los fosfolípidos incluyen glicerofosfatidas (que contienen glicerol) y las esfingomielinas (que contienen
20 esfingosina). Fosfolípidos de ejemplo incluyen fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina y esfingomielina; y fosfolípidos sintéticos que comprenden dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, distearoil fosfatidilcolina, distearoil fosfatidilglicerol, dipalmitoil fosfatidilglicerol, dimiristoil fosfatidilserina, distearoil fosfatidilserina, y dipalmitoil serina.
Se pueden utilizar los siguientes fosfolípidos de ejemplo.
DDPC
1,2-Didecanoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DEPA-NA
1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DEPC
1,2-Erucoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DEPE
1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DEPG-NA
1,2-Dierucoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLOPC
1,2-Linoleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DLPA-NA
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DLPC
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DLPE
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DLPG-NA
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...) (Sal de Sodio)
DLPG-NH4
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DLPS-NA
1,2-Dilauroil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina(Sal de Sodio)
DMPA-NA
1,2-Diimiristoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DMPC
1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DMPE
1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DMPG-NA
1,2-Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DMPG-NH4
1,2-Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DMPG-NH4/NA
1,2-Miristoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DMPS-NA
1,2-Dimiristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina(Sal de Sodio)
DOPA-NA
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DOPC
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DOPE
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DOPG-NA
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DOPS-NA
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina(Sal de Sodio)
DPPA-NA
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DPPC
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DPPE
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DPPG-NA
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DPPG-NH4
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol..)
DPPS-NA
1,2-Dipalmitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina(Sal de Sodio)
DPyPE
1,2-diFItanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
DSPA-NA
1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-Fosfato (Sal de Sodio)
DSPC
1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
DSPE
1,2-Diostearpil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
DSPG-NA
1,2-Distearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DSPG-NH4
1,2-Distearoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol...)
DSPS-NA
1,2-Distearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilserina(Sal de Sodio)
EPC
PC de huevo
HEPC
PC de huevo hidrogenado
HSPC
Soy PC hidrogenado de alta pureza
HSPC
Soy PC hidrogenado
LYSOPC MIRÍSTICO
1-Miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC PALMÍTICO
1-Pahnitoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
LYSOPC ESTEÁRICO
1-Stearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
Leche de Esfingomielina MPPC
1-Miristoilo,2-palmitoil-sn-Glicero 3-fosfatidilcolina
MSPC
1-Miristoilo,2-stearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
PMPC
1-Palmitoilo,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
POPC
1-Palmitoilo,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
POPE
1-Palmitoil-2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidiletanolamina
POPG-NA
1,2-Dioleoil-sn-Glicero-3[Fosfatidil-rac-(1-glicerol)...](Sal de Sodio)
PSPC
1-Palmitoilo,2-stearoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
SMPC
1-Stearoilo,2-miristoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
SOPC
1-Stearoilo,2-oleoil-sn-Glicero-3-fosfatidilcolina
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En ciertas realizaciones, puede ser ventajoso utilizar un lípido neutro. También puede ser ventajoso utilizar fosfolípido, que incluye un fosfolípido de ión bipolar, por ejemplo, un fosfolípido que contiene uno o más radicales alquilo o alquenilo de aproximadamente 12 a aproximadamente 22 carbonos en longitud (por ejemplo, aproximadamente 12 a aproximadamente 14, a aproximadamente 16, a aproximadamente 18, a aproximadamente 20, a aproximadamente 22 carbonos), cuyos radicales pueden contener, por ejemplo, desde 0 hasta 1 hasta 2 hasta 3 enlaces dobles. Puede ser ventajoso utilizar un fosfolípido de ión bipolar.
Los fosfolípidos preferidos incluyen, por ejemplo, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE), fosfatidilcolina de huevo (PC de huevo), palmitoil oleoil fosfatidilcolina (POPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), DPPC, dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), palmitoil linoleil fosfatidilcolina (PLPC), DPyPE, o una combinación de los mismos.
En ciertas realizaciones, el fosfolípido es DOPE. La emulsión aceite en agua catiónica puede comprender desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml de DOPE. Por ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender DOPE desde aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, o desde aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 7,5 mg/ml de DOPE.
En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica comprende aproximadamente 1,5 mg/ml de DOPE.
En ciertas realizaciones, el fosfolípido es PC de huevo. La emulsión aceite en agua catiónica puede comprender desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml de PC de huevo. Por ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender PC de huevo desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o desde aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml de PC de huevo.
En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica comprende aproximadamente 1,55 mg/ml de PC de huevo.
En ciertas realizaciones, el fosfolípido es DPyPE. La emulsión aceite en agua catiónica puede comprender desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml de DPyPE. Por ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender DPyPE desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, desde aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o desde aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de DPyPE.
En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica comprende aproximadamente 1,6 mg/ml de DPyPE.
En ciertas realizaciones, las partículas en emulsión pueden comprender una combinación de un tensioactivo y un fosfolípido descrito en la presente memoria.
D. Fase acuosa (fase Continua)
La fase acuosa (fase continua) de las emulsiones aceite en agua es una solución de sal regulada (por ejemplo, solución salina) o agua. La solución de sal regulada es una solución acuosa que comprende una sal (por ejemplo, NaCl), un tampón (por ejemplo, un tampón de citrato), y puede comprender adicionalmente un agente de ajuste de osmolalidad (por ejemplo, un sacárido), un polímero, un tensioactivo, o una combinación de los mismos. La fase acuosa puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos. Si las emulsiones se formulan para administración parenteral, es preferible compensar soluciones reguladas finales de tal manera que la tonicidad, es decir, la osmolalidad, es esencialmente la misma que los fluidos fisiológicos normales con el fin de evitar consecuencias posteriores a administración no deseadas, tales como la inflamación posterior a administración
o una rápida absorción de la composición. También es preferible regular la fase acuosa con el fin de mantener un pH compatible con las condiciones fisiológicas normales. También, en ciertos casos, puede ser deseable mantener el pH a un nivel particular con el fin de asegurar la estabilidad de determinados componentes de la emulsión.
Por ejemplo, puede ser deseable preparar una emulsión que es isotónica (es decir, la misma concentración de soluto permeable (por ejemplo, sal) medida como las células normales del cuerpo y la sangre) y isosmótica. Para controlar la tonicidad, la emulsión puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. El cloruro de sodio (NaCl), por ejemplo, se puede utilizar a aproximadamente 0,9 % (p/v) (solución salina fisiológica). Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. Los agentes de tonicidad no iónicos también se pueden utilizar para controlar la tonicidad. Una serie de agentes modificadores de la tonicidad no iónicos normalmente se conocen en la técnica. Por lo general son carbohidratos de varias clasificaciones (véase, por ejemplo, Voet and Voet (1990) Biochemistry (John
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Wiley & Sons, New York). Los monosacáridos clasificados como aldosas tales como glucosa, manosa, arabinosa y ribosa, así como los clasificados como cetosas tales como fructosa, sorbosa, y xilulosa se pueden utilizar como agentes de tonicidad no iónicos en la presente invención. También se puede utilizar disacáridos tales como sacarosa, maltosa, trehalosa y lactosa. Adicionalmente, los alditoles (alcoholes polihidroxi acíclico, también denominados alcoholes de azúcar), tales como glicerol, manitol, xilitol y sorbitol son agentes de tonicidad no iónicos útiles en la presente invención. Los agentes que modifican tonicidad no iónicos pueden estar presentes en una concentración de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 10 % o aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, dependiendo del agente que se utilice.
Se puede regular la fase acuosa. Se puede utilizar en la presente memoria cualquier tampón fisiológicamente aceptable, tal como agua, tampones de citrato, tampones de fosfato, tampones de acetato, tampones de tris, tampones de bicarbonato, tampones de carbonato, tampones de succinato, o similares. El pH del componente acuoso preferiblemente estará entre 6,0-8,0, preferiblemente aproximadamente 6,2 a aproximadamente 6,8. En una realización de ejemplo, el tampón es tampón de citrato 10 mM con un pH a 6,5. En otra realización de ejemplo, la fase acuosa es, o el tampón se prepara utilizando, agua libre de RNasa o agua tratada con DEPC. En algunos casos, la mucha sal en el tampón podría interferir con la formación de complejos de molécula de ácido nucleico en la partícula de emulsión por lo tanto se evita. En otros casos, se puede incluir cierta cantidad de sal en el tampón.
En una realización de ejemplo, el tampón es tampón de citrato 10 mM con un pH a 6,5. En otra realización de ejemplo, la fase acuosa, o el tampón se prepara utilizando agua libre de RNasa o agua tratada con DEPC.
La fase acuosa también puede comprender componentes adicionales tales como moléculas que cambia la osmolaridad de la fase acuosa o moléculas que estabilizan la molécula de ácido nucleico después de la formación de complejos. Preferiblemente, la osmolaridad de la fase acuosa se ajusta con un agente de tonicidad no iónico, tal como un azúcar (por ejemplo, trehalosa, sacarosa, dextrosa, fructosa, palatinosa reducida, etc.), un alcohol de azúcar (tal como manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, maltitol, glicerol, etc.), o combinaciones de los mismos. Si se desea, se puede utilizar un polímero no iónico (por ejemplo, un poli (alquil glicol), tal como polietilenglicol, polipropilenglicol, o polibutilenglicol) o tensioactivo no iónico.
En algunos casos, el agua sin adulterar puede ser preferida como la fase acuosa de la emulsión cuando la emulsión se prepara inicialmente. Por ejemplo, el aumento de la concentración de sal o concentración de azúcar puede hacer que sea más difícil lograr el tamaño de partícula deseable (por ejemplo, menos de aproximadamente 200 nm).
En ciertas realizaciones, la fase acuosa de la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender adicionalmente un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos. En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua contiene un poloxámero. Los poloxámeros son copolímeros de tres bloques no iónicos que tienen una cadena central hidrófoba de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas de polioxietileno hidrófilo (poli(óxido de etileno)). Los poloxámeros también se conocen por el nombre comercial polímeros de Pluronic®. Los polímeros de poloxámero pueden conducir a una mayor estabilidad y mayor resistencia a la RNasa de la molécula de ARN después de formación de complejos de ARN.
Alternativamente o además de, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender desde aproximadamente 0,1 % hasta aproximadamente 20 % (p/v) de polímero, o desde aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 10 % (p/v) de polímero. Por ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender un polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic® F127) desde aproximadamente 0,1 % hasta aproximadamente 20 % (p/v), desde aproximadamente 0,1 % hasta aproximadamente 10 % (p/v), desde aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 10 % (p/v), o desde aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 5 % (p/v).
En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua comprende aproximadamente 4 % (p/v), o aproximadamente 8 % (p/v) de Pluronic® F127.
La cantidad del componente acuoso empleado en estas composiciones será aquella cantidad necesaria para llevar el valor de la composición a la unidad. Es decir, una cantidad de componente acuoso suficiente para hacer que el 100 % se mezcle, con los otros componentes enumerados anteriormente con el fin de llevar las composiciones hasta el volumen.
4. Moléculas de ácido nucleico
Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría particular, se considera que las moléculas de ácido nucleico interactúan con el lípido catiónico a través de interacciones de carga iónica no covalentes, (fuerzas electrostáticas), y la fuerza del complejo, así como la cantidad de molécula de ácido nucleico que puede ser un complejo con una partícula se relacionan con la cantidad de lípido catiónico en la partícula. Adicionalmente, las interacciones hidrófobas/hidrófilas entre la molécula de ácido nucleico y la superficie de las partículas también pueden desempeñar una función.
La molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN autorreplicante que codifica un antígeno, tal como un ARN que codifica un péptido, polipéptido o proteína.
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(N4-acetilcitidina); f5C (5-fonnilcitidina); m5Cm (5,2-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2’-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2’-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2’-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2’-O-ribosilguanosina (fosfato)); yW (wibutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* (hidroxiwibutosina modificada); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (mannosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7deazaguanosina); G* (arcaeosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2’-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2’-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridina 5-oxiacético); mcmo5U (éster de metilo de ácido uridina 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (éster de metilo de 5-(carboxihidroximetil) uridina); mcm5U (5metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2-O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-2’-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximetilaminometil2-L-Ometiluridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2’-Ometilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2trimetiladenosina); m2’7G (N2,7-dimetilguanosina); m2’2’7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-Odimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2’-O-metilcitidina); m1Gm (1,2’-O-dimetilguanosina); m’Am (1,2-O-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetil guanosina); imG2 (isoguanosina); ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, derivados 7 sustituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquiluracilo (C1-C6), 5-metiluracilo, 5-alqueniluracilo (C2-C6), 5-alquiniluracilo (C2-C6), 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina (C1-C6), 5-metilcitosina, 5-alquenilcitosina (C2-C6), 5alquinilcitosina (C2-C6), 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8azaguanina, 7-deaza-guanina 7 sustituida, 7-deaza-7-alquinilguanina (C2-C6), 7-deaza-guanina 8 sustituida, 8hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6diaminopurina, 8-azapurina, deazapurina 7 sustituida, 7-deaza-purina 7 sustituida, 7-deaza-purina 8 sustituida, hidrógeno (residuo abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W, o 2’-O-metil-U. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus correspondientes ribonucleósidos están disponibles de proveedores comerciales. Véase, por ejemplo, documento WO 2011/005799.
Un ARN utilizado con la invención incluye idealmente solo enlaces fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas realizaciones puede contener fosforamidato, fosforotioato y/o enlaces metilfosfonato.
En algunas realizaciones, la molécula de ARN no incluye nucleótidos modificados, por ejemplo, no incluye nucleobases modificadas, y todos los nucleótidos en la molécula de ARN son ribonucleótidos estándar convencionales A, U, G y C, con la excepción de una cap 5’ que puede incluir, por ejemplo, 7-metilguanosina. En otras realizaciones, el ARN puede incluir una cap 5’ con una 7’-metilguanosina, y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos 5’ que pueden ser metilados en la posición 2’ de la ribosa.
A. ARN autorreplicante
La emulsión aceite en agua catiónica contiene una molécula de ARN autorreplicante. En determinadas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante se deriva de o se basa en un alfavirus.
Las moléculas de ARN autorreplicante son bien conocidas en la técnica y se pueden producir al utilizar elementos de replicación derivados de, por ejemplo, alfavirus, y sustituyen las proteínas víricas estructurales con una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína de interés. Una molécula de ARN autorreplicante normalmente es una molécula de cadena (+) que puede ser traducida directamente después de suministro a una célula y esta traducción proporciona una polimerasa de ARN dependiente de ARN que luego produce tanto transcriptos codificantes como anticodificantes del ARN suministrado. De esta manera el ARN suministrado conduce a la producción de múltiples ARN hijas. Estos ARN hija, así como las transcripciones subgenómicas colineales, se pueden traducir ellas mismas para proporcionar expresión in situ de un antigénico codificado, o se pueden transcribir para proporcionar transcriptos adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que se traduce para proporcionar expresión in situ del antígeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es una amplia amplificación en el número de ARN replicón introducidos y de esta manera el antígeno codificado se hace un producto de polipéptido principal de las células. Las células transfectadas con ARN autorreplicante producen brevemente antígeno antes de experimentar muerte apoptótica. Esta muerte probablemente es un resultado de intermedios de ARN de doble cadena (ds) de requisito, que también han mostrado súper activación de células dendríticas. De esta manera, la inmunogenicidad mejorada del ARN autorreplicante puede ser un resultado de la producción de dsARN antiinflamatorio, que imita una infección por virus ARN de células anfitrionas.
Ventajosamente, se utiliza la maquinaria de la célula mediante moléculas de ARN autorreplicante para generar un aumento exponencial de los productos génicos codificados, tal como proteínas o antígenos, que se pueden acumular en las células o ser secretados de las células. La sobreexpresión de las proteínas mediante moléculas de ARN autorreplicante toma ventaja de los efectos adyuvantes inmunoestimuladores, que incluyen estimulación de
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receptores tipo Toll (TLR) 3, 7 y 8 y rutas no TLR (por ejemplo, RIG-1, MD-5) mediante los productos de replicación de ARN y amplificación y traducción que induce apoptosis de las células transfectadas.
El ARN autorreplicante contiene en general al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de replicasas víricas, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación CIS de extremo 5’ y 3’, y una secuencia heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos deseada (un antígeno de interés). Un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia heteróloga se puede incluir en el ARN autorreplicante. Si se desea, la secuencia heteróloga (un antígeno de interés) se puede fusionar en marco con otras regiones de codificación en el ARN autorreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).
En determinadas realizaciones, la molécula de ARN autorreplicante no se encapsula en una partícula tipo virus. Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se pueden diseñar de tal manera que la molécula de ARN autorreplicante no puede inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al omitir uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN autorreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autorreplicante se basa en un virus alfa, tal como el virus de Sinebis (SIN), virus del bosque Semliki y virus de la encefalitis equina venezolana (EEV), uno o más genes que codifican las proteínas estructurales víricas, tal como glicoproteínas de envoltura y/o cápside, se pueden omitir.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención también se pueden diseñar para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que son atenuadas o virulentas, o para producir partículas víricas que son capaces de una única ronda de infección posterior.
Un sistema adecuado para alcanzar auto replicación en esta forma es utilizar un replicón basado en alfavirus. Los alfavirus comprenden un grupo de virus de origen de artrópodos genéticamente, estructuralmente y serológicamente relacionados de la familia Togaviridae. Veintiséis virus conocidos y subtipos de virus se han clasificado dentro del género alfavirus, que incluyen virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus del río Ross, y virus de la encefalitis equina venezolana. Como tal, el ARN autorreplicante de la invención puede incorporar un ARN replicasa derivado del virus del bosque semliki (SFV), virus sindbis (pecado), virus de la encefalitis equina venezolana (EEV), virus del río Ross (RRV), virus de la encefalitis equina oriental, u otros virus que pertenecen a la familia alfavirus.
Se puede utilizar un vector de expresión “replicón” basado en alfavirus en la invención. Los vectores replicón se pueden utilizar en diversos formatos, que incluyen ADN, ARN, y partículas de replicón recombinantes. Dichos vectores replicón se han derivado del alfavirus que incluyen, por ejemplo, virus Sindbis (Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), Semliki Forest virus (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), and Venezuelan equine encephalitis virus (Pushko et al. (1997) Virology 239:389401). Los replicones derivados de alfavirus son en general bastante similares en características principales (por ejemplo, estructura, replicación), los alfavirus individuales pueden exhibir alguna propiedad particular (por ejemplo, unión de receptor, sensibilidad de interferón, y perfil de enfermedad) que es único. Por lo tanto, los replicones alfavirus quiméricos hechos de familias de virus divergentes también pueden ser útiles.
Los replicones ARN basados en alfavirus normalmente son ARN de cadena (+) que conducen a la traducción de una replicasa (o replicasa-transcriptasa) después de administración a una celda. La replicasa se traduce como una poliproteína que se autodivide para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de cadenas (-) genómicas del ARN administrado de cadena (+). Estas transcripciones de cadena (-) pueden ellas mismas ser trascritas para dar copias adicionales del ARN pariente de cadena (+) y también da una transcripción subgenómico que codifica el antígeno. La traducción de la transcripción subgenómica conduce de esta manera a expresión in situ del antígeno mediante la célula infectada. Los replicones alfavirus adecuados pueden utilizar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etcétera.
Un ARN replicón comprende preferiblemente un genoma de ARN de un picornavirus, togavirus, flavivirus, coronavirus, paramixovirus, virus de la fiebre amarilla o alfavirus (por ejemplo, virus Sindbis, virus del bosque Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana y Virus del río Ross), que se ha modificado mediante el reemplazo de uno o más genes de proteína estructural con una secuencia de ácido nucleico heteróloga seleccionada que codifica un producto de interés.
Un replicón preferido codifica (i) una polimerasa de ARN dependiente de ARN que puede transcribir ARN desde el replicón y (ii) un antígeno. La polimerasa puede ser una replicasa alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más proteínas alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4. Mientras que los genomas alfavirus naturales codifican proteínas de virión estructurales en adición a la poliproteína replicasano estructural, se prefiere que el replicón no codifique las proteínas estructurales alfavirus. De esta manera un replicón preferido puede conducir a la producción de copias de ARN genómicas de sí mismo en una célula, pero no para la producción de viriones que contienen ARN. La incapacidad para producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus tipo natural, el replicón preferido no se puede perpetuar en sí mismo en forma infecciosa. Las proteínas estructurales alfavirus que son necesarias
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para la perpetuación de los virus tipo natural están ausentes del replicón preferido y su lugar es tomado por los genes que codifican el antígeno de interés, que la transcripción subgenómico codifica el antígeno en lugar de las proteínas de virión alfavirus estructurales.
Un replicón útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5’) codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierto (3’) codifica un antígeno. En algunas realizaciones el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, en la dirección 3’), por ejemplo, para codificar antígenos adicionales o para codificar polipéptidos accesorios.
Un replicón preferido tiene una cap 5’ (por ejemplo, una 7-metilguanosina), que frecuentemente puede mejorar la traducción in vivo del ARN. En algunas realizaciones la secuencia 5’ del replicón puede necesitar ser seleccionado para asegurar compatibilidad con la replicasa codificada.
Un replicón puede tener una cola poli-A 3’. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa poli-A (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3’.
Los replicones pueden tener diversas longitudes, pero normalmente son 5000-25000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos, o 9000-12000 nucleótidos.
El replicón se puede preparar convenientemente mediante transcripción in vitro (IVT). El IVT puede utilizar una plantilla de (cADN) creada y propagada en forma de plásmido en bacterias, o creada sintéticamente (por ejemplo, mediante procedimientos de ingeniería de reacción de cadena de polimerasa (PCR) y/o síntesis génica). Por ejemplo, una polimerasa de ARN dependiente de ADN (tal como el bacteriófago T7, T3 o las polimerasas de ARN SP6) se pueden utilizar para transcribir el replicón a partir de una plantilla de ADN. Se puede utilizar reacciones de adición poli-A y de recubrimiento adecuadas según se requiera (aunque el poli-A del replico se codifica habitualmente dentro de la plantilla de ADN). Estas polimerasas de ARN pueden tener requisitos estrictos para los nucleótidos 5’ nucleótido transcritos y en algunas realizaciones estos requerimientos se deben hacer coincidir con los requerimientos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito IVT puede funcionar eficientemente como un sustrato para su uno replicasa autocodificada. Ejemplos específicos incluyen plásmidos basados en virus Sindbis (pSIN) tal como pSINCP, descrito, por ejemplo, en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,814,482 y 6,015,686, así como las publicaciones internacionales Nos. WO 97/38087 y WO 99/18226 WO 02/26209. Las construcciones de dichos replicones, en general, se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,814,482 y 6,015,686.
En otros aspectos, la molécula de ARN autorreplicante se deriva de o se basa en un virus diferente de un alfavirus, preferiblemente, un virus ARN de cadena positiva y más preferiblemente un picornavirus flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus, o coronavirus. Las secuencias alfavirus tipo natural adecuadas son bien conocidas y están disponibles de los depositantes de secuencias, tal como el American Type Culture Collection, Rockville, Md. Ejemplo representativos de alfavirus adecuados incluyen (ATCC VR-368), virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR1240), Cabassou (ATCC VR-922), virus chikunguña (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), Virus de la encefalomielitis equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), Virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), virus del rio Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), Bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR1247), virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), Encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), Encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), y Y-62-33 (ATCC VR-375).
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención son mayores que otros tipos de ARN (por ejemplo, mARN) que se han preparado utilizando nucleótidos modificados. Normalmente, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención contienen al menos aproximadamente 4 kb. Por ejemplo, el ARN autorreplicante puede contener al menos aproximadamente 5 kb, al menos aproximadamente 6 kb, al menos aproximadamente 7 kb, al menos aproximadamente 8 kb, al menos aproximadamente 9 kb, al menos aproximadamente 10 kb, al menos aproximadamente 11 kb, al menos aproximadamente 12 kb o más de aproximadamente 12 kb. En determinados ejemplos, el ARN autorreplicante es de aproximadamente 4kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 7kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 8kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 9kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 10kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 11kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 11kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 10kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 9kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 8kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 7kb, aproximadamente 5kb hasta aproximadamente 6kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 12kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 11kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 10kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 9kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 8kb, aproximadamente 6kb hasta aproximadamente 7kb, aproximadamente 7kb hasta aproximadamente 11kb, aproximadamente 7kb hasta aproximadamente 10kb, aproximadamente 7kb hasta aproximadamente 9kb, aproximadamente 7kb hasta
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aproximadamente 8kb, aproximadamente 8kb hasta aproximadamente 11kb, aproximadamente 8kb hasta aproximadamente 10kb, aproximadamente 8kb hasta aproximadamente 9kb, aproximadamente 9kb hasta aproximadamente 11kb, aproximadamente 9kb hasta aproximadamente 10kb, o aproximadamente 10kb hasta aproximadamente 11kb.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden comprender uno o más tipos de nucleótidos modificados (por ejemplo, pseudouridina, N6-metiladenosina, 5 metilcitidina, 5-metiluridina).
La molécula del ARN autorreplicante puede codificar un único polipéptido heterólogo u, opcionalmente, dos o más antígenos de polipéptidos heterólogos ligados juntos en una forma que cada una de las secuencias retiene su identidad (por ejemplo, ligado en serie) cuando se expresa como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos heterólogos generados a partir del ARN autorreplicante se pueden producidor luego como un polipéptido de fusión o diseñar con ingeniería en tal forma que resulta en secuencias de péptidos o polipéptidos separadas.
El ARN autorreplicante de la invención puede codificar uno o más antígenos de polipéptidos que contienen un rango de epítopos. Preferiblemente los epítopos capaces de provocar una respuesta de células T auxiliares o una respuesta de células T citotóxicas o ambas.
Las moléculas de ARN autorreplicante descritas en la presente memoria se pueden diseñar con ingeniería para expresar múltiples secuencias de nucleótidos, de dos o más marcos de lectura abierto, permitiendo por lo tanto la coexpresión de proteína, tal como dos o más antígenos junto con citoquinas u otros inmunomoduladores, que pueden mejorar la generación de una respuesta inmunitaria. Dicha molécula de ARN autorreplicante puede ser particularmente útil, por ejemplo, en la producción de diversos productos génicos (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo, por ejemplo, como una vacuna bivalente o multivalente.
Las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se pueden preparar utilizando cualesquiera procedimientos adecuados. Se conocen diversos procedimientos adecuados en la técnica para producir moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, una molécula de ARN autorreplicante que contiene nucleótidos modificados se puede preparar al transcribir (por ejemplo, en transcripción in vitro) un ADN que codifica la molécula de ARN autorreplicante que utiliza una polimerasa de ARN dependiente de ADN adecuada, tal como polimerasa de ADN fago T7, polimerasa de ARN fago SP6, polimerasa de ARN fago T3 y similares, o mutantes de estas polimerasas que permiten la incorporación eficiente de nucleótidos modificados en moléculas de ARN. La reacción de transcripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados y otros componentes que soportan la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como un tampón adecuado y sales adecuadas. La incorporación de análogos de nucleótidos en un ARN autorreplicante se puede diseñar por ingeniería, por ejemplo, para alterar la estabilidad de dichas moléculas de ARN, para aumentar la resistencia contra RNasas, para establecer la replicación después de introducción en células anfitrionas adecuadas (“infectividad” del ARN), y/o para inducir o reducir respuestas inmunitarias innatas y adaptativas.
Los procedimientos sintéticos adecuados se pueden utilizar solo o en combinación con uno o más procedimientos (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinante), para producir una molécula de ARN autorreplicante de la invención. Los procedimientos adecuados para la síntesis de novo son bien conocidos en la técnica y se pueden adaptar para aplicaciones particulares. Los procedimientos de ejemplo incluyen, por ejemplo, síntesis química, que utilizan grupos de protección adecuaos tal como CEM (Masuda et al., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:34), the β-cyanoethyl phosphoramidite method (Beaucage S L et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); nucleoside Hphosphonate method (Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C et al. (1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:261922). Estas químicas se pueden realizar o adaptar para uso con sintetizadores automatizados de ácidos nucleicos que están disponibles comercialmente. Se divulgan procedimientos sintéticos adecuados adicionales en Uhlmann et al. (1990) Chem Rev 90:544-84, and Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. La síntesis de ácidos nucleicos también se puede realizar utilizando procedimientos recombinantes adecuados que son bien conocidos y convencionales en la técnica, que incluyen clonación, procesamiento y/o expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados mediante dichos polinucleótidos. La mezcla de ADN mediante fragmentación aleatoria y reensamble PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos son ejemplos de técnicas conocidas que se pueden utilizar para diseñar y producir por ingeniería secuencia de polinucleótidos. Se puede utilizar mutagénesis dirigida al sitio para alterar los ácidos nucleicos y las proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones y similares. Los procedimientos adecuados para transcripción, traducción y expresión de secuencias de ácidos nucleicos son conocidos y convencionales en la técnica. (Véase en general, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, et al., in Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982; and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989)
La presencia y/o la cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de ARN autorreplicante se pueden determinar utilizando cualesquiera procedimientos adecuados. Por ejemplo, un ARN autorreplicante se
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puede digerir a monofosfatos (por ejemplo, utilizando nucleasa P1) y desfosforilar (por ejemplo, utilizando una fosfatasa adecuada tal como CIAP) y nucleósidos resultantes analizados mediante HPLC de fase reversa (por ejemplo, utilizando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 micras, 4,6 X 250 mm) y eluye utilizando un gradiente, 30 % B (0-5 min) a 100 % B (5-13 min) y en 100 % B (13-40) min, índice de fluidez (0,7 ml/min), detección UV (longitud de onda: 260 nm), temperatura de columna (30ºC). Tampón A (ácido acético 20 mM -acetato de amonio pH 3,5), tampón B (20 mM ácido acético -acetato de amonio pH 3,5/metanol [90/10])).
Opcionalmente, las moléculas de ARN autorreplicante de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos modificados de tal manera que la molécula luego de la introducción o entrada en una célula anfitriona (por ejemplo, una célula humana) en comparación con la molécula de ARN autorreplicante correspondiente que no contiene nucleótidos modificados.
Si se desea, las moléculas de ARN autorreplicante se pueden seleccionar o analizar para confirmar sus propiedades terapéuticas y profilácticas utilizando diversos procedimientos de prueba in vitro o in vivo que son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las vacunas que comprende la molécula del ARN autorreplicante se pueden probar por su efecto en la inducción de la proliferación o función efectora del tipo de linfocito particular de interés, por ejemplo, células B, células T, estirpes de células T y clones de células T. Por ejemplo, las células de bazo de ratones inmunizados se pueden aislar y la capacidad de los linfocitos citotóxicos T para lisar células objetivos autóloga que contienen una molécula de ARN autorreplicante que codifica un antígeno de polipéptido. Adicionalmente, la diferenciación de células auxiliares T se puede analizar al medir la proliferación o producción de citoquinas TH1 (IL-2 y IFN-γ) y/o TH2 ci (IL-4 e IL-5) mediante ELISA o directamente en células T CD4+ mediante tinción de citoquinas citoplásmica y citometría de flujo.
Las moléculas de ARN autorreplicante que codifican un antígeno de polipéptido también se pueden probar para determinar la capacidad para inducir respuesta inmunitaria humoral, como se evidencia, por ejemplo, mediante inducción de producción de células B de anticuerpos específicos para un antígeno de interés. Estos ensayos se pueden realizar utilizando, por ejemplo, linfocitos B periféricos de individuos inmunizados. Dichos procedimientos de ensayo son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Se pueden utilizar otros ensayos para caracterizar las moléculas de ARN autorreplicante de la invención que pueden implicar detectar la expresión del antígeno codificado mediante células objetivo. Por ejemplo, los FACS se pueden utilizar para detectar la expresión de antígeno en la superficie celular o intracelularmente. Otra ventaja de la selección FACS es que uno puede clasificar para diferentes niveles de expresión; en ocasiones se puede desear menor expresión. Otro procedimiento adecuado para identificar células que expresan un antígeno particular implican barrido utilizando anticuerpos monoclonales sobre una placa o captura utilizando globos magnéticos recubiertas con anticuerpos monoclonales.
B. Antígenos
La molécula de ácido nucleico descrita en la presente memoria es una molécula de ácido nucleico (una molécula de ARN autorreplicante) que codifica un antígeno. Los antígenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un antígeno bacteriano, un antígeno vírico, un antígeno fúngico, un antígeno de protozoario, un antígeno de planta, un antígeno contra el cáncer o una combinación de los mismos.
Los antígenos adecuados incluyen proteínas y péptidos de un patógeno tal como un virus, bacteria, hongo, protozoario, vegetal, o de un tumor. Los antígenos víricos e inmunógenos que se pueden codificar mediante la molécula del ARN autorreplicante incluyen, pero no se limitan a, proteínas y péptidos de un ortomixovirus, tal como influenza A, B y C; virus Paramixoviridae, tal como Pneumovirus (RSV), Paramixovirus (PIV), Metapneumovirus y Morbillivirus (por ejemplo, sarampión); Pneumovirus, tal como virus sincitial respiratorio (SRV), virus sincitial respiratorio de bovinos, virus de neumonía de ratones y virus de rinotraqueítis de Turkey; Paramixovirus tal como virus de parainfluenza tipo 1-4 (PIV), virus de paperas, virus Sendai, virus 5 del simio, virus de parainfluenza de bovino, Nipahvirus, Henipavirus y virus de enfermedad de Newcastle; Poxviridae, que incluye Ortopoxvirus tal como Variola vera (que incluye pero no se limita a, la Variola mayor y Variola menor); Pneumovirus, como el metapneumovirus humano (hMPV) y metapneumovirus aviar (aMPV); Morbillivirus, tal como sarampión; Picornavirus, tal como enterovirus, rinovirus, Heparnavirus, Parecovirus, Cardiovirus y Aftovirus; Enterovirus, tal como Poliovirus tipo 1, 2 o 3, virus Coxsackie A tipos 1 a 22 y 24, virus Coxsackie B tipos 1 a 6, virus ecovirus (echo) tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y Enterovirus 68 a 71, Bunyavirus, que incluye Ortobunyavirus tal como virus de la encefalitis de california; un Flenobovirus, tal como virus de la fiebre del Valle del Rift; un Nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo; Heparnavirus, tal como virus de la Hepatitis A (HAV); Togavirus (rubéola), tal como un Rubivirus, un Alfavirus o un Arterivirus; Flavivirus, tal como virus de la encefalitis de la garrapata (TBE), virus del Dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis del Japón, virus del bosque Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo Occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis de la primera-verano Ruso, virus de la encefalitis de Powassan; Pestivirus, tal como diarrea vírica bovina (BVDV), fiebre clásica del cerdo (VFPC) o enfermedad de border (BDV); Hepadnavirus, tal como virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C; Rabdovirus, tal como Lissavirus (virus de rabia) y Vesiculovirus (VSV), Caliciviridae, tal como virus de Norwalk y virus del tipo Norwalk, tal como virus de Hawái y Virus Snow Mountain; Coronavirus, tal como SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis del ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible por porcinos (TGEV); Retrovirus tal como un Oncovirus, un Lentivirus o un Spumavirus; Reovirus, tal como un Ortoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus y Coltivirus; Parvovirus, tal como el
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Parvovirus B19; Virus de la hepatitis Delta (HDV); Virus de la hepatitis E (HEV); Virus de la hepatitis G (HGV); virus del herpes humano, tal como, por la forma de vía de virus Herpes Simplex (HSV), virus varicela-zóster (VZV), virus Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), Herpesvirus 6 (humano HHV6), Herpesvirus 7 humano (HHV7) y Herpesvirus 8 humano (HHV8); Papovavirus, tal como papiloma virus y Poliomavirus, Adenovirus y arenavirus.
En algunas realizaciones, el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un virus que infecta peces, tal como: el virus de anemia infecciosa del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática de salmón (SPDV), virus de necrosis pancreática infecciosa (IPNV), virus del bagre del canal (CCV), virus de enfermedad limpoquistica de los peces (FLDV), virus de necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), virus Herpes de Koi, virus del tipo picorna del salmón (también conocido como virus del tipo picorna del salmón del Atlántico), virus de salmón sin litoral (LSV), rotavirus de del Salmón Atlántico (ASR), virus de enfermedad de fresa de la trucha (TSD), virus del tumor del salmón Coho (CSTV), o virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV).
En algunas realizaciones el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. De esta manera la invención se puede utilizar para inmunizar contra malaria. En algunas realizaciones el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellas del género de Lepeophtheirus y de Caligus por ejemplo, piojos del mar Lepeophtheirus salmonisor Caligus rogercresseyi
Antígenos bacterianos e inmunógenos que se pueden codificar mediante moléculas de ARN autorreplicante incluyen, pero no se limitan a, proteínas y péptidos de Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Burkholderia sp. (por ejemplo, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Haemophilus influenzae, Clostridium tetani (Tetanus), Clostridium perfringens, Clostridium botulinums (Botulism), Cornynebacterium diphtheriae (Diphtheria), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella sp. (por ejemplo, B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis y B. pinnipediae,), Francisella sp. (por ejemplo, F. novicida, F. philomiragia y F. tularensis), Streptococcus agalactiae, Neiserria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum (Syphilis), Haemophilus ducreyi, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Helicobacter pylori, Staphylococcus suprophyticus, Yersinia enterocolitica, E. coli (tal como E. coli enterotoxigenica (ETEC), E. coli enteroaggregativa (EAggEC), E. coli de adhesión difusa (DAEC), E. coli enteropatogenico (EPEC), E. coli patogenico extraintestinal (ExPEC; tal como E.coli uropathogenico (UPEC) y E.coli asociado a meningitis/sepsia (MNEC)), y/o E. coli enterohemorragico (EHEC), Bacillus anthracis (anthrax), Yersinia pestis (plague), Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia, Listeria monocytogenes, Chlamydia pneumoniae, Vibrio cholerae, Salmonella typhi (fiebre tifoidea), Borrelia burgdorfer, Porphyromonas gingivalis, Klebsiella, Mycoplasma pneumoniae, etcétera.
Antígenos fúngico e inmunógenos que se pueden codificar mediante la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero no se limitan a, proteínas y péptidos de Dermatophytres, que incluyen: Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaria spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
Antígenos de protozoarios e inmunógenos que se pueden codificar mediante la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero no se limitan a, proteínas y péptidos de Entamoeba histolytica, Giardia lambli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis y Toxoplasma.
Antígenos de plantas e inmunógenos que se pueden codificar mediante la molécula de ARN autorreplicante incluyen, pero no se limitan a, proteínas y péptidos de Ricinus communis.
Antígenos adecuados incluyen las proteínas y péptidos de un virus tal como, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus A de la hepatitis (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C
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(HCV), virus herpes simplex (HSV), citomegalovirus (CMV), virus de la influenza (flu), virus sincitial respiratorio (RSV), parvo virus, norovirus, virus del papiloma humano (HPV), rinovirus, virus de la fiebre amarilla, virus de rabia, virus de fiebre del dengue, virus del sarampión, virus de paperas, virus de rubéola, virus de varicela zoster, enterovirus Enterovirus 71), virus de Ébola, y virus de la diarrea de bovinos. Preferiblemente, la sustancia antigénica se selecciona del grupo que consiste de GD de glicoproteína de HSV, gp120 de glicoproteína del VIH, GP 40 de glicoproteína de VIH, P55 GAG VIH, y polipéptidos de las regiones de Pol y de TAT. En otras realizaciones preferidas de la invención, el antígeno es una proteína o péptido derivado de una bacteria tal como, para ejemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Vibrio cholerae (cólera), C. diphtheriae (difteria), C. tetani (tétano), Neisseria meningitidis, B. pertussis, Mycobacterium tuberculosis, y similares.
Los antígenos del VIH que se pueden codificar mediante moléculas de ARN autorreplicante de la invención se describen en la Solicitud Estadounidense No. De Serie 490,858, presentada el 9 de marzo, 1990, y solicitud Europea publicada No. 181150 (14 de mayo de 1986), así como las Solicitudes Estadounidenses Nos. De series 60/168471; 09/475,515; 09/475,504; y 09/610,313.
Los antígenos de citomegalovirus que se pueden codificar mediante las moléculas de ARN autorreplicante de la invención se describen en la Patente Estadounidense No. 4,689,225, Solicitud Estadounidense No. De serie 367,363, presentada el 16 de junio de 1989 y la publicación PCT WO 89/07143.
Los antígenos de la hepatitis C que se pueden codificar mediante moléculas de ARN autorreplicante de la invención se describen en el documento PCT/US88/04125, Solicitud Europea Publicada No. 318216 (31 de mayo de 1989), Solicitud Japonesa Publicada No. 1-500565 presentada el 18 de noviembre, 1988, solicitud canadiense 583,561, y EPO 388.232. Un grupo diferente de antígenos HCV se describe en la solicitud de patente Europea 90/302866.0, presentada el 16 de marzo, 1990, y la Solicitud estadounidense No. De serie 456.637, presentada el 21 de diciembre de 1989 y el documento PCT/US90/01348.
En algunas realizaciones, el antígeno se deriva de un alérgeno, tal como alérgenos de polen (alérgenos de polen, arboles, hierbas, malezas y césped); alérgenos de arácnidos o insectos (inhalantes, alérgenos veneno y saliva, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y jejenes, alérgenos de venenos de himenópteros; alergénos de caspa y pelos de animales (de, por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, etcétera); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, una gliadina). Alérgenos de polen importante de árboles, césped y hierbales son aquellos que se originan del orden taxonómico de fagales, oléales, pinales y Platanaceae que incluyen, pero no se limitan a, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corylus), Carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Juniperus), platano (Platanus), el orden de Poales que incluyen grasas del géneros Lolium, Phleum, POA, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale, y sorgo, las órdenes de Asterales y Urticales que incluyen hierbas del género Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de los ácaros del polvo domestico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento, por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, jejenes y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides, y aquellos de mamíferos tales como gato, perros y caballos, alérgenos de venenos que incluyen insectos ponzoñosos que orbitan tales como aquellos del orden taxonómico de Hymenoptera que incluyen abejas (Apidae), avispas (Vespidea), y hormigas (Formicoidae).
En determinadas realizaciones, un antígeno o inmunógeno de tumor, o antígeno o inmunógeno de cáncer, se puede codificar mediante la molécula de ARN autorreplicante. En determinadas realizaciones, los antígenos e inmunógenos de tumor son antígenos de tumor que contienen péptidos, tal como un antígeno tumoral polipéptidico o antígenos tumorales glicoproteícos.
Los antígenos e inmunógenos tumorales adecuados para el uso en la presente memoria abarcan una amplia variedad de moléculas, tal como (a) antígenos tumorales que contienen polipéptidos, que incluyen polipéptidos (que pueden variar, por ejemplo, de 8-20 aminoácidos en longitud, aunque longitudes fuera de este rango también son comunes), lipopolipéptidos y glicoproteínas.
En determinadas realizaciones, los inmunógenos de tumor son, por ejemplo, (a) moléculas de longitud completa asociadas con células de cáncer, (b) homólogos de formas modificadas de la misma, que incluyen moléculas con partes eliminadas, añadidas y/o sustituidas, y (c) fragmentos de la misma. Los inmunógenos tumorales incluyen, por ejemplo, antígenos restringidos clase I reconocidos por linfocitos CD8+ o antígenos restringidos clase II reconocidos por linfocitos CD4+.
En determinadas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, (a) antígenos del cáncer testicular tal como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como polipéptidos de la familia RAGE, BAGE, GAGE, y MAGE por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, y MAGE-12 (que se pueden utilizar, por ejemplo, para superar melanoma, tumores de pulmón, cabeza y el cuello, NSCLC, mama, gastrointestinal, y de vejiga), (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, cabeza y cuello), p21/ras (asociada con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociada con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado
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alcoholes de azúcar, también son crioprotectores que pueden proteger el ARN, y otras moléculas de ácido nucleico, cuando se liofilizan. En realizaciones de ejemplo, el tampón comprende de aproximadamente 560 nm a 600 mm de trehalosa, sacarosa, sorbitol, o dextrosa.
En algunos casos, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico como solución hipertónica, y preparar la emulsión catiónica utilizando agua no adulterada o un tampón hipotónico. Cuando la emulsión y la molécula de ácido nucleico se combinan, la mezcla se vuelve isotónica. Por ejemplo, una solución acuosa que comprende ARN puede ser una solución hipertónica 2X, y una emulsión catiónica se puede preparar utilizando un tampón de citrato de 10 mm. Cuando una solución de ARN y la emulsión se mezclan en una relación 1:1 (v/v), la composición se vuelve isotónica. Con base en las cantidades relativas deseadas de la emulsión para la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v), mezcla 2:1 (v/v), mezcla 1:2 (v/v), etcétera), uno puede determinar fácilmente la tonicidad de la solución acuosa que se requiere con el fin de alcanzar una mezcla isotónica.
Del mismo modo, las composiciones que tienen osmolalidad fisiológica pueden ser deseables para administración in vivo. La osmolalidad fisiológica es de aproximadamente 255 mOsm/kg de agua hasta aproximadamente 315 mOsm/kg de agua. En ocasiones, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprende una molécula de ácido nucleico como una solución hiperosmolar, y preparar la emulsión catiónicos utilizando agua no adulterada o un tampón hipoosmolar. Cuando la emulsión y la molécula de ácido nucleico se combinan, se alcanza la osmolalidad fisiológica. Por supuesto, esto se puede lograr utilizando solución de ácido nucleico hipoosmolar y un tampón hiperosmolar. Con base en las cantidades relativas deseadas de la emulsión para la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v), mezcla 2:1 (v/v), mezcla 1:2 (v/v), etcétera), uno puede determinar fácilmente la osmolalidad de la solución acuosa que se requiere con el fin de alcanzar una mezcla iso-osmolar.
En determinadas realizaciones, la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico puede comprender adicionalmente un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos. En una realización de ejemplo, la emulsión aceite en agua contiene un poloxámero. En particular, los inventores han observado que agregar Pluronic® F127 a la solución acuosa de ARN antes de formación de complejos para partículas en emulsión catiónicos conduce a mayor estabilidad y aumento de resistencia Rnasa de la molécula de ARN. Además del F127 pluronic para la solución acuosa del ARN también se encontró que reduce el tamaño de partícula del complejo ARN/CNE. Los polímeros de poloxámero tambien pueden también facilitar la descomplejación/liberación adecuada de la molécula del ARN, evita la agregación de las partículas en emulsión, y tiene efecto inmunomodulador. Otros polímeros que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, Pluronic® F68 o PEG300.
Alternativamente o adicionalmente, la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico puede comprender de aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente 20 % (p/v) de polímero. Por ejemplo, la emulsión aceite en agua catiónica puede comprender un polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic® F127, Pluronic® F68, o PEG300) de aproximadamente 0,05 % hasta aproximadamente de 10 % (p/v), tal como 0,05 %, 0,5 %, 1%, o el 5%.
El sistema de tampón puede comprender cualquier combinación de dos o más moléculas descritas anteriormente (sal, tampón, sacárida, polímero, etcétera). En una realización preferida, el tampón comprende 560 mM de sacárido, 20 mM de NaCl, y 2 mM de citrato, que se puede mezclar con una emulsión aceite en agua catiónica descrita en la presente memoria para producir una fase acuosa final que comprende 280 mM de sacarosa, 10 mM de NaCl y 1 mM de citrato. En otras realizaciones, el tampón comprende aproximadamente 2-20 mM de citrato, que se puede mezclar con un aceite catiónico en una emulsión de agua descrita en la presente memoria para producir una fase acuosa final que comprende aproximadamente 1-10 mM de citrato.
5. Procedimientos de preparación
Un procedimiento para preparar una composición que comprende una molécula de ácido nucleico en complejo con una partícula de una emulsión de aceite en agua catiónica en una relación N/P de al menos 4:1 y con un diámetro de partícula promedio de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 180 nm que comprende: preparar un emulsión aceite en agua catiónica en el que la comprende: (1) de aproximadamente 0,2 % a aproximadamente 20 % (v/v) aceite, (2) de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 2,5 % (v/v) tensioactivo, y (3) un lípido catiónico; y agregar la molécula de ácido nucleico a la emulsión de aceite en agua catiónica de tal manera que la molécula de ácido nucleico forma complejos con la partícula de la emulsión.
Un enfoque de ejemplo para generar la emulsión aceite en agua catiónica es mediante un proceso que comprende:
(1) combinar el aceite y el lípido catiónico para formar la fase del aceite de la emulsión; (2) proporcionar una solución acuosa para formar la fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase de aceite en la fase acuosa, por ejemplo, mediante homogeneización. La homogeneización se puede alcanzar en cualquier forma adecuada, por ejemplo, utilizando un homogeneizador comercial (por ejemplo, homogeneizador IKA T25, disponible en VWR International (West Chester, PA).
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El lípido catiónico se puede disolver en un disolvente adecuado, tal como cloroformo (CHCl3), diclorometano (DCM), etanol, acetona, tetrahidrofurano (THF), 2,2,2 trifluoroetanol, acetonitrilo, acetato de etilo, hexano, dimetilformamida (DMF), dimetil sulfóxido (DMSO), etcétera, y se agrega directamente al componente de aceite de la emulsión. Alternativamente, el lípido catiónico se puede agregar a un disolvente adecuado para formar una suspensión de liposoma; luego, se puede agregar al componente de aceite de aceite de la emulsión. El lípido catiónico también se puede disolver directamente en el aceite.
Puede ser deseable calentar el aceite a una temperatura entre aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 65ºC para facilitar la disolución del lípido.
La cantidad deseada del lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP) se puede medir y disolver en un disolvente, en agua,
o directamente en aceite para alcanzar la concentración final deseada como se describe y ejemplifica en la presente memoria.
Los disolventes tal como cloroformo (CHCl3) o diclorometano (DCM) se pueden retirar de la fase aceitosa, por ejemplo, mediante evaporación, antes de combinar la fase acuosa y la fase de aceite o antes de homogeneización. Alternativamente, en casos en el que la solubilidad de los lípidos puede ser un problema, la emulsión primaria se puede hacer con el disolvente (por ejemplo, DCM) aun en la fase aceitosa. En dichos casos, se puede retirar el disolvente (por ejemplo, se deja evaporar) de la emulsión primaria antes de una homogeneización secundaria.
Si la emulsión comprende uno o más tensioactivos, los tensioactivos se pueden incluir en la fase aceitosa o la fase acuosa de acuerdo con la práctica convencional en la técnica. Por ejemplo, SPAN®85 se puede disolver en la fase de aceite (por ejemplo, escualeno), y Tween® 80 se puede disolver en la fase acuosa (por ejemplo, en un tampón de citrato).
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para preparar una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (ARN) en complejos con una partícula de una emulsión aceite en agua catiónica, que comprende: (i) proporcionar una emulsión aceite en agua catiónica como se describe en la presente memoria; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula de ácido nucleico (ARN); y (iii) combinar la emulsión aceite en agua de (i) una solución acuosa de (iii), de tal manera que la molécula de ácido nucleico forma complejos con la partícula de la emulsión. Por ejemplo, una emulsión aceite en agua catiónica se puede combinar con una solución acuosa que comprenda una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una solución ARN acuosa) en cualesquier cantidad relativa deseada, por ejemplo, aproximadamente 1:1 (v/v), aproximadamente 1,5:1 (v/v), aproximadamente 2:1 (v/v), aproximadamente 2,5:1 (v/v), aproximadamente 3:1 (v/v), aproximadamente 3,5:1 (v/v), aproximadamente 4:1 (v/v), aproximadamente 5:1 (v/v), aproximadamente 10:1 (v/v), aproximadamente 1:1,5 (v/v), aproximadamente 1:2 (v/v), aproximadamente 1:2,5 (v/v), aproximadamente 1:3 (v/v), aproximadamente 1:3,5 (v/v), aproximadamente 1:4 (v/v), aproximadamente 1:1,5 (v/v), o aproximadamente 1:1,10 (v/v), etcétera.
La concentración de cada componente en la composición posterior al complejo (por ejemplo, complejo de la emulsión de ARN) se puede determinar fácilmente de acuerdo con las cantidades relativas de la emulsión aceite en agua pre complejo y la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una solución de ARN acuoso) que se utiliza. Por ejemplo, cuando se combina una emulsión aceite en agua catiónica con una solución acuosa que comprende una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una solución de ARN acuoso) en una relación 1:1 (v:v), las concentraciones del lípido catiónico y aceite se hacen 1⁄2 de aquella de la emulsión precomplejo. Por lo tanto, si una emulsión que comprende 4,3 % (p/v) de escualeno, se combina 1,4 mg/ml DOTAP, 0,5 % v/v SPAN® 85 y 0,5 % v/v Tween®80 (denominado en la presente memoria como “CNE17”) con una solución de ARN acuosa que comprende 560 mM sacarosa, 20 mM NaCl, 2 mM citrato, y el 1 % (w/v) Pluronic F127 en 1:1 (v:v), la composición posterior a complejo comprende 2,15 % (p/v) de escualeno, 0,7 mg/ml DOTAP, 0,25 % v/v SPAN®85, 0,25 % v/v Tween®80, 280 mM sacarosa, 10 mM NaCl, 1mM citrato, y 0,5 % (p/v) Pluronic F127.
Etapas opcionales adicionales para promover la formación de partículas, para mejorar la formación de complejos entre moléculas de ácido nucleico y partículas catiónicas, para aumentar la estabilidad de la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, para evitar la degradación de una molécula de ARN), para facilitar la decomplejación/liberación adeucada de las moléculas de ácido nucleico (tal como una molécula de ARN), o para evitar la agregación de las partículas en emulsión se puede incluir. Por ejemplo, un polímero (por ejemplo, Pluronic® F127) o un tensioactivo s pueden agregar a la solución acuosa que comprende la molécula de ácido nucleico (tal como ARN). En una realización de ejemplo, se agrega Pluronic® F127 a la molécula de ARN para formación de complejos para la partícula de la emulsión.
El tamaño de las partículas en emulsión puede variar al cambiar la relación de tensioactivo a aceite (aumentando la relación se reduce el tamaño de la gota), presión de funcionamiento (aumentando la presión de funcionamiento se reduce el tamaño de gota), temperatura (aumentando la temperatura se reduce el tamaño de la gota) y otros parámetros de proceso. El tamaño de partícula actual también variará con un tensioactivo particular, aceite, y lípido catiónico utilizado, y con las condiciones de funcionamiento particular seleccionadas. El tamaño de partícula de emulsión se puede verificar mediante el uso de instrumentos de medición del tamaño, tal como el analizador de partículas de submicras comercial (Modelo N4MD) fabricado por Coulter Corporation, y los parámetros se pueden
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Una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones descritas en la presente memoria variará dependiendo de, entre otros, la enfermedad indicada, la gravedad de la enfermedad, la edad y salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto administrado, el modo de administración y el tratamiento deseado.
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden administrar en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, pero no se limitan a antibióticos, agentes antibacterianos, agentes antieméticos, agentes antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes inmunomoduladores, citoquinas, antidepresivos, hormonas, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos , inhibidores de la topoisomerasa, agentes citostáticos, agentes anti-invasión, agentes antiangiogénicos, inhibidores de inhibidores del factor de crecimiento de la función de la replicación viral, inhibidores de enzimas virales, agentes anticancerígenos, αinterferones, β-interferón, ribavirina, hormonas, otros moduladores de los receptores de tipo toll , inmunoglobulinas (Igs), y anticuerpos que modulan la función de Ig (tales como anti-IgE (omalizumab)).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria se utilizan en el tratamiento de enfermedades infecciosas, que incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad provocada por los patógenos divulgados en la presente memoria, que incluyen enfermedades virales tales como verrugas genitales, verrugas comunes, verrugas plantares, rabia, virus sincitial respiratorio (RSV), hepatitis B, hepatitis C, virus del dengue, fiebre amarilla, virus del herpes simple (solo a modo de ejemplo, HSV-I, HSV-II, CMV, o VZV), molluscum contagiosum, vaccinia, viruela, lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis B, virus de hepatitis A), citomegalovirus (CMV), virus de la varicela zoster (VZV), rinovirus, enterovirus (por ejemplo, EV71), adenovirus, coronavirus (por ejemplo, SARS), influenza, para-influenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, papovavirus, hepadnavirus, flavivirus, retrovirus, arenavirus (solo a modo de ejemplo, LCM, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito y Fiebre de Lassa) y filovirus (solo a modo de ejemplo , virus Ébola o el virus de Marburg).
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria se utilizan en el tratamiento de infecciones por bacterias, hongos, y protozoos que incluyen, pero no se limitan a, malaria, tuberculosis y Mycobacterium avium, lepra; carnii pneumocystis, criptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis, infección por tripanosoma, leishmaniasis, infecciones provocadas por bacterias del género Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus,y Chlamydia, e infecciones fúngicas tales como candidiasis, aspergilosis, histoplasmosis y meningitis criptocócica.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria se utilizan en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos respiratorios, trastornos dermatológicos, enfermedades y/o trastornos oculares, enfermedades y/o trastornos genitourinarios que incluyen, rechazo de aloinjertos, cáncer autoinmunitario y alérgico o piel dañada o envejecida, tales como cicatrices y arrugas.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo, tal como un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición como se divulga en la presente memoria. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria primaria y/o para reforzar una respuesta inmunitaria.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas se pueden utilizar como un medicamento, por ejemplo, para uso en el aumento o mejora de una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo, tal como un mamífero.
En ciertas realizaciones, las composiciones divulgadas en la presente memoria se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad del mismo, tal como un mamífero.
La divulgación también proporciona un dispositivo de suministro pre-llenado con una composición o una vacuna divulgada en la presente memoria.
El mamífero es preferiblemente un humano, pero puede ser, por ejemplo, una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, ya que los patógenos cubiertos en la presente memoria pueden una problemática a través de un amplio rango de especies. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o bebé), un adolescente o un adulto; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el humano es, preferiblemente, un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección por patógenos después de la administración de las composiciones o vacunas divulgadas en la presente memoria. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar las respuestas inmunitarias, sistémicamente (tal como monitorizar el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o por vía de mucosa (tal como monitorizar el nivel de producción de IgA), contra el antígeno. Normalmente, las respuestas de anticuerpos de suero específicos de antígeno se determinan después de inmunización, pero antes de inoculación, mientras que las respuestas de
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anticuerpos de la mucosa específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la inoculación.
Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones o vacunas divulgadas en la presente memoria en las que la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, el ARN) codifica un antígeno de proteína es expresar el antígeno de proteína de forma recombinante para el cribado de sueros de pacientes o secreciones mucosas mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este procedimiento también se puede utilizar para identificar antígenos y/o epítopos inmunodominantes dentro de antígenos de proteína.
La eficacia de las composiciones también se puede determinar in vivo, al inocular modelos animales apropiados del patógeno de infección de interés.
La dosificación puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples se pueden utilizar en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples las diversas dosis se pueden administrar por la misma o diferentes rutas, por ejemplo, una sensibilización parenteral y refuerzo de mucosa, una sensibilización y refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente al menos 1 semana aparte (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).
Las composiciones divulgadas en la presente memoria que incluyen uno o más antígenos o se utilizan en conjunto con uno o más antígenos se pueden utilizar para tratar tanto niños como adultos. Por lo tanto, un sujeto humano puede ser menor de 1 año de edad, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años, o al menos 55 años de edad. Los sujetos preferidos para recibir las composiciones son los ancianos (por ejemplo, >50 años, >60 años de edad, y preferiblemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas pacientes con enfermedades crónicas o inmunodeficientes. Las composiciones no son adecuadas solo para estos grupos, sin embargo, y se pueden utilizar más en general en una población.
Las composiciones divulgadas en la presente memoria que incluyen uno o más antígenos o se utilizan en conjunto con uno o más antígenos se pueden administrar a los pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional de salud o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra rubéola, una vacuna MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna DTP, una vacuna b del tipo H. influenzae conjugada, una vacuna de poliovirus inactivado, una vacuna de virus de hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna AC W135 Y tetravalente), una vacuna de virus respiratorio sincitial, etc.
En ciertas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria incluyen u opcionalmente incluyen uno o más agentes inmunorreguladores tales como adyuvantes. Los adyuvantes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un adyuvante TH1 y/o un adyuvante de TH2, discute adicionalmente más adelante. En ciertas realizaciones, los adyuvantes usados en las composiciones inmunogénicas proporcionan en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a:
1.
Composiciones que contienen minerales;
2.
Emulsiones en aceite;
3.
Formulaciones de saponina;
4.
Virosomas y partículas semejantes al virus;
5.
Derivados bacterianos o microbianos;
6.
Bioadhesivos y mucoadhesivos;
7.
Liposomas;
8.
Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno;
9.
Polifosfaceno (PCPP);
10.
Péptidos de muramilo;
11.
Compuestos de imidazoquinolona;
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12.
Compuestos de tiosemicarbazona
13.
Compuestos de triptantrina;
14.
Inmunomoduladores humanos;
15.
Lipopéptidos;
16.
Benzonaftiridinas;
17.
Micropartículas
18.
Polinucleótido inmunoestimulante (tal como ARN o ADN, por ejemplo, oligonucleótidos que contienen CpG)
Ejemplificación
La invención ahora descrita de forma general, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen solo para fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.
Ejemplo 1: emulsiones aceite en agua catiónicas
El escualeno, trioleato de sorbitán (Span 85), monololeato de polioxi-etileno sorbitán (Tween 80) se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) se adquirió de Lipoid (Ludwigshafen Alemania).
Los componentes de las emulsiones utilizadas en estos estudios se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
CNE
Lípido catiónico (+) mg/ml +Lípido Tensioactivo Escualeno Tampón/agua
CNE17
DOTAP (en DCM) 1,40 0,5 % de SPAN 85 0,5 % de Tween 80 4,3 % tampón de citrato 10 mM pH 6,5
CMF32
DOTAP 3,2 0,5 % de SPAN 85 0,5 % de Tween 80 4,3 % tampón de citrato 10 mM pH 6,5
CMF34
DOTAP 4,4 0,5 % de SPAN 85 0,5 % de Tween 80 4,3 % tampón de citrato 10 mM pH 6,5
CMF35
DOTAP 5,0 0,5 % de SPAN 85 0,5 % de Tween 80 4,3 % tampón de citrato 10 mM pH 6,5
Los CNE se prepararon similar a MF59 cargadoa como se describió previamente Ott et al., Journal of Controlled Release, volumen 79, páginas 1-5, 2002). Los CMF 32, 34 y 35 se prepararon con una modificación importante de ese proceso. El DOTAP se disolvió en escualeno directamente, y no se utilizó ningún solvente orgánico. Se descubrió que la inclusión de un solvente en emulsiones que contenían más de 1,6 mg/ml de DOTAP produce una materia prima de espuma que no se pudo microfluidizar para producir una emulsión. El escualeno calentado a 37°C permitió al DOTAP ser disuelto directamente en escualeno, y luego la fase de aceite se pudo dispersar con éxito en la fase acuosa (por ejemplo, por homogeneización) para producir una emulsión. El DOTAP es soluble en escualeno y se pueden lograr concentraciones más altas de DOTAP en escualeno que aquellas enumeradass en la Tabla 1 se. Sin embargo, se ha reportado que la alta dosis de DOTAP puede tener efectos tóxicos. Véase, por ejemplo, Lappalainen et al., Pharm. Res., vol. 11(8):1127-31 (1994).
Brevemente, el escualeno se calentó a 37°C, y el DOTAP se disolvió directamente en escualeno en presencia de SPAN 85. A continuación, la fase de aceite resultante luego se combinó con la fase acuosa (Tween 80 en tampón de citrato) e inmediatamente se homogeneizaron durante 2 min utilizando un homogeneizador IKA T25 a 24K rpm para producir una materia prima homogénea (emulsiones primarias). Las emulsiones primarias se pasaron tres a cinco veces a través de un microfluidizador 10S M-1 o un microfluidizador M-110P (Microfluidics, Newton, MA) con una bobina de enfriamiento en baño de hielo a una presión de homogeneización de aproximadamente 15K-20K PSI. Las muestras de tandas de 20 ml se retriraron de la unidad y se almacenaron a 4°C.
Cabe señalar que las concentraciones de los componentes de CNE, como se describe en la Tabla 1, son concentraciones calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de estos componentes que se utilizan para preparar las emulsiones. Se entiende que durante el proceso de producción de emulsiones, o durante el proceso de
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esterilización mediante filtración, pequeñas cantidades de escualeno, DOTAP, u otros componentes se pueden perder, y las concentraciones reales de estos componentes en el producto final (por ejemplo, en un 20 % aproximadamente. A veces, las concentraciones reales de los componentes en el producto final pueden ser ligeramente inferiores en hasta aproximadamente 25 %, o hasta aproximadamente 35 %. Sin embargo, la práctica convencional en la técnica es describir la concentración de un componente particular con base en la cantidad inicial que se utiliza para preparar la emulsión, en lugar de la concentración real en el producto final.
Síntesis de ARN
El ADN de plásmido que codifica un replicón de alfavirus (ARN autorreplicante) se utilizó como una plantilla para la síntesis de ARN in vitro. Cada replicón contiene los elementos genéticos necesarios para la replicación del ARN, pero carece de secuencias que codifican productos de genes que son necesarios para el ensamblaje de partículas. Los genes estructurales del genoma de alfavirus se reemplazaron por secuencias que codifican una proteína heteróloga (cuya expresión es impulsada por el promotor subgenómico de alfavirus). Luego del suministro de los replicones a las células eucariotas, el ARN de cadena positiva se traduce para producir cuatro proteínas no estructurales, que en conjunto se replica el ARN genómico y transcriben los ARNm subgenómicos abundantes que codifican la proteína heteróloga. Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales de alfavirus, replicones son incapaces de generar partículas infecciosas. Un promotor del bacteriófago T7 se encuentra en dirección 5’ del ADNc de alfavirus para facilitar la síntesis del ARN sw replicón in vitro, y la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) situada inmediatamente en dirección 3’ de la cola poli(A) genera el extremo 3’ correcto a través su actividad de autodivisión.
Luego de la linealización del ADN de plásmido de dirección 3’ de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, las transcripciones extraídas y descartadas se sintetizaron in vitro utilizando bacteriófago T7 o SP6 derivado de ADN-polimerasa dependiente de ARN. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37°C en presencia de concentración final 7,5 mM (polimerasa de ARN T7) o 5 mM (polimerasa de ARN SP6) de cada uno de los trifosfatos de nucleósidos (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion, Austin, TX). Después de la transcripción, la plantilla de ADN se digirió con TURBO DNasa (Ambion, Austin, TX). El replicón de ARN se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. El ARN no encapsulado se cubrió post-transcripcionalmente con Enzima de Encapsulamiento de Vaccinia (VCE) utilizando el Sistema de encapsulamiento ScriptCap m7G Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) como se indica en el manual del usuario. El ARN encapsulado posttranscripcionalmente se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. Alternativamente, los replicones pueden ser limitados por que se completan las reacciones de transcripción con m7G (5’)ppp(5’)G 6 mM (para polimerasa de ARN T7) o 4 mM (para polimerasa de ARN SP6), un análogo de estructura de cápsula no reversible (New England Biolabs , Beverly, MA) y la reducción de la concentración de trifosfato de guanosina a 1,5 mM (para polimerasa de ARN T7) o 1 mM (para polimerasa de ARN SP6). Las transcripciones se pueden purificar luego por digestión TURBO DNasa (Ambion, Austin, TX) seguido por precipitación con LiCl y un lavado en etanol al 75 %.
La concentración de las muestras de ARN se determinó al medir la densidad óptica a 260 nm. Integridad de los transcritos in vitro se confirmó por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante para la presencia de la construcción de longitud completa.
Formación de complejos de ARN
El número de nitrógenos en solución se calcula a partir de la concentración de lípido catiónico, el DOTAP por ejemplo, tiene 1 nitrógeno que se puede protonar por molécula. La concentración de ARN se utilizó para calcular la cantidad de fosfato en solución utilizando una estimación de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Mediante la variación de la cantidad de ARN: lípido, se puede modificar la relación de N/P. El ARN formó complejo con el CNE en un rango de relaciones de fosfato de nitrógeno/(N/P). El cálculo de la relación de N/P se llevó a cabo mediante el cálculo del número de moles de átomos de nitrógeno protonizables en la emulsión por mililitro. Para calcular el número de fosfatos, se utilizó una constante de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Después se determinaron los valores, se agregó la proporción adecuada de la emulsión a la ARN. Utilizando estos valores, el ARN se diluyó hasta la concentración apropiada y se agregó directamente en un volumen igual de la emulsión mientras se agitaba en vórtex ligeramente. La solución se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Una vez formó complejo la solución resultante se diluyó hasta la concentración apropiada y se utilizó en 1 hora.
Ensayo de tamaño de partículas
El tamaño de partícula de la emulsión se midió utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tamaños de partícula se presentan como el promedio Z (ZAve) con el índice de polidispersidad (pdi). Todas las muestras se diluyeron en agua antes de las mediciones. Adicionalmente, el tamaño de partícula de la emulsión se midió utilizando el medidor de partículas Horiba LA-930 (Horiba Scientific, EE.UU.). Las muestras se diluyeron en agua antes de las mediciones. El potencial zeta se midió utilizando Zetasizer Nano ZS que utiliza muestras diluidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Ensayo de fosfatasa alcalina secretada (SEAP)
Para evaluar la cinética y la cantidad de producción de antígeno, un replicón de ARN que codifica SEAP se administró con y sin formulación a ratones por vía intramuscular. Grupos de 3 o 5 ratones Balb/C hembra de edades de 8-10 semanas y un peso de aproximadamente 20 g se inmunizaron con CNES en complejo con replicón de ARN que codifica para SEAP. El ARN desnudo se formuló en RNasa libre de 1X PBS. Una dosis de 100 µl se administró a cada ratón (50 µl por sitio) en el músculo cuádriceps. Se tomaron muestras de sangre 1, 3, y 6 días después de inyección. Se separó el suero de la sangre inmediatamente después de recolección, y se almacenó a -30°C hasta uso.
Un ensayo de SEAP quimioluminiscente Phospha-Light System (Applied Biosystems, Bedford, MA) se utilizó para analizar el suero. Los sueros de ratón se diluyeron 1:4 en tampón de dilución 1X Phospha-Light. Las muestras se colocaron en un baño de agua sellado con una lámina de sellado de aluminio y se inactivaron con calor durante 30 minutos a 65°C. Después de enfriar en hielo durante 3 minutos, y equilibrarla a la temperatura ambiente, se agregaron 50 uL de tampón de ensayo Phospha-Light a los pozos y las muestras se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, se agregaron 50 uL de tampón de reacción que contiene sustrato CSPD® 1:20 (sustrato de fosfato alcalino quimioluminiscente), y se midió la luminiscencia después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente. La luminiscencia se midió en un luminómetro Berthold Centro LB 960 (Oak Ridge, TN) con una integración de 1 segundo por pozo. La actividad de SEAP en cada muestra se midió por duplicado y se muestra la media de estas dos mediciones.
Ejemplo 2: efecto del tamaño de partícula sobre la inmunogenicidad
Este ejemplo muestra que el tamaño de partícula afecta a la inmunogenicidad de las formulaciones CNE/ARN.
A. Los protocolos para el ensayo de tamaño de partícula y ensayo de SEAP in vivo se describen en el Ejemplo 1. Los protocolos para estudios de inmunogenicidad en murinos se describen en el Ejemplo 3. La Figura 1A muestra los resultados (media aritmética) del ensayo de SEAP in vivo. La Figura 1B muestra los títulos totales de IgG de los animales individuales en los ratones BALB/C en puntos de tiempo2wpl y 2wp2.
La formación de complejos de ARN con CNE 17 aumentó el tamaño de las partículas de la emulsión desde aproximadamente 220 nm hasta aproximadamente 300 nm. Como se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, cuando aumentó el tamaño de partícula, se redujeron los niveles de expresión de SEAP, y también se redujeron las respuestas inmunitarias del anfitrión.
B. El CMF34 preparado en diferentes tamaños formó complejo con el ARN que codifica RSV-F en una relación de N/P teórica de 7:1 y se inyectó en el músculo cuadriceps de ratones Balb/C bilateralmente (0,05 ml/sitio). Los tamaños de partícula de emulsión se modularon por el aumento de la presión de procesamiento del microfluidizador. Los datos (Tabla 2) muestran que los títulos anti-RSV F más altos se generaron cuando el tamaño de partícula de la emulsión era más pequeño (véase partículas de 120 nm y 90 nm) a las dos semanas después de la primera inmunización.
Tabla 2
Formulación
Dosis de ARN Relación de N/P 2wp1 GMT 2wp2 GMT
1 ug de tanda vA375 1
1 ug 7:1 16 151
1 ug de tanda vA375 1 + CMF34 (5k de procesamiento de PSI -200 nm de tamaño )
1 ug 7:1 162 1644
1 ug de tanda vA375 1 + CMF34 (7k de procesamiento de PSI -150 nm de tamaño)
1 ug 7:1 183 2540
1 ug de tanda vA375 1 + CMF34 (12k de procesamiento de PSI -120 nm de tamaño)
1 ug 7:1 465 3563
1 ug de tanda vA375 1 + CMF34 (20k de procesamiento de PSI-90 nm de tamaño)
1 ug 7:1 548 2542
Ejemplo 3: efectos de composiciones reguladoras sobre la inmunogenicidad y el tamaño de partícula
En este ejemplo, se prepararon diversas emulsiones con base en CNE17 pero con diferentes componentes reguladores. La Tabla 3 muestra las composiciones de las emulsiones modificadas con tampón.
Tabla 3
Emulsión Base
Tampón/agua
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 0 mM (en dH2O libre de RNasa, no DCM)
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 1 mM (en dH2O libre de RNasa, no DCM)
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 5 mM (en dH2O libre de RNasa, no DCM)
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 10 mM pH 6,5 Trehalosa 300 mM
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80,1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 10 mM pH 6,5 Sacarosa 300 mM
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 10 mM pH 6,5 Sorbitol 300 mM
CNE17: 4,3 % de Escualeno, 0,5 % de SPAN 85, 0,5 % de Tween 80, 1,4 mg/ml de DOTAP
tampón de citrato 10 mM pH 6,5 Dextrosa 300 mM
El ensayo de unión in vitro mostró que reducir la concentración de tampón de citrato provoca que el ARN se una con más fuerza.
Los resultados de los estudios de inmunogenicidad murinos mostraron que la adición de azúcares a CNE17 no impactó significativamente la inmunogenicidad del ARN formulado con CNE17 (Tabla 4, grupos de 9-12)). Se observaron aumentos leves en los títulos de IgG con la adición de sorbitol y dextrosa.
Tabla 4
Grupo #
Descripción 2wpl 2wp2 Relación 2wp2/2wpl
Emulsión
Relación de N:P
1
1ugvA317 - 77 1.710 22,2
2
RV01(15) - 3.441 59.557 17,3
3
CNE17 DOTAP 10:1 1.474 6.512 4,4
4
CNE13 DDA 18:1 482 8.385 17,4
5
CMF37 DOTMA 10:1 474 6.556 13,8
6
CNE16 DOEPC 12:1 1.145 9.673 8,4
7
CMF42 DSTAP 10:1 22 148 6,7
8
Liposomas DDA 18:1 898 5.333 5,9
9
CNE17 con Trehalosa 300 mM 10:1 1.807 6.445 3,6
10
CNE17 con Sacarosa 300 mM 10:1 1.042 5.515 5,3
11
CNE17 con Sorbitol 300 mM 10:1 1.209 8.874 7,3
12
CNE17 con Dextrosa 300 mM 10:1 1.247 7.956 6,4
10 Los grupos 1-8 tenían 5 animales/grupo, y los grupos de 9-12 tuvieron 10 animales/grupo. La Tabla 5 resume los resultados de los estudios de inmunogenicidad en murinos cuando los ARN formulados con CNE17 se prepararon utilizando diferentes sistemas reguladores. 37
Tabla 5
Grupo #
Descripción 2wp1 2wp2 Relación 2wp2/2wpl 1
ARN
Emulsión Relación de N:P
1
1 µg de RSV-F* PBS - 100 2269 23
2
RV01 (15) PBS - 8388 105949 13
3
1 µg de RSV-F* CNE17 con Sacarosa 280 mM 10:1 898 9384 10
4
1 µg de RSV-F** CNE17 con Sacarosa 280 mM, 10 mM NaCl, Citrato 1 mM, 10:1 1032 3184 3,1
5
CNE17 con Sacarosa 280 mM, 10 mM NaCl, Citrato 1 mM, 0,5 % (p/v) y Pluronic F127 10:1 79 895 11,3
* Replicón vA375, ** replicón vA317. Los replicones se transcribieron Ambion en tampón de HEPES, luego (i) se precipitó LiCl, (ii) se encapsularon en tampón Tris y (iii) se precipitó LiCl. Todos los grupos tenían 8 animales/grupo.
Las diferentes composiciones de tampón también afectaron el tamaño de partícula. Como se muestra en la Figura 2A, la adición de azúcar (sacarosa) disminuyó el tamaño de partícula del complejo de ARN/CNE; la adición de bajas 5 concentraciones de NaCl (a 10 mM) también redujo el tamaño de partícula del complejo de ARN/CNE (Figura 2A). El tampón de citrato no afectó el tamaño de partícula del complejo de ARN/CNE (Figura 2B).
Los efectos de los polímeros sobre el tamaño de partícula se muestran en la Figura 2C. En particular, la adición de 0,5 % de pleuronic F127 a un tampón de ARN redujo el tamaño de partícula del complejo de ARN/CNE al tamaño anterior a la formación de complejos (partículas CNE sin ARN).
10 Los títulos de anticuerpos totales y los títulos de anticuerpos neutralizantes de CNE 17 en sistemas reguladores preferidos, sacarosa 280 mM, NaCl 10 mM, y citrato 1 mM; o sacarosa 280 mM, NaCl 10 mM, citrato 1 mM y 0,5 % (p/v) de Pluronic F127, se muestran en la Tabla 5 (grupos 4 y 5).
Ejemplo 4: efectos de la relación de n/p sobre la inmunogenicidad
En este ejemplo, el replicón de ARN vA375, que codifica un antígeno F de RSV, se formuló como liposoma (RV01),
15 en complejo con CNE 17 en N/P de 10:1, y con CMF32 o CMF34 en N/P teórica de 12;1, 10:1, 8:1, 6:1, y 4:1. LAs relaciones de N/P teóricas reflejan las relaciones de N/P calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de DOTAP y el ARN que se utilizaron para preparar las formulaciones. Las relaciones de N/P reales fueron ligeramente menores que las relaciones de N/P teóricas debido a que pequeñas cantidades de DOTAP se perdieron durante la preparación de las emulsiones. Los datos GMT reflejan la media log10 del título de ratones individuales en cada
20 grupo (8 ratones/grupo). Todas las formulaciones se ajustaron a 300 mOsm/kg con sacarosa antes de inmunización. No hubo problemas de tolerabilidad obvios observados (por ejemplo, el peso corporal, las primeras citoquinas en suero), con cualquiera de las formulaciones CMF32 o CMF34.
Las relaciones de N/P reales se determinaron al cuantificar el contenido DOTAP en tandas de CNE o CMF utilizando HPLC con un detector de aerosol cargado (Corona Ultra, Chelmsford, MA). Las muestras de CNE y CMF se
25 diluyeron en isopropanol y se inyectaron en una columna XTera C18 4,6 x 150 mm 3,5 (Waters, Milford, MA). El área bajo la curva se tomó desde el pico de DOTAP en el cromatograma y la concentración se interpoló de una curva estándar DOTAP. Utilizando la concentración DOTAP real, se puede calcular una relación de N/P real.
Los datos de inmunogenicidad de la Tabla 6 muestran que se obtuvieron buenos títulos cuando la relación de N/P real fue de al menos 4:1.

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