ES2657221T3 - Composiciones y métodos para la detección de anticuerpos específicos para Anaplasma phagocitophilum (Aph) y Anaplasma platys (Apl) - Google Patents
Composiciones y métodos para la detección de anticuerpos específicos para Anaplasma phagocitophilum (Aph) y Anaplasma platys (Apl) Download PDFInfo
- Publication number
- ES2657221T3 ES2657221T3 ES09819862.5T ES09819862T ES2657221T3 ES 2657221 T3 ES2657221 T3 ES 2657221T3 ES 09819862 T ES09819862 T ES 09819862T ES 2657221 T3 ES2657221 T3 ES 2657221T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- polypeptide
- anaplasma
- seq
- amino acid
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000605280 Anaplasma platys Species 0.000 title abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 32
- 241000606646 Anaplasma Species 0.000 title description 24
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 194
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 191
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 189
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 69
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 56
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 56
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 55
- 241000605281 Anaplasma phagocytophilum Species 0.000 abstract description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 17
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 60
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 39
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 39
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- 241000099175 Anaplasma sp. Species 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- -1 t-butyloxycarbonyl Chemical group 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-n-methylthiophene-2-sulfonamide Chemical group CNS(=O)(=O)C1=CC=C(Br)S1 JLLYLQLDYORLBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N Dioxetane Chemical class C1COO1 BVTJGGGYKAMDBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243988 Dirofilaria immitis Species 0.000 description 1
- 241000605312 Ehrlichia canis Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 241000002163 Mesapamea fractilinea Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940099686 dirofilaria immitis Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940051998 ehrlichia canis Drugs 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006101 laboratory sample Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N methylazanide Chemical group [NH-]C MGJXBDMLVWIYOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Chemical group O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0233—Rickettsiales, e.g. Anaplasma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/29—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Richettsiales (O)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6056—Antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/29—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Richettsiales (o)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Mycology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Una composición que comprende uno o más polipéptidos purificados que consiste en: (a) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 8, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma platys; (b) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 1, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (c) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 4, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (d) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 5, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (e) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 6, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (f) una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 7, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (g) al menos 17 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 8, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma platys; (h) al menos 17 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 19, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma platys; (i) al menos 17 aminoácidos contiguos de una secuencia de aminoácidos expuesta como SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 15, 16, 17, 18 o 20, en donde los polipéptidos comprenden un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; (j) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 94% de identidad con las SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 15, 16, 17, 18 o 20, que comprende un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma phagocytophilum; o (k) un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 94% de identidad con las SEC ID Nº: 8 o 19, que comprende un determinante antigénico que es reconocido por anticuerpos específicos para Anaplasma platys;
Description
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Se muestra en SEC ID Nº: 11 una secuencia de consenso de SEC ID Nº: 4-7 y 9:
SEC ID Nº: 11 YLLAKELAYDVVTGQTDXLXAALAKTSGKDXVQFA
En una forma de realización descrita en el presente texto, la X en la posición 18 de la SEC ID Nº: 11 es N o K; la X en la posición 20 es T o A; y la X en la posición 31 es F o I. Una forma de realización descrita en el presente texto comprende los aminoácidos 4-21 de SEC ID Nº: 11; aminoácidos 19-34 de SEC ID Nº: 11; o los aminoácidos 11-30 de SEC ID Nº: 11.
Una forma de realización proporciona un polipéptido purificado que consiste en menos de aproximadamente 46, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos contiguos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 46 y aproximadamente 6 aminoácidos) de SEC ID Nº: 1-9 y 11-21. Una forma de realización proporciona un polipéptido purificado que consiste en más de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, o 46 aminoácidos contiguos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 46 y aproximadamente 6 aminoácidos) de SEC ID Nº: 1-9 y 11-12. Los aminoácidos de Aph o ApI de origen natural son cualquier polipéptido producido naturalmente por un organismo Aph o ApI. Un polipéptido purificado puede comprender menos de un cierto número de aminoácidos de Anaplasma contiguos de origen natural (por ejemplo, aproximadamente menos de 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 200 y aproximadamente 6 aminoácidos)) de SEC ID Nº: 1-21. Es decir, el polipéptido purificado es más pequeño que el polipéptido de longitud completa. El hecho de que estos polipéptidos sean más pequeños que un polipéptido de Anaplasma de longitud completa es importante porque los polipéptidos más pequeños pueden tener una mayor especificidad y/o sensibilidad que los polipéptidos de longitud completa en los ensayos de ApI y/o Aph. Adicionalmente, estos polipéptidos más pequeños pueden ser de elaboración menos costosa y se pueden obtener con mayor pureza que el polipéptido de longitud completa.
Otra forma de realización proporciona un polipéptido purificado que consiste en menos de aproximadamente 200, 175, 150, 125, 100, 75, 50, 25, 20, 15, 10, 6 o menos aminoácidos de Anaplasma de origen natural contiguos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 200 y aproximadamente 6 aminoácidos) de SEC ID Nº: 10. Otra forma de realización proporciona un polipéptido purificado que consiste en más de aproximadamente 6, 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 o más aminoácidos de Anaplasma de origen natural contiguos (o cualquier intervalo entre aproximadamente 6 y aproximadamente 200 aminoácidos) de la SEC ID Nº: 10.
Polipéptidos variantes que son al menos aproximadamente 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a las secuencias polipeptídicas mostradas en SEC ID Nº: 1-21 se describen también en el presente texto. Por ejemplo, un polipéptido variante de SEC ID Nº: 1 puede ser de al menos aproximadamente 98% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 96% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 93% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos), 91% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos), 89% (aproximadamente 5 cambios de aminoácidos), 87% (aproximadamente 6 cambios de aminoácidos), 84% (aproximadamente 7 cambios de aminoácidos), 82% (aproximadamente 8 cambios de aminoácidos) o 80 % (aproximadamente 9 cambios de aminoácidos), idéntico a SEC ID Nº: 1. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 2 puede ser de al menos 98% (aproximadamente 1 cambio de aminoácido), 96% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 94% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos), 92% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos), 90% (aproximadamente 5 cambios de aminoácidos), 88% (aproximadamente 6 cambios de aminoácidos), aproximadamente 86% (aproximadamente 7 cambios de aminoácidos), 84% (aproximadamente 8 cambios de aminoácidos), 82% (aproximadamente 9 cambios de aminoácidos), o 80% (aproximadamente 10 cambios de aminoácidos) idénticos a la SEC ID Nº: 2. Un polipéptido variante de la SEC ID Nº: 3 puede ser al menos aproximadamente 98% (aproximadamente 1 cambio de aminoácido), 96% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 94% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos), 91% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos), 89% (aproximadamente 5 cambios de aminoácidos), 87% (aproximadamente 6 cambios de aminoácidos), 85% (aproximadamente 7 cambios de aminoácidos), 83% (aproximadamente 8 cambios de aminoácidos), o 80% (aproximadamente 9 cambios de aminoácidos) idéntico a SEC ID Nº: 3. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 4 y 9 puede ser aproximadamente al menos 97% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 94% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 91% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos), 89% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos), 86% (aproximadamente 5 cambios de aminoácidos), 83% (aproximadamente 6 cambios de aminoácidos), o 80% (aproximadamente 7 cambios de aminoácidos) idéntico a SEC ID Nº: 4 y 9. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 5 puede ser al menos aproximadamente 94% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 89% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), o 83% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos) idéntico a SEC ID Nº: 5. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 6 puede ser al menos aproximadamente 94% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 88% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), o 82% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos) idéntico a SEC ID Nº: 6. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 7 puede ser aproximadamente al menos 95% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 90% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 85% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos) o 80% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos) idéntico a SEC ID Nº: 7. Un polipéptido variante de SEC ID Nº: 8 puede ser al menos 97% (aproximadamente 1 cambio de aminoácidos), 94% (aproximadamente 2 cambios de aminoácidos), 91% (aproximadamente 3 cambios de aminoácidos), 88% (aproximadamente 4 cambios de aminoácidos), 84% (aproximadamente 5 cambios de aminoácidos), o 81% (aproximadamente 6 cambios de
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
aminoácidos) idénticos a la SEC ID Nº: 8.
Los polipéptidos variantes tienen una o más variaciones conservadoras de aminoácidos u otras modificaciones menores y retienen la actividad biológica, es decir, son equivalentes biológicamente funcionales. Un equivalente biológicamente activo tiene una función sustancialmente equivalente cuando se compara con el correspondiente polipéptido de tipo silvestre. En una forma de realización de la invención, un polipéptido tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos.
El porcentaje de identidad de secuencia tiene un significado reconocido en la técnica y hay varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o de polinucleótidos. Véase, por ejemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin y Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Parte I, Humana Press, Nueva Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov y Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nueva York, (1991). Los métodos para alinear polinucleótidos o polipéptidos se codifican en programas informáticos, que incluyen el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al. J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)), y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) que utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2: 482 -489 (1981)). Por ejemplo, se puede usar el programa ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, con una búsqueda de hueco afín con una penalización abierta de hueco de -12 y una penalización de extensión de hueco de -2.
Cuando se utiliza cualquiera de los programas de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente idéntica en un 95% a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa del polinucleótido de referencia y se permiten huecos en la identidad de hasta 5% del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia.
Los polipéptidos variantes pueden identificarse generalmente modificando una de las secuencias polipeptídicas descritas en el presente texto, y evaluando las propiedades del polipéptido modificado para determinar si es un equivalente biológico. Una variante es un equivalente biológico si reacciona sustancialmente igual que un polipéptido descrito en el presente texto en un ensayo tal como un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunoenzimático o un ensayo western blot o transferencia western, p. ej. tiene 90 -110% de la actividad del polipéptido original. En una forma de realización, el ensayo es un ensayo de competición en el que el polipéptido biológicamente equivalente es capaz de reducir la unión del polipéptido a un antígeno o anticuerpo reactivo correspondiente en aproximadamente un 80, 95, 99 o 100%. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido correspondiente de tipo silvestre también se une específicamente al polipéptido variante.
Una sustitución conservadora es la sustitución en la que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de tal forma que un experto en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permaneciesen sustancialmente sin cambios. En general, los grupos de aminoácidos siguientes representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.
Un polipéptido de descrito en el presente texto puede comprender además una secuencia señal (o líder) que dirige la transferencia de la proteína de manera traduccional o post-traduccional. El polipéptido también puede comprender un enlazador u otra secuencia para facilitar la síntesis, la purificación o la identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina o albúmina de suero bovino.
Un polipéptido se puede enlazar de forma covalente o no covalente a una secuencia de aminoácidos con la que el polipéptido no está normalmente asociado en la naturaleza, es decir, una secuencia de aminoácidos heteróloga. Una secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser de un gen no Anaplasma phagocytophilum, un organismo no Anaplasma plastys, una secuencia sintética o una secuencia de Anaplasma phagocytophilum o secuencia de Anaplasma platys no localizada normalmente en el extremo carboxi o amino de un polipéptido descrito en el presente texto. Además, un polipéptido puede estar unido de forma covalente o no covalente a compuestos o moléculas distintos de los aminoácidos, tales como reactivos indicadores. Un polipéptido puede estar unido de forma covalente o no covalente a un espaciador de aminoácidos, un enlazador de aminoácidos, una secuencia señal, una secuencia de parada de transferencia, un dominio transmembrana, un ligando de purificación de proteína o una combinación de los mismos. Un polipéptido también se puede unir a un resto (es decir, un grupo funcional que puede ser un polipéptido u otro compuesto) que potencia una respuesta inmunitaria (por ejemplo, citocinas tales como IL-2), un resto que facilita la purificación (por ejemplo, etiquetas de afinidad tales como una etiqueta de seis histidinas, trpE, glutatión, proteína de unión a maltosa) o un resto que facilita la estabilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol, grupos protectores del extremo amino tales como acetilo, propilo, succinilo, bencilo, benciloxicarbonilo o t-butiloxicarbonilo; grupos protectores del extremo carboxilo tales como amida, metilamida y etilamida). En una forma de realización descrita en el presente texto,, un ligando de purificación de proteínas puede
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ser uno o más restos de aminoácidos C en, por ejemplo, el extremo amino o el extremo carboxi de un polipéptido descrito en el presente texto. Un espaciador de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos que no están asociados con un polipéptido descrito en el presente texto en la naturaleza. Un espaciador de aminoácidos puede comprender aproximadamente 1, 5, 10, 20, 100 o 1.000 aminoácidos.
Si se desea, un polipéptido descrito en el presente texto puede ser parte de una proteína de fusión, que también puede contener otras secuencias de aminoácidos tales como enlazadores de aminoácidos, espaciadores de aminoácidos, secuencias señal, secuencias de transferencia de parada de TMR, dominios transmembrana, así como ligandos útiles en la purificación de proteínas, tales como glutatión-S-transferasa, etiqueta de histidina y proteína A estafilocócica, o combinaciones de los mismos. Otras secuencias de aminoácidos pueden estar presentes en el extremo C o N de un polipéptido descrito en el presente texto para formar una proteína de fusión. Más de un polipéptido descrito en el presente texto puede estar presente en una proteína de fusión. Los fragmentos de polipéptidos descritos en el presente texto pueden estar presentes en una proteína de fusión de la invención. Una proteína de fusión descrita en el presente texto puede comprender uno o más polipéptidos de la invención, fragmentos de los mismos o combinaciones de los mismos.
Los polipéptidos descritos en el presente texto pueden estar en forma multimérica. Es decir, un polipéptido puede comprender una o más copias de un polipéptido descrito en el presente texto o una combinación de los mismos. Un polipéptido multimérico puede ser un péptido antigénico múltiple (MAP). Véase, por ejemplo, Tam, J. Immunol. Methods, 196: 17 -32 (1996).
Los polipéptidos descritos en el presente texto pueden comprender un determinante antigénico que es reconocido por un anticuerpo específico para Anaplasma phagocytophilum o Anaplasma platys o ambos, Anaplasma phagocytophilum y Anaplasma platys. El polipéptido puede comprender uno o más epítopos, es decir, determinantes antigénicos). Un epítopo puede ser un epítopo lineal, un epítopo secuencial o un epítopo conformacional. Los epítopos dentro de un polipéptido descrito en el presente texto se pueden identificar por varios métodos. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos nº 4.554.101; Jameson y Wolf, CABIOS 4: 181 -186 (1988). Por ejemplo, un polipéptido descrito en el presente texto puede ser aislado y cribado. Se puede preparar por escisión proteolítica una serie de péptidos cortos, que juntos comprenden una secuencia polipeptídica completa. Comenzando, por ejemplo, con fragmentos polipeptídicos 30-meros, cada fragmento puede analizarse para determinar la presencia de epítopos reconocidos en un ELISA. Por ejemplo, en un ensayo ELISA, un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum, tal como un fragmento de polipéptido 30-mero, se une a un soporte sólido, tal como los pocillos de una placa de pocillos múltiples de material plástico. Se marca una población de anticuerpos, se añade al soporte sólido y se permite que se una al antígeno no marcado, bajo condiciones en las que se bloquea la absorción no específica y se eliminan mediante lavado los anticuerpos no unidos y otras proteínas. La unión de anticuerpos se detecta, por ejemplo, mediante una reacción que convierte un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado. Los fragmentos progresivamente más pequeños y solapantes se pueden ensayar luego a partir de un 30-mero identificado para cartografiar el epítopo de interés. Un polipéptido descrito en el presente texto puede producirse de forma recombinante. Un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en el presente texto se puede introducir en un vector de expresión recombinante, que se puede expresar en un sistema de células hospedadoras de expresión adecuada usando técnicas bien conocidas en este campo. Están disponibles en la técnica una variedad de sistemas de expresión de bacterias, levaduras, plantas, mamíferos e insectos, y se puede usar cualquier sistema de expresión de este tipo. Opcionalmente, un polinucleótido que codifica un polipéptido puede traducirse en un sistema de traducción libre de células. Un polipéptido también puede sintetizarse químicamente u obtenerse a partir de células Anaplasma.
Un polipéptido inmunogénico descrito en el presente texto puede comprender una secuencia de aminoácidos que se muestra en las SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de las mismas. Un polipéptido inmunogénico puede desencadenar anticuerpos u otras respuestas inmunitarias (por ejemplo, respuestas de células T del sistema inmunitario) que reconocen epítopos de un polipéptido que tiene SEC ID Nº: 1-21. Un polipéptido inmunogénico descrito en el presente texto también puede ser un fragmento de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en SEC ID Nº: 1-21. Un fragmento polipeptídico inmunogénico descrito en el presente texto puede ser de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 o más aminoácidos de longitud. Un fragmento polipeptídico inmunogénico descrito en el presente texto puede tener una longitud de aproximadamente 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o menos aminoácidos.
Polinucleótidos de Anaplasma.
Los polinucleótidos descritos en el presente texto contienen menos de un genoma microbiano completo y pueden ser ácidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios. Un polinucleótido puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN sintetizados químicamente o combinaciones de los mismos. Los polinucleótidos pueden purificarse libres de otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser purificado en un 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Una molécula de ácido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moléculas de ácido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc
o genómicas, o rodajas de gel que contienen un material de digestión de restricción de ADN genómico no debe considerarse como polinucleótido purificado. Los polinucleótidos descritos en el presente texto codifican los
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
típicamente de manera específica de la secuencia, por ejemplo mediante hibridación. Los cebadores son un subconjunto de sondas que pueden soportar una manipulación enzimática y que pueden hibridarse con un ácido nucleico diana de forma que tiene lugar la manipulación enzimática. Se puede preparar un cebador a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica que no interfieran con la manipulación enzimática.
Una sonda o cebador puede ser de aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 , 90, 100, 125, 150, 175, 200 o más nucleótidos contiguos que codifican polipéptidos descritos en el presente texto.
La hibridación de ácidos nucleicos es bien entendida en la técnica y se discute en el presente texto. Típicamente, una sonda puede prepararse a partir de cualquier combinación de nucleótidos o derivados de nucleótidos o análogos disponibles en la técnica. La capacidad de dichas sondas y cebadores para hibridarse específicamente con secuencias de polinucleótidos de Anaplasma phagocytophilum o de Anaplasma platys les permitirá ser utilizados para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra de ensayo dada. Las sondas y los cebadores de polinucleótido descritos en el presente texto pueden hibridarse con secuencias complementarias en una muestra de ensayo tal como una muestra biológica, que incluye saliva, esputo, sangre, plasma, suero, orina, heces, fluido cerebroespinal, fluido amniótico, exudado de heridas o tejido. Los polinucleótidos de la muestra pueden someterse, por ejemplo, a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaños o pueden inmovilizarse sin separación por tamaño. Las sondas o cebadores de polinucleótidos pueden marcarse. En la técnica se conocen marcadores adecuados y métodos para marcar sondas y cebadores, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos incorporados por traslado de mella o por cinasa, marcadores de biotina, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores de quelantes metálicos y marcadores enzimáticos. Los polinucleótidos de la muestra se ponen en contacto con las sondas o cebadores en condiciones de hibridación de rigor adecuado.
Dependiendo de la aplicación, se pueden usar condiciones variables de hibridación para conseguir grados variables de selectividad de la sonda o cebador hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, pueden usarse condiciones relativamente rigurosas, tales como condiciones de baja cantidad de sal y/o alta temperatura, tal como las que se proporcionan por una concentración de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de sal, a temperaturas de aproximadamente 50 ºC a aproximadamente 70 ºC. Para aplicaciones que requieren menos selectividad, se pueden usar condiciones de hibridación menos rigurosas. Por ejemplo, las condiciones de sal de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que se encuentran en el intervalo de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. La presencia de un complejo hibridado que comprende la sonda o el cebador y un polinucleótido complementario de la muestra de ensayo indica la presencia de ApI o una secuencia de polinucleótido ApI en la muestra.
Anticuerpos.
Los anticuerpos descritos en el presente texto son moléculas de anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum o un polipéptido de Anaplasma platys o un polipéptido variante descrito en el presente texto o un fragmento del mismo. Un anticuerpo descrito en el presente texto puede ser específico para un polipéptido Aph o un polipéptido ApI o un polipéptido variante o una combinación de los mismos, por ejemplo un anticuerpo específico para una o más de las SEC ID Nº: 1 -21. En otra forma de realización de la invención, un anticuerpo es específico para un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum (por ejemplo, un anticuerpo específico para las SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18 o 20). En otra forma de realización descrita en el presente texto, un anticuerpo es específico para un polipéptido de Anaplasma platys (por ejemplo, un anticuerpo específico para las SEC ID Nº: 8 o 19). En otra forma de realización descrita en el presente texto, un anticuerpo es específico tanto para un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum como para un polipéptido de Anaplasma platys (por ejemplo, un anticuerpo específico para las SEC ID Nº: 2, 3, 10, 13, 14 o 21). Un profesional con experiencia normal en la técnica puede determinar fácilmente si un anticuerpo es específico para un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum o un polipéptido de Anaplasma platys, usando los ensayos descritos en el presente texto. Un anticuerpo descrito en el presente texto puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno son una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o región variable de un anticuerpo intacto, donde la porción está libre de los dominios de cadena pesada constantes de la región Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo que se unen a antígenos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab' -SH, F (ab ')2 y Fv.
Un anticuerpo descrito en el presente texto puede ser cualquier clase de anticuerpo que incluye, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo o un fragmento del mismo se une a un epítopo de un polipéptido descrito en el presente texto. Se puede preparar un anticuerpo in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro usando técnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Dean, Methods MoI. Biol. 80: 23 -37 (1998); Dean, Methods MoI. Biol. 32: 361 -79 (1994); Baileg, Methods MoI. Biol. 32: 381 -88 (1994); Gullick, Methods MoI. Biol. 32: 389 -99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37: 7 -56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10: 239 -65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12: 125 -68 (1992). Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden producirse administrando un
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
polipéptido descrito en el presente texto a un animal, tal como un ser humano u otro primate, ratón, rata, conejo, cobaya, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, asno o caballo El suero del animal inmunizado se recoge y los anticuerpos se purifican del plasma mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato amónico, seguida de cromatografía, tal como cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales son conocidas en la técnica.
"Se une específicamente" o "específico para" significa que un primer antígeno, por ejemplo un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum o Anaplasma platys, reconoce y se une a un anticuerpo de la invención con mayor afinidad que a otras moléculas no específicas. Una molécula no específica es un antígeno que no comparte ningún epítopo común con el primer antígeno. En una forma de realización de la invención preferida, una molécula no específica no se deriva de Anaplasma sp. Una Anaplasma sp. es cualquier especie del género Anaplasma. Por ejemplo, un anticuerpo preparado contra un primer antígeno (por ejemplo, un polipéptido) al que se une de manera más eficaz que a un antígeno no específico puede describirse como un anticuerpo que se une específicamente al primer antígeno. En una forma de realización, un anticuerpo o fragmento del mismo de unión a antígeno se une específicamente a un polipéptido de SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos del mismo cuando se une con una afinidad de unión Ka de 107 l/mol o más. La unión específica se puede ensayar utilizando, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de transferencia Western usando una metodología bien conocida en la técnica.
Los anticuerpos descritos en el presente texto incluyen anticuerpos y fragmentos de unión con el antígeno de los mismos que (a) compiten con un anticuerpo de referencia por la unión a SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de unión con el antígeno de los mismos; (b) se une al mismo epítopo de SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de unión con el antígeno del mismo como anticuerpo de referencia; (c) se une a SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de unión a antígeno del mismo con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo de referencia; y/o (d) se une a SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de los mismos sustancialmente con la misma velocidad de descuento que un anticuerpo de referencia, donde el anticuerpo de referencia es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de SEC ID Nº: 1-21 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, con una afinidad de unión Ka de 107 l/mol o más.
Además, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos presentes en un polipéptido descrito en el presente texto también se pueden producir fácilmente. Por ejemplo, células B normales procedentes de un mamífero tal como un ratón, que se inmunizaron con un polipéptido descrito en el presente texto, pueden fusionarse con, por ejemplo, células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos de Anaplasma se pueden identificar utilizando RIA o ELISA y se pueden aislar mediante clonación en agar semisólido o mediante dilución limitante. Los clones que producen anticuerpos específicos de Anaplasma se aíslan mediante otra tanda de cribado. Los anticuerpos monoclonales pueden cribarse en relación con su especificidad usando técnicas estándar, por ejemplo uniendo un polipéptido descrito en el presente texto a una placa de microtitulación y midiendo la unión del anticuerpo monoclonal mediante un ensayo ELISA. Las técnicas para producir y procesar anticuerpos monoclonales son conocidas en este campo. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal se pueden preparar directamente seleccionando a partir de la fusión inicial, o se pueden preparar de forma secundaria, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente usando una técnica de selección de sib para aislar variantes de cambio de clase. Véase Steplewski et al, P.N.A.S. U.S.A. 82: 8653 1985; Spria et al., J. Immunolog. Meth. 74: 307, 1984. Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente texto pueden ser también anticuerpos monoclonales recombinantes. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 4.474.893; patente de Estados Unidos nº 4.816.567. Los anticuerpos descritos en el presente texto también pueden ser construidos químicamente. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 4.676.980.
Los anticuerpos descritos en el presente texto pueden ser quiméricos (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Nº 5.482.856), humanizados (véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 (1992)), anticuerpos caninizados, caninos o humanos. Los anticuerpos humanos se pueden preparar, por ejemplo, mediante inmortalización directa, presentación de fagos, ratones transgénicos o una metodología Trimera, véase, por ejemplo, Reisener et al., Trends Biotechnol. 16: 242 246 (1998).
Los anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de Anaplasma phagocytophilum con exclusión de los antígenos de Anaplasma platys (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18 o 20) son particularmente útiles para detectar la presencia de antígenos de Anaplasma phagocytophilum en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, plasma, orina, heces, tejido, célula o saliva de un animal infectado con Anaplasma phagocytophilum.
Los anticuerpos que se unen específicamente a los antígenos de Anaplasma platys con exclusión de los antígenos de Anaplasma phagocytophilum (por ejemplo, SEC ID Nº: 8 o 19), son particularmente útiles para detectar la presencia de antígenos de Anaplasma platys en una muestra, como suero, sangre, plasma, orina, heces, tejido o saliva de un animal infectado con Anaplasma platys.
Los anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum (por
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
ejemplo, SEC ID Nº: 2, 3, 10, 13, 14 o 21) son particularmente útiles para detectar la presencia de antígenos de Anaplasma platys y Anaplasma phagocytophilum en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, plasma, orina, heces, tejido o saliva de un animal infectado con Anaplasma platys o Anaplasma phagocytophilum.
Un inmunoensayo para un antígeno de Anaplasma puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para un antígeno de Anaplasma puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para un epítopo de Anaplasma, una combinación de anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de un polipéptido de Anaplasma, anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de diferentes polipéptidos de Anaplasma, anticuerpos policlonales específicos para el mismo antígeno Anaplasma, anticuerpos policlonales específicos para diferentes antígenos de Anaplasma, o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo pueden basarse, por ejemplo, en ensayos de competición, reacción directa o ensayos de tipo sándwich usando, por ejemplo, anticuerpo marcado. Los anticuerpos descritos en el presente texto pueden marcarse con cualquier tipo de marcador conocido en la técnica, que incluye, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos, coloidales, de radioisótopos y bioluminiscentes. Los anticuerpos descritos en el presente texto pueden unirse específicamente a antígenos Aph solamente, a antígenos ApI, o a antígenos Apl y antígenos ApI.
Los anticuerpos descritos en el presente texto o fragmentos de los mismos pueden unirse a un soporte y usarse para detectar la presencia de antígenos ApI y/o Aph. Los soportes incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilón, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magletita.
Los anticuerpos descritos en el presente texto pueden usarse además para aislar organismos o antígenos ApI y/o Aph por columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o mediante enlace covalente de forma que los anticuerpos conserven su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, pueden incluirse grupos espaciadores de forma que permanezca accesible el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos inmovilizados pueden usarse para unir organismos Anaplasma o antígenos de Anaplasma de una muestra, como una muestra biológica que incluye saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, exudado de herida o tejido. Los organismos Anaplasma o antígenos de Anaplasma unidos se recuperan de la matriz de la columna mediante, por ejemplo, un cambio del pH.
Los anticuerpos descritos en el presente texto también pueden usarse en estudios de inmunolocalización para analizar la presencia y distribución de un polipéptido descrito en el presente texto durante varios eventos celulares o condiciones fisiológicas. Los anticuerpos pueden también usarse para identificar moléculas implicadas en la inmunización pasiva y para identificar moléculas implicadas en la biosíntesis de antígenos no proteicos. La identificación de tales moléculas puede ser útil en el desarrollo de vacunas. Los anticuerpos descritos en el presente texto que incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena sencilla, pueden usarse para monitorizar el curso de la mejoría de una enfermedad causada por ApI y/o Aph. Midiendo el aumento o la disminución de anticuerpos específicos para ApI y/o Aph en una muestra de ensayo de un animal, se puede determinar si es eficaz un régimen terapéutico particular destinado a mejorar el trastorno. Los anticuerpos se pueden detectar y/o cuantificar usando, por ejemplo, ensayos de unión directa tales como RIA, ELISA o ensayos de transferencia Western.
Métodos de detección.
Los métodos descritos en el presente texto pueden usarse para detectar anticuerpos o fragmentos específicos de unión de los mismos, específicos para antígenos de Anaplasma, antígenos de ApI, antígenos de Aph, polinucleótidos de ApI, polinucleótidos de Aph o una combinación de los mismos en una muestra de ensayo, como una muestra biológica, una muestra ambiental, o una muestra de laboratorio. Una muestra de ensayo puede comprender potencialmente polinucleótidos de ApI, polinucleótidos de Aph, polipéptidos de ApI, polipéptidos de Anaplasma sp., polipéptidos de Aph, anticuerpos específicos para Anaplasma sp., anticuerpos específicos para ApI, y/o anticuerpos específicos para Aph, polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos o antígenos no relacionados, combinaciones de los anteriores, o ninguno de los anteriores. Una muestra biológica puede incluir, por ejemplo, sueros, sangre, células, plasma, saliva, orina, heces o tejido de un mamífero tal como un caballo, gato, perro o persona. La muestra de ensayo puede ser no tratada, precipitada, fraccionada, separada, diluida, concentrada o purificada.
En una forma de realización, los métodos descritos en el presente texto comprenden poner en contacto uno o más polipéptidos descritos en el presente texto con una muestra de ensayo en condiciones que permiten que se formen complejos polipéptido/anticuerpo, es decir, inmunocomplejos. Esto es, los polipéptidos descritos en el presente texto se unen específicamente a anticuerpos específicos para antígenos ApI y/o Aph localizados en la muestra. En una forma de realización descrita en el presente texto uno o más polipéptidos descritos en el presente texto (por ejemplo, SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 20 o fragmentos de los mismos) se unen específicamente a anticuerpos que son específicos para antígenos Aph y no se unen específicamente a antígenos ApI. En otra forma de realización descrita en el presente texto, uno o más polipéptidos descritos en el presente texto (por ejemplo, SEC ID Nº: 2, 3, 10, 13, 14, 21 o fragmentos de los mismos) se unen específicamente a anticuerpos que son específicos para antígenos tanto Aph como ApI. En una forma de realización descrita en el presente texto, uno o más
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
secundario que está acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de señal. Los reactivos indicadores que comprenden compuestos generadores de señal (marcadores) asociados con un complejo polipéptido/anticuerpo pueden detectarse usando los métodos descritos anteriormente e incluyen agentes cromogénicos, catalizadores tales como compuestos fluorescentes conjugados con enzimas tales como fluoresceína y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos, acridinios, fenantridinio, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, así como cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Los ejemplos de conjugados enzimáticos incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, betagalactosidasa y similares. La selección de un marcador concreto no es crítica, pero habrá de ser capaz de producir una señal por sí mismo o en unión con una o más sustancias adicionales.
La formación del complejo es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo. Por tanto, los métodos descritos en el presente texto pueden utilizarse para diagnosticar la infección por ApI y/o Aph en un paciente.
Los métodos descritos en el presente texto también pueden indicar la cantidad de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo. Con muchos reactivos indicadores, tales como conjugados enzimáticos, la cantidad de anticuerpo presente es proporcional a la señal generada. Dependiendo del tipo de muestra de ensayo, puede diluirse con un reactivo tampón adecuado, concentrarse o ponerse en contacto con una fase sólida sin ninguna manipulación. Por ejemplo, normalmente se prefiere analizar muestras de suero o plasma que previamente han sido diluidas, o muestras concentradas tales como orina, con el fin de determinar la presencia y/o la cantidad de anticuerpo presente.
También se describe en el presente texto kits de ensayo (por ejemplo, artículos manufacturados) para detectar anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph o fragmentos de anticuerpos, polipéptidos ApI, y/o polipéptidos Aph en una muestra. Un kit comprende uno o más polipéptidos descritos en el presente texto y medios para determinar la unión del polipéptido a anticuerpos anti-Apl y/o anticuerpos anti-Aph o fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno en la muestra. Un kit o artículo manufacturado también puede comprender uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen al antígeno descritos en el presente texto y medios para determinar la unión de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos a polipéptidos ApI y/o polipéptidos Aph en la muestra. Un kit puede comprender un dispositivo que contiene uno o más polipéptidos o anticuerpos descritos en el presente texto e instrucciones para el uso del polipéptido o los polipéptidos o anticuerpos para, por ejemplo, la identificación de la infección por ApI y/o Aph en un mamífero. El kit puede comprender también material de envasado que comprende una etiqueta que indica que uno o más polipéptidos o anticuerpos del kit se pueden usar para la identificación de la infección por ApI y/o Aph. Se pueden incluir en tales kits de ensayo otros componentes tales como tampones, controles y similares, conocidos por los expertos en la materia. Los polipéptidos, anticuerpos, ensayos y kits descritos en el presente texto son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de casos individuales de infección por ApI y/o Aph en un paciente, así como en estudios epidemiológicos de los brotes de ApI y/o Aph.
Los polipéptidos y los ensayos descritos en el presente texto pueden combinarse con otros polipéptidos o ensayos para detectar la presencia de Anaplasma junto con otros organismos. Por ejemplo, los polipéptidos y los ensayos descritos en el presente texto pueden combinarse con reactivos que detectan el gusano del corazón (Dirofilaria immitis) y/o Borrelia burgdorferi y/o Ehrlichia canis.
Los polinucleótidos descritos en el presente texto pueden usarse para detectar la presencia de polinucleótidos de ApI y/o Aph en una muestra. Los polinucleótidos se pueden usar para detectar los polinucleótidos de ApI y/o Aph en una muestra mediante una reacción de hibridación simple y también se pueden usar, por ejemplo, en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) tales como una reacción de PCR en tiempo real. Los métodos y composiciones descritos en el presente texto se pueden usar también para detectar diferencialmente la presencia de Aph de otras Anaplasma sp., tales como ApI.
Los ensayos PCR están bien descritos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº. 4.683.195; patente de EE. UU. nº 4.683.202; patente de EE. UU. nº 4.965.188. Generalmente, los cebadores de polinucleótido se hibridan con cadenas desnaturalizadas de un ácido nucleico diana. Los productos de extensión del cebador se forman por polimerización de trifosfatos de desoxinucleósido por una polimerasa. La PCR implica entonces ciclos repetitivos de desnaturalización de ácidos nucleicos de plantilla, alineamiento de cebadores y extensión de los cebadores alineados por la acción de una polimerasa termoestable. El proceso da como resultado la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos diana de Anaplasma sp. en la muestra de ensayo, que permite la detección de polinucleótidos diana que existen en concentraciones muy bajas en una muestra.
Los ensayos de PCR en tiempo real se basan en la detección de una señal, por ejemplo, una señal informadora fluorescente. Esta señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en una reacción. La PCR en tiempo real es cualquier técnica de amplificación que hace posible monitorizar la evolución de una reacción de amplificación en marcha. Véase, cuantificación de ADN/ARN usando detección por PCR en tiempo real, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989). Registrando la cuantía de emisión de fluorescencia en cada ciclo, es posible controlar la reacción de PCR durante la fase exponencial, donde el primer aumento significativo en la cantidad de producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de plantilla diana. Cuanto mayor es el número de copias de partida del ácido nucleico diana, antes se observa un aumento
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
significativo de la fluorescencia.
Una forma de realización descrita en el presente texto proporciona un método para detectar y/o cuantificar los polinucleótidos de ApI y/o Aph en una muestra de ensayo. Los cebadores de sentido y los cebadores antisentido se pueden agregar a una muestra de ensayo en condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores se hibridan con los polinucleótidos de ApI y/o Aph de modo que se forma un producto de amplificación si los polinucleótidos ApI y/o Aph están presentes en la muestra de ensayo. Se detectan productos de amplificación y se determina la presencia y/o la cantidad de polinucleótidos ApI y/o Aph. Los productos de amplificación se pueden detectar con una sonda de polinucleótidos que se hibrida, en condiciones adecuadas para una reacción en cadena de la polimerasa, con una secuencia de polinucleótidos ApI y/o Aph. El producto de amplificación se puede cuantificar midiendo una señal de detección de la sonda y comparando dicha señal de detección con una segunda señal de detección de sonda a partir de un estándar de cuantificación. El estándar de cuantificación se puede extraer en paralelo con la muestra de ensayo.
Una forma de realización descrita en el presente texto proporciona un método para detectar diferencialmente los polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum de los de Anaplasma platys en una muestra. El método comprende:
- (a)
- poner en contacto con una muestra uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido que consiste en las SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18 o 20 bajo unas condiciones que permitan que se formen los complejos polipéptido/anticuerpo y detectar los complejos polipéptido/anticuerpo; y
- (b)
- poner en contacto con la muestra uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido que consiste en SEC ID Nº: 8 o 19 en condiciones que permiten que los complejos polipéptido/anticuerpo se formen y detectar los complejos polipéptido/anticuerpo.
Si los complejos polipéptido/anticuerpo se detectan en la etapa (a) y en la etapa (b), la muestra contiene entonces polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum y contiene polipéptidos de Anaplasma platys. Si los complejos polipéptido/anticuerpo se detectan en la etapa (a) y no se detectan en la etapa (b), entonces la muestra contiene polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum y no contiene polipéptidos de Anaplasma platys. Si los complejos polipéptido/anticuerpo no se detectan en la etapa (a) y se detectan en la etapa (b), entonces la muestra contiene polipéptidos de Anaplasma platys y no contiene polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum. Si los complejos polipéptido no se detectan en la etapa (a) y no se detectan en la etapa (b), entonces la muestra no contiene polipéptidos de Anaplasma platys y no contiene polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum.
Otra forma de realización descrita en el presente texto proporciona un método para detectar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de Anaplasma platys, un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum, o un polipéptido de Anaplasma platys y un polipéptido de Anaplasma phagocytophilum. El método comprende:
- (a)
- poner en contacto uno o más polipéptidos purificados que comprenden las SEC ID Nº: 1, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 18 o 20 con una muestra de ensayo, bajo unas condiciones que permitan que se formen complejos de polipéptido/anticuerpo y detectar los complejos polipéptido/anticuerpo; y
- (b)
- poner en contacto uno o más polipéptidos purificados que comprenden la SEC ID Nº: 8 o 19, en donde el polipéptido purificado con una muestra de ensayo, en condiciones que permiten que se formen complejos de polipéptido/anticuerpo y detectar los complejos polipéptido/anticuerpo.
Si los complejos polipéptido/anticuerpo se detectan en la etapa (a) y en la etapa (b), la muestra contiene entonces anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum y polipéptidos de Anaplasma platys (es decir, anticuerpos capaces de unirse específicamente a polipéptidos tanto de Anaplasma platys como de Anaplasma phagocytophilum). Si los complejos polipéptido/anticuerpo se detectan en la etapa (a) y no se detectan en la etapa (b), entonces la muestra contiene anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum y no contiene anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de Anaplasma platys. Si los complejos polipéptido/anticuerpo no se detectan en la etapa (a) y se detectan en la etapa (b), entonces la muestra contiene anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de Anaplasma platys y no contiene anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum. Si los complejos de polipéptidos no se detectan en la etapa (a) y no se detectan en la etapa (b), entonces la muestra no contiene anticuerpos específicos para los polipéptidos de Anaplasma platys y no contiene anticuerpos específicos para los polipéptidos de Anaplasma phagocytophilum.
Métodos de tratamiento, mejora o prevención de una enfermedad causada por Aph y/o ApI.
Los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos descritos en el presente texto se pueden usar para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad provocada por ApI y/o Aph. Por ejemplo, se puede administrar a un animal tal como un ser humano o un perro, un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal descrito en el presente texto o fragmentos de unión al antígeno del mismo. En una forma de realización descrita en el presente texto, se administra un anticuerpo
o fragmento de unión al antígeno del mismo a un animal en una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmentos de unión al antígeno del mismo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es
5
10
15
20
25
30
35
veces con tampón para lavado PetChek®, se añadieron a las placas 60 μL de 3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidina ("TMB") y se incubaron durante 10 minutos. Se añadieron 50 μL de solución de parada y se determinó el valor de A650. Las muestras de análisis fueron las siguientes:
- APL_13DPI:
- perro infectado experimentalmente por ApI 13 días después de la infección
- APL_78DPI:
- perro infectado experimentalmente por ApI 78 días después de la infección
- APH:
- conjunto de muestras de 7 perros de Minnesota infectados por Aph
- neg:
- conjunto de muestras de 7 perros sanos al azar
Los resultados se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 1. Tabla 1.
- Péptido
- SEC ID Nº: APL_13DPI APL_78DPI APH neg
- Aph rp44
- 10 1,13 0,49 2,62 0,13
- Aph p44-1
- 12 0,29 0,24 1,09 0,28
- Aph p44-2
- 13 1,40 1,57 3,42 0,22
- Aph p44-3
- 14 1,10 0,51 2,39 0,24
- Aph p44-4
- 15 0,22 0,16 3,08 0,18
- Aph p44-4-1
- 16 0,20 0,14 2,80 0,11
- Aph p44-4-2
- 17 0,19 0,14 2,38 0,11
- Aph p44-4-3
- 18 0,23 0,16 2,75 0,15
Los 8 péptidos ensayados mostraron reactividad positiva frente al conjunto de sueros de 7 perros de Minnesota infectados por Aph. Los rp44, p44-2 y p44-3 mostraron reactividad cruzada con los sueros de un perro infectado experimentalmente con ApI en 2 momentos de infección diferentes. Las reactividades de p44-1, p44-4, p44-4-1, p444-2 y p44-4-3 con los sueros del perro infectado experimentalmente con ApI estaban próximas a los niveles de fondo. Por tanto, los polipéptidos p44-1, p44-4, p44-4-1, p44-4-2 y p44-4-3 no presentan reactividad cruzada con los sueros de perros infectados con ApI.
Ejemplo 2: Detección específica de la especie de Aph o ApI en muestras de campo de zonas endémicas.
Se aplicaron como recubrimiento polipéptidos (Aph p44-4 y ApI p44-4 a 0,5 μg/mL; Aph rp44 a 0,25 μg/mL) sobre placas de Immulon® 4 en tampón de carbonato pH 9,6, durante la noche. Las placas se lavaron 2 x con tampón para lavado PetChek® y luego se bloquearon con TWEEN® 20 al 2% (polisorbato)/sacarosa al 2,5% en Tris 0,1 M a pH 7,6 durante 2 horas. Las placas se secaron con desecante durante la noche. Una muestra de ensayo de 25 μL se mezcló con 50 μL de conjugado de péptido:HRP (0,5 μg/mL para el conjugado p44-4-Aph (SEC ID Nº: 15): HRP, 1 μg/mL para el conjugado de p44-4-Apl (SEC ID Nº: 19): HRP, y 3 μg/mL para el conjugado Aph rp44) y se incubaron en la placa de microtítulo (el tiempo de incubación fue de 1 hora en el experimento mostrado en la Figura 2 y de 1 hora y 45 minutos en el experimento mostrado en la Figura 3). Las placas se lavaron 6 veces con tampón para lavado PetChek®. Se añadieron a las placas 60 μL de TMB y se incubó durante 10 minutos. Se añadieron 50 μL de solución de parada y se determinó el valor de A650. El valor de corte se determinó basándose en reactividades a 10 muestras negativas; corte = media + 2 x SD (desviaciones estándar).
La Figura 2 muestra los resultados usando muestras positivas para A. platys de perros que viven en zonas endémicas de A. platys (HP: Arizona, P: Bahamas). rp44 (SEC ID Nº: 10) proporcionó resultados positivos para 4 de las 5 muestras "HP", y resultados positivos para 7 de las 7 muestras "P". El Aph p44-4 (SEC ID Nº: 15) proporcionó resultados positivos para 0 de las 5 muestras "HP", y para 0 de las 7 muestras "P". ApI p44-4 (SEC ID Nº: 19) proporcionó resultados positivos para 5 de las 5 muestras "HP" y para 7 de las 7 muestras "P". Por tanto, Aph p44-4 no reacciona de forma cruzada con el suero de los perros infectados con ApI.
La Figura 3 muestra los resultados usando muestras positivas de A. phagocytophilum de perros que viven en un área endémica de Aph (Minnesota "ME"). rp44 (SEC ID Nº: 10) proporcionó resultados fuertemente positivos para 21 de las 22 muestras ME. Aph p44-4 (SEC ID Nº: 15) proporcionó resultados fuertemente positivos para 20 de las 22 muestras ME. ApI p44-4 (SEC ID Nº: 19) proporcionó resultados negativos para 18 de las 22 muestras y resultados muy débilmente positivos para 4 de las 22 muestras ME. Por tanto, se puede considerar que ApI p44-4 no reacciona
Claims (1)
-
imagen1 imagen2 imagen3
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10374308P | 2008-10-08 | 2008-10-08 | |
| US103743P | 2008-10-08 | ||
| PCT/US2009/059956 WO2010042691A1 (en) | 2008-10-08 | 2009-10-08 | Compositions and methods for detection of antibodies specific for anaplasma phagocytophilum (aph) and anaplasma platys (apl) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2657221T3 true ES2657221T3 (es) | 2018-03-02 |
Family
ID=42075996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES09819862.5T Active ES2657221T3 (es) | 2008-10-08 | 2009-10-08 | Composiciones y métodos para la detección de anticuerpos específicos para Anaplasma phagocitophilum (Aph) y Anaplasma platys (Apl) |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8303959B2 (es) |
| EP (1) | EP2335070B1 (es) |
| JP (3) | JP6110066B2 (es) |
| KR (1) | KR20110086027A (es) |
| CA (2) | CA2739796C (es) |
| ES (1) | ES2657221T3 (es) |
| MX (1) | MX2011003634A (es) |
| TW (1) | TWI586365B (es) |
| WO (1) | WO2010042691A1 (es) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8158370B2 (en) * | 2007-11-27 | 2012-04-17 | Idexx Laboratories, Inc. | Anaplasma phagocytophilum (Aph) antigens and antibodies specific for Anaplasma |
| JP6110066B2 (ja) * | 2008-10-08 | 2017-04-05 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｐｈ）およびアナプラズマ・プラチス（Ａｐｌ）に特異的な抗体を検出するための組成物および方法 |
| EP2877196B1 (en) | 2012-06-27 | 2020-03-25 | Virginia Commonwealth University | Ompa and asp14 in vaccine compositions and as diagnostic targets |
| WO2014056885A1 (en) | 2012-10-09 | 2014-04-17 | Universiteit Gent | Cooperia vaccine |
| US9194870B2 (en) | 2014-01-21 | 2015-11-24 | Abaxis, Inc. | Peptides, devices, and methods for the detection of Anaplasma antibodies |
| US10086058B2 (en) | 2014-02-03 | 2018-10-02 | Virginia Commonwealth University | AIPA, OMPA, and ASP14 in vaccine compositions and diagnostic targets for anaplasma phagocytophilum infection |
| KR102207455B1 (ko) * | 2019-04-26 | 2021-01-26 | 조선대학교산학협력단 | 아나플라즈마병의 진단용 마커로서 ｐ４４의 용도 |
| CN114703308B (zh) * | 2022-05-06 | 2023-05-26 | 山东康华生物医疗科技股份有限公司 | 用于检测犬片状边虫与巴贝斯虫的引物探针组合物、核酸检测试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5192679A (en) * | 1990-05-03 | 1993-03-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Growing ehrlichia species in a continuous cell line |
| US5401656A (en) * | 1990-05-03 | 1995-03-28 | United States Of America | Use of human immortalized endothelial cells to isolate and propagate Ehrlichia chaffeensis and Ehrlichia canis |
| WO1992018113A1 (en) * | 1991-04-18 | 1992-10-29 | The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Identification of a new ehrlichia species from a patient suffering from ehrlichiosis |
| US5726010A (en) * | 1991-07-31 | 1998-03-10 | Idexx Laboratories, Inc. | Reversible flow chromatographic binding assay |
| FR2723950B1 (fr) * | 1994-08-24 | 1996-10-25 | Bio Merieux | Fragments nucleotidiques capables de s'hybrider specifiquemennt a l'adnr ou arnr des rickettsia et leur utilisation comme sondes ou amorces. |
| CA2160423A1 (en) * | 1994-11-02 | 1996-05-03 | Hemant N. Joshi | Salts of nefazodone having improved dissolution rates |
| US6284238B1 (en) * | 1995-06-06 | 2001-09-04 | Aquila Biopharmaceuticals, Inc. | Cell lines infected with granulocytic ehrlichia, vaccines, diagnostics and methods |
| US5976860A (en) * | 1995-06-06 | 1999-11-02 | Aquila Biopharmaceuticals, Inc. | Cell lines infected with granulocytic ehrlichia, vaccines, diagnostics and methods |
| US5955359A (en) * | 1995-08-25 | 1999-09-21 | University Of Maryland At Baltimore | Method of growing granulocytic ehrlichiae of the Ehrlichia phagocytophila genogroup in promyelocytic leukemia cell culture, and preparing antigens and vaccines of said granulocytic ehrlichiae |
| US5928879A (en) * | 1995-08-25 | 1999-07-27 | The Regents Of The University Of Minnesota | Method of diagnosing human granulocytic Ehrlichiosis |
| US5869335A (en) * | 1995-08-25 | 1999-02-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Method of growing rickettsiae in Ixodes scapularis tick cell culture and preparing antigens and vaccines of rickettsiae |
| US6015691A (en) * | 1996-05-31 | 2000-01-18 | Research Development Foundation | Immunodominant 120 kDa surface-exposed adhesion protein genes of Ehrlichia chaffeensis |
| US6653128B2 (en) * | 1996-10-17 | 2003-11-25 | University Of Florida | Nucleic acid vaccines against rickettsial diseases and methods of use |
| US6025338A (en) * | 1996-10-17 | 2000-02-15 | University Of Florida | Nucleic acid vaccines against rickettsial diseases and methods of use |
| US6231869B1 (en) * | 1997-03-21 | 2001-05-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of ehrlichia infection |
| US20020068343A1 (en) | 1997-03-21 | 2002-06-06 | Reed Steven G. | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of ehrlichia infection |
| US6277381B1 (en) * | 1997-03-21 | 2001-08-21 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of Ehrlichia infection |
| US6207169B1 (en) * | 1997-03-21 | 2001-03-27 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of Ehrlichia infection |
| US20020086984A1 (en) * | 1997-03-21 | 2002-07-04 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the diagnosis and treatment of Ehrlichia infection |
| EP0915980B1 (en) | 1997-04-25 | 2009-08-05 | Antigenics Inc. | Characterization of granulocytic ehrlichia and methods of use |
| CA2258266A1 (en) * | 1997-04-25 | 1998-11-05 | Aquila Biopharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids, proteins, and methods of use of granulocytic ehrlichia |
| EP1026949B1 (en) | 1997-09-19 | 2010-09-15 | The Ohio State University Research Foundation | Outer membrane proteins of ehrlichia chaffeensis |
| CA2326717A1 (en) | 1998-04-09 | 1999-10-21 | The Ohio State Research Foundation | Nucleic acids encoding outer membrane protein of human granulocytic ehrlichiosis agent |
| US6458942B1 (en) * | 1998-11-30 | 2002-10-01 | Research Development Foundation | 28-kDa immunoreactive protein gene of Ehrlichia canis and uses thereof |
| US20020115840A1 (en) * | 1998-11-30 | 2002-08-22 | Walker David H. | Homologous 28-kilodaltion immunodominant protein genes of Ehrlichia canis and uses thereof |
| US6392023B1 (en) * | 1999-03-03 | 2002-05-21 | Research Development Foundation | Homologous 28-kilodalton immunodominant protein genes of Ehrlicha canis and uses thereof |
| US7807810B2 (en) | 1999-04-08 | 2010-10-05 | The Ohio State University Research Foundation | Nucleic acids encoding the major outer membrane protein of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis and peptides encoded thereby |
| US6355777B1 (en) * | 2000-04-28 | 2002-03-12 | Research Development Foundation | P43 antigen for the immunodiagnosis of canine ehrlichiosis and uses thereof |
| CA2407946A1 (en) * | 2000-05-01 | 2001-11-08 | Research Development Foundation | Ehrlichia chaffeensis 28 kda outer membrane protein multigene family |
| US20030194756A1 (en) | 2002-04-12 | 2003-10-16 | O'connor Thomas Patrick | Peptides for detection of antibody to Ehrlichia equi |
| WO2003087757A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Particle-bound human immunodeficiency virus envelope clycoproteins and related compositions and methods |
| US7304139B2 (en) * | 2003-10-28 | 2007-12-04 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Polynucleotides and polypeptides of Anaplasma phagocytophilum and methods of using the same |
| US7507789B2 (en) * | 2007-04-09 | 2009-03-24 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of Anaplasma platys |
| US8158370B2 (en) | 2007-11-27 | 2012-04-17 | Idexx Laboratories, Inc. | Anaplasma phagocytophilum (Aph) antigens and antibodies specific for Anaplasma |
| JP6110066B2 (ja) * | 2008-10-08 | 2017-04-05 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｐｈ）およびアナプラズマ・プラチス（Ａｐｌ）に特異的な抗体を検出するための組成物および方法 |
-
2009
- 2009-10-08 JP JP2011531167A patent/JP6110066B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-08 KR KR20117010484A patent/KR20110086027A/ko not_active Ceased
- 2009-10-08 WO PCT/US2009/059956 patent/WO2010042691A1/en not_active Ceased
- 2009-10-08 CA CA2739796A patent/CA2739796C/en active Active
- 2009-10-08 US US12/575,531 patent/US8303959B2/en active Active
- 2009-10-08 EP EP09819862.5A patent/EP2335070B1/en active Active
- 2009-10-08 ES ES09819862.5T patent/ES2657221T3/es active Active
- 2009-10-08 MX MX2011003634A patent/MX2011003634A/es active IP Right Grant
- 2009-10-08 TW TW098134171A patent/TWI586365B/zh active
- 2009-10-08 CA CA3018728A patent/CA3018728A1/en active Pending
-
2012
- 2012-11-05 US US13/668,597 patent/US8580272B2/en active Active
-
2013
- 2013-11-01 US US14/069,489 patent/US9120857B2/en active Active
-
2015
- 2015-07-10 JP JP2015138765A patent/JP6333220B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-07-30 US US14/813,200 patent/US20150323531A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-07-04 JP JP2017130835A patent/JP6688767B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016020343A (ja) | 2016-02-04 |
| US20150323531A1 (en) | 2015-11-12 |
| KR20110086027A (ko) | 2011-07-27 |
| US8580272B2 (en) | 2013-11-12 |
| EP2335070A1 (en) | 2011-06-22 |
| WO2010042691A8 (en) | 2010-08-19 |
| EP2335070B1 (en) | 2017-12-27 |
| MX2011003634A (es) | 2011-05-02 |
| CA2739796A1 (en) | 2010-04-15 |
| JP2018007664A (ja) | 2018-01-18 |
| JP6333220B2 (ja) | 2018-05-30 |
| CA2739796C (en) | 2018-11-06 |
| EP2335070A4 (en) | 2012-07-25 |
| JP6688767B2 (ja) | 2020-04-28 |
| US20140050757A1 (en) | 2014-02-20 |
| TW201018486A (en) | 2010-05-16 |
| TWI586365B (zh) | 2017-06-11 |
| BRPI0920387A2 (pt) | 2014-01-28 |
| JP6110066B2 (ja) | 2017-04-05 |
| US9120857B2 (en) | 2015-09-01 |
| CA3018728A1 (en) | 2010-04-15 |
| US20100086563A1 (en) | 2010-04-08 |
| WO2010042691A1 (en) | 2010-04-15 |
| US20130064842A1 (en) | 2013-03-14 |
| US8303959B2 (en) | 2012-11-06 |
| JP2012504964A (ja) | 2012-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2657221T3 (es) | Composiciones y métodos para la detección de anticuerpos específicos para Anaplasma phagocitophilum (Aph) y Anaplasma platys (Apl) | |
| JP5606904B2 (ja) | アナプラズマ・プラチス（Ａｎａｐｌａｓｍａｐｌａｔｙｓ）の検出 | |
| US20120207779A1 (en) | Anaplasma phagocytophilum (Aph) Antigens and Antibodies Specific for Anaplasma | |
| US8409817B2 (en) | Methods and compositions for detection of Ehrlichia chaffeensis (VLPT) | |
| KR101289812B1 (ko) | 에르리키아 에인지에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드 | |
| US7892568B2 (en) | Methods and compositions for detection of Ehrlichia chaffeensis (p120) |