ES2656587B1 - Método para predecir la respuesta clínica a un tratamiento con agentes antiinflamatorios - Google Patents

Abstract

Método para predecir la respuesta clínica a un tratamiento con agentes antiinflamatorios.#La presente invención se refiere al uso de variantes alélicas de TLR10 humano, incluyendo a la variante alélica de TLR10 humano I473T, como biomarcador para predecir la gravedad o el pronóstico en enfermedades inflamatorias, incluyendo la artritis reumatoide y/o para predecir la respuesta a un tratamiento con agentes antiinflamatorios, tales coma agentes anti-TNF{al}.

Description

MÉTODO PARA PREDECIR LA RESPUESTA CLlNICA A UN TRATAMIENTO CON AGENTES ANTIINFLAMATORIOS

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención puede incluirse en el campo de la medicina personalizada . Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de variantes alélicas de TLR10 humano, incluyendo a la variante alélica de TLR1 0 humano 1473T, como biomarcador para predecir la gravedad o el pronóstico en enfermedades inflamatorias, incluyendo la artritis reumatoide y/o para predecir la respuesta a un tratamiento con agentes antiinflamatorios, tales como agentes anti-TNFa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La artritis reumaloide (AR) es una enfermedad autoinmunitaria sistémica principalmente caracterizada por inflamación crónica del revestimiento sinovial y activación de Th1 , lo que conduce a la destrucción progresiva de las articulaciones. Se ha sugerido que virus y bacterias pueden contribuir a iniciar o agravar la AR al unirse a receptores de tipo Tol! (TLR) [Iwahashi M, et al. , Arthritis Rheum 2004, 50(5):1457-1467.; Pierer M, et al., J Immunol 2004,172(2):1256-1265J.

Los TLR pertenecen a una familia de proteínas transmembrana que constituyen uno de los mecanismos de defensa primaria en enfermedades infecciosas y algunas no infecciosas en

mamíferos [Gdor 1, et al., Cham Phys 2011, 13(9):3782-3787J. En particular, los TLR son

glicoproteínas transmembrana de tipo 1 con repeticiones ricas en leucina (LRR) extracelulares y un dominio de homologia con el receptor Tol1/de IL-1 intracelular (TIR) [Ulevitch RJ, Nat Rev Immunol 2004, 4(7):512-520). La activación inapropiada de rutas mediadas por TLR se ha implicado en la pérdida de autotolerancia que conduce a autoinmunidad e inflamación crónica (Wagner H, Adv Immuno/2006 , 91 :159-173; Deighton

K, et al.. Appetite 2014, 81:52-591. Además, se ha sugerido que los TLR eslán implicados en respueslas a patógenos en AR [Cromartie WJ, et al., J Exp Med 1977, 146(6):1585-1602].

La señalización por los TLR implica interacción con adaptadores que contienen dominio TIR,

incluyendo MyD88, TRIF, TRAM, TIRAP Y SARM1 [O'Neill LA, Bowie AG; Nat Rev Immunol

2007, 7(5):353-364) que promueve la activación del factor nuclear potenciador de cadenas ligeras kappa de células B activadas (NFKB) entre otras funciones. La activación

dependiente de TLR de NFKB conduce a la producción de quimiocinas, citocinas y

moléculas de adhesión celular proinflamatorias [O'Neill LA, Bowie AG; Nal Rev Immunol 2007,7(5):353-364.; Drexler SK, el al. , Inl J Biochem Ce" Biol2010, 42(4):506-518]. Cada

vez existen más pruebas de que NFKB es un factor de transcripción importante, si no el

principal, que conlrola la inflamación [Abu-Soud HM, el al., Biochemislry 1998, 37(11):3777

3786] y descifrar los mecanismos que regulan la actividad de NFKB se considera de gran importancia para entender la respuesta a estímulos inflamatorios.

TLR10 sigue siendo el único miembro huérfano entre los TLR humanos porque sus ligandos siguen siendo desconocidos y existen datos discordantes acerca de su funciÓn [005tin9 M,

el al., Proc Nall Acad Sci U S A 2014, 111(42):E4478-4484.; Hasan U, el al., J Immunol 2005, 174(5):2942-2950]. La expresión de TLR10 se ha descrilo principalmente en células

B, células dendríticas, eosinófilos, neutrófilos y células no inmunitarias tales como

troloblaslos [Hasan U el al., J Immunol 2005, 174(5):2942-2950.; Hornung V el al., J Immunol2002, 168(9):4531-4537.; Nagase H, el al. , J Immunol 2003, 171(8):3977-3982.; Mulla MJ, el al., Am J Reprod /mmuno/2013, 69(5):449-453]. En mamileros, TLR10, TLR1 ,

y TLR6 comparten un locus común en el cromosoma 4p14 y son estructuralmente similares entre si [Hasan U, el al., J Immunol 2005, 174(5):2942-2950]. Pese a interaccionar con

MyD88 [Hasan U, el al., J Immunol2005, 174(5):2942-2950], TLR10 difiere de olros TLR por

la falta de una ruta de señalización posterior clásica [Guan Y, el al., J Immunol 2010,

184(9):5094-5103]. La filogenia apoya la idea de que TLR10 surgió antes de la duplicación génica que generó TLR1 y TLR6 [Abhishek A, el al., J Cfin Rheumalo/2010, 16(1):15-18.; Zhou H, el al., J Mol Evol2007, 65(2):119-123]. TLR1 y TLR6 pueden formar un complejo proteico con TLR2 y TLR10 [Hasan U, el al., J Immuno/2005, 174(5):2942-2950.: Mulla MJ el al., Am J Reprod Immunol2013, 69(5):449-453], aunque la contribución individual de cada

proterna a la función del complejo se desconoce en gran medida.

Hoy en día, TLR10 es el único miembro de la familia de TLR sin una función biológica bien definida. Diversos estudios describen que TLR10 actúa como receptor proinflamatorio activando la señalización de NFKB [Hasan U, el al., J Immunol 2005, 174(5):2942-2950;

Regan T, el al., J Immunol 2013, 191(12):6084-6092]. Otro estudio mostró que TLR10 no

activa la señalización inducida por TLR típica, incluyendo activación transcripcional mediada

por NFKB o inler/erón-bela (IFNP) [Guan Y, el al., J Immunol 2010, 184(9):5094-5103].

Recientemente, se ha mostrado que TLR10 es un modulador con efectos principalmente inhibidores [Stappers MH, el al., J Infect Dis 2015). En línea con esto, bloquear TLR10 con

anticuerpos antagonistas potencia la producción de citodna proinflamatoria [Oosting M. el

al" Proc Natl Acad Sci U S A 2014, 111(42):E4478-4484J. Además, se han proporcionado

pruebas de que TLR10 induce apoptosis a través de la activación de caspasa-3 [Kuuliala K.

el al., Ann Rheum Dis 2006, 65(9):1241-1243J.

Variantes genéticas en miembros de la familia de TLR se han asociado principalmente con propensión a enfermedad en pacientes con AR con nivel de significación variable e incluso

resultados discordantes [Kuuliala K, el al., Ann Rheum Dis 2006, 65(9):1241-1243.; Radstake TR, el al., Arthrilis Rheum 2004, 50(3):999-1001 .; Etem EO, el al., Rheumalollnl 2011 , 31(10):1369-1374.; Coenen MJ, el al., PLoS One 2010, 5(12):e14326; Zheng B, el al., Rheumalollnl 2010,30(9):1249-1252].

Un estudio previo investigó la asociación entre variantes de TLR10 y propensión a AR pero no se encontró significación estadística [Etem EO, et al., Rheumatollnt 201 1,31(10):13691374]. Aunque variantes de un solo nucleótido del gen de TLR10 se han asociado con otras enfermedades autoinmunitarias (Requena T, el al. , Immunogenetics 2013, 65(5):345·355],

tumores [Kutikhin AG, Hum Immuno/2011, 72(11 ):1095-111 6J, enfermedades infecciosas e

inflamatorias tales como tuberculosis extrapulmonar y asma [Ma X, el al., PLoS One 2007,

2(12):e1318; Lazarus R, el al., Am J Respir Cril Care Med 2004, 170(6):594-600J, la

actividad funcional de esta proteína y la significaci6n clinica de las variantes génicas son

aún controvertidas [Hasan U, el al., J Immunol2005, 174(5):2942-2950.; Stappers MH, el al., J Infeel Dis 2015J.

La variante alélica 1473T solo se ha descrito en un trabajo previo asociado con un riesgo de meningioma disminuido (Rajaraman P, et al., Cancer Epidemial Biomarkers Prev 2010,

19(5):1356-1361J.

Pese a haberse realizado avances significativos en los últimos años en el descubrimiento de marcadores pronósticos y/o predictivos relacionados con AR y enfermedades inflamatorias, existe una necesidad continuada de métodos mejorados para evaluar la gravedad y el pronóstico de la enfermedad, para predecir la evoluci6n de la enfermedad y el riesgo de recurrencia o recaída, para permitir la clasificaci6n de la poblaci6n de pacientes según el pronóstico y seleccionar el tratamiento más apropiado en consecuencia. También se desea identificar regiones polim6rficas dentro de un gen, tal como TLR10 humano, que se asocian con la respuesta a uno o más fármacos usados en el tratamiento de AR y otras

enfermedades inflamatorias, tales como fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs en inglés) o terapias biológicas, incluyendo inhibidores de TNFo:.

RESUMEN DE LA INVENCiÓN

NFKB es un factor de transcripción implicado en muchos trastornos inflamatorios crónicos, incluyendo AR. Por primera vez, los autores de la invención han descrito que TLR10 puede inhibir la señalización de NFKB en células hematopoyéticas. Estudios funcionales in vitro mostraron que TLR10 reducía la activación de la ruta inflamatoria de NFKB en células hematopoyéticas, mientras que la variante 1473T no tenia esta capacidad inhibidora. Los inventores observaron que, tras la eslimulaci6n de la ruta de NFKB con TNFa tras la

exposición a infliximab (un inhibidor de TNFa) las células que expresan la variante 1473T mostraron una actividad de NFKB más alta en comparación con células que portan TLR10 de tipo natural.

Es conocido que los inhibidores de TNFa. ayudan a controlar la evolución de la AR Sin

embargo, no todos los pacientes responden de manera adecuada al tratamiento anti-TNFa. inicial [Alten R, el al., Int J Rheum Dis 2014, 17(1):5-18]. Los inventores analizaron la asociación de la variante contrasentido de TLR10 humano, 1473T, que se sitúa en el dominio

LRR18, con AR observándose que la variante 1473T no está asociada con propensión a AR. Sin embargo, se encontró que dicha variante correlaciona significativamente con enfermedad erosiva en pacientes seropositivos para anticuerpos frente a proteínas citrulínadas (ACPA) (p=O,017 en la cohorle total y p=O,0049 en mujeres) y con una respuesta inferior al tratamiento con infliximab medida mediante el índice DAS28 (p=O,012) y mediante los criterios de la EULAR (p=O,049), tal como se muestra en la figura 28.

Los datos muestran que una variante genética de TLR10 selecciona un grupo de pacientes con una enfermedad más grave y resistente. Asimismo, dicha variante genética de TLR10 puede ser un buen marcador candidato de respuesta a inHiximab u otros tratamientos anti-TNFa. en pacientes con enfermedad inflamatoria y en particular con AR.

En un primer aspecto, la presente invención hace referencia a un método in vitro para predecir la respuesta cHnica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria a un agente anti-TNFa., en el que dicho método comprende:

a)

determinar, en una muestra biológica aislada de dicho sujeto. la presencia de uno o más polimorfismos de TLR10 que den lugar a una variante de TLR10 que ha perdido la capacidad de inhibir a NFKB.

s

En una realización preferida, la presente invención hace referencia a un método in vitro para predecir la respuesta clínica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria a un agente anti-TNFa, en el que dicho método comprende:

10

a) determinar, en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, el genotipo del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) r511466657.

lS

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para identificar un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria con un mayor riesgo de no responder al tratamiento con un agente anti-TNFa., en el que dicho método comprende la etapa a) según el primer aspecto.

20

En un aspecto relacionado, la invención hace referencia a un método in vitro para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, en el que dicho método comprende la etapa a) definida más arriba; y además comprende:

25

b) seleccionar un agente anti-TNFa. cuando el alelo (A) está presente en al menos uno de los alelos en el locus del SNP rs11466657, preferiblemente cuando el alelo (A) está presente en ambos alelos. En un aspecto adicional, la invención hace referencia a un método in vitro para determinar la gravedad y/o el pronóstico de la enfermedad en un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, comprendiendo dicho método la etapa a) definida anteriormente.

30

Asimismo, hace referencia a un método in vitro para obtener datos útites para determinar la respuesta clínica de un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, a un agente anti-TNFa., la gravedad y/o el pronóstico de dicha enfermedad donde dicho método comprende la etapa a) definida anteriormente.

Asimismo, la invención proporciona un método para tratar un enfermedad inflamatoria, en el que dicho método comprende anteriormente: y además comprende:

sujeto que tiene una la etapa a) definida

5

b) administrar a dicho sujeto un agente anti-TNFa cuando el alelo (A) está presente en al menos uno de los alelos en el locus del SNP r511466657, preferiblemente cuando el alelo (A) está presente en ambos alelos.

10

Además, la presente invención hace referencia a un agente anti·TNFa para su uso en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, en el que dicho sujeto presenta el alelo (A) en al menos uno de los alelos en ellocus del SNP rs11466657, preferiblemente en el que dicho sujeto es homocigoto para el alelo (A).

lS 20

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un kit para determinar en una muestra biológica aislada de un sujeto el genotipo de uno o más polimomsmos de TLR10 que den lugar a una variante de TLR10 que ha perdido la capacidad de inhibir a NFKB, donde dicho kit comprende: -un reactivo para determinar el genotipo de dichos polimorfismos; -opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo en la determinación del genotipo de dichos polimorfismos en una muestra biológica aislada.

25

La invención se refiere también al uso de un kit, tal y como se ha descrito en el aspecto anterior, para predecir la respuesta cHnica de un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, para identificar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria con riesgo de no responder a un tratamiento con un agente anti-TNFa, para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, o para determinar la gravedad y/o el pronóstico de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, de acuerdo con los métodos de la invención.

30

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

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Figura 1. Variantes del gen de TLR10. (A) Representación esquemática de la proterna TLR10 que ilustra la posición de las variantes contrasentido (KmissenseB en inglés) identificadas mediante secuenciación de nueva generación (NGS). LRR, repeticiones ricas

en leucina; TM, dominio transmembrana; TIR, dominio de receptor Toll-de inlerleucina. (8 ) Distribución de genotipo de la variante 1473T en la cohorte independiente de 1493 controles sanos (He) y 1201 pacientes con artritis reumaloide (RA). (e) Frecuencias de genotipo de TLR10 en poblaciones HapMap (HapMap es un mapa de haplotipos en el genoma humano; International HapMap consortium el al. (2010), Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations, Nature, 467, 52-8).

Figura 2. Asociación de la variante 1473T con la gravedad de la enfennedad en dos cohortes de (A) 453 Y (B) 1201 pacientes con AR. Se estimó el valor de beta (coeficiente de regresión), usado para evaluar el efecto de la variante 1473T (riesgo genético), para varios hallazgos clínicos. Un coeficiente de regresión positivo significa que la variante aumenta el riesgo. Las líneas discontinuas indican los valores de punto de corte. Los parámetros clínicos se categorizaron como variables binarias. Eccp/años, asociación con erosiones en pacientes positivos para ACPA incluyendo los años de evolución de la enfermedad; Eccp/años en mujeres, asociación con erosiones en pacientes femeninos positivos para ACPA incluyendo los años de evolución de la enfermedad; IFX-EULAR, asociación con la respuesta a infiiximab (criterios de respuesta de la EULAR: moderadalbuena frente a ninguna); IFX-DAS28, asociación con cambio en DAS28 en pacientes tratados con infliximab.

Figura 3. Regulación de la actividad transcripcional de NFKB por la variante 1473T. A)

estructura 3D de TLR10 usando el visor Jmol que muestra la ubicación del residuo 1473. NAG, 2-(acetilamino}-2-desoxi-beta-O-glucopiranosa. (B) y (e) Se cotransfectaron células K562 y U937 (respectivamente) con TLR10 de tipo natural (wild type o wt) o su variante mutada (mut) y un vector indicador que contiene secuencias que responden a NFKB. Se estimularon las células con TNFa 10 ng/ml durante 24 h Y después se prepararon y se analizaron los extractos celulares para determinar la actividad luciferasa. Asimismo, se trataron con TNFn células (O) K562 Y (El U937 translectadas con las variantes de TLR10 indicadas en presencia o en ausencia de infliximab y se analizó la actividad luciferasa. Los histogramas muestran la media ± DE de tres experimentos independientes. ·p<O,05.

Figura 4. Regulación de los niveles de genes diana de NFKB por la variante 1473T. Se translectaron células U937 (A, B, e) y K562 (O, E, F) con TLR10 (de tipo natural o variante mutada) y entonces se trataron o no con TNFa 20 ng/ml en presencia o en ausencia de infiiximab (IFX) durante 24 h. Se determinó la expresión de genes diana de NFKB, CCL2 (A,

D, F) TRAIL (B, El Y TNFa (C) mediante RT-PCR cuantitativa. Se usó p-actina para

normalización. e, células transfectadas con vector vacio como control adicional. Los

histogramas muestran la media ± DE de tres experimentos independientes. ·p<O,05.

s

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Definiciones

El término ·sujeto· tal como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto

mamífero. Preferiblemente, se selecciona de un humano, animal de compañía, ganado no

10

doméstico o animal de zoo. Por ejemplo, el sujeto puede seleccionarse de un humano,

perro, gato, vaca, cerdo, oveja, caballo, oso, etc. En una realización preferida, dicho sujeto

mamífero es un sujeto humano.

El término ·sujeto que tiene una enfermedad~ tal como se usa en el presente documento se

15

refiere a aquellos sujetos a los que se les ha diagnosticado dicha enfermedad. Por ejemplo,

un ~diagnóstico confirmado de artritis reumatoide" o "artritis reumatoide definitiva" puede

basarse en la presencia confinnada de sinovitis en al menos una articulación, ausencia de

un diagnóstico alternativo que explique mejor la sinovitis, y el logro de una puntuación total

de 6 o mayor (de un máximo posible de 10) a partir de las puntuaciones individuales en

20

cuatro dominios que incluyen: numero y emplazamiento de articulaciones afectadas (rango

0-5), alteraciones serológicas (rango 0-3), respuesta de fase aguda elevada (rango 0-1) Y

duración de los síntomas ( dos niveles, rango 0-1). El significado de estos parámetros es tal

y como se define en los criterios de clasificación EULAR (Ann Rheum Dis 2010; 69: 1580

1588).

2S

El término ·sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad~ tal como se usa en el

presente documento se refiere a un sujeto que presenta uno o más signos o s!ntomas

indicativos de dicha enfermedad. Un sujeto que se sospecha que tiene una enfermedad

también puede tener uno o más factores de riesgo (es decir, un sujeto que se sospecha que

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va a desarrollar o que presenta riesgo de desarrollar una enfermedad). Además abarca a un

individuo que ha recibido un diagnóstico preliminar pero para el cual no se ha realizado una

prueba de confirmación. Además, incluye aquellos individuos en remisión.

El término -examen-tal como se usa en el presente documento se refiere a identificar,

3S

determinar o distinguir a aquellos sujetos o individuos que presentan las características o el

fenotipo definidos. Puede usarse una prueba de uexamen~ cuando se sospecha la presencia de dichas características o fenotipo.

El término Mtratamiento· abarca tanto un tratamiento profiláctico como terapéutico. El término Mtratamiento terapéutico· o Mterap¡a~ tal como se usa en el presente documento se refiere a llevar a un cuerpo de un estado patológico o de enfermedad de vuelta a su estado normal, sano. El término "tratamiento profiláctico· tal como se usa en el presente documento se refiere a prevenir un estado patológico.

El término "respuesta a un tratamiento· tal como se usa en el presente documento se refiere al grado en el que un tratamiento logra los resultados deseados o previstos, por ejemplo la capacidad de una terapia o un fármaco para conseguir el efecto clínico deseado.

El término "enfermedad inflamatoria" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier enfermedad en la que hay una respuesta inflamatoria excesiva o alterada que conduce a síntomas inflamatorios. Dichas enfermedades inflamatorias incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addison, acné vulgaris, alopecia areata, amiloidosis, ulceraciones, estomatitis aftosa, arteriosclerosis, artritis, osteoartritis, artritis reumatoide, artritis idiopática juvenil, artritis psoriásica, espondiloartropatia, espondilitis anquilosante, asma bronquial, enfermedad de Behcet. enfermedad de Boeck, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, coroiditis, colitis ulcerosa, enfermedad de celiaca, crioglobulinemia, degeneración macular, dermatitis, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, diabetes dependiente de insulina, diabetes juvenil, enfermedad desmielinizante inflamatoria, contractura de Dupuytren, encefalomielilis, encefalomielitis alérgica, endoftalmitis, enteritis alérgica, síndrome de enteropatía auloinmune, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, fibrosis · quistica, gingivitis, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, síndrome de Graves, enfermedad de Hashimoto, hepatitis crónica, histiocitosis, ileilis regional, iritis, lupus eritematoso sistémico, lupus eritematoso cutáneo, lupus eritomatoso diseminado, linfogranuloma, mononucleosis infecciosa, miastenia gravis, mielitis transversa, mixedema idiopático primario, nefrosis, obesidad, oftalmia simpática, granulomatosa orquitis, pancreatitis, paniculitis, pénfigo vulgar, la periodontitis, la poliarteritis nodosa, poliartritis crónica, polimiositis, polirradiculitis aguda, psoriasis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la púrpura, pioderma gangrenoso, síndrome de Reiler, la retinopatía diabética, la rosácea, la sarcoidosis, esclerosis atáxica, esclerosis sistémica progresiva, escleritis, esclerodermia, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, uveitis, vitíligo, enfermedad de Whipple, enfermedades asociadas al SIDA, inrnunodeficiencia combinada severa y al virus de Epstein Barr: tales como el slndrome de Sjogren, la tuberculosis osteoarticular y enfennedades parasitarias: como la leishmaniasis.

El término "enfermedad reumática inflamatoria-tal como se usa en el presente documento se refiere a una enfermedad del aparato locomotor y/o de los tejidos conjuntivos en los que los mecanismos inflamatorios desempeñan un papel importante. Una enfermedad reumática puede afectar a articulaciones, huesos, cartílago, tendones, ligamentos y mUsculos.

Una "muestra-en el contexto de la presente invención es una muestra biológica que contiene cualquier tipo de célula corporal y puede incluir, como ejemplos ilustrativos y no limitativos, fluidos corporales y/o extractos de tejido tales como homogeneizados o tejido solubilizado obtenidos de un sujeto. Los extractos de tejido se obtienen de manera rutinaria de una biopsia de tejido. Una muestra biológica útil en la presente invención incluye sangre, orina, saliva, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, lavado bronquial, liquido ascítico, aspirado de médula ósea, derrame pleural, así como cualquier tejido, liquido o cualquier otro constituyente corporal que pueda contener células. En una realización preferida, la muestra que va a someterse a prueba es saliva o sangre. En una realización más preferida, la muestra es una muestra de sangre.

El término ~alelo· tiene el significado que se conoce comúnmente en la técnica, es decir, una forma alternativa de un gen (un miembro de un par) que se sitúa en una posición específica en un cromosoma específico que, cuando se traduce da como resultado productos génicos funcionales o disfuncionales (incluyendo no existentes).

El término ·polimorfismo· o ·variante alélica· se refiere a una variación de secuencia común de un gen. Pueden encontrarse variantes alélicas en los exones, intrones, regiones reguladoras sin traducir del gen, o en las secuencias que controlan la expresión del gen. La secuenciación génica completa permite a menudo identificar numerosas variantes alélicas para un gen concreto. La significación de las variantes alélicas a menudo no está clara hasta realizarse un estudio adicional del genotipo y el fenotipo correspondiente en una población suficientemente grande.

El término 8 polimorfismo de un solo nucleótido~ o ~SNPM se refiere a un tipo de polimoñismo de ADN que implica la variación de un único par de bases. Existen millones de SNP en el genoma humano. Comúnmente, estas variaciones se encuentran en secuencias codificantes de genes, regiones no codificantes de genes o en regiones intergénicas entre genes. La presencia de un SNP dentro de un gen o en una región reguladora cerca de un gen, pueden desempeñar un papel más directo en la enfermedad afectando a la función del gen.

El término usonda-tal como se usa en el presente documento se refiere a ácidos nucleicos sintéticos o producidos biológicamente, de entre 10 y 285 pares de bases de longitud que contienen secuencias de nucle6tidos específicas que permiten hibridación específica y preferente en condiciones predeterminadas para seleccionar como diana secuencias de ácido nucleico, y contienen opcionalmente un resto para detectar o para potenciar el rendimiento del ensayo. Generalmente es necesario un mínimo de diez nucleótidos con el fin de obtener de manera estadística especificidad y formar productos de hibridación estables, y un máximo de 285 nucleótidos generalmente representa un límite superior para la longitud en la que los parámetros de reacción pueden ajustarse fácilmente para determinar secuencias apareadas erróneamente e hibridación preferente. Las sondas pueden contener opcionalmente determinados constituyentes que contribuyen a su funcionamiento adecuado u óptimo en determinadas condiciones de ensayo. Por ejemplo, pueden modificarse las sondas para mejorar su resistencia a la degradación con nucleasa (por ejemplo, mediante ocupación de extremos), para portar ligandos de detección (por ejemplo, fluoresceína) o para facilitar su captura sobre un soporte sólido (por ejemplo, "colasR de poli-desoxiadenosina).

El término Mcebadores· tal como se usa en el presente documento se refiere a oligonucleótidos que pueden usarse por ejemplo en un método de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"), para amplificar una secuencia de nucleótidos. Los cebadores se designan basándose en la secuencia de polinucleótidos de una secuencia diana particular. El diseño y la validación de cebadores y sondas se conocen bien en la técnica. Para métodos de PCR cuantitativos en tiempo real. véase por ejemplo Rodriguez A el al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275:31-56).

El término "especffico· tal como se usa en el presente documento en relación con una secuencia de nucle6tidos significa que una secuencia de nucleótidos se hibridará con/amplificará una secuencia diana predeterminada y no se hibridará con/amplificará sustancialmente una secuencia no diana en las condiciones de ensayo, generalmente se usan condiciones rigurosas.

El término MhibridaciónR tal como se usa en el presente documento se refiere a un proceso mediante el cual, en condiciones de reacción predeterminadas, se permite que se junten dos cadenas de ácido nucleico parcial o completamente complementarias de un modo antiparalelo para formar un ácido nucleico bicatenario con puentes de hidrógeno específicos y estables, siguiendo normas explicitas correspondientes a qué bases de ácido nucleico pueden emparejarse entre si.

El término ~hibridaci6n sustancial-significa que la cantidad de hibridación observada será tal que alguien que observe los resultados podria considerar el resultado positivo con respecto a los datos de hibridación en controles positivos y negativos. Los datos que se consideran ~ruido de fondo· no son hibridación sustancial.

El término ~condiciones de hibridación rigurosas· significa aproximadamente de 35°C a 65°C en una disolución de sal de NaCI aproximadamente 0,9 molar. También puede regirse la rigurosidad por parámetros de reacción tales como la concentración y el tipo de especies iónicas presentes en la disolución de hibridación, los tipos y las concentraciones de agentes desnaturalizantes presentes, y la temperatura de hibridación. Generalmente a medida Que se vuelven más estrictas las condiciones de hibridación, se prefieren sondas más largas si van a formarse híbridos estables. Como norma, la rigurosidad de las condiciones en las que se realiza la hibridación dictarán determinadas características de las sondas preferidas Que van a emplearse.

El término Midentidad~ tal como se usa en el presente documento se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o aminoácido con aminoácido de dos secuencias de polipéptido o polinucleótidos o, respectivamente. Pueden compararse dos o más secuencias (de polinucleótidos o aminoácidos) detenninando su ~porcentaje de identidad-. El ·porcentaje de identidad-de dos secuencias, ya sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicado por 100. Programas adecuados para calcular la identidad en porcentaje o similitud entre secuencias se conocen bien en la técnica, tal como el programa BLAST de NCBI, usado por ejemplo con los parámelros por defecto (http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).

El término ·parcialmente idéntica/complementaria-tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia Que es idéntica/complementaria en al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a una secuencia de referencia. En algunas realizaciones, la secuencia parcialmente idéntica/complementaria puede ser sustancialmente idéntica/complementaria a una secuencia de referencia, que es idéntica/complementaria en al menos aproximadamente el 95%. el 96%, el 97%, el 98% o el 99% a dicha secuencia de referencia. En una realización, la secuencia parcialmente idéntica/complementaria es idéntica/complementaria en el 100% a una secuencia de referencia.

El término "kit" indica un conjunto de reactivos y coadyuvantes requeridos para un análisis. Aunque un kit consiste en la mayorla de los casos de varias unidades, también pueden estar disponibles los varios elementos de análisis presentados en una única unidad, que deben considerarse como kits.

Descripción

Un método para predecir la respuesta clínica a un agente anti-TNFa

En un primer aspecto, la presente invención hace referencia a un método in vitro para predecir la respuesta clínica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria a un agente anti-TNFa. en el que dicho método comprende:

a) determinar, en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, la presencia de uno

o más polimorfismos de TLR10 que den lugar a una variante de TLR10 que ha perdido la capacidad de inhibir a NFKB.

El NF-kB (factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas) juega un papel clave en la regulación de la respuesta inmune debida a la infección. La regulación defectuosa del NF-kB está también relacionada con el cáncer, enfermedades inflamatorias y autoinmunes, shock séptico, infecciones virales o un desarrollo inmune inadecuado. También está implicado en procesos de plasticidad sináptica y de memoria.

En una realización particular, dicha variante de TLR10 presenta al menos un polimorfismo que da lugar a una sustitución aminoacidica contrasentido. Dichos polimorfismos incluyen pero no se limitan a aquellos indicados en la tabla 2. Preferiblemente, dicho polimorfismo es seleccionado entre rs11466657 y rs11466650. Más preferiblemente, dicho polimorfismo es

rs11466657.

Así pues, en una realización preferida, la presente invención hace referencia a un método in vitro para predecir la respuesta clínica de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria a un agente anti-TNFo., en el que dicho método comprende:

a) detenninar, en una muestra biológica aislada de dicho sujeto, el genotipo del polimorfismo de un solo nucle6tido (SNP) rs11466657.

Asimismo, se refiere a un método in vitro para identificar un sujeto que tiene o se sospecha

que tiene una enfermedad inflamatoria con un mayor riesgo de no responder al tratamiento con un agente anti-TNFo.. en el que dicho método comprende la etapa a) según el primer aspecto.

La invención hace referencia también a un método in vitro para obtener datos útiles para determinar la respuesta clfnica de un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, a un agente anti-TNFa, donde dicho método comprende la etapa a) descrita anteriormente.

El polimortismo de un solo nucleótido (SNP) rs11466657 ha sido previamente descrito y su secuencia está disponible en bases de datos públicas (http://www.ncbLnlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=11466657). Tal y como muestra la figura 1A, rs11466657 se encuentra situado en la región que codifica para el dominio LRR18 de TLR10 humano.

El rs11466657 se encuentra en el cromosoma 4, en la posición 38774173 y corresponde por ejemplo a la posición 2056 del transcrito de TRLR10 humano NM_030956.3 (SEO ID NO:1). Para dicha posición (Iocus) el alelo ancestral es T y se ha descrito un cambio alélico de AIT a A~Tque se traduce en un cambio en la secuencia proteica (NP _112218.2; SEO ID NO:2) de isoleucina (lle) a treonina (Thr) en la posición 473 (1473T). Cuando dicho polimortismo se

dete""ina en la cadena complementaria el cambio alélico es de A a G (ver ejemplo 2). En la presente invención la variante alélica del SNP rs11466657, que da lugar al cambio de aminoacido 1473T se refiere como alelo (G).

De acuerdo con los datos presentados en el ejemplo 2, los pacientes con la variante 1473T muestran una respuesta significativamente menor a agentes anti-TNFa, de acuerdo con el índice DAS28 (Prevoo ML, van 't Hof MA, Kuper HH, van Leeuwen MA, van de Putte LB, van Riel PL (1995). Modified disease activity scores that inelude twenty-eight-joint counts.

Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthrilis Rheum., 38, 44-48) Y los crilerios de respuesta EULAR (Karonitsch T, Aletaha O, Boers M, Bombardieri S. Combe B, Dougados M, Emery P, Felson O, GomezReino J, Keystone E, Kvien TK, Martín-Mola E, Matucci-Cerinic M, Richards P, van Riel P, Siegel J, Smolen JS, Sokka T, van der Heijde D, van Vollenhoven R, Ward M, Wells G, Zink A, Landewe R. (2008). Melhods of deriving EULARlACR recommendalions on reporting disease activity in clinical tríals of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheurn Ois, 67(10), 1365-73), lo cuál indica también que dicha variante selecciona a un grupo de pacientes con una enfermedad más grave o severa.

Así pues, la determinación de la presencia del alelo (G) en al menos uno de los alelas en el locus del SNP rs11466657, preferiblemente la determinación del alelo (G) en ambos alelos (Le., genotipo GG) es indicativo de un mayor riesgo de no responder al agente antiinflamatorio. En otras palabras es predictivo de ausencia de respuesta clínica o resistencia al tratamiento.

La delerminaci6n de la presencia o ausencia de dicho SNP puede ser delenminada por la secuenciación del ADN, el análisis de PCR o cualquier otro método de genotipificación conocido en el estado del arte. Ejemplos de tales métodos incluyen, pero no se limitan a, ensayos químicos, tales como la hibridación alelo específica, la extensión del cebador ("primer extension"), ligación de oligonucleótidos alelo especifica, secuenciación, escisión enzimática, discriminación de 5' (flap) endonucleasa; y métodos de detección, tales como fluorescencia, quimioluminiscencia, y espectrometría de masas. Por ejemplo, la presencia o ausencia de dichos pOlimorfismos se pueden detectar en una muestra de AON, preferiblemente después de su amplificación. Por ejemplo, el AON aislado se puede someter a amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el polimorfismo o que permiten la amplificación de una región que contiene el polimorfismo. Por ejemplo, las condiciones para la hibridación del cebador pueden ser seleccionadas para asegurar la amplificación especifica; por lo que la aparición de un producto de amplificación sea indicativo de la presencia del polimorfismo de acuerdo con la invención. Alternativamente, el AON puede ser amplificado, de manera que el SNP se puede detectar en la secuencia amplificada por hibridación con una sonda adecuada o por secuenciación directa, o cualquier otro método apropiado conocido en la técnica.

Han sido descritas numerosas estrategias para el análisis de genotipo (Cooper el al., 1991 ; Grampe. 1993). Por ejemplo, se puede determinar la presencia o ausencia de un sitio de restricción en un ácido nucleico. Cuando un polimorfismo crea o elimina el sitio de reconocimiento de una enzima de restricción, esto permite un genotipado del pOlimorlismo de manera simple mediante PCR directa. Otras estrategias incluyen, pero no se limitan 8, la secuenciaci6n directa, polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP); hibridación con oligonucle6tidos específicos de alelo (ASO), PCR especifica de alelo; PCR usando cebadores mutagénicos; ligasa-PeR, HOT creavage; electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE), electroforesis en gel de gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP) y cromatografía líquida de alta resolución desnaturalizante (Kuklin et al, 1997).

La secuenciación directa puede realizarse por cualquier método conocido en el estado del arte, incluyendo, pero sin limitarse a, secuenciación química, usando el método de Maxam-Gilbert; secuenciación enzimática, utilizando el método de Sanger; pirosecuenciación, secuenciación de espectrometría de masas; secuenciación utilizando arrays; o PCR en tiempo real cuantitativa. Tipicamente, el ADN a secuenciar se somete primero a la amplificación por PCR utilizando cebadores de amplificación específicos. Sin embargo, varios otros métodos están disponibles, permitiendo estudiar el AON independientemente de la reacción de peR, por ejemplo, la amplificación por círculo rodante (RCA), el ensayo Invader®, o el ensayo de ligacióon a oligonucleotido (OLA).

Otro procedimiento de cuantificación preferido es la PCR cuantitativa (qPCR). La qPCR o PCR en tiempo real es bien conocidad por un experto en la materia. Se comercializan distintos instrumentos para llevar a cabo dicha reacción, tales como ASI Prism 7700 SOS, GeneAmp 5700 SDS, ABI Prism 7900 HT SDS de Applied Biosyslems; iCycler iQ de BioRad; Smart Cycler de Cepheid; Rotor-Gene de Corbett Research; LightCycler de Roche Molecular Biochemicals y Mx4000 Multiplex de Stratagene. El procedimiento de qPCR permite la cuantificación exacta del producto de PCR en tiempo real midiendo la acumulación del producto de PCR muy pronto en la fase exponencial de la reacción, reduciendo así el sesgo en la cuantificación ligado a la eficacia de la amplificación de PCR que se produce en la PCR de punto final. La PCR en tiempo real es bien conocida en la técnica y por tanto, no se describe en detalle en el presente documento. Una visión general de la tecnología y los protocolos para qPCR están disponibles, por ejemplo, de los proveedores mencionados anteriormente, por ejemplo, http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.htmlo

http://www.sigmaaldrich.com/1ife-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/qpcr

technical-guide.html. Una revisión del uso de qPCR en la cuantificación de mRNA se

encuentra por ejemplo en Wong ML y Medrana JF, Biotechniques 2005, 39(1 ):75-85.

5

Están disponibles diferentes bioquímicas de detección para qPCR. Se pueden usar todas

ellas con los instrumentos de qPCR mencionados anteriormente. El término ~ bioquímica de

detección-se refiere a un procedimiento para infonnar de la amplificación del producto de

PCR específico en PCR en tiempo real. Dichas bioquímicas de detección se clasifican en

dos grupos principales. El primer grupo comprende moléculas de intercalado de ADN de

10

doble cadena: tales como SYBR Green I y EvaGreen; y el segundo grupo incluye

oligonucleótidos marcados tlpicamente con un f1uoróforo. Este último, a su vez, se ha

dividido en tres subgrupos: (i) cebadores-sondas (Scorpions, Amplifluor®, LUXTM , Cyclicons,

Angler®); (ii) sondas de hidrólisis (TaqMan, MGB-TaqMan , Snake assay) y de hibridación

(Hybprobe or FRET, Molecular Beacons, HyBeacon"', MGB-Pleiades, MGB-Eclipse,

15

ResonSense®, Yin-Yang or displacing); y (iii) análogos de ácidos nucleicos (PNA, LNA®,

ZNA TM , bases no naturales: Plexor™ primer, Tiny-Molecular Beacon), ver E. Navarro eta l.

,Clínica Chimica Acta, Volume 439,15 January 2015, Pages 231-250.

Por ejemplo, dichas sondas son oligonucleótidos pueden ser de doble marcaje, tales como

20

sondas de hidrólisis o balizas moleculares. El extremo 5' del oligonucleótido, típicamente, se

marca con una molécula indicadora (reporter) fluorescente tales como FAM, TET o JOE

mientras que el extremo 3' se marca con una molécula desactivadora (quencher), tales

como TAM o BHQ1 . La secuencia de la sonda es específica para una región de interés en la

molécula diana amplificada. En un modo de realización preferido, dicha sonda es una sonda

2S

de hidrólisis que está diseñada de modo que la longitud de la secuencia sitúa el f1uoróforo 5'

y la molécula desactivadora 3' en proximidad suficientemente estrecha para suprimir la

fluorescencia. Varias moléculas indicadoras y extintoras para su uso en sondas de qPCR

son bien conocidas en la técnica. Estas están disponibles, por ejemplo, de

https:J/www.eurofinsgenomics.euJen/dna-rna-oligonucleotides/optimised-application

30

oligos/qpcr-probes.aspx.

Asimismo, la presente invención se refiere a secuencias de oligonucleotides (cebadores y/o

sondas) que hibridan de manera específica con uno de los alelos de los polimorfismos. El

ténnino M un cebador y/o sonda" incluye específicamente ·cebadores y/o sondas~,

3S

englobando por ejemplo a un cebador, una sonda, un cebador y una sonda, una pareja de

cebadores, y una pareja de cebadores y una sonda.

,.

Preferiblemente, una sonda y/o cebador es un secuencia de polinucleótidos de entre 10 Y 30 nucleótidos, más preferiblemente de entre 15 y 26 nucle6tidos, aún más preferiblemente de entre 18 y 22 nucle6tidos, y aún mucho más preferiblemente de alrededor de 20 nucle6tidos. En una realización particular, dichos cebadores y/o sondas han sido modificados para la detección o para potenciar el rendimiento del ensayo.

En un aspecto relacionado, la invención hace referencia a un método in vitro para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, en el que dicho método comprende la etapa a) definida más arriba; y además comprende:

b) seleccionar un agente anti-TNFa cuando el alelo (A) está presente en al menos

uno de los alelas en el locus del SNP rs11466657, preferiblemente cuando el

alelo (A) está presente en ambos alelas.

En una realización preferida, el sujeto es ACPA positivo. En una realización más preferida, dicho sujeto es una mujer ACPA positivo.

Un agente anti-factor de necrosis tumoral (en inglés ~tumor necrosis factor", TNF) disminuye, bloquea, inhibe, anula o interfiere con la actividad TNF in vitro ylo in vivo. El ténnino antiTNFa e inhibidor de TNFa se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria. En una realización preferida, dicho agente anti-TNFa es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo anti-TNFa específico. Métodos para la obtención de anticuerpos frente a un antígeno conocido son parte del estado del arte y un experto en la materia sabrá como obtener anticuerpos anti-TNFa.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')" Fv, scFv, diabodies), anticuerpos de dominio único (sdAb) y péptidos recombinantes que comprenden los anteriores, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo" también se refiere a una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina.

Los agentes anti-TNFa son bien conocidos en el estado del arte. A modo de ilustración. agentes anti-TNFa incluyen pero no se limitan a agentes anti-TNFa seleccionados del grupo que consiste en etanercept, adalimimab, infliximab, golimumab, certolizumab, riluximab, abatacept, anakinra and tocizumab. En una realización preferida, dicho agente anti-TNFa es infiiximab. Singh et al., Arthritis & Rheumathology, 2016, 68(1), 1-16 proporciona un manual para el tratamiento de la AR del American College 01 Rheumatology. En particular, la Tabla 1 proporciona un listado de tratamientos para la AR que incluye agentes anti-TNFa.

En una realización particular, dicha enfermedad inflamatoria es una enfermedad reumática inflamatoria. Preferiblemente, dicha enfermedad reumática inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, sindrome de Sjbgren, artritis reumatoide juvenil, yespondiloartropatia.

En otra realización particular, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa) psoriasis, artritis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjbgren, artritis reumatoide juvenil, espondiloartropatia. uveltis y enfermedad de Behcet. En una realización preferida, dicha enfermedad inflamatoria es la artritis reumatoide.

Un método para el pronóstico y/o determinación de la gravedad de un sujeto gue padece una enfermedad inflamatoria

En un aspecto adicional, la invención hace referencia a un método in vitro para determinar la gravedad y/o el pronóstico de la enfermedad en un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, comprendiendo dicho método la etapa a) definida anteriormente.

Asimismo, hace referencia a un método in vitro para obtener datos útiles para determinar la gravedad y/o el pronóstico de la enfermedad en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, comprendiendo dicho método la etapa a) definida

anteriormente.

Para cada enfermedad o grupo de enfermedades inflamatorias se han establecido criterios por parte de la comunidad cHnica para determinar la gravedad o grado de avance y/o actividad de la enfermedad que son bien conocidos por un experto en la materia. Como se

ha descrito más arriba el índice DAS28 y los criterios de la ACRlEULAR se utilizan habitualmente para determinar el grado de severidad de la AR. Por ejemplo se consideran tipicamente pacientes con enfermedad grave aquellos que presentan una o más.

preferiblemente todas, de las siguientes características: positividad para factor reumatoide (FR) y/o anticuerpos frente a antígenos de protelna citrulinada (ACPA), presencia de erosiones y resistencia (por ejemplo, DAS28 2: 3,2 o intolerancia) a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (DMARDs en inglés) Agentes DMARDs son bien conocidos en el estado del arte e incluyen por ejemplo, methotrexate, leflunomide, hydroxychloroquine and sulfasalazine. Un experto en la materia entenderá que una mayor severidad o gravedad de la enfermedad está asociada a un peor pronóstico.

De acuerdo con los datos del Ejemplo 2, se ha encontrado una correlación entre la gravedad de la enfermedad y la presencia del alelo (G), en particular la variante 1473T está asociada a un aumento de la erosión, especialmente en pacientes ACPA positivos, y a una menor respuesta a agentes anti-TNFa (Le., infliximab). Así pues. en una realización particular del método de la invención, la presencia del alelo (G) en al menos uno de los alelas en ellocus del SNP rs11466657, preferiblemen1e en ambos alelas, es indica1ivo de un aumen10 de gravedad de la enfermedad inflamatoria.

Asimismo, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, en el que dicho método comprende la etapa a) definida anteriormente; y además comprende:

b) administrar a dicho sujeto un agente anti-TNFa cuando el alelo (A) está

presente en al menos uno de los alelas en el locus del SNP rs11466657,

preferiblemente cuando el alelo (A) está presente en ambos alelas.

En una realización preferida, el sujeto es ACPA positivo. En una realización más preferida, dicho sujeto es una mujer ACPA positivo.

Además, la presente invención hace referencia a un agente anti-TNFa para su uso en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, en el que dicho sujeto presenta el alelo (A) en al menos uno de los alelas en ellocus del SNP rs1 1466657, preferiblemente en el que dicho sujeto es homocigoto para el alelo (A).

Los métodos de la presente invenci6n pueden comprender además la determinación de otros biomarcadores asociados a dicha enfermedad inflamatoria, preferiblemente, dichos biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos anti-protelnas cilrulinadas (ACPA), anticuerpos del factor reumatoide (FR), anticuerpos antí·lectina de unión a manasa (MBL), velocidad de sedimentación globular (VSG), proteína e-reactiva (CRP), recuento de plaquetas, los niveles de hemoglobina y el hematocrito. Más detalles sobre dichos biomarcadores se proporcionan por ejemplo en Gupta B el aL J Autoimmun. 2006. 27: 125-133, Alzal Net al. Clin Lab. 2011. 57: 895-899, Takizawa Y et al. Ann Rheum Dis. 2006. 65: 1013-1020, Vossenaar ER et al. Arthritis Res Ther. 2004. 6: R142-R150 y EP0175270 que se incorporan a este documento por referencia.

El factor reumaloide (RF) es el auloanticuerpo que primero se identificó en la artritis reumatoide. Se define como un anticuerpo contra la porción Fc de IgG. RF Y IgG se unen para formar complejos inmunes que contribuyen a la enfermedad. Por otra parte, los anticuerpos frente a antígenos de proteína citrulinados (ACPA) son autoanticuerpos que se dirigen contra péptidos y proteínas que son citrulinados. Los ACPA están presentes en la mayoría de los pacientes con artritis reumatoide.

En una realización preferida de los métodos de la invención, se determinan también los anticuerpos anti-proteína citrulinados (ACPA).

Opcionalmente, dichos métodos pueden comprender además la determinación de parámetros clínicos. Ejemplos de signos y/o slntomas cuya presencia/ausencia puede determinarse son: rigidez matutina, presencia de artritis en tres o más articulaciones, afectación de las articulaciones de las manos, artritis simétrica, nódulos reumatoides, y los cambios radiográficos (véase la Tabla 1 de Rindflelsch y Muller, y criterios de clasificación de la ACR/EULAR (Ann Rheum Dis 2010; 69: 1580-1588).

El método de la invención puede comprender además el almacenaje de los resultados obtenidos en dispositivo de almacenamiento de datos. En un modo de realización, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es una lámina de papel. En un modo de realización preferente, dicho dispositivo de almacenamiento de datos es un medio legible por ordenador. Como se usa en el presente documento, "un medio legible por ordenador" puede ser cualquier aparato que pueda incluir, almacenar, comunicar, propagar o transportar los resultados de la determinación del procedimiento de la invención. El medio puede ser un sistema (o aparato o dispositivo) electrónico, magnético, óptico, electromagnético, infrarrojo

o semiconductor o un medio de propagación.

Los métodos de la presente invención pueden ser implementados por un ordenador. Por lo tanto, un aspeclo adicional de la invención se refiere a un método implementado por ordenador. en el que el método es cualquiera de los métodos descritos en el presente documento o cualquier combinación de los mismos.

Así pues, cualquier programa de ordenador capaz de implementar cualquiera de los métodos de la presente invención o utilizado para implementar cualquiera de estos métodos

o cualquier combinación de los mismos, también fonna parte de la presente invención. Asimismo, cualquier dispositivo o aparato que comprende o que lleva un programa de ordenador capaz de llevar a cabo, o para la aplicación de cualquiera de los métodos de la presente invención o cualquier combinación de los mismos, se incluye también como parte de la presente memoria descriptiva.

Finalmente, los métodos de la presente invención pueden aplicarse con los individuos de ambos sexos, es decir, hombres o mujeres, ya cualquier edad. El perfil determinado por la presente invención es predictivo y pronóstico.

Kit de la invención y usos del mismo

En otro aspecto adicional, la invención proporciona un kit para determinar en una muestra biológica aislada de un sujeto el genotipo de uno o más polimorfismos de TLR10 que den lugar a una variante de TLR10 que ha perdido la capacidad de inhibir a NFKB, donde dicho kit comprende:

un reactivo para determinar el genotipo de dichos polimorfismos: -opCionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo en la determinación del genotipo de dichos polimorfismos en una muestra biológica aislada.

En una realización preferida, la invención hace referencia a un kit para determinar en una muestra biológica aislada de un sujeto el genotipo del SNP rs11466657, que comprende:

un reactivo para detenninar el genotipo del SNP rs11466657; -opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo en la determinación del genotipo del SNP rs11466657 en una muestra biológica aislada.

En una realización particular, dicho reactivo es un cebador y/o sonda específico de SEa ID NO: 1 que amplifica una región que comprende el SNP rs11466657. Típicamente. dicho reactivo incluye un cebador directo parcialmente idéntico, preferiblemente substancialmente idéntico, a un fragmento de SEa ID NO: 1, y una sonda y/o un cebador inverso es parcialmente complementario, preferiblemente substancialmente complementario, a un fragmento de SEO ID NO: 1.

Preferiblemente. dicho cebador y/o sonda comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEa ID NO: 3, SEO ID NO: 4 y secuencias idénticas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.

Las secuencias oligonucleotidicas con una identidad de al menos un 75 % mencionadas en la presente invención presentan preferiblemente una identidad de al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, más preferentemente, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % con las respectivas secuencias de referencia. Además, estas secuencias con una identidad de al menos un 75 % pueden tener el mismo número de nucleótidos, o bien presentar más o menos nucleótidos que la secuencia de referencia.

En una realización particular, dicho kit comprende reactivos para llevar a cabo una reacción de PCR en tiempo real, que normalmente contiene una AON polimerasa, tal como TaO ADN polimerasa, un tampón, magnesio, dNTPs, y opcionalmente otro agentes (por ejemplo, agentes estabilizantes tales como gelatina y albúmina de suero bovino). Además, mezclas de reacción PCR en tiempo real también contienen reactivos para la detección en tiempo real y la cuantificación de los productos de amplificación como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Realizaciones particulares y características preferidas de este aspecto de la invención se han definido en aspectos anteriores.

La invención se refiere también al uso de un kit, tal y como se ha descrito en el aspecto anterior, para predecir la respuesta clínica de un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, para identificar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria con riesgo de no responder a un tratamiento con un agente anti-TNFa, para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, o para detenninar la gravedad y/o el pronóstico de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, en un método de acuerdo con los aspectos anteriores de la invención.

Se contempla que cualquier realización comentada en esta memoria descriptiva puede implementarse con respecto a cualquier método, kit y uso de la invención descritos en el presente documento. Se entenderá que las realizaciones particulares descritas en el presente documento se muestran a modo de ilustración y no como limitaciones de la invención. Las características principales de esta invención pueden emplearse en diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar, usando únicamente experimentación de rutina, numerosos equivalentes a los procedimientos específicos descritos en el presente documento. Se considera que tales equivalentes están dentro del alcance de esta invención y se cubren por las reivindicaciones.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de conocimiento de los expertos en la técnica a la que se refiere esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan al presente documento como referencia en la misma medida que si se indicara que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora especffica e individualmente como referencia.

El uso de la palabra Mun· o Muna· puede significar Muna·, pero también concuerda con el significado de Muna o más·, "al menos uno· y Muna o más de uno~. El uso del término Matra· también puede referirse a uno o más. El uso del término "o· en las reivindicaciones se usa para significar ·y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere solo a alternativas

o que las alternativas son mutuamente excluyentes.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación/reivindicaciones, las palabras Mque comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como ·comprenden" y ·comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene·), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son incluyentes o de significado abierto y no excluyen elementos o etapas de método adicionales, no citados. El término "comprende" también abarca y da a conocer expresamente los términos "consiste en" y "consiste esencialmente en". Tal como se usa en el presente documento, la expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y a aquellos que no afectan materialmente a la(s) caracterfstica(s)

básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. Tal como se usa en el presente

documento, la expresión ~que consiste en-excluye cualquier elemento, etapa o componente

no especificado en la reivind icación exceptuando, por ejemplo, impurezas normalmente

asociadas con el elemento o la limitación.

5

El término MO combinaciones de los mismos· tal como se usa en el presente documento se

refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los elementos enumerados que

preceden al término. Por ejemplo, MA, B. e, o combinaciones de los mismos· se pretende

que incluya al menos uno de: A, 8, e, AB, AC, Be o ABe, y si el orden es importante en un

10

contexto particular, también BA, CA, CS, CeA, seA, ACB, BAC o CAB. Continuando con

este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o

más elementos o términos, tales como BB, AAA, AB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA,

CABABB, etc. El experto en la técnica entenderá que normalmente no existen límites en el

número de elementos o términos en cualquier combinación, a menos que sea evidente de

lS

otra manera a partir del contexto.

Tal como se usa en el presente documento, palabras de aproximación tales como, sin

limitación, "aproximadamente-, "alrededor de"', ~de manera aproximada~ se refieren a una

condición que cuando se modifica de ese modo se entiende que no es necesariamente

20

absoluta o perfecta pero podría considerarse lo suficientemente cerca para los expertos

habituales en la técnica como para garantizar la designación de que la condición está

presente. El grado en que puede variar la descripción dependerá de la medida en que puede

instituirse un cambio y de que un experto habitual en la técnica todavía pueda reconocer que

el rasgo distintivo modificado todavía tiene las características y capacidades requeridas del

2S

rasgo distintivo sin modificar. En general, pero sujeto a la discusión precedente, un valor

numérico en el presente documento que se modifica por una palabra de aproximación tal

como ~aproximadamente· puede variar del valor establecido en ± el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el

6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 11 , el 12, el 13, el 14 o el 15%. Preferiblemente el término

"aproximadamente" significa exactamente el valor indicado (± el 0%).

30

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invención y no deben interpretarse

como limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLOS

Ejemplo 1.-Material y métodos

1.1 Muestras

En este trabajo se han incluido dos cohortes de pacientes con AR, una primera cohorte de 5 453 pacientes sin seleccionar con seguimiento en el Hospital Universitario Marqués de

Valdecilla (Santander, España) y el Hospital Universitario La Paz (Madrid, España), y una

segunda de 1201 pacientes reclutados por el Consorcio de Enfermedades Inflamatorias

Mediadas por el Sistema Inmunitario (España) [Avila-Pedretti G. et al., PLoS One 2015.

10(4):e0122088]. La información clínica. incluyendo datos demográficos, características de 10 enfermedad y tratamiento, se resumen en la tabla 1. Todos los pacientes se diagnosticaron

según los criterios de clasificación del American COllege of Rheumatology [Arnett Fe, et al.,

Arthritis Rheum 1988, 31(3):315-324]. Como población de control, también se genotiparon

1702 individuos sanos del mismo trasfondo genético (es decir, una población del sur de

Europa) [Julia A, et al., Gut 2013, 62(10):1440-1445]. Todos los individuos de control se

15 habían examinado para determinar la presencia de una enfermedad autoinmunitaria o antecedentes familiares de trastornos autoinmunitarios, y se excluyeron si eran positivos.

Tabla 1. Características principales de dos cohortes de pacientes con AR.

Cohorte I Cohorte II (n=453) (n=1 .201 )

Mujeres (%)

Media de edad (años)

Duración del seguimiento (meses) Manifestaciones extra·articulares (%) Presencia de dai'io articular (%) Positivo para FR (%)

Positivo para ACPA (%)

Número de tratamientos previos con DMARDs Número de terapias biológicas previas

73,1 65,6 ± 14,5' 123,8 ± 91,5' 22,2

64,8 62,2 2,2 ± 1,5' 1,8 ± 1,2' 76,8 46,5 ± 14,5' 171 ,6 ± 123,6'

100 74,6 74,1 1,7 ± 1,5' 0,6 ± 0,9'

FR, factor reumatoide; DMARDs. fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad; ACPA, anticuerpos anli-proteínas citrulinadas. 8Media ± DE.

20 1.2 Líneas celulares

Se mantuvieron células K562 (ATCC, Middlesex, Reino Unido) y U937 (ATCC Middlesex, Reino Unido) en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) complementado con suero bovino felal (FBS) al 10% (Lanza, Verviers, Bélgica). Se sustituyó el medio cada 2-3 días.

1.3 Análisis de secuenciaci6n del gen de TLR10 Se secuenciaron los exones codificantes y las regiones f1anqueantes del gen de TLR10 en 66 pacientes con AR seleccionados con enfermedad grave. Se consideraron pacientes con enfermedad grave aquellos con posilividad para factor reurnatoide (FR) y/o anticuerpos frente a antígenos de proteína citrulinada (ACPA), presencia de erosiones y resistencia a al menos un fármaco antirreumático modificador de la enfemnedad (OMAROs en inglés) y 30 controles sanos mediante secuenciaci6n de nueva generación (NGS). El FR se midió por nefelometría (BN!!, Siemens Healthcare) y el valor de corte 22 UI I mI. Los ACPA se midieron mediante un test EUSA comercial (CCP2, Eurodiagnostica) y se consideraron positivos por encima de 50 U/mI. Se clasificaron como resistentes a DMARDS aquellos que presentaban falta de respuesta en el índice DAS28 (DAS28 ~ 3,2) o intolerancia.

Las librerfas de ADN se procesaron para enriquecimiento híbrido usando un diseño SeqCap EZ (Roche Nimblegen, Basilea, Suiza) que contenía las secuencias codificantes de TLR10. A continuación, se secuenciaron librerías de doble código de barras usando una plataforma MiSeq NGS (lIIumina, Madison, WI). Para la secuenciación de Sanger, se extrajo ADN de sangre completa usando el kit para ADN en sangre QIAamp (Qiagen, Hamburgo, Alemania)

y se amplificó con cebadores para TLR10 humano (SEO ID NO: 3): 5'-CATGGCCAGAAACTGTGGTC-3' y (SEO ID NO: 4): 5'-ACCATCCAACCATCATGACC-3'.

Se llevó a cabo el análisis de secuencia del fragmento amplificado usando un analizador

genético (Applied Biosystems, Foster City, CA).

1.4 Análisis de SNP único Se analizó la variante 1473T de TLR10 (rs11466657;

htlp:llwww.ncbi.nlm.nih.gov/projectslSNP/snp_ref.cgi?rs=11466657), en una cohorte

independiente de 1201 pacientes con AR y 1493 controles sanos usando la plataforma de

genotipado TaqMan® (Assay Id C_25643390_30, Life Technologies, Carlsbad, CA). Todas

las lecturas de fluorescencia de punto final y reacción de PCR se realizaron usando un

sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems). Las

2.

condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 50 o e durante 2 min y 95 o e

durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 92 o e durante 15 s y60 o e durante 1 mino Se

estimó el error de genotipado genotipando el 20% de las muestras por duplicado (error <1%)

[Lopez-Lasanta M, Julia A, Maymo J, Femandez-Gutierrez B, Urena-Gamica 1, Blanco FJ,

S

Canete JO, Alperi-Lopez M, Olive A, Corominas H el al: Variation at Interleukin-6 Receptor

Gene 15 Associated to Jalnt Damage in Rheumatoid Arthritis. Atthritis Res Ther 2015,

17:242).

1.5 Transfecciones para realizar los ensayos de gen indicador

10

Se clonó ADNc de TLR10 (NM_030956; http://www.ncbLnlm.nih.gov/nuccore/NM_030956.3;

SEQ ID NO: 1) en pCMV6 (Origene, Rockville, MD). La variante 1473T se generó mediante

mutagénesis dirigida al sitio usando el kit de mutagénesis Ouick Change (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA) con los siguientes cebadores: SEO ID NO: 5

5'-GGCCTTACGAGAACTAAATACTGCATTTAATTTTCTAACTGATC-3' y SEQ ID NO: 6

15

5'-ATCAGTTAGAAAATTAAATGCAGTATTTAGTTCTCGTAAGGCC-3'. Se secuenció el

injerto modificado para verificar la mutación. Se cotransfectaron células K562 y U937 con

2).1g de constructos de TLR10 de tipo natural o mutante, 1 ).1g de plásmido pBVI-Luc

indicador, que contenía seis repeticiones en tándem de los sitios de reconocimiento de

NFKB dentro de la región promotora unida al gen de la luciferasa [Inohara N, el al., J Biol

20

ehem 2001 , 276(4):2551-2554J y 0,2 ~g de pRSV-p-gal usando Lipofectamine 2000 (Sigma

Aldrich, St Louis, MO).

1.6 Ensayos de gen indicador

Tras 24 h de transfección, se incubaron las células K562 y U937 con 10 ng/ml y 20 ng/ml de

25

factor de necrosis tumoral-alfa (TNFa) en presencia o en ausencia de 200 )lg/ml de

infliximab y tras 24 h se prepararon los extractos celulares y se analizaron para determinar la

actividad luciferasa relativa mediante un sistema de ensayo de gen indicador Oual-Light

(Applied Biosystems). Se normalizaron los resultados para determinar la eficacia de

transfección con valores obtenidos con pRSV-j3-gal.

30

1.7 Análisis de expresión de genes diana de NF1C8

Para evaluar la expresión de genes individuales, se generó un AON complementario y se

amplificó usando cebadores para TNFa humano SEO ID NO; 7

(5'-CAATGGCGTGGAGCTGAGAG-3' y SEQ ID NO: 8

S'-GGCTGATGGTGTGGGTGAGG-3'), CCL2 SEO ID NO: 9 (S'-CTCGCTCAGCCAGATGCAAT-3' y SEO ID NO: 10 S'-GTCTTCGGAGTTTGGGTTTGC-3'), TRAIL SEO ID NO: 11 (S '-GAGCTGAAGCAGATGCAGGAC-3' y SEO ID NO: 12 5 S' -TGACGGAGTTGCCACTTGACT-3'), y p-actina SEO ID NO: 13 (S'-GCTGCCTCAACACCTCAAC-3' y SEO ID NO: 14 S'-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3'), Se realizó PCR cuanlitativa en tiempo real en

un sistema de detección de secuencias 7000 (Applied Biosystems). Se calculó la razón de la abundancia de marcadores de diferenciación con respecto a la de transcritos de (3-actina

10 como 2n , donde n es el valor de ciclo umbral de p-actina menos el valor de ciclo umbral del ARNm correspondiente y se normalizó por el valor de la muestra con el nivel de expresión más bajo de estos genes. Se determinó la especificidad de los productos de PCR deseados con análisis de curva de fusión.

15 La PCR en tiempo real, se llevó a cabo utilizando el Applied Biosystems 7000 Real-Time PCR system (Bio-Rad), Cada reacción de PCR contenla 12,S ~I SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Byosystems), 400 nM de cada cebador, y 1 ~I cDNA diluido (100 ng) en un volumen total de 25 ~I . Las reacciones se realizaron en una placa de reacción de 96 pocillos bajo las siguientes condiciones: 2 min a 60 oC, 10 min a 95 oC, seguido de 40 ciclos

20 de IS s a 9S oC, 3 s y 1 min a 60 oC,

El método delta Cl (.ó.Ct), se utilizó para el análisis de datos de la matriz de PCR. El valor

(6Ct) normalizado para cada gen de interés (GOl) se calculó restando el Ct medio de los dos

genes de expresión constitutiva ("housekeeping genes N de la CI de cada GOl. A

)

25 continuación, el doble delta el (lillCt) para cada GOl se calculó restando el .ó.Ct medio de

cada GOl en el grupo de control de la 6Ct de cada GOL El factor de cambio ("fold-change")

de cada GOl comparado con el grupo de control se calculó como 2-MCt del log,02o6 Ct.

1.8 Análisis estadistico

30 Todos los análisis estadísticos se realizaron usando el programa SPSS 20 (18M, Armonk, Nueva York) y el software R statistical (versión 3.2.0). Se compararon las diferencias en variables cuantitativas entre grupos de pacientes con la prueba de la U de Mann-Whitney, y se usó la estadística de chi-cuadrado para variables categóricas. Se realizó significación estadística entre grupos en análisis in vitro usando la prueba de la t de Student bilateral para

datos independientes. Se estableció el nivel de significación en p<O,05. Se realizaron

análisis de asociación genética usando modelos de regresión linear y logística. Tal como se

ha descrito previamente, las covariantes en estos análisis genéticos incluyeron los años de

evolución de la enfermedad y la puntuación de actividad de enfermedad basal (OAS28) para

S

la asociación del genotipo rs11466657 con el nivel de daño articular [Lopez-Lasanta M, Julia

A, Maymo J, Fernandez-Gulierrez B, Urena-Gamica 1, Blanco FJ, Caneta JO, Alperi-Lopez

M, Oliva A, Corominas H et al: Variation at Interleukin-6 Receptor Gene 15 Associaled to

Jaint Damage in Rheumatoid Arthritis. Arthritis Res Ther 2015, 17:242], y el cambio en

DAS28 a las 12 semanas [Acosta-Colman 1, Palau N, Tornero J, Fernandez-Nebro A, Blanco

10

F, Gonzalez-Alvaro 1, Canete JO, Maymo J, Ballina J, Fernandez-Gutierrez B el al: Gwas

Replication Study Confirms the Association of Pde3aSIco1c1 with Anti-Tnf Therapy

Response in Rheumatoid Arthritis. Pharmacogenomics 2013, 14(7):727-734],

respectivamente.

15

Ejemplo 2.-La variante 1473T está asociada con la gravedad de la enfermedad y

respuesta al tratamiento en pacientes con AA

La función de TLR10 es controvertida y su asociación con AR apenas se ha estudiado. Con

el fin de evaluar si las variantes de TLR10 contribuyen a modificar el desarrollo de la

20

enfermedad en pacientes con AR, se secuenciaron los exones codificantes del gen de

TLR10 en 66 pacientes con AR seleccionados y 30 controles sanos. Tras filtrar las bases

que tenían al menos cobertura de secuencia 30X, se identificaron dieciséis variantes (véase

la tabla 2 a continuación).

25

Tabla 2. Dieciséis variantes alélicas del gen de TLR10 encontradas mediante NGS en

poblaciones control y con AR. REF, alelo de referencia: ALT, alelo alternativo: MAF,

frecuencia de alelo minoritario; (+) cambio dañino; (-) sin cambio dañino; nr, sin registro.

ID de SNP

REF ALT MAF valor de Cambio Clase Predicci Predicción

de referencia

P de AA funcional 6n mediante

mediant

SNPs30

e SIFT

rs10776482 rs4129008

A C G T 0,29 0,01 0,2306 0,5652 0809 R799Q SILENTE CONTRASEN TIOO nr nr

31

ID de SNP REF ALT MAF valor de Cambio Clase Predicci Predicción de referencia P de AA funcional 6n mediante mediant SNPs3D e SIFT

rs4129009 T e 0,271 0,1889 1775V cONTRASEN

TIDO r510776483 A G 0,302 0,3296 H724 SILENTE nr nr rs11466658 G A 0,026 0,1599 R525W CONTRASEN

TIDO rs11466657 A G 0,089 0,04327 1473T cONTRASEN + + TIDO r511096955 T G 0,422 0,07296 1369L cONTRASEN

TIDO r511096956 e A 0,292 0,3918 P344 SILENTE nr nr rs11466653 A G 0,026 0,5824 M326T cONTRASEN nr

TIDO rs11466652 T e 0,13 0,1403 K303 SILENTE nr nr rs11466651 e T 0,026 0,5824 V2981 c ONTRASEN

TIDO rs11096957 T G 0,438 0,015 N241H cONTRASEN TIDO rs11466650 A G 0,0005 0,137 L167P cONTRASEN + + TIDO rs11466649 e A 0,026 0,5824 A163S cONTRASEN

TIDO rs10858837 e T 0,026 0,5824 T37 SILENTE nr nr rs10856838 A T 0,146 0,5813 11 3 SILENTE nr nr

Entonces, se realizó una selección basándose en las frecuencias alélicas en ambas poblaciones de pacientes y de control y el impacto funcional previsto sobre la proteína

usando los programas SIFT (Nq PC and Henikoff S, Nucleic Acids Res. 2003, 31(13):38125 4) Y SNPs3D (Yue el al., BMC Bioinformalics. 2006, 7:166). La mayoria de los cambios

contrasentido encontrados se situaron en los dominios LRR (figura 1A). Como resultado del procedimiento de selección, se identificó la variante 1473T (Tabla 2) para estudios de asociación adicionales. Primero, se estudió una población de 453 pacientes y se encontró que las frecuencias de genotipo (el 86,6% de AA, el 11 ,9% de AG, el 1,5% de GG) no eran 10 significativamente diferentes de las de una población de 209 controles (el 84,5% de M , el 14,3% de AG, el 1,2% de GG). Después se analizaron varios hallazgos clínicos en la

población de pacientes asociados con la gravedad de la enfermedad, incluyendo la

presencia de autoanticuerpos típicos de AR (RF Y ACPA), manifestaciones extra-articulares

y la necesidad de tratamientos biológicos específicos y cirugía . Todos ellos indicaron una

correlación tendencial entre la gravedad y el genotipo GG que no se observó con el genotipo

5

AA (figura 2A). Para reforzar esta observación, se estudió una cohorte mayor de 1201

pacientes con AR y 1493 controles sanos. Tal como se observó previamente. se encontró

que la distribución de genotipos era similar en ambas poblaciones de pacientes y de control

(figura 1B), lo que es concuerda con los genotipos descritos para la población europea en la

base de datos HapMap (Nature. 2005, 437(7063):1299-320; figura 1C). Resulta interesante,

10

tal como se muestra en la figura 28, que la variante 1473T está altamente asociada con

enfermedad erosiva en AR positiva para ACPA (p=O,017 en la cohorte total y p=O,0049 en

pacientes femeninos) y con una respuesta menor al tratamiento con infliximab medido

mediante el cambio en el índice OAS28 (p=O,012 en la cohorte total) así como mediante los

criterios de respuesta de la EULAR (p=0,025 en la cohorte total), lo que indica que esta

15

variante selecciona un grupo de pacientes con una enfermedad más grave.

Ejemplo 3.-La variante 1473T modifica la capacidad regulatoria de NFxB de TLR10

Basándose en un modelo de estructura 3D usando el visor Jmol (Nepomnyachiy S1 ,et aL ,

Structure. 2015 May 5;23(5):941-8; figura 3A), la posición 473 está dentro de una cadena

20

bela en el dominio LRR18 y está ocupada por una isoleucina, un aminoácido altamente

hidrófobo, escondida dentro del núcleo de la proteína. En la variante de TLR10, se sustituye

isoleucina por treonina, un aminoácido polar que puede participar en puentes de hidrógeno y

se sitúa habitualmente en la superficie de la proterna. Los dominios LRR proporcionan

marco destacado para lograr diversas interacciones de proteínas. Por tanto, este cambio

2S

estructural disminuye los contactos hidrófobos y puede alterar interacciones proteína

proteína funcionalmente relevantes. Se sabe que los miembros de la familia de TLR son

reguladores de la actividad de NFKB, una ruta clave en la inflamación. Para demostrar

experimentalmente las consecuencias funcionales de la variante 1473T sobre la activación

de NFKB, se introdujo el nuc1eótido de alteración de codón en un constructo que contenía

30

ADNc de TLR10 mediante mutagénesis dirigida al sitio y se estudió la capacidad de esta

variante para modificar la actividad transcripcional de NFKB. Tal como se muestra en las

figuras 3B y 3C, TLR10 de tipo natural regula por disminución la actividad transcripcional de

NFKB tanto en condiciones no estimuladas como en condiciones estimuladas por TNFa. en

las líneas celulares hematopoyéticas K562 y U937. Sin embargo, la sustitución de 1473T

35

bloquea la capacidad de inhibición de TLR10. Con el fin de trasladar la respuesta reducida a

infliximab en pacientes al modelo in vitro, se estimularon células con TNFa en presencia o en ausencia de infliximab. En consecuencia, las células que expresaban la variante 1473T tenian un nivel de actividad de NFKB más alto que permanecía tras el tratamiento con infliximab en comparación con células que expresaban la variante de tipo natural (figuras 3D 5 Y 3E). Después, se confirmó este resultado analizando la expresión de genes diana de NFKB. Los niveles de expresión de CCL2, TRAIL y TNFo. se regularon por disminución en presencia de TLR10 de tipo natural tras la estimulaci6n de la ruta de NFKB con TNFa. En línea con los resultados previos, se anuló la regulación por disminución de genes diana de NF"B cuando se transfectaron las células con el constructo que contenía la variante y se

10 cultivaron con TNFa. (figura 4AME). La expresión de CCL2 también confirmó que la variante genera una menor respuesta a infliximab (figura 4F).

En conclusión, la variante 1473T conduce a una capaCidad reducida de TLR10 para inhibir la activación de NFKB en respuesta a estímulos inflamatorios. Este efecto podría explicarse

15 debido a que el cambio de aminoácido disminuye la hidrofobicidad de un dominio LRR, lo que puede alterar la interacción con proteínas TLR necesaria para la señalización de TLR10 [Govindaraj RG, el al., PLoS One 2010, 5(9):e12713J.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1,

   Método in vitro para predecir la respuesta cllnica de un sujeto, que tiene o se

   sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, a un agente anti~TNFa, en el que

   5

   dicho método comprende :

   a) determinar en una muestra biológica aislada de dicho sujeto el genotipo del

   polimorfismo de un solo nucle6tido (SNP) rs11466657;

   10

   donde la presencia del alelo (G) en al menos uno de los alelos en el locus del SNP

   rs11466657 indica un mayor riesgo de no responder al agente anti-TNFa.: y

   donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en

   enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis. artritis psoriasica, artritis reumatoide,

   15

   lupus eritematoso sistémico, slndrome de Sjógren, artritis reumatoide juvenil,

   espondiloartropatia, uveftis y enfermedad de Behcet's.

2. 2.

   Método in vitro para identificar un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene una

   enfennedad inflamatoria , que presenta un mayor riesgo de no responder al

   20

   tratamiento con un agente anti-TNFa, en el que dicho método comprende la etapa a}

   según la reivindicación 1;

   donde la presencia del alelo (G) en al menos uno de los alelos en ellocus del SNP

   rs11466657 indica un mayor riesgo de no responder al agente anti-TNFa; y

   25

   donde dicha enfennedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en

   enfennedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, artritis reumatoide,

   lupus eritematoso sistémico, síndrome de SjOgren, artritis reurnatoide juvenil,

   espondiloartropatia, uvertis y enfermedad de Behcet's.

   30

3. 3.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la presencia del

   alelo (G) en ambos alelos indica un mayor riesgo de no responder al agente anti

   TNFa.

   35 4. Método in vitro para seleccionar un tratamiento para un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene una enfennedad inflamatoria, en el que dicho método comprende la etapa a) según la reivindicación 1; Y además comprende:

   b) seleccionar un agente anti-TNFa cuando el alelo (A) está presente en ambos alelas en ellocus del SNP rs11466657;

   donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide juvenil, espondiloartropatia, uveítis y enfermedad de Behcet's.
4. 5. Método in vitro para determinar la gravedad y/o el pronóstico de la enfermedad en un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, donde dicho método comprende la etapa a) según la reivindicación 1;

   donde la presencia del alelo (G) en al menos uno de los alelos en el locus del SNP rs11466657 es indicativo de enfermedad severa; y

   donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, slndrome de Sj6gren, artritis reumatoide juvenil, espondiloartropatia, uveítis y enfermedad de Behcet's.

5. 6.

   El método según la reivindicación 5 donde la presencia del alelo (G) en ambos alelos es indicativo de enfermedad severa.

6. 7.

   Método in vitro para obtener datos útiles para determinar la respuesta clínica de un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad inflamatoria, a un agente anti-TNFa, la gravedad y/o el pronóstico de dicha enfermedad donde dicho método comprende la etapa a) según la reivindicación 1;

   donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sj6gren, artritis reumatoide juvenil, espondiloartropatia, uveítis y enfermedad de Behcet's.

7. 8.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sujeto es positivo para anticuerpos anti-péptido citrulinado (ACPA).

8. 9.

   El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra biológica es una muestra de sangre,

9. 10.

   El método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el genotipo de SNP rs11466657 se determina mediante secuenciaci6n directa o PCR cuantitativa.

10. 11 . El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho método además comprende almacenar los resultados del método en un dispositivo de almacenamiento de datos.

11. 12.

    Método implementado por ordenador, en el que el método es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 .

12. 13.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho agente anti-TNFa es seleccionado del grupo que consiste en etanercept, adalimimab, infliximab, gotimumab, certolizumab, rituximab, abatacept, anakinra and tocizumab ..

13. 14.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde dicho agente anti-TNFa es infliximab.

14. 15.

    Uso de infliximab en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, que tiene o se sospecha que tiene dicha enfermedad inflamatoria, en el que dicho sujeto presenta el alelo (A) en ambos alelos en elloeus del SNP rsl 1466657,

    donde dicha enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis psoriasica, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjógren, artritis reumatoide juvenil, espondiloartropatia, uvertis y enfermedad de Behcet's.

15. 16.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 140 el uso de infliximab según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad inflamatoria es la artritis reumatoide.

16. 17.

    El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 16,0 el uso de infliximab según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en el que dicho sujeto es un sujeto humano.

17. 18.

    Kit para determinar en una muestra biológica aislada de un sujeto el genotipo de

    SNP rsl1466657, que comprende : -un reactivo para determinar el genotipo del SNP rs11466657; -opcionalmente, instrucciones para el uso de dicho reactivo en la

    determinación del genotipo del SNP rs11466657 en una muestra biológica aislada.

18. 19.

    El kit según la reivindicación 18, en el que dicho reactivo es un cebador y/o sonda específico de SEO ID NO: 1 que amplifique una región que comprenda el SNP r511466657.

19. 20.

    El kit según la reivindicación 19 donde dicho cebador y/o sonda específico se selecciona del grupo que consiste en SEO ID NO: 3, SEO ID NO: 4, y secuencias idénticas a cualquiera de las mismas en al menos 75%.

20. 21 . Uso de un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para predecir la respuesta cllnica de un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, para identificar un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria con riesgo de no responder a un tratamiento con un agente anti-TNFa, para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene una enfermedad inflamatoria, y/o para determinar la gravedad y/o el pronóstico de una enfermedad inflamatoria en un sujeto.
21. 3.