ES2656353T3 - Nuevas aplicaciones de HIP/PAP o derivados de la misma - Google Patents

Abstract

La proteína "HIP/PAP" o un derivado proteico de la misma para uso en la prevención o el tratamiento de una lesión cerebral neonatal, que incluye una lesión cerebral neonatal provocada por hipoxia cerebral, en donde la proteína "HIP/PAP" comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de aminoácidos con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los polipéptidos de SEQ ID Nº 1 a 3,

Description

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de un residuo de aminoácido, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína HIP/PAP de referencia.

Tal como se pretende en esta memoria, un derivado proteico HIP/PAP es biológicamente activo. Tal como se pretende en esta memoria, un derivado proteico HIP/PAP abarca una porción biológicamente activa de una proteína HIP/PAP.

Un derivado "biológicamente activo" de una proteína HIP/PAP incluye un péptido derivado de HIP/PAP que posee una o más de las siguientes actividades biológicas: -(i) prevenir in vitro la muerte de células neuronales inducida por N-metil-D-aspartato (NMDA) en cultivos neuronales primarios de ratones, particularmente en cultivo primario de neuronas corticales de ratones y en cultivo primario de células granulares de cerebelo de ratones; -(ii) prevenir in vivo las lesiones excitotóxicas provocadas por el análogo glutamanérgico ibotenato en el cerebro en desarrollo, por ejemplo, el cerebro en desarrollo de ratones; -(iii) poseer un efecto de rescate in vivo sobre las lesiones excitotóxicas provocadas por el análogo glutamanérgico ibotenato en el cerebro en desarrollo, p. ej., el cerebro en desarrollo de ratones; -(iv) afectar la neuroprotección contra la muerte de células neuronales neonatales inducida por una especie de oxígeno reactivo tal como peróxido de hidrógeno (H2O2). -(v) prevenir in vitro los daños inducidos por H2O2 en células granulares primarias del cerebelo de ratones y -(vi) inducir cambios en la producción, fosforilación y distribución de Gap-43.

Un derivado "biológicamente activo" de una proteína HIP/PAP con una actividad biológica seleccionada entre (i) -(v) anterior, no está necesariamente dotado del mismo orden de magnitud de dicha o dichas actividades biológicas, con la condición de que dicho derivado de proteína HIP/PAP posea una o más de las actividades biológicas (i) -(iv) anteriores a un nivel detectable, utilizando los ensayos descritos en los ejemplos de esta memoria.

En algunas realizaciones, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma, incluyendo una porción biológicamente activa de HIP/PAP tal como se describe arriba, puede aislarse de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales.

En otras realizaciones, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma, incluyendo una porción biológicamente activa de HIP/PAP tal como se describe arriba, puede producirse por técnicas de ADN recombinante que son familiares para un experto en la técnica.

De acuerdo con realizaciones adicionales, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma, incluyendo una porción biológicamente activa de HIP/PAP tal como se describe arriba, puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas de síntesis de péptidos convencionales.

Una proteína HIP/PAP aislada o purificada o un derivado de la misma, incluyendo una porción biológicamente activa de HIP/PAP tal como se describe arriba, está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de contaminación de la fuente celular o tisular de la que se deriva dicha proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos cuando se sintetiza químicamente.

Derivados de proteína HIP/PAP también abarcan proteínas HIP/PAP quiméricas o de fusión. Tal como se utiliza en esta memoria, una proteína quimérica o una proteína de fusión comprenden los polipéptidos citados anteriormente que están condensados a un polipéptido que no es HIP/PAP. Dentro de la proteína de fusión, el polipéptido HIP/PAP y el polipéptido no HIP/PAP están condensados entre sí. El polipéptido no HIP/PAP puede fusionarse al extremo N o al extremo C del polipéptido HIP/PAP.

Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-HIP/PAP en la que la secuencia de HIP/PAP se fusiona con el extremo C de la secuencia de GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de HIP/PAP recombinante.

En todos los casos, las proteínas de fusión de la invención son "biológicamente activas" de acuerdo con la definición anterior de esta expresión en esta memoria, que incluye que dichas proteínas de fusión poseen la misma actividad biológica que la HIP/PAP de SEQ ID Nº 3.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos para los fines de la presente invención, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos. Por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos para una alineación óptima y las secuencias no homólogas pueden despreciarse para fines de comparación.

Para fines de comparación óptimos, el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos se puede lograr con CLUSTAL W (versión 1.82) con los siguientes parámetros: (1) MODO CPU = ClustalW mp; (2) ALINEACIÓN = «lleno»; (3) FORMATO DE SALIDA = «aln w/números»; (4) ORDEN DE SALIDA = «alineado»; (5) ALINEACIÓN DE COLOR = «no»; (6) KTUP (tamaño de palabra) = «por defecto»; (7) LONGITUD DE VENTANA = «por defecto»; (8)

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TIPO DE PUNTUACIÓN = «porcentaje»; (9) TOPDIAG = «por defecto»; (10) PAIRGAP = «por defecto»; (11) ÁRBOL FLOLOGENÉTICO/TIPO DE ÁRBOL = «ninguno»; (12) MATRIZ = «por defecto»; (13) HUECO ABIERTO = «por defecto»; (14) HUECOS EXTREMOS = «por defecto»; (15) EXTENSIÓN DE HUECO = «por defecto»; (16) DISTANCIAS DE HUECO = «por defecto»; (17) TIPO DE ÁRBOL = «cladograma» y (18) DISTANCIAS DE GRAPS DE ÁRBOL = «ocultar».

Porciones biológicamente activas de HIP/PAP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de HIP/PAP de cualquiera de las SEQ ID Nº 1 a 3, que incluyen el mismo número de aminoácidos que la correspondiente HIP/PAP de longitud completa, y exhiben al menos la misma actividad biológica que HIP/PAP.

Porciones biológicamente activas de HIP/PAP incluyen péptidos adicionales que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a la secuencia de aminoácidos de longitud completa de HIP/PAP de una cualquiera de las SEQ ID Nº 1 a 3, que incluyen más aminoácidos que la correspondiente HIP/PAP de longitud completa, y exhiben al menos la misma actividad biológica que HIP/PAP.

Además de variantes alélicas que se producen de forma natural de la porción biológicamente activa de secuencias de HIP/PAP que existen en mamíferos, la persona experta en la técnica apreciará además que pueden introducirse cambios por mutación en la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de SEQ ID N° 1 a 3, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de HIP/PAP sin alterar la actividad biológica de HIP/PAP.

Además, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos no esenciales en las secuencias correspondientes a una proteína HIP/PAP. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo de aminoácido que puede alterarse a partir de la secuencia de tipo salvaje de HIP/PAP sin alterar la actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de aminoácido "esencial" para la actividad biológica.

Generalmente, los derivados de proteínas HIP/PAP abarcan sustancias que comprenden una proteína HIP/PAP o una porción biológicamente activa de HIP/PAP de la misma.

En determinadas realizaciones de estos derivados proteicos HIP/PAP, la proteína HIP/PAP de la porción biológicamente activa de HIP/PAP de la misma puede combinarse o asociarse con la porción no HIP/PAP de la misma a través de enlaces no covalentes. Realizaciones ilustrativas abarcan liposomas que comprenden una proteína HIP/PAP o una porción biológicamente activa de HIP/PAP de la misma, en donde la parte no HIP/PAP de la misma consiste en las partículas de liposomas en sí mismas. Dependiendo del tipo de liposomas que se consideren o, alternativamente, dependiendo del procedimiento utilizado para fabricar dichos liposomas, la proteína HIP/PAP o la porción biológicamente activa de la misma, puede estar localizada en la superficie del liposoma (p. ej., expuesta al entorno externo del liposoma) o alternativamente encapsulado en el mismo.

En determinadas otras realizaciones de estos derivados de proteína HIP/PAP, la proteína HIP/PAP de la porción biológicamente activa de HIP/PAP de la misma puede combinarse o asociarse con la porción no HIP/PAP de la misma a través de enlaces no covalentes. De forma ilustrativa, la proteína HIP/PAP PAP, o la porción biológicamente activa de la misma, puede unirse covalentemente a una porción no HIP/PAP seleccionada de una proteína o a un compuesto no proteína tal como una molécula de polietilenglicol, en donde el derivado de HIP/PAP final consiste en una HIP/PAP pegilada o una porción biológicamente activa pegilada de la misma.

En un derivado de proteína HIP/PAP que se considera en su estado antes de su administración a un paciente que lo necesite, dicho derivado de proteína puede no ser "biológicamente activo", con la condición de que dicha proteína HIP/PAP sea biológicamente activa una vez administrada a dicho paciente.

Además, en un derivado de proteína HIP/PAP que se considera en su estado anterior a su administración a un paciente que lo necesite, dicho derivado de proteína puede ser ya "biológicamente activo".

Generalmente, cuando se utiliza para prevenir o tratar una lesión cerebral, o para cualquier otro uso de HIP/PAP descrito en esta memoria, una proteína HIP/PAP o un derivado de proteína de la misma está comprendido en una composición farmacéutica en una cantidad efectiva, en combinación con uno o más excipientes fisiológicamente aceptables.

Sin desear estar ligados a teoría particular alguna, los autores de la invención creen que la proteína HIP/PAP completa de la secuencia SEQ ID Nº 2, es decir, un polipéptido que comprende la secuencia CRD, y un pro-péptido, conduce a un mejor plegamiento de dicha proteína, particularmente cuando dicha proteína se produce a través de técnicas recombinantes de ADN en células eucariotas que han sido transfectadas con un casete de expresión que lo codifica. Incidentalmente, un plegamiento correcto de la HIP/PAP terapéuticamente activa puede mejorar la eficacia biológica de la composición farmacéutica que comprende dicha proteína, para prevenir o tratar una lesión cerebral provocada por hipoxia, en comparación con una composición que comprende sólo una parte de la proteína.

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Sin embargo, otras formas de una proteína HIP/PAP que incluyen las formas polipeptídicas de SEQ ID Nº 1 y 2, así como uno cualquiera de los derivados de HIP/PAP descritos en la presente memoria descriptiva, pueden utilizarse in vitro e in vivo, incluso si estos polipéptidos no consisten necesariamente en las realizaciones más preferidas de la presente invención.

En un aspecto más general, la presente divulgación se refiere al uso de una proteína HIP/PAP en un método para tratar la lesión cerebral neonatal provocada por una hipoxia cerebral. Sin desear estar ligado a teoría particular alguna, los autores de la invención creen que los diversos efectos de la proteína HIP/PAP sobre la lesión cerebral neonatal in vitro e in vivo que se describen en esta memoria también pueden ser útiles en situaciones patofisiológicas muy específicas del cerebro adulto o infantil, seleccionadas del grupo que consiste en accidentes cerebrovasculares.

Por lo tanto, dicha lesión cerebral en adultos o niños consiste en un accidente cerebrovascular, que también puede denominarse apoplejía.

Un accidente cerebrovascular o apoplejía consiste en una pérdida rápida de funciones del cerebro debida a una alteración en los vasos sanguíneos que suministran sangre al cerebro. Un accidente cerebrovascular abarca (i) una isquemia provocada por trombosis o embolia, que también puede denominarse "apoplejía isquémica" y (ii) una isquemia debido a una hemorragia, que también puede denominarse "apoplejía hemorrágica". Al igual que la lesión cerebral neonatal, un accidente cerebrovascular o apoplejía puede provocar daño neurológico permanente y puede conducir a la muerte. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, un accidente cerebrovascular o apoplejía consiste en un déficit neurológico de causa cerebrovascular que persiste más allá de las 24 horas o se interrumpe por la muerte en el espacio de 24 horas.

Un accidente cerebrovascular o apoplejía abarca apoplejía trombótica, apoplejía embólica, isquemia provocada por una disfunción cardíaca, hipoperfusión sistémica, trombosis venosa y hemorragia intracerebral.

Las lesiones cerebrales traumáticas provocan generalmente un deterioro del flujo de oxígeno en el cerebro como resultado de hemorragias cerebrales, hematomas o edema.

En algunas realizaciones, la lesión traumática cerebral en adultos o niños pertenece a lesiones cerebrales provocadas por hipoxia.

La lesión cerebral traumática (TBI) se produce cuando un trauma físico lesiona el cerebro y generalmente se clasifica como leve, moderada o grave, dependiendo del grado de pérdida de conciencia, pérdida de memoria y puntuación en una escala neurológica después de la lesión. El diagnóstico y la escala de la lesión cerebral traumática se realizan de forma convencional mediante un método seleccionado del grupo que consiste en la Escala de Coma de Glasgow (GCS) (Arlinghaus et al., 2005, Textbook of Traumatic Brain Injury, Washington, DC: American Psychiatric Association, págs..; 59 -62), un método de determinación de la duración de la amnesia post-traumática (PTA por sus siglas en inglés) y un método para determinar a escala la pérdida de conciencia (LOC por sus siglas en inglés) (Rao et al., 2000, Psychosomatics, Vol. 41 (n° 2) : 95-103). En general, se acepta que una TBI con una GCS de 13 o más es leve, mientras que una GCS de 9 a 12 es moderada y una GCS de 8 o menos es grave. De forma ilustrativa, se determina una puntuación de GCS de 13 a 15 para una persona cuya duración de amnesia posttraumática (PTA) es inferior a 24 horas y cuya duración de la pérdida de conciencia (LOC) oscila entre 0 y 30 minutos. Todavía ilustrativamente, se determina una puntuación GCS de 9 a 12 para una persona cuya duración de amnesia post-traumática (PTA) oscila entre 1 y 7 días y cuya duración de la pérdida de conciencia (LOC) oscila entre 30 minutos y 24 horas. Aún ilustrativamente, se determina una puntuación de GCS de 3 a 8 para una persona cuya duración de amnesia post-traumática (PTA) es de más de 7 días y cuya duración de la pérdida de conciencia (LOC) es de más de 24 horas.

Entre las similitudes fisiológicas entre la lesión cerebral traumática y la lesión cerebral neonatal, la lesión cerebral traumática TBI va acompañada de hemorragias debido a la ruptura de los vasos sanguíneos la cual provoca hipoxia.

La proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma pueden utilizarse para prevenir o tratar lesiones cerebrales traumáticas que tienen puntuaciones de clasificación GCS que varían de 3 a 15. Por lo tanto, la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma se puede utilizar para prevenir o tratar lesiones cerebrales traumáticas seleccionadas del grupo que consiste en TBI "leve" (puntuación GSC que varía de 13 a 15), TBI moderada (puntuación GCS que varía de 9 a 12) y TBI grave (puntuación GSC que varía de 3 a 8). Típicamente, las TBI leves tienen una puntuación GCS que varía de 13 a 15, una puntuación PTA de menos de una hora y una puntuación LOC inferior a 30 minutos. Típicamente, las TBI moderadas tienen una puntuación GCS que varía de 9 a 12, una puntuación PTA que varía de 30 minutos a 24 horas y una puntuación LOC que varía de 1 a 24 horas. Típicamente, las TBI graves tienen una puntuación GCS que varía de 3 a 8, una puntuación PTA de más de un día y una puntuación LOC de más de un día.

Se cree que una proteína HIP/PAP demostrará ser terapéuticamente útil en métodos para tratar la TBI en general, independientemente de la puntuación de GSC que se haya determinado para el paciente a tratar.

La utilidad terapéutica de HIP/PAP para tratar la TBI abarca el tratamiento de la lesión cerebelosa traumática directa es mucho menos común que las TBIs frontales o temporales. Sin embargo, el cerebelo se ve afectado a menudo, incluso cuando la lesión inicial no implica directamente a esta estructura. Dicha lesión indirecta puede inducir una pluralidad de trastornos neurológicos que incluyen inestabilidad postural, temblor, alteraciones en el equilibrio y habilidades motoras finas y déficits cognitivos. Incluso si las causas del daño indirecto al cerebelo que resultan de un trauma supratentorial no se comprenden completamente, varios estudios sugieren la implicación de excitotoxicidad (liberación excesiva del neurotransmisor glutamato) en la transmisión del daño al cerebelo (Potts et al., Cerebellum, 2009, (8), 211-221).

Sin desear estar ligados a teoría particular alguna, los autores de la invención creen que una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma puede proteger las neuronas del cerebelo del daño indirecto del cerebelo que resulta de la TBI en pacientes infantiles o adultos al proteger a la célula cerebelosa de la excitotoxicidad.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva también se refiere al uso de una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma para tratar o prevenir la lesión del cerebelo traumática indirecta que resulta de la TBI.

Se cree que la proteína HIP/PAP debe administrarse a los pacientes afectados con TBI durante la fase aguda, aunque también se puede administrar durante la fase crónica.

La TBI abarca TBI focal o difusa. La TBI difusa incluye edema y lesión axonal difusa, que es un daño generalizado a los axones, incluidos los tractos de materia blanca y la proyección a la corteza. La TBI difusa también abarca una conmoción cerebral y una lesión axonal difusa, un daño generalizado a los axones en zonas que incluyen la materia blanca y los hemisferios cerebrales.

Para la TBI focal, las zonas más comunes para tener lesiones focales en TBI penetrante son la corteza orbitofrontal y los lóbulos temporales anteriores, que consisten en zonas que están implicadas en el comportamiento social, la regulación de emociones, el olfato y la toma de decisiones. Un tipo de lesión focal, laceración cerebral, se produce cuando el tejido cerebral se corta o se desgarra.

Lesiones cerebrales traumáticas incluyen, sin limitación, TBI frontal, TBI temporal, TBI cerebelosa directa y TBI cerebelosa indirecta.

Como ya se mencionó en la presente memoria descriptiva, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma puede proteger a las neuronas cerebelosas in vitro de la muerte oxidativa y excitotóxica.

Sin desear estar ligado por teoría particular alguna, los autores de la invención creen que una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma puede proteger a las neuronas cerebelosas de la muerte que se produce en diversos trastornos cerebelosos tales como las ataxias cerebelosas.

En tales condiciones, se puede observar una atrofia cerebelosa.

Por lo tanto, la presente memoria descriptiva también se refiere al uso de una proteína HIP/PAP o a un derivado de la misma para tratar o prevenir una ataxia cerebelosa.

Tal como se utiliza en esta memoria, la ataxia cerebelosa se refiere a la disfunción del cerebelo. Las ataxias cerebelosas pueden provocar una diversidad de déficits neurológicos elementales tales como hipotonía antagonista, asinergia, dismetría, discronometría y disdiadococinesia.

Las ataxias cerebelosas abarcan ataxias espinocerebelosas heredadas y ataxias cerebelosas adquiridas.

En alguna realización, la presente memoria descriptiva se refiere al uso de una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma para tratar ataxias espinocerebelosas inherentes.

Las ataxias espinocerebelosas inherentes incluyen, sin limitación, ataxias espinocerebelosas autosómicas dominantes (SCA por sus siglas en inglés) y ataxias espinocerebelosas autosómicas recesivas.

Ejemplos de ataxias espinocerebelosas autosómicas dominantes incluyen SCA1 (autosómica dominante tipo 1), SCA2, SCA3, SCA4, SCA6, SCA7, SCA8, SCA9, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, ataxia episódica tipo 1 (EA-1) y ataxia episódica tipo 2 (EA-2).

Las ataxias espinocerebelosas autosómicas recesivas incluyen, sin limitación, ataxia de Friedreich, ataxia telangiectasia y ataxia espinocerebelosa de aparición infantil.

En algunas realizaciones, la presente memoria descriptiva se refiere al uso de una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma para tratar y prevenir las ataxias cerebelosas adquiridas.

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Las ataxias cerebelosas adquiridas incluyen, sin limitación, el síndrome paraneoplásico, las ataxias cerebelosas inducidas por intoxicación, las ataxias infecciosas y las ataxias cerebelosas vasculares.

La ataxia cerebelosa inducida por intoxicación puede ser provocada por la exposición a tóxicos tales como disolventes, gasolina y metales pesados, la ingesta de productos tales como alcohol, barbitúricos o litio y fármacos quimioterapéuticos citotóxicos.

Las ataxias infecciosas abarcan ataxias provocadas por infecciones virales, bacterianas o priónicas.

Por ejemplo, las ataxias cerebelosas infecciosas virales pueden ser el resultado de encefalopatías virales y postvirales.

Las ataxias cerebelosas infecciosas bacterianas incluyen, sin limitación, ataxias resultantes de la sífilis meningovascular o la enfermedad de Lyme.

Las ataxias vasculares incluyen, sin limitación, ataxias provocadas por accidente cerebrovascular isquémico, incluyendo infarto cerebeloso, hemorragia o hematoma subdural.

Tal como se utiliza en esta memoria, "lesión cerebral", independientemente de si dicha lesión cerebral consiste en una lesión cerebral neonatal, una lesión cerebral infantil o una lesión cerebral en adultos, no abarca lesiones cerebrales que son provocadas inicialmente por una desmielinización de células neuronales. En otras palabras, "lesión cerebral" no abarca las lesiones provocadas al cerebro por una enfermedad desmielinizante, independientemente del tipo de enfermedad desmielinizante, p. ej., enfermedad autoinmune o hereditaria. Por lo tanto, como se pretende en esta memoria, "lesión cerebral" no abarca una lesión cerebral provocada por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Guillain-Barré, mielinosis central pontina, enfermedad de Tay-Sachs, así como enfermedades desmielinizantes heredadas tales como enfermedades por leucodistrofia y de Charcot Marie Tooth. Tal como se utiliza en esta memoria, las enfermedades de leucodistrofia abarcan adrenoleucodistrofia (clasificación de la OMS n° E71.3), adrenomieloneuropatía (clasificación de la OMS n° E71.3), leucodistrofia metacromática (clasificación de la OMS n° E75.2), enfermedad de Krabbe (clasificación de la OMS n° E75.2), enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (clasificación de la OMS n° E75.2), enfermedad de Canavan, ataxia infantil con hipomelinación central (CACH por sus siglas en inglés), leucoencefalopatía con materia blanca que se desvanece, enfermedad de Alexander, enfermedad de Refsum (clasificación de la OMS n° G60.1), enfermedad de Zellweger, síndrome de Aicardi-Goutieres, leucodistrofia megaloencefálica y xantomatosis cerebrotendinosa.

Como ya se mencionó en la presente memoria descriptiva, debido a la actividad de HIP/PAP en la producción o fosforilación de Gap-43 que se ha mostrado aquí, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma también se puede utilizar in vitro e in vivo para la modulación, potenciación o mejora del crecimiento neuronal o la plasticidad mediada por Gap-43, una proteína neuronal relacionada con el crecimiento.

Por lo tanto, esta invención también concierne al uso de la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma para prevenir o tratar un trastorno o una enfermedad que implica un defecto o una desregulación de la producción de Gap-43 o un defecto o una desregulación de la fosforilación de Gap-43. que incluye la enfermedad de Alzheimer.

Merece la pena mencionar que ya se ha alegado en la técnica que las proteínas relacionadas con HIP/PAP son útiles para actuar sobre la enfermedad de Alzheimer, pero sin ningún resultado experimental de partida que respalde técnicamente tales alegaciones de actividad.

En contraposición, la actividad biológica de una proteína HIP/PAP en la producción o en la fosforilación de la proteína Gap-43 sustenta por primera vez la utilidad de dicha proteína HIP/PAP para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.

De hecho, es bien sabido por el experto en la técnica que en la enfermedad de Alzheimer se produce un defecto en la producción o en la fosforilación de la proteína Gap-43. De manera notable, se ha demostrado en la técnica que la producción de una proteína Gap-43 inactiva está implicada en pacientes afectados con una enfermedad de Alzheimer. Además, una fosforilación alterada de Gap-43 se ha mostrado previamente en la técnica en pacientes afectados con una enfermedad de Alzheimer.

Por lo tanto, esta memoria descriptiva también se refiere al uso de una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma para prevenir o tratar una enfermedad de Alzheimer.

La presente memoria descriptiva también concierne a un método para prevenir o tratar una enfermedad de Alzheimer que comprende una etapa de administrar, a un paciente que lo necesita, una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma.

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Esta memoria descriptiva también se refiere al uso de la proteína HIP/PAP o un derivado de proteico de la misma para prevenir o tratar estados patológicos que preceden a la aparición de la enfermedad de Alzheimer per se, que incluye deterioro cognitivo mental.

En otras palabras, esta memoria descriptiva también se refiere al uso de la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma para prevenir o tratar deficiencias cognitivas mentales que se producen antes de la enfermedad de Alzheimer per se.

Debido a que se ha demostrado en los ejemplos en esta memoria que una proteína HIP/PAP tiene la capacidad de rescatar células neuronales in vitro, entonces también se ha demostrado que una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma es útil como agente para mantener o mejorar la viabilidad o el crecimiento de células neuronales cultivadas. Entonces, los resultados de los ejemplos de esta memoria respaldan la utilidad de una proteína HIP/PAP

o de un derivado de la misma como un agente de cultivo de células neuronales que puede añadirse a un medio de cultivo de células neuronales.

Esta memoria descriptiva también abarca el uso de una proteína HIP/PAP para el cultivo in vitro de células neuronales, incluyendo cultivos primarios de células neuronales y cultivos de líneas celulares neuronales.

La presente memoria descriptiva también pertenece a un medio de cultivo para células neuronales que comprende una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma. Aparte de la presencia de una proteína HIP/PAP o de un derivado de la misma, la constitución cualitativa y cuantitativa de un medio de cultivo apropiado se determina fácilmente por un experto en la técnica. De forma ilustrativa, la proteína HIP/PAP o el derivado de la misma se pueden añadir simplemente a un medio de cultivo conocido, adecuado para células neuronales, p. ej., en un medio de cultivo RPMI

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Dicho medio de cultivo comprende una cantidad efectiva de dicha proteína HIP/PAP o de dicho derivado de la misma. La concentración final de una proteína HIP/PAP o un derivado de la misma en un medio de cultivo de arriba oscila preferiblemente entre 1 ng/mL y 10 mg/ml.

Con respecto a los usos in vivo, la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma está preferiblemente comprendida como un ingrediente activo en una composición farmacéutica.

Dicha composición farmacéutica comprende la proteína HIP/PAP, o un derivado proteico de la misma, y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Dicha composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de la proteína HIP/PAP, o un derivado proteico de la misma.

Habitualmente, una composición farmacéutica que se puede utilizar de acuerdo con la invención comprende de 0,1% en peso a 99,9% en peso de la proteína HIP/PAP, o un derivado proteico de la misma, basado en el peso total de la composición farmacéutica. Por lo tanto, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender al menos 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% en peso o más de la proteína HIP/PAP, o un derivado proteico de la misma, basado en el peso total de la composición farmacéutica. También, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender hasta 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% en peso o menos de uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, basado en el peso total de la composición farmacéutica.

La dosis terapéuticamente eficaz de la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma variará, por supuesto, dependiendo de factores tales como la afección patológica a tratar (incluida la prevención), el método de administración, el tipo de compuesto que se esté utilizando para el tratamiento, cualquier co-terapia implicada, la edad del paciente, el peso, la condición médica general, el historial médico, etc., y su determinación está dentro de las habilidades de un médico en ejercicio. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta valore la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el máximo efecto terapéutico. El médico administrará la proteína HIP/PAP o un derivado proteico de la misma hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado para el tratamiento de la afección en cuestión.

La afección a tratar se refiere a una de las afecciones patológicas que se describen en la presente solicitud tales como una lesión cerebral neonatal provocada por hipoxia, una lesión cerebral en adultos o niños provocada por hipoxia tal como accidente cerebrovascular, TBIs y trastornos cerebelosos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "paciente" se refiere a un paciente recién nacido, un paciente infantil

o un paciente adulto, incluyendo este último a una paciente embarazada.

Tal como se utiliza en esta memoria más particularmente, una cantidad eficaz de la proteína HIP/PAP o del derivado proteico de la misma consiste en la cantidad de proteína HIP/PAP o derivado de la misma que puede revertir, al

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menos parcialmente, los daños físicos provocados al cerebro durante una lesión del cerebro de un recién nacido. Particularmente, una cantidad eficaz de la proteína HIP/PAP o del derivado proteico de la misma consiste en la cantidad de proteína HIP/PAP o derivado de la misma que reduce o bloquea la muerte de células neuronales que se produce durante la lesión cerebral neonatal.

Partiendo de los resultados mostrados en los ejemplos de esta memoria, la cantidad efectiva de la proteína HIP/PAP

o del derivado proteico de la misma puede oscilar entre aproximadamente 0,1 μg/kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, una cantidad efectiva de la proteína HIP/PAP o del derivado proteico de la misma abarca cantidades de al menos 1 μg/kg, 2 μg/kg, 3 μg/kg, 4 μg/kg, 5 μg/kg, 6 μg/kg, 7 μg/kg, 8 μg/kg, 9 μg/kg, 10 μg/kg, 15 μg/kg, 20 μg/kg, 20 μg/kg, 30 μg/kg, 40 μg/kg, 50 μg/kg, 60 μg/kg, 70 μg/kg, 80 μg/kg, 90 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg, 300 μg/kg, 400 μg/kg, 500 μg/kg, 600 μg/kg, 700 μg/kg, 800 μg/kg, 900 μg/kg, 1 mg/kg o más de peso corporal del paciente.

En el caso de una lesión neonatal, el término "paciente" se refiere al paciente recién nacido, incluido el feto, así como a la paciente embarazada.

Para prevenir o tratar una lesión cerebral neonatal en el cuerpo del feto, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra preferiblemente al cuerpo adulto gestante. Sin embargo, en algunas realizaciones, dicha composición farmacéutica puede administrarse directamente al cuerpo del feto, utilizando instrumentación médica de endoscopia específica.

Para prevenir o tratar una lesión cerebral neonatal del neonato durante el parto o posterior al parto, así como para prevenir o tratar una lesión cerebral del adulto, se administra una composición farmacéutica de acuerdo con la invención al cuerpo neonato o al cuerpo del adulto, respectivamente.

En determinadas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra sistémicamente.

En otras determinadas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra localmente a través de una ruta intracraneal, especialmente al cuerpo del feto o al cuerpo del recién nacido en el que la formación del hueso del cráneo no está terminada.

La ruta de la proteína HIP/PAP o del derivado proteico de la misma está de acuerdo con métodos conocidos, p. ej., mediante inyección o infusión por vía intravenosa, intramuscular, intracerebral, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, oral, tópica o rutas de inhalación, o mediante sistemas de liberación sostenida tal como se indica más adelante.

En algunas realizaciones, la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma o, alternativamente, la composición farmacéutica que la contiene, se administra como una dosis única.

En algunas otras realizaciones, la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma o, alternativamente, la composición farmacéutica que la contiene, se administra como una pluralidad de dosis a intervalos de tiempo determinados, p. ej., comenzando desde el momento del diagnóstico de lesión cerebral o desde el momento en que se diagnostica la expectativa de lesión cerebral, y hasta el momento en que el cuerpo tratado está fuera de peligro.

En determinadas realizaciones de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma se puede combinar con uno o más de otros ingredientes activos útiles para prevenir

o tratar una lesión cerebral provocada por una hipoxia cerebral, incluyendo uno o más ingredientes activos ya conocidos en la técnica por ser útiles para prevenir o tratar una lesión cerebral neonatal.

Composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención pueden prepararse para el almacenamiento mezclando la molécula deseada que tiene el grado apropiado de pureza con soportes, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. comp. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Soportes, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico, alquil-parabenos tales como metil-o propilparabeno; catecol, resorcinol, ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina

o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (p. ej., complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN.TM., PLURONICS.TM. o polietilenglicol (PEG).

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Ejemplos adicionales de soportes de este tipo incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales

o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrógeno-fosfato disódico, hidrógeno-fosfato de potasio, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa y polietilenglicol. Soportes para formas tópicas o basadas en gel de la HIP/PAP o sustancias derivadas de la misma de acuerdo con la invención incluyen polisacáridos tales como carboximetilcelulosa sódica o metilcelulosa, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, se utilizan adecuadamente formas de depósito convencionales. Tales formas incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, emplastos, formas de inhalación, aerosoles nasales, tabletas sublinguales y preparaciones de liberación sostenida. La proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma se formulará típicamente en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

La proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. La proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en solución si se administra por vía sistémica. Si está en forma liofilizada, la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma se formula típicamente en combinación con otros ingredientes para la reconstitución con un diluyente apropiado en el momento del uso. Un ejemplo de una formulación líquida de la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma es una solución no conservada estéril, transparente e incolora, cargada en un vial de dosis única para inyección subcutánea. Composiciones farmacéuticas conservadas adecuadas para uso repetido pueden contener, por ejemplo, dependiendo principalmente de la indicación y del tipo de polipéptido:

a) la proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma;

b) un tampón capaz de mantener el pH en un intervalo de estabilidad máxima del polipéptido u otra molécula en solución, preferiblemente alrededor de 4-8;

c) un detergente/tensioactivo, principalmente para estabilizar el polipéptido o la molécula contra la agregación inducida por la agitación;

d) un isotonificador;

e) un conservante seleccionado del grupo de fenol, alcohol bencílico y un haluro de bencetonio, p. ej., cloruro; y

f) agua.

Si el detergente empleado es no iónico, puede ser, por ejemplo, polisorbatos (p. ej., Polysorbate®, Tween®) 20,80, etc.) o poloxámeros (p. ej., Poloxamer®. 188). El uso de tensioactivos no iónicos permite que la formulación se exponga a tensiones superficiales de cizallamiento sin provocar la desnaturalización del polipéptido. Además, tales formulaciones que contienen tensioactivo se pueden emplear en dispositivos de aerosol tales como los utilizados en una dosificación pulmonar, y pistolas de inyección de chorro sin aguja (véase, p. ej., el documento EP 257.956).

Puede estar presente un isotonificador para asegurar la isotonicidad de una composición líquida de la proteína HIP/PAP o del derivado proteico de la misma, e incluye alcoholes de azúcar polihídricos, preferiblemente alcoholes trihídricos o de azúcar superiores, tales como glicerol, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Estos alcoholes de azúcar se pueden utilizar solos o en combinación. Alternativamente, se puede utilizar cloruro sódico u otras sales inorgánicas apropiadas para hacer que las soluciones sean isotónicas.

El tampón puede ser, por ejemplo, un tampón acetato, citrato, succinato o fosfato, dependiendo del pH deseado. El pH de un tipo de formulación líquida de esta invención está tamponado en el intervalo de aproximadamente 4 a 8, de preferencia aproximadamente pH fisiológico.

Los conservantes fenol, alcohol bencílico y haluros de bencetonio, p. ej., cloruro, son agentes antimicrobianos conocidos que se pueden emplear.

Las composiciones de la proteína terapéutica HIP/PAP o derivado proteico de la misma se colocan generalmente en un recipiente que tiene una lumbrera de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las formulaciones se administran preferentemente como inyecciones intravenosas (i.v.), subcutáneas (s.c.) o intramusculares (i.m.) repetidas, o como formulaciones en aerosol adecuadas para la administración intranasal o intrapulmonar (para la administración intrapulmonar, véase, p. ej., el documento EP 257.956).

La proteína HIP/PAP o el derivado proteico de la misma también se puede administrar en forma de preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices

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ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-D-(-)-ácido 3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas a lo largo de más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y. Se pueden idear diversas estrategias racionales de estabilización, dependiendo del mecanismo de desnaturalización implicado. Estas estrategias pueden lograrse modificando residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones de carácter ácido, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

La presente invención se ilustra adicionalmente, sin limitación, por los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Se produjo una proteína HIP/PAP humana recombinante en un sistema bacteriano de E. coli, y luego se purificó. El producto resultante se denominó ALF-5755. En comparación con HIP/PAP SEQ ID N° 2, ALF-5755 de SEQ ID N° 3 tiene un solo aminoácido extra, una metionina, en el extremo terminal NH2.

Ejemplo 1: Efectos in vitro de una proteína HIP/PAP en un modelo de lesión cerebral neonatal

A. Materiales y métodos

Cultivo de Neuronas Corticales.

Se prepararon cultivos primarios de neuronas corticales a partir de ratones embrionarios E14.5. En síntesis, los fetos se retiraron del útero y se colocaron en una placa de Petri estéril. Los cerebros se cortaron y se colocaron en HBSS 1x con HEPES 1 M (Invitrogen). Utilizando un microscopio de disección, se diseccionaron cerebros, meninges, ganglios basales e hipocampo y las neocortezas se colocaron en medio Neurobasal que contenía suplemento B27 (Invitrogen). Luego, la neocorteza se disoció con tripsina al 0,25% -EDTA al 0,02% y se incubó con DNasa 1 (Sigma St-Quentin Fallavier, Francia). Las células se sembraron con MEM1X y suero de caballo al 10% a una densidad de 80000 células/pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con poli-DL-ornitina (Sigma St-Quentin Fallavier, Francia). Dos a cuatro horas después de la siembra, el medio se retiró y se sustituyó con Neurobasal plus B27. Tres días más tarde, las células se trataron con 5 μM de AraC (citosina arabinósido) para frenar la proliferación glial. Entre DIV10 y DIV12, las neuronas fueron tratadas durante 8 horas con uno u otro producto:

(i): PBS;

(ii): 3 µg/ml o 5 µg/ml de ALF-5755;

(iii): 300 µM de NMDA;

(iv): 300 μM de NMDA más 10 μM de MK801 o

(v): 300 µM de NMDA y 3 µg/ml o 5 µg/ml de ALF-5755.

Medición de la viabilidad Celular

La viabilidad celular se controló utilizando el ensayo MTS/Formazan (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Charbonnieres, Francia).

Análisis de Transferencia Western.

Se extrajeron proteínas totales de cultivos neuronales tratados (véase más adelante) y del neopalio derecho de crías que habían recibido inyecciones intraparenquimales P5 de PBS, 10 μg de ibotenato, 0,3 μg de ALF-5755 (que se ha determinado como la mejor concentración de ALF-5755) o 10 μg de ibotenato con 0,3 μg de ALF-5755. Se mató a las crías 4, 24, 48 o 120 horas después de la administración de los fármacos. Las proteínas se extrajeron de acuerdo con el protocolo de un kit disponible comercialmente (Cell Signaling Technology). Anti-Total-Gap43 y anti-Ser41-fosfo-Gap43 se utilizaron a una concentración de 1/1000. Para estandarizar la expresión de la proteína entre las muestras, los autores de la invención utilizaron un anticuerpo anti-b-tubulina de cabra (Santa Cruz Biotechnology) a una concentración de 1/10000. Los experimentos de transferencia Western se realizaron por duplicado. Las diferencias en las concentraciones de proteínas entre las muestras se estimaron utilizando ImageJ.

Inmunocitoquímica.

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Para Total Gap-43, FosfoGap43 y las detecciones del cono de crecimiento (2G13), los cultivos celulares tratados se fijaron en PFA al 4% y reaccionaron con anticuerpo anti-Total-Gap43 de pollo (Interchim; 1/200), anticuerpo anti-Ser41-FosfoGap43 de conejo (Novus Biologicals 1/200), anticuerpo anti-Cono de Crecimiento 2G13 de ratón (Novus Biologicals 1/200). La detección de antígenos marcados se realizó con un anticuerpo anti-pollo de burro conjugado con Cy3, anticuerpo anti-conejo de burro conjugado con AMCA y anticuerpo anti-ratón de burro conjugado con Alexa 488 (Jackson Immunoresearch).

Análisis estadístico

Para estudiar el efecto de cada uno de los tratamientos, los datos se analizaron con un test de Kruskal-Wallis.

B. Resultados

Se produjo una proteína HIP/PAP humana recombinante en un sistema bacteriano de E. coli, y luego se purificó. El producto resultante se denominó ALF-5755. En comparación con HIP/PAP SEQ ID N° 2, ALF-5755 de SEQ ID N°3 tiene un único aminoácido extra, una metionina, en el extremo terminal NH2.

Se han realizado estudios bioquímicos, biológicos y funcionales de ALF-5755. Estos establecieron que ALF-5755 exhibía las mismas actividades biológicas, especialmente actividades mitogénicas y antiapoptóticas, como las que se habían demostrado previamente que pertenecían a HIP/PAP en varios modelos animales diferentes.

La eficacia neuroprotectora de ALF-5755, in vitro contra la muerte celular inducida por N-metil-D-aspartato (NMDA), se ha estudiado en cultivos neuronales corticales de ratones primarios.

Las propiedades de neuroprotección in vitro de ALF-5755 han sido evaluadas utilizando un modelo bien establecido de cultivos neuronales primarios (neuronas del hemisferio cerebral de ratones E14 Swiss expuestos a NMDA). Los experimentos se realizaron entre el día 8 y el día 12 desde el inicio del cultivo. Se añadieron dosis de HIP/PAP (que oscilaban entre 150 ng/ml y 10 μg/ml) al medio de cultivo inmediatamente después o 3 horas después del comienzo de una intoxicación de 8 horas por 300 μM de NMDA o por 10, 30, 100 µM de H2O2. La viabilidad celular se midió luego utilizando un ensayo de MTT.

La muerte neuronal después de la exposición a NMDA solo (sin tratamiento con ALF-5755) fue del 60% de las neuronas. El tratamiento con ALF-5755 provocó una disminución significativa, dependiente de la dosis, de la proporción de muerte neuronal. La disminución en la muerte neuronal fue máxima (35% de muerte neuronal frente al 45% sin ALF-5755) a 5 μg/ml de ALF-5755 cuando se añadió inmediatamente después del comienzo del insulto. También se observó un efecto neuroprotector de ALF-5755 cuando se añadió 3 horas después del comienzo del insulto.

La exposición a H2O2 solo induce una disminución dependiente de la dosis de la supervivencia celular por daño oxidativo, que es máxima a 100 μM de exposición (64% de la muerte neuronal). El tratamiento con ALF-5755 revierte total o parcialmente la toxicidad de H2O2. Este efecto protector es máximo para 3 μg/ml de ALF-5755. Los efectos protectores de ALF-5755 fueron equiparables a los observados con catalasa. Los efectos protectores de ALF-5755 se observan si el fármaco se agrega inmediatamente después de H2O2 o 3 horas después del insulto. ALF-5755 muestra propiedades antioxidantes. Estudios de inmunocitoquímica (ICC por sus siglas en inglés) y Transferencia Western (WB por sus siglas en inglés) se realizaron en cultivos neuronales para determinar los efectos de ALF-5755 en la producción, el estado de fosforilación en serina 41 (S41) y la distribución de GAP-43, una proteína implicada en el crecimiento axonal y la plasticidad neuronal.

Cuando se añade inmediatamente después de NMDA, ICC demuestra que ALF-5755 induce una distribución fascicular de procesos neuronales marcados con GAP-43. Este efecto es óptimo a 5 µg/ml y no se observa en los cultivos de control, en cultivos tratados con NMDA o H2O2, o en los cultivos tratados con H2O2 y ALF-5755. Además, ICC demuestra que ALF-5755 induce una expresión incrementada de fosfo-GAP-43 en procesos neuronales, cuando se compara con cultivos de control o con cultivos tratados con NMDA o H2O2 solo.

Los análisis de transferencia Western de extractos de neuronas cultivadas permitieron cuantificar los cambios de los niveles totales de GAP-43 y fosfo-GAP-43. NMDA no indujo cambio significativo alguno en la cantidad de GAP-43. Por el contrario, ALF-5755 solo indujo una disminución dependiente de la dosis de GAP-43 total, pero un aumento significativo de la proporción de GAP-43 fosforilada (fosfo GAP-43/Gap-43 total). El efecto de ALF-5755 en GAP-43 fue aún más pronunciado en cultivos expuestos a NMDA. Estos cambios en el estado de fosforilación de GAP-43 inducidos por ALF-5755 podrían explicar la fasciculación observada en cultivos expuestos a ALF-5755.

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precisa y reproducible de los diámetros fronto-occipitales máximos de las lesiones, que es igual al número de secciones en donde la lesión estaba presente, multiplicada por 20 μm.

B. Resultados

El potencial neuroprotector de ALF-5755 in vivo se evaluó mediante un modelo de ratón de lesiones cerebrales excitotóxicas neonatales que imitaban el daño cerebral asociado con la parálisis cerebral.

El daño cerebral fue inducido por ibotenato, un agonista glutamanérgico que actúa sobre NMDA y receptores metabotrópicos de glutamato. Cuando se inyectó en el neopalio murino en el día postnatal (P) 5, el ibotenato produjo una drástica pérdida neuronal en las capas neocorticales y grandes quistes de la materia blanca periventriculares similares a los observados en la leucomalacia periventricular, que es una lesión que aparece en numerosos recién nacidos prematuros humanos.

ALF-5755 se co-inyectó con ibotenato intracerebralmente en P5, o se inyectó ALF-5755 por vía intraperitoneal inmediatamente o 3 horas después de ibotenato. El análisis de las lesiones cerebrales se realizó en P10.

La co-inyección de ALF-5755 con ibotenato redujo las lesiones de materia blanca y materia gris cortical en un 37% y 67%, respectivamente, para una dosis de 150 ng de ALF-5755 (en comparación con las crías tratadas con ibotenato solo). También se observó una buena neuroprotección (50% de disminución del tamaño de las lesiones cerebrales) cuando la inyección de ALF-5755 se realizó por vía intraperitoneal inmediatamente, o 3 horas después del insulto. Esto establece la eficacia de una única inyección de ALF-5755, incluso retardada, a través de la ruta sistémica. Esto también indica que ALF5755, administrado intracranealmente o en la periferia, puede exhibir un efecto terapéutico en enfermedades neurológicas y enfermedades relacionadas tal como se definió anteriormente.

Confirmando adicionalmente los datos in vitro, el análisis de transferencia western demostró que ALF-5755, solo o en combinación con ibotenato, induce una disminución significativa en GAP-43 total, pero un aumento significativo y muy importante en la proporción de GAP-43 fosforilada en comparación con los controles o animales a los que inyectó ibotenato solo.

Ejemplo 3: Expresión in vivo de una proteína HIP/PAP en el desarrollo de cerebelo de crías de ratón y efectos in vitro de la proteína ALF-5755 en un modelo de lesión cerebelosa

A. Materiales y Métodos

RT PCR cuantitativa

ARNs de cerebelos de ratones suizos P0, P5-7 y P60, cortezas de P5 y úteros de adultos se extrajeron utilizando el mini kit RNeasy (Quiagen). La transcripción inversa se realizó con 600 ng de ARNs totales para obtener ADNcs de HIP/PAP y HPRT. A continuación, se suscitó la PCR cuantitativa de transcripciones de HIP/PAP y HPRT (45 ciclos de 30" de desnaturalización a 94°C, 30" de hibridación a 58°C y 30" de polimerización a 72°C con cebadores apropiados) con el sistema Biorad. La cuantificación de la expresión de HIP/PAP en el cerebelo de crías de diversas edades se obtuvo racionalizando HIP/PAP frente a transcripciones de HPRT (software Biorad asociado) para calibrar la RT PCR y comparar los niveles de expresión de HIP/PAP a lo largo del tiempo.

Cultivo de Neuronas Granulares Cerebelosas.

Las células granulares representan la gran mayoría de las neuronas cerebelosas. Se prepararon cultivos de neuronas granulares primarias a partir de crías de ratones P7. En síntesis, los cerebros se diseccionaron y se colocaron en HHGN (HBSS 1x con HEPES 1 M y glucosa al 4,45%; Invitrogen). Las meninges se retiraron para evitar la contaminación masiva por astrocitos. Después del aislamiento, los cerebelos se lavaron en HHGN, se redujeron en trozos pequeños y las células se disociaron con tripsina al 0,25% -EDTA al 0,02% y se incubaron con DNasa 1 (Sigma St-Quentin Fallavier, Francia). Las células se sembraron en MEM1X y suero de caballo al 10% a una densidad de 22 millones de células/pocillo en placas de 24 pocillos recubiertas con poli-L-ornitina (Sigma). Veinticuatro horas después de la siembra, se añadieron 10 μM de AraC (citosina arabinósido) a medio de cultivo para frenar la proliferación glial. Después de 7 días in vitro (DIV7), la muerte neural se indujo tratando células durante 1 hora y permitiendo un período de recuperación posterior de 8, 16 o 24 horas con los siguientes inductores: (i): H2O2 0,01 a 1 mM para inducir estrés oxidativo y lograr una muerte celular posterior del 60%, (ii): NMDA 0,3 a 3 mM para inducir excito-toxicidad y lograr una muerte celular posterior de aproximadamente el 40%.

En ambas condiciones, el efecto neuro-protector de ALF-5755 se evaluó a 5 y 10 µg/mL en presencia de una concentración 0,3 mM de H2O2 o en presencia de NMDA1 mM.

Inmunocitoquímica.

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Se examinó el número de neuritas primarias, secundarias y terciarias, además de examinar el número de puntos de ramificación. Se utilizó tubulina beta III como marcador (datos no mostrados en el ejemplo). Las imágenes fueron capturadas en un Zeiss Axioplan II. La longitud de la neurita se obtuvo utilizando el software IM50.

B. Resultados

5 Los resultados están representados en las Figuras 2 a 6, respectivamente.

Los resultados de las Figuras 2 a 5 demuestran que la proteína HIP/PAP, incluso cuando se utiliza sola, ejerce un incremento en la neuroplasticidad, ya que la proteína HIP/PAP (i) aumenta el número de neuritas primarias (Fig. 2), así como el número de células que tienen neuritas secundarias y terciarias (Véanse las Figuras 3 y 4, respectivamente).

10 Los resultados representados en la Figura 6 demuestran que la proteína HIP/PAP tiene la capacidad de proteger las células neuronales contra los efectos adversos provocados por NMDA sobre el crecimiento de neuritas. Más precisamente, los resultados presentados en la Figura 6 demuestran que HIP/PAP, cuando se añade a las células neuronales incubadas con NMDA, restaura el nivel de crecimiento de neuritas que se mide en los cultivos de células neuronales de control incubados con medio de cultivo solo.

15 Además, se ha demostrado que la proteína HIP/PAP tiene la capacidad de restaurar la neuroplasticidad de las células neuronales corticales sometidas a una incubación con una cantidad citotóxica de NMDA.

Los resultados mostrados en las Figuras 2, 5 y 6 se obtuvieron a partir de cultivos in vitro de células corticales procedentes de ratones que son homocigotos para el gen GAP 43 de tipo salvaje (GAP43 +/+).

Aunque no se muestra, los mismos resultados se obtuvieron utilizando cultivos in vitro de células corticales que se 20 originaron (i) a partir de ratones GAP43 +/-o (ii) a partir de ratones GAP43 -/-.

Los últimos resultados sugieren que el efecto positivo de la proteína HIP/PAP sobre la neuroplasticidad que se observó no requirió la presencia de la proteína GAP43.

Claims (1)

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