ES2656287T3 - Psychosa epimerase mutant and method to prepare psychosa through its use - Google Patents
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Abstract
Un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos en la que el acido glutámico en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens representada por SEQ ID NO: 1 o fragmentos funcionales de la misma está sustituido con prolina.A D-psychosa 3-epimerase mutant comprising an amino acid sequence in which glutamic acid at position 77 of the amino acid sequence of the wild-type D-psychosa 3-epimerase of Agrobacterium tumefaciens represented by SEQ ID NO: 1 or functional fragments thereof is substituted with proline.
Description
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DESCRIPCIONDESCRIPTION
Mutante de psicosa epimerasa y método para preparar psicosa mediante su uso Campo técnicoPsychosa epimerase mutant and method for preparing psychosa through its use Technical field
La presente invención se refiere a un mutante de D-psicosa 3-epimerasa, a un vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante y a un microorganismo que incluye el mutante. Asimismo, la presente invención se refiere a un método para preparar D-psicosa utilizando el mutante de enzima o el microorganismo.The present invention relates to a D-psychosa 3-epimerase mutant, a recombinant vector that includes a gene encoding the mutant and a microorganism that includes the mutant. Also, the present invention relates to a method for preparing D-psychosa using the enzyme mutant or the microorganism.
Antecedentes en la técnicaBackground in the art
D-psicosa es un monosacárido conocido por ser un azúcar raro ya que raramente se encuentra en los materiales naturales o está presente en cantidades reducidas. D-psicosa tiene muy pocas calorías y un sabor dulce similar al del azúcar y, por tanto, su uso está muy extendido como edulcorante funcional.D-psychosa is a monosaccharide known to be a rare sugar since it is rarely found in natural materials or is present in small quantities. D-psychosa has very few calories and a sweet taste similar to that of sugar and, therefore, its use is widespread as a functional sweetener.
D-psicosa es un epímero de D-fructosa y tiene un grado de dulzor y un gusto muy similar al de D-fructosa. A diferencia de D-fructosa, D-psicosa apenas se metaboliza en el organismo y tiene casi cero calorías. D-psicosa se puede utilizar como un ingrediente eficaz para alimentos de dieta ya que D-psicosa tiene la capacidad de inhibir la actividad de una enzima relacionada con la síntesis de lípidos y de reducir la obesidad abdominal. Asimismo, los alcoholes de azúcar, como xilitol y similares, cuyo uso está muy extendido como sustitutos del azúcar, pueden presentar efectos secundarios, como pueda ser causar diarrea, cuando se consumen en grandes cantidades. Por el contrario, se sabe que D-psicosa no tiene sustancialmente ningún efecto secundario.D-psychosa is an epimer of D-fructose and has a degree of sweetness and a taste very similar to that of D-fructose. Unlike D-fructose, D-psychosa is hardly metabolized in the body and has almost zero calories. D-psychosa can be used as an effective ingredient for diet foods since D-psychosa has the ability to inhibit the activity of an enzyme related to lipid synthesis and reduce abdominal obesity. Also, sugar alcohols, such as xylitol and the like, whose use is widespread as sugar substitutes, may have side effects, such as causing diarrhea, when consumed in large quantities. On the contrary, it is known that D-psychosa has substantially no side effects.
Por esta razón, D-psicosa es objeto de atención como edulcorante de dieta y existe una creciente necesidad de contar con un método para producir eficientemente D-psicosa en la industria de la alimentación. Siendo así, dada la creciente necesidad de desarrollar D-psicosa, ha habido varias tentativas para producir D-psicosa a partir de D- fructosa utilizando los métodos biológicos existentes. Como enzimas capaces de convertir D-fructosa en D-psicosa, se conocen D-psicosa 3-epimerasa (DPE) derivada de Agrobacterium tumefaciens y D-tagatosa 3-epimerasa derivada de Pseudomonas cichorii o Rhodobacter sphaeroides. Se sabe que D-psicosa 3-epimerasa tiene una actividad mayor que D-tagatosa 3-epimerasa.For this reason, D-psychosa is the subject of attention as a diet sweetener and there is a growing need for a method to efficiently produce D-psychosa in the food industry. Thus, given the growing need to develop D-psychosa, there have been several attempts to produce D-psychosa from D-fructose using existing biological methods. As enzymes capable of converting D-fructose into D-psychosa, D-psychosa 3-epimerase (DPE) derived from Agrobacterium tumefaciens and D-tagatose 3-epimerase derived from Pseudomonas cichorii or Rhodobacter sphaeroides are known. It is known that D-psychosa 3-epimerase has an activity greater than D-tagatose 3-epimerase.
En la producción D-psicosa, se produce más D-psicosa al aumentar la temperatura de reacción. Sin embargo, cuando se utiliza un tipo silvestre de D-psicosa 3-epimerasa para la producción de D-psicosa, se desnaturaliza la enzima a una temperatura de reacción de aproximadamente 50 °C o más, lo que reduce la actividad de la enzima, causando así el problema de que se reduce la cantidad de D-psicosa producida. Por lo tanto, existe una urgente necesidad de contar con un mutante de D-psicosa 3-epimerasa con una mejor resistencia térmica para producir eficientemente D-psicosa con una alta utilidad.In D-psychosa production, more D-psychosa is produced by increasing the reaction temperature. However, when a wild type of D-psychosa 3-epimerase is used for the production of D-psychosa, the enzyme is denatured at a reaction temperature of about 50 ° C or more, which reduces the activity of the enzyme, thus causing the problem that the amount of D-psychosa produced is reduced. Therefore, there is an urgent need for a D-psychosa 3-epimerase mutant with a better thermal resistance to efficiently produce D-psychosa with high utility.
DivulgaciónDivulgation
Problema técnicoTechnical problem
Los autores de la presente invención se han dado cuenta del hecho de que D-psicosa 3-epimerasa de Agrobacterium tumefaciens presentado en la SEQ ID NO: 1 apenas se ha utilizado por su baja estabilidad térmica a pesar de su alta actividad. Por lo tanto, los autores de la presente invención han desarrollado un mutante de D- psicosa 3-epimerasa que tiene una mejor estabilidad térmica y un método para producir de forma continua D-psicosa empleando dicho mutante de manera que es posible producir a nivel industrial a gran escala D-psicosa que es objeto de atención como un importante aditivo de los alimentos.The authors of the present invention have realized the fact that D-psychosa 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens presented in SEQ ID NO: 1 has hardly been used because of its low thermal stability despite its high activity. Therefore, the authors of the present invention have developed a D-psychosa 3-epimerase mutant that has a better thermal stability and a method for continuously producing D-psychosa using said mutant so that it is possible to produce on an industrial level Large-scale D-psychosa that is the subject of attention as an important food additive.
Concretamente, la presente invención se dirige a proporcionar un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que tiene una mejor estabilidad térmica sustituyendo un aminoácido en una posición específica de una secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre.Specifically, the present invention is directed to providing a D-psychosa 3-epimerase mutant that has better thermal stability by substituting an amino acid at a specific position in an amino acid sequence of a wild-type D-psychosa 3-epimerase.
Por otra parte, la presente invención tiene por objeto proporcionar un polinucleótido que codifica un mutante de D- psicosa 3-epimerasa que tiene una mejor estabilidad térmica.On the other hand, the present invention aims to provide a polynucleotide encoding a D-psychosa 3-epimerase mutant that has better thermal stability.
Asimismo, la presente invención está dirigida a proporcionar un vector recombinante que incluye un gen que codifica un mutante de D-psicosa 3-epimerasa.Also, the present invention is directed to providing a recombinant vector that includes a gene encoding a D-psychosa 3-epimerase mutant.
Asimismo, la presente invención está dirigida a proporcionar un microorganismo recombinante transformado para producir un mutante de D-psicosa 3-epimerasa.Also, the present invention is directed to providing a transformed recombinant microorganism to produce a D-psychosa 3-epimerase mutant.
Asimismo, la presente invención está dirigida a proporcionar un método para preparar D-psicosa a partir de D- fructosa utilizando el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo recombinante transformado para producir un mutante de D-psicosa 3-epimerasa.Also, the present invention is directed to providing a method for preparing D-psychosa from D-fructose using the D-psychosa 3-epimerase mutant or the recombinant microorganism transformed to produce a D-psychosa 3-epimerase mutant.
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Solución técnicaTechnical solution
La presente invención proporciona un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que tiene una mejor estabilidad térmica para producir eficientemente D-psicosa sustituyendo un aminoácido en una posición específica de una secuencia de aminoácidos de D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre.The present invention provides a D-psychosa 3-epimerase mutant that has a better thermal stability to efficiently produce D-psychosa by substituting an amino acid at a specific position of a wild-type D-psychosa 3-epimerase amino acid sequence.
Concretamente, la presente invención proporciona un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que incluye una secuencia de aminoácidos en la que el ácido glutámico en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre derivada de Agrobacterium tumefaciens está sustituido con prolina, en la que D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre se muestra en la SEQ NO: 1. El mutante puede incluir una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, cisteína y valina, y/o serina en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con cisteína.Specifically, the present invention provides a D-psychosa 3-epimerase mutant that includes an amino acid sequence in which glutamic acid at position 77 of the amino acid sequence of the wild-type D-psychosa 3- epimerase derived from Agrobacterium Tumefaciens is substituted with proline, in which wild-type D-psychosa 3-epimerase is shown in SEQ NO: 1. The mutant may include an amino acid sequence in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence of a Wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with an amino acid selected from the group consisting of leucine, cysteine and valine, and / or serine at position 213 of the amino acid sequence of a type D-psychosa 3- epimerase. Wild is also substituted with cysteine.
El mutante puede incluir una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con leucina, y serina en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con cisteína.The mutant may include an amino acid sequence in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence of a wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with leucine, and serine at position 213 of the amino acid sequence of a wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with cysteine.
La presente invención se refiere también a un polinucleótido que codifica el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la presente invención.The present invention also relates to a polynucleotide encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant according to the present invention.
La presente invención se refiere también a un vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante de D- psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la presente invención.The present invention also relates to a recombinant vector that includes a gene encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant according to the present invention.
La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante transformado para producir el mutante de D- psicosa 3-epimerasa.The present invention relates to a recombinant microorganism transformed to produce the D-psychosa 3-epimerase mutant.
La presente invención se refiere también a un método para producir D-psicosa, que incluye: proporcionar D-fructosa con un mutante de D-psicosa 3-epimerasa de la presente invención o un microorganismo recombinante transformado para producir el mutante de D-psicosa 3-epimerasa, causando así la reacción de enzima; y purificar la masa de reacción de enzima resultante para obtener D-psicosa.The present invention also relates to a method of producing D-psychosa, which includes: providing D-fructose with a D-psychosa 3-epimerase mutant of the present invention or a recombinant microorganism transformed to produce the D-psychosa 3 mutant -epimerase, thus causing the enzyme reaction; and purify the resulting enzyme reaction mass to obtain D-psychosa.
La presente invención se refiere también a un reactor inmovilizado para producir D-psicosa que incluye una columna rellena con un vehículo en la que se inmoviliza el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo recombinante transformado para producir el mutante de acuerdo con la presente invención.The present invention also relates to a reactor immobilized to produce D-psychosa that includes a column filled with a vehicle in which the D-psychosa 3-epimerase mutant or the recombinant microorganism transformed to produce the mutant according to the invention is immobilized. present invention
La presente invención se refiere además a un método para producir D-psicosa suministrando una solución de D- fructosa al reactor inmovilizado.The present invention further relates to a method of producing D-psychosa by supplying a solution of D-fructose to the immobilized reactor.
Efectos ventajososAdvantageous effects
La presente invención proporciona un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que tiene una notable mejor estabilidad térmica al mismo tiempo que mantiene su actividad de enzima, en el que un aminoácido en una posición específica de una secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 está sustituido, en virtud de lo cual se da cabida a que D-psicosa, que es objeto de atención actualmente como material alimentario, se produzca más eficientemente y a nivel industrial a gran escala.The present invention provides a D-psychosa 3-epimerase mutant that has noticeably better thermal stability while maintaining its enzyme activity, in which an amino acid in a specific position of an amino acid sequence of D-psychosa 3 Wild-type epimerase shown in SEQ ID NO: 1 is substituted, whereby it is possible that D-psychosa, which is currently the object of attention as food material, is produced more efficiently and on a large-scale industrial level .
Concretamente, el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con una realización de la presente invención tiene una semivida notablemente prolongada a la temperatura de reacción de la enzima en comparación D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre o los mutantes previamente conocidos de la misma, en virtud de lo cual se da cabida a que la D-psicosa 3-epimerasa preparada se utilice durante un largo período de tiempo en la producción de D- psicosa. Por lo tanto, el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de acuerdo con la presente invención puede reducir el tiempo y el coste de producción mejorando así la eficiencia de producción.Specifically, the D-psychosa 3-epimerase mutant according to an embodiment of the present invention has a markedly prolonged half-life at the reaction temperature of the enzyme compared to wild-type D-psychosa 3- epimerase or the previously known mutants of the same, by virtue of which it is possible that the prepared D-psychosa 3-epimerase be used for a long period of time in the production of D-psychosa. Therefore, the D-psychosa 3-epimerase mutant according to the present invention can reduce production time and cost thereby improving production efficiency.
Asimismo, de acuerdo con otra realización de la presente invención, se puede producir eficientemente D-psicosa a gran escala utilizando el vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo recombinante transformado para producir el mutante de D-psicosa 3-epimerasa.Also, according to another embodiment of the present invention, large-scale D-psychosa can be efficiently produced using the recombinant vector that includes a gene encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant or the transformed recombinant microorganism to produce the mutant. of D-psychosa 3-epimerase.
Descripción de los dibujosDescription of the drawings
Fig. 1 representa un modelado molecular de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens.Fig. 1 depicts a molecular modeling of a wild-type D-psychosa 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens.
Fig. 2 es un gráfico que representa la estabilidad térmica del mutante de D-psicosa 3-epimerasas del Ejemplo 1 en comparación con la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre del Ejemplo Comparativo 1.Fig. 2 is a graph depicting the thermal stability of the D-psychosa 3-epimerase mutant of Example 1 compared to the wild-type D-psychosa 3-epimerase of Comparative Example 1.
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Fig. 3 es un gráfico que representa la estabilidad térmica de mutante de D-psicosa 3-epimerasa (133L/E77P/S213C) del Ejemplo 2 en comparación con el mutante de D-psicosa 3-epimerasa (133L/S213C) convencional del Ejemplo Comparativo 2.Fig. 3 is a graph representing the thermal stability of D-psychosa 3-epimerase mutant (133L / E77P / S213C) of Example 2 compared to the conventional D-psychosa 3-epimerase mutant (133L / S213C) mutant of Example Comparative 2.
Mejor modoBetter mode
A continuación, se describirá la presente invención con mayor detalle. Las descripciones de los detalles que sean evidentes para las personas especializadas en la técnica con un conocimiento normal dentro de este campo técnico o el campo correspondiente se omiten en el presente documento.Next, the present invention will be described in greater detail. Descriptions of the details that are apparent to persons skilled in the art with normal knowledge within this technical field or the corresponding field are omitted in this document.
La presente invención se refiere a un mutante de D-psicosa 3-epimerasa (en adelante denominado "Mutante E77P") que incluye una secuencia de aminoácidos en la que el acido glutámico en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos de una D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens está sustituido con prolina. La secuencia de aminoácidos del mutante de enzima está representado por SEQ ID NO: 2.The present invention relates to a D-psychosa 3-epimerase mutant (hereinafter referred to as "E77P mutant") that includes an amino acid sequence in which the glutamic acid at position 77 of the amino acid sequence of a D-psychosa Agrobacterium tumefaciens wild-type 3-epimerase is substituted with proline. The amino acid sequence of the enzyme mutant is represented by SEQ ID NO: 2.
Agrobacterium tumefaciens es una cepa conocida y, en más detalle, se puede utilizar Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970.Agrobacterium tumefaciens is a known strain and, in more detail, Agrobacterium tumefaciens ATCC 33970 can be used.
La conformación de D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens fue descubierta en 2006, y actualmente, la información conformacional de la misma se divulga en el Banco de Datos de proteínas (en adelante denominado “BDP”). D-psicosa 3-epimerasa (BDP ID: 2HK1) comprende 309 aminoácidos y se la conoce por formar un complejo, es decir un tetrámero que comprende cuatro monómeros. La D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre tiene una estructura en la que están conectadas de forma repetida hélices a y hebras p para formar un sitio activo en el que se puede unir D-fructosa como sustrato.The conformation of wild-type D-psychosa 3-epimerase of Agrobacterium tumefaciens was discovered in 2006, and currently, the conformational information thereof is disclosed in the Protein Data Bank (hereinafter referred to as "BDP"). D-psychosa 3-epimerase (BDP ID: 2HK1) comprises 309 amino acids and is known to form a complex, that is, a tetramer comprising four monomers. Wild-type D-psychosa 3-epimerase has a structure in which helices a and p-strands are repeatedly connected to form an active site where D-fructose can be attached as a substrate.
La D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens incluye una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 o fragmentos funcionales de la misma. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "fragmentos funcionales" puede referirse a fragmentos que incluyen mutaciones como consecuencia de una sustitución, una inserción o una deleción de algunos aminoácidos en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y que tiene una actividad de conversión de D-fructosa en D-psicosa.Agrobacterium tumefaciens wild-type D-psychosa 3-epimerase includes an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or functional fragments thereof. As used herein, the term "functional fragments" may refer to fragments that include mutations as a result of a substitution, an insertion or a deletion of some amino acids in the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 and which has a Conversion activity of D-fructose into D-psychosa.
El Mutante E77P puede incluir una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, cisteína y valina, y/o serina en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con cisteína.Mutant E77P may include an amino acid sequence in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence of wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with an amino acid selected from the group consisting of leucine, cysteine and valine , and / or serine at position 213 of the amino acid sequence of wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with cysteine.
Concretamente, el Mutante E77P incluye una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con leucina y serina en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre está sustituida además con cisteína. Este mutante se puede denominar "mutante I33L/E77P/S213C". El aminoácido del mutante I33L/E77P/S213C está representado por SEQ ID NO: 3.Specifically, Mutant E77P includes an amino acid sequence in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence of wild-type D-psychosa 3-epimerase is further substituted with leucine and serine at position 213 of the amino acid sequence. of wild-type D-psychosa 3-epimerase is also substituted with cysteine. This mutant can be called "mutant I33L / E77P / S213C". The mutant amino acid I33L / E77P / S213C is represented by SEQ ID NO: 3.
Como tal, la presente invención proporciona un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que tiene una mejor estabilidad térmica, en comparación con la epimerasa de tipo silvestre o un mutante de epimerasa convencional, sustituyendo aminoácidos en posiciones específicas, en concreto un aminoácido en la posición 77, adicionalmente un aminoácido en la posición 33 y/o un aminoácido en la posición 213 en la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre, en virtud de lo cual se da cabida a una producción eficiente de D-psicosa utilizando el mutante.As such, the present invention provides a D-psychosa 3-epimerase mutant that has better thermal stability, compared to wild-type epimerase or a conventional epimerase mutant, substituting amino acids at specific positions, specifically an amino acid in the position 77, additionally an amino acid at position 33 and / or an amino acid at position 213 in the amino acid sequence of wild-type D-psychosa 3-epimerase, whereby an efficient production of D is accommodated -psicosa using the mutant.
La presente invención se refiere también a un polinucleótido que codifica el mutante E77P. El polinucleótido puede ser un polinucleótido que codifica un mutante en el que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos está sustituida además con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en leucina, cisteína y valina, y/o serina en la posición 213 de la secuencia de aminoácidos está sustituida además con cisteína además de la sustitución de ácido glutámico en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos con prolina. Más concretamente, el polinucleótido es un polinucleótido que codifica el mutante I33L/E77P/S213C.The present invention also relates to a polynucleotide encoding the E77P mutant. The polynucleotide may be a polynucleotide encoding a mutant in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence is further substituted with an amino acid selected from the group consisting of leucine, cysteine and valine, and / or serine at position 213 of The amino acid sequence is further substituted with cysteine in addition to the replacement of glutamic acid at position 77 of the amino acid sequence with proline. More specifically, the polynucleotide is a polynucleotide that encodes the mutant I33L / E77P / S213C.
La presente invención se refiere también a un vector recombinante que incluye un gen que codifica un mutante de D- psicosa 3-epimerasa divulgado en la presente invención. Los vectores utilizados para construir el vector recombinante no están limitados en particular y se puede utilizar cualquier vector empleado normalmente en la técnica. Entre los ejemplos de vectores se incluye concretamente un vector plásmido. Concretamente, el plásmido puede ser un plásmido pUC, sin limitarse sólo a él. Asimismo, tal como se expone más adelante, es posible utilizar un vector lanzadera derivado de microorganismos que pertenecen a Escherichia coli, Escherichia coli recombinante, Bacillus, levadura, Corynebacterium o Agrobacterium para transformar los microorganismos mencionados. Concretamente, se pueden utilizar vectores lanzadera derivados de microorganismos que pertenecen al género Corynebacterium o al género Agrobacterium.The present invention also relates to a recombinant vector that includes a gene encoding a D-psychosa 3-epimerase mutant disclosed in the present invention. The vectors used to construct the recombinant vector are not particularly limited and any vector normally employed in the art can be used. Examples of vectors specifically include a plasmid vector. Specifically, the plasmid can be a pUC plasmid, without being limited only to it. Also, as set forth below, it is possible to use a shuttle vector derived from microorganisms belonging to recombinant Escherichia coli, Bacillus, yeast, Corynebacterium or Agrobacterium to transform the mentioned microorganisms. Specifically, shuttle vectors derived from microorganisms belonging to the genus Corynebacterium or the genus Agrobacterium can be used.
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La presente invención se refiere también a un microorganismo recombinante transformado para producir un mutante de D-psicosa 3- epimerasa. El microorganismo recombinante puede incluir, por ejemplo, microorganismos transformados con el vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de la presente invención. Entre los ejemplos de microorganismos se pueden incluir Escherichia coli, Escherichia coli recombinante, Bacillus, levadura, Corynebacterium o Agrobacterium. En particular, se puede utilizar en la presente invención Corynebacterium glutamicum.The present invention also relates to a recombinant microorganism transformed to produce a D-psychosa 3- epimerase mutant. The recombinant microorganism may include, for example, microorganisms transformed with the recombinant vector that includes a gene encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant of the present invention. Examples of microorganisms may include recombinant Escherichia coli, Escherichia coli, Bacillus, yeast, Corynebacterium or Agrobacterium. In particular, Corynebacterium glutamicum can be used in the present invention.
Concretamente, las cepas del género Corynebacterium son generalmente reconocidos como cepas GRAS (por sus siglas en inglés - generalmente reconocidos como seguros) y tienen las propiedades de su facilidad de utilización en ingeniería genética y su cultivo a gran escala. Asimismo, las cepas del género Corynebacterium tienen una alta estabilidad en varias condiciones de proceso y una estructura de membrana celular relativamente fuerte en comparación con otras bacterias. Por estas razones, las cepas tienen propiedades biológicas que permiten que existan células bacterianas en un estado estable a una alta presión osmótica gracias a la alta concentración de azúcar y similares.Specifically, strains of the genus Corynebacterium are generally recognized as GRAS strains (generally recognized as safe) and have the properties of their ease of use in genetic engineering and their large-scale cultivation. Likewise, strains of the genus Corynebacterium have high stability in various process conditions and a relatively strong cell membrane structure compared to other bacteria. For these reasons, the strains have biological properties that allow bacterial cells to exist in a stable state at a high osmotic pressure thanks to the high concentration of sugar and the like.
La presente invención se refiere también a Corynebacterium glutamicum CJ KY (KCCM11403P) transformada con el vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de la presente invención. La cepa recombinante, Corynebacterium glutamicum CJ KY (KCCM11403P) fue depositada en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) (Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea), que es un depósito internacional, el 28 de marzo de 2013, con el número de referencia KCCM 11403P en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest.The present invention also relates to Corynebacterium glutamicum CJ KY (KCCM11403P) transformed with the recombinant vector that includes a gene encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant of the present invention. The recombinant strain, Corynebacterium glutamicum CJ KY (KCCM11403P) was deposited at the Korean Center for Cultivation of Microorganisms (KCCM) (Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea), which is an international deposit, on March 28, 2013, with the reference number KCCM 11403P in accordance with the provisions of the Budapest Treaty.
La presente invención se refiere también a un método para preparar D-psicosa a partir de D-fructosa utilizando el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo de la presente invención. El método puede incluir: proporcionar a D-fructosa el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo recombinante transformado para producir el mutante de D-psicosa 3-epimerasa de la presente invención, en virtud de lo cual se causa una reacción de enzima; y recuperar D-psicosa tras la purificación del producto de reacción de enzima.The present invention also relates to a method for preparing D-psychosa from D-fructose using the D-psychosa 3-epimerase mutant or the microorganism of the present invention. The method may include: providing D-fructose with the D-psychosa 3-epimerase mutant or the recombinant microorganism transformed to produce the D-psychosa 3-epimerase mutant of the present invention, whereby a reaction of enzyme; and recovering D-psychosa after purification of the enzyme reaction product.
En el método para preparar D-psicosa, las condiciones de reacción como la concentración, la temperatura de reacción, el tiempo de reacción, el pH, la concentración de D-fructosa del mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo se pueden ajustar convenientemente dependiendo del fin deseado.In the method for preparing D-psychosa, reaction conditions such as concentration, reaction temperature, reaction time, pH, D-fructose concentration of the D-psychosa 3-epimerase mutant or the microorganism can be adjust conveniently depending on the desired purpose.
Por ejemplo, la temperatura para la reacción de enzima puede estar comprendida entre 20 °C y 60 °C y el tiempo de reacción puede oscilar entre 1 minuto y 2 horas. La relación entre el peso del mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo y D-fructosa puede estar comprendida entre aproximadamente 1:10 y 10:1. Concretamente, la temperatura de reacción oscila entre 30 °C y 55°C, el tiempo de reacción oscila entre 10 minutos y 90 minutos y la relación de peso puede estar comprendida entre aproximadamente 1:5 y aproximadamente 5:1.For example, the temperature for the enzyme reaction may be between 20 ° C and 60 ° C and the reaction time may range from 1 minute to 2 hours. The ratio between the weight of the D-psychosa 3-epimerase mutant or the microorganism and D-fructose may be between approximately 1:10 and 10: 1. Specifically, the reaction temperature ranges from 30 ° C to 55 ° C, the reaction time ranges from 10 minutes to 90 minutes and the weight ratio can be between about 1: 5 and about 5: 1.
Se puede añadir además un ion metálico a la reacción de enzima.A metal ion can also be added to the enzyme reaction.
Concretamente, la reacción de enzima se puede llevar a cabo en presencia de metales. D-psicosa 3-epimerasa es una metaloenzima, cuya activación está regulada por iones metálicos y, por tanto, tiene la ventaja de que se aumenta la actividad de enzima en presencia de iones metálicos.Specifically, the enzyme reaction can be carried out in the presence of metals. D-psychosa 3-epimerase is a metalloenzyme, whose activation is regulated by metal ions and, therefore, has the advantage that enzyme activity is increased in the presence of metal ions.
El tipo de metal que se utilice puede incluir manganeso, níquel, cobre y similares. Concretamente, es posible utilizar manganeso. La concentración de metal puede ser concretamente de 0,01 mM a 5 mM, más concretamente de 0,1 mM a 5 mM, más concretamente aún de 0,5 mM a 3 mM. Dentro de este intervalo, la presente invención tiene la ventaja de que se puede regular apropiadamente la actividad del mutante de D-psicosa 3-epimerasa aumentando así la eficiencia de producción de D-psicosa.The type of metal used may include manganese, nickel, copper and the like. Specifically, it is possible to use manganese. The metal concentration can be specifically from 0.01 mM to 5 mM, more specifically from 0.1 mM to 5 mM, more specifically from 0.5 mM to 3 mM. Within this range, the present invention has the advantage that the activity of the D-psychosa 3-epimerase mutant can be appropriately regulated thereby increasing the production efficiency of D-psychosa.
En la producción de D-psicosa, la reacción para aumentar la eficiencia de producción de D-psicosa puede llevarse a cabo concretamente a un pH de aproximadamente 5 a 9.In the production of D-psychosa, the reaction to increase the production efficiency of D-psychosa can be carried out specifically at a pH of about 5 to 9.
Asimismo, la presente invención se refiere a un reactor inmovilizado para producir D-psicosa que incluye una columna rellenada con un vehículo en el que se inmoviliza el mutante de D-psicosa 3-epimerasa o el microorganismo recombinante transformado para producir el mutante. La presente invención se refiere a un método para producir D-psicosa introduciendo en el reactor inmovilizado una solución de D-fructosa.Also, the present invention relates to a reactor immobilized to produce D-psychosa that includes a column filled with a vehicle in which the D-psychosa 3-epimerase mutant or the recombinant microorganism transformed to produce the mutant is immobilized. The present invention relates to a method for producing D-psychosa by introducing a solution of D-fructose into the immobilized reactor.
El término "reactor inmovilizado" se refiere a un reactor en el que se realiza la reacción para producir D-psicosa con una cepa inmovilizada en un vehículo o con una enzima, o a través de una cepa inmovilizada sobre un vehículo o a través de una columna cargada con una enzima. Es decir, la inmovilización significa que se inmoviliza en un vehículo una sustancia que proporciona actividad biológica, en este caso D-psicosa 3-epimerasa o una cepa que la incluye.The term "immobilized reactor" refers to a reactor in which the reaction is carried out to produce D-psychosa with a strain immobilized in a vehicle or with an enzyme, or through a strain immobilized on a vehicle or through a loaded column With an enzyme That is, immobilization means that a substance that provides biological activity is immobilized in a vehicle, in this case D-psychosa 3-epimerase or a strain that includes it.
El vehículo para inmovilizar el mutante de enzima o el microorganismo recombinante no está limitado en particular y se puede utilizar cualquier vehículo aplicable para la inmovilización de enzimas o microorganismos en este campoThe vehicle for immobilizing the enzyme mutant or the recombinant microorganism is not particularly limited and any applicable vehicle for the immobilization of enzymes or microorganisms in this field can be used.
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técnica o los campos pertinentes. Concretamente, se utiliza alginato sódico.technique or relevant fields. Specifically, sodium alginate is used.
Alginato sódico es un polisacárido coloidal natural abundante en las membranas celulares de las algas y consiste en ácido manurónico y ácido glurónico, que están unidos a través de una unión beta-1,4- aleatoriamente en número de ácido manurónico y glurónico. El alginato sódico puede utilizarse para la inmovilización estable de cepas o enzimas.Sodium alginate is an abundant natural colloidal polysaccharide in the cell membranes of algae and consists of manuronic acid and gluronic acid, which are linked through a beta-1,4-junction randomly in number of manuronic and gluronic acid. Sodium alginate can be used for stable immobilization of strains or enzymes.
A continuación, se describirá la presente invención con mayor detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos y ejemplos experimentales. Debe entenderse que estos ejemplos y ejemplos experimentales tienen un fin ilustrativo únicamente y no se han de interpretar en absoluto como exhaustivos del alcance de la presente invención.Next, the present invention will be described in greater detail with reference to the following examples and experimental examples. It should be understood that these examples and experimental examples are for illustrative purposes only and should not be interpreted at all as exhaustive of the scope of the present invention.
Ejemplo 1Example 1
Preparación de Mutante E77P de D-psicosa 3-epimerasaPreparation of E77P mutant of D-psychosa 3-epimerase
(1) Selección de sitio de secuencia de aminoácidos que se va a sustituir(1) Selection of amino acid sequence site to be replaced
Después de analizar la estructura de D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre (Fig. 1) utilizando un programa de análisis de estructura de proteínas de uso general, PyMol, se seleccionó un aminoácido en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre como el aminoácido para la sustitución responsable de mejorar la resistencia al calor de la enzima sin afectar a la actividad de la enzima.After analyzing the structure of wild-type D-psychosa 3-epimerase (Fig. 1) using a general purpose protein structure analysis program, PyMol, an amino acid was selected at position 77 of the amino acid sequence of the Wild-type D-psychosa 3-epimerase as the amino acid for substitution responsible for improving the heat resistance of the enzyme without affecting the activity of the enzyme.
En la Fig. 1, se indica la posición del ácido glutámico en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos.In Fig. 1, the position of glutamic acid at position 77 of the amino acid sequence is indicated.
(2) Preparación de Mutante E77P(2) Preparation of E77P mutant
Se sustituyó ácido glutámico (Glu, E) en la posición 77 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens ATCC33970 con prolina por mutagénesis dirigida a sitio. Para sobreexpresar el mutante de D-psicosa 3-epimerasa sustituido, se insertó un gen que codifica el mutante de D-psicosa 3- epimerasa en un vector pUC_HCE para construir un vector recombinante, que se insertó después en E. coli K12G utilizando un método de choque térmico.Glutamic acid (Glu, E) was substituted at position 77 of the amino acid sequence of the wild-type D-psychosa 3-epimerase of Agrobacterium tumefaciens ATCC33970 with proline by site-directed mutagenesis. To overexpress the substituted D-psychosa 3-epimerase mutant, a gene encoding the D-psychosa 3- epimerase mutant was inserted into a pUC_HCE vector to construct a recombinant vector, which was then inserted into E. coli K12G using a method of thermal shock.
Se inoculó en medio LB que contenía 50 pg/ml de ampicilina E. coli K12G transformado seguido del cultivo a 37 °C durante 6 horas. Se tomó una porción de la solución de cultivo, se transfirió a un medio que contenía 50 pg/ml de ampicilina y 0,1 mM de IPTG (Isopropil-p-tiogalactopiranosida) y a continuación se cultivó a 37 °C durante 6 horas para inducir la expresión del mutante de D-psicosa 3-epimerasa. A continuación, se trató térmicamente la solución cultivada a 60 °C durante 5 minutes, seguido de la adición de D-fructosa con la concentración final de 15 mM, en virtud de lo cual se causó la reacción a 55 °C durante 30 minutos. Utilizando un equipo de ensayo de fructosa convencional, se midió la cantidad residual de D-fructosa. Como resultado de la medición, se confirmó que el mutante de D-psicosa 3-epimerasa E77P de la presente invención presentó una alta semivida a la temperatura de reacción de 55 °C.It was inoculated in LB medium containing 50 pg / ml of transformed E. coli K12G ampicillin followed by cultivation at 37 ° C for 6 hours. A portion of the culture solution was taken, transferred to a medium containing 50 pg / ml ampicillin and 0.1 mM IPTG (Isopropyl-p-thiogalactopyranoside) and then cultured at 37 ° C for 6 hours to induce D-psychosa 3-epimerase mutant expression. Then, the cultured solution was heat treated at 60 ° C for 5 minutes, followed by the addition of D-fructose with the final concentration of 15 mM, whereby the reaction was caused at 55 ° C for 30 minutes. Using a conventional fructose test set, the residual amount of D-fructose was measured. As a result of the measurement, it was confirmed that the D-psychosa 3-epimerase E77P mutant of the present invention exhibited a high half-life at the reaction temperature of 55 ° C.
El término "semivida", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al período que trascurre hasta que se reduce a 50 la actividad relativa de la reacción inicial de enzima de una enzima o una enzima mutante, cuando la actividad relativa de la reacción inicial de la enzima de la enzima o el mutante de enzima se presupone en 100.The term "half-life", as used herein, refers to the period that elapses until the relative activity of the initial enzyme reaction of an enzyme or a mutant enzyme is reduced to 50, when the relative activity of the Initial reaction of the enzyme enzyme or the enzyme mutant is presupposed at 100.
Ejemplo 2Example 2
Preparación de mutante compuesto I33L/E77P/S213C de D-psicosa 3-epimerasaPreparation of compound mutant I33L / E77P / S213C of D-psychosa 3-epimerase
Para sobre-expresar la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens ATCC33970, se insertó un gen que codifica la enzima en un vector pUC_HCE para construir un vector recombinante. Se preparó mutante I33L/E77P/S213C por mutagénesis dirigida a sitio. Se transformó E. coli K12G con el vector recombinante seguido del cultivo de las cepas para dar cabida a la sobre-expresión del mutante de enzima.To overexpress the wild-type Agrobacterium tumefaciens ATCC33970 D-psychosa, a gene encoding the enzyme was inserted into a pUC_HCE vector to construct a recombinant vector. I33L / E77P / S213C mutant was prepared by site-directed mutagenesis. E. coli K12G was transformed with the recombinant vector followed by culture of the strains to accommodate over-expression of the enzyme mutant.
Ejemplo 3Example 3
Construcción de un vector recombinante que incluye un gen que codifica el mutante compuesto I33L/E77P/S213C de D-psicosa 3-epimerasa y transformación de una cepa que pertenece al género Corynebacterium utilizándoloConstruction of a recombinant vector that includes a gene encoding the compound mutant I33L / E77P / S213C of D-psychosa 3-epimerase and transformation of a strain belonging to the genus Corynebacterium using it
(1) Construcción de un vector recombinante y transformación de cepas utilizándolo(1) Construction of a recombinant vector and transformation of strains using it
Se amplificó el gen que codifica el mutante de D-psicosa 3-epimerasa por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde se utilizó el ADN del mutante I33L/E77P/S213C de acuerdo con Ejemplo 2 como matriz y se utilizó un oligonucleótido que incluía las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción PstI y XbaI como cebador. Para expresar el mutante de D-psicosa 3-epimerasa codificado por el gen amplificado a gran escala, se construyó un vector de expresión recombinante por digestión de un vector lanzadera pCJ-1 (depositado en el Centro Coreano deThe gene encoding the D-psychosa 3-epimerase mutant was amplified by polymerase chain reaction (PCR), where the mutant DNA I33L / E77P / S213C was used according to Example 2 as a matrix and an oligonucleotide was used which included the restriction enzyme recognition sequences PstI and XbaI as a primer. To express the D-psychosa 3-epimerase mutant encoded by the large-scale amplified gene, a recombinant expression vector was constructed by digestion of a shuttle vector pCJ-1 (deposited at the Korean Center of
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Cultivo de Microorganismos (KCCM), que es un depósito internacional, el 6 de noviembre de 2004 con el número de referencia KCCM-10611) derivado de una bacteria que pertenece al género Corynebacterium con las enzimas de restricción KpnIand Xba I; y ligado de un promotor lysC (NCg10247) derivado de Corynebacterium glutamicum y el producto de PCR amplificado con el vector lanzadera pCJ-1 digerido. Se introdujo el vector de expresión recombinante en Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 por transformación utilizando electroporación para preparar una cepa recombinante capaz de expresar un gen que codifica un mutante de D-psicosa 3-epimerasa (I33L/E77P/S213C). Se depositó la cepa recombinante Corynebacterium glutamicum CJ KY En el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM), que es un depósito internacional, el 28 de marzo de 2013 con el número de referencia KCCM 11403P en conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest.Cultivation of Microorganisms (KCCM), which is an international deposit, on November 6, 2004 with the reference number KCCM-10611) derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium with the restriction enzymes KpnIand Xba I; and ligated from a lysC promoter (NCg10247) derived from Corynebacterium glutamicum and the PCR product amplified with the digested shuttle vector pCJ-1. The recombinant expression vector was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 by transformation using electroporation to prepare a recombinant strain capable of expressing a gene encoding a D-psychosa 3-epimerase mutant (I33L / E77P / S213C). The recombinant strain Corynebacterium glutamicum CJ KY was deposited at the Korean Center for Cultivation of Microorganisms (KCCM), which is an international deposit, on March 28, 2013 with reference number KCCM 11403P in accordance with the provisions of the Budapest Treaty.
(2) Cultivo de la cepa recombinante(2) Recombinant strain culture
Se inoculó en medio MB que contenía 10 pg/ml de kanamicina (10 g/l de Bacto-triptona, 5 g/l de extracto de levadura Bacto, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de peptona de soja) la cepa recombinante obtenida en el punto (1) anterior a una concentración inicial de ODa00=0,1, seguido del cultivo a 30 °C durante 24 horas para inducir la expresión de mutantes de D-psicosa 3-epimerasa. Se añadió la solución de cultivo obtenida a un fermentador cargado con un medio modificado (8 g/l de glucosa, 20 g/de peptona de soja, 10 g/l de (NH^SO4, 1,2 g/l de KH2PO4, 1,4 g/l de MgSO4) que contiene 10 pg/ml de kanamicina a ODa00=0,6 y se cultivó a 30 °C durante 20 horas.Inoculated in MB medium containing 10 pg / ml of kanamycin (10 g / l of Bacto-triptone, 5 g / l of Bacto yeast extract, 5 g / l of NaCl, 5 g / l of soybean peptone) the Recombinant strain obtained in item (1) above at an initial concentration of ODa00 = 0.1, followed by culture at 30 ° C for 24 hours to induce expression of D-psychosa 3-epimerase mutants. The culture solution obtained was added to a fermenter loaded with a modified medium (8 g / l of glucose, 20 g / of soybean peptone, 10 g / l of (NH ^ SO4, 1.2 g / l of KH2PO4, 1.4 g / l of MgSO4) containing 10 pg / ml of kanamycin at ODa00 = 0.6 and grown at 30 ° C for 20 hours.
Ejemplo Comparativo 1Comparative Example 1
Del mismo modo que en el Ejemplo 1, se prepararon un vector y una cepa que pertenece al género Corynebacterium transformada con el vector con la excepción de que se utilizó un gen que codifica una D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens en lugar del mutante E77P del Ejemplo 1.In the same way as in Example 1, a vector and a strain belonging to the genus Corynebacterium transformed with the vector were prepared with the exception that a gene encoding a wild-type D-psychosa 3- epimerase of Agrobacterium tumefaciens was used in place of the E77P mutant of Example 1.
Ejemplo Comparativo 2Comparative Example 2
Del mismo modo que en el Ejemplo 1, se prepararon el mutante I33L/S213C del Ejemplo Comparativo 2, un vector que incluyó el gen mutante y una cepa recombinante que pertenecía al género Corynebacterium transformada con el vector con la excepción de que se utilizó un gen que codifica un mutante de D-psicosa 3-epimerasa que tenía una secuencia de aminoácidos en la que isoleucina en la posición 33 de la secuencia de aminoácidos de la D-psicosa 3- epimerasa de tipo silvestre de Agrobacterium tumefaciens ATCC33970 había sido sustituida con leucina y cisteína en la posición 213 con prolina por mutagénesis dirigida a sitio del Ejemplo 1.In the same way as in Example 1, mutant I33L / S213C of Comparative Example 2, a vector that included the mutant gene and a recombinant strain belonging to the genus Corynebacterium transformed with the vector were prepared with the exception that a gene was used encoding a D-psychosa 3-epimerase mutant that had an amino acid sequence in which isoleucine at position 33 of the amino acid sequence of the wild-type D-psychosa 3- epimerase of Agrobacterium tumefaciens ATCC33970 had been substituted with leucine and cysteine at position 213 with proline by site-directed mutagenesis of Example 1.
Ejemplo Experimental 1Experimental Example 1
Evaluación de la resistencia térmica y la actividad de enzima del mutante de D-psicosa 3-epimerasaEvaluation of the thermal resistance and enzyme activity of the D-psychosa 3-epimerase mutant
(1) Tratamiento térmico(1) Heat treatment
Se introdujo cada una de las cepas K12G E. coli recombinantes preparadas en Ejemplo 1 al Ejemplo 3, el Ejemplo Comparativo 1 y el Ejemplo Comparativo 2 en un matraz de 250 ml cargado con 50 ml de medio LB, seguido del cultivo en una incubadora en agitación a 37 °C durante aproximadamente 12 horas. Se centrifugó la solución de cultivo de K12G E. coli resultante a 7.000 x g durante 10 minutes a 4 °C, seguido de la suspensión en 5 ml de 50 mM solución de tampón EPPS, pH 8,0. A continuación, se lisó la suspensión resultante utilizando un ultrasonicador colocado sobre hielo durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 13,000 x g durante 40 minutos a 4 °C, proporcionado así un sobrenadante que se almacenó una vez separado.Each of the recombinant K12G E. coli strains prepared in Example 1 was introduced to Example 3, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 in a 250 ml flask loaded with 50 ml of LB medium, followed by culture in an incubator in stirring at 37 ° C for approximately 12 hours. The resulting K12G E. coli culture solution was centrifuged at 7,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, followed by suspension in 5 ml of 50 mM EPPS buffer solution, pH 8.0. The resulting suspension was then lysed using an ultrasonic placed on ice for 10 minutes, followed by centrifugation at 13,000 x g for 40 minutes at 4 ° C, thus providing a supernatant that was stored once separated.
Se midió la concentración de proteínas del sobrenadante a través de un ensayo de proteínas Bradford y a continuación, se ajustó la concentración total de proteína a 0,1 mg/ml utilizando 50 mM solución de tampón EPPS, pH 8,0. Tras la sobreexpresión se identificó el mutante de D-psicosa 3-epimerasa por SDS-PAGE, se trató térmicamente el mutante en un baño de agua en agitación a 50 °C y 55 °C durante 1 hora, 2 horas y 4 horas, cada uno de ellos, respectivamente.The protein concentration of the supernatant was measured through a Bradford protein assay and then the total protein concentration was adjusted to 0.1 mg / ml using 50 mM EPPS buffer solution, pH 8.0. After overexpression the D-psychosa 3-epimerase mutant was identified by SDS-PAGE, the mutant was heat treated in a shaking water bath at 50 ° C and 55 ° C for 1 hour, 2 hours and 4 hours, each one of them, respectively.
(2) Medición de la actividad de enzima a través de la producción de D-psicosa utilizando D-fructosa como sustrato(2) Measurement of enzyme activity through the production of D-psychosa using D-fructose as a substrate
Después del tratamiento térmico, para medir la actividad de enzima del mutante de enzima, se mezcló cada una de las soluciones de proteína tratadas térmicamente con 50 mM solución de tampón EPPS, pH 8,0 que contenía 40 mM de D-fructosa en una relación de 1:1, seguido de la reacción a 50 °C durante 10 minutos. A continuación, se detuvo la reacción por calentamiento a 100 °C durante 5 minutos. Se diluyó la solución de reacción a 1/40 y se midió la cantidad de D-psicosa generada a partir de D-fructosa por HPLC.After heat treatment, to measure the enzyme activity of the enzyme mutant, each of the heat-treated protein solutions was mixed with 50 mM EPPS buffer solution, pH 8.0 containing 40 mM D-fructose in a ratio 1: 1, followed by the reaction at 50 ° C for 10 minutes. Then, the reaction was stopped by heating at 100 ° C for 5 minutes. The reaction solution was diluted to 1/40 and the amount of D-psychosa generated from D-fructose was measured by HPLC.
Como resultado, se observó que el mutante E77P (Ejemplo 1) había mejorado su resistencia térmica en 4 °C o más en comparación con la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre (Ejemplo Comparativo 1) (véase Fig. 2).As a result, it was observed that the E77P mutant (Example 1) had improved its thermal resistance by 4 ° C or more compared to wild-type D-psychosa 3-epimerase (Comparative Example 1) (see Fig. 2).
55
1010
15fifteen
20twenty
2525
3030
3535
Asimismo, se observó que el mutante I33L/E77P/S213C (Ejemplo 2) había mejorado su resistencia térmica en 5 °CIt was also observed that the I33L / E77P / S213C mutant (Example 2) had improved its thermal resistance by 5 ° C
0 más en comparación con el mutante I33L/S213C (Ejemplo Comparativo 2). Se identificó que la semivida del mutante I33L/e77P/S213C a 55°C fue mayor que la semivida del mutante I33L/S213C a 50 °C (véase Fig. 3).0 more compared to the I33L / S213C mutant (Comparative Example 2). It was identified that the half-life of the I33L / e77P / S213C mutant at 55 ° C was greater than the half-life of the I33L / S213C mutant at 50 ° C (see Fig. 3).
En las Fig. 2 y 3, respectivamente, se muestran los resultados de las mediciones de la actividad de enzima. Concretamente, en la Fig. 2, se muestra un gráfico en el que se representa la actividad de enzima residual relativa de la D-psicosa 3-epimerasa de tipo silvestre del Ejemplo Comparativo 1 y el mutante E77P del Ejemplo 1 después de la reacción de la enzima de tipo silvestre y el mutante de enzima a las dos temperaturas (50 °C y 55 °C) duranteIn Fig. 2 and 3, respectively, the results of the enzyme activity measurements are shown. Specifically, in Fig. 2, a graph showing the relative residual enzyme activity of wild-type D-psychosa 3-epimerase of Comparative Example 1 and mutant E77P of Example 1 after the reaction of the wild-type enzyme and the enzyme mutant at both temperatures (50 ° C and 55 ° C) during
1 hora, 2 horas y 4 horas, respectivamente. Por otra parte, Fig. 3 es un gráfico en el que se representa la actividad de enzima residual relativa del mutante I33L/S213C del Ejemplo Comparativo 2 y el mutante I33L/E77P/S213C del Ejemplo 2 tras la reacción de estos dos mutantes a las dos temperaturas (50 °C y 55 °C) durante 1 hora, 2 horas y 4 horas, respectivamente.1 hour, 2 hours and 4 hours, respectively. On the other hand, Fig. 3 is a graph depicting the relative residual enzyme activity of mutant I33L / S213C of Comparative Example 2 and mutant I33L / E77P / S213C of Example 2 after the reaction of these two mutants to the two temperatures (50 ° C and 55 ° C) for 1 hour, 2 hours and 4 hours, respectively.
Tal como se puede observar en las Fig. 2 y 3, el mutante de enzima de acuerdo con la presente invención presenta una mejor estabilidad térmica en comparación con la cepa de tipo silvestre anterior o un mutante anteriormente conocido, I33L/S213C.As can be seen in Figs. 2 and 3, the enzyme mutant according to the present invention exhibits better thermal stability compared to the previous wild type strain or a previously known mutant, I33L / S213C.
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