ES2655764T3 - Microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada de producción de putrescina y un procedimiento para producir putrescina utilizando el mismo - Google Patents
Microorganismo recombinante que tiene una capacidad mejorada de producción de putrescina y un procedimiento para producir putrescina utilizando el mismo Download PDFInfo
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Abstract
Un microorganismo modificado del género Corynebacterium que tiene aumentada la capacidad para producir putrescina, en el que la actividad de una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 20 está debilitada o eliminada en comparación con la actividad endógena de la misma, y en el que la actividad de la ornitina descarboxilasa (ODC) se ha introducido adicionalmente en el mismo.
Description
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En un ejemplo de la presente invención, la cepa de Corynebacterium glutamicum con una capacidad aumentada para producir putrescina se preparó debilitando o eliminando la actividad de la proteína NCgl1469 expuesta en la SEQ ID NO: 18 en el microorganismo de Corynebacterium glutamicum KKCM1138P (Publicación de Patente Coreana Nº 2012-0064046), con una capacidad para producir putrescina con una concentración alta por la eliminación de argF y NCgI1221, introducción de speC y aumento de argCJDB (refiérase a la Figura 1).
La cepa con la actividad de la proteína NCgl1469 eliminada se llamó Corynebacterium glutamicum CC01-0163, depositada en el Centro de Cultivo de Microorganismos Coreano (al que se hace referencia de aquí en adelante como “KCCM”) con el número de depósito KCCM11240P de 26 de diciembre de 2011. El resultado del cultivo de la cepa que presenta no producción de N-acetil putrescina, la productividad de putrescina está mejorada con un nivel de mejora similar al nivel de no producción de N-acetil putrescina, y por lo tanto la NCgl1469 tiene actividad de acetilar la putrescina.
Además, La cepa de Corynebacterium glutamicum, DAB12-aΔNCgl1469, con un aumento de capacidad para producir putrescina se preparó eliminado la actividad de la proteína NCgl1469 expuesta en la SEQ ID NO: 20 en la cepa DAB12-a productora de putrescina, y el resultado del cultivo de la cepa mostraba que la N-acetil putrescina no se produce y la productividad de putrescina aumenta.
Entre tanto, la presente invención se prefiere al procedimiento de producción de putrescina que comprende el cultivo del microorganismo para producir un cultivo celular, un microorganismo del género Corynebacterium que aumenta la capacidad para producir putrescina en el que la actividad de la proteína NCgl1469 que tiene una secuencia que se expone en la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 20 está debilitada o eliminada en comparación con la actividad endógena de la misma; y aislar la putrescina del cultivo celular obtenido. En una realización, el microorganismo del género Corynebacterium es el Corynebacterium glutamicum.
El procedimiento de cultivo de la presente invención puede consistir en el medio y condiciones de cultivo apropiados conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica pueden ajustar y utilizar fácilmente el procedimiento de cultivo de acuerdo con las cepas seleccionadas. Un ejemplo del procedimiento de cultivo incluye el uso de cultivos discontinuos, continuos y semi-continuos, pero no se limita a estos. El medio de cultivo que se utiliza debe satisfacer apropiadamente las necesidades de la cepa específica.
El medio de cultivo que se utiliza debe satisfacer apropiadamente las necesidades de la cepa específica. Se conocen medios de cultivo para distintos microorganismos (por ejemplo, "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). Como fuente de carbono en el medio, se pueden utilizar azúcares y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, molasas, almidón y celulosa), grasa de mantequilla y grasas (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semillas de girasol, aceite de maní y aceite de coco), ácidos grasos (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico), alcoholes (por ejemplo, glicerol y etanol), y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético, etc. Estas sustancias se pueden utilizar individualmente o como una mezcla. Como fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, extracto de carne bovina, extracto de malta, agua de macerado de maíz, polvo de harina de soja y urea) o compuestos inorgánicos (por ejemplo, sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico, carbonato amónico y nitrato amónico) y estas sustancias se pueden utilizar también individualmente o como una mezcla. Como fuente de fósforo, se puede utilizar fosfato dihidrógeno de potasio o fosfato hidrógeno dipotásico o la sal correspondiente que contienen sodio. Además, el medio de cultivo puede comprender sales metálicas (por ejemplo, sulfato magnésico o sulfato de hierro) que son esenciales para el crecimiento, y finalmente sustancias de promoción del crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas, se pueden utilizar además de las sustancias mencionadas anteriormente. El precursor adecuado se puede añadir además al medio de cultivo. La sustancia de alimentación se puede proporcionar en el cultivo de una vez o adecuadamente durante el cultivo.
El pH del cultivo se puede ajustar por al uso apropiado de un compuesto básico (por ejemplo, hidróxido sódico, hidróxido potásico o amoniaco) o un compuesto ácido (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico). Se puede ajustar la producción de espuma utilizando un agente anti-espumante tal como un poliglicoléster de ácido graso. El estado aeróbico se puede mantener introduciendo oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, por ejemplo, aire en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 20 a 45 ºC, preferentemente de 25 a 40 ºC. El cultivo continúa hasta que la generación alcanza el máximo deseado. Este objetivo se consigue habitualmente en 10 a 160 horas. La putrescina se puede liberaren el medio de cultivo, o estar contenida en las células.
Para el procedimiento de recolección y recogida de la putrescina producida en el procedimiento de cultivo de la presente invención, la sustancia diana se puede recolectar el medio de cultivo utilizando el procedimiento apropiado en la técnica dependiendo del procedimiento de cultivo, por ejemplo, un procedimiento de cultivo discontinuo, continuo o semi-continuo.
Modo para la invención
De aquí en adelante, la invención se describirá con más detalle en referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos solamente tienen fines ilustrativos, y la invención no pretende estar limitada por estos Ejemplos.
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Ejemplo 1: Cepa con actividad de NCgl1469 eliminada
Ejemplo 1-1: Preparación de la cepa con la NCgl1469 eliminada basada en la cepa ATCC13032 productora de putrescina
Con el fin de bloquearla ruta sintética de N—acetil putrescina de putrescina en la célula, se preparó una cepa mutante en la que se eliminó el gen que codifica la NCgl1469, basándose en la base del microorganismo del género Corynebacterium que tiene la capacidad para producir putrescina (KCCM11138P(ATCC13032ΔargF ΔNCgl1221P(CJ7)-argCJBDbio-AD::P(CJ7)-speC(Ec)) desvelada en la solicitud de patente de los presentes inventores (Publicación de Patente Nº 2012-0064046), que se preparó eliminando el gen endógeno que codifica la carbamoil transferasa (ArgF) y el gen endógeno que codifica el exportador de glutamato (NCgI1221) que está implicado en la liberación de glutamato, introduciendo el gen que codifica la ornitina descarboxilasa (SpeC) derivada de la E. coli W3110 de tipo silvestre en el cromosoma, y sustituyendo un promotor del grupo genético argCJBD que codifica la enzima implicada en la síntesis de ornitina a partir de glutamato en la cepa ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre.
Específicamente, se prepararon como cebadores NCgl1469-del-F1_BamHI y NCgl1469-del-R1_SalI para obtener un fragmento recombinante homólogo del dominio del extremo N de la NCgl1469 y se prepararon como cebadores NCgl1469-del-F2_SalI y NCgl1469-del-R2_XbaI para obtener un fragmento recombinante homólogo del dominio del extremo C de NCgl1469, basándose en la secuencia de nucleótidos del gen NCgl1469 de la cepa ATCC13032 (SEQ ID NO: 17) (Tabla 1).
[Tabla 1]
- Cebadores para la producción de una cepa con NCgl1469 eliminado basada en la ATCC13032
- NCgl1469-del-F1_BamH1 (SEQ ID NO: 1)
- CGGGATCCAACCTTCAGAACGCGAATAC
- NCgl1469-del-R1_SalI (SEQ ID NO: 2)
- CGCGTCGACTTGGCACTGTGATTACCATC
- NCgl1469-del-F2_SalI (SEQ ID NO: 3)
- CGCGTCGACTTGGGTTATATCCCCTCAGA
- NCgl1469-del-R2_XbaI (SEQ ID NO: 4)
- TGCTCTAGATAGTGAGCCAAGACATGGAA
Con el fin de obtener el fragmento del extremo N y el fragmento del extremo C del gen NCgl1469, se llevó a cabo una PCR utilizando el conjunto de cebadores (NCgl1469-del-F1_BamHI y NCgl1469-del-R1_SalI, y NCgl1469-delF2_SalI y NCgl1469-del-R2_XbaI) y el cromosoma de la cepa ATCC13032 como matriz. Se llevó a cabo la reacción PCR con 30 ciclos de desnaturalización a 95 ºC durante 30 segundos, hibridación a 53 ºC durante 30 segundos, y elongación a 72 ºC durante 30 segundos.
Después se procesaron los productos de la PCR en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, se aisló una banda de ADN del tamaño diana y se purificó. Entonces, el producto de PCR del dominio del extremo N y el producto de PCR del dominio del extremo C se trataron con BamHI y SalI y SalI y XbaI respectivamente, y entonces se clonaron en el vector pDZ tratado con BamHI y XbaI. El plásmido resultante que se utilizó para la eliminación de NCgl1469 se denominó pDZ-NCgl1469 (K/O).
Con el fin de generar la cepa KCCM11138PANCgl1469, el vector pDZ-NCgl1469 (K/O) se introdujo en la cepa KCCM11138P mediante electroporación y se colocó en una placa con medio BHIS (infusión de corazón-cerebro 37 g/l, sorbitol 91 g/l, y agar al 2 % por 1 l) que contenía kanamicina (25 mg/ml).
La inserción satisfactoria del vector se confirmó observando el color azul del medio sólido que contenía 5-bromo-4cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-gal). Las cepas con cruzamiento sencillo se cultivaron con agitado en un medio de nutrientes (30 ºC, 8 horas), y cada una de ellas se diluyó en serie desde 10-4 a 10-10 y se colocaron en placas en medio sólido que contenía X-gal. Aunque la mayoría de las colonias aparecían como colonias azules, una baja proporción de colonias aparecía como colonias blancas y se seleccionaron las colonias blancas, finalmente se seleccionaron las cepas con el gen NCgl1469 eliminado con un doble cruzamiento. Se confirmó la inactivación satisfactoria del gen en la cepa por PCR utilizando los cebadores NCgl1469-del-F1_BamHI y NCgl1469-delR2_XbaI. La cepa confirmada por PCR se denominó KCCM11138PΔNCg11469.
Ejemplo 1-2. Preparación de una cepa con NCgl1469 eliminado basándose en la cepa ATCC13869 productora de putrescina
Utilizando el mismo procedimiento que se usa para la producción de la cepa productora de putrescina KCCM11138P basada en la Corynebacterium glutamicum ATCC13032, se preparó otra cepa productora de putrescina en el presente Ejemplo, basándose en el Corynebacterium glutamicum ATCC13869, eliminando el gen endógeno que codifica la carbamoil transferasa (ArgF) y el gen endógeno que codifica el exportador de glutamato (NCgI1221) que está implicado en la liberación de glutamato, introduciendo el gen que codifica la ornitina descarboxilasa (SpeC)
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<211> 612
<212> ADN
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