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ES2651522T3 - Altos niveles de FT de TEM para el diagnóstico del cáncer, en particular de cáncer colorrectal (CCR) y de páncreas (CP) - Google Patents

Altos niveles de FT de TEM para el diagnóstico del cáncer, en particular de cáncer colorrectal (CCR) y de páncreas (CP) Download PDF

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ES2651522T3
ES2651522T3 ES13197367.9T ES13197367T ES2651522T3 ES 2651522 T3 ES2651522 T3 ES 2651522T3 ES 13197367 T ES13197367 T ES 13197367T ES 2651522 T3 ES2651522 T3 ES 2651522T3
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twist1
zeb2
seq
cancer
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ES13197367.9T
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Luigi Laghi
Giuseppe Celesti
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Humanitas Mirasole SpA
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Abstract

Un método para determinar si un sujeto está afectado por un cáncer que comprende el paso de someter a ensayo un muestra biológica de dicho sujeto para determinar la presencia de un panel de ARNm que codifican para factores de transcripción involucrados en la transición epitelial mesenquimal, en donde: a) dicho panel comprende al menos los ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2, b) el aumento de los niveles de ARNm, tanto de genes TWIST1 como SLUG, pero no del gen ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cáncer colorrectal, c) el aumento de los niveles de ARNm de todos los genes TWIST1, SLUG y ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cáncer de páncreas, donde dicha muestra biológica es una muestra de células sanguíneas.

Description

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DESCRIPCION
Altos niveles de FT de TEM para el diagnostico del cancer, en particular de cancer colorrectal (CCR) y de pancreas (CP) Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de los marcadores moleculares para el diagnostico de enfermedades, preferiblemente para el diagnostico del cancer. La presente invencion esta dirigida a detectar y medir los niveles de ARNm de genes involucrados en la transicion epitelial-mesenquimal en muestras biologicas, es decir, en muestras de sangre periferica de pacientes con tumores, para determinar la presencia de la enfermedad, su progresion y riesgo de recurrencia.
Antecedentes
Las celulas tumorales circulantes (CTC) son una poblacion heterogenea de celulas cancerosas que circulan en la sangre periferica que se han desprendido de un tumor primario o su metastasis. Actualmente, el numero aproximado y el fenotipo correspondiente de CTC en la sangre completa de pacientes cancerosos tienen relevancia clmica con respecto al diagnostico de los pacientes. El conjunto de CTC incluye celulas con caractensticas de tipo epitelial, mesenquimal y troncal. Se ha demostrado que la intravasacion del cancer en los seres humanos (Min Yu et al., Science, 2013, 339, 580) y los animales esta unida a la transicion epitelial-mesenquimal (TEM), un proceso impulsado por factores de transcripcion (FT; similares, pero que no se limitan a TWIST1, ZEB2, SLUG, SNAIL, etc.) y susceptible de reversion (transicion mesenquimal-epitelial, TME) en nichos metastasicos. Por lo tanto, se espera que la deteccion de celulas TEM en la sangre humana proporcione pistas para efectuar diagnosticos y pronosticos.
Celesti et al. (Gastroenterology 2013, 145, 647) demostraron que los niveles de ARNm de TWIST1 teman mayor significacion estadfstica (valor de la mediana) en muestras de sangre de pacientes con cancer colorrectal (CCR) que en las de los controles. Desafortunadamente, la distribucion de niveles de TWIST1 en pacientes y controles se superpone parcialmente, haciendo que la medicion de ARNm de TWIST1 solamente no sea confiable ni adecuada para el diagnostico.
M. J. Larriba et al. (Carcinogenesis, vol. 30, Nro. 8, 2009) se refiere a la sobreexpresion de SLUG en cancer colorrectal, pero nada dice acerca de los niveles de expresion en sangre de TWIST1, SLUG y ZEB2.
Kenoki Ohuchida et al. (lnternational Journal of Cancer, vol. 120, Nro. 8, 2007) se refiere a la sobreexpresion de ARNm de TWIST1 en cancer de pancreas, pero nada dice acerca de los niveles de expresion en sangre de TWIST1, SLUG y ZEB2.
Hung Pham et al. (Pancreas, vol. 39, Nro. 3, 2010) se refiere a la sobreexpresion de ARNm de SLUG en cancer de pancreas, pero nada dice acerca de los niveles de expresion en sangre de TWIST1, SLUG y ZEB2.
Y. lmamichi et al., (Oncogene, vol. 26, Nro. 16, 2006) se refiere a la sobreexpresion de ARNm de ZEB2 en cancer de pancreas, pero nada dice acerca de los niveles de expresion en sangre de TWIST1, SLUG y ZEB2.
El documento WO2012/103025 se refiere a un metodo para evaluar la progresion del cancer en un paciente que sufre de cancer, que comprende determinar el nivel de expresion de ARN de un gen espedfico de cancer en una muestra enriquecida en celulas tumorales circulantes (CTC), donde el marcador de TEM se selecciona del grupo que consiste en: N-cadherina, vimentina, B-catenina (localizacion nuclear), Snail-1, Snail-2 (Slug), Twist, EF1/ZEB1, SIP1/ZEB2 y E47.
Descripcion de la invencion
Los metodos convencionales, aprobados por la FDA (por sus siglas en ingles: Food and Drug Administration - Administracion de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.) (es decir, "Cell Search" (Veridex), "Adna Test Breast Cancer Select" y "Adna Test Breast Cancer Detect" (AdnaGen AG), "Biocept Onco CEE" (Biocept Laboratories), detectan antfgenos epiteliales expresados, entre otros, por las CTC. Por tanto, el valor de diagnostico y pronostico de estos ensayos es limitado.
Los autores muestran un ensayo de RCP-TR (reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real) cuantitativa espedfico para genes de transicion epitelial-mesenquimal (TEM) presentes en las celulas circulantes de pacientes con tumores. A diferencia de lo descrito en la tecnica anterior, no es necesaria la separacion previa de poblaciones de celulas circulantes antes de la extraccion del ARNm. Esta estrategia permite detectar niveles aumentados de transcritos circulantes de FT de TEM, prescindiendo de cualquier caractenstica celular antigenica o fenotfpica.
Los autores hallaron que en las celulas sangumeas de pacientes CCR estan presentes altos niveles de ARNm de TWIST1 y SLUG, mientras que en celulas sangumeas de pacientes con cancer de pancreas (CP) estan presentes altos niveles de ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2, lo que permite un diagnostico mas robusto y confiable.
Por lo tanto, un objeto de la presente invencion es un metodo para determinar si un sujeto esta afectado por un cancer que comprende el paso de someter a ensayo una muestra biologica de dicho sujeto para detectar la
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presencia de un panel de ARNm que codifican los factores de transcripcion implicados en la transicion epitelial mesenquimal, en donde:
a) dicho panel comprende al menos los ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2,
b) el aumento de los niveles de ARNm, tanto de genes TWIST1 como SLUG, pero no del gen ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cancer colorrectal,
c) el aumento de los niveles de ARNm de todos los genes TWIST1, SLUG y ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cancer de pancreas, donde dicha muestra biologica es una muestra de celulas sangumeas.
En una realizacion preferida de la invencion al sujeto no se le administra un tratamiento antitumoral (p. ej., terapia neoadyuvante).
De modo conveniente, la muestra de celulas sangumeas es una muestra enriquecida de celulas tumorales circulantes (CTC), mas preferiblemente una muestra de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC, por sus siglas en ingles).
Los autores seleccionaron grados de admision apropiados como sigue:
- ARNm de TWIST1: 9,30E-09 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, o 2,57E-8 si el sujeto esta afectado por un cancer de pancreas;
- ARNm de SLUG: 1,83E-10 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, o 5,70E-9 si el sujeto esta afectado por un cancer de pancreas;
- ZEB2 : 4,08E-05 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, como indicacion luego del tratamiento contra el cancer de remision parcial o total de cancer colorrectal, y/o una variacion en la etapa de cancer colorrectal y/o respuesta al tratamiento, o 26,84E-6 si el sujeto esta afectado por cancer de pancreas.
En una realizacion preferida, los niveles de ARNm se obtienen mediante RCP-TR. Cualquier otro metodo para detectar ARNm espedfico en una muestra biologica conocido por el experto en la tecnica se encuentra dentro del alcance de la presente invencion. Los ejemplos ilustrativos son: Metodos de amplificacion de RCP (sistema de RCP Droplet Digital™ QX200™, sondas TaqMan), otros metodos de amplificacion; hasta el analisis de expresion genica unicelular (miRGE-nCounter®).
El metodo de la invencion es capaz de detectar transcritos de TEM en muestras de sangre de seres humanos o animales; en un aspecto particular el metodo comprende los siguientes pasos:
a) separar por gradiente de densidad Ficoll las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC),
b) detectar los niveles de expresion de genes TEM usando RCP-TR,
c) comparar el nivel de los genes TEM del paciente con niveles normales de control,
d) diagnosticar que el paciente tiene un tumor espedfico si los niveles detectados de los genes TEM difieren con significacion estadfstica (son superiores o inferiores a un valor de grado de admision predeterminado segun el gen seleccionado) del nivel de control.
Un objeto adicional de la invencion es el uso de un kit de RCP-TR cuantitativa para llevar a cabo el metodo descrito anteriormente, que incluye:
- elementos de retrotranscripcion para obtener ADNc espedficos;
- sondas espedficas de amplificacion para amplificar ADNc espedficos;
- elementos de deteccion para detectar y medir el nivel de ADNc espedficos amplificados.
En una realizacion preferida del uso del kit para RCP-TR cuantitativa de la invencion, las sondas de amplificacion son capaces de amplificar:
- la region nt. 781-835 de TWIST1, nro. de entrada: NM_000474.3, (SEQ ID No. 1);
- la region nt. 711-819 de SLUG, nro. de entrada: NM_003068.3, (SEQ ID No. 2);
- la region nt. 1262-1352 de ZEB2, nro. de entrada: NM_014795.3, (SEQ ID No. 3);
- la region nt. 174-244 de SNAIL, nro. de entrada: NM_005985.3, (SEQ ID No. 4).
En una realizacion preferida adicional del uso del kit para RCP-TR cuantitativa de la invencion, las sondas de amplificacion esencialmente tienen las secuencias:
TWIST1 directo AGCAAGATTCAGACCCTCAAGCT (SEQ ID No. 8);
TWIST1 inverso CCTGGTAGAGGAAGTCGATGTACCT (SEQ ID No. 9);
5 SLUG directo TGTTTGCAAGATCTGCGGC (SEQ ID No. 10);
SLUG inverso TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA (SEQ ID No. 11);
ZEB2 directo GCTACACGTTTGCCTACCGC (SEQ ID No. 12);
ZEB2 inverso CGATTACCTGCTCCTTGGGTT (SEQ ID No. 13).
Descripcion detallada de la invencion
10 Se describira la invencion con referencia a ejemplos no limitativos.
Leyendas de las Figuras
Figura 1. Niveles de ARNm de TWIST1 (A), SLUG (B), ZEB2 (C) y SNAIL (D) en sangre de 26 pacientes CCR comparados con 5 pacientes miscelaneos y con 16 controles sanos.
Figura 2. Curva ROC (caractenstica operativa del receptor, por sus siglas en ingles) para niveles de ARNm de 15 TWIST1 (A), SLUG (B) en 26 pacientes CCR en comparacion con 16 controles sanos.
Figura 3. Curva ROC para niveles de ARNm de ZEB2 en 26 pacientes CCR en comparacion con 5 pacientes miscelaneos.
Figura 4. Niveles de ARNm de TWIST1 (A), SLUG (B), ZEB2 (C) y SNAIL (D) en sangre de 10 pacientes CP comparados con 16 controles sanos.
20 Figura 5. Curva ROC para niveles de ARNm de TWIST1 (A), SLUG (B) y ZEB2 (C) en 10 pacientes CP en comparacion con 16 controles sanos.
Figura 6. Comparacion de niveles en sangre de ARNm de ZEB2 en CCR y CP (A). Curva ROC para niveles de ARNm de ZEB2 (B) en 26 pacientes con cancer colorrectal en comparacion con 10 pacientes con CP.
Materiales y metodos
25 Cuantificacion de transcritos genicos en muestras sangumeas no seleccionadas
Se recogio sangre periferica (6mL) en vacutainer revestido con anticoagulantes (EDTA, citrato de sodio, heparina) y se almaceno a 4°C. La sangre periferica se proceso dentro de las 4 horas de recogida y se separo por gradientes de densidad con Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Life Science) segun las instrucciones del fabricante. En smtesis, se agregaron 15 ml de Ficoll-Paque a un tubo centnfugo y se extendio PBS diluido (6 ml+29 ml de solucion salina 30 equilibrada) cuidadosamente en capas sobre la placa de Ficoll. Se centrifugo la solucion sin mezclar (400 g durante 40 minutos a 20°C). Se elimino la capa superior utilizando una pipeta Pasteur limpia dejando intacta la capa de linfocitos en la interfase. A continuacion, con el uso de una nueva pipeta Pasteur se transfirio la capa de PBMC que contema las celulas tumorales circulantes a un tubo centrifugo limpio y se lavo con al menos 3 volumenes (18 ml) de solucion salina equilibrada. Una vez resuspendidas, las celulas se centrifugaron (300 g durante 20 minutos a 20°C), 35 y luego se elimino el sobrenadante. Despues de agregar 50 mL de solucion salina equilibrada, los sedimentos celulares finalmente se centrifugaron (200 g durante 20 minutos a 20°C). El sobrenadante fue nuevamente eliminado y las celulas se lisaron con tampon de lisis Qiagen mas p-Mercaptoetanol (1:100). Luego se aislo el ARN total usando el mini kit Qiagen Rneasy segun las instrucciones del fabricante. A continuacion, el ARN total resuspendido en 60 |jL de agua tratada con dietilpirocarbonato (agua DEPC) se trato con ADNasa (Ambion, Life Science) para 40 minimizar la contaminacion por ADN genomico.
Todos los pasos de preparacion y manipulacion de ARN tuvieron lugar en una campana de flujo laminar, en condiciones libres de ARN. Las concentraciones de ARN se determinaron por lectura de absorbancia a 260 nm usando nanogotas.
Dos jg de ARN tratado se sometieron a transcripcion inversa a ADNc usando el kit de transcripcion inversa de ADNc 45 de alta capacidad (Applied Biosystem, Life Science).
El ADNc sintetizado se sometio a RCP-TR para detectar y cuantificar los niveles de ARNm del factor de transcripcion de TEM.
TWIST1: Nro. de entrada del NCBI (por sus siglas en ingles: National Center for Biotechnology Information - Centro
Nacional para la Informacion Biotecnologica de los EE.UU.) NM_000474.3 (SEQ ID No.1),
SLUG o SNAI2: Nro. de entrada del NCBI NM_003068.3 (SEQ ID No.2),
ZEB2 o SIP1: Nro. de entrada del NCBI NM_014795.3 (SEQ ID No.3),
SNAIL: Nro. de entrada del NCBI NM_005985.3 (SEQ ID No.4).
5 En smtesis, se coloco 1 pl de ADNc (40ng) en 20 pL de volumen de reaccion que contema 12 pl de Fast SyberGreen Master Mix, 3 pl de cebadores constitutivos y diana directos e inversos mezclados en 5 pM y 4 pl de agua DEPC.
Las secuencias de los cebadores espedficos fueron:
18s directo CGC CGC TAG AGG TGA AAT TCT (SEQ ID No. 6),
18s inverso CTT TCG CTC TGG TCC GTC TT (SEQ ID No. 7);
10 para amplificar la region nt. 1049-1100 de 18s, nro. de entrada: M10098.1, NCBI, (SEQ ID No. 5), como control;
TWIST1 directo AGC AAG ATT CAG ACC CTC AAG CT (SEQ ID No. 8);
TWIST1 inverso CCT GGT AGA GGA AGT CGA TGT ACC T (SEQ ID No. 9);
para amplificar la region nt. 781-835 de TWIST1, nro. de entrada: NM_000474.3, (SEQ ID No. 1);
SLUG directo TGT TTG CAA GAT CTG CGG C (SEQ ID No. 10);
15 SLUG inverso TGC AGT CAG GGC AAG AAA AA (SEQ ID No. 11);
para amplificar la region nt. 711-819 de SLUG, nro. de entrada: NM_003068.3, (SEQ ID No. 2);
ZEB2 directo GCT ACA CGT TTG CCT ACC GC (SEQ ID No. 12);
ZEB2 inverso CGA TTA CCT GCT CCT TGG GTT (SEQ ID No. 13);
para amplificar la region nt. 1262-1352 de ZEB2, nro. de entrada: NM_014795.3, (SEQ ID No. 3);
20 SNAIL directo CTT CCA GCA GCC CTA CGA C, (SEQ ID No. 14);
SNAIL inverso CGG TGG GGT TGA GGA TCT (SEQ ID No. 15);
para amplificar la region nt. 174-244 de SNAIL, nro. de entrada: NM_005985.3, (SEQ ID No. 4).
La amplificacion se realizo en un sistema de RCP en tiempo real ABI 7900 HT (Applied Biosystem) y se utilizo el programa: 95°C durante 10 minutes; 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 60 segundos. Todas las 25 muestras se analizaron por triplicado. La cuantificacion de los genes diana y los genes de referencia interna 18s se realizo usando la emision de fluorescencia de SyberGreen. La apropiada contaminacion de ADN se evaluo mediante la realizacion de PCR sobre la porcion no inversamente transcrita de cada muestra. Se detecto la fluorescencia de todas las muestras luego de 0-40 ciclos para los genes de control y marcadores en una sola reaccion, lo que permite la deduccion de los ciclos en el valor umbral (CT, por sus siglas en ingles) para cada producto. Se considero al valor 30 CT como el ciclo de RCP en el que se detecta un aumento significativo en la fluorescencia debido a la acumulacion exponencial de productos de rCp bicatenarios. La expresion de los aenes diana se normalizo sobre la expresion del gen constitutivo, 18s para obtener la cuantificacion absoluta (2'a ), mientras que la cuantificacion relativa se calculo mediante el metodo 2'aaCT para comparar los niveles de transcritos de los controles frente a los pacientes (Livak Kj, Methods, 2001; 25(4):402-8).
35 Analisis estadfstico
Se utilizo la prueba U de Mann-Whitney para evaluar las diferencias con significacion estadfstica en los niveles de expresion de los ARNm circulantes de los FT de TEM entre pacientes con cancer y controles. Para los FT de TEM con niveles significativamente altos en pacientes CCR y CP, se estimo la sensibilidad y especificidad usando los puntos optimos del grado de admision determinados mediante el analisis de las curvas ROC. Se considero que un 40 valor p <0,05 tema significacion estadfstica. Todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el programa informatico StatDirect (StatsDirect Ltd, Altrincham CHESHIRE, R.U.).
Pacientes y metodos
El estudio piloto incluyo 31 pacientes con neoplasia colorrectal. De estos, 26 pacientes teman cancer colorrectal, 4 pacientes teman cancer rectal y se sometieron a radioquimioterapia neoadyuvante antes de la cirugfa (lo que resulto 45 en la remision patologica completa, etapa ypT0N0, segun el sistema de etapas del AJCC (por sus siglas en ingles:
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American Joint Committee on Cancer - Comite Conjunto Estadounidense sobre el Cancer), mas un paciente con un adenoma avanzado (que mostraba alto grado de displasia). Otros 10 pacientes teman cancer de pancreas, y se usaron 16 sujetos sanos como controles. Todas las muestras se procesaron como se describio anteriormente luego de obtener el consentimiento informado de los pacientes.
Resultados
1. En las celulas sangumeas de pacientes CCR se encuentran presentes altos niveles de ARNm de TWIST1 y SLUG
En 16 controles sanos se detecto ARNm de TWIST1, ZEB2 y SNAIL (16/16, 100%), mientras que se detecto ARNm de SLUG en 3 de 16 casos (18,75%). En las muestras de sangre de 31 pacientes con neoplasia colorrectal, los autores detectaron TWIST1, ZEB2 y SNAIL en todos los casos (31/31, 100%), y SLUG en 30 de 31 casos (96,15%). Como se muestra en la Figura 1, los pacientes CCR tuvieron niveles mas altos de TWIST1 (Fig. 1A, cuantificacion absoluta, mediana, controles 9,8E-9 frente a CCR 3,22E-8; p<0,01) y SLUG (Fig. 1B, controles 9,09E-13 frente a CCR, 1,76E-08; p<0,001), pero no de ZEB2 (Fig. 1C, controles 1,35E-06 frente a CRC 7,45E-06; p=0,26) y de SNAIL (Fig. 1D, controles 7,61E-08 frente a CcR 5,74E-08; p=0,20). Por consiguiente, los niveles de ARNm de TWIST1 y SLUG en celulas sangumeas de pacientes con cancer fueron en promedio 3 y 4.000 veces mas elevados, respectivamente, que en los controles (cuantificacion relativa).
El estudio tambien incluyo un conjunto de muestras de sangre (Miscelaneo) de 4 pacientes con cancer de recto que se sometieron a radioquimioterapia neoadyuvante antes de la cirugfa, lo que resulto en la remision histologica completa de la enfermedad (ypT0N0), y de un paciente con un adenoma avanzado (que mostraba alto grado de displasia). En el conjunto Miscelaneo los autores detectaron una expresion significativamente mas alta de ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2 que en controles sanos. Sin embargo, en este conjunto los niveles de ZEB2 tambien fueron significativamente mas altos que en pacientes con cancer (5,13E-05 frente a 7,45E-06 de pacientes CCR, p=0,01, Figura 1C), lo que probablemente proporciona un metodo para discriminar entre pacientes que estan experimentando remision y aquellos que son proclives a la progresion luego de la radioquimioterapia neoadyuvante.
Valores umbral de TWIST1 y SLUG en celulas sangumeas que identifican pacientes CCR.
Luego, los autores determinaron el punto optimo del grado de admision para altos niveles de transcritos discriminando pacientes CCR mediante el analisis de la curva ROC (Fig. 2). Mediante esta estrategia, los niveles altos de TWIST1 (por encima del valor de admision, 9,30E-09) tuvieron 100% de sensibilidad y 50% de especificidad (Fig. 2A), y los de SLUG (por encima del grado de admision, 1,83E-10) tuvieron 96% de sensibilidad y 81% de especificidad en la discriminacion de pacientes con cancer entre los controles sanos (Fig. 2B). Asimismo, en el conjunto Miscelaneo, los niveles de ARNm de ZEB2 superiores al valor optimo del valor de admision de 4,08E-05 permitieron discriminar antes de la cirugfa entre pacientes con CCR y aquellos con cancer rectal que tuvieron respuesta histologica completa despues de la terapia neoadyuvante (96% de sensibilidad y 100% de especificidad; Figura 3 y Tabla 2).
Altos niveles combinados de ARNm de TWISTi y SLUG mejoran la especificidad en la identificacion de pacientes con cancer.
Al discriminar pacientes CCR de individuos sanos mediante la combinacion de altos valores de TWISTi y SLUG (segun se determino por las curvas ROC), no se afecto la sensibilidad (96%), ya que todos los pacientes menos uno tuvieron altos niveles de ambos transcritos, mientras que la especificidad se aumento hasta 93,3%, ya que solamente en un control estaban presentes altos niveles de ambos transcritos (Tabla1).
Tabla 1. Sensibilidad y especificidad para cancer colorrectal de niveles circulantes de ARNm de TWISTi y SLUG por encima de los valores optimos del grado de admision determinados por el analisis de la curva ROC.
FT de TEM
TWIST1 SLUG Combinados
Pacientes CCR
TP
26 25 25
FN
0 1 1
Sensibilidad
100% 96% 96%
Controles
TN
8 13 15
5
10
15
20
25
30
35
FP
8 3 1
Especificidad
50% 81% 93,3%
*Pacientes que presentan niveles simultaneos por encima de los valores optimos del grado de admision de TWIST1 y SLUG. TP = Verdadero positivo FN = Falso negativo
Tabla 2. Sensibilidad y especificidad de niveles circulantes* de ARNm de ZEB2 para discriminar pacientes con cancer colorrectal de aquellos con cancer de recto que experimentaron remision patologica completa luego de quimioterapia y radioterapia neoadyuvantes.
FT de TEM ZEB2
Pacientes CCR

TP 25

FP 1
Sensibilidad 96%
Cancer de recto, remision completa*

TN 4

FN 0
Especificidad 100%
*Pacientes con cancer de recto tratados con terapia neoadyuvante y respuesta histologica completa. TP = Verdadero positivo FN = Falso negativo
2. En las celulas sangumeas de pacientes con cancer de pancreas (CP) se encuentran altos niveles de ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2.
Los niveles de ARNm de FT de TEM difieren entre pacientes CP e individuos sanos.
Como se muestra en la Figura 4, en comparacion con controles sanos, 10 pacientes CP tuvieron niveles mas altos de TWIST1 (Fig. 4A, cuantificacion absoluta, mediana, controles 9,8E-9 frente a CP 4,10E-8; p<0,001) y de SLUG (Fig. 4B, controles 9,09E-13 frente a CP, 17,00E-08; p<0,0001 ), como asf tambien de ZEB2 (Fig. 4C, controles 1,35E-06 frente a CP 36,96E-06; p<0,001), pero no asf de SNAIL (Fig. 4D, controles 7,61 E-08 frente a CP 12,00E- 08; p=0,12). Por consiguiente, los niveles circulantes de ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2 en sangre de pacientes CP fueron en promedio 4, 4.000 y 22 veces mas elevados, respectivamente, que en los controles (cuantificacion relativa).
Valores umbral de FT de TEM en sangre que identifica pacientes CP.
Mediante el analisis de la curva ROC, los niveles altos de TWIST1 (por encima del grado de admision, 2,57E-8) tuvieron 90% de sensibilidad y 75% de especificidad (Fig. 5A), y los de SLUG (por encima del grado de admision, 5,70E-9) tuvieron 100% de sensibilidad y 87,5% de especificidad en la discriminacion de pacientes con cancer entre controles sanos (Fig. 5B y Tabla 3). Ademas, altos niveles de ZEB2 (por encima del valor del grado de admision, 26,84E-6) discriminaron entre pacientes con CP y controles con 80% de sensibilidad y 93% de especificidad (Fig. 5C y Tabla 3).
Los niveles de ARNm de ZEB2 son mas elevados en las celulas sangumeas de pacientes CP que en las de pacientes CCR. Ademas, al comparar los niveles en sangre de FT de TEM entre pacientes CP y CCR, hallamos que los niveles de ZEB2 eran significativamente superiores (p<0,001) en CP que en pacientes CCR. Mediante cuantificacion relativa, la diferencia en el nivel de transcritos fue de 8 veces (Fig. 6A). Solo los pacientes con cancer de recto en remision despues de terapia neoadyuvante (grupo Miscelaneo) tuvieron niveles de ARNm de ZEB2 similares a los de pacientes con CP.
Altos niveles concomitantes de ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2 aumentan la especificidad en la identificacion de pacientes CP, y en la discriminacion de pacientes CP de pacientes CCR. Al discriminar pacientes CP de individuos sanos mediante la combinacion de altos valores de TWIST1, SLUG y ZEB2 (segun se determino mediante las curvas ROC), la sensibilidad fue 80%, ya que todos los pacientes menos dos tuvieron altos niveles de los tres transcritos, mientras que la especificidad aumento hasta 100%, ya que los altos niveles concomitantes de estos tres

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para determinar si un sujeto esta afectado por un cancer que comprende el paso de someter a ensayo un muestra biologica de dicho sujeto para determinar la presencia de un panel de ARNm que codifican para factores de transcripcion involucrados en la transicion epitelial mesenquimal, en donde:
    a) dicho panel comprende al menos los ARNm de TWIST1, SLUG y ZEB2,
    b) el aumento de los niveles de ARNm, tanto de genes TWIST1 como SLUG, pero no del gen ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cancer colorrectal,
    c) el aumento de los niveles de ARNm de todos los genes TWIST1, SLUG y ZEB2 con respecto a las muestras de control es indicativo de un cancer de pancreas,
    donde dicha muestra biologica es una muestra de celulas sangumeas.
  2. 2. El metodo para determinar si un sujeto esta afectado por un cancer segun la reivindicacion 1, en donde al sujeto no se le administra un tratamiento antitumoral.
  3. 3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde dicha muestra de celulas sangumeas es una muestra enriquecida de celulas tumorales circulantes (CTC).
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 3, en donde dicha muestra enriquecida de celulas tumorales circulantes (CTC) es una muestra de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC).
  5. 5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los grados de admision pertinentes son los siguientes:
    - ARNm de TWIST1: 9,30E-09 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, o 2,57E-8 si el sujeto esta afectado por un cancer de pancreas;
    - ARNm de SLUG: 1,83E-10 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, o 5,70E-9 si el sujeto esta afectado por un cancer de pancreas;
    - ZEB2: 4,08E-05 si el sujeto esta afectado por un cancer colorrectal, como indicacion, luego del tratamiento contra el cancer, de remision parcial o total de cancer colorrectal, y/o una variacion de la etapa de cancer colorrectal y/o respuesta al tratamiento, o 26,84E-6 si el sujeto esta afectado por cancer de pancreas.
  6. 6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los niveles de ARNm se obtienen mediante RCP-TR.
  7. 7. El uso de un kit de RCP-TR cuantitativa para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes que incluye:
    - elementos de retrotranscripcion para obtener ADNc espedficos;
    - sondas espedficas de amplificacion para amplificar ADNc espedficos;
    - elementos de deteccion para detectar y medir el nivel de ADNc espedficos amplificados.
  8. 8. El uso del kit de RCP-TR cuantitativa segun la reivindicacion 7, en donde dichas sondas de amplificacion son capaces de amplificar:
    - la region nt. 781-835 de TWIST1, nro. de entrada: NM_000474.3, (SEQ ID No. 1);
    - la region nt. 711-819 de SLUG, nro. de entrada: NM_003068.3, (SEQ ID No. 2);
    - la region nt. 1262-1352 de ZEB2, nro. de entrada: NM_014795.3, (SEQ ID No. 3);
    - la region nt. 174-244 de SNAIL, nro. de entrada: NM_005985.3, (SEQ ID No. 4).
  9. 9. El uso del kit de RCP-TR cuantitativa segun la reivindicacion 7 u 8, en donde dichas sondas de amplificacion tienen esencialmente las secuencias:
    TWIST1 directo AGCAAGATTCAGACCCTCAAGCT (SEQ ID No. 8);
    TWIST1 inverso CCTGGTAGAGGAAGTCGATGTACCT (SEQ ID No. 9);
    SLUG directo TGTTTGCAAGATCTGCGGC (SEQ ID No. 10);
    SLUG inverso TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA (SEQ ID No. 11);
    ZEB2 directo GCTACACGTTTGCCTACCGC (SEQ ID No. 12); ZEB2 inverso CGATTACCTGCTCCTTGGGTT (SEQ ID No. 13).
    A
    i\j
    CO
    3-i
    2-*-
    20t
    1.0-
    |-----P=0.04
    1
    "¥* 0^,3°
    imagen1
    2-(0dta CT>.j0a<)
    B
    1000-
    Expresion de ARNm de SLUG ----------------fXO.0001---------------- — FX0.001 — *
    500- o < o X t-
    •
    z a 4.0-
    0 * •
    v
    0*
    • Mimyii---------------,----------------------1----------- Controles Miscelaneo CCR
    Fig. 1(1/2)
    c
    l\J
    -fc.
    200
    100
    to
    <
    U
    PMJ.25-
    0
    ► P=0.02
    r
    P=0.03 ■
    20r
    1.0
    X •••
  10. 0.06- - 0.04- 0.02- 0.00-L
    ------1----
    Controles
    1
    • •
    --------1-----------------1—
    Miscelaneo CCR
    2(Dd»aCT)o^()*g
    Fig. 1 (2/2)
    Expresion de ARNm de SNAIL
    10-|
    &
    S'
    7'
    6'
    5*
    ZOr
    1.0
    .. -sli
    imagen2
    imagen3
    Sensibilidad
    CCR (*), Consoles (-)
    Sensibilidad
    CCR (*), Consoles (-)
    rwisn
    1.00
    0,75
    U.OO-*—i--1---1---1
    0,00
    0,25
    0,50
    0,75
    Especmcidad 1
    SLUG
  11. 0.75-
  12. 0.75
    1,00
    Especmcidad 1
    imagen4
  13. 0.08n
    Expresion de ARNm de TWIST1 -----------p<0.01-------------
    i\j
    -'j
    ao6-
    A
    o awH
  14. 0.02-
  15. 0.00-
    < <•
    Controles
    imagen5
    —r~
    CP
    2*(Ddta CT>*10A9
    B
  16. 300.0-1
  17. 200.0-
    40-r
    Fig. 4 (1/2)
    20-
    -fr»
    Controles
    ~r
    CP
    NJ
    00
    imagen6
    2-( Delta CT)*^QAg
    P
  18. 2.0-
    1.5-
    1.0-
    imagen7
    Controles CP
    Fig. 4 (2/2)
    imagen8
    Sensibilidad
    o CP(+), Controles(-)
    Sensibilidad
    CP(+), Controles(-)
    0 00
    0,25
    0,50
    0,75
    1,00
    Especificidad 1
    SLUG
    1.00
    Especificidad 1
    Fig. 5 1/2
    TWISTl
    imagen9
    imagen10
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