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ES2649966T3 - Anticuerpos anti-VEGF y sus usos - Google Patents

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ES2649966T3
ES2649966T3 ES13805701.3T ES13805701T ES2649966T3 ES 2649966 T3 ES2649966 T3 ES 2649966T3 ES 13805701 T ES13805701 T ES 13805701T ES 2649966 T3 ES2649966 T3 ES 2649966T3
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Yoshiko Akamatsu
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AbbVie Biotherapeutics Inc
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Abstract

Un anticuerpo anti-VEGF, en donde el anticuerpo es biespecífico y la región variable de la cadena pesada comprende: (a) las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3; (b) las sustituciones Y en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3; o (c) las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y A en Kabat 100a en CDR-H3; en donde, además de dichas sustituciones, el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.

Description

Anticuerpos anti-VEGF y sus usos
2. Campo de lainvención
La presente descripción se refiere a anticuerpos anti-VEGF, composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF y usos terapéuticos de tales anticuerpos.
3. Antecedentes
La angiogénesis ha surgido como una diana terapéutica atractiva debido a su implicación en una variedad de afecciones patológicas, que incluyen crecimiento tumoral, retinopatías proliferativas, degeneración macular relacionada con la edad, artritis reumatoide (AR) y psoriasis (Folkman et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934) La primera indicación de factores angiogénicos moleculares específicos se basó en la observación de la fuerte respuesta neovascular inducida por tumores trasplantados. Ahora se sabe que la angiogénesis es esencial para el crecimiento de la mayoría de los tumores primarios y su posterior metástasis. Numerosas moléculas se han asociado desde entonces a la regulación positiva de la angiogénesis, incluyendo el factor de crecimiento transformante (TGF)-α, TGF-β, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de necrosis tumoral-α, la angiogenina, la interleuquina (IL)-8 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, también denominado VEGFA
o factor de permeabilidad vascular (VPF)) (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676).
Las proteínas VEGF son importantes proteínas de señalización implicadas tanto en la vasculogénesis embrionaria normal (la formación de novo del sistema circulatorio embrionario) como en la angiogénesis anómala (el crecimiento de los vasos sanguíneos a partir de la vasculatura preexistente) (Ferrara et al., 1996, Nature 380:439-442; Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol. 146:1029-1039). El VEGF se asocia con tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas, síndromes neovasculares interoculares, inflamación y edema cerebral y patología del tracto reproductivo femenino (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). El ARNm de VEGF está expresado en exceso en muchos tumores humanos, incluidos los de pulmón, mama, tracto gastrointestinal, riñón, páncreas y ovario (Berkman et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:153-159). Los aumentos de VEGF en el humor acuoso y vítreo de los ojos se han asociado con diversas retinopatías (Aiello y col., 1994, N. Engl. J. Med. 331:1480-1487). La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), una de las principales causas de pérdida de visión en los ancianos, se debe a la neovascularización y la exudación vascular. Se ha demostrado la localización de VEGF en las membranas neovasculares coroideas en pacientes afectados por AMD (López et al., 1996, Invest. Ophtalmo.Vis. Sci. 37:855-868).
La familia de genes de VEGF incluye el miembro prototípico VEGFA, así como VEGFB, VEGFC, VEGFD y factor de crecimiento placentario (PLGF). El gen VEGFA humano está organizado en forma de ocho exones separados por siete intrones. Existen al menos seis isoformas diferentes de VEGF, VEGF121, VEGF145, VEGF162, VEGF165, VEGF65b, VEGF83, VEG189 y VEGF206, donde los subíndices se refieren al número de aminoácidos que quedan después de la escisión de la señal. El VEGF nativo es una glucoproteína de unión a heparina homodimérica de 45 kDa (Ferrara et al., 2003, Nature Medicine 9:669-676). El VEGF (específicamente el VEGFA) se une a dos tirosina quinasas receptoras relacionadas, VEGFR-1 (también denominado Flt-1) y VEGFR-2 (también denominado Flk-1 o región de dominio de quinasa (KDR) o CD309). Cada receptor tiene siete regiones extracelulares y una región transmembrana. El VEGF también se une a las neuropilinas NRP1 (también denominado receptor del factor de crecimiento vascular endotelial 165 (VEGF165R) o CD304) y NRP2 también denominado receptor 2 del factor de crecimiento vascular endotelial 165 (VEGF165R2)).
Dado su papel central en la regulación de la angiogénesis, VEGF proporciona una diana atractiva para la intervención terapéutica. De hecho, actualmente se están desarrollando una variedad de estrategias terapéuticas destinadas a bloquear el VEGF o su sistema de señalización de receptores para el tratamiento de enfermedades neoplásicas. El anticuerpo anti-VEGF bevacizumab, también conocido como rhuMAb VEGF o Avastin®, es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante creado y comercializado por Genentech (Presta et al., 1997, Cancer Res. 57:4593-4599). Para construir bevacizumab, se injertaron las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal murino anti-VEGF A.4.6.1 en marcos humanos y una región constante de IgG. Después, se introdujeron mutaciones adicionales fuera de las CDR en la molécula para mejorar la unión, proporcionando un anticuerpo en el que ~93% de la secuencia de aminoácidos deriva de la IgG1 humana y ~7% de la secuencia deriva del anticuerpo murino A.4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149.000 Dalton y está glicosilado.
Ranibizumab es un fragmento Fab madurado por afinidad derivado de bevacizumab. Ranibizumab tiene una afinidad más alta por VEGF y también tiene de un tamaño más pequeño, lo que le permite penetrar mejor en la retina, y así tratar la neovascularización ocular asociada con la AMD (Lien y Lowman, en: Chernajovsky, 2008, Therapeutic Antibodies. Handbook of Experimental Pharmacology 181, Springer-Verlag, Berlín Heidelberg 131-150).
Ranibizumab fue desarrollado y comercializado por Genentech bajo el nombre comercial Lucentis®.
El tratamiento de los pacientes con cáncer con un régimen que incluya Avastin® puede provocar efectos secundarios que incluyen hipertensión, proteinuria, eventos tromboembólicos, hemorragia y toxicidad cardíaca (Blowers y Hall, 2009, Br. J. Nurs. 18(6):351-6, 358). Además, a pesar de ser un anticuerpo humanizado, bevacizumab puede provocar una respuesta inmunológica cuando se administra a seres humanos. Dicha respuesta inmunológica puede dar como resultado una aclaramiento mediado por el complejo inmunológico de los anticuerpos
o fragmentos de la circulación, y hacer que la administración repetida sea inadecuada para la terapia, reduciendo de ese modo el beneficio terapéutico para el paciente y limitando la re-administración del anticuerpo.
Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos o fragmentos anti-VEGF mejorados que superen uno o más de estos problemas, por ejemplo, generando variantes con mayor afinidad que bevacizumab que se puedan administrar a dosis reducidas, o variantes con inmunogenicidad reducida y otras efectos secundarios en comparación con bevacizumab.
La cita o identificación de cualquier referencia en la Sección 2 o en cualquier otra sección de esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como estado de la técnica en la presente descripción.
El documento WO 2010/148223 describe anticuerpos dirigidos al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y los usos de tales anticuerpos.
El documento WO 2009/129538 describe la creación de CDR equivalentes humanas y anticuerpos que las contienen mediante un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno.
4. Compendio
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-VEGF, en donde el anticuerpo es biespecífico y la región variable de la cadena pesada comprende: (a) las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en la CDR-H1 y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (b) las sustituciones Y en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en la CDR-H1, y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (c) las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en la CDR-H1, y A en Kabat 100a en la CDR-H3; en donde, además de dichas sustituciones, el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
La presente invención también se refiere a un anticuerpo anti-VEGF, en donde el anticuerpo es una IgG y la región variable de la cadena pesada comprende Y en Kabat 31 en la CDR-H1 y: (a) las sustituciones G en Kabat 28 y N en Kabat 30 en la CDR-H1, y F en Kabat 97 y A en Kabat 100a en la CDR-H3; (b) las sustituciones G en Kabat 28 en la CDR-H1, y F en Kabat 97 y A en Kabat 100a en la CDR-H3; (c) las sustituciones G en Kabat 28 en la CDR-H1, y F en Kabat 97 y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (d) las sustituciones G en Kabat 28 en la CDR-H1, y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (e) las sustituciones Y en Kabat 28 en la CDR-H1, y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (f) las sustituciones Y en Kabat 28 en la CDR-H1, y F en Kabat 97 y Q en Kabat 100a en la CDR-H3; (g) las sustituciones G en Kabat 28 en la CDR-H1, y A en Kabat 100a en la CDR-H3; (h) las sustituciones G en Kabat 28 en la CDR-H1, y G en Kabat 100a en la CDR-H3; en donde además de dichas sustituciones, el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
La presente invención se refiere adicionalmente a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VEGF de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción se refiere a variantes del anticuerpo anti-VEGF bevacizumab con características mejoradas, tales como una inmunogenicidad reducida y/o una afinidad mejorada frente a VEGF en comparación con bevacizumab o ranibizumab. Bevacizumab tiene tres CDR de cadena pesada, a las que se hace referencia en la presente memoria (en orden de amino a carboxi terminal) como CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, y tres CDR de cadena ligera, a las que se hace referencia en la presente memoria (en orden de amino a carboxi terminal) como CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3. Las secuencias de las CDR de bevacizumab se muestran en las Figuras 1A y 1B, y su numeración se expone en la Tabla 1 (para las CDR de cadena pesada) y la Tabla 2 (para las CDR de cadena ligera). Un anticuerpo relacionado, ranibizumab, se generó por medio de la maduración de afinidad de bevacizumab. Ranibizumab tiene secuencias idénticas de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H2 a las de bevacizumab, pero varía en sus secuencias CDR-H1 y CDR-H3 de las de bevacizumab. Las secuencias de cadena pesada y ligera de ranibizumab se muestran en la Figura 1C, y las CDR se muestran en la Figura 1D.
Los anticuerpos de la descripción generalmente tienen CDR con al menos una sustitución de aminoácido en al menos una CDR en comparación con bevacizumab y ranibizumab. Los anticuerpos de la descripción típicamente tienen secuencias de CDR de cadena pesada que confieren una o más características favorables en comparación
con las secuencias de CDR de bevacizumab y/o ranibizumab, tales como mejoras en uno o más de: la velocidad de asociación (ka), velocidad de disociación (kd) , constante de afinidad (KD), CE50 para la inhibición de la unión de VEGF al receptor 1 de VEGF ("VEGFR1" o "VEGF-R1"), CE50 para la inhibición de la unión de VEGF al receptor 2 de VEGF ("VEGFR2" o "VEGF-R2"), y CE50 para la inhibición de la proliferación de HUVEC mediada por VEGF. En algunas realizaciones, las mejoras se determinan en el contexto de un anticuerpo IgG monoespecífico. En otras realizaciones más, las mejoras se determinan en el contexto de un anticuerpo multiespecífico, tal como las moléculas de Ig-DVD de la Tabla 23. En diversas realizaciones, una o más de estas características se mejoran en al menos 25%, en al menos 50%, o en al menos 100%, y opcionalmente se mejoran hasta en 150%, hasta en 200%, hasta en 300% o incluso más.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción típicamente tienen CDR con al menos una sustitución de aminoácido en comparación con las CDR de bevacizumab y/o ranibizumab. En varios aspectos, los anticuerpos tienen CDR con 2, 3 o incluso 4 o más sustituciones en comparación con las CDR de bevacizumab y/o ranibizumab. En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF tienen al menos una sustitución de aminoácido en CDR-H1 y/o al menos una sustitución de aminoácido en CDR-H3, en comparación con las CDR de bevacizumab y/o ranibizumab. Además, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden tener secuencias de VH y/o VL que están relacionadas con las secuencias de VH y/o VL de bevacizumab y/o ranibizumab, es decir, tienen secuencias marco que están relacionadas con las secuencias marco de bevacizumab y/o ranibizumab. En ciertos aspectos, las secuencias marco pueden tener cada una hasta 1, hasta 2 o hasta 3 sustituciones de aminoácidos. En otros aspectos, las secuencias marco son idénticas a las secuencias marco de bevacizumab y/o ranibizumab. De acuerdo con esto, en ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden tener, además de hasta 17 sustituciones de CDR (y en ciertas realizaciones hasta 10, hasta 9, hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta a 5, o hasta 4 sustituciones de CDR), (a) una secuencia de VH correspondiente a VH de bevacizumab y una secuencia de VL correspondiente a VL de bevacizumab; (b) una secuencia de VH correspondiente a VH de ranibizumab y una secuencia de VL correspondiente a VL de ranibizumab; (c) una secuencia de VH correspondiente a VH de bevacizumab y una secuencia de VL correspondiente a VL de ranibizumab; o (d) una secuencia de VH correspondiente a VH de ranibizumab y una secuencia de VL correspondiente a VL de bevacizumab.
En ciertos aspectos, los anticuerpos incluyen al menos una sustitución de CDR o una combinación de sustituciones de CDR expuestas en una cualquiera de las Tablas 21-22, 24 y 26, opcionalmente combinadas con una o más sustituciones de CDR adicionales o combinaciones de sustituciones de CDR de una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9, 13-16 y 21-26. En una realización específica, se incluyen una o más sustituciones de la Tabla 6.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos, tres, cuatro o los cinco de: (a) T o G o R o Y en Kabat 28en laCDR-H1; (b) KoNoRoW en Kabat 30en laCDR-H1; (c)FoHoLoW oYen Kabat 31en laCDR-H1; (d) Ao Do E oF oP oY en Kabat 97 en la CDR-H3; y (e) AoG oQ o Ten Kabat 100aen la CDR-H3. La correspondencia entre la numeración de Kabat y las posiciones de CDR se expone en la Tabla 1 para las CDR de cadena pesada y en la Tabla 2 para las CDR de cadena ligera.
En aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) G en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) A en Kabat 100a en la CDR-H3. En otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) G en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) Q en Kabat 100a en la CDR-H3. En aún otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) G en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) T en Kabat 100a en la CDR-H3.
En otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) T en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) A en Kabat 100a en la CDR-H3. En otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) T en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) Q en Kabat 100a en la CDR-H3. En aún otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen uno, dos o los tres de: (a) T en Kabat 28 en la CDR-H1; (b) Y en Kabat 31 en la CDR-H1; y (c) T en Kabat 100a en la CDR-H3.
En otros aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen al menos 2 de las sustituciones de aminoácidos presentes en las variantes combinatorias designadas C1 a C13 en la Tabla 24. En ciertos aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen las tres sustituciones presentes en C9, C10, C12 o C13, o tres de las sustituciones presentes en cualquiera de C1-C8 y C11. En otros aspectos más, los anticuerpos anti-VEGF incluyen las cuatro sustituciones presentes en cualquiera de C5-C8 y C11, o cuatro de las sustituciones presentes en uno cualquiera de C1-C4. En otros aspectos más, los anticuerpos anti-VEGF incluyen las cinco sustituciones presentes en uno cualquiera de C1-C4. En cada uno de los aspectos anteriores, Kabat 100a puede ser sustituido por T.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen, opcionalmente además de las sustituciones de CDR descritas anteriormente, al menos una sustitución en comparación con bevacizumab o ranibizumab seleccionado entre T30K en la CDR-H1; T30N en la CDR-H1; N31H en la CDR-H1; N31L en la CDR-H1; N31W en la CDR-H1;
N31Y en la CDR-H1; H97F en la CDR-H3; S100aQ en la CDR-H3; y S100aT en la CDR-H3. En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas entre una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9, 13-16, y 21-26.
En otros aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen, opcionalmente además de las sustituciones de CDR descritas anteriormente, al menos una sustitución en comparación con bevacizumab o ranibizumab seleccionada entre N31F en la CDR-H1; K64S en la CDR-H2; K64Q en la CDR-H2; Y53F en la CDR-H2; H97E en la CDR-H3; H97D en la CDR-H3; H97P en la CDR-H3; Y98F en la CDR-H3; Y99E en la CDR-H3; Y99D en la CDR-H3; S100aG en la CDR-H3 y T51A en la CDR-L2. En otros aspectos, los anticuerpos anti-VEGF incluyen al menos una sustitución seleccionada de las Tablas 8 y 9. Las mutaciones adicionales que se pueden incorporar a los anticuerpos variantes de afinidad mejorada pueden ser sustituciones desinmunizantes candidatas, tales como las descritas en la Tabla 6, así como otras mutaciones, p. ej., sustituciones, que no destruyen la capacidad de los anticuerpos para unirse al VEGF, incluidas, entre otras, las mutaciones descritas en las Tablas 10 y 11, o mutaciones conocidas, tales como las mutaciones descritas en las Tablas 12-1 a 12-9 y 13. Otras mutaciones más que se pueden incorporar incluyen, pero no se limitan a, las mutaciones descritas en las Tablas 14-16 y 21-26.
En aspectos específicos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen, opcionalmente además de las sustituciones de CDR descritas anteriormente, una combinación de sustituciones seleccionadas de la Tabla 7, y opcionalmente una o más mutaciones adicionales, p.ej., sustituciones desinmunizantes candidatas, tales como las descritas en la Tabla 6, así como otras mutaciones, p.ej., sustituciones, que no destruyen la capacidad de los anticuerpos para unirse al VEGF, incluidas, pero no limitadas a, las mutaciones descritas en las Tablas 10 y 11, o mutaciones conocidas, tales como las mutaciones descritas en las Tablas 12-1 a 12-9 y 13. Otras mutaciones más que se pueden incorporar a los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen, pero no se limitan a, las mutaciones descritas en las Tablas 14-16 y 21-26.
En otros aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen una, opcionalmente además de las sustituciones de CDR descritas anteriormente, o más de las siguientes sustituciones de CDR: K64S (CDR-H2), K64Q (CDR-H2), Y53F y K64Q (CDR-H2), H97E e Y98F (CDR-H3) o T51A (CDR-L2). Los anticuerpos anti-VEGF también pueden incluir opcionalmente una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas a partir de una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9 o 13-16 y 21-26.
Otras sustituciones de CDR pueden incluir N31F (CDR-H1), H97E (CDR-H3), H97D (CDR-H3), H97P (CDR-H3), Y99E (CDR-H3), Y99D (CDR-H3), S100aG (CDR -H3) en donde la posición 3 en la CDR-H3 opcionalmente no es tirosina, T28P, N31F, N31G y N31M (CDR-H1), H97A, H97Q, H97S, H97T, S100aD, S100aE y S100Av (CDR-H3), T30W, T30R o T30Q (CDR-H1), Y53F, T58F, A61G, A61K, A61R, A61H, A61Y, K64G, K64E, R65L, R65T, R65A, R65E y R65D (CDR-H2), y Y98F e Y100eF (CDR-H3). Las CDR opcionalmente contienen una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas entre una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9, 13 y 21-26.
Otras sustituciones más pueden incluir sustituciones de CDR de cadena pesada que incluyen una combinación de sustituciones seleccionadas entre: (a) N31F en la CDR-H1, H97D en la CDR-H3, Y99D en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3; (b) N31F en la CDR-H1, H97P en la CDR-H3, Y99D en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3; (c) N31F en la CDR-H1, H97P en la CDR-H3 e Y99E en la CDR-H3; (d) N31F en la CDR-H1, H97E en la CDR-H3 e Y99E en la CDR-H3; (e) N31F en la CDR-H1, H97D en la CDR-H3 e Y99E en la CDR-H3; (f) N31F en la CDR-H1, H97E en la CDR-H3, Y99D en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3; (g) N31F en la CDR-H1, Y99D en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3; (h) N31F en la CDR-H1, H97P en la CDR-H3 e Y99D en la CDR-H3; (i) N31F en la CDR-H1, H97D en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3; (j) N31F en la CDR-H1 y S100aG en la CDR-H3; o (k) N31F en la CDR-H1, H97P en la CDR-H3 y S100aG en la CDR-H3. Otras sustituciones opcionales pueden incluir una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas a partir de una o más de las Tablas 6, 7, 8, 9, 10, 11, 121 a 12-9, 13 y 21-26.
Otras sustituciones más de la cadena pesada pueden incluir al menos una sustitución seleccionada entre A61F en la CDR-H2, A61E en la CDR-H2, A61D en la CDR-H2, D62L en la CDR-H2, D62G en la CDR-H2, D62Q en la CDR-H2, D62T en la CDR-H2, D62K en la CDR-H2, D62R en la CDR-H2, D62E en la CDR-H2, D62H en la CDR-H2, K64S en la CDR-H2, K64V en la CDR-H2, K64Q en la CDR-H2, R65V en la CDR-H2, R65F en la CDR-H2, R65H en la CDR-H2, R65N en la CDR-H2, R65S en la CDR-H2, R65Q en la CDR-H2, R65K en la CDR-H2, R65I en la CDR-H2 e Y98H en la CDR-H3. Opcionalmente, se pueden incluir una o más mutaciones adicionales o combinaciones de mutaciones seleccionadas a partir de una o más de las Tablas 7, 8, 9, 10, 11, 12-1 a 12-9, 13 y 21-26.
En ciertos aspectos, los anticuerpos de la descripción tienen secuencia de VH y VL que tienen una identidad de secuencia de al menos 80% (y en ciertas realizaciones, una identidad de secuencia de al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99%) con las secuencias de VH y VL de bevacizumab o ranibizumab, e incluyen al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una CDR en comparación con bevacizumab o ranibizumab. En otros aspectos, los anticuerpos de la descripción tienen secuencias de VH y VL que tienen una
identidad de secuencia de al menos 80% (y en ciertos aspectos una identidad de secuencia de al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o al menos 99%) con las secuencias de VH y VL de bevacizumab o ranibizumab, e incluyen al menos una sustitución de aminoácidos en al menos una región marco en comparación con bevacizumab o ranibizumab. En aspectos específicos, el porcentaje de identidad de secuencia para la cadena pesada y la cadena ligera en comparación con las secuencias de VH y VL de bevacizumab o ranibizumab se seleccionan independientemente entre una identidad de secuencia de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% de identidad de secuencia, o al menos 99%. En ciertos aspectos, los anticuerpos de la descripción tienen secuencias de VH y/o VL que tienen una identidad de secuencia de al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% con las secuencias de VH y/o VL de bevacizumab o ranibizumab.
En ciertos aspectos, los anticuerpos de la descripción tienen hasta 17 sustituciones de aminoácidos en sus CDR en comparación con bevacizumab o ranibizumab. Bostrom et al., 2009, Science 323: 1610-14 han generado anticuerpos variantes con 17 sustituciones de aminoácidos que mantienen su capacidad de unión a la diana.
En aspectos específicos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción tiene, independientemente:
● hasta uno, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve
o hasta diez sustituciones en CDR-H1 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab;
●
hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez, hasta once, hasta doce, hasta trece, hasta catorce, hasta quince, hasta dieciséis o hasta diecisiete sustituciones en CDR-H2 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab;
●
hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez, hasta once, hasta doce, hasta trece o hasta catorce sustituciones en CDR-H3 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab;
●
hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho, hasta nueve, hasta diez o hasta once sustituciones en CDR-L1 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab;
●
hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis o hasta siete sustituciones en CDR-L2 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab; y
●
hasta una, hasta dos, hasta tres, hasta cuatro, hasta cinco, hasta seis, hasta siete, hasta ocho o hasta nueve sustituciones en CDR-L3 en comparación con la correspondiente CDR de bevacizumab o de ranibizumab.
En algunos aspectos, cualquier mutación individual no disminuye la afinidad en más de dos veces y preferiblemente mantiene o mejora la afinidad en comparación con el aminoácido correspondiente de bevacizumab o ranibizumab.
En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo multiespecífico, que comprende una porción de unión a VEGF y una segunda porción de unión a la diana (que puede ser VEGF o una diana diferente). Un anticuerpo multiespecífico de la descripción puede incluir regiones Fc con mutaciones que imponen una asociación de cadena correcta.
En algunos aspectos, el anticuerpo multiespecífico tiene afinidad por VEGF y DLL4.
Un tipo preferido de anticuerpo multiespecífico es una inmunoglobulina de dominio de variable dual ("DVD") ("DVD-Ig"). Una región variable de cadena pesada de DVD-Ig ilustrativa en la que se pueden incorporar las sustituciones de cadena pesada descritas en la presente memoria se establece como SEQ ID NO: 413, y una cadena pesada de DVD-Ig ilustrativa en la que se pueden incorporar las sustituciones de cadena pesada descritas en la presente memoria se establece como SEQ ID NO: 415. Las regiones variables de cadena ligera de DVD-Ig ilustrativas en las que se pueden incorporar las sustituciones de cadena ligera descritas en la presente memoria se presentan como SEQ ID NO: 414 y SEQ ID NO: 434, y las cadenas ligeras de DVD-Ig ilustrativas en las que se pueden incorporar las sustituciones de cadena pesada descritas en la presente memoria se presentan SEQ ID NO: 435 y SEQ ID NO: 416. En una realización, la DVD-Ig anti-VEGF en la que se pueden introducir las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente memoria es una inmunoglobulina que tiene una región variable de cadena pesada del SEQ ID NO: 413 y una región variable de cadena ligera del SEQ ID NO: 414 o SEQ ID NO: 434. En otra realización, la anti-VEGF DVD-Ig en la que se pueden introducir las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente memoria es una inmunoglobulina que tiene una cadena pesada del SEQ ID NO: 415 y una cadena ligera del SEQ ID NO: 416 o SEQ ID NO: 435.
En otras realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser componentes de anticuerpos multiespecíficos que están basados en moléculas de inmunoglobulina completas e incluyen regiones Fc, por ejemplo regiones Fc de IgG. Tales estructuras pueden incluir, pero no se limitan a, IgG-Fv, IgG-(scFv)2, DVD-Ig, (scFv)2-(scFv)2-Fc y (scFv)2-Fc-(scFv)2. En otros aspectos, los fragmentos anti-VEGF de los mismos pueden ser
componentes de moléculas multiespecíficas sin regiones Fc, basadas en fragmentos de IgG o DVD o scFv. Las moléculas multiespecíficas ilustrativas que carecen de regiones Fc y en las que se pueden incorporar los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de anticuerpos, tales como dímeros de scFv (diacuerpos), trímeros (triabodies) y tetrámeros (tetracuerpos), dímeros de Fab (productos conjugados por polipéptido adherente o dominios de proteína) y trímeros de Fab (químicamente conjugados).
Si bien las sustituciones descritas anteriormente utilizan las posiciones de CDR de bevacizumab como punto de referencia, también se pueden incorporar a secuencias de CDR de ranibizumab, incluso si ranibizumab tiene una secuencia diferente de bevacizumab en ciertas posiciones. A modo de ejemplo, las variantes de la descripción pueden incluir "T28P" en la CDR-H1; sin embargo, Kabat 28 en ranibizumab no es T (como en bevacizumab) sino D. Sin embargo, la sustitución de prolina también se puede incorporar a Kabat 28 en la CDR-H1 de ranibizumab.
Los anticuerpos de la descripción se pueden conjugar con fármacos para formar productos conjugados de anticuerpo-fármaco ("ADC"). Los agentes ilustrativos a los que se pueden conjugar se establecen en la Sección 6.6.
La presente descripción proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-VEGF modificados. Los reactivos y formulaciones ilustrativos se establecen en la Sección 6.9. En algunos aspectos, las composiciones farmacéuticas tienen una mayor afinidad por VEGF y/o una menor inmunogenicidad en comparación con bevacizumab o ranibizumab.
Los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se proporcionan en la presente memoria, al igual que los vectores que comprenden los ácidos nucleicos (véanse, p.ej., las realizaciones ilustrativas 76 y 177 en la Sección 13). Adicionalmente, en la presente memoria se proporcionan células recombinantes. Tales células recombinantes incluyen, por ejemplo, células anfitrionas procarióticas y eucarióticas transformadas con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-VEGF, así como células anfitrionas eucarióticas (tales como mamífero) modificadas por ingeniería genética para expresar las secuencias de nucleótidos. También se proporcionan métodos para producir anticuerpos anti-VEGF mediante el cultivo de células anfitrionas.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción son útiles en el tratamiento de cánceres, afecciones retinianas y trastornos inmunológicos. Los cánceres ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, carcinoma de colon, carcinoma rectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de mama. Las afecciones retinianas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, la degeneración macular relacionada con la edad ("AMD"), el edema macular después de la oclusión venosa retiniana ("RVO") y el edema macular diabético ("DME"). Los trastornos inmunológicos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, psoriasis y enfermedad de Grave.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden utilizar en dosis reducidas en comparación con bevacizumab o ranibizumab, p.ej., dosificaciones al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% más bajas.
Cabe señalar que los artículos indefinidos "un", "uno" y "una" y los artículos definidos "el" y "la" se utilizan en la presente solicitud, como es común en las solicitudes de patente, para significar uno o más a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, el término "o" se utiliza en la presente solicitud, como es común en las solicitudes de patente, para significar el "o" disyuntivo o el "y" conjuntivo.
Las características y ventajas de la descripción serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de las realizaciones de la misma.
5. Breve descripción de las tablas yfiguras
La Tabla 1 muestra la numeración de los aminoácidos en las CDR de cadena pesada de bevacizumab. Las CDR 1-3 se describen como SEQ ID NO: 3-5, respectivamente.
La Tabla 2 muestra la numeración de los aminoácidos en las CDR de la cadena ligera de bevacizumab. Las CDR 1-3 se describen como SEQ ID NO: 6-8, respectivamente.
La Tabla 3 muestra péptidos de VL de bevacizumab que se sometieron a ensayo para determinar su inmunogenicidad.
La Tabla 4 muestra péptidos de VH de bevacizumab que se sometieron a ensayo para determinar su inmunogenicidad.
La Tabla 5 muestra las regiones del epítopo de células T CD4+ identificadas en bevacizumab. Las regiones CDR están subrayadas.
La Tabla 6 muestra mutaciones candidatas en CDR-H2 y CDR-H3 para disminuir la inmunogenicidad de bevacizumab. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 6 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 7 muestra sustituciones de aminoácidos de la CDR de cadena pesada en bevacizumab que dan como resultado una mejor KD como se analiza por medio de resonancia de plasmón superficial. Δ kon se refiere a la multiplicidad de mejora en la kon (mutante/WT). Δ koff se refiere a la multiplicidad de mejora en la koff (WT/mutante). Δ KD se refiere a la mejora en la KD en el mutante con respecto al tipo salvaje. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 7 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 8 muestra mutaciones en las CDR de cadena pesada de bevacizumab que los estudios de unión preliminares indican que aumentan la afinidad hacia VEGF (datos no mostrados). La numeración de los aminoácidos en la Tabla 8 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 9 muestra mutaciones en las CDR de cadena pesada de bevacizumab que los estudios preliminares indican que aumentan la afinidad hacia VEGF (datos no mostrados). La numeración de los aminoácidos en la Tabla 9 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 10 muestra mutaciones en las CDR de cadena pesada de bevacizumab que no afectan a la unión y se pueden incorporar a los anticuerpos de la descripción. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 10 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 11 muestra mutaciones en las CDR de cadena ligera de bevacizumab que no afectan a la unión y se pueden incorporar a los anticuerpos de la descripción. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 11 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena ligera de bevacizumab.
Las Tablas 12-1 a 12-9 muestran mutaciones conocidas en las CDR de cadena pesada de bevacizumab que se pueden incorporar a los anticuerpos de la descripción. Cada fila en las Tablas 12-1 a 12-9 incluye una variante conocida distinta. Para cada variante, las secuencias de CDR conocidas están sombreadas. Los identificadores de secuencia para cada variante identificada en las Tablas 12-1 a 12-9 se establecen en las Tablas 20-1 a 20-9, respectivamente. La columna CDR-H1 proporciona una secuencia parcial de CDR-H1. La asparragina final de CDR-H1 no se muestra. Esta secuencia parcial corresponde al SEQ ID NO: 411. Aunque se muestran mutaciones conocidas en CDR-H1 en el contexto de esta secuencia parcial, se observa que las mutaciones existen en el contexto de la CDR completa.
La Tabla 13 muestra mutaciones conocidas en las CDR de cadena ligera de bevacizumab que se pueden incorporar a los anticuerpos de la descripción. Cada fila en la Tabla 13 incluye una variante conocida distinta. Para cada variante, las secuencias de CDR conocidas están sombreadas. Los identificadores de secuencia para cada variante identificados en la Tabla 13 se muestran en la Tabla 20-10.
La Tabla 14 muestra péptidos de VH de CDR2 de bevacizumab que se sometieron a ensayo para determinar su inmunogenicidad, en donde los residuos inalterados del SEQ ID NO: 62 están indicados por una caja en blanco. También se proporcionan resultados de análisis de células T CD4+.
La Tabla 15 muestra péptidos de VH de CDR3 de bevacizumab que se sometieron a ensayo para determinar su inmunogenicidad, en donde los residuos inalterados del SEQ ID NO: 74 están indicados por una caja en blanco. También se proporcionan resultados de análisis de células T CD4+.
La Tabla 16 muestra los péptidos de VL de CDR2 de bevacizumab que se sometieron a ensayo para determinar su inmunogenicidad, en donde los residuos inalterados del SEQ ID NO: 25 están indicados por una caja en blanco. También se proporcionan resultados de análisis de células T CD4+.
La Tabla 17 muestra modificaciones de epítopos seleccionadas para los tres epítopos de células T CD4+ en bevacizumab.
La Tabla 18 muestra mutantes de región variable única y su valor de intensidad de fluorescencia media (IFM) asociado.
La Tabla 19 muestra mutantes de región variable combinados y su CE50 asociada.
Las Tablas 20-1 a 20-10 muestran los SEQ ID NO, cuando se conocen, correspondientes a las CDR de las variantes de bevacizumab enumeradas en las Tablas 12-1 a 12-9 y en la Tabla 13, respectivamente. N/A indica una secuencia de CDR desconocida.
La Tabla 21 muestra datos de unión para IgG anti-VEGF, inmunoglobulina (Ig) DVD DLL4-VEGF SS, e inmunoglobulina (Ig) DVD SL DLL4-VEGF, comprendiendo cada uno CDR de cadena pesada de bevacizumab mutantes. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 21 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 22 muestra mutaciones en CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de bevacizumab que dan como resultado una afinidad de VEGF similar o reducida en una Ig-DVD SS DLL4-VEGF en comparación con una Ig-DVD SS DLL4-VEGF sin la mutación. La numeración de los aminoácidos en la Tabla 22 corresponde a la numeración de Kabat en la cadena pesada de bevacizumab.
La Tabla 23 muestra regiones variables de cadena pesada de DVD-Ig anti-VEGF de cadena pesada y ligera ejemplares y cadenas pesadas y ligeras DVD-Ig anti-VEGF ejemplares en las que se pueden introducir las sustituciones de aminoácidos descritas en la presente memoria. Las CDR se muestran en negrita, las secuencias conectoras se muestran subrayadas y las regiones constantes se muestran en cursiva. Una región variable de cadena pesada ilustrativa, con un conector corto, se muestra como SEQ ID NO: 413. Las regiones variables de la cadena ligera ilustrativas, con conectores cortos y largos, se muestran como SEQ ID NO: 414 y SEQ ID NO: 434, respectivamente. Una cadena pesada ilustrativa, con un conector corto, se muestra como SEQ ID NO: 415. Las cadenas ligeras ilustrativas, con conectores cortos y largos, se muestran como SEQ ID NO: 435 y SEQ ID NO: 416, respectivamente.
La Tabla 24 resume los datos de expresión y afinidad y las mejoras en la inhibición de la unión de VEGF a sus receptores y en la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF para las variantes que tienen las combinaciones de sustituciones designadas C1 a C13 en comparación con el VH de bevacizumab ("WT" en la Tabla 24) y el VH de ranibizumab ("Luc" en la Tabla 24).
La Tabla 25 resume los datos de afinidad comparativa para el VH de bevacizumab ("WT" en la Tabla 25) o el VH de ranibizumab ("Luc" en la Tabla 25) en formatos IgG y DVD-Ig. Ambos controles de "WT" y "Luc" tenían la secuencia de VL de bevacizumab (SEQ ID NO: 2). Los formatos DVD-Ig eran moléculas DVD-Ig DLL4-VEGF en las que las secuencias de VH de VEGF estaban en el dominio interno, con una versión SL y una versión SS.
La Tabla 26 resume los datos de afinidad para las variantes que tienen las combinaciones de sustituciones designadas C5, C6, C9, C10, C11, C12 y C13 en el contexto de una DVD-Ig DLL4-VEGF que contiene conectores SL y en el que las secuencias de VH de VEGF estaban en el dominio interno. Los controles para este análisis fueron moléculas de DVD-Ig que contenían secuencias de CDR de bevacizumab ("WT" en la Tabla 26) o ranibizumab ("Luc" en la Tabla 26). Se muestran los resultados de 2 análisis diferentes, separados por una línea en blanco.
Figuras 1A-1D. La Figura 1A muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de bevacizumab, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente, con las regiones CDR en negrita. La Figura 1B muestra las secuencias de CDR y los identificadores de secuencia correspondientes de bevacizumab. La Figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de ranibizumab, que incluyen las regiones constantes, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente, con las regiones CDR en negrita, texto subrayado. La región variable de la cadena pesada termina con la secuencia "VTVSS" y la región constante de la cadena pesada comienza con la secuencia "ASTKGP". La región variable de la cadena ligera finaliza con la secuencia "VEIKP" y la región constante de la cadena ligera comienza con la secuencia "TVAAPS". La Figura 1D muestra las secuencias de CDR y los identificadores de secuencia correspondientes de ranibizumab.
Las Figuras 2A-2B muestran las respuestas del péptido VL de bevacizumab. La Figura 2A muestra el porcentaje de respuestas del donante a cada péptido VL con un índice de estimulación de 2,95 o superior. N = 99 donantes. La Figura 2B muestra el índice de estimulación promedio para los 99 donantes para cada péptido más o menos el error estándar.
Las Figuras 3A-3B muestran las respuestas del péptido VH de bevacizumab. La Figura 3A muestra el porcentaje de respuestas del donante a cada péptido VH con un índice de estimulación de 2,95 o superior. N = 99 donantes. La Figura 3B muestra el índice de estimulación promedio para los 99 donantes para cada péptido más o menos el error estándar.
Las Figuras 4A-4C muestran las respuestas de las células T CD4+ a péptidos epitópicos de bevacizumab mutante. Las respuestas promedio a las secuencias epitópicas originales no modificadas se indican con marcas abiertas. Los círculos grandes indican cambios seleccionados referidos en la Tabla 17. La Figura 4A está dirigida a péptidos CDR2 de VH; la Figura 4B está dirigida a péptidos VH de CDR3; y la Figura 4C está dirigida a péptidos VL de CDR2.
La Figura 5 es un esquema de una DVD-Ig DLL4-VEGF ilustrativa en la que el dominio variable anti-DLL4 está en el exterior y el dominio variable anti-VEGF está en el interior de la molécula. Los enlaces disulfuro intermoleculares no se muestran, pero se incluyen en la proteína real.
6. Descripción detallada
6.1 Anticuerpos anti-VEGF
La presente descripción proporciona anticuerpos anti-VEGF. A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" (Ab) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a, o es inmunológicamente reactiva con, un antígeno particular, e incluye formas de anticuerpos policlonales, monoclonales, modificadas genéticamente y modificadas de otro modo, incluyendo pero no limitado a anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos heteroconjugados (p.ej., anticuerpos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos específicos de bi-, tri-y tetra-específicos) y fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, incluidos p.ej., fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rIgG y scFv. Además, a menos que se indique lo contrario, se pretende que el término "anticuerpo monoclonal" (mAb) incluya tanto las moléculas intactas como los fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse específicamente a una proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación del animal y pueden tener menos unión no específica del tejido que un anticuerpo intacto (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316).
El término "scFv" se refiere a un anticuerpo Fv de cadena sencilla en el que los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo tradicional se han unido para formar una cadena.
Las referencias a "VH" se refieren a la región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye la cadena pesada de un Fv, scFv o Fab. Las referencias a "VL" se refieren a la región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina, que incluye la cadena ligera de un Fv, scFv, dsFv o Fab. Los anticuerpos (Ab) y las inmunoglobulinas (Ig) son glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos muestran especificidad de unión a una diana específica, las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad diana. Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas son normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena pesada tiene en el término amino un dominio variable (VH) seguido de numerosos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en el extremo amino (VL) y un dominio constante en el extremo carboxi.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden ser diacuerpos, triacuerpos o tetracuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en donde cada cadena polipeptídica comprende dominios VH y VL unidos por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, lo que permite que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48 y Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, en ese caso un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Se pueden utilizar cadenas polipeptídicas que tengan diferentes secuencias para elaborar un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De forma similar, las triacuerpos y los tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se unen al VEGF humano e inhiben la actividad del receptor de VEGF en una célula.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción contienen regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen secuencias relacionadas con las CDR del anticuerpo bevacizumab (también conocido como Avastin®) y/o ranibizumab (también conocido como Lucentis®).
Las CDR también se conocen como regiones hipervariables en los dominios variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se llaman marco (FR). Como es sabido en la técnica, la posición/límite de aminoácido que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, dependiendo del contexto y de las diversas definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones dentro de un dominio variable se pueden ver como posiciones hipervariables híbridas ya que se puede considerar que estas posiciones están dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios mientras se considera que están fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también se pueden encontrar en regiones hipervariables extendidas. La descripción proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones híbridas hipervariables. Los dominios variables de
las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, principalmente adoptando una configuración de lámina β, conectada por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina β. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca por las regiones FR en el orden FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a la diana de los anticuerpos (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Md. 1987). Según se utiliza en la presente memoria, la numeración de los residuos de aminoácidos de inmunoglobulinas se realiza de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulina de Kabat. et al., a menos que se indique lo contrario.
Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera de bevacizumab están representadas por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y ligera también se representan en la Figura 1A. Las secuencias de las CDR de bevacizumab, y sus identificadores correspondientes, se presentan en la Figura 1B. Cualquier secuencia de nucleótidos que codifica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 puede usarse en las composiciones y métodos de la presente descripción.
Las secuencias de las cadenas pesada y ligera de ranibizumab están representadas por los SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras también se representan en la Figura 1C. La región variable de la cadena pesada termina con la secuencia "VTVSS" y la región constante de la cadena pesada comienza con la secuencia "ASTKGP". La región variable de la cadena ligera finaliza con la secuencia "VEIKP" y la región constante de la cadena ligera comienza con la secuencia "TVAAPS". Las secuencias de las CDR de ranibizumab, y sus identificadores correspondientes, se presentan en la Figura 1D. Se puede utilizar cualquier secuencia de nucleótidos que codifique los SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o las regiones variables de la misma en las composiciones y métodos de la presente descripción.
La presente descripción proporciona adicionalmente fragmentos de anticuerpos anti-VEGF que comprenden secuencias de CDR que están relacionadas con las secuencias de CDR de bevacizumab y ranibizumab. El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción de un anticuerpo completo, generalmente la región de unión a la diana o variable. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento de la diana completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación estrecha, no covalente (dímero VH-VL). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a la diana en la superficie del dímero VH-VL. A menudo, las seis CDR confieren especificidad de unión a la diana al anticuerpo. Sin embargo, en algunos casos, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para una diana) puede tener la capacidad de reconocer y unirse a la diana. Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo en una única cadena polipeptídica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende adicionalmente un conector polipeptídico entre el dominio VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión a la diana. Los "anticuerpos de dominio único" se componen de dominios de VH o VL únicos que exhiben una afinidad suficiente hacia la diana. En un aspecto específico, el anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de camélido (véase, p.ej., Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).
El fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de bisagra del anticuerpo. Los fragmentos F(ab') se producen por escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de la bisagra del producto de la digestión con pepsina F(ab')2. Los expertos en la técnica conocen acoplamientos químicos adicionales de fragmentos de anticuerpos.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción son anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" según se utiliza en la presente memoria no está limitado a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridoma. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método mediante el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales útiles en conexión con la presente descripción se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados o humanos.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden ser anticuerpos quiméricos. El término anticuerpo "quimérico" según se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o ratón, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, típicamente elegidas entre un molde de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Véanse, p.ej., Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden humanizar. Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanas (p.ej., anticuerpos murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otros subdominios de anticuerpos que se unen a una diana) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de los al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos son conocidos en la técnica. Véanse, p.ej., Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7; Patentes de los Estados Unidos Núm.: 5.530.101; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; y 6.180.370 de Queen et al.; documento EP239400; Publicación PCT WO 91/09967; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539; documento EP592106; documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Ing. 7: 805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; y Patente de los Estados Unidos Núm. 5.565332.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden ser anticuerpos humanos. Los anticuerpos anti-VEGF completamente "humanos" pueden ser deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Según se utiliza en la presente memoria, "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de presentación en fagos utilizando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Véanse las Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.444.887 y 4.716.111; y las publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Véanse, p.ej., las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598.
Además, se pueden contratar compañías como Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) y Regeneron (Tarrytown, NY) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado utilizando tecnología similar a la descrita anteriormente. Se pueden generar anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado utilizando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, p.ej., un anticuerpo de ratón, se utiliza para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden primatizar. El término "anticuerpo primatizado" se refiere a un anticuerpo que comprende regiones variables de mono y regiones constantes humanas. Los métodos para producir anticuerpos primatizados son conocidos en la técnica. Véanse p.ej., las Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.658.570; 5.681.722; y 5.693.780.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden ser multi-específicos, p.ej., anticuerpos biespecíficos, anticuerpos, tri-específicos o anticuerpos tetra-específicos.
En ciertos aspectos, los anticuerpos multiespecíficos pueden incluir mutaciones Fc que refuerzan la asociación de cadenas correctas en anticuerpos multiespecíficos, como describen Klein et al., 2012, mAbs 4(6):653-663.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, a menudo humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser componentes de anticuerpos multiespecíficos que están basados en moléculas de inmunoglobulina completas e incluyen regiones Fc, por ejemplo regiones Fc de IgG. Tales estructuras pueden incluir, pero no se limitan a, IgG-Fv, IgG-(scFv)2, DVD-Ig, (scFv)2-(scFv)2-Fc y (scFv)2-Fc-(scFv)2. En el caso de IgG-(scFv)2, el scFv se puede unir al extremo N-terminal o C-terminal de la cadena pesada o de la cadena ligera. Las moléculas multiespecíficas ilustrativas que incluyen las regiones Fc y en las que se pueden incorporar anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de anticuerpos han sido revisadas por Kontermann, 2012, mAbs 4(2):182-197, Yazaki et al., 2013, Protein Engineering, Design & Selection 26(3):187-193 y Grote et al., 2012, en Proetzel & Ebersbach (eds.), Antibody Methods and Protocoles, Methods in Molecular Biology vol. 901, capítulo 16: 247-263 (DOI 10.1007/978-1-61779-931-0_016).
En otros aspectos, los fragmentos anti-VEGF de los mismos pueden ser componentes de moléculas multiespecíficas sin regiones Fc, basadas en fragmentos de IgG o DVD o scFv. Las moléculas multiespecíficas ilustrativas que
carecen de regiones Fc y en las que se pueden incorporar los anticuerpos anti-VEGF o los fragmentos de anticuerpos, tales como dímeros de scFv (diacuerpos), trímeros (triacuerpos) y tetrámeros (tetracuerpos), dímeros de Fab (productos conjugados por polipéptido adherente o dominios de proteínas) y trímeros de Fab (químicamente conjugados), son descritos por Hudson y Souriau, 2003, en Nature Medicine 9: 129-134.
En la presente descripción, una de las especificidades de unión puede dirigirse hacia VEGF, la otra puede ser para cualquier otro antígeno, p.ej., para una proteína de la superficie celular, receptor, subunidad del receptor, antígeno específico del tejido, proteína derivada de virus, proteína de la envuelta codificada viralmente, proteína derivada de bacterias o proteína de la superficie bacteriana, etc. En una realización específica, un anticuerpo de la descripción es un anticuerpo biespecífico con especificidades de unión tanto para VEGF como para CD3. En otra realización específica, un anticuerpo de la descripción es un anticuerpo biespecífico con especificidades de unión tanto para VEGF como para DLL4.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción pueden ser inmunoglobulinas de dominio variable dual ("DVD") ("DVD-Ig") (véase, Gu y Ghayur, 2012, Methods in Enzymology 502:25-41. Una DVD-Ig combina los dominios variables de unión a la diana de dos anticuerpos monoclonales por medio de conectores para crear un agente individual tetravalente de doble direccionamiento. Los conectores adecuados para su uso en las cadenas ligeras de los DVD de la presente descripción incluyen los identificados en la Tabla 2.1 en la página 30 de Gu y Ghayur, 2012, Methods in Enzymology 502:25-41, los conectores de cadena κ cortos ADAAP (SEQ ID NO: 417) (murino) y TVAAP (SEQ ID NO: 418) (humano); los conectores de cadena κ largos ADAAPTVSIFP (SEQ ID NO: 419) (murino) y TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 420) (humano); el conector de cadena λ QPKAAP corto (SEQ ID NO: 421) (humano); el conector de cadena λ largo QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 422) (humano); el conector GS-corto GGSGG (SEQ ID NO: 423), el conector GS-medio GGSGGGGSG (SEQ ID NO: 424), y el conector GS-largo GGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 425) (todos los conectores GS son murinos y humanos). Los conectores adecuados para su uso en las cadenas pesadas de los DVD de la presente descripción incluyen los identificados en la Tabla 2.1 en la página 30 de Gu & Ghayur, 2012, Methods in Enzymology 502: 25-4 1, los conectores cortos AKTTAP (SEQ ID NO: 426) (murino) y ASTKGP (SEQ ID NO: 427) (humano); los conectores largos AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 428) (murino) y ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 429) (humano); el conector GS-short GGGGSG (SEQ ID NO: 430), el conector GScorto GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 431), y el conector GS-largo GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 432) (todos los conectores GS son murinos y humanos). Preferiblemente, los conectores humanos se utilizan para DVD-Ig humanas o humanizadas. Otros ejemplos de conectores que se pueden emplear en las moléculas de DVD-Ig de la descripción incluyen, pero no se limitan a, los descritos en DiGiammarino et al., 2011, mAbs 3: 487-494.
En la presente descripción, la DVD-Ig se dirige hacia VEGF y una segunda diana. En una realización, la segunda diana es DLL4. El componente anti-VEGF incluye CDR con una o más sustituciones descritas en la presente memoria en comparación con las CDR de bevacizumab o ranibizumab. Los anticuerpos anti-DLL4 y los fragmentos de anticuerpos útiles en el diseño de una DVD-Ig de la descripción son descritos por en Chen et al., Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2011/0217237, publicado el 8 de septiembre de 2011.
En otras realizaciones, la segunda diana es EGFR, HER2, ErbB3 o cualquier otra diana descrita por Tariq et al., Publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos 2011/0044980, publicada el 24 de Febrero de 2011.
Los dominios de unión a la diana de las inmunoglobulinas de DVD se disponen típicamente en tándem, con un dominio variable apilado sobre otro para formar los dominios de Fv interno y externo. Los dominios variables de direccionamiento a VEGF se pueden organizar como dominios Fv internos o externos de una DVD-Ig. En una realización específica, la DVD-Ig tiene dominios variables de direccionamiento a VEGF dispuestos como dominios de Fv internos y dominios variables de direccionamiento a DLL4 dispuestos como dominios de Fv externos. La Figura 5 muestra un esquema de una DVD-Ig de la descripción que tiene VEGF que se dirigen a dominios de Fv internos y DLL4 que se dirigen a dominios de Fv externos.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los anticuerpos derivatizados se modifican típicamente por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína (véase la Sección 6.6 para una discusión de productos conjugados de anticuerpos), etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales, p.ej., utilizando la tecnología ambrx (véase, p.ej., Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).
En otra realización más, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos cuya secuencia se ha modificado para alterar al menos una función efectora biológica mediada por la región constante con respecto a la secuencia de tipo salvaje correspondiente.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF se puede modificar para reducir al menos una
función efectora biológica mediada por una región constante con respecto a un anticuerpo no modificado, p.ej., unión reducida al receptor de Fc (FcγR). La unión de FcγR se puede reducir mutando el segmento de la región constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones FcγR (véanse p.ej., Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). La reducción en la capacidad de unión de FcγR del anticuerpo también puede reducir otras funciones efectoras que dependen de las interacciones FcγR, tales como la opsonización, la fagocitosis y la citotoxicidad celular dependiente de antígenos ("ADCC").
En otras realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF se puede modificar para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con respecto a un anticuerpo no modificado, p.ej., para mejorar las interacciones FcγR (véase, por ejemplo, el documento US 2006/0134709). Por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción puede tener una región constante que se une a FcγRIIA, FcγRIIB y/o FcγRIIIA con mayor afinidad que la región constante de tipo salvaje correspondiente.
Por lo tanto, los anticuerpos de la descripción pueden tener alteraciones en la actividad biológica que dan como resultado una mayor o menor opsonización, fagocitosis o ADCC. Tales alteraciones son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las modificaciones en anticuerpos que reducen la actividad de ADCC se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.834.597. Una variante que disminuye la ADCC ilustrativa corresponde al "mutante 3" que se muestra en la Figura 4 de la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.834.597, en la que se elimina el residuo 236 y los residuos 234, 235 y 237 (utilizando la numeración de EU) se sustituyen por alaninas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF tienen bajos niveles de fucosa o carecen de ella. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con una ADCC potenciada (actividad, especialmente a bajas dosis de anticuerpo. Véanse Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278: 3466-73. Los métodos para preparar anticuerpos sin fucosa incluyen el crecimiento en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las células YB2/0 expresan bajos niveles de ARNm de FUT8, que codifica la α-1,6-fucosiltransferasa, una enzima necesaria para la fucosilación de polipéptidos.
En otro aspecto más, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar o reducir sus afinidades de unión al receptor de Fc fetal, FcRn, por ejemplo mutando el segmento de la región constante de inmunoglobulina en regiones particulares implicadas en las interacciones de FcRn (véase, p.ej., el documento WO 2005/123780). En realizaciones particulares, un anticuerpo anti-VEGF de la clase IgG está mutado de modo que al menos uno de los residuos de aminoácidos 250, 314 y 428 de la región constante de la cadena pesada está sustituido solo, o en cualquier combinación de los mismos, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428, siendo las posiciones 250 y 428 una combinación específica. Para la posición 250, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido distinto de treonina, incluyendo, pero no limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparragina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 314, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido distinto de leucina, que incluye, pero no limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparragina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 428, los residuos de aminoácidos sustituyentes pueden ser cualquier residuo de aminoácido distinto de metionina, incluyendo, pero no limitado a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparragina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Las combinaciones específicas de sustituciones de aminoácidos adecuadas se identifican en la Tabla 1 de la Patente de los Estados Unidos Núm. 7.217.797. Tales mutaciones aumentan la unión del anticuerpo a FcRn, que protege al anticuerpo de la degradación y aumenta su vida media.
Las regiones Fc pueden incluir mutaciones de Fc que fuerzan la asociación correcta de la cadena en anticuerpos multiespecíficos, como describen Klein et al., 2012, mAb 4 (6): 653-663.
En otros aspectos más, un anticuerpo anti-VEGF tiene uno o más aminoácidos insertados en una o más de sus regiones hipervariables, por ejemplo como describen Jung y Plückthun, 1997, Protein Engineering 10(9):959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng Des. Sel. 17(5):481-9. Epub 17 de agosto de 2004; y documento US 2007/0280931.
En diversas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar la expresión en anfitriones heterólogos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para una mayor expresión y/o secreción de células anfitrionas heterólogas. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresión en bacterias, tales como E coli. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresión en levadura (Kieke et al., 1999, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:5651-5656). En otras realizaciones más, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos se modifican
para aumentar la expresión en células de insecto. En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos se modifican para aumentar la expresión en células de mamífero, tales como células CHO.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se han modificado para aumentar la estabilidad de los anticuerpos durante la producción. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden modificar para reemplazar uno o más aminoácidos tales como asparragina o glutamina que son susceptibles de desamidación no enzimática con aminoácidos que no experimentan desamidación (Huang et al., 2005, Anal. Chem. 77:1432-1439). En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden modificar para reemplazar uno o más aminoácidos que son susceptibles de oxidación, tales como metionina, cisteína o triptófano, con un aminoácido que no experimenta fácilmente oxidación. En otras realizaciones más, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden modificar para reemplazar uno o más aminoácidos que son susceptibles de ciclación, tales como asparragina o ácido glutámico, con un aminoácido que no experimenta fácilmente ciclación.
6.2 Sistemas de expresión y ácidos nucleicos
La presente descripción abarca moléculas de ácido nucleico y células anfitrionas que codifican los anticuerpos anti-VEGF de la descripción.
Se puede preparar un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula anfitriona. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula anfitriona se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula anfitriona y, opcionalmente, se secretan al medio en el que se cultivan las células anfitrionas, de cuyo medio se pueden recuperar los anticuerpos. Las metodologías de ADN recombinante convencionales se utilizan para obtener genes de cadenas pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células anfitrionas, tales como las descritas en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor,
N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., Eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.397.
En un aspecto, los anticuerpos anti-VEGF son similares a bevacizumab o ranibizumab, excepto por cambios en una
o más CDR. En otro aspecto, los anticuerpos anti-VEGF son similares a bevacizumab o ranibizumab, excepto por cambios en una o más regiones marco. En otro aspecto más, los anticuerpos anti-VEGF son similares a bevacizumab o ranibizumab, excepto por cambios en una o más CDR y en una o más regiones marco. En la presente memoria se hace referencia colectivamente a que dichos anticuerpos tienen secuencias "relacionadas con bevacizumab" o "relacionadas con ranibizumab" y a veces se mencionan simplemente como anticuerpos anti-VEGF de la descripción. Para generar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-VEGF, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN se pueden obtener por amplificación y modificación de ADN de la línea germinal o ADNc que codifica secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humanas son conocidas en la técnica (véase, p.ej., la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBASE"; véase también Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación NIH Núm. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827-836.
Se puede sintetizar un fragmento de ADN que codifica la región variable de cadena pesada o ligera de bevacizumab
o ranibizumab y se puede utilizar como molde para la mutagénesis para generar una variante como se describe en la presente memoria utilizando técnicas de mutagénesis de rutina; alternativamente, se puede sintetizar directamente un fragmento de ADN que codifica la variante.
Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos VH y VL anti-VEGF, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadenas de anticuerpo completas, genes de fragmentos Fab o genes de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. Se pretende que el término "unido operativamente", según se utiliza en este contexto, signifique que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.
El ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir en un gen de cadena pesada completa mediante la unión operativa del ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de la cadena
pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana son conocidas en la técnica (véase, p.ej., Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación NIH Núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en ciertas realizaciones es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede unir operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de la cadena pesada CH1.
El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase, p.ej., Kabat, E.A. y col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación NIH Núm. 91-3242)) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en ciertas realizaciones es una región constante kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están unidos operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible. p.ej., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4~Ser)3 (SEQ ID NO: 412), de manera que las secuencias VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas mediante el conector flexible (véase, p.ej., Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552-554).
Para expresar los anticuerpos anti-VEGF de la descripción, los ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas parciales o completas, obtenidos como se describió anteriormente, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, pretende que el término "unido operativamente" signifique que un gen de anticuerpo se liga a un vector de modo que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector cumplan su función prevista de regular la transcripción y la traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo se pueden insertar en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.
Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., ligamiento de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligamiento de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera o pesada de los anticuerpos anti-VEGF de la descripción, el vector de expresión ya puede llevar secuencias de la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir las secuencias de VH y VL anti VEGF en genes de anticuerpo completos consiste en insertarlas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento VH esté operativamente unido a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento VL está vinculado operativamente al segmento de CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula anfitriona. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal se una en marco al extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína que no es inmunoglobulina).
Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la descripción llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas del anticuerpo en una célula anfitriona. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p.ej., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de las cadenas del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, por Goeddel, en Gene Expression Technology: Methods in Enzymology: 185 (Academic Press, San Diego, California, 1990). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se vaya a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de células anfitrionas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tales como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus, (p.ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción más detallada de los elementos reguladores virales, y sus secuencias, véanse, p.ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.168.062 de Stinski, Patente de los Estados Unidos Núm. 4.510.245 de Bell et al., y Patente de los Estados Unidos Núm.
4.968.615 de Schaffner et al.
Además de los genes de las cadenas del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la descripción pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (p.ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células anfitrionas en las que se ha introducido el vector (véanse p.ej., las Patentes de los Estados Unidos Núm. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todo de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, puromicina, blasticidina, higromicina o metotrexato, a una célula anfitriona en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células anfitrionas DHFR-con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418). Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula anfitriona mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas utilizadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, p.ej., electroporación, lipofección, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares.
Es posible expresar los anticuerpos de la descripción en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas. En ciertas realizaciones, la expresión de anticuerpos se realiza en células eucarióticas, p.ej., células anfitrionas de mamífero, para la secreción óptima de un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo. Las células anfitrionas de mamífero ilustrativas para expresar los anticuerpos recombinantes de la descripción incluyen células de ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO DHFR-), descritas por Urlaub y Chasin, 1980, en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable DHFR, p.ej., como describen Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS0, células COS, células 293 y células SP2/0. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que las células anfitrionas crecen. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos convencionales de purificación de proteínas. Las células anfitrionas también se pueden utilizar para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula anfitriona con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo anti-VEGF de esta descripción.
La tecnología de ADN recombinante también se puede utilizar para eliminar parte o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para la unión a VEGF. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también están abarcadas por los anticuerpos de la descripción.
Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera son un anticuerpo de la descripción y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de VEGF al entrecruzar un anticuerpo de la descripción con un segundo anticuerpo por medio de métodos de entrecruzamiento químico convencionales. Los anticuerpos bifuncionales también se pueden preparar expresando un ácido nucleico diseñado para codificar un anticuerpo bifuncional.
En ciertos aspectos, se pueden producir anticuerpos específicos duales, es decir., anticuerpos que se unen a VEGF y un antígeno no relacionado que utiliza el mismo sitio de unión, mutando residuos de aminoácidos en las CDR de la cadena ligera y/o de la cadena pesada. En diversos aspectos, los anticuerpos específicos duales que se unen a dos antígenos, tales como HER2 y VEGF, se pueden producir mutando residuos de aminoácidos en la periferia del sitio de unión al antígeno (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614). Los anticuerpos funcionales duales se pueden preparar expresando un ácido nucleico modificado genéticamente diseñado para codificar un anticuerpo específico dual.
Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción, la célula anfitriona se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la descripción, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Típicamente, los dos vectores contienen cada uno un marcador seleccionable por separado. Alternativamente, se puede utilizar un único vector que codifica polipéptidos tanto de la cadena ligera como de la pesada. En otras formas de realización más, los anticuerpos (que incluyen anticuerpos multiespecíficos) y sus fragmentos se pueden producir mediante traducción in vitro utilizando productos lisados de células bacterianas o de mamífero, seguido de plegamiento o ensamblaje de proteínas asistido por la adición de chaperonas moleculares. Tales métodos han sido descritos, por ejemplo, por Yin et al., 2012, mAbs, 4:217-225.
Una vez que se genera un ácido nucleico que codifica una o más porciones de un anticuerpo anti-VEGF, se pueden introducir alteraciones o mutaciones adicionales en la secuencia codificante, por ejemplo para generar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias de CDR, anticuerpos con una afinidad reducida para el receptor de Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción también se pueden producir por síntesis química (p.ej., por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Los anticuerpos variantes también se pueden generar utilizando una plataforma libre de células (véase, p.ej., Chu et al., 2001, Biochemia Núm. 2 (Roche Molecular Biologicals)).
Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por expresión recombinante, se puede purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (p.ej., intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad para VEGF después de la selección de Proteína A o Proteína G, y cromatografía en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos anti-VEGF de la presente descripción o fragmentos de los mismos se pueden fusionar a secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en la presente memoria o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación.
Una vez aislado, un anticuerpo anti-VEGF se puede, si se desea, purificar aún más, p.ej., mediante cromatografía líquida de alta resolución (véase, p.ej., Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980)), o mediante cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex ™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).
6.3 Actividades biológicas de anticuerpos anti-VEGF
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF tienen ciertas actividades biológicas, tales como la competición con bevacizumab o ranibizumab por la unión a VEGF o la neutralización de la actividad de VEGF.
Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF compiten con bevacizumab o ranibizumab por la unión a VEGF. La capacidad de competir por la unión a VEGF se puede someter a ensayo utilizando un análisis competitivo. En un ejemplo de un análisis competitivo, el VEGF se adhiere sobre una superficie sólida, p.ej., una placa de micropocillos, poniendo en contacto la placa con una solución de VEGF (p.ej., a una concentración de 1 μg/mL en PBS durante la noche a 4°C). La placa se lava (p.ej., Tween 20 al 0,1% en PBS) y se bloquea (p.ej., en Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Se añade una mezcla de una cantidad sub-saturante de bevacizumab biotinilado (80 ng/ml) o una cantidad equivalente de ranibizumab biotinilado y bevacizumab sin marcar (o ranibizumab, según sea el caso) (el anticuerpo de "referencia") o un anticuerpo anti-VEGF competitivo (el anticuerpo "de ensayo") en dilución seriada (p.ej., a una concentración de 2,8 μg/mL, 8,3 μg/mL o 25 μg/mL) en tampón ELISA (p.ej., BSA al 1% y Tween 20 al 0,1% en PBS) a los pocillos y las placas se incuban durante 1 hora con agitación suave. La placa se lava, se agrega 1 µg/mL de estreptavidina conjugada con HRP en tampón ELISA a cada pocillo y las placas se incuban durante 1 hora. Las placas se lavan y los anticuerpos unidos se detectan mediante la adición de sustrato (p.ej., TMB, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). La reacción se termina por adición de tampón de parada (p.ej., Bio FX Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) y la absorbancia se mide a 650 nm utilizando un lector de microplacas (p.ej., VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las variaciones en este análisis competitivo también se pueden utilizar para someter a ensayo la competición entre un anticuerpo anti-VEGF de la descripción y bevacizumab o ranibizumab. Por ejemplo, en ciertos aspectos, el anticuerpo anti-VEGF se utiliza como un anticuerpo de referencia y se utiliza bevacizumab o ranibizumab como un anticuerpo de ensayo. Además, en lugar de VEGF soluble, se puede utilizar VEGF unido a membrana expresado en las superficies de células (por ejemplo, células de mamífero) en cultivo. Se conocen en la técnica otros formatos para análisis competitivos y se pueden emplear.
En diversas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF reduce la unión de bevacizumab o ranibizumab marcado en al menos 30%, en al menos 40%, en al menos 50%, en al menos 60%, en al menos 70%, al menos 80%, en al menos 90%, en al menos 95%, en al menos 99% o en un porcentaje que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., un anticuerpo anti-VEGF de la descripción reduce la unión de bevacizumab o ranibizumab marcado en un 50% a 70%) cuando el anticuerpo anti-VEGF se utiliza a una concentración de 0,08 μg/ml, 0,4 μg/ml, 2 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL o a una concentración que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., a una concentración que varía de 2 μg/mL a 10 μg/mL).
En otras realizaciones, bevacizumab o ranibizumab reducen la unión de un anticuerpo anti-VEGF marcado de la descripción en al menos 40%, en al menos 50%, en al menos 60%, en al menos 70%, en al menos 80%, en al menos 90%, o en un porcentaje que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., bevacizumab o ranibizumab reduce la unión de un anticuerpo anti-VEGF marcado de la descripción en 50% a 70%) cuando se utiliza bevacizumab o ranibizumab a una concentración de 0,4 μg/ml, 2 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 250 μg/ml o a una concentración que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., a una concentración que varía de 2 μg/mL a 10 μg/mL).
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción inhibe (o neutraliza) la actividad de VEGF en una gama de análisis in vitro, tal como la proliferación celular o la migración celular. Por ejemplo, en una realización, la
actividad de VEGF analizada es la inducción de la proliferación de células endoteliales ("EC" por sus siglas en inglés) (véase, p.ej., Protocol de Qin et al., 2006, J. Biol. Chem. 281:32550-32558). En otra realización, la actividad de VEGF analizada es la inducción de la migración de EC (véase, p.ej., el análisis de protocolo de raspado in vitro descrito por Liang et al., 2007, Nat. Protoc. 2:329-333). En una realización específica, se somete a ensayo un anticuerpo anti-VEGF para determinar la capacidad de invertir la proliferación y la migración celulares estimuladas por VEGF y la deslocalización de las proteínas de unión estrecha inducidas por VEGF165 en células endoteliales de la retina bovina inmortalizadas (Deissler et al., 2008, British Journal of Ophthalmology 92:839-843). En otra realización más, la neutralización de la actividad de VEGF se analiza utilizando un análisis informador (véanse, p.ej., Yohno et al., 2003, Biological & Pharmaceutical Bulletin 26 (4):417-20 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.787.323).
Se conocen en la técnica otros formatos para análisis de neutralización de VEGF y se pueden emplear.
En diversas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción neutraliza VEGF en al menos 30%, en al menos 40%, en al menos 50%, en al menos 60%, en al menos 70%, en al menos 80%, en al menos 90%, o en un porcentaje que oscila entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., un anticuerpo anti-VEGF de la descripción neutraliza la actividad de VEGF en 50% a 70%) cuando el anticuerpo anti-VEGF se utiliza a una concentración de 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/mL, 0,1 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, o a una concentración que varía entre cualquiera de los valores anteriores (p.ej., a una concentración que varía de μg/mL a 5 μg/mL).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción es al menos 0,7 veces más eficaz, 0,8 veces más eficaz, al menos 0,9 veces más eficaz, al menos 1 vez más eficaz, al menos 1,1 veces más eficaz , al menos 1,25 veces más eficaz, al menos 1,5 veces más eficaz, al menos 2 veces más eficaz, al menos 5 veces más eficaz, al menos 10 veces más eficaz, al menos 20 veces más eficaz, en al menos 50 veces más eficaz, al menos 100 veces más eficaz, al menos 200 veces más eficaz, al menos 500 veces más eficaz, al menos 1.000 veces más eficaz que bevacizumab o ranibizumab en la neutralización del VEGF, o tiene una eficacia al neutralizar VEGF con respecto a bevacizumab o ranibizumab que oscila entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., de 0,9 veces a 5 veces tan eficaz como bevacizumab o ranibizumab o de 2 a 50 veces más eficaz que bevacizumab o ranibizumab en la neutralización de VEGF).
6.4 Propiedades cinéticas de anticuerpos anti-VEGF
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción tienen una alta afinidad de unión por VEGF. En realizaciones específicas, los anticuerpos anti-VEGF de la presente descripción tienen constantes de velocidad de asociación (valores kon o ka), constantes de velocidad de disociación (valores koff o kd), constantes de afinidad (valores KA), constantes de disociación (valores KD) y/o valores de CI50 específicos. En diversas realizaciones, las constantes de unión para la interacción de los anticuerpos anti-VEGF con el receptor de VEGF se pueden determinar utilizando resonancia de plasmón superficial, p.ej., de acuerdo con el método descrito en Karlsson et al., 1991, J. Immunol. Methods 145:229-240. En ciertos aspectos, tales valores se seleccionan entre las siguientes realizaciones.
En un aspecto específico, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con una kon de al menos 104 M1s-1 al menos 5 X 104 M-1s-1, al menos 105 M-1s-1, al menos 5 X 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 X 106 M-1s1, al menos 107 M-1s-1, al menos 5 X 107 M-1s-1, al menos 108 M-1s-1, al menos 5 X 108 M-1s-1, al menos 109 M-1s-1 o con una kon de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., 5 X 105 a 5 X 106 M-1s-1 o 107 a
108 M-1-1).
s
En otro aspecto, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con un velocidad koff de 10-3 s-1 o menos, 5 X 10-4 s-1 o menos, 10-4 s-1 o menos, 5 X 10-5 s-1 o menos, 10-5 s-1 o menos, 5 X 10-6 s-1 o menos, 10-6 s-1 o menos, 5 X 10-5 s-1 o menos, 10-7s-1 o menos, 5 X 10-8s-1, o menos, 10-8 s-1 o menos, o con una velocidad koff de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., de 5 X 10-4 a 10-6s-1 o de 10-3 a 5 X 10-5s-1).
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con una KA (kon/koff) de al menos 108 M-1, al menos 5 X 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 X 1010 M-1, 1011 M-1, al menos 5 X 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 X 1012 M-1, al menos 1013 M-1, al menos 5 X 1013 M-1, al menos 1014 M-1, al menos 5 X 1014M-1, al menos 1015 M-1o con un KA de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., de 5 X 109 M-1 a 1011 M-1, o de 1011 M-1 a 5 X 1014 M-1).
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con una KD (koff/kon) de 10-8 M o menos, 5 X 1-9 M o menos, 10-9 M o menos, 5 X 10-10 M o menos, 10-10 M o menos, 5 X 10-11 M o menos, 10-11 M o menos, 5 X 10-12 M o menos, 10-12 M o menos, 5 X 10-13 M o menos, 10-13 M o menos, 5 X 10-14 M o menos, 10-14 M
o menos, 5 X 10-15 M o menos, 10-15 M o menos, o con una KD de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., 5 X 10-9 a 5 X 10-12 M, o de 5 X 10-11 M a 5 X 10-13 M).
En realizaciones específicas, la KD (koff/kon) el valor se determina mediante análisis bien conocidos en la técnica o descritos en la presente memoria, p.ej., ELISA, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), análisis de polarización fluorescente o cualquier otro biosensor tal como BIAcore.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF e inhibe la unión de VEGF a un receptor de VEGF (Flt-1 o Flk-1) a un valor de CI50 de menos de 5 X 107 nM, menos de 107 nM, menos de 5 X 106 nM, menos de 106 nM, menos de 5 X 105 nM, menos de 105 nM, menos de 5 X 104 nM, menos de 104 nM, menos de 5 X 103 nM, menos de 103 nM, menos de 5 X 102 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM, menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 50 nM, menos de 40 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 12 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, menos de 5 X 10-1 nM, menos de 10-1 nM, menos de 5 X 10-2 nM, menos de 10-2 nM, menos de 5 X 10-3 nM, menos de 10-3 nM, menos de 5 X 10-4 nM, o menos de 10-4 nM, o con un CI50 de cualquier rango entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., 5 X 107 a 50 nM, o 15 nM a 5 X 10-3 Nuevo Méjico). La CI50 se puede medir de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica o descritos en la presente memoria, p.ej., ELISA.
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF y neutraliza la actividad de VEGF en un bioanálisis (p.ej., CE de proliferación o migración) a un valor de CI50 de menos de 5 X 107 nM, menos de 107 nM, menos de 5 X 106 nM, menos de 106 nM, menos de 5 X 105 nM, menos de 105 nM, menos de 5 X 104 nM, menos de 104 nM, menos de 5 X 103 nM, menos de 103 nM, menos de 5 X 102 nM, menos de 100 nM, menos de 90 nM, menos de 80 nM, menos de 70 nM, menos de 65 nM, menos de 60 nM, menos de 50 nM, menos de 40 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 12 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 1 nM, menos de 5 X 10-1 nM, menos de 10-1 nM, menos de 5 X 10-2 nM, menos de 10-2 nM, menos de 5 X 10-3 nM, menos de 10-3 nM, menos de 5 X 10-4 nM, o menos de 10-4 nM, o con una CI50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., de 5 X 107 a 50 nM, o de 15 nM a 5 X 10-3 nM). Un análisis de neutralización ilustrativo que se puede utilizar para medir la CI50 de un anticuerpo anti-VEGF se describe en la Sección 6.3 a continuación.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF se une a VEGF e inhibe la unión de VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos,
o inhibe la actividad de VEGF en un análisis de neutralización de VEGF, a un valor de CI50 entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 1 μM. En aspectos específicos, un anticuerpo anti-VEGF se une a VEGF e inhibe la unión de VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos, o inhibe la actividad de VEGF en un análisis de neutralización de VEGF, a un valor de CI50 entre 10 pM y 100 nM, entre 100 pM y 10 nM, entre 200 pM y 5 nM, entre 300 pM y 4 nM, entre 500 pM y 3 nM, entre 750 pM y 2 nM, entre 1 nM y 20 nM, entre 500 pM y 40 nM, entre 50 pM y 50 nM, entre 250 pM y 100 nM, y entre 100 nM y 1 μM, o con una CI50 de cualquier intervalo entre cualquier par de los valores anteriores (p.ej., 10 pM a 50nM, o750pM a2nM).
En ciertos aspectos de las realizaciones anteriores, la CI50 se mide en presencia de VEGF a una concentración de 0,001 μM, 0,005 μM, 0,01 μM, 0,05 μM, 0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 10 μM, 20 μM, 30 μM, 40 μM, 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM, 600 μM, 700 μM, 800 μM, 900 μM, 1000 μM o a una concentración de cualquier intervalo entre cualquier par de valores anteriores (p.ej., de 0,01 a 50 μM, o de 10 μM a 100 μM).
En ciertos aspectos, las propiedades cinéticas de un anticuerpo de la descripción son comparables a, o mejores con respecto a, bevacizumab o de ranibizumab en un análisis comparable. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con una velocidad kon que varía de aproximadamente 0,5x a 1000x de la kon de bevacizumab o de ranibizumab, por ejemplo, una kon de 0,5x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 0,75x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 0,9x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,1x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,2x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,3x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,4x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,5x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 1,75x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 2x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 2,25x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 2,5x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 3x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 4x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 5x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 7,5x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 10x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 15x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 20x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 50x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 75x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 100x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 150x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 200x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 200x la kon de bevacizumab o de ranibizumab o una kon que oscila entre cualquier par de los valores anteriores, p.ej., una kon de 2x-75x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 5x-100x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 0,5x-1000x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, una kon de 0,75x200x la kon de bevacizumab o de ranibizumab, etc.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con una velocidad koff de 0,001x a 3x
la koff de bevacizumab o de ranibizumab, por ejemplo, una koff de 0,002x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,005x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,0075x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,01x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,025x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,05x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,075x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,1x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,25x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,5x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,75x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,9x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 1x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 1,1x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 1,25x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 1,5x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 1,75x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 4x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 3x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 2x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 3x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, o una koff que oscila entre cualquier par de los valores anteriores, p.ej., una koff de 0,01x a 1,1x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,05x-1,25x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, una koff de 0,1x0,9x la koff de bevacizumab o de ranibizumab, etc.
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF con un KA (kon/koff) que oscila de 0,25x a 1000x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, por ejemplo, una KA de 0,5x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 0,75x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 1x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 2x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 4x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 10x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 15x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 20x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 30x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 40x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 50x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 100x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 250x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 500x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 750x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 1000x la KA de bevacizumab o de ranibizumab o una KA que oscila entre cualquier par de los valores anteriores, por ejemplo, una KA de 0,75x-10 5x de KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 1x-100x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, un KA de 10x-20x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 4x50x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, una KA de 2x-20x la KA de bevacizumab o de ranibizumab, o cualquier valor o intervalo que se pueda calcular a partir de las velocidades kon y koff descritas en la presente memoria.
En otros aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF a una KD (koff/kon) que oscila de 0,001 x a 10x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, por ejemplo, una KD de 0,001x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,005x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,01x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,05x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,075x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,1x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,2x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,3x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,4x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,5x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,6x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,7x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,8x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,9x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 1x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 1,5x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 2x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 4x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 7,5x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 10x la KD de bevacizumab o de ranibizumab o una KD que oscila entre cualquier par de los valores anteriores, p.ej., una KD de 0,01x-2x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,1x-1,5x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0,7x-4x la KD de bevacizumab o de ranibizumab, una KD de 0.2x-2x la KD de bevacizumab o de ranibizumab o cualquier valor o intervalo que se pueda calcular a partir de las velocidades kon y koff descritas en la presente memoria.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se une a VEGF e inhibe la unión de VEGF a Flt-1, Flk-1 o ambos, o neutraliza la actividad de VEGF a un valor de CI50 que oscila de 0,001x a 10x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, por ejemplo, una CI50 de 0,001x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,005x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,01x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,05x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,075x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,1x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,2x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,3x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,4x la CI50 de bevacizumab
o de ranibizumab, una CI50 de 0,5x la CI50 de bevacizumah o de ranibizumab, una CI50 de 0,6x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,7x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,8x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,9x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 1x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 1,5x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 2x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 4x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 7,5x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 10x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab o una CI50 que oscila entre cualquier par de los valores anteriores, p.ej., una CI50 de 0,01x-2x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,1x-1,5x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,7x-4x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab, una CI50 de 0,2x-2x la CI50 de bevacizumab o de ranibizumab. En ciertos aspectos, una única sustitución de CDR puede dar como resultado las diferencias anteriores en la CI50 en comparación con bevacizumab
o ranibizumab, mientras que un anticuerpo anti-VEGF de la descripción puede comprender dicha sustitución y hasta 16 sustituciones de CDR adicionales en comparación con bevacizumab o ranibizumab.
6.5 Inmunogenicidad reducida de anticuerpos anti-VEGF
En ciertos aspectos, la presente descripción proporciona anticuerpos anti-VEGF que tienen una inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab. La presente descripción proporciona anticuerpos anti-VEGF que tienen sustituciones de aminoácidos simples o múltiples en sus CDR y/o regiones flanqueantes en comparación con las CDR de bevacizumab, en donde al menos una sustitución reduce la inmunogenicidad del anticuerpo en comparación con bevacizumab o ranibizumab. En ciertas realizaciones, la reducción de la inmunogenicidad es el resultado de una o más sustituciones de aminoácidos que producen la eliminación o mitigación de uno o más epítopos de células T.
En ciertos aspectos, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción que tienen una inmunogenicidad reducida tienen una actividad biológica comparable o mejorada en comparación con bevacizumab o ranibizumab, p.ej., afinidad hacia VEGF o neutralización de la actividad de VEGF. Tales propiedades se pueden someter a ensayo, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la Sección 6.3 anterior.
En ciertos aspectos, la inmunogenicidad de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se reduce con respecto al anticuerpo bevacizumab o ranibizumab. Tales anticuerpos generalmente tienen secuencias variantes con respecto a la región variable de la cadena pesada y/o ligera en las regiones correspondientes a los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62 y/o SEQ ID NO: 74. Los anticuerpos generalmente tendrán una, dos o tres sustituciones de aminoácidos en una, dos o las tres secuencias correspondientes a los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 74, aunque se contemplan en la presente memoria hasta cuatro o cinco sustituciones en una, dos o las tres regiones.
Según se utiliza en la presente descripción, una variante con "inmunogenicidad reducida" se refiere a un anticuerpo anti-VEGF con una secuencia variante en una región correspondiente a los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62, y/o SEQ ID NO: 74 que provoca una respuesta proliferativa reducida en células mononucleares de sangre periférica en comparación con un péptido de los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 74, respectivamente. Un análisis de proliferación ilustrativo que se puede utilizar para evaluar la respuesta proliferativa se expone en la Sección 7 a continuación. La respuesta proliferativa reducida se puede reflejar en términos del porcentaje de respondedores, el índice de estimulación o ambos.
En otros aspectos, en comparación con un péptido que tiene la secuencia de los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62 o SEQ ID NO: 74, la secuencia variante da como resultado al menos un 25% menos respondedores, al menos 30% menos respondedores, al menos 35% menos respondedores, al menos 40% menos respondedores, al menos 45% menos respondedores, al menos 50% menos respondedores, al menos un 60% menos respondedores, al menos 65% menos respondedores, al menos 70% menos respondedores, al menos 75% menos respondedores, al menos 80% menos respondedores, al menos 85% menos respondedores, al menos 90% menos respondedores, al menos 95% menos respondedores, 100% menos respondedores, o una reducción de los respondedores en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores, p.ej., 25%-75% menos respondedores, 50%-90% menos respondedores, 60%-100% menos respondedores, 70%-90% menos respondedores, o similares.
En otros aspectos, la secuencia variante da como resultado un índice de estimulación que es al menos 5% menos, al menos 10% menos, al menos 15% menos, al menos 20% menos, al menos 25% menos, al menos 30% menos, al menos 35% menos, o al menos 40% menos que el índice de estimulación provocado por un péptido de los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 74, respectivamente, o da como resultado un índice de estimulación reducido en un intervalo entre cualquiera de los valores anteriores en comparación con un péptido de los SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 62, o SEQ ID NO: 74, p.ej., 5%-20% menos, 10%-30% menos, 25%-35% menos, 30%-40% menos, o similar.
Los aspectos ilustrativos de los anticuerpos anti-VEGF candidatos con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab comprenden una o más de las sustituciones o combinaciones de sustituciones de CDR expuestas en la Tabla 6. Opcionalmente, los anticuerpos anti-VEGF con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab comprenden una o más sustituciones adicionales, tales como las mutaciones de CDR en cualquiera de las Tablas 7-13, individualmente o combinadas.
Otros aspectos ilustrativos más de los anticuerpos anti-VEGF candidatos con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab comprenden una o más de las sustituciones o combinaciones de sustituciones de CDR expuestas en las Tablas 14-16. Algunos aspectos preferidos de los anticuerpos anti-VEGF con inmunogenicidad reducida en comparación con bevacizumab o ranibizumab se proporcionan en la Tabla 19.
6.6 Productos conjugados de anticuerpos
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción incluyen productos conjugados de anticuerpo que se modifican, p. ej., mediante el anclaje covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo, de modo que el anclaje covalente no interfiere en la unión a VEGF.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se puede conjugar con un radical efector o una marca. El término "radical efector" según se utiliza en la presente memoria incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos (p.ej., ADN y ARN), radionúclidos, particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos informadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar mediante espectroscopía de RMN o ESR.
En un ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF se pueden conjugar con un radical efector, tal como un agente citotóxico, un radionúclido o radical de fármaco para modificar una respuesta biológica dada. El radical efector puede ser una proteína o polipéptido, tal como, por ejemplo y sin limitación, una toxina (tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o toxina de Difteria), una molécula de señalización (tal como interferón α, interferón β, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular), un agente trombótico o un agente anti-angiogénico (p.ej., angiostatina o endostatina) o un modificador de la respuesta biológica tal como una citoquina o factor de crecimiento (p.ej., interleuquina-1 (IL-I), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL6), factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), o factor de crecimiento nervioso (NGF)).
En otro ejemplo, los radicales efectores pueden ser citotoxinas o agentes citotóxicos. Los ejemplos de citotoxinas y agentes citotóxicos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantranodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Los radicales efectores también incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (p.ej. metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C5 y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p.ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (p.ej., vincristina y vinblastina).
Otros radicales efectores pueden incluir radionúclidos tales como, pero no limitados a, 111I e 90Y, 177Lu, bismuto, 252californio, 192iridio y 188tungsteno/188renio y fármacos tales como, pero no limitados a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.
Los mecanismos para conjugar dichos radicales efectores con anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véanse,
p. ej., Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2ª Ed., en las páginas 623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).
En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF o fragmento del mismo se fusionan a través de un enlace covalente (p.ej., un enlace peptídico), a través del extremo N o el extremo C del anticuerpo o internamente, a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o una porción de la misma, por ejemplo al menos una porción de 10, 20 o 50 aminoácidos de la proteína). El anticuerpo, o fragmento del mismo, se pueden unir a la otra proteína en el extremo N del dominio constante del anticuerpo. Se pueden utilizar procedimientos de ADN recombinante para crear tales fusiones, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745. En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida in vivo, y/o mejorar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunológico. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO 2005/117984.
En ciertos aspectos, un anticuerpo anti-VEGF se conjuga con una toxina de molécula pequeña. En ciertas realizaciones ilustrativas, un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se conjuga con una dolastatina o un análogo o derivado peptídico de dolostatina, p.ej., una auristatina (Patentes de los Estados Unidos Núm. 5.635.483 y 5.780.588). El radical de fármaco de dolastatina o auristatina se puede unir al anticuerpo a través de su extremo N (amino), su extremo C (carboxilo) o internamente (documento WO 02/088172). Las realizaciones ilustrativas de auristatina incluyen los radicales de fármaco de monometilauristatina unidos al extremo N DE y DF, como se describe en Patente de los Estados Unidos Núm. 7.498.298 (que describen, p.ej., conectores y métodos para preparar compuestos de monometilvalina tales como MMAE y MMAF conjugados con conectores).
En otras realizaciones ilustrativas, las toxinas de molécula pequeña incluyen, pero no se limitan a, caliqueamicina, maitansina (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.208.020), tricoteno y CC1065. En una realización de la descripción, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (p.ej., de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina se puede convertir, por ejemplo, May-SS-Me, que se puede reducir a May-SH3 y hacer reaccionar con un anticuerpo (Chari et al., 1992, Cancer Research 52:127-131) para generar un producto conjugado de fusión con maitansinoide-anticuerpo o maitansinoide-Fc. Los análogos estructurales de caliqueamicina que también se pueden utilizar incluyen, pero no están limitados a, γ11, γ31, N-acetil-γ11, PSAG y θ11, (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58: 2925-2928; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.714.586; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.712.374; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.264.586; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.773.001).
Los anticuerpos de la descripción también se pueden conjugar con liposomas para el suministro dirigido (Véanse, p.ej., Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399-435; Marty y Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).
En un ejemplo, los anticuerpos de la presente descripción se pueden unir a radicales de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y los radicales de PEG se pueden unir a través de cualquier grupo cadena lateral de aminoácido o grupo funcional aminoacídico terminal disponible localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden aparecer de forma natural en el fragmento de anticuerpo o se pueden modificar genéticamente al fragmento utilizando métodos de ADN recombinante. Véase por ejemplo Patente de los Estados Unidos Núm.
5.219.996. Se pueden utilizar múltiples sitios para anclar dos o más moléculas de PEG. Los radicales de PEG se pueden unir covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cuando se utiliza un grupo tiol como punto de unión, se pueden utilizar radicales efectores activados apropiadamente, por ejemplo derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína.
En un ejemplo específico, un producto conjugado de anticuerpo anti-VEGF es un fragmento Fab' modificado que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol)) anclado covalentemente al mismo p.ej., de acuerdo con el método descrito en el documento EP0948544. Véase también Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, Nueva York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris y S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); y Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam y A. Dent, eds., Grove Publishers, Nueva York, 1998); y Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. El PEG se puede anclar a una cisteína en la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab' modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Se puede unir covalentemente un residuo de lisina al grupo maleimida y se puede anclar a cada uno de los grupos amina en el residuo de lisina un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG anclado al fragmento Fab' puede por lo tanto ser de aproximadamente 40.000 Da.
La palabra "marca" cuando se utiliza en la presente memoria se refiere a un compuesto o composición detectable que se puede conjugar directa o indirectamente con un anticuerpo anti-VEGF de la descripción. La marca puede ser detectable en sí misma (p.ej., marcas de radioisótopos o marcadores fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que sea detectable. Los radicales fluorescentes útiles incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Los marcadores enzimáticos útiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares.
Otros productos conjugados de anticuerpos anti-VEGF que son útiles entre otros, para propósitos de diagnóstico, se describen en la Sección 6.7 a continuación.
6.7 Uso diagnóstico de anticuerpos anti-VEGF
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción, incluidos los anticuerpos que se han modificado, p.ej., mediante biotinilación, peroxidasa de rábano picante, o cualquier otro radical detectable (incluidos los descritos en la Sección 6.6), se pueden utilizar ventajosamente para fines de diagnóstico.
En particular, los anticuerpos anti-VEGF se pueden utilizar, por ejemplo, sin limitación, para purificar o detectar VEGF, incluyendo métodos de diagnóstico tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoanálisis para medir cualitativamente y cuantitativamente los niveles de VEGF en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
La presente descripción abarca adicionalmente anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados con un agente de diagnóstico. Los anticuerpos se pueden utilizar de manera diagnóstica, por ejemplo, para detectar la expresión de una diana de interés en células, tejidos o suero específicos; o para controlar el desarrollo o la progresión de una respuesta inmunológica como parte de un procedimiento de ensayo clínico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable se puede acoplar o conjugar directamente con el anticuerpo (o fragmento del mismo) o indirectamente, a través de un intermedio (tal como, por ejemplo, un conector conocido en la técnica) utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Los ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas (p.ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los Estados Unidos Núm. 4.737.456), luciferina, 2,3dihidroftalazindionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, como la peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, acetilcolinesterasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (p.ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 111In o 99Tc.
La descripción proporciona la detección de la expresión de VEGF, que comprende poner en contacto una muestra biológica (células, tejido o fluido corporal de un individuo) utilizando uno o más anticuerpos anti-VEGF de la descripción (opcionalmente conjugado con resto detectable) y detectar si la muestra es positiva o no para la expresión de VEGF, o si se ha alterado (p.ej., reducido, o aumentado) la expresión de la muestra en comparación con una muestra de control.
Las enfermedades que se pueden diagnosticar utilizando los presentes métodos incluyen, pero no se limitan a, las enfermedades descritas en la presente memoria. En ciertas realizaciones, el tejido o fluido corporal es sangre periférica, leucocitos de sangre periférica, tejidos de biopsia tales como biopsias de pulmón o de piel y tejido.
6.8 Métodos terapéuticos que utilizan anticuerpos anti-VEGF
6.8.1 Beneficios clínicos
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden utilizar para tratar diversos neoplasias o afecciones no neoplásicas caracterizadas por angiogénesis patológica.
Los anticuerpos de la descripción son útiles en el tratamiento de tumores en los que la angiogénesis juega un papel importante en el crecimiento tumoral, incluidos cánceres y tumores benignos. Los ejemplos de cáncer que se van a tratar en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más específicos de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o cáncer de estómago (incluido cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluido linfoma no Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no segmentadas de alto grado; NHL de células voluminosas; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postrasplante (PTLD), así como la proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y el síndrome de Meigs. Más particularmente, los cánceres que son susceptibles de tratamiento por los anticuerpos de la descripción incluyen cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón no microcítico, linfoma no Hodgkin (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se utilizan para tratar el cáncer colorrectal en un paciente humano.
La presente descripción abarca una terapia antiangiogénica, una estrategia de tratamiento del cáncer destinada a
inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales necesarios para proporcionar nutrientes para soportar el crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis está implicada tanto en el crecimiento tumoral primario como en la metástasis, el tratamiento antiangiogénico proporcionado por la descripción es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario así como prevenir la metástasis de tumores en los sitios secundarios.
Las afecciones no neoplásicas que son susceptibles de tratamiento con los anticuerpos de la descripción incluyen afecciones retinianas (p.ej., degeneración macular relacionada con la edad ("AMD"), edema después de la oclusión de la vena de la retina ("RVO") y edema macular diabético ("DME") y enfermedades inmunitarias e inflamatorias (p. ej., artritis reumatoide, psoriasis, aterosclerosis, retinopatías diabéticos y otras retinopatías proliferativas incluyendo retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasias tiroideas (incluida la enfermedad de Grave), trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, derrame pericárdico (tal como el asociado a la pericarditis) y derrame pleural).
Por consiguiente, la presente descripción proporciona métodos para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades anteriores en un paciente que lo necesite, que comprende: administrar al paciente un anticuerpo anti-VEGF de la descripción. Opcionalmente, dicha administración se repite, p.ej., después de un día, dos días, tres días, cinco días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, ocho semanas, dos meses o tres meses. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente. La administración puede repetirse una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más veces. Por ejemplo, de acuerdo con ciertos regímenes de dosificación, un paciente recibe terapia anti-VEGF durante un período prolongado de tiempo, p.ej., 6 meses, 1 año o más. La cantidad de anticuerpo anti-VEGF administrado al paciente es, en ciertas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz. Según se utiliza en la presente memoria, se puede administrar una cantidad "terapéuticamente eficaz" de anticuerpo VEGF como una dosis única o durante el transcurso de un régimen terapéutico, p.ej., en el transcurso de una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, tres meses, seis meses, un año o más. Los regímenes terapéuticos ilustrativos se describen en la Sección 6.11 a continuación.
De acuerdo con la presente descripción, el tratamiento de una enfermedad abarca el tratamiento de pacientes ya diagnosticados que tienen cualquier forma de la enfermedad en cualquier etapa o manifestación clínica; el retraso del inicio o la evolución o el agravamiento o el deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o la prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad.
Un "sujeto" o "paciente" al que se administra el anticuerpo anti-VEGF de la descripción es preferiblemente un mamífero tal como un no primate (p.ej., vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o un primate (p.ej., mono o humano). En ciertas realizaciones, el sujeto o paciente es un ser humano. En ciertos aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.
6.9 Composiciones farmacéuticas y rutas de administración
Las composiciones que comprenden un anticuerpo anti-VEGF de la descripción y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como los agentes terapéuticos combinados descritos en la Sección 6.10 a continuación, se proporcionan en la presente memoria. Las composiciones se suministrarán normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del método deseado de administración a un paciente).
Los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden administrar a un paciente por una variedad de rutas tales como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular, tópica, intratecal e intracerebroventricular. La ruta más adecuada para la administración en cualquier caso dado dependerá del anticuerpo particular, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto.
Para el tratamiento de indicaciones distintas de las enfermedades retinianas, la dosis eficaz de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción puede oscilar entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 75 mg/kg por individuo (p.ej., administración en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o para lograr una concentración en suero de 0,01-5.000 μg/mL de concentración en suero por individuo (p.ej., administración en embolada), administraciones múltiples o administración continua, o cualquier intervalo o valor eficaz en la misma dependiendo de la afección que se está tratando, la vía de administración y la edad, el peso y el estado del sujeto. En ciertos aspectos de la descripción, p.ej. para el tratamiento del cáncer, cada dosis puede variar de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, por ejemplo de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 25 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo se puede formular como una solución acuosa y se puede administrar por inyección subcutánea.
Para el tratamiento de afecciones retinianas (p.ej., degeneración macular relacionada con la edad ("AMD"), edema
macular después de la oclusión venosa retiniana ("RVO") y edema macular diabético ("DME"), la dosificación da como resultado adecuadamente una concentración del anticuerpo anti-VEGF en el humor acuoso del ojo en el que se inyecta de 1-50 μg/ml. Para el tratamiento de la AMD, cada dosis puede ser de 0,1 mg a aproximadamente 1 mg, por ejemplo de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 mg. El anticuerpo se puede formular como una solución acuosa y se puede administrar mediante inyección intravítrea.
Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por dosis. Dicha unidad puede contener, por ejemplo, pero sin limitación, de 0,1 mg a 5 g, por ejemplo de 1 mg a 1 g, o de 10 a 50 mg. Los portadores farmacéuticamente aceptables para su uso en la descripción pueden adoptar una amplia variedad de formas dependiendo, p.ej., con la condición que se vaya a tratar o con la ruta de administración.
Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden preparar para el almacenamiento en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales típicamente empleados en la técnica (todos los cuales son referidos en la presente memoria como "operadores"), es decir, agentes tamponadores, agentes estabilizantes, conservantes, agentes isotónicos, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición (Osol, ed. 1980). Tales aditivos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.
Los agentes tamponadores ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden estar presentes a una concentración que oscila de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 50 mM. Los agentes tamponadores adecuados para uso con la presente descripción incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sales de los mismos tales como tampones de citrato (p.ej., mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (p.ej., mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínicosuccinato disódico, etc.), tampones de tartrato (p.ej., mezcla de ácido tartárico y tartrato de sodio, mezcla de ácido tartárico y tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico e hidróxido de sodio, etc.), tampones de fumarato (p.ej., mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato disódico y fumarato monosódico, etc.), tampones de gluconato (p.ej., mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampón de oxalato (p.ej., mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio etc.), tampones de lactato (p.ej., mezcla de ácido láctico-lactato de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de acetato (p.ej., mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio etc.). Adicionalmente, se pueden utilizar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.
Se pueden añadir conservantes para retardar el crecimiento microbiano, y se pueden añadir en cantidades que oscilan entre 0,2%-1% (p/v). Los conservantes adecuados para su uso con la presente descripción incluyen fenol, alcohol bencílico, metacresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (p.ej., cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio y alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol. Los agentes isotónicos a veces conocidos como "estabilizantes" se pueden añadir para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente descripción e incluyen alcoholes de azúcares polihidroxilados, por ejemplo alcoholes trihidroxilados o de azúcares superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizantes se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de carga a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o la adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihidroxilados (enumerados anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparragina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (p.ej., péptidos de 10 residuos o menos); proteínas tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como monosacáridos de polivinilpirrolidona, tales como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa y trisacaridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 partes en peso de proteína activa.
Se pueden añadir tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico y para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por la agitación, que también permite que la formulación se exponga a la superficie de cizallamiento sometida a tensión sin causar desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), poloxámeros (184, 188 etc.), polioles Pluronic, monoéteres de polioxietilen sorbitán (TWEEN®-20, TWEEN®-80,
etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, por ejemplo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
Los excipientes misceláneos adicionales incluyen agentes volumétricos (p.ej., almidón), agentes quelantes (p.ej., EDTA), antioxidantes (p.ej., ácido ascórbico, metionina, vitamina E) y codisolventes.
La formulación de la presente memoria también puede contener un agente terapéutico combinado además del anticuerpo anti-VEGF de la descripción. Los ejemplos de los agentes terapéuticos combinados adecuados se proporcionan en la Sección 6.10 a continuación.
El programa de dosificación para la administración subcutánea puede variar de una vez cada seis meses a diario dependiendo de una serie de factores clínicos, que incluyen el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-VEGF.
La dosificación de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción que se va a administrar variará de acuerdo con el anticuerpo particular, el tipo de enfermedad (p.ej., cáncer, inflamatoria, etc.), el sujeto y la gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (p.ej., si se utiliza un agente terapéutico combinado), y la ruta de administración seleccionada; la dosificación apropiada puede ser determinada fácilmente por una persona experta en la técnica.
Un experto en la técnica reconocerá que la cantidad óptima y el espaciamiento de las dosis individuales de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción se determinarán por la naturaleza y el alcance de la afección que se esté tratando, la forma, ruta y sitio de administración, y la edad y las condiciones del sujeto particular que se esté tratando, y que un médico finalmente determinará las dosificaciones apropiadas que se utilizarán. Esta dosificación se puede repetir tantas veces como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de la dosis se pueden alterar o reducir, de acuerdo con la práctica clínica habitual.
6.10 Terapia combinada
A continuación se describen métodos combinatorios en los que se pueden utilizar los anticuerpos anti-VEGF de la descripción. Los métodos combinatorios de la descripción implican la administración de al menos dos agentes a un paciente, el primero de los cuales es un anticuerpo anti-VEGF de la descripción, y el segundo de los cuales es un agente terapéutico combinado. El anticuerpo anti-VEGF y el agente terapéutico combinado se pueden administrar simultáneamente, secuencialmente o por separado.
Los métodos de terapia combinatoria de la presente descripción pueden dar como resultado un efecto mayor que el aditivo, que proporciona beneficios terapéuticos cuando ni el anticuerpo anti-VEGF ni el agente terapéutico combinado se administran en una cantidad que es terapéuticamente eficaz sola.
En los presentes métodos, el anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se pueden administrar concurrentemente, o simultáneamente o sucesivamente. Según se utiliza en la presente memoria, se dice que el anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se administran sucesivamente si se administran al paciente el mismo día, por ejemplo, durante la misma visita al paciente. La administración sucesiva puede ocurrir con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 horas de diferencia. Por el contrario, se dice que el anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se administran por separado si se administran al paciente en diferentes días, por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se pueden administrar a intervalos de 1 día, 2 días o 3 días, una semana, 2 semanas o meses. En los métodos de la presente descripción, la administración del anticuerpo anti-VEGF de la descripción puede preceder o seguir a la administración del agente terapéutico combinado.
Como un ejemplo no limitante, el anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se pueden administrar concurrentemente durante un período de tiempo, seguido de un segundo período de tiempo en el que la administración del anticuerpo anti-VEGF de la descripción y el agente terapéutico combinado se alterna.
Debido a los efectos potencialmente sinérgicos de la administración de un anticuerpo anti-VEGF de la descripción y un agente terapéutico combinado, tales agentes se pueden administrar en cantidades que, si uno o ambos agentes se administran solos, no son terapéuticamente eficaces.
En ciertos aspectos, el agente terapéutico combinado es un agente antiangiogénico, un fármaco antirreumático, un agente antiinflamatorio, un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, un inmunosupresor o un fármaco citotóxico.
Se contempla que cuando se utilizan para tratar diversas enfermedades, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden combinar con otros agentes terapéuticos adecuados para la misma enfermedad o enfermedades
similares. Cuando se utilizan para tratar el cáncer, los anticuerpos de la presente descripción se pueden utilizar combinados con terapias contra el cáncer convencionales, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de las mismas.
En algunos otros aspectos, otros agentes terapéuticos útiles para la terapia de tumores combinados con el anticuerpo de la descripción incluyen antagonistas, p.ej., anticuerpos, de otros factores que están involucrados en el crecimiento tumoral, tal como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2), ErbB3, ErbB4 o TNF-α.
A veces, para el tratamiento de cánceres y enfermedades inmunitarias, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. En una realización preferida, el anticuerpo contra VEGF se coadministra con un agente inhibidor del crecimiento.
Las dosificaciones adecuadas para el agente inhibidor del crecimiento son las que se utilizan actualmente y se pueden reducir debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo anti-VEGF.
Para el tratamiento de cánceres, enfermedades inmunitarias y enfermedades retinianas, los agentes antiinflamatorios se pueden utilizar adecuadamente combinados con los anticuerpos anti-VEGF de la descripción. Los agentes antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, acetaminofeno, difenhidramina, meperidina, dexametasona, pentasa, mesalazina, asacol, fosfato de codeína, benorilato, fenbufeno, naprosina, diclofenaco, etodolaco e indometacina, aspirina e ibuprofeno.
Para el tratamiento del cáncer, los agentes quimioterapéuticos se pueden utilizar adecuadamente combinados con los anticuerpos anti-VEGF de la descripción. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, moléculas radiactivas, toxinas, también denominadas citotoxinas o agentes citotóxicos, que incluyen cualquier agente que sea perjudicial para la viabilidad de células, agentes y liposomas u otras vesículas que contienen compuestos quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracil-descarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, un anticuerpo anti-integrina α5β1, agentes alquilantes, alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, diamino dicloro platino, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparraginasa, BCG vivo (intravesical), fosfato sódico de betametasona y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfán, leucoralina cálcica, caliqueamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrógenos conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, Citoxan, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunorrubicina HCL, citrato de daunorrubicina, denilequina diftitox, Dexrazoxano, dibromomanitol, dihidroxiantracinodiona, docetaxel, mesilato de dolasetrón, doxorrubicina HCL, dronabinol, L-asparraginasa de E coli, eolociximab, emetina, epoetina-α, Erwinia Lasparraginasa, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato sódico de estramustina, bromuro de etidio, etinilestradiol, etidronato, factor etopósido citrororum, fosfato de etopósido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, gemcitabina HCL, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetrón HCL, hidroxiurea, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferón α-2b, irinotecán HCL, letrozol, leucovorina cálcica, acetato de leuprolida, levamisol HCL, lidocaína, lomustina, maitansinoide, mecloretamina HCL, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán HCL, mercaptopurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreótido, ondansetrón HCL, paclitaxel, pamidronato disódico, pentostatina, pilocarpina HCL plimicina, polifeprosan 20 con implante de carmustina, porfímero de sodio, procaína, procarbazina HCL, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, tenopósido, testolactona, tetracaína, tioepa clorambucilo, tioguanina, tiotepa, topotecan HCL, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina.
Se puede utilizar cualquier agente anti-angiogénico junto con los anticuerpos anti-VEGF de la descripción, incluidos los enumerados por Carmeliet y Jain, 2000, Nature 407:249-257. En ciertas realizaciones, el agente anti-angiogénico es otro antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tal como variantes de VEGF, fragmentos de receptores de VEGF solubles, aptámeros capaces de bloquear VEGF o VEGFR, anticuerpos anti-VEGFR neutralizantes, inhibidores de tirosina quinasas de VEGFR de bajo peso molecular y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, o además, se pueden administrar simultáneamente dos o más anticuerpos anti-VEGF al paciente.
En ciertas realizaciones, la terapia hormonal se puede utilizar junto con anticuerpos anti-VEGF de la descripción. En algunas realizaciones, la terapia hormonal incluye uno o más agentes que inhiben el estrógeno y/o la progesterona para promover el crecimiento de células cancerosas, p.ej., un modulador selectivo del receptor de estrógenos tales como tamoxifeno, un inhibidor de la aromatasa tal como el anastrozol (Arimidex®) o el letrozol (Femara), un inactivador de la aromatasa como el exemestano (Aromasin®) o un agente que inhibe la producción de estrógenos tal como la goserelina (Zoladex). En otras realizaciones, la terapia hormonal consiste en uno o más agentes que
inhiben la producción de hormonas de los ovarios.
En algunos aspectos, se puede utilizar un anticuerpo anti-VEGF junto con un inhibidor de proteína tirosina quinasa (PTK) de molécula pequeña. En algunas realizaciones, el inhibidor de PTK es específico para una tirosina quinasa receptora de VEGF. En otras realizaciones, el inhibidor de PTK se une a más de una de la familia de tirosina quinasas receptoras de VEGF (p.ej., VEGFR-1, VEGFR-2). En otras realizaciones, los inhibidores de proteína tirosina quinasa útiles en las composiciones y métodos de la invención incluyen inhibidores de PTK que no se unen selectivamente a la familia tirosina quinasas receptoras de VEGF, sino que también se unen a los dominios tirosina quinasa de otras familias de proteínas tales como HER2, HER3, HER4, PDGFR, y/o Raf.
En algunas realizaciones, la tirosina quinasa es un receptor de tirosina quinasa, es decir, es un dominio intracelular de una proteína más grande que tiene un dominio de unión al ligando extracelular y se activa mediante la unión de uno o más ligandos. En ciertas realizaciones, la proteína tirosina quinasa es una tirosina quinasa no receptora. Los inhibidores de PTK para su uso en los métodos de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, gefitinib (ZD-1839, Iressa®), erlotinib (OSI-1774, Tarceva™), canertinib (CI-1033), vandetanib (ZD6474, Zactima®), tirfostina AG-825 (CAS 149092-50-2), lapatinib (GW-572016), sorafenib (BAY43-9006), AG-494 (CAS 133550-35-3), RG13022 (CAS 149286-90-8), RG-14620 (CAS 136831-49-7), BIBW 2992 (Tovok), tirfostina 9 (CAS 136831-49-7), tirfostina 23 (CAS 118409-57-7), tirfostina 25 (CAS 118409-58-8), tirfostina 46 (CAS 122520-85-8), tirfostina 47 (CAS 122520-86-9), tirfostina 53 (CAS 122520-90-5), buteína (1-(2,4-dihidroxifenil)-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-propen-1-ona 2',3,4,4'-tetrahidroxichalcona; CAS 487-52-5), curcumina ((E,E)-1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadien-3,5diona; CAS 458-37-7), N4-(1-bencil-1H-indazol-5-il)-N6,N6-dimetil-pirido-[3,4-d]-pirimidina-4,6-diamina (202272-682), AG-1478, AG-879, amiduro de ácido (3-(6-(3-trifluorometil)fenilamino)-pirimidin-4-ilamino)-fenil)ciclopropanocarboxílico (CAS 879127-07-8), N8-(3-cloro-4-fluorofenil)-N2-(1-metilpiperidin-4-il)-pirimido[5,4-d] pirimidin-2,8-diamina, 2HCl (CAS 196612-93-8), 4-(4-benciloxianilino)-6,7-dimetoxiquinazolina (CAS 179248-61-4), N-(4-((3-cloro)-4-fluorofenil)amino)pirido[3,4-d]pirimidin-6-il)-2-butinamida (CAS 881001-19-0), EKB-569, HKI-272 y HKI-357.
En una realización específica, se utiliza un anticuerpo anti-VEGF de la descripción combinado con quimioterapia intravenosa basada en 5-fluorouracilo. En un aspecto de la descripción, esta combinación es adecuada, entre otros, para el tratamiento de primera o segunda línea de pacientes con carcinoma metastásico de colon o recto.
En otra realización específica, se utiliza un anticuerpo anti-VEGF de la descripción combinado con carboplatino y paclitaxel. En un aspecto de la descripción, esta combinación es adecuada, entre otros, para el tratamiento de primera o segunda línea de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, no escamoso, no resecable, localmente avanzado, recurrente o metastásico.
En otra realización específica más, se utiliza un anticuerpo anti-VEGF de la descripción combinado con paclitaxel. En un aspecto de la descripción, esta combinación es adecuada, entre otros, para el tratamiento de pacientes que no han recibido quimioterapia para el cáncer de mama negativo para HER2 metastásico.
Para el tratamiento de enfermedades retinianas, los anticuerpos anti-VEGF de la descripción se pueden utilizar combinados con E10030, un aptámero pegilado derivado del factor de crecimiento antiplaquetario (PDGF); con ARC 1905, un aptámero pegilado dirigido al componente C5 de la cascada del complemento; y volociximab, un anticuerpo monoclonal dirigido al receptor transmembrana de integrina α5β1; terapia fotodinámica con Visudyne® (PDT); o Macugen®, un aptámero (pegaptanib sódico).
6.11 Regímenes terapéuticos La presente descripción proporciona regímenes terapéuticos que implican la administración de los anticuerpos anti-VEGF de la descripción. El régimen terapéutico variará según la edad, el peso y el estado de enfermedad del paciente. El régimen terapéutico puede continuar durante 2 semanas hasta indefinidamente. En realizaciones específicas, el régimen terapéutico se continúa durante 2 semanas a 6 meses, de 3 meses a 5 años, de 6 meses a 1 o 2 años, de 8 meses a 18 meses, o similares. El régimen terapéutico puede ser un régimen de dosis no variable o un régimen de dosis variable múltiple.
Para los regímenes de dosificación ilustrativos descritos a continuación, el anticuerpo anti-VEGF se puede administrar en forma de una solución estéril libre de conservantes para la administración subcutánea.
Para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico, se administra un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por vía intravenosa a una dosis de 0,5-15 mg/kg cada 2 semanas con régimen de embolada-IFL (irinotecán, 5fluorouracilo y leucovorina). En realizaciones específicas, la dosis es 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas con embolada-IFL.
En otra realización para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico, se administra un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por vía intravenosa a una dosis de 1-30 mg/kg cada 2 semanas con FOLFOX4 (régimen de
oxaliplatino, leucovorina y fluorouracilo). En realizaciones específicas, la dosis es de 2-9 mg/kg, 3-12 mg/kg, 1-7,5 mg/kg, 2-20 mg/kg, 6-9,75 mg/kg o 4-9,5 mg/kg cada dos semanas con FOLFOX4.
Para el tratamiento de cáncer de pulmón de células no pequeñas no escamosas, se administra un anticuerpo anti
5 VEGF de la descripción por vía intravenosa a una dosis de 2-40 mg/kg cada tres semanas con carboplatino/paclitaxel. En realizaciones específicas, la dosis es de 5-14 mg/kg, 4-20 mg/kg, 10-17,5 mg/kg, 7-14 mg/kg, 10-30 mg/kg o 3-30 mg/kg cada tres semanas con carboplatino/paclitaxel.
Para el tratamiento del cáncer de mama metastásico, se administra un anticuerpo anti-VEGF de la descripción por
10 vía intravenosa a una dosis de 0,5-20 mg/kg cada dos semanas con paclitaxel. En realizaciones específicas, la dosis es de 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas con paclitaxel.
Para el tratamiento del cáncer de mama metastásico, se administra un anticuerpo anti-VEGF de la invención por vía intravenosa a una dosis de 0,5-20 mg/kg cada dos semanas como monoterapia. En realizaciones específicas, la
15 dosis es de 1-4 mg/kg, 2-6 mg/kg, 0,5-3 mg/kg, 1-10 mg/kg, 3-4,8 mg/kg o 1-4,5 mg/kg cada dos semanas como monoterapia.
Para el tratamiento de afecciones retinianas (p.ej., degeneración macular relacionada con la edad ("AMD"), edema macular después de la oclusión de la vena de la retina ("RVO") o edema macular diabético ("DME"), se administra 20 un anticuerpo anti-VEGF de la descripción a una dosis de 0,1-1 mg por inyección intravítrea una vez al mes (aproximadamente 28 días). En realizaciones específicas, la dosis es de 0,1-0,4 mg, 0,2-0,6 mg, 0,1-0,25 mg, 0,250,5 mg, 0,25-0,75 mg, o 0,3-0,45 mg por inyección intravítrea una vez al mes (aproximadamente 28 días). En una realización específica de la descripción, un paciente tratado con un anticuerpo anti-VEGF de la descripción tiene AMD húmeda. En otra realización específica de la descripción, un paciente tiene AMD seca. En otra realización más,
25 un paciente tiene RVO. En otra realización, un paciente tiene DME.
6.12 Kits de diagnóstico y farmacéuticos
La presente descripción abarca los kits farmacéuticos que contienen los anticuerpos anti-VEGF (que incluyen
30 productos conjugados de anticuerpos) de la descripción. El kit farmacéutico es un paquete que comprende el anticuerpo anti-VEGF de la descripción (p.ej., ya sea en forma liofilizada o como una solución acuosa) y uno o más de los siguientes:
● Una combinación de agente terapéutico, por ejemplo como se describe en la Sección 6.10 anterior; 35 ● Un dispositivo para administrar el anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo un bolígrafo, aguja y/o jeringa; y
● Agua o tampón de calidad farmacéutica para resuspender el anticuerpo si el anticuerpo está en forma liofilizada.
En ciertos aspectos, cada dosis unitaria del anticuerpo anti-VEGF se empaqueta por separado, y un kit puede
40 contener una o más dosis unitarias (p.ej., dos dosis unitarias, tres dosis unitarias, cuatro dosis unitarias, cinco dosis unitarias, ocho dosis unitarias, diez dosis unitarias o más). En una realización específica, las una o más dosis unitarias están alojadas cada una en una jeringa o bolígrafo.
Los kits de diagnóstico que contienen los anticuerpos anti-VEGF (que incluyen productos conjugados de
45 anticuerpos) de la descripción también se incluyen en la presente memoria. El kit de diagnóstico es un paquete que comprende el anticuerpo anti-VEGF de la descripción (p.ej., en forma liofilizada o como una solución acuosa) y uno
o más reactivos útiles para realizar un análisis de diagnóstico. Cuando el anticuerpo anti-VEGF está marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima (p.ej., un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como 50 estabilizadores, tampones (p.ej., un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y similares. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-VEGF incluido en un kit de diagnóstico se inmoviliza sobre una superficie sólida, o se incluye en el kit una superficie sólida (p.ej., un portaobjetos) en la que se puede inmovilizar el anticuerpo. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del análisis. En una realización específica, se pueden proporcionar el
55 anticuerpo y uno o más reactivos (individualmente o combinados) como polvos secos, habitualmente liofilizados, que incluyen excipientes que, al disolverse, proporcionarán una solución de reactivo que tenga la concentración apropiada.
7. Ejemplo 1: Identificación de epítopos de células T de Bevacizumab 60
7.1 Materiales y métodos
7.1.1 Péptidos
Los péptidos se sintetizaron utilizando un formato Multi-pin para Mimotopos (Adelaida, Australia). Las secuencias de las regiones V de cadena ligera y pesada de bevacizumab se sintetizaron como péptidos de 15 unidades que se solapaban en 12 aminoácidos (Tablas 3 y 4) para un total de 69 péptidos. Los péptidos llegaron liofilizados y se volvieron a suspender en DMSO (Sigma-Aldrich) a aproximadamente 1-2 mg/ml. Los péptidos de partida se mantuvieron congelados a -20°C.
7.1.2 Células mononucleares de sangre periférica humana
Los productos de la capa leucocitaria del donante de la comunidad se adquirieron del Stanford Blood Center, Palo Alto, CA. El material de la capa leucocitaria se diluyó 1:1 v:v con DPBS que no contenía calcio ni magnesio. El material de la capa leucocitaria diluida (25-35 ml) se recuperó en tubos de centrífuga cónicos de 50 ml (Sarsted o Costar) con 12,5 ml de FicollPaque-PLUS (GE Healthcare). Las muestras se centrifugaron a 900 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se obtuvieron de la interfaz. Se añadió DPBS para llevar el volumen final a 50 ml y las células se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las células sedimentadas se resuspendieron en DPBS y se contaron.
7.1.3 Células dendríticas
Para el aislamiento de células dendríticas, se sembraron matraces de cultivo T75 (Costar) con 108 PBMC recién aisladas en un volumen total de 30 ml de medio AIM V (Invitrogen). El exceso de PBMC se congeló a -80°C en suero de ternera fetal al 90% (FCS), DMSO al 10% a 5 x 107 células/mL. Los matraces T75 se incubaron a 37°C en CO2 al 5% durante 2 horas. Las células no adherentes se eliminaron, y la monocapa adherente se lavó con DPBS. Para diferenciar las células dendríticas de los monocitos, se añadieron 30 ml de medio AIM V que contenía 800 unidades/ml de GM-CSF (R y D Systems) y 500 unidades/ml de IL-4 (R y D Systems). Los matraces se incubaron durante 5 días. El día 5 se añadieron IL-1α (Endogen) y TNFα (Endogen) a 50 pg/ml y 0,2 ng/ml. Los matraces se incubaron dos días más. El día 7, las células dendríticas se recogieron mediante la adición de 3 ml de EDTA 100 mM que contenía de 0,5 a 1,0 mg de Mitomicina C (Sigma-Aldrich) para una concentración final de EDTA 10 mM y de 16,5 a 33 μg/ml de Mitomicina C. Los matraces se incubaron una hora adicional a 37°C y con CO2 al 5%. Las células dendríticas se recogieron y se lavaron en medio AIM V 2-3 veces.
7.1.4 Cultivo celular
El día 7, las PBMC autólogas previamente congeladas se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C. Las células se diluyeron inmediatamente en medio DPBS o AIM V y se centrifugaron a 350 g durante 5 minutos. Las células CD4+ se enriquecieron mediante selección negativa utilizando esferas magnéticas (kit Easy-Sep CD4+, Stem Cell Technologies). Las células T CD4+ autólogas y las células dendríticas se cocultivaron a 2 x 105 células CD4+ por 2 x 104 células dendríticas por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Costar 9077). Los péptidos se añadieron a aproximadamente 5 μg/ml. Los pocillos de control contenían el vehículo DMSO (Sigma) solo al 0,25%
v:v. Los pocillos de control positivo contenían DMSO al 0,25% y el toxoide del tétanos (List Biologicals o CalBioChem) a 1 μg/ml. Los cultivos se incubaron durante 5 días. El día 5, se añadieron 0,25 μCi por pocillo de timidina tritiada (Amersham o GE Healthcare). Los cultivos se cosecharon el día 6 en FilterMat utilizando una cosechadora Packard Filtermate Cell. El recuento de centelleo se realizó utilizando un contador de centelleo Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer).
7.1.5 Análisis de datos
Los valores promedio de CPM de fondo se calcularon promediando los resultados individuales de 6 a 12 réplicas. Se promediaron los valores de CPM de los cuatro pocillos de control positivo. Se promediaron los pocillos duplicados o triplicados para cada péptido. Los valores del índice de estimulación para el control positivo y los pocillos peptídicos se calcularon dividiendo los valores de CPM experimentales medios por los valores de control promedio. Para ser incluido en el conjunto de datos, se requirió un índice de estimulación de más de 3,0 en los pocillos de control positivo de toxoide tetánico. Se observó una respuesta para cualquier péptido que daba como resultado un índice de estimulación de 2,95 o superior. Los péptidos se sometieron a ensayo utilizando muestras de sangre periférica de un grupo de 99 donantes. Las respuestas a todos los péptidos fueron recopiladas. Para cada péptido sometido a ensayo, se calculó el porcentaje del conjunto donante que respondió con un índice de estimulación de 2,95 o superior. Además, también se calculó el índice de estimulación promedio para todos los donantes.
7.2 Resultados
7.2.1 Identificación de epítopos de células T CD4+ en las regiones VH y VL de Bevacizumab
Se identificaron los péptidos epitópicos de células T CD4+ mediante un análisis de las respuestas porcentuales a los péptidos dentro del conjunto de 99 donantes. El porcentaje de respuesta promedio y la desviación típica se calcularon para todos los péptidos sometidos a ensayo que describen las regiones V de cadena pesada y cadena
ligera de bevacizumab. Una tasa de respuesta mayor o igual a la respuesta de fondo promedio más tres desviaciones típicas se consideró un posible epítopo de células T CD4+. Para la región V de la cadena ligera de bevacizumab, se analizaron 32 péptidos (Tabla 3) que dieron como resultado un porcentaje de respuesta promedio de fondo de 2,1 ± 2,7%. Se determinó que tres desviaciones típicas por encima del fondo eran de 10,2%. Un péptido en la posición 13 (Q40-T54) mostró este nivel de respuesta en el conjunto de datos del péptido de cadena ligera de bevacizumab, con una tasa de respuesta de 15,2% (Figura 2A). Para la región V de la cadena pesada de bevacizumab, se analizaron 37 péptidos (Tabla 4). La respuesta promedio porcentual de fondo fue de 2,8 ± 3,1%. Tres desviaciones típicas por encima del fondo fueron 12,1%. Un péptido dentro del conjunto de datos de cadena pesada de bevacizumab, núm.18 (N52-R56), logró un porcentaje de respuesta de 16,2% (Figura 3A). Un segundo péptido en la posición núm. 30 en el conjunto de datos de cadena pesada alcanzó una tasa de respuesta de 9,1%, y se consideró un epítopo debido a un aumento del índice de estimulación (véase a continuación).
El índice de estimulación promedio se calculó para todos los péptidos en el conjunto de datos. El péptido 13 de la cadena ligera tenía un alto índice de estimulación promedio de 1,82 ± 0,24 e.t.m. (Figura 2B). El péptido de cadena pesada núm. 18 tenía un valor de índice de estimulación promedio de 2,16 ± 0,35 e.t.m. (Figura 3B). El péptido en la posición núm. 30 arrojó un índice de estimulación promedio de 1,45 + 0,18 e.t.m. (Figura 3B) debido a un índice de estimulación promedio elevado y una tasa de respuesta superior a la media. El péptido en la posición núm. 30 se incluyó al determinar el contenido de epítopo de células T CD4+ de esta región V del anticuerpo. Todos estos valores del índice de estimulación son significativamente más altos que el índice de estimulación promedio para todos los péptidos en los dos conjuntos de datos (1,14 ± 0,07 para los 69 péptidos de cadena pesada y cadena ligera).
Estos datos indican que hay tres regiones de epítopos de células T CD4+ en las regiones V de bevacizumab (Tabla 5). En la región VL, se encuentra un epítopo en la posición del péptido 13 que abarca el marco 2 y dos aminoácidos de CDR2. La secuencia contiene una retromutación murina (V46) insertada en la secuencia durante la humanización. En la Tabla 5, los aminoácidos derivados de CDR están subrayados. En la cadena pesada, se identificaron dos regiones de péptidos epitópicos. El epítopo más fuerte en la posición núm. 18 abarca toda la CDR2. La segunda región peptídica del epítopo contiene tanto el marco 3 como los aminoácidos de CDR3.
7.2.2
Variantes de inmunogenicidad reducida de anticuerpos variantes de Bevacizumab
Se sometió bevacizumab a análisis mutacional (véase el Ejemplo 2 a continuación). Basándose en estudios de unión a antígeno realizados junto con el análisis mutacional, se identificó un conjunto de sustituciones de aminoácidos candidatas dentro de la región CDR-H2 y CDR-H3 que no redujeron significativamente la afinidad del anticuerpo hacia VEGF (Tabla 6). Estas sustituciones de aminoácidos se analizaron individualmente y combinadas para identificar variantes de bevacizumab con una inmunogenicidad reducida en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje.
8.
Ejemplo 2: Identificación de variantes de bevacizumab con mayor afinidad hacia VEGF
El anticuerpo bevacizumab se sometió a un análisis mutacional completo para identificar mutantes que tenían una mayor afinidad hacia VEGF en comparación con el bevacizumab. La mayor afinidad de mutantes candidatos de alta afinidad hacia VEGF en comparación con bevacizumab se analizó mediante BIAcore para confirmar sus características de unión.
8.1 Materiales y métodos
8.1.1 BIAcore
Se clonaron 15 variantes de constructos de la región VH de bevacizumab junto con la región VL no modificada en un plásmido que contenía IgG1 humana, expresado en líneas celulares 293T/17 por transfección transitoria, y anticuerpos purificados por afinidad con Proteína A o Proteína G. La afinidad de los anticuerpos para VEGF (R y D Systems, Minneapolis, MN) se determinó utilizando un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore 2000 y 3000 (BIAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). El anticuerpo anti-Fc humano policlonal de cabra (Jackson Immunoresearch) se inmovilizó primero en la superficie del biosensor utilizando reactivos de acoplamiento de amina BIAcore convencionales (N-etil-N'-dimetilamino-propilcarbodiimida, EDC; N-hidroxisuccinimida, NHS y etanolamina HCl, pH 8,5), seguido de la captura de anticuerpos anti-VEGF (bevacizumab y variantes de bevacizumab) en superficies paralelas a una velocidad de flujo baja de 5 μL/min. RL se mantuvo bajo para minimizar la avidez debida a la naturaleza dimérica de VEGF. No se realizó captura del anticuerpo en la superficie de referencia para que sirviera como control negativo. Posteriormente, se inyectó VEGF a todas las células de flujo a una velocidad de flujo de 50 μL/min durante dos minutos para controlar la asociación, seguido de un flujo de 25 minutos de tampón de migración HBS-P (HEPES 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, P-20 al 0,005%, pH 7,4) para controlar la fase de disociación. En cada ciclo, se inyecto sobre la superficie VEGF, a 6 concentraciones diferentes de VEGF que variaban entre 0 nM y 512 nM y en incrementos de cuatro veces. La superficie se regeneró con H3PO4 al 1,5% a una velocidad de flujo de 100 μL/min en dos pulsos breves al final de cada ciclo. Los datos de unión se ajustaron al
modelo Langmuir 1:1 para extraer las constantes de unión del soporte lógico BIAevaluate. Se aplicó una doble referencia en cada análisis para eliminar las respuestas de fondo de la superficie de referencia y el control de tampón solo. Todos los datos de la cinética de unión se analizaron al menos en tres determinaciones separadas.
8.2 Resultados
Los resultados se muestran como números absolutos y como la multiplicidad de mejora sobre el tipo salvaje. Casi todas las variantes enumeradas tienen mejores velocidades de asociación (kon) y disociación (koff) en comparación con bevacizumab o el tipo salvaje (Tabla 7). Los valores de afinidad finales para las variantes estaban en el intervalo de 0,1 nM y alcanzaban valores tan bajos como 0,08 nM para la variante correspondiente al SEQ ID NO: 82. Estos valores contrastan con los de bevacizumab, que tiene una afinidad medida en estos experimentos de 1,9 nM.
Las tablas 8 y 9 muestran variantes de cadena pesada adicionales que los estudios de unión preliminares muestran que tienen una mayor afinidad hacia VEGF que bevacizumab (datos no mostrados). La Tabla 10 muestra variantes de cadena pesada que los estudios preliminares indican que tienen una afinidad hacia VEGF similar a la de bevacizumab (datos no mostrados). La Tabla 11 muestra variantes de cadena ligera que los estudios preliminares indican que tienen una afinidad hacia VEGF similar a la de bevacizumab (datos no mostrados).
9. Ejemplo 3: Selección de péptidos variantes desinmunizados
Se generaron péptidos variantes correspondientes a las regiones inmunogénicas de bevacizumab (véase el Ejemplo 1) (Tablas 14-16). Los péptidos variantes se seleccionaron basándose en el análisis mutacional completo descrito en el Ejemplo 2, en el que se identificaron modificaciones de CDR que no redujeron sustancialmente la afinidad de unión de bevacizumab a VEGF.
Se sintetizaron y sometieron a ensayo un total de 77 péptidos basándose en los estudios de unión a antígeno, que incluyen dos síntesis de cada uno de los péptidos de 15 unidades parentales. Se sometió a ensayo un total de 93 donantes se probaron con los péptidos parentales y variantes utilizando el método descrito en la Sección 7.1 y los resultados se muestran en las Figuras 4A-4C. En particular, las Figuras 4A-4C muestran respuestas de células T CD4+ a péptidos epitópicos de bevacizumab mutante. Las respuestas promedio a las secuencias de epítopos parentales no modificadas se indican con marcas abiertas. Los círculos grandes indican los péptidos seleccionados a los que se hace referencia en la Tabla 17 (ver a continuación). La Figura 4A muestra péptidos CDR2 de VH; La Figura 4B muestra péptidos CDR3 de VH; y la Figura 4C muestra péptidos CDR2 de VL. Los datos de inmunogenicidad para los péptidos seleccionados se muestran en la Tabla 17.
Para los péptidos CDR2 de la región variable de la cadena pesada, el porcentaje medio de respuesta a los péptidos parentales en este estudio fue de 5,38% y de 6,45%. Tres péptidos mutantes demostraron una tasa de respuesta global reducida y un índice de estimulación promedio en comparación con los péptidos parentales.
Las tasas de respuesta al péptido parental para los péptidos epitópicos de CDR3 de la región variable de cadena pesada en este estudio fueron de 7,53% y de 6,45%. Se encontró una única secuencia peptídica mutante que demostró respuestas globales reducidas en comparación con el péptido parental.
Finalmente, las tasas de respuesta del péptido CDR2 de la región variable de la cadena ligera en este estudio fueron del 25,8% y 15%. Se identificó un péptido mutante que demostró una inmunogenicidad global reducida en comparación con el péptido original.
Para demostrar que las mutaciones desinmunizantes mantenían afinidad hacia VEGF en comparación con bevacizumab, se utilizó la citometría de flujo para comparar las propiedades de unión de anticuerpos variantes que incorporaban mutaciones en los péptidos epitópicos modificados (como modificaciones simples o dobles de aminoácidos y bevacizumab). Varias mutaciones desinmunizantes tuvieron una afinidad comparable o mayor hacia VEGF en comparación con bevacizumab.
En un estudio, las células 293c18 transfectadas transitoriamente que expresaban las formas unidas a la superficie de las variantes de bevacizumab se tiñeron con rHuVEGF conjugado con Alexa647 (Invitrogen núm. de Cat. PHG0143) a 3 nM y anti-kappa humana de cabra-RPE (Southern Biotech núm. de Cat. 2063-09) a una dilución de
1:400. Los datos se recogieron mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo DakoCytomation CyAn ADP y se analizaron utilizando el programa de análisis FloJo de Treestar. Las intensidades medias de fluorescencia (MFI) medidas en este trabajo se muestran en la Tabla 18.
En otro estudio, se midió la CE50 de bevacizumab y el anticuerpo variante que se une a VEGF. Los diagramas de titulación de anticuerpos se generaron utilizando bevacizumab y sus variantes con rHu VEGF conjugado con Alexas647 como se ha descrito anteriormente, con el VEGF diluido en serie dos veces de 5 μM a 0,01 μM. Los valores de CE50 se muestran en la Tabla 19.
10. Ejemplo 4: Identificación de variantes adicionales de bevacizumab con mayor afinidad hacia VEGF
Se llevó a cabo un análisis mutacional más completo centrado en la VH de bevacizumab y las sustituciones beneficiosas resultantes se introdujeron en inmunoglobulinas (Ig) de dominio variable dual ("DVD") DLL4-VEGF. Una inmunoglobulina DVD-Ig combina los dominios variables de unión a la diana de dos anticuerpos monoclonales por medio de conectores para crear un agente individual tetravalente con doble direccionamiento (véase Gu y Ghayur, 2012, Methods in Enzymology 502:25-41). Las DVD-Ig DLL4-VEGF incluían las regiones variables del anticuerpo humanizado anti-DLL4 h1A11.1 (que tiene una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 187 del documento U.S. Ap. 2011/0217237 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 197, documento U.S. Ap. 2011/ 0217237). DLL4 es un ligando tipo delta que se expresa fuertemente en vasos tumorales y cuya señalización a través de la vía Notch es necesaria para el desarrollo vascular normal y la angiogénesis tumoral. Se descubrió que el bloqueo de la señalización D114/Notch retrasaba el crecimiento tumoral al potenciar la característica de brote vascular caótico, no productivo, de la angiogénesis tumoral. Véase Lobov et al., 2007, Proc. Nat'1. Acad. Sci. U.S.A. 104:3219-3224.
Se generaron dos versiones de DVD-Ig DLL4-VEGF, que contenían diferentes conectores. La primera versión "SL" contenía un conector de cadena pesada corto (por su equivalente en inglés short) (con la secuencia de aminoácidos ASTKGP (SEQ ID NO: 427)) que separaba las regiones variables de cadena pesada anti-DLL4 y bevacizumab y un conector de cadena ligera largo (con la secuencia de aminoácidos TVAAPSVFFPP (SEQ ID NO: 433)) que separaba las regiones variables de cadena ligera anti-DLL4 y bevacizumab. La segunda versión "SS" contenía un conector de cadena pesada corto (por su equivalente en inglés short) (con la secuencia de aminoácidos ASTKGP (SEQ ID NO: 427)) que separaba las regiones variables de cadena pesada anti-DLL4 y bevacizumab y un conector de cadena ligera corto (por su equivalente en inglés short) (con la secuencia de aminoácidos TVAAP (SEQ ID NO: 418)) que separaba las regiones variables de la cadena ligera anti-DLL4 y bevacizumab. En ambos casos, las regiones variables de bevacizumab eran internas a las regiones variables anti-DLL4 (véase la Figura 5).
Las DVD-Ig DLL4-VEGF se sometieron a un análisis mutacional adicional para identificar mutantes que mostraran una mayor afinidad hacia VEGF. Se realizó un análisis mutacional completo centrado en la VH de bevacizumab en 2 condiciones diferentes: un "análisis de 1 hora" que implicaba 1 hora de unión del anticuerpo a la diana seguido de lavado, y un "análisis durante la noche" que implicaba 1 hora de unión del anticuerpo al VEGF marcado y competición durante la noche con exceso de VEGF sin marcar seguido de lavado. Es más probable que el análisis de 1 hora enriquezca las variantes con velocidades de asociación más rápidas y se pretende que el análisis durante la noche enriquezca aquellos anticuerpos con velocidades de disociación más lentas, ya que la unión tiene que sobrevivir durante la noche en presencia de un competidor frío. Las variantes se escrutaron en tres formatos diferentes: IgG, DVD-Ig con conectores SL, y DVD-Ig con conectores SS. La unión de bevacizumab y sus variantes que contenían las 4 sustituciones de aminoácidos empleadas en VH de ranibizumab (T28D, N31H, H97Y y S100aT; véase Chen, 1999, J. Mol. Biol. 293:865-881) no fue distinguible en el análisis de 1 hora, pero fue distinguible en el análisis durante la noche (datos no mostrados). De manera similar, el análisis durante la noche mide las diferencias entre las variantes con velocidades de disociación más lentas mejores que las del análisis de 1 hora convencional. Esto se ilustra para la sustitución H97Y: la unión se midió como 2,6x sobre la de WT en el análisis de 1 hora, pero 9,3x en el análisis durante la noche. Para un anticuerpo con una velocidad de disociación lenta, como bevacizumab, el análisis de 1 hora es demasiado corto para que la unión alcance el equilibrio, por lo que los resultados estarán sesgados hacia velocidades de asociación más rápidas. La incubación durante la noche permite que la unión de la mayoría de las variantes alcance el equilibrio, por lo que debe estar cerca de la afinidad de unión real. Las variantes de Bevacizumab en formato IgG también se analizaron mediante BIAcore además de los análisis de 1 hora y durante la noche. Las variantes correspondientes en el formato DVD-Ig se analizaron para determinar la cinética de unión solo por BIAcore.
10.1 Materiales y métodos
10.1.1 Elisa
Para detectar variantes identificadas que se unen al antígeno, se recubrieron placas ELISA (placas Nunc-Immuno MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY) durante la noche a 4°C con VEGF humano no marcado a 1 μg/ml en tampón de bicarbonato de sodio 0,2 M (pH 9.4, Pierce, Rockford, IL). Después, las placas se bloquearon con SuperBlock Blocking Buffer (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos y se lavaron con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,1%). Todas las etapas de lavado se realizaron tres veces. Las variantes de Bevacizumab diluidas en 100 μL de tampón ELISA (PBS que contenía BSA al 1% y Tween 20 al 0,1%) 2 μM se añadieron a los pocillos y se incubaron durante 1 hora o durante la noche a 37°C en un agitador. Cada placa contenía bevacizumab parental como control que se utilizará para normalizar la mejora de la unión de cada variante. Las placas se lavaron y se añadieron a cada pocillo 100 μl de anticuerpo conjugado con HRP anti-kappa humano de cabra (Southern Biotech, Birmingham, AL) diluido a 1:1000 en tampón ELISA. Después de 30 minutos de incubación, las placas se lavaron y los anticuerpos unidos se detectaron mediante la adición del sustrato TMP 1 Componente HRP Microwell (BioFx núm. TMBW-1000-01). La reacción se terminó mediante la adición de 100 μl/pocillo de Reactivo Stop 650 nM para
sustrato TMB Microwell y se midió la absorbancia a 650 nm utilizando un lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal con el soporte lógico GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego) y la multiplicidad de mejora respecto a WT se refirió como CE50 tipo salvaje/CE50 mutante.
10.1.2 BIAcore
La cinética de unión y la afinidad de los anticuerpos para VEGF (residuos 27-191 de VEGF-A humano de núm. de Acceso AAV38412) se determinaron utilizando un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore T200 (BIAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). El tampón de migración del acoplamiento fue tampón de migración HBS-EP+ (HEPES 10 mM, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, P-20 al 0,05%, pH 7,4); el tampón de migración del análisis fue HBS-EP+ con cloruro sódico 300 mM y 0,1 mg/ml de BSA (Sigma A7906). Se inmovilizó primero anti-Fc humano de cabra policlonal (Thermo Scientific núm. prod. 31125) en la superficie del biosensor en acetato de sodio 10 mM, pH 4,5 utilizando reactivos de acoplamiento de amina BIAcore convencionales (N-etil-N'-dimetilaminopropilcarbodiimida, EDC; hidroxisuccinimida, NHS; y etanolamina HCl, pH 8,5). Para el análisis de la cinética de unión se realizó una serie de ciclos, cada ciclo consistió en 1) captura de mAb, 2) inyección de Ag o tampón, 3) fase de disociación y 4) regeneración. Brevemente, los anticuerpos anti-VEGF se capturaron sobre superficies paralelas a una baja velocidad de flujo de 10 μL/min. Los niveles de captura se mantuvieron bajos para minimizar la avidez debida a la naturaleza dimérica de VEGF. No se realizó captura del anticuerpo en la superficie de referencia para que sirviera como referencia primaria y como control negativo. Posteriormente, el VEGF o el tampón solo se inyectaron a todas las células de flujo a una velocidad de flujo de 80 μL/min durante tres minutos para controlar la asociación, seguido de un flujo de tampón de migración del análisis de 20 a 60 minutos a una velocidad de flujo de 80 μL/min. para controlar la disociación. Las inyecciones de VEGF fueron una serie de concentración 1:9 de 3 puntos desde 900 nM a 11,11 nM, las inyecciones de tampón solo sirvieron para referencias secundarias. Al final de cada ciclo, la superficie se regeneró con glicina 10 mM, pH 1,5 a una velocidad de flujo de 60 μL/min en pulsos de 60 y 10 segundos. Los datos de unión se ajustaron al modelo de Langmuir 1:1 con el término de transporte de masa incluido utilizando el soporte lógico de evaluación Biacore T200 para determinar las constantes de unión.
10.2
Resultados
Los resultados para las variantes de afinidad mejoradas se muestran en la Tabla 21. Las variantes cuya unión era similar o menor que la del bevacizumab se identifican en la Tabla 22. La mejora de afinidad se calculó como KD de tipo salvaje/KD mutante y CE50 de tipo salvaje/CE50 mutante para los estudios BIAcore y ELISA, respectivamente. Además de los ya descritos en el Ejemplo 2, se identificaron un total de 22 variantes con afinidad mejorada por ELISA o BIAcore en formato IgG. Curiosamente, no todas las propiedades de las variantes de IgG son transferibles al dominio variable interno de DVD-Ig. Para DVD-Ig unido a SL, 6 variantes (T30N, N31F, N31H, N31W y N31Y en CDR-H1 y S100aT en CDR-H3) mostraron una mejora de al menos 1,5 veces en KD en afinidad global y para DVD-Ig Ig unido a SS, solo 3 (N31F, N31H y N31Y en CDR-H1) tuvieron una mejora de al menos 1,5 veces en la KD. Las sustituciones que producían mejoras en la velocidad de disociación tenían efectos similares tanto en el formato IgG como en el formato DVD-Ig con el conector SL. Las sustituciones que daban como resultado velocidades de disociación reducidas en el formato de IgG también dieron como resultado reducciones en las velocidades de disociación de las correspondientes variantes de DVD-Ig con el conector SS, aunque a una magnitud reducida en comparación con la IgG. Aunque se identificaron 11 variantes con velocidades de asociación más rápidas en IgG, solo la sustitución H97P dio como resultado una tasa de asociación más rápida entre variantes de DVD-Ig con el conector SS, lo que sugiere que la presencia del dominio externo puede cancelar el efecto de mejora de la asociación. Para DVD-Ig unido a SS, el impedimento estérico del dominio interno podría ser incluso mayor que en DVD-Ig unido a SL debido a la corta distancia del péptido que une los dos dominios.
11.
Ejemplo 5: Caracterización de variantes combinatorias de Bevacizumab
11.1. Antecedentes
Se generaron variantes adicionales de CDR de bevacizumab que incorporaban múltiples sustituciones identificadas en el Ejemplo 4. La capacidad de las variantes para bloquear la unión de VEG a los receptores de VEGF, y su capacidad para inhibir la proliferación de células HUVEC inducida por VEGF, se analizaron como se describe a continuación.
11.2 ELISA de competición de VEGF-R1 y VEGF-R2
Las placas de ELISA se recubrieron con VEGF-R1 o VEGF-R2 recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN) a 250 ng/ml, en tampón carbonato-bicarbonato de sodio (pH 9,4, Thermo Scientific, Rockford, IL) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron y se bloquearon con Superblock (Thermo Scientific) durante 30 minutos. El VEGF (4 ng/ml para las placas de VEGF-R1 y 400 ng/ml para las placas de VEGF-R2, respectivamente) y los anticuerpos (en formato IgG) en tampón ELISA (EB) (a partir de 670 nM a diluciones 1:2,5 para VEGF-R1 y de 67 nM a diluciones 1:2
para VEGF-R2) se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, y después se añadieron a la placa lavada. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, después se añadió anti-VEGF de cabra biotinilado (RyD Systems, 0,5 mg/ml) diluido a 1:2.000 en EB después del lavado. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se añadió Estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA 1 mg/ml) diluido a 1:2.000 en EB. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron y la unión se detectó con 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (BioFX, Owings Mills, MD). La reacción se terminó con solución de parada (BioFX) y se midió la absorbancia a 650 nM utilizando un lector de microplacas VERSA max (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los datos se ajustaron mediante regresión no lineal con el soporte lógico GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego, CA) y se refirieron como CE50 de tipo salvaje/CE50 mutante en forma de "multiplicidad de mejora sobre el tipo salvaje".
11.3 Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF
Se utilizaron células endotérmicas de vena umbilical humana (HUVEC) para la medición de la actividad mitogénica de VEGF como se describe en otra parte (Fuh et al., 1998, JBC 273:11197; Fairbrother et al., 1998, Biochemistry 37:17754). En este análisis, se compararon las potencias de la IgG anti-VEGF parental con aquellas que contenían mutaciones combinatorias por su capacidad para inhibir el crecimiento de HUVEC estimulado por VEGF.
Las células HUVEC se cultivaron en una placa de 96 pocillos a 6.000 células por pocillo (Life Technologies, Grant Island, NY) en medio M200RPF (Life Technologies) con FBS al 0,2% y se incubaron durante la noche a 37°C. Se prepararon diluciones seriadas de anticuerpos a partir de 125 μg/ml en 100 μl de M200RPF que contenía FBS al 0,2% y se preincubaron con 100 μl de VEGF a 50 ng/ml durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, las mezclas de VEGF/anticuerpo se añadieron a pocillos individuales después de la eliminación de los medios y las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C. Se añadieron 20 μl de azul de Alamar a cada pocillo y se incubaron durante la noche y la señal resultante se leyó espectrofluorométricamente (excitación a 544 nM, emisión a 590 nM) utilizando un lector de microplacas SPECTRAmax GEMINI SX (Molecular Devices).
11.4 Resultados
Los resultados para las variantes combinatorias designadas C1 a C13 se muestran en la Tabla 24. Las mejoras en la inhibición de la unión de VEGFR1 y VEGFR2 en la proliferación de HUVEC se calcularon como CE50 de tipo salvaje/CE50 variante. Como se muestra en la Tabla 24, la mejora en la capacidad para bloquear la inhibición de la proliferación se correlaciona con la afinidad mejorada hacia VEGF.
Debido a que la mutación H97F sola mejoró la velocidad de disociación en> 6 veces y empeoró la velocidad de asociación en 2,3 veces (Tabla 21), la incorporación de H97F a variantes combinatorias en un formato de IgG tiende a mejorar la velocidad de disociación pero puede no siempre dar como resultado una mejora significativa en la afinidad (comparar C5 vs.C12; C6 vs.C9 en la Tabla 26). Además, la sustitución de H97F tiende a reducir el rendimiento después de la purificación de la proteína A (véase la columna "Rendimiento de expresión" de la Tabla 26). La incorporación de la sustitución T30W empeora aún más el rendimiento. Estos efectos sobre el rendimiento pueden deberse a alteraciones en el plegamiento durante la producción causadas por la mayor cantidad de residuos hidrófobos expuestos a la solución. La disminución del rendimiento no se observó en un formato DVD-Ig (datos no mostrados).
12. Ejemplo 6: Caracterización de la unión de variantes de bevacizumab en formato DVD
Se sabe que el diseño del conector DVD-Ig y su longitud causan un impacto significativo en la actividad del dominio interno. Se sabe que la pérdida de afinidad de los dominios de variables internos hacia sus dianas se debe principalmente a los efectos del impedimento estérico (DiGiammarino et al., 2011, mAbs 3 487-494).
La unión del dominio variable anti-VEGF a VEGF se comparó en diferentes formatos: IgG, y DVD-Ig con conectores SS, o DVD-Ig con conectores SL. En el formato DVD-Ig, el dominio variable anti-VEGF se colocó como el dominio interno. La unión se analizó mediante BIAcore utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 4.
Como era de esperar, la colocación del dominio variable anti-VEGF como dominio variable interno de DVD-Ig con un conector SS dio como resultado la pérdida de afinidad, en este caso 32 veces (la razón IgG/SS KD fue de 0,03) (véase la Tabla 25). El uso de un conector SL todavía dio como resultado una pérdida de afinidad, pero no tan significativa como la pérdida de afinidad con el conector SS -en este caso, la reducción de afinidad fue de 2,7 veces (la razón IgG/SL KD fue de 0,37). La pérdida de afinidad se debió principalmente a una velocidad asociación más lenta, como se observó previamente para DVD-Ig anti-TNFα (DiGiammarino et al., 2011, mAbs 3:487-494).
Para mejorar la afinidad de VEGF en el dominio variable interno, se incorporaron sustituciones de VH de ranibizumab (Lucentis®) a la región variable de cadena pesada anti-VEGF (T28D y N31H en CDR-H1, y H97Y y S100aT en CDR-H3): Las sustituciones de VH de ranibizumab mejoraron la afinidad en 5,4 veces en el formato de
IgG en las condiciones de BIAcore empleadas (Tabla 25). Cuando se introdujeron en el dominio VH interno de DVD-Ig, las sustituciones de ranibizumab mejoraron la unión de VEGF en 2,5 veces para una DVD-Ig con conector SS; sin embargo, las sustituciones no mejoraron en absoluto la unión de DVD-Ig con el conector SL (la razón KD de la variante con respecto a las secuencias de tipo salvaje fue de 0,8). Debido a que el conector SS solo causó un
5 impacto significativo sobre la afinidad, la KD fue solo de 7,86 nM, que es 13 veces más baja que el anticuerpo parental anti-VEGF, incluso con la contribución de las sustituciones de VH de ranibizumab.
A continuación, se incorporaron las variantes combinatorias de la Tabla 24 en formatos DVD-Ig, en el contexto de la versión SL de DVD-Ig DLL4-VEGF como se describe en el Ejemplo 4. La unión de las variantes a VEGF se analizó
10 mediante BIAcore, como también se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran en la Tabla 26. Como en estudios previos de DVD-Ig, no todas las sustituciones de aumento de afinidad en el contexto de una molécula de IgG condujeron a un aumento de la afinidad en el contexto de un dominio interno anti-VEGF de DVD-Ig. De acuerdo con los datos en la Tabla 24, las sustituciones de 15 aminoácidos en ranibizumab que aumentan la afinidad varias veces en el contexto de una IgG no mejoran en absoluto la afinidad del dominio de VEGF interno. Al menos dos de las variantes combinatorias, que tenían las combinaciones C10 y C12, aumentaron la afinidad en aproximadamente 2 veces en el contexto de ese análisis. Es probable que las mejoras de afinidad sean aún mayores, ya que las velocidades de disociación de desactivación para estas variantes se encontraban en los límites de detección para el análisis (marcado con un asterisco (*) en la
20 Tabla 26). Las variantes que incorporaban las combinaciones C5, C6, C5, C9 y C11 también mostraron velocidades de disociación en los límites de detección para el análisis, y es probable que tengan mejores afinidades que las que se muestran en la Tabla 26.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ABBVIE BIOTHERAPEUTICS INC. 5 <120> Anticuerpos anti-VEGF y sus usos
<130> 381493-808WO (126289)
<140> 10 <141>
<150> 61/732.256
<151> 2012-11-30 15 <160> 435
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 20 <211> 123
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
25 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"
<400> 1
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético" 39
<400> 2
<210> 3 5 <211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
10 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
25 <400> 4
<210> 5
<211> 14 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 35 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 5 40
<210> 6
<211> 11 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 10 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 6
15 <210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 8
<211> 9
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 35
<400> 8
<210> 9 40 <211> 231
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"
<400> 9
5 <210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: polipéptido sintético"
<400> 10
5 <210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 12
<211> 14 43
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 12
<210> 13
<211> 15
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<210> 209
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<220>
<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 35
<400> 209
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45 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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20 <220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 215
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<212> PRT
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<220>
25 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 216
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 217
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<221> fuente
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
15 <400> 219
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<220>
<221> fuente 25 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 220
30 <210> 221
<211> 17
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35 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 222
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<220>
10 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
25 <400> 224
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 228
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<212> PRT
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<220>
35 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 229
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<400> 231
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20 <220>
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<210> 233
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<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
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<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 35
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<212> PRT
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<220>
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<400> 234
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
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<400> 235
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<211> 17
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 239
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
45 <400> 242
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente 55 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 243
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 244
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<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 245
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 246
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 247
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 248
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 249
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<210> 251
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 251
<210> 252
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 252
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<211> 14 101
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 253
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<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 254
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<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 255
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<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 256
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 258
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 258
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<212> PRT
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<212> PRT
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<400> 266
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<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
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<220>
<221> fuente 10 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 270
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<211> 17
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20 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 272
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<220>
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<211> 17 5 <212> PRT
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<220>
<221> fuente 10 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 274
15 <210> 275
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 276
<211> 14
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 35
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 277
<210> 278
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 278
<210> 279
<211> 14 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 279
25 <210> 280
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 281
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 281
<210> 282
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 55 <221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 282
<210> 283
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
15 <400> 283
<210> 284
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 25 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 284
<210> 285
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 285
<210> 286
<211> 17
<212> PRT 45 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 286
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
10 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 287
<210> 288
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
25 <400> 288
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<211> 18 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente 35 <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 289
40 <210> 290
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
45 <220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 290
<210> 291
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 292
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 292
<210> 293
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
35 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 293
<210> 294
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 294
<210> 295
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 295
15 <210> 296
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 297
<211> 18
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 297
<210> 298
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
45 <221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 298
<210> 299
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 299
<210> 300
<211> 17 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<400> 300
25 <210> 301
<211> 17
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente <223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético"
<210> 302
<211> 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> fuente
<223>/nota = "Descripción de la secuencia artificial: péptido sintético" 45
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Cualquier aminoácido
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Cualquier aminoácido 55
<400> 302 <210> 303
<211> 17 5 <212> PRT
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<220>
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<400> 433
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<400> 434
5 <210> 435
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<400> 435

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo anti-VEGF, en donde el anticuerpo es biespecífico y la región variable de la cadena pesada comprende:
    (a)
    las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3;
    (b)
    las sustituciones Y en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3; o
    (c)
    las sustituciones G en Kabat 28 e Y en Kabat 31 en CDR-H1, y A en Kabat 100a en CDR-H3;
    en donde, además de dichas sustituciones, el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
  2. 2. Un anticuerpo anti-VEGF, en donde el anticuerpo es una IgG y la región variable de la cadena pesada comprende Y en Kabat 31 en CDR-H1 y:
    (a)
    las sustituciones G en Kabat 28 y N en Kabat 30 en CDR-H1, y F en Kabat 97 y A en Kabat 100a en CDR-H3;
    (b)
    las sustituciones G en Kabat 28 en CDR-H1, y F en Kabat 97 y A en Kabat 100a en CDR-H3;
    (c)
    las sustituciones G en Kabat 28 en CDR-H1, y F en Kabat 97 y Q en Kabat 100a en CDR-H3;
    (d)
    las sustituciones G en Kabat 28 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3;
    (e)
    las sustituciones Y en Kabat 28 en CDR-H1, y Q en Kabat 100a en CDR-H3;
    (f)
    las sustituciones Y en Kabat 28 en CDR-H1, y F en Kabat 97 y Q en Kabat 100a en CDR-H3;
    (g)
    las sustituciones G en Kabat 28 en CDR-H1, y A en Kabat 100a en CDR-H3; o
    (h)
    las sustituciones G en Kabat 28 en CDR-H1, y G en Kabat 100a en CDR-H3;
    en donde además de dichas sustituciones, el anticuerpo tiene una región variable de cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 2.
  3. 3.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 1 o 2, que es un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo humanizado, respectivamente.
  4. 4.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 1 o 2, que incluye una o más mutaciones en la región Fc con respecto a la secuencia de tipo salvaje correspondiente que aumenta la actividad ADCC en comparación con la secuencia de tipo salvaje correspondiente.
  5. 5.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 1 o 2, que no está fucosilado.
  6. 6.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 1 o 2, que incluye una o más mutaciones en la región Fc con respecto a la secuencia de tipo salvaje correspondiente que aumenta la unión a FcγR en comparación con la secuencia de tipo salvaje correspondiente.
  7. 7.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 2, que es de la clase IgG y que incluye una o más mutaciones en la región Fc con respecto a la secuencia de tipo salvaje correspondiente que aumenta la unión a FcRn en comparación con la secuencia de tipo salvaje correspondiente, en donde las una o más mutaciones incluyen mutaciones de la región constante de la cadena pesada en las posiciones 250 en CH2 y 428 en CH3 que aumentan la unión a FcRn.
  8. 8.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo IgG es una IgG1 o una IgG2.
  9. 9.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo biespecífico es una inmunoglobulina de doble dominio variable (Ig-DVD) en la que dichas regiones variables de cadena pesada anti-VEGF y de cadena ligera anti-VEGF forman juntas una porción de unión anti-VEGF y que comprende adicionalmente una segunda porción de unión, comprendiendo dicha segunda porción de unión una segunda región variable de cadena pesada y una segunda región variable de cadena ligera que se unen juntas a una segunda diana, adicionalmente en donde dicha segunda porción de unión se une a DLL4 opcionalmente.
  10. 10.
    10. El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 9, en donde la porción de unión anti-VEGF es un dominio Fv interno de la Ig-DVD.
  11. 11.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 9, en donde la porción de unión anti-VEGF es un dominio Fv externo de la Ig-DVD.
  12. 12.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 9, en donde la cadena ligera anti-VEGF y la segunda cadena ligera están conectadas a través de un conector de aminoácidos, en donde el conector de aminoácidos es TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 420), QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID NO: 422) o GGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 425).
  13. 13.
    El anticuerpo anti-VEGF de la reivindicación 9, en donde la cadena pesada anti-VEGF y la segunda cadena pesada están conectadas a través de un conector de aminoácidos, en donde el conector de aminoácidos es ASTKGP (SEQ ID NO: 427) o GGGGSG (SEQ ID NO: 430).
  14. 14.
    Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-VEGF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  15. 15.
    El anticuerpo anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de un cáncer en un paciente humano, opcionalmente en donde el cáncer es carcinoma metastásico del colon, carcinoma metastásico del recto, cáncer de pulmón de células no pequeñas, no escamoso, o cáncer de mama metastásico negativo para HER2, opcionalmente adicionalmente en donde el cáncer es cáncer de pulmón de células pequeñas, no es escamoso que no es resecable, localmente avanzado, recurrente o metastásico.
  16. 16.
    El anticuerpo anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de una afección retiniana en un paciente humano, opcionalmente en donde la afección retiniana es la degeneración macular relacionada con la edad, edema después de la oclusión de la vena retiniana, o edema macular diabético, opcionalmente adicionalmente en donde la degeneración macular relacionada con la edad es la degeneración macular húmeda relacionada con la edad o la degeneración macular seca relacionada con la edad.
  17. 17.
    El anticuerpo anti-VEGF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de un trastorno inmunológico en un paciente humano, opcionalmente en donde el trastorno inmunológico es artritis reumatoide o enfermedad de Grave.
    170 171 172
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