ES2647662T3 - Vacunas de ADN infeccioso frente al virus chikungunya - Google Patents
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Abstract
Un vector de ADN que comprende: (a) un ADN que codifica una molécula de ARN infecciosa que inicia la producción en células de una vacuna de virus atenuado vivo VCHIK; y (b) un promotor de la ARN polimerasa eucariota; en el que: (i) el ADN que codifica una molécula de ARN infecciosa está unido operativamente al promotor de la ARN polimerasa; y (ii) la molécula de ARN infecciosa codifica un virus chikungunya (VCHIK).
Description
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ARN y se llevó a cabo la transcripción inversa PCR (RT-PCR). Los fragmentos de RT-PCR se clonaron y secuenciaron.
Los fragmentos de ADNc se secuenciaron y se compararon con las secuencias de varias cepas virulentas del VCHIK procedentes del GenBank, así como con la secuencia de 181/25 original. El análisis reveló que varios clones secuenciados contenían mutaciones de “reversión” al virus virulento. El resultado mostrado en la Figura 12 es que en la región secuenciada uno de cada siete clones tiene la misma secuencia que la vacuna IND de 181/25, mientras que otros tenían sustituciones de nucleótidos presentes en los aislados virulentos. Solo el clon 3.5_40 de entre siete tiene un resto isoleucina (I) en el aminoácido 301, como en 181/25, mientras que los otros seis clones tienen el resto treonina (T), que está presente en los aislados virulentos del VCHIK de tipo silvestre y en el aislado VR1 del paciente enfermo vacunado con 181/25. También se detectó heterogeneidad en la posición 314.
Las vacunas descritas en el presente documento pueden proporcionar mayores ventajas de seguridad y regulación Debido a que el mismo i-DNA™ clonalmente purificado utilizarse para la producción de distintos lotes de vacuna, estas vacunas tendrán una uniformidad y consistencia entre lotes mayores, en comparación con las vacunas actuales, las cuales pueden acumular mutaciones durante los pases de virus.
Ejemplo 4. Vacunación in vivo utilizando la vacuna de i-DNA™. Como alternativa, el i-DNA™ del VCHIK (Figuras 38) puede administrarse de forma directa al receptor de la vacuna en una formulación farmacéuticamente aceptable, por ejemplo por vía intramuscular o intravenosa, como se ilustra en la Figura 2. La administración directa de i-DNA™ al receptor de la vacuna inicia la producción in vivo de la vacuna de VCHIK en los tejidos del paciente y proporciona una vacunación satisfactoria frente a chikungunya. Una ventaja adicional de la inmunización con i-DNA™ frente a la vacuna de virus atenuado vivo convencional radica en las características inmunogénicas del propio i-DNA™. El ADN producido con bacterias, incluyendo el i-DNA™, contiene motivos CpG no metilados. Estos motivos activan la ruta de señalización del receptor de tipo toll (TLR) lo que da como resultado una inducción de la inmunidad innata y la producción de citocinas proinflamatorias y de interferones de tipo 1 (IFN 1), poco después de la inyección del ADN.
La señalización a través de receptores induce una respuesta de citocinas robusta a partir de las CD mieloides y la producción de IFN 1 a partir de las CD plasmocitoides, así como estimula la presentación cruzada de antígenos exógenos y respuestas de T CTL. Por lo tanto, la inmunización con i-DNA™ conduce a la activación y maduración de las CD incluso antes de que se liberen partículas de virus. Tales CD preactivadas potencian respuestas inmunitarias específicas inducidas por el virus atenuado vivos sintetizados recientemente.
Ejemplo 5. Vacunas de i-DNA™ con codones desoptimizados. Una vacuna, i-DNAC, contiene la copia de ADNc de longitud completa del genoma de ARN de la vacuna IND de 181/25, pero los codones traduccionales dentro del gen de la cápside se desoptimizan a través de codones seleccionados. Otra vacuna, i-DNAE2-E1, también contiene la copia de ADNc de longitud completa del genoma de ARN de la vacuna IND de 181/25, pero los codones traduccionales dentro de la región génica E2-E1 se desoptimizan de forma similar. Los genes E1, E2 y C se seleccionan a base de la inmunogenicidad de estos antígenos en ratones y del actual conocimiento sobre las respuestas inmunitarias adaptativas después de la infección por VCHIK en seres humanos. Los codones desoptimizados cambian solo la secuencia de nucleótidos y no dan lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos. Estas mutaciones silenciosas aumentan la estabilidad genética y conservan el fenotipo atenuado, y se diseñan de forma que son necesarias al menos dos mutaciones genéticas independientes para cada codón para revertir a un codón de VCHIK de tipo silvestre.
Se sintetiza de forma bioquímica (GenScript, Piscataway, NJ) el fragmento sintético de 181/25 que abarca 3.771 pares de bases de la región 7567-11313 de los genes estructurales (C-E1-E2) de 181/25. Las construcciones recombinantes de i-DNA, i-DNAC e i-DNAE2-E1 de 181/25 se transfectan in vitro en células CHO-K1. Se recogen muestras de virus atenuado vivo del medio de cultivo y de células a intervalos de 6 horas durante 96 horas. Se evalúan in vitro los virus VCHIK vivos producidos a través de la transfección de las células y las características fenotípicas de estos virus recuperados, examinando parámetros cinéticos de replicación en cultivo celular, las propiedades antigénicas, la estabilidad genética y heterogeneidad molecular mediante los siguientes ensayos in vitro: (1) ensayo y fenotipo de placa; (2) curvas de crecimiento de virus; (3) transferencia de western; (4) inmunofluorescencia; (5) al menos 10 pases en E. coli; (6) transcripción inversa PCR y (7) secuenciación de ADN de la región estructural completa de al menos 120 aislados de placa obtenidos de cada virus, incluyendo el control 181/25 (para evaluar la heterogeneidad de la población y la estabilidad genética en células de mamífero). La capacidad de los antígenos de la vacuna de VCHIK nueva de reaccionar con antisueros humanos procedentes de casos clínicos de VCHIK recientes se evalúa a través de ELISA.
Ejemplo 6. Análisis de la vacuna de i-DNA™ en un modelo animal. La producción de i-DNA™ plasmídico a partir de
E. coli se realiza utilizando métodos establecidos para la producción de un banco de células bacterianas, de fermentación, recogida, lisis de la biomasa y de purificación de ADN aguas abajo. Este procedimiento da como resultado un producto de ADN estéril con aproximadamente un 95 % de ADN superenrollado y una proporción de A260/A280 de aproximadamente 1,9, así como endotoxinas, ARN, ADN genómico e impurezas de proteína residuales mínimos. Los controles de calidad incluyen (1) análisis de endotoxinas, (2) gel de agarosa, (3) SDS-PAGE; (4) análisis con enzimas de restricción y (5) secuenciación de ADN. Se inyectan por vía intramuscular (i.m.)
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