ES2647070T3 - Vacunas para tuberculosis que comprenden antígenos expresados durante la fase de infección latente - Google Patents

Abstract

Una vacuna que comprende un polipéptido de fusión que comprende: i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, o ii) uno o más fragmentos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 que comprende un epítopo de linfocitos T o un epítopo de linfocitos B, o iii) polipéptidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con i) o ii) que comprenden un epítopo de linfocitos T o linfocitos B, y en la que el polipéptido de fusión se construye a partir de una combinación de uno o más antígenos inducidos durante la inanición con uno o más antígenos de M. tuberculosis.

Description

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(continuación)

Antígeno inducido durante la inanición

SEQ ID NO de ADN SEQ ID NO de aa

Rv0188

19 20

Rv3290c

21 22

Rv3289c

23 24

Rv2034

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Rv2169c

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Rv0116c

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Rv1284

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Rv1954c

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41 42

Rv2517c

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Rv3288c

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Rv3675

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Rv2050

57 58

Rv3287c

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Rv2557

61 62

Rv0122

63 64

Rv2497c

65 66

Rv1250

67 68

Rv1552

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Rv2526

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Rv1809

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Rv0918

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Rv0516c

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(continuación)

Polipéptido

Secuencia de aminoácidos

Ag85A

SRGPLP VEYLQVPSPS MGRDIKVQFQ SGGANSPALY LLDGLRAQDD FSGWDINTPA FEWYDQSGLS VVMPVGGQSS FYSDWYQPAC GKAGCQTYKW ETFLTSELPG WLQANRHVKP TGSAVVGLSM AASSALTLAI YHPQQFVYAG AMSGLLDPSQ AMGPTLIGLA MGDAGGYKAS DMWGPKEDPA WQRNDPLLNV GKLIANNTRV WVYCGNGKPS DLGGNNLPAK FLEGFVRTSN IKFQDAYNAG GGHNGVFDFP DSGTHSWEYW GAQLNAMKPD LQRALGATPN TGPAPQGA

Ag85B

SRPGLPVEY LQVPSPSMGR DIKVQFQSGG NNSPAVYLLD GLRAQDDYNG WDINTPAFEW YYQSGLSIVM PVGGQSSFYS DWYSPACGKA GCQTYKWETF LTSELPQWLS ANRAVKPTGS AAIGLSMAGS SAMILAAYHP QQFIYAGSLS ALLDPSQGMG PSLIGLAMGD AGGYKAADMW GPSSDPAWER NDPTQQIPKL VANNTRLWVY CGNGTPNELG GANIPAEFLE NFVRSSNLKF QDAYNAAGGH NAVFNFPPNG THSWEYWGAQ LNAMKGDLQS SLGAG

TB10.4

MSQIMYNYPA MLGHAGDMAG YAGTLQSLGA EIAVEQAALQ SAWQGDTGIT YQAWQAQWNQ AMEDLVRAYH AMSSTHEANT MAMMARDTAE AAKWGG

ORF2c

MIVGAAGGMP PMAPLAPLLP AAADIGLHII VTCQMSQAYK ATMDKFVGAA FGSGAPTMFL SGEKQEFPSS EFKVKRRPPG QAFLVSPDGK VIQAPYIEPP EEVFAAPPSA G

Rv1036

LIPGRMVLNW EDGLNALVAE GIEAIVFRTL GDQCWLWESL LPDEVRRLPE ELARVDALLD DPAFFAPFVP FFDPRRGRPS TPMEVYLQLM FVKFRYRLGY ESLCREVADS IT

Rv0285

MTLRVVPEGL AAASAAVEAL TARLAAAHAS AAPVITAVVP PAADPVSLQT AAGFSAQGVE HAVVTAEGVE ELGRAGVGVG ESGASYLAGD AAAAATYGVV GG

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(o derivados de nucleótidos).

El término “restrictivo” cuando se utiliza en conjunto con las condiciones de hibridación es como se define en el campo, es decir la hibridación se realiza a una temperatura no mayor de 15-20°C bajo el punto de fusión Tm, véase Sambrook y colaboradores, 1989, páginas 11.45-11.49. Preferiblemente, las condiciones son “sumamente restrictivas”, es decir 5-10°C bajo el punto de fusión Tm.

Identidad de secuencias

El término “identidad de secuencias” indica una medida cuantitativa del grado de homología entre dos secuencias de aminoácidos de una longitud sustancialmente igual o entre dos secuencias de ácido nucleico de una longitud sustancialmente igual. Las dos secuencias a ser comparadas deben alinearse para el mejor ajuste posible con la inserción de espacios o alternativamente el truncamiento en los extremos de las secuencias de proteínas. La imagen8

identidad de secuencias se puede calcular como en donde Ndif es el número total de residuos no

idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencias de 75% con la secuencia AATCAATC (Ndif=2 y Nref=8). Un espacio se cuenta como falta de identidad del(los) residuo(s) específico(s), es decir la secuencia de ADN AGTGTC tendrá una identidad de secuencias de 75% con la secuencia de ADN AGTCAGTC (Ndif=2 y Nref=8). La identidad de secuencias puede calcularse alternativamente por medio del programa BLAST por ejemplo el programa BLASTP (Pearson W.R y D.J. Lipman (1988))(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST). En una modalidad de la invención, el alineamiento se realiza con el método de alineamiento de secuencias ClustalW con parámetros por omisión como es descrito por Thompson J. y colaboradores 1994, disponible en http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/.

Un porcentaje mínimo preferido de identidad de secuencias es al menos 80%, tal como al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% y al menos 99.5%. Preferiblemente, los números de sustituciones, inserciones, adiciones

o supresiones de uno o más residuos de aminoácidos en el polipéptido de fusión están limitados, es decir no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 inserciones, no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 adiciones y no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 supresiones en comparación con las unidades de polipéptidos inmunógenos en base a los polipéptidos derivados de M. tuberculosis.

Porción inmunógena

El polipéptido de la invención comprende una porción inmunógena, tal como un epítopo para una célula B o una célula T. La porción inmunógena de un polipéptido inmunógeno es la parte del polipéptido, la cual produce una respuesta inmune en un animal o un ser humano y/o en una muestra biológica determinada por cualquiera de los ensayos biológicos descritos en este documento. La porción inmunógena de un polipéptido puede ser un epítopo de células T o un epítopo de células B. Las porciones inmunógenas pueden estar relacionadas con una o algunas partes relativamente pequeñas del polipéptido, pueden estar esparcidas por toda la secuencia del polipéptido o pueden estar situadas en partes específicas del polipéptido. Para algunos polipéptidos, se ha demostrado aún que los epítopos están esparcidos por todo el polipéptido cubriendo la secuencia completa (Ravn y colaboradores 1999).

A fin de identificar los epítopos de células T relevantes que son reconocidos durante una respuesta inmune, es posible utilizar un método de “fuerza bruta”: puesto que los epítopos de células T son lineales, los mutantes de supresión del polipéptido, si son construidos sistemáticamente, revelarán qué regiones del polipéptido son esenciales en el reconocimiento inmune, por ejemplo al sujetar estos mutantes de supresión por ejemplo al ensayo de IFN-(descrito en este documento). Otro método utiliza oligopéptidos solapantes para la detección de los epítopos de MHC clase II, preferiblemente sintéticos, que tienen una longitud de por ejemplo 20 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Estos péptidos pueden someterse a prueba en ensayos biológicos (por ejemplo en el ensayo de IFN-(descrito en este documento) y algunos de éstos tendrán una respuesta positiva (y por lo cual serán inmunógenos) como es evidenciado por la presencia de un epítopo de célula T en el péptido. Para la detección de los epítopos de MHC clase I, es posible predecir los péptidos que se enlazarán (Stryhn y colaboradores 1996) y por lo tanto producirán sintéticamente estos péptidos y someterlos a prueba en ensayos biológicos relevantes por ejemplo el ensayo de IFN-(como es descrito en este documento). Los péptidos que tienen preferiblemente una longitud de por ejemplo 8 a 11 residuos de aminoácidos derivados del polipéptido. Los epítopos de células B se pueden determinar por medio del análisis del reconocimiento de células B para péptidos solapantes que cubren el polipéptido de interés como es descrito por ejemplo en Harboe y colaboradores 1998.

Las porciones inmunógenas de polipéptidos pueden ser reconocidas por una parte amplia (alta frecuencia) o por una parte menor (baja frecuencia) de la población humana genéticamente heterogénica. Además, algunas porciones inmunógenas inducen altas respuestas inmunológicas (dominantes), mientras que otras inducen respuestas más bajas, pero aún significativas (subdominantes). La alta frecuencia >< baja frecuencia puede relacionarse con la porción inmunógena que se enlaza a las moléculas de MHC ampliamente distribuidas (tipo HLA) o aún por las múltiples moléculas de MHC (Kilgus y colaboradores 1991, Sinigaglia y colaboradores 1988).

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inoculaciones subsecuentes u otras administraciones.

La forma de aplicación se puede variar ampliamente. Cualquiera de los métodos convencionales para la administración de una vacuna son aplicables. Éstos incluyen la aplicación oral, nasal o a la mucosa en ya sea una forma sólida que contiene los ingredientes activos (tal como una píldora, supositorio o cápsula) o en una dispersión fisiológicamente aceptable, tal como una pulverización, polvo o líquido o por vía parenteral, por medio de una inyección, por ejemplo, aplicada por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular o transdérmica. La dosificación de la vacuna dependerá de la ruta de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona que es vacunada y, en un grado menor, el tamaño de la persona que es vacunada. Actualmente, la mayoría de vacunas son administradas por vía intramuscular por medio de una inyección con aguja y esto es probablemente para continuar como la ruta estándar. Sin embargo, se han desarrollado formulaciones de vacuna las cuales inducen una inmunidad mucosa, típicamente por medio del suministro oral o nasal. Uno de los sistemas de suministro más ampliamente estudiados para la inducción de la inmunidad mucosa contiene la toxina del cólera (CT, por sus siglas en inglés) o su subunidad B. Esta proteína mejora las respuestas inmunes de las mucosas e induce la producción de IgA cuando se administra en formulaciones de vacunas. Una ventaja es la facilidad de suministro para vacunas orales o nasales. Las toxinas modificadas de otras especies microbianas, las cuales tienen toxicidad reducida pero una capacidad inmunoestimuladora retenida, tal como la toxina modificada lábil al calor de bacterias Gram-negativas

o enterotoxinas de estafilococos también se pueden utilizar para generar un efecto similar. Estas moléculas son particularmente adecuadas para la administración a las mucosas.

Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, por medio de la inyección, por ejemplo, ya sea por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, las sustancias aglutinantes y portadores tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles y triglicéridos; estos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0.5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen ventajosamente 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.

En muchos casos, será necesario tener múltiples administraciones de la vacuna. Especialmente, las vacunas se pueden administrar para prevenir una infección con micobacterias virulentas y/o para tratar una infección micobacteriana establecida o para reforzar a una persona vacunada previamente con la BCG. Cuando se administra para prevenir una infección, la vacuna se proporciona profilácticamente, antes de que estén presentes los signos clínicos o síntomas definitivos de una infección.

Debido a la variación genética, diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunes de resistencia variante al mismo polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender varios polipéptidos de fusión y/o polipéptidos diferentes a fin de incrementar la respuesta inmune. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos de fusión o polipéptidos inducidos durante la inanición o porciones inmonógenas de los mismos, donde todos los antígenos inducidos durante la inanición o polipéptidos de fusión son como se definió anteriormente o algunos pero no todos los polipéptidos pueden derivarse de micobacterias virulentas. En el último ejemplo, los polipéptidos que no satisfacen necesariamente los criterios expuestos anteriormente para los polipéptidos de fusión pueden actuar ya sea debido a su inmunogenicidad propia o pueden actuar solamente como adyuvantes.

La vacuna puede comprender 1-20, tal como 2-20 o aún 3-20 diferentes polipéptidos o polipéptidos de fusión, tal como 3-10 diferentes polipéptidos o polipéptidos de fusión.

La descripción también pertenece a un método para inmunizar un animal, inclusive un ser humano, contra la TB causada por micobacterias virulentas, que comprende administrar al animal el polipéptido de fusión de la invención o una composición de vacuna de la invención como se describió anteriormente o una vacuna viva descrita anteriormente. En una modalidad actualmente preferida, el animal o humano es un individuo inmune como se describió anteriormente.

La descripción también pertenece a un método para producir una composición inmunógena de acuerdo con la invención, el método comprende preparar, sintetizar o aislar un polipéptido de fusión de acuerdo con la invención y solubilizar o dispersar el polipéptido de fusión en un medio para una vacuna y agregar opcionalmente otros antígenos de M. tuberculosis y/o un portador, vehículo y/o sustancia adyuvante.

Los fragmentos de ácido nucleico de la invención se pueden utilizar para efectuar la expresión in vivo de polipéptidos inmunógenos, es decir los fragmentos de ácido nucleico se pueden utilizar en las comúnmente llamadas vacunas de ADN como se revisa en Ulmer y colaboradores 1993, el cual se incorpora a manera de referencia.

En la construcción y preparación de ADN plásmido que codifica un polipéptido de fusión a utilizarse definido por la vacunación de ADN se puede utilizar una cepa hospedante tal como E. coli. El ADN plásmido entonces se puede

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Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo.

Figuras 6: Inmunogenicidad de Hybrid56, HyVac21 e HyVac28 Los grupos de ratones F1(Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con 5 microgramos de Ag85b-ESAT6-Rv2660c (H56), Ag85a-TB10.4-Rv2660c (H21) o Ag85b-TB10.4-Rv2660c (H28) en DDA/TDB (LipoVac). Una semana después de la vacunación final, las PBMCs se analizaron por medio del ensayo ELISA por la liberación de IFN-gamma después de la estimulación con 1 microgramo/ml de la proteína de fusión utilizada para la inmunización, Ag85b, TB10.4 o Rv2660c (figuras 6A-6C). Tres semanas después de la vacunación final con Ag85b-ESAT6-Rv2660c, las células de bazo FIG. 6D se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml de Ag85B, ESAT6 o Rv2660c recombinante y las PBMCs FIG. 6E se analizaron por las respuestas proliferativas contra los mismos antígenos a 1 microgramo/ml.

Figuras 7: Protección fuerte contra la infección con M. tuberculosis después de la inmunización con Hybrid56 FIG. 7A: Los grupos de ratones Balb/c-C57BL/6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Ag85B-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56) y la eficacia de protección se evaluó por medio de conteos de CFU en los pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 2, 6, 12 y 24 semanas después de la infección por aerosol. FIG. 7B: Los grupos de ratones B6 se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con ya sea Ag85b-ESAT6 (Hybrid1) o Ag85b-ESAT6-Rv2031c (Hybrid32) y la eficacia de protección se evaluó por medio de conteos de CFU en los pulmones y se comparó con ratones no inmunizados e inmunizados con la BCG 7, 13, 24, 35 y 44 semanas después de la infección por aerosol. Los resultados son expresados como unidades formadoras de colonias log10 (CFU) en los pulmones y son resultados promedio de 6 ratones por grupo experimental. Como control positivo, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo.

Figura 8: Curvas de supervivencia Kaplan-Meier (n = 7). La inmunización de cobayos con la proteína de fusión Ag85b-ESAT6-Rv2660c prolonga el tiempo de supervivencia al nivel de los animales inmunizados con la BCG después del reto con M. tuberculosis en aerosol en dosis bajas.

Figura 9: El antígeno Hybrid56 (Ag85b-ESAT6-Rv2660c) indujo inmunogenicidad y protección. Los ratones F1(Balb/cxC57BL/6) se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Ag85b-ESAT6-Rv2660c (Hybrid56) en DDA/MPL. Diez semanas después de la vacunación final, las células del bazo se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 ug/ml de Ag85B, ESAT6 o Rv2660c (como se observó anteriormente en la figura 9A). La eficacia de protección se evaluó por la reducción en conteos de CFU en los pulmones en comparación con ratones inmunizados con un control adyuvante diez semanas después de la vacunación. Los resultados se expresan como log10 de unidades formadoras de colonias (CFU) en los pulmones de 12 ratones por grupo experimental (figura 9B).

Ejemplos

Materiales y métodos

Animales

Los ratones hembra C57BL/6xBalb/C F1 o C57BL/6 libres de agentes patógenos específicos, de 8 a 16 semanas de edad, obtenidos de Bomholtegaard, Dinamarca se utilizaron para el análisis de respuestas inmunes y estudios de protección evaluados por el análisis de CFU. Los estudios de infección se realizaron en las instalaciones BSL3 en Statens Serum Institute. Los animales se alojaron en jaulas aisladoras y se alimentaron con agua y alimento estéril ad libitum. Se permitió a todos los animales un período de descanso de una semana antes del inicio de los experimentos.

Preparaciones de Antígenos Recombinantes

El antígeno recombinante Ag85B-ESAT6 (Hybrid1) se produjo como se describió previamente (Olsen, van Pinxteren y colaboradores, 2001). En resumen, esta proteína etiquetada con His se expresó en Escherichia coli XL-1 Blue y se purificó en una columna TalonMR seguido por la cromatografía de intercambio iónico de proteínas utilizando una columna HiTrap QMR (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La muestra se dializó contra amortiguador de HEPES 25 mM (pH 8.0)-NaCl 0.15 M-glicerol al 10%-Tween 20 al 0.01% antes de la dilución y el almacenamiento.

El antígeno Rv2660c recombinante se produjo por medio del mismo procedimiento descrito previamente para otra proteína micobacteriana pequeña (Skjot, Oettinger y colaboradores, 2000). En resumen, el gen de Rv2660c de longitud completa se amplificó por medio de la PCR de ADN geonómico de M. tuberculosis y se subclonó en el plásmido de expresión pDest17. La proteína recombinante se produjo en Escherichia coli B121 blue y se purificó por medio de la cromatografía de afinidad con iones metálicos en una columna de Ni+ en esencia como se describiera previamente (Theisen, Vuust y colaboradores, 1995) pero con amortiguadores de fosfato que contenían urea 8 M, la

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cual se retiró después de la purificación.

Las proteínas de fusión Hybrid56 (Ag85B-ESAT6-Rv2660c), Hybrid32 (Ag85b-ESAT6-Rv2031c), HyVac21 (Ag85aTB10.4-Rv2660c) y HyVac28 (Ag85b-TB10.4-Rv2660c) se clonaron en el vector de expresión pDest17 (Invitrogen) por medio de la recombinación de un sitio específico de acuerdo con el fabricante.

Las proteínas de fusión se expresaron en la cepa de E.coli BL21 después de la inducción por medio de IPTG. Las cuatro proteínas de fusión recombinantes se recolectaron como cuerpos de inclusión después de la alteración de las células por detergente suave (B-PER, Sigma) y sonicación. Los cuerpos de inclusión lavados se disolvieron en NaOAc 20 mM + urea 8 M a pH 4.9 y se pasaron sobre una columna Q sepharoseMR para capturar la endotoxina. La práctica recolectada se diluyó en amortiguador de bis-tris + urea 8 M pH 6.5 y el pH se ajustó pH 6.5. La proteína entonces se pasó sobre CM sepharoseMR para capturar las impurezas y luego se capturó en una columna Q sepharoseMR. La columna se lavó con amortiguador de bis-tris pH 6.5 + urea 3 M. Las proteínas enlazadas se eluyeron con NaCl. La proteína entonces se intercambió con amortiguador en una columna af SephadexMR a tris-HCl 25 mM pH 8 y glicerol al 10%.

Reconocimiento humano -serología

Todos los sueros se empobrecieron en anticuerpos de reacción cruzada antes del uso en un ensayo ELISA por la adición de 20 l de extracto de E. coli (S3761, Promega, Madison, WI) a 200 l de muestra de suero seguido por la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente mientras se mezclaba. Después de la centrifugación (10.000 x g, 10 minutos), se agregó azida de sodio 0.05% al sobrenadante. El ensayo ELISA se realizó como sigue, las placas de microtítulo MaxisorpMR de 96 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron durante toda la noche a 4°C con un antígeno a 1.0 g/ml (100 l por pocillo) en amortiguador de carbonato-bicarbonato (pH 9.6). Las placas entonces se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween 20MR al 0.05% (PBS-T). Las muestras de suero se diluyeron 1:100 en PBS que contenía Tween 20MR al 0.2% y albúmina de suero bovino al 1.0% (peso/volumen) (amortiguador de dilución) y se agregó 0.1 ml de suero diluido a los pocillos por duplicado y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después de los lavados 3 x con PBS-T, las placas se incubaron durante una hora con 100 ul de Ig antihumano de conejo conjugada con Peroxidasa (P212, DAKO, Glostrup, Dinamarca) diluida 1:8000 en amortiguador de dilución. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-T y se incubaron con substrato de Tetrametilbenzidina (TMB plus, Kem-En-Tec, ***, Dinamarca) durante 30 minutos y el desarrollo se detuvo por la adición de H2SO4 1 M. Entonces se midió la densidad óptica a 405 nm (OD405).

Preparación de vacunas y procedimiento de inmunización

Los ratones se inmunizaron con 5 micro g de vacuna recombinante (ya sea Rv2659c, Rv2660c, Hybrid56, HyVac21, HyVac28 o Hybrid32) suministrados en 25 g de lípido A de monofosforilo (MPL, Corixa, WA, EUA) emulsionado en bromuro de dioctadecilamonio (DDA, 250 g/dosis, Eastman Kodak, Inc., Rochester, N.Y.) en un volumen total de 200 l, como se describió recientemente (Olsen, van Pinxteren y colaboradores, 2001). Las vacunas (0.2 ml/ratón) se inyectaron tres veces por vía subcutánea (s.c.) en la espalda con intervalos de dos semanas. Una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5 x 104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad; no se administraron inyecciones de refuerzo. La inmunidad previa al reto se evaluó típicamente con linfocitos sanguíneos 5 y 7 semanas después de la primera vacunación y esplenocitos 7 semanas después de la primera vacunación.

Infecciones experimentales y enumeración bacteriana en órganos

Para evaluar el nivel de protección, los ratones se sometieron a un reto 10 semanas después de la primera inmunización ya sea por la ruta del aerosol en un sistema de exposición por inhalación Glas-Col, calibrado para suministrar aproximadamente 100 CFU de M. tuberculosis Erdman por pulmón. Los ratones se sacrificaron 2, 6, 12 o 24 semanas después (Hybrid56) o 7, 13, 24, 35 o 44 semanas después (Hybrid32) y los pulmones y los bazos se retiraron para la enumeración bacteriana. Los órganos se homogeneizaron por separado en solución salina estéril y las diluciones en serie se colocaron en agar Middlebrook 7H11MR complementado con 2 mg de hidrazida de ácido 2tiofen-carboxílico por ml para inhibir selectivamente el crecimiento de BCG residual en los órganos de prueba. Las colonias se contaron después de 2 a 3 semanas de incubación a 37°C.

Cultivos de Linfocitos

Los órganos se homogeneizaron por medio de maceración a través de un tamiz de acero inoxidable de malla fina en RPMI completo (GIBCO, Grand Island, NY, que incluía glutamina 2 mM, 100 U/ml de cada uno de penicilina 6potásica y sulfato de estreptomicina, FCS al 10% y 2-ME 50 mM). Los linfocitos sanguíneos se purificaron en un gradiente de densidad LympholyteMR (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá). Las células se acumularon de cinco ratones en cada grupo y se cultivaron por triplicado en pocillos de microtítulo de fondo redondo (96 pocillos; Nunc, Roskilde, Dinamarca) que contenían 2x105 células en un volumen de 200 microlitros de medio RPMI 1640 complementado con 2-mercaptoetanol 5x10-5 M, glutamina 1 mM, penicilina-estreptomicina 5% (vol/vol) suero bovino fetal. Los antígenos micobacterianos se utilizaron en concentraciones que variaban de 5 a 0.2 mg/ml. Los cultivos se incubaron a 37°C en CO2 al 10% durante 3 días, antes de la remoción de 100 l de sobrenadante para interferón

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gamma (determinación de IFN-gamma por medio de un ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) como se describe a continuación.

Ensayo Inmunoabsorbente Unido a Enzimas (ELISA) para IFN-gamma

Un método de ELISA de doble emparedado se utilizó para cuantificar los niveles de IFN-gamma en titulaciones por duplicado de sobrenadantes de cultivo, utilizando un equipo comercial para el ensayo de IFN-gamma, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, AB. Suecia). Las concentraciones de IFN-gamma en las muestras se calcularon utilizando una curva estándar generada a partir de IFN-gamma recombinante (Life Technologies) y los resultados se expresan en pg/ml. La diferencia entre los pozos por duplicado fue consistentemente menor que 10% del promedio.

Infección experimental y evaluación de eficacia de las vacunas en el modelo de cobayo

A los cobayos hembra Hartley no consanguíneos adquiridos de Charles River Laboratories (North Wilmington, Mass.) se les administró ya sea la BCG por vía intradérmica en una dosis de 103 CFU una vez o 20 g de ya sea Ag85b-ESAT6 o Ag85b-ESAT6-Rv2660c emulsionado en DDA/MPL tres veces con un período de descanso de 3 semanas entre las inmunizaciones. Seis semanas después de la tercera inmunización se administró un reto de MTB en aerosol utilizando un dispositivo (Glas-Col, Terre Haute, Ind.) calibrado para suministrar aproximadamente 20 bacilos en cada pulmón de los cobayos. Los tiempos de supervivencia para los cobayos infectados se determinaron al observar los animales en una base diaria por los cambios en el consumo de alimentos, evidencia de respiración dificultosa y cambios de comportamiento. Además, los animales se pesaron en una base semanal hasta que se observó una caída de peso sostenida durante varios días, indicando una enfermedad.

Ejemplo 1

Reconocimiento humano de un antígeno inducido durante la inanición

El antígeno Rv2660c se evaluó para el reconocimiento humano en un panel de pacientes con TB pulmonar de Uganda proporcionado por el Banco de Especímenes de Tuberculosis WHO. Ambos pacientes con un estado positivo y negativo de infección por VIH se incluyeron (N=94 y N=73, respectivamente). El grupo de control consistió en cien donadores saludables residentes en Dinamarca con una cobertura calculada de BCG de >90%.

Las placas de microtítulo se revistieron con 1.0 g/ml (100 l por pozo) de proteína de Rv2660c incubada con 100 x muestras de suero diluido y se desarrollaron utilizando Ig antihumano de conejo conjugada con peroxidasa y tetrametilbenzidina como substrato (resultados en la Figura 1).

Conclusión

En este estudio, se sometió a prueba el reconocimiento de una proteína inducida durante la inanición. Basándose en un corte determinado a partir del grupo de control utilizando una sensibilidad de 97% si era posible confirmar la infección de TB en 45% de los casos con VIH-y 61% de los casos con VIH+. Indicando claramente que la proteína de RV2660c es expresada y reconocida por el sistema inmune durante una infección con MTB.

Ejemplo 2

Inmunogenicidad y prevención de la reactivación por medio de la administración posterior a la exposición de un antígeno inducido durante la inanición (Rv2659c)

Los ratones se infectaron con M. tuberculosis y se trataron con antibióticos para reducir la carga bacteriana y entrar a una etapa de infección latente con una carga bacteriana cercana al nivel de detección. Durante la etapa latente de la infección, los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2659c en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL). Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con Rv2659c (figura 2).

Capacidad de la proteína inducida durante la inanición Rv2659c para inducir la protección contra la reactivación de

M. tuberculosis

Los grupos de ratones con M. tuberculosis latente se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2659c formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones y bazos cuando se compararon con ratones no vacunados (infectados de manera latente). La protección contra la reactivación se avaluó tres meses después de la vacunación. El antígeno Rv2659c indujo una reducción de 3 a 90 veces los niveles bacterianos en los pulmones en comparación con los ratones infectados de manera latente, no inmunizados, reactivados (figura 3). Para evaluar la influencia de la vacunación con Rv2659c sobre el posible desarrollo de una patología en los ratones infectados de manera latente, se tomó tejido pulmonar de ratones vacunados, infectados de manera latente para el examen histopatológico. No se detectó necrosis caseosa, fibrosis o mineralización significativas en las lesiones y no se observó una infiltración aumentada de células inflamatorias.

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Conclusión

En este estudio, se sometió a prueba el potencial de una proteína inducida durante la inanición, Rv2659c como una vacuna terapéutica. Cuando la proteína de Rv2659c se administró a ratones en combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio-lípido de monofosforilo A, se indujo/reforzó una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción logarítmica de 0.5-1.0 en la carga bacteriana en los pulmones. De esta manera, los estudios sugieren que la vacunación posterior a la exposición reduce o retarda la reactivación de M. Tuberculosis sin desencadenar una inmunopatología pulmonar.

Ejemplo 3

Inmunogenicidad y protección contra la infección por aerosol de M. tuberculosis por el antígeno inducido durante la inanición Rv2660c

Los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2660c en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL). Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizaron por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con Rv2660c (figura 4A). Tres semanas después de la vacunación final, las células del bazo se analizaron por la secreción de IFN-gamma después de la estimulación con Rv2660c (figura 4B) y las células sanguíneas se analizaron por las respuestas proliferativas específicas de antígenos (figura 4C).

Los grupos de ratones vacunados por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con Rv2660c formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) se sometieron a un reto por medio de la infección por aerosol con

M. tuberculosis y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) aisladas de los pulmones en comparación con ratones no vacunados. La protección se evaluó 12 semanas después de la vacunación. El antígeno Rv2660c indujo una reducción logarítmica (10) de ½ en los niveles bacterianos de los pulmones en comparación con ratones infectados no inmunizados (figura 5).

Conclusión

En este estudio, se sometió a prueba el potencial de una proteína inducida durante la inanición Rv2660c como un antígeno de vacuna. Cuando la proteína Rv2660c se administró a ratones en combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio-lípido de monofosforilo A, se indujo una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción logarítmica (10) de aproximadamente 0.5 en la carga bacteriana en los pulmones.

Ejemplo 4

Fusión de antígenos inducidos durante la inanición con vacunas preventivas (Vacuna de múltiples fases)

Respuestas inmunológicas después de la inmunización con proteínas de fusión triples

Los grupos de ratones se vacunaron por vía subcutánea dos veces en intervalos de dos semanas con los polipéptidos de fusión Hybrid56, HyVac21 o HyVac28 en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL). Una semana después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizan por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 1 microgramo/ml de proteína de fusión de inmunización o los componentes individuales en las proteínas de fusión (figuras 6A-6C). Tres semanas después de la vacunación final con Hybrid56, las células de bazo se analizan por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 microgramos/ml de los componentes individuales en la proteína de fusión (figura 6D). Las células sanguíneas se analizan por las respuestas proliferativas específicas de antígenos tres semanas después de la vacunación final (Figura 6E),

La capacidad de tres polipéptidos de fusión para inducir la protección contra la infección con M. tuberculosis en ratones

Los grupos de ratones se vacunan por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con los polipéptidos de fusión Hybrid1, Hybrid56 y Hybrid32 en adyuvante (DDA/MPL) y la eficacia de protección se evalúa por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones y bazos en comparación con ratones naturales (no vacunados) después de la infección por aerosol. Como un control positivo para la protección, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyectó s.c. en la base de la cola al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad (Figuras 7A y 7B).

Capacidad de protección del polipéptido Hybrid56 (Ag85b-ESAT6-Rv2660c) contra una infección por aerosol de M. tuberculosis en cobayos

Los grupos de cobayos se vacunan por vía subcutánea tres veces en intervalos de tres semanas con el polipéptido de fusión en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evalúa principalmente al medir cada peso de los animales en una base semanal. Como un control positivo para la protección, una dosis individual de BCG Danish 1331MR (5x104 bacilos/ratón) se inyecta i.d. al mismo tiempo que la primera vacunación de subunidad.

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Los resultados se presentan como curvas de supervivencia en la figura 8.

Conclusión

En este estudio, se investigó el potencial inmunológico de tres proteínas de fusión (Hybrid56, HyVac21 y HyVac28). Cuando las proteínas de fusión se administraron a ratones en la combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio-lípido de monofosforilo A, se indujo una fuerte respuesta inmune dependiente de la dosis en los tres componentes de proteínas individuales indicando su potencial como una vacuna de múltiples fases. Seleccionando a Hybrid56 como un ejemplo, las respuestas inmunes inducidas estuvieron acompañadas por altos niveles de inmunidad de protección que incrementan con el tiempo, alcanzando un nivel que fue claramente superior al nivel de protección alcanzado con la BCG de Mycobacterium bovis, la vacuna clásica contra la MTB. Además, una proteína de fusión triple similar que contenía el antígeno clásico de latencia de MTB Rv2031c (Ag85b-ESAT6-Rv2031c) reemplazando Rv2660c, no mostró una protección mejorada a través del tiempo. Finalmente, el alto nivel de protección para Hybrid56 se confirmó en el modelo de cobayo mucho más susceptible.

Ejemplo 5

Actividad de una fusión de un antígeno inducido durante la inanición y una vacuna preventiva (vacuna de múltiples fases) administrada después de la exposición (terapéuticamente).

Los ratones se infectaron con M. tuberculosis y se trataron con antibióticos para reducir la carga bacteriana y para entrar a una etapa de infección latente con una carga bacteriana baja. Durante la etapa latente de infección, los ratones se vacunaron tres veces en intervalos de dos semanas con el polipéptido de fusión en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL). Quince semanas después de la vacunación final, las células sanguíneas se analizan por medio del ensayo ELISA por la secreción de INF-gamma después de la estimulación con 0.2, 1 o 5 ug/ml de componentes individuales de la proteína de fusión (figura 9A).

La capacidad del polipéptido de fusión para inducir la protección contra la reactivación de M. tuberculosis

Los grupos de ratones con M. tuberculosis latente se vacunaron por vía subcutánea tres veces en intervalos de dos semanas con el polipéptido de fusión formulado en adyuvante (por ejemplo DDA/MPL) y la eficacia de protección se evaluó por medio de la reducción en unidades formadoras de colonias (CFU) de los pulmones en comparación con ratones no vacunados (infectados de manera latente). La protección contra la reactivación se evaluó tres meses después de la vacunación. El polipéptido de fusión indujo una reducción significativa de la reactivación dando por resultado niveles bacterianos pulmonares reducidos en comparación con los ratones infectados de manera latente, no inmunizados, reactivados (figura 9B).

Conclusión

En este estudio, se investigó el potencial de una vacuna de subunidad de tuberculosis basada en una proteína de fusión de los antígenos Rv2660c, ESAT6 (Rv3875) y el antígeno 85B (Rv1886c) como una vacuna terapéutica. Cuando la proteína de fusión se administró a ratones en la combinación de adyuvantes de bromuro de dimetildioctadecilamonio-lípido de monofosforilo A, se indujo/reforzó una respuesta inmune fuerte. La inmunización dio por resultado una reducción en la carga bacteriana en los pulmones durante la reactivación de la infección latente. De esta manera, los estudios sugieren que la vacunación después de la exposición con una fusión de un antígeno inducido durante la inanición y una vacuna preventiva (Vacuna de múltiples fases) reduce o retarda la reactivación de M. tuberculosis.

Referencias

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Claims (1)

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