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ES2645763T3 - Plantas modificadas para la reducción del transporte de cadmio, productos derivados y métodos relacionados - Google Patents

Plantas modificadas para la reducción del transporte de cadmio, productos derivados y métodos relacionados Download PDF

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ES2645763T3
ES2645763T3 ES12191891.6T ES12191891T ES2645763T3 ES 2645763 T3 ES2645763 T3 ES 2645763T3 ES 12191891 T ES12191891 T ES 12191891T ES 2645763 T3 ES2645763 T3 ES 2645763T3
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ES
Spain
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nthma
sec
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ident
gene
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ES12191891.6T
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English (en)
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Alec J. Hayes
Chengalrayan Kudithipudi
Rutger S. Van Der Hoeven
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Philip Morris Products SA
Original Assignee
Philip Morris Products SA
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Publication date
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Abstract

Un método para reducir los niveles de Cd en una planta de tabaco, que comprende modificar genéticamente la planta mediante la reducción de la expresión génica de la ATPasa de metales pesados de Nt (NtHMA), en donde el gen de NtHMA en forma modificada o no modificada se selecciona del grupo que consiste en: un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 3; un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 47; un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; y un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; en donde la reducción de la expresión génica de NtHMA se logra mediante modificación a través de mutagénesis del gen de NtHMA o a través de inactivación del gen de NtHMA, y en donde la inactivación se logra mediante la introducción de transposones y/o elementos de secuencias de inserción (IS) en el genoma de la planta, mediante Direccionamiento a Lesiones Locales Inducidas en Genomas ("TILLING"), o mediante la introducción de ribozimas específicas de la diana.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
DESCRIPCIÓN
Exón
Nucleótidos Posición
Exón 1
1-303 724-1026
Exón 2
304-561 3245-3502
Exón 3
562-659 7364-7461
Exón 4
660-915 11 525-11 780
Exón 5
916-1056 11 866-12 007
Exón 6
1057-1381 12 317-12 644
Exón 7
1382-1584 13 108-13 310
Exón 8
1585-1787 13 456-13 658
Exón 9
1788-3285 14 278-15 775
Exón 10
3286-3618 16 097-16 429
Exón 11
3619-4392 16 650-17 423
Plantas modificadas para la reducción del transporte de cadmio, productos derivados y métodos relacionados
Campo técnico 5
Composiciones, vectores de expresión, polinucleótidos, polipéptidos, plantas, plantas transgénicas, líneas celulares transgénicas y semillas transgénicas, y métodos para obtener y usar estas modalidades para producir diversas plantas que pueden reducir el transporte de metales pesados hacia las porciones aéreas.
Variedad transgénica
Hoja Raíz
Cd µg/g
Zn µg/g Cd µg/g Zn µg/g
K326 06T458
7,09 22,2 703 201
K326 06T459
4,97 24,1 696 225
K326 06T473
3,7 34 929 215
K326 06T480
3,93 38,6 989 224
K326 06T482
2,55 36,3 520 126
Control de K326
174,7 36,3 64,3 35,7
10
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
Esta es una solicitud divisional de la solicitud de patente europea núm. 08860815.
Antecedentes 15
Las plantas obtienen los metales pesados esenciales, tales como Zn, Ni y Cu, mediante la absorción de sustratos con iones metálicos provenientes de su entorno a través de diversos mecanismos de transporte mediados por transportadores de transmembrana que se expresan en la superficie de las células de las raíces y otros tejidos vasculares. Los transportadores clasificados como ATPasas tipo P, tales como ATPasas tipo P1B, son 20 transportadores que translocan sustratos cargados positivamente a través de las membranas plasmáticas mediante la utilización de energía liberada de las reacciones exergónicas de la hidrólisis del ATP. Las ATPasas tipo P1B se denominan además como ATPasas de metales pesados ("HMA") o ATPasas tipo CPx. Las HMA se han agrupado por su especificidad a los sustratos en dos subclases, los grupos Cu/Ag y Zn/Co/Cd/Pb. La primera ATPasa tipo P1B caracterizada en plantas es AtHMA4, clonada a partir de Arabidopsis. La selectividad del sustrato por las HMA no se 25 limita estrictamente al transporte de metales esenciales ya que varios metales no esenciales pueden ser reconocidos indiscriminadamente como sustratos, lo que da como resultado la acumulación de muchos metales no esenciales, tales como Cd, Pb, As, y Hg.
TN90 06T428
26,3 48,6 626 184
TN90 06T430
16,08 37,2 684 213
TN90 06T444
15,98 28,1 738 234
TN90 06T445
20,72 32,6 618 186
TN90 06T455
17,87 24,4 582 157
TN90 PBI121
181,2 35,5 62,6 44,3
Control de TN90
172,4 32,3 72,9 46,6
VA359 06T493
7,59 23,1 543 148
VA359 06T498
1,62 26,2 706 175
VA359 06T506
5,72 28,8 351 109
VA359 06T542
7,03 27,1 738 136
VA359 06T543
11,78 29,3 547 106
VA359 PBI121
206 47,5 35,3 27,6
Control de VA359
158,5 32,6 37,6 26,2
Variedad de semilla transgénica
Cd en corteza Cd en lámina Cd en brea Cd en raíz
TN90 06T619
7,36 31,1 4,67 557
TN90 06T658
3,76 8,89 2,89 727
Control de TN90
30,9 151 25,3 115
TN90 PBI121
23,1 201 20 124
K326 06T682
2,02 4,32 1,97 1020
K326 06T696
2,53 4,48 4,25 1030
Control de K326
19,5 133 25,3 145
K326 PBI121
25,5 143 26,2 253
Lugon-Moulin y otros (Advances in Agronomy 83: 111-180, 2004) revisaron los enfoques para reducir el contenido 30 de cadmio en plantas de tabaco.
Resumen de la invención y descripción
La invención se dirige a un método para reducir los niveles de Cd en una planta de tabaco, que comprende modificar 35 genéticamente la planta mediante la reducción de la expresión génica de la ATPasa de metales pesados de Nt (NtHMA), en donde el gen de NtHMA en una forma modificada o no modificada se selecciona del grupo que consiste en:
un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo 40 P1B;
un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 3;
un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 47; 45
un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; y
un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 49, en donde el polipéptido es un transportador de 50 NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B;
en donde la reducción de la expresión génica de NtHMA se logra mediante modificación a través de mutagénesis del gen de NtHMA o a través de inactivación del gen de NtHMA, y en donde la inactivación se logra mediante la introducción de transposones y/o elementos de secuencias de inserción (IS) en el genoma de la planta, mediante Direccionamiento a Lesiones Locales Inducidas en Genomas (“TILLING”), o mediante 55 la introducción de ribozimas específicas de la diana.
La mutagénesis del gen de NtHMA puede lograrse por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a un sitio, mutagénesis dirigida a un oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente o mutagénesis inducida por radiación. 60
Un homólogo de HMA ("NtHMA") se ha identificado en el tabaco, el cual puede utilizarse para la construcción de diversos constructos de ARNi, que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés que pueden facilitar la degradación de transcritos endógenos de ARN de NtHMA. Las plantas transgénicas que pueden expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de acuerdo con la descripción pueden utilizarse para reducir los niveles de 65 estado estable de los transcritos de ARN de NtHMA, y consecuentemente, para reducir la cantidad de
transportadores de NtHMA funcionalmente activos disponibles para transportar metales a través de las membranas celulares.
Otros aspectos de la descripción se dirigen a vectores de expresión recombinantes que comprenden diversos constructos de ARNi de NtHMA, plantas y semillas transgénicas genéticamente modificadas para expresar 5 exógenamente polinucleótidos de ARNi de NtHMA, líneas celulares derivadas de plantas y semillas transgénicas, y productos de consumo que incorporan hojas derivadas de plantas transgénicas producidas de acuerdo con los métodos descritos.
De acuerdo con la presente descripción se proporciona un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que 10 consiste en:
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.:1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; 15
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.: 3;
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al 20 menos 70 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.: 47;
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.:2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; y 25
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B.
30
El polinucleótido aislado de la descripción puede hibridarse a una molécula de ácido nucleico que comprende o que consiste en las secs. con núms. de ident.: 1, 3, o 47, o a la secuencia complementaria de las secs. con núms. de ident.: 1, 3 o 47, en condiciones de alta rigurosidad.
Otro aspecto de la descripción es un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado como se define en 35 la presente.
Se describe además una planta transgénica obtenida mediante un proceso que comprende introducir el polinucleótido aislado como se define en la presente o el vector de expresión como se define en la presente. La planta transgénica puede ser, por ejemplo, una planta de tabaco. 40
Adicionalmente se describe una línea celular obtenida mediante un proceso que comprende introducir el polinucleótido aislado como se define en la presente o el vector de expresión como se define en la presente.
Se describe además un producto de tabaco consumible (por ejemplo, pero sin limitarse a, un artículo para fumar o 45 producto de tabaco sin humo) que incorpora hojas cosechadas de la planta transgénica como se define en la presente.
Se describe además un constructo de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que corresponde, el constructo comprende: 50
una primera secuencia que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia, con una porción de la sec. con núm. de ident.:3 o 47;
una segunda secuencia; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en 55 la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
En el constructo de ARNi de NtHMA: 60
(a) la primera secuencia puede tener al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 95 % de identidad de secuencia, con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), un fragmento del exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), un fragmento del exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), un fragmento del exón 3 65 (sec. con núm. de ident.:9), exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), un fragmento del exón 4 (sec. con núm. de
ident.:11), exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), un fragmento del exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), un fragmento del exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), un fragmento del exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), un fragmento del exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), un fragmento del exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), un fragmento del exón 10 (sec. con núm. 5 de ident.:23), exón 11 (sec. con núm. de ident.:25), y un fragmento del exón 11 (sec. con núm. de ident.:25);
(b) la segunda secuencia puede tener al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 95 % de identidad de secuencia, con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), un fragmento del intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), un 10 fragmento del intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), un fragmento del intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), un fragmento del intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), un fragmento del intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), un fragmento del intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), un fragmento del intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), intrón 8 (sec. con núm. de 15 ident.:18), un fragmento del intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), un fragmento del intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), un fragmento del intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), un fragmento del intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26), y un fragmento del intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26); 20
(c) la tercera secuencia puede tener al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 95 % de identidad de secuencia, con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.:27, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:27, sec. con núm. de ident.:28, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:28, sec. con núm. de ident.:29, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:29, sec. con núm. de 25 ident.:30, un fragmento de sec. con núm. de ident.:30, sec. con núm. de ident.:31, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:32, sec. con núm. de ident.:33, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:33, sec. con núm. de ident.:34, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:34, sec. con núm. de ident.:35, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:35, sec. con núm. de ident.:36, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:36, sec. con núm. de ident.:37, y un 30 fragmento de la sec. con núm. de ident.:37;
(d) la primera secuencia puede comprender la sec. con núm. de ident.:38, la segunda secuencia puede comprender la sec. con núm. de ident.:39, y la tercera secuencia puede comprender la sec. con núm. de ident.:40;
(e) la primera secuencia puede comprender la sec. con núm. de ident.:42, la segunda secuencia puede 35 comprender la sec. con núm. de ident.:43, y la tercera secuencia puede comprender la sec. con núm. de ident.:44; o
(f) puede aplicar uno o dos o tres de (a), (b), (c), (d) y (e).
La descripción abarca además un vector de expresión que comprende un promotor ubicado corriente arriba y unido 40 operativamente al constructo de ARNi de NtHMA como se define en la presente. El promotor puede seleccionarse del grupo que consiste en: un promotor con especificidad tisular, un promotor inducible, y un promotor constitutivo. En el constructo de ARNi de NtHMA, cada una de la primera y la segunda secuencia puede tener una longitud seleccionada del grupo que consiste en 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 45 nucleótidos y 600-700 nucleótidos.
Adicionalmente se describe una planta transgénica que comprende el ARNi (o el constructo de ARNi de NtHMA, o el vector de expresión) como se define en la presente, en donde la planta transgénica tiene una reducción de los niveles de Cd en al menos una parte de la planta en comparación con la parte en una contraparte no transgénica. La 50 planta transgénica puede ser, por ejemplo, una planta de tabaco.
Se describe además un producto de tabaco consumible (por ejemplo, pero sin limitarse a, un artículo para fumar o producto de tabaco sin humo) que incorpora hojas cosechadas de la planta transgénica que comprende el ARNi como se define en la presente. 55
El producto puede tener un valor de la reducción de Cd en % de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %.
60
El producto puede tener un contenido de Cd en un valor que está en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
65
Se describe además un método para reducir los niveles de Cd en al menos una parte de una planta, que comprende:
reducir los niveles de un ARNm de NtHMA en la planta al provocar la expresión de un constructo de ARNi.
Para este método, el constructo de ARNi puede ser como se define en la presente, y en particular puede 5 comprender:
una primera secuencia que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 90 % de identidad de secuencia, con una porción de la sec. con núm. de ident.:3 o 47;
una segunda secuencia; y 10
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
15
De acuerdo con el método, después de la expresión del constructo de ARNi, la parte de la planta puede tener un contenido de Cd reducido en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %.
Adicional o alternativamente, después de la expresión del constructo de ARNi, la parte de la planta puede tener un 20 contenido de Cd que está en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
Se describe además un polipéptido sustancialmente purificado que tiene al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 25 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 70 % de identidad de secuencia o al menos 95 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.:2 o 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B.
Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido como se define en la presente, por ejemplo que 30 comprende o que consiste en la sec. con núm. de ident.:2 o 49, también se incluye en la descripción.
Otros aspectos diversos (referidos además en la presente como “modalidades”) de la presente invención y descripción se describen más adelante.
35
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un esquema de un clon genómico de NtHMA que comprende 11 exones.
La Figura 2A ilustra una estrategia de subclonación ilustrativa para construir un vector de expresión de ARNi de 40 NtHMA que permite la expresión constitutiva de polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 2B ilustra un híbrido de ARN bicatenario hipotético formado (como estructura "tallo-bucle-tallo") por las interacciones intramoleculares, por pares de bases, dentro del polinucleótido de ARNi de NtHMA producido como un 45 producto transcrito a partir de un constructo de ARNi de NtHMA ilustrativo.
La Figura 3A muestra una secuencia de ARNi ilustrativa, NtHMA (660-915), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se describe en el Ejemplo 2.
50
Las Figuras 3B-3D muestran reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de la primera generación (T0), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915), como se describe en el Ejemplo 5.
La Figura 4A muestra una secuencia de ARNi ilustrativa, NtHMA (1382-1584), para producir polinucleótidos de ARNi 55 de NtHMA de interés, como se describe en el Ejemplo 3.
Las Figuras 4B-4D muestran reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de la primera generación (T0), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584), como se describe en el Ejemplo 5. 60
Las Figuras 5A-C muestran niveles normalizados del transcrito de ARN de NtHMA en diversas líneas transgénicas de la primera generación (T0) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se determina mediante análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de extractos de la lámina de las hojas, como se describe en el Ejemplo 6. 65
La Figura 6 muestra la distribución de Cd y Zn entre la lámina foliar y la raíz de diversas líneas transgénicas de la primera generación (T0) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la Tabla 2 y se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 7 muestra la distribución de Cd entre los tejidos de corteza (“B”), lámina foliar (“L”), brea (“P”), y raíz (“R”) 5 de diversas líneas transgénicas de la primera generación (T0) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la Tabla 3 y se describe en el Ejemplo 8.
La Figura 8 muestra la distribución de Cd entre la lámina foliar (“L”) y la raíz (“R”) de diversas líneas transgénicas de la segunda generación (T1) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA 10 de interés, como se describe en el Ejemplo 9.
Descripción detallada de la invención y descripción
I. Aislamiento de genes de NtHMA de tabaco y productos génicos 15
La Figura 1 es un esquema de un clon genómico de NtHMA que comprende 11 exones que codifican un transportador de metales pesados relacionado con la familia de transportadores de HMA. El Ejemplo 1 describe además la identificación del clon genómico de NtHMA (_HO-18-2) y 4 clones de ADNc de NtHMA. La Tabla 1 más adelante proporciona las posiciones de los nucleótidos que corresponden a las subregiones de exones e intrones 20 mapeadas dentro del clon genómico de NtHMA (_HO-18-2).
A. Polinucleótidos de NtHMA
El término "polinucleótido" se refiere a un polímero de nucleótidos que comprende al menos 10 bases de longitud. 25 Los polinucleótidos pueden ser ADN, ARN o un híbrido de ADN/ARN, que comprende ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, combinaciones de desoxirribo- y ribonucleótidos, y combinaciones de bases y/o modificaciones, que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN o ARN. El término "ADN" incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR y combinaciones/equivalentes de estos. 30 El término "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido no contiguo con cualquier genoma de origen, o separado de un contexto nativo. El término incluye cualquier molécula de polinucleótido recombinante tales como los constructos de ARNi de NtHMA, vectores de expresión de ARNi de NtHMA, clones genómicos de NtHMA, y fragmentos y variantes de estos.
35
Como se muestra en la Figura 1, el clon genómico de NtHMA, designado como sec. con núm. de ident.:1, comprende: intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), intrón 7 40 (sec. con núm. de ident.:16), exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24, exón 11 (sec. con núm. de ident.:25) e intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26). Para las secuencias, ver el Listado de secuencias más adelante. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que representan 45 fragmentos genómicos aislados en el locus de NtHMA, que comprende la sec. con núm. de ident.:1, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:1, o variantes de estos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polinucleótidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:1. 50
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen secuencias que se complementan con las de las variantes de polinucleótidos de NtHMA que comprenden al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:1. Diversas modalidades descritas en la presente se 55 dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones de rigurosidad de moderadas a altas, con polinucleótidos que comprenden la sec. con núm. de ident.:1, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:1.
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados de ADNc de NtHMA (Clon 60 P6663), que comprenden la sec. con núm. de ident.:3, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:3, o variantes de estos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polinucleótidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:3.
65
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polirribonucleótidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:3, y en las cuales las T se han sustituido con U (por ejemplo, ARN). Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar específicamente, en condiciones de rigurosidad de moderadas a altas, con polinucleótidos que 5 comprenden la sec. con núm. de ident.:3, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:3. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen una secuencia que se complementa con la de variantes de polinucleótidos de NtHMA que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:3. 10
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados de ADNc de NtHMA (Clon P6643), que comprenden la sec. con núm. de ident.:47, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:47, o variantes de estos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polinucleótidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de 15 secuencia con la sec. con núm. de ident.:47, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:47. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polirribonucleótidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:47, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:47, y en las cuales las T se han sustituido con U (por ejemplo, ARN). Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que pueden hibridar 20 específicamente, en condiciones de rigurosidad de moderadas a altas, a polinucleótidos que comprenden la sec. con núm. de ident.:47, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:47. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polinucleótidos aislados que tienen una secuencia que se complementa con la de variantes de polinucleótidos de NtHMA que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:47, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:47. 25
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a biopolímeros que son homólogos a polinucleótidos de NtHMA y polipéptidos de NtHMA ("homólogos de NtHMA"), que pueden identificarse a partir de diferentes especies de plantas. Por ejemplo, los homólogos de NtHMA pueden aislarse experimentalmente mediante el tamizaje de genotecas de ácidos nucleicos adecuadas que se derivan de diferentes especies de plantas de interés. 30 Alternativamente, los homólogos de NtHMA pueden identificarse mediante tamizaje de bases de datos de genomas que contienen secuencias de una o más especies que utilizan una secuencia derivada de polinucleótidos de NtHMA y/o polipéptidos de NtHMA. Tales bases de datos genómicas están disponibles fácilmente para una serie de especies (por ejemplo, en internet (www) en los sitios tigr.org/tdb; genetics.wisc.edu; stanford.edu/.about.ball; hiv-web.lan1.gov; ncbi.nlm.nig.gov; ebi.ac.uk; y pasteur.fr/other/biology). Por ejemplo, pueden obtenerse secuencias de 35 oligonucleótidos degeneradas mediante "traducción inversa" de fragmentos de polipéptidos de NtHMA. Los polinucleótidos de NtHMA pueden utilizarse como sondas o cebadores para identificar/amplificar secuencias relacionadas, o para obtener secuencias de longitud completa para NtHMA relacionados mediante PCR, por ejemplo, o mediante otras técnicas muy conocidas (por ejemplo, ver PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis y otros, eds., Academic Press, Inc. (1990)). 40
B. Polipéptidos de NtHMA
El término "polipéptido de NtHMA" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos designada como la sec. con núm. de ident.:2; polipéptidos que tienen homología sustancial (es decir, similitud de 45 secuencia) o identidad sustancial a la sec. con núm. de ident.:2; fragmentos de la sec. con núm. de ident.:2; y variantes de estos. Los polipéptidos de NtHMA incluyen secuencias que tienen suficiente o sustancial grado de identidad o similitud a la sec. con núm. de ident.:2, y que pueden funcionar para el transporte de metales pesados a través de las membranas celulares.
50
Los polipéptidos de NtHMA incluyen variantes producidas mediante la introducción de cualquier tipo de alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones, o sustituciones de aminoácidos; cambios en estados de glicosilación; cambios que afectan el replegamiento o isomerizaciones, estructuras tridimensionales, o estados de autoasociación), los que pueden diseñarse deliberadamente o aislarse naturalmente. Los polipéptidos de NtHMA pueden estar en forma lineal o cíclica mediante el uso de métodos conocidos (por ejemplo, H. U. Saragovi, y otros, Bio/Technology 10, 773 55 (1992); y R. S. McDowell, y otros, J. Amer. Chem. Soc. 114:9245 (1992), ambos incorporados en la presente como referencia). Los polipéptidos de NtHMA comprenden al menos 8 a 10, al menos 20, al menos 30, o al menos 40 aminoácidos contiguos.
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados codificados por la 60 secuencia de polinucleótido, sec. con núm. de ident.:1, que comprende la sec. con núm. de ident.:2, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:2, o variantes de estos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polipéptidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:2. 65
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados (Clon P6663), que comprenden la sec. con núm. de ident.:2, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:2, o variantes de estas. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polipéptidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:2. 5
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a polipéptidos de NtHMA aislados (Clon P6643), que comprenden la sec. con núm. de ident.:49, fragmentos de la sec. con núm. de ident.:49, o variantes de estas. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a variantes de polipéptidos de NtHMA aislados que comprenden al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia 10 con la sec. con núm. de ident.:49, o fragmentos de la sec. con núm. de ident.:49.
II. Composiciones y métodos relacionados para reducir la expresión génica de NtHMA y/o la actividad del transportador mediado por NtHMA
15
Las composiciones antagonistas adecuadas que pueden regular negativamente la expresión y/o la actividad de NtHMA y variantes de NtHMA incluyen polinucleótidos de secuencia específica que pueden interferir con la transcripción de uno o más genes de NtHMA endógenos; polinucleótidos de secuencia específica que pueden interferir con la traducción de transcritos de ARN de NtHMA (por ejemplo, dsARN, siARN, ribozimas); polipéptidos de secuencia específica que pueden interferir con la estabilidad proteica de NtHMA, la actividad enzimática de NtHMA, 20 y/o la actividad de unión de NtHMA con respecto a sustratos y/o proteínas reguladoras; anticuerpos que muestran especificidad para NtHMA; y compuestos moleculares pequeños que pueden interferir con la estabilidad proteica de NtHMA, la actividad enzimática de NtHMA, y/o la actividad de unión de NtHMA. Un antagonista eficaz puede reducir el transporte de metales pesados (por ejemplo, Cd) hacia estructuras de la lámina foliar en al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %. 25
A. Definiciones
A lo largo de esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, los términos "un/una” y "el/la" funcionan como referentes singular y plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia 30 a "un polinucleótido de ARNi" incluye una pluralidad de tales polinucleótidos de ARNi, y una referencia a "la planta" incluye la referencia a una o más de tales plantas.
El término "orientación" se refiere a un orden particular en la ubicación de un polinucleótido con respecto a la posición de un polinucleótido de referencia. Un ADN lineal tiene dos orientaciones posibles: la dirección de 5' a 3' y 35 la dirección de 3' a 5'. Por ejemplo, si una secuencia de referencia se ubica en la dirección 5' a 3', y si una segunda secuencia se ubica en la dirección 5' a 3' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia están orientadas en la misma dirección, o tienen la misma orientación. Típicamente, una secuencia promotora y un gen de interés bajo la regulación del promotor dado están ubicados en la misma orientación. Sin embargo, con respecto a la secuencia de referencia ubicada en la dirección 5' 40 a 3', si una segunda secuencia está ubicada en la dirección 3' a 5' dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido, entonces la secuencia de referencia y la segunda secuencia están orientadas en la dirección antisentido, o tienen orientación antisentido. Dos secuencias que tienen orientaciones antisentido una con respecto a la otra pueden describirse alternativamente como que tienen la misma orientación, si la secuencia de referencia (dirección 5' a 3') y la secuencia complementaria inversa de la secuencia de referencia (secuencia de referencia 45 ubicada en 5' a 3') están ubicadas dentro de la misma molécula/cadena de polinucleótido.
El término "vector de expresión de ARNi de NtHMA" se refiere a un vehículo de ácido nucleico que comprende una combinación de componentes de ADN para permitir el transporte y la expresión de constructos de ARNi de NtHMA. Los vectores de expresión adecuados incluyen episomas capaces de una replicación extracromosómica tales como 50 plásmidos de ADN circulares, bicatenarios; plásmidos de ADN lineales, bicatenarios; y otros vectores de expresión equivalentes funcionalmente de cualquier origen. Un vector de expresión de ARNi de NtHMA adecuado comprende al menos un promotor ubicado corriente arriba y unido operativamente a un constructo de ARNi de NtHMA, como se define más adelante.
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El término "constructo de ARNi de NtHMA" se refiere a un fragmento de ADN recombinante, bicatenario, que codifica "polinucleótidos de ARNi de NtHMA" que tienen actividad de interferencia del ARN. El constructo de ARNi de NtHMA comprende una "cadena molde" con apareamiento de bases con una "cadena codificante o sentido" complementaria. Un constructo de ARNi de NtHMA dado puede insertarse en un vector de expresión de ARNi de NtHMA en dos orientaciones posibles, ya sea en la misma orientación (o sentido) o en la orientación contraria (o 60 antisentido) con respecto a la orientación de un promotor ubicado dentro de un vector de expresión de ARNi de NtHMA.
El término "polinucleótidos de ARNi de NtHMA" puede dirigir el ARN de NtHMA a la degradación enzimática, lo que implica la formación de fragmentos más pequeños de polinucleótidos de ARNi de NtHMA ("siARN") que pueden 65 unirse a múltiples secuencias complementarias dentro del ARN de NtHMA diana. Los niveles de expresión de uno o
más genes de NtHMA pueden reducirse mediante la actividad de interferencia del ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA.
El término "cadena molde" se refiere a la cadena que comprende una secuencia que se complementa con la "cadena sentido o codificante" de un híbrido de ADN, tal como un fragmento genómico de NtHMA, ADNc de NtHMA, 5 o constructo de ARNi de NtHMA, o cualquier fragmento de ADN que comprenda una secuencia de ácido nucleico que pueda transcribirse por la ARN polimerasa. Durante la transcripción, la ARN polimerasa puede translocarse a lo largo de la cadena molde en la dirección de 3' a 5' durante la síntesis del ARN naciente.
Los términos "cadena sentido" o "cadena codificante" se refieren a la cadena que comprende una secuencia que se 10 complementa con la cadena molde en un híbrido de ADN. Por ejemplo, la secuencia de la cadena sentido ("secuencia sentido") para el clon genómico de NtHMA identificado se designa como la sec. con núm. de ident.:1. Por ejemplo, la secuencia sentido para el ADNc de NtHMA, identificado como el clon P6663, se designa como la sec. con núm. de ident.:3. Por ejemplo, la secuencia sentido para el ADNc de NtHMA, identificado como el clon P6643, se designa como la sec. con núm. de ident.:46. Por ejemplo, si la cadena sentido comprende una secuencia 15 hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia correspondiente sustancialmente idéntica dentro de un ARNm diana hipotético es 5'-UAAUCCGGU-3'.
El término "secuencia complementaria inversa" se refiere a la secuencia que se complementa con la "secuencia sentido" de interés (por ejemplo, secuencia del exón) ubicada dentro de la misma cadena, en la misma orientación 20 con respecto a la secuencia sentido. Por ejemplo, si una cadena comprende una secuencia hipotética 5'-TAATCCGGT-3', entonces la secuencia complementaria inversa 5'-ACCGGATTA-3' puede estar unida operativamente a la secuencia sentido, separada por una secuencia espaciadora.
Los términos "transcrito de ARN de NtHMA" o "ARN de NtHMA," en el contexto de interferencia del ARN, se refieren 25 a moléculas de ácidos polirribonucleicos producidas dentro de una célula vegetal huésped de interés, que es el resultado de la transcripción de genes endógenos de la familia de HMA, que incluye el gen de NtHMA aislado (sec. con núm. de ident.:1). Así, estos términos incluyen cualquier especie de ARN o variantes de ARN producidas como productos transcripcionales a partir de genes relacionados con HMA que pueden ser distintos del gen de NtHMA aislado (sec. con núm. de ident.:1) pero que tienen suficiente similitud a nivel estructural y/o funcional para ser 30 clasificados dentro de la misma familia. Por ejemplo, si una célula vegetal huésped seleccionada para la modificación genética de acuerdo con los métodos descritos es de tabaco, entonces los transcritos de ARN de NtHMA diana incluyen: (1) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción del gen de NtHMA aislado (sec. con núm. de ident.:1); (2) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de cualquier gen que tenga al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de 35 secuencia con la secuencia del gen de NtHMA aislado (sec. con núm. de ident.:1) (es decir, otros genes distintos sustancialmente idénticos al gen de NtHMA identificado y que codifiquen isoformas relacionadas de transportadores de HMA); y (3) pre-ARNm y ARNm producidos a partir de la transcripción de alelos del gen de NtHMA (sec. con núm. de ident.:1). Los transcritos de ARN de NtHMA incluyen variantes de ARN producidas como resultado de reacciones alternativas de corte y empalme de ARN heteronucleares ("hnARN") de un gen de NtHMA particular, 40 variantes de ARNm que resultan de tales reacciones alternativas de corte y empalme del ARN, y cualquier variante intermedia de ARN.
Los términos "homología" o "identidad" o "similitud" se refieren al grado de similitud de secuencias entre dos polipéptidos o entre dos moléculas de ácidos nucleicos comparadas mediante alineación de secuencias. El grado de 45 homología entre dos secuencias de ácidos nucleicos discretas que se comparan es una función del número de nucleótidos idénticos, o coincidentes, en posiciones comparables. El por ciento de identidad puede determinarse mediante inspección visual y cálculos matemáticos. Alternativamente, el por ciento de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos puede determinarse mediante comparación de la información de la secuencia con el uso del programa informático GAP, versión 6,0 descrito por Devereux y otros (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) y disponible 50 del Grupo Informático en Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). Los parámetros predeterminados para el programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) una penalidad de 3,0 para cada 55 hueco y una penalidad adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalidad para los huecos en los extremos. Diversos programas conocidos por los expertos en la técnica de comparación de secuencias pueden utilizarse alternativamente.
El término "corriente arriba" se refiere a una dirección/posición relativa con respecto a un elemento de referencia a lo 60 largo de una secuencia de polinucleótido lineal, que indica una dirección/posición hacia el extremo 5' de la secuencia de polinucleótido. "Corriente arriba" puede usarse indistintamente con el "extremo 5' de un elemento de referencia".
El término “unido operativamente” se refiere a la unión de distintos elementos de ADN, fragmentos, o secuencias para producir una unidad transcripcional funcional o un vector de expresión funcional. 65
El término "promotor" se refiere a un elemento de ácido nucleico/ secuencia, ubicado típicamente corriente arriba y unido operativamente a un fragmento de ADN bicatenario, tal como un constructo de ARNi de NtHMA. Por ejemplo, un promotor adecuado permite la activación transcripcional de un constructo de ARNi de NtHMA mediante el reclutamiento del complejo transcripcional, que incluye la ARN polimerasa y diversos factores, para iniciar la síntesis de ARN. Los "promotores" pueden derivarse totalmente de regiones próximas a un gen de interés nativo, o pueden 5 estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores nativos y/o segmentos de ADN sintéticos. Los promotores adecuados incluyen promotores específicos de tejidos reconocidos por factores específicos de tejidos presentes en diferentes tejidos o tipos celulares (por ejemplo, promotores específicos de la raíz, promotores específicos de brotes, promotores específicos de xilema), o presentes durante diferentes etapas del desarrollo, o presentes en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Los promotores adecuados incluyen 10 promotores constitutivos que pueden activarse en la mayoría de los tipos celulares sin requerir inductores específicos. Los ejemplos de promotores adecuados para controlar la producción de polipéptidos de ARNi de NtHMA incluyen los promotores de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos o los promotores de ubiquitina o faseolina. Los expertos en la técnica son capaces de generar múltiples variaciones de promotores recombinantes, como se describe en un grupo de referencias, tales como Okamuro y 15 Goldberg, Biochemistry of Plants, Vol. 15:pp1-82 (1989).
Los promotores específicos de tejidos son elementos de control transcripcional que solo son activos en células o tejidos particulares en momentos específicos durante el desarrollo de la planta, tal como en tejidos vegetativos o tejidos reproductivos. La expresión específica de tejidos puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando se prefiere la 20 expresión de polinucleótidos en ciertos tejidos. Los ejemplos de promotores específicos de tejidos bajo el control del desarrollo incluyen promotores que pueden iniciar la transcripción solo (o fundamentalmente solo) en ciertos tejidos, tales como tejidos vegetativos, por ejemplo, raíces u hojas, o tejidos reproductivos, tales como frutos, óvulos, semillas, polen, pistilos, flores o cualquier tejido embrionario. Los promotores específicos de tejidos reproductivos pueden ser, por ejemplo, específicos de anteras, específicos de óvulos, específicos de embriones, específicos del 25 endospermo, específicos del tegumento, específicos de la cubierta de semillas y de semillas, específicos del polen, específicos de pétalos, específicos de sépalos, o combinaciones de estos.
Los promotores específicos de hojas adecuados incluyen el promotor de piruvato, ortofosfato diquinasa (PPDK) de plantas C4 (maíz), promotor cab-m1Ca+2 del maíz, el promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana 30 (Atmyb5), los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS) (por ejemplo, los genes de tomate RBCS 1, RBCS2 y RBCS3A expresados en hojas y plántulas cultivadas a la luz, RBCS1 y RBCS2 expresados en frutos de tomate en desarrollo y/o el promotor de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en células del mesófilo en las láminas y las vainas foliares en niveles altos).
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Los promotores adecuados específicos de la senescencia incluyen un promotor de tomate activo durante la maduración de los frutos, la senescencia y la escisión de las hojas, un promotor de maíz del gen que codifica una cisteína proteasa. Pueden usarse promotores específicos de anteras adecuados. Tales promotores son conocidos en la técnica o puede descubrirse mediante técnicas conocidas; ver, por ejemplo, Bhalla y Singh (1999) Molecular control of male fertility in Brassica, Proc. 10th Annual Rapeseed Congress, Canberra, Australia; van Tunen y otros 40 (1990) Pollen- and anther-specific chi promoters from petunia: tandem promoter regulation of the chiA gene. Plant Cell 2:393-40; Jeon y otros (1999) Isolation and characterization of an anther-specific gene, RA8, from rice (Oryza sativa L). Plant Molecular Biology 39:35-44; y Twell y otros (1993) Activation and developmental regulation of an Arabidopsis anther-specific promoter in microspores and pollen of Nicotiana tabacum. Sex. Plant Reprod. 6:217-224.
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Los promotores adecuados con preferencia por la raíz conocidos por los expertos en la técnica pueden seleccionarse. Ver, por ejemplo, Hire y otros (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de la glutamina sintetasa específica de la raíz de la soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento control específico de la raíz en el gen GRP 1.8 del frijol francés); Sanger y otros (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de la raíz del gen de manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao y otros (1991) Plant 50 Cell 3(1):11-22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica la glutamina sintetasa citosólica (GS), que se expresa en las raíces y en los nódulos de la raíz de la soja). Ver además Bogusz y otros (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores específicos de la raíz, aislados a partir de genes de hemoglobina de la no leguminosa Parasponia andersonii fijadora de nitrógeno y la especie relacionada no leguminosa Trema tomentosa no fijadora de nitrógeno. 55
Los promotores adecuados con preferencia por las semillas incluyen tanto los promotores específicos de semillas (los promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de proteínas de almacenamiento en semillas) como los promotores de la germinación de semillas (los promotores activos durante la germinación de las semillas). Ver, por ejemplo, Thompson y otros (1989) BioEssays 10: 108, incorporado en la 60 presente como referencia. Tales promotores con preferencia por las semillas incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz); milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); mZE40-2, conocido además como Zm-40 (patente de Estados Unidos núm. 6,403,862); nuclc (patente de Estados Unidos núm. 6,407,315); y celA (celulosa sintasa) (ver WO 00/11177). Gama-zeína es un promotor específico del endospermo. Glob-1 es un promotor específico del embrión. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de 65 semillas incluyen, pero no se limitan a, beta-faseolina de frijol, napin, beta-conglicinina, lectina de frijol de soya,
cruciferina, y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de zeína de 15 kDa de maíz, un promotor de zeína de 22 kDa, un promotor de zeína de 27 kDa, un promotor de g-zeína, un promotor de gamma-zeína de 27 kD (tal como el promotor de gzw64A, ver núm. de acceso del Genbank S78780), un promotor ceroso, un promotor de shrunken 1, un promotor de shrunken 2, un promotor de globulina 1 (ver núm. de acceso del Genbank L22344), un promotor de Itp2 (Kalla, y otros, Plant Journal 5 6:849-860 (1994); patente de Estados Unidos núm. 5,525,716), promotor de cim1 (ver patente de Estados Unidos núm. 6,225,529) promotores de end1 y end2 de maíz (ver patente de Estados Unidos núm. 6,528,704 y solicitud 10/310,191, presentada el 4 de diciembre de 2002); promotor de nuc1 (patente de Estados Unidos núm. 6,407,315); promotor de Zm40 (patente de Estados Unidos núm. 6,403,862); eep1 y eep2; lec1 (solicitud de patente de Estados Unidos núm. de serie 09/718,754); promotor de thioredoxinH (solicitud provisional de patente de Estados Unidos 10 60/514,123); promotor de mlip15 (patente de Estados Unidos núm. 6,479,734); promotor de PCNA2; y el promotor de shrunken-2. (Shaw y otros, Plant Phys 98:1214-1216, 1992; Zhong Chen y otros, PNAS USA 100:3525-3530, 2003).
Los ejemplos de promotores inducibles incluyen promotores que responden al ataque de patógenos, condiciones 15 anaeróbicas, temperatura elevada, luz, sequía, temperatura fría, o alta concentración de sales. Los promotores inducibles por patógenos incluyen los de las proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), las cuales se inducen después de una infección por un patógeno (por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa). Ver, por ejemplo, Redolfi y otros (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y otros (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Ver además la solicitud titulada "Inducible Maize 20 Promoters", solicitud de patente de Estados Unidos núm. de serie 09/257,583, presentada el 25 de febrero de 1999.
Adicionalmente a los promotores de plantas, otros promotores adecuados pueden derivarse de un origen bacteriano, por ejemplo, el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa y otros promotores derivados de plásmidos Ti), o pueden derivarse de promotores virales (por ejemplo, promotores de ARN 35S y 19S del virus del 25 mosaico de la coliflor (CaMV), promotores constitutivos del virus del mosaico del tabaco, promotores de 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), o el promotor de 35S del virus del mosaico de la celedonia).
El término "potenciador" se refiere a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que puede reclutar proteínas reguladoras de la transcripción tales como activadores transcripcionales, para potenciar la 30 activación transcripcional mediante el incremento de la actividad del promotor. Los potenciadores adecuados pueden derivarse de regiones próximas a un promotor de interés nativo (fuentes homólogas) o pueden derivarse de contextos no nativos (fuentes heterólogas) y unirse operativamente a cualquier promotor de interés dentro de los vectores de expresión de ARNi de NtHMA para potenciar la actividad y/o la especificidad tisular de un promotor. Algunos potenciadores pueden funcionar en cualquier orientación con respecto a la orientación de una unidad de 35 transcripción. Por ejemplo, los potenciadores pueden ubicarse corriente arriba o corriente abajo de una unidad transcripcional que comprende un promotor y un constructo de ARNi de NtHMA. Los expertos en la técnica son capaces de unir operativamente los potenciadores y promotores para optimizar los niveles de transcripción de los constructos de ARNi de NtHMA.
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B. Vectores de expresión de ARNi que comprenden constructos de ARNi de NtHMA que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA
La interferencia por ARN ("ARNi") o el silenciamiento por ARN es un proceso conservado evolutivamente mediante el cual los ARNm específicos pueden ser dirigidos a la degradación enzimática. Un ARN bicatenario (dsARN) debe 45 introducirse o producirse por una célula (por ejemplo, virus de dsARN, o polinucleótidos de ARNi de NtHMA) para iniciar la vía del ARNi. El dsARN puede convertirse en múltiples híbridos de siARN de 21 a 23 pb de longitud ("siARN") por las RNasas III, que son endonucleasas específicas dsARN ("Dicer"). Los siARN pueden reconocerse posteriormente mediante complejos de silenciamiento inducidos por ARN ("RISC") que promueven el desenrollamiento de siARN a través de un proceso dependiente de ATP. La cadena antisentido desenrollada del 50 siARN guía al RISC activado hacia el ARNm diana (por ejemplo, variantes de ARN de NtHMA) que comprende una secuencia complementaria a la cadena antisentido del siARN. El ARNm diana y la cadena antisentido pueden formar una hélice en forma A, y el surco mayor de la hélice en forma A puede ser reconocido por los RISC activados. El ARNm diana puede escindirse mediante el RISC activado en un sitio único definido por el sitio de unión del extremo 5' de la cadena del siARN. El RISC activado puede reciclarse para catalizar otro evento de escisión. 55
La Figura 2A ilustra la construcción de un vector de expresión de ARNi de NtHMA ilustrativo. En la Figura 2A, “S I” indica la Etapa I y “S II” indica la Etapa II del proceso de construcción. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden constructos de ARNi de NtHMA que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA que muestran actividad de interferencia del ARN mediante la 60 reducción del nivel de expresión de los ARNm de NtHMA, pre-ARNm de NtHMA, y variantes de ARN de NtHMA relacionadas. Los vectores de expresión comprenden un promotor ubicado corriente arriba y unido operativamente a un constructo de ARNi de NtHMA, como se define adicionalmente más adelante. Los vectores de expresión de ARNi de NtHMA pueden comprender un promotor mínimo adecuado, un constructo de ARNi de NtHMA de interés, una región regulatoria corriente arriba (5'), una región regulatoria corriente abajo (3'), que incluye señales de terminación 65
de la transcripción y poliadenilación, y otras secuencias conocidas para los expertos en la técnica, tales como varios marcadores de selección.
Los polinucleótidos de NtHMA pueden producirse en diversas formas, que incluyen estructuras bicatenarias en forma de horquilla ("dsARNi"). Los dsARNi de NtHMA pueden convertirse enzimáticamente a siARN de NtHMA 5 bicatenarios. Una de las cadenas del híbrido de siARN de NtHMA puede hibridar con una secuencia complementaria dentro del ARNm de NtHMA diana y variantes de ARN de NtHMA relacionadas. Los híbridos de siARN/ARNm son reconocidos por el RISC que puede escindir los ARN de NtHMA en múltiples sitios de una manera dependiente de la secuencia, lo que da como resultado la degradación del ARNm de NtHMA diana y variantes relacionadas del ARN de NtHMA. 10
La Figura 2B ilustra la formación de un híbrido de ARN bicatenario hipotético formado (como una estructura de "tallo-bucle-tallo") como un producto transcrito a partir de un constructo de ARNi de NtHMA ilustrativo. En la Figura 2B, se muestra un constructo de ARNi de NtHMA 10 hipotético, que comprende 3 fragmentos de ADN bicatenarios, tales como los fragmentos 1-3. La flecha I indica la formación del constructo de ARNi, la flecha II la transcripción, y la 15 flecha III la formación de dsARN. El fragmento 1 se ubica corriente arriba y unido operativamente al fragmento 2, el cual se ubica corriente arriba y unido operativamente al fragmento 3, para lo cual las cadenas/secuencias de ADN 4, 6, y 8 se unen entre sí en tándem para formar la cadena 11, como se muestra. Alternativamente, un constructo de ARNi de NtHMA comprende "una secuencia sentido" 5, que se ubica corriente arriba y unida operativamente a "una secuencia espaciadora" 7, que se ubica corriente arriba y se une operativamente a "una secuencia complementaria 20 inversa" 9. Las cadenas/secuencias 5, 7, y 9 pueden unirse entre sí en tándem para formar la cadena/secuencia 12. Alternativamente, un constructo de ARNi de NtHMA comprende "una secuencia sentido" 8, que se ubica corriente arriba y unida operativamente a "una secuencia espaciadora" 6, que se ubica corriente arriba y se une operativamente a "una secuencia complementaria inversa" 4. Las cadenas/secuencias 8, 6, y 4 pueden unirse entre sí en tándem para formar la cadena/secuencia 11. La cadena 12 es complementaria a la cadena 11. La cadena 11 25 es una cadena molde que puede transcribirse a un polinucleótido de ARNi de NtHMA 13. El polinucleótido de ARNi de NtHMA 13 forma una estructura de horquilla ("tallo-bucle-tallo"), en la cual el tallo 16 es una región complementaria que es el resultado de las interacciones intramoleculares por complementariedad de bases del polinucleótido de ARNi de NtHMA 15 y el bucle 17 representa una región no complementaria codificada por una secuencia espaciadora, tal como las cadenas/secuencias 6 o 7. 30
Cualquier polinucleótido de ARN de NtHMA de interés puede producirse mediante la selección de una adecuada composición de secuencias, tamaño del bucle, y longitud del tallo para producir el híbrido en horquilla del NtHMA. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del tallo de un híbrido en horquilla, incluye longitudes del tallo de 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 35 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos, y 600-700 nucleótidos. Un intervalo adecuado para diseñar las longitudes del bucle de un híbrido en horquilla, incluye longitudes del bucle de 4-25 nucleótidos, 25-50 nucleótidos, o más largas si la longitud del tallo del híbrido en horquilla es sustancial. En determinados contextos, las estructuras de horquillas con regiones híbridas más largas que 21 nucleótidos pueden promover un efectivo silenciamiento dirigido por el siARN, independientemente de la secuencia y la longitud del 40 bucle.
Los constructos de ARNi de NtHMA ilustrativos para regular negativamente el nivel de expresión del gen de NtHMA (sec. con núm. de ident.:1) y otros genes relacionados con NtHMA incluyen los siguientes:
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Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden un constructo de ARNi de NtHMA que comprende uno o más de: intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), intrón 6 (sec. con 50 núm. de ident.:14), exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24, exón 11 (sec. con núm. de ident.:25) e intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26), fragmentos de estos, y variantes de estos. 55
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), un fragmento del exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), un 60 fragmento del exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), un fragmento del exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), un fragmento del exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), un fragmento del exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), un fragmento del exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), un fragmento del exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), un fragmento del exón 8 (sec. con núm. 65 de ident.:19), exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), un fragmento del exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), exón 10
(sec. con núm. de ident.:23), un fragmento del exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), exón 11 (sec. con núm. de ident.:25), y un fragmento del exón 11 (sec. con núm. de ident.:25).
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA capaces de 5 autohibridar para formar una estructura en horquilla, en el cual el constructo de ARNi comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o la sec. con núm. de ident.:47; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del polinucleótido de ARNi de NtHMA que forma un bucle de la estructura en horquilla; y (c) una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en 10 la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que 15 comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA capaces de autohibridar para formar una estructura en horquilla, en el que el constructo de ARNi comprende (a) una primera secuencia que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o la sec. con núm. de ident.:47; (b) una segunda secuencia que codifica un elemento espaciador del polinucleótido de ARNi de NtHMA que forma un bucle de la estructura en horquilla; y (c) 20 una tercera secuencia que comprende una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia (sec. con núm. de ident.:46 o sec. con núm. de ident.:48), ubicada en la misma orientación que la primera secuencia, en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
25
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que comprende una primera secuencia que tiene una "similitud sustancial", o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3, o porciones de la sec. con núm. de ident.:3. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden un constructo de 30 ARNi de NtHMA que comprende una primera secuencia que tiene una "similitud sustancial," o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:47, o porciones de la sec. con núm. de ident.:47.
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que 35 comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que comprende una segunda secuencia que tiene una "similitud sustancial," o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), un fragmento del intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), un fragmento del intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), un fragmento del intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), 40 intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), un fragmento del intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), un fragmento del intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), un fragmento del intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), un fragmento del intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), un fragmento del intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), un fragmento del intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), intrón 10 45 (sec. con núm. de ident.:22), un fragmento del intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), un fragmento del intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26), y un fragmento del intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26). Alternativamente, la segunda secuencia del constructo de ARNi de NtHMA puede generarse aleatoriamente sin utilizar una secuencia de intrón derivada del gen de NtHMA (sec. con núm. de ident.:1). 50
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que comprende una tercera secuencia que tiene una "similitud sustancial," o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:46, o porciones de la sec. con núm. de ident.:46. Diversas modalidades 55 descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden un constructo de ARNi de NtHMA que comprende una tercera secuencia que tiene una "similitud sustancial," o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:48, o porciones de la sec. con núm. de ident.:48.
60
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden: un constructo de ARNi de NtHMA que comprende una tercera secuencia que tiene una "similitud sustancial," o que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia con una secuencia complementaria inversa seleccionada del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.:27 (exón 1), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:27 (exón 1), sec. con núm. de ident.:28 (exón 2), un 65 fragmento de la sec. con núm. de ident.:28 (exón 2), sec. con núm. de ident.:29 (exón 3), un fragmento de la sec.
con núm. de ident.:29 (exón 3), sec. con núm. de ident.:30 (exón 4), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:30 (exón 4), sec. con núm. de ident.:31 (exón 5), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:31 (exón 5), sec. con núm. de ident.:32 (exón 6), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:32 (exón 6), sec. con núm. de ident.:33 (exón 7), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:33 (exón 7), sec. con núm. de ident.:34 (exón 8), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:34 (exón 8), sec. con núm. de ident.:35 (exón 9), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:35 5 (exón 9), sec. con núm. de ident.:36 (exón 10), un fragmento de la sec. con núm. de ident.:36 (exón 10), sec. con núm. de ident.:37 (exón 11), y un fragmento de la sec. con núm. de ident.:37 (exón 11).
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden un constructo de ARNi de NtHMA que comprende: la sec. con núm. de ident.:38 ("secuencia/fragmento 10 sentido"), la segunda secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:39 ("secuencia/fragmento espaciador") y la tercera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:40 ("secuencia/fragmento antisentido").
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión de ARNi de NtHMA que comprenden un constructo de ARNi de NtHMA que comprende: la sec. con núm. de ident.:42 ("secuencia/fragmento 15 sentido"), la segunda secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:43 ("secuencia/fragmento espaciador"), y la tercera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:44 ("secuencia/fragmento antisentido").
Alternativamente, las secuencias descritas pueden utilizarse para construir diversos polinucleótidos de NtHMA que no forman estructuras en horquillas. Por ejemplo, un ARN de doble cadena de NtHMA, largo, puede formarse al (1) 20 transcribir una primera cadena del ADNc de NtHMA al unirse operativamente a un primer promotor, y (2) transcribir la secuencia complementaria inversa de la primera cadena del fragmento de ADNc de NtHMA al unirse operativamente a un segundo promotor. Cada cadena del polinucleótido de NtHMA puede transcribirse a partir del mismo vector de expresión, o a partir de vectores de expresión diferentes. El híbrido de ARN de NtHMA que tiene actividad de interferencia del ARN puede convertirse enzimáticamente a siARN para reducir los niveles de ARN de 25 NtHMA.
C. Vectores de expresión para reducir la expresión génica de NtHMA mediante cosupresión
Se proporcionan diversas composiciones y métodos para reducir los niveles de expresión endógenos de los 30 miembros de la familia génica de NtHMA al promover la cosupresión de la expresión génica de NtHMA. El fenómeno de co-supresión se produce como un resultado de introducir múltiples copias de un transgén en una célula vegetal huésped. La integración de múltiples copias de un transgén puede resultar en una expresión reducida del transgén y el gen diana endógeno. El grado de co-supresión depende del grado de identidad de secuencias entre el transgén y el gen objetivo endógeno. El silenciamiento tanto del gen endógeno como del transgén puede producirse por 35 metilación extensa de los loci silenciados (es decir, el promotor endógeno y el gen endógeno de interés) que puede impedir la transcripción. Alternativamente, en algunos casos, la co-supresión del gen endógeno y el transgén puede producirse mediante silenciamiento génico post transcripcional ("PTGS"), en el que los transcritos pueden producirse pero el aumento de las tasas de degradación impide la acumulación de transcritos. El mecanismo para la co-supresión mediante PTGS parece asemejarse a la interferencia por ARN, en que el ARN parece ser tanto un 40 iniciador importante como un objetivo en estos procesos, y puede estar mediado al menos en parte por la misma maquinaria molecular, posiblemente a través de la degradación de ARNm guiada por los ARN.
La co-supresión de los miembros de la familia génica de NtHMA puede lograrse mediante la integración de múltiples copias del ADNc de NtHMA o fragmentos de este, como transgenes, en el genoma de una planta de interés. La 45 planta huésped puede transformarse con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente al ADNc de NtHMA o fragmentos de este. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión para promover la co-supresión de genes endógenos de la familia de NtHMA que comprende: un promotor unido operativamente al ADNc de NtHMA identificado como Clon P6663 (sec. con núm. de ident.:3) o un fragmento de este, o ADNc de NtHMA identificado como Clon P6643 (sec. con núm. de ident.:47) o un fragmento de este. 50 Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a vectores de expresión para promover la co-supresión de genes endógenos de la familia de NtHMA que comprenden: un promotor unido operativamente al ADNc de NtHMA, o un fragmento de este, que tiene al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o sec. con núm. de ident.:47.
55
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA mediante la integración de múltiples copias de ADNc de NtHMA o un fragmento de este en el genoma de una planta, que comprende: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a la sec. con núm. de ident.:3, o un fragmento de esta; o la sec. con núm. de ident.:47, o un fragmento de esta. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a 60 métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA mediante la integración de múltiples copias de ADNc de NtHMA, o un fragmento de este, en el genoma de una planta, que comprenden: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a ADNc de NtHMA, o un fragmento de este, que tiene al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o la sec. 65 con núm. de ident.:47.
D. Vectores de expresión para reducir la expresión génica de NtHMA mediante la inhibición de la traducción por agentes antisentido
Se describen diversas composiciones y métodos para reducir el nivel de expresión endógeno de la familia génica de NtHMA mediante la inhibición de la traducción del ARNm de NtHMA. Una célula vegetal huésped puede 5 transformarse con un vector de expresión que comprende: un promotor unido operativamente a un ADNc de NtHMA o un fragmento de este, ubicado en una orientación antisentido con respecto al promotor para permitir la expresión de polinucleótidos de ARN que tienen una secuencia complementaria a una porción del ARNm de NtHMA. Diversos vectores de expresión para inhibir la traducción de ARNm de HMA comprenden: un promotor unido operativamente al ADNc de NtHMA identificado como Clon P6663 (sec. con núm. de ident.:3) o un fragmento de este; o ADNc de 10 NtHMA identificado como Clon P6643 (sec. con núm. de ident.:47) o un fragmento de este, en donde el ADNc de NtHMA, o el fragmento de este, se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor. Diversos vectores de expresión para inhibir la traducción de ARNm de HMA comprenden: un promotor unido operativamente a un ADNc de NtHMA, o un fragmento de este, que tiene al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o la sec. con núm. de ident.:47, 15 en donde el ADNc de NtHMA, o el fragmento de este, se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor. Las longitudes de los polinucleótidos de ARN de NtHMA antisentido pueden variar, incluidos 15-20 nucleótidos, 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 50-75 nucleótidos, 75-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, y 200-300 nucleótidos.
20
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA mediante la inhibición de la traducción de ARNm de NtHMA, que comprenden: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente al ADNc de NtHMA identificado como Clon P6663 (sec. con núm. de ident.:3) o un fragmento de este; o ADNc de NtHMA identificado como Clon P6643 (sec. con núm. de ident.:47) o un fragmento de este, en 25 donde el ADNc de NtHMA, o el fragmento de este, se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a métodos para reducir el nivel de expresión de genes endógenos de la familia de NtHMA mediante la inhibición de la traducción de ARNm de NtHMA, que comprenden: transformar una célula vegetal huésped con un vector de expresión que comprende un promotor unido operativamente a un ADNc de NtHMA, o un fragmento de este, que tiene al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 30 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:3 o la sec. con núm. de ident.:47, en donde el ADNc de NtHMA, o el fragmento de este, se ubica en orientación antisentido con respecto al promotor.
E. Otras composiciones y métodos para reducir la expresión génica de NtHMA 35
Los métodos para obtener variantes conservativas y más variantes divergentes de polinucleótidos y polipéptidos de NtHMA son conocidos por los expertos en la técnica. Cualquier planta de interés puede modificarse genéticamente mediante diversos métodos conocidos para inducir mutagénesis, que incluyen mutagénesis dirigida a un sitio, mutagénesis dirigida a un oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente, mutagénesis inducida por radiación, 40 y otros métodos equivalentes. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida a un sitio se describe en, por ejemplo, Smith (1985) "In vitro mutagenesis," Ann. Rev. Genet. 19:423-462, y referencias en él, tales como Botstein y Shortle (1985) "Strategies and Applications of in vitro Mutagenesis," Science 229:1193-1201; y en Carter (1986) "Site-directed mutagenesis," Biochem. J. 237:1-7. La mutagénesis dirigida por oligonucleótidos se describe en, por ejemplo, Zoller y Smith (1982) "Oligonucleotide-directed Mutagenesis using M13-derived Vectors: an Efficient and General 45 Procedure for the Production of Point mutations in any DNA Fragment," Nucleic Acids Res. 10:6487-6500. La mutagénesis que utiliza bases modificadas se describe en, por ejemplo, Kunkel (1985) "Rapid and Efficient Site-specific Mutagenesis without Phenotypic Selection," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, y en Taylor y otros (1985) "The Rapid Generation of Oligonucleotide-directed Mutations at High Frequency using Phosphorothioate-modified DNA," Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787. La mutagénesis que utiliza ADN híbrido con huecos se describe en, 50 por ejemplo, Kramer y otros (1984) "The Gapped Duplex DNA Approach to Oligonucleotide-directed Mutation Construction," Nucl. Acids Res. 12: 9441-9460). La mutagénesis por errores de apareamiento puntuales se describe en, por ejemplo, Kramer y otros (1984) "Point Mismatch Repair," Cell 38:879-887). La mutagénesis por rotura de la doble cadena se describe en, por ejemplo, Mandecki (1986) Oligonucleotide-directed Double-strand Break Repair in Plasmids of Escherichia coli: A Method for Site-specific Mutagenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181, y 55 en Arnold (1993) "Protein Engineering for Unusual Environments," Current Opinion in Biotechnology 4:450-455). La mutagénesis que utiliza cepas huésped con deficiencias en la reparación se describe en, por ejemplo, Carter y otros (1985) "Improved Oligonucleotide Site-directed Mutagenesis using M13 Vectors," Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443. La mutagénesis por síntesis génica total se describe en, por ejemplo, Nambiar y otros (1984) "Total Synthesis and Cloning of a Gene Coding for the Ribonuclease S Protein," Science 223: 1299-1301. El barajado de ADN se describe 60 en, por ejemplo, Stemmer (1994) "Rapid Evolution of a Protein in vitro by DNA Shuffling," Nature 370:389-391, y en Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In Vitro Recombination for Molecular Evolution," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Alternativamente, el direccionamiento a los genes de NtHMA puede ser por inactivación al introducir transposones 65 (por ejemplo, elementos IS) en los genomas de plantas de interés. Estos elementos genéticos móviles pueden
introducirse por fecundación cruzada sexual y los mutantes por inserción pueden tamizarse para determinar la pérdida de la actividad de NtHMA, tal como una reducción del transporte de Cd. El gen de NtHMA interrumpido en una planta parental puede introducirse en otras plantas al cruzar la planta parental con una planta no sujeta a mutagénesis inducida por transposones mediante, por ejemplo, fecundación cruzada sexual. Puede utilizarse cualquier técnica de mejoramiento estándar conocida por los expertos en la técnica. En una modalidad, uno o más 5 genes relacionados con NtHMA pueden inactivarse mediante la inserción de uno o más transposones. Las mutaciones pueden resultar en interrupción homocigota de uno o más genes de NtHMA, en interrupción heterocigota de uno o más genes de NtHMA, o una combinación de ambas interrupciones homocigota y heterocigota si se interrumpe más de un gen de NtHMA. Los elementos transponibles adecuados pueden seleccionarse de dos amplias clases, designadas como Clase I y Clase II. Los elementos transponibles de Clase I adecuados incluyen 10 retrotransposones, retroposones, y elementos similares a SINE. Tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica como se describe en Kumar y Bennetzen (1999), Plant Retrotransposons in Annual Review of Genetics 33:479.
Alternativamente, el direccionamiento a los genes de NtHMA puede ser por inactivación mediante un método 15 referido como Direccionamiento a Lesiones Locales Inducidas en Genomas ("TILLING"), que combina mutaciones puntuales de alta densidad con detección rápida y sensible de las mutaciones. Típicamente, las semillas de las plantas se exponen a mutágenos, tales como etilmetanosulfonato (EMS) o EMS alquilatos guanina, lo que conduce típicamente a errores de apareamiento. Los agentes y métodos adecuados son conocidos por los expertos en la técnica como se describe en McCallum y otros, (2000), "Targeting Induced Local Lesions IN Genomics (TILLING) for 20 Plant Functional Genomics," Plant Physiology 123:439-442; McCallum y otros, (2000) "Targeted screening for induced mutations," Nature Biotechnology 18:455-457; y Colbert y otros, (2001) "High-Throughput Screening for Induced Point Mutations," Plant Physiology 126:480-484.
Alternativamente, el direccionamiento a los genes de NtHMA puede ser por inactivación al introducir ribozimas 25 derivadas a partir de un número de ARN circulares pequeños que son capaces de autoescisión y replicación en plantas. Estos ARN pueden replicarse lo mismo solos (ARN viroides) o con un virus auxiliar (ARN satélites). Los ejemplos de ARN adecuados incluyen los derivados del viroide del veteado marrón rojizo del aguacate y ARN satélites derivados de virus de la mancha de anillo del tabaco, virus del veteado transitorio de la alfalfa, virus del moteado del tabaco suave, virus del moteado nodoso de flor del género Solanum, y virus del moteado del trébol 30 subterráneo. Diversas ribozimas específicas para el ARN diana son conocidas por los expertos en la técnica como se describe en Haseloff y otros (1988) Nature, 334:585-591.
III. Plantas transgénicas, líneas celulares, y semillas que comprenden polinucleótidos de ARNi de NtHMA y métodos relacionados 35
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a plantas transgénicas genéticamente modificadas para reducir el nivel de expresión génica de NtHMA mediante diversos métodos que se pueden utilizar para silenciar la expresión génica de NtHMA, y de esa manera, producir plantas transgénicas en las cuales el nivel de expresión de los transportadores de NtHMA puede reducirse dentro de los tejidos vegetales de interés. Las tasas de transporte de 40 metales pesados y los patrones de distribución del transporte de metales pesados, en particular, el transporte de cadmio, puede alterarse en plantas transgénicas producidas de acuerdo con los métodos descritos y composiciones. Las plantas adecuadas para la modificación genética incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas.
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a plantas transgénicas de tabaco genéticamente 45 modificadas para reducir el nivel de expresión génica de NtHMA mediante diversos métodos, conocidos por los expertos en la técnica, que pueden utilizarse para regular negativamente la expresión génica de NtHMA, y de esa manera, producir plantas transgénicas de tabaco en las cuales el nivel de expresión de transportadores de NtHMA puede reducirse dentro de los tejidos vegetales de interés. Se han proporcionado diversos vectores de expresión para producir líneas transgénicas de tabaco de cualquier variedad que muestran reducción de los niveles de 50 expresión génica de NtHMA. Las composiciones y métodos descritos pueden aplicarse a cualquier especie de plantas de interés, que incluye plantas del género Nicotiana, diversas especies de Nicotiana, que incluyen N. rustica y N. tabacum (por ejemplo, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, y Petico). Otras especies incluyen N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. 55 cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. 60 spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides, y N. x sanderae. Las plantas adecuadas para la transformación incluyen cualquier tejido vegetal capaz de transformación mediante diversos métodos para transformar plantas que conocen los expertos en la técnica, que incluyen electroporación, bombardeo de microproyectiles, y transferencia mediada por Agrobacterium como se describe, por ejemplo, en la patente de 65 Estados Unidos núm. 4,459,355 que describe un método para transformar plantas susceptibles, que incluyen
dicotiledóneas, con una cepa de Agrobacterium que contiene un plásmido Ti; patente de Estados Unidos núm. 4,795,855 que describe la transformación de plantas leñosas con un vector de Agrobacterium; patente de Estados Unidos núm. 4,940,838 que describe un vector binario de Agrobacterium; patente de Estados Unidos núm. 4,945,050; y patente de Estados Unidos núm. 5,015,580.
5
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a plantas transgénicas de tabaco genéticamente modificadas para expresar exógenamente un constructo de ARNi que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA que facilitan la degradación de transcritos de ARN de NtHMA, y consecuentemente, que reduce la cantidad de transcritos de ARN disponibles para la traducción a transportadores de NtHMA. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a plantas transgénicas que comprenden un vector de expresión que permite la expresión de 10 polinucleótidos de NtHMA producidos de acuerdo con los métodos descritos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a líneas celulares derivadas de plantas transgénicas producidas de acuerdo con los métodos descritos. Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a semillas transgénicas derivadas de plantas transgénicas producidas de acuerdo con los métodos descritos.
15
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a métodos para reducir los niveles de expresión génica de NtHMA en plantas, el método comprende reducir el nivel de expresión de un gen de NtHMA, que puede acompañarse por diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Como ejemplos, esta descripción describe: (1) método de interferencia por ARN para reducir el nivel de estado estable de variantes endógenas de ARN de NtHMA disponibles para la traducción mediante expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA; (2) 20 método de co-supresión para reducir la transcripción de gen(es) de NtHMA mediante la integración de múltiples copias del ADNc de NtHMA o fragmentos de este, como transgenes, en el genoma de una planta; (3) método antisentido para reducir la traducción de NtHMA mediante la expresión de polinucleótidos antisentido que pueden dirigirse al ARN de NtHMA; y (4) diversos métodos para inducir mutagénesis.
25
Diversas modalidades descritas en la presente se dirigen a plantas transgénicas de tabaco genéticamente modificadas para reducir el nivel de expresión génica de NtHMA mediante diversos métodos, conocidos por los expertos en la técnica, y modificadas además para reducir la expresión de un segundo gen de interés endógeno (es decir, no relacionado con NtHMA) o para potenciar la expresión de un gen de interés exógeno (es decir, no relacionado con NtHMA). Por ejemplo, la regulación negativa de un segundo gen de interés endógeno que codifica 30 una enzima implicada en la biosíntesis de alcaloides puede ser conveniente. En otras situaciones, la potenciación en el nivel de expresión de un transgén que codifica una proteína de interés recombinante, tal como una hormona humana para uso terapéutico, puede ser conveniente. Los expertos en la técnica son capaces de producir diversas plantas transgénicas que pueden modificarse, por ejemplo, para expresar exógenamente polinucleótidos de ARNi de NtHMA y al menos un producto génico de interés recombinante, tal como un factor de crecimiento humano 35 recombinante o polinucleótidos de ARNi que pueden dirigirse a un segundo gen de interés no relacionado con la familia de NtHMA.
La producción de plantas transgénicas de acuerdo con los métodos descritos proporciona una serie de ventajas. Las plantas transgénicas, que incluyen plantas transgénicas de tabaco, pueden cultivarse en suelos que contienen 40 concentraciones variables de Cd, o en suelos que contienen concentraciones de Cd menores que las deseadas. Estas plantas y las semillas derivadas pueden proporcionar más opciones para cultivarlas en una variedad más amplia de ambientes de suelo, lo que puede aumentar la cantidad de suelos cultivables disponibles para los profesionales (por ejemplo, agricultores). Además, estas plantas transgénicas, que muestran reducción del contenido de Cd, en comparación con sus contrapartes no transgénicas pueden consumirse directamente como 45 productos comestibles. El consumo de porciones comestibles de estas plantas transgénicas puede ser una opción más saludable en comparación con el consumo de sus contrapartes no transgénicas. Las plantas adecuadas que pueden modificarse genéticamente de acuerdo con los métodos descritos, incluyen plantas cultivables para su uso en la agricultura, que incluyen arroz, maíz, calabaza, soja, lechuga, patata, batidos, hierbas, trigo, cebada, zanahorias, etcétera. El % de reducción de Cd en estas plantas transgénicas, que incluye la porción de la lámina 50 foliar, puede ser aproximadamente al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % y 99 %, cuando se compara con las contrapartes no transgénicas. El contenido de Cd de estas plantas transgénicas, que incluye la porción de la lámina foliar, es un valor de un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a 55 aproximadamente 1,0 ppm, y de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
IV. Productos consumibles que incorporan hojas de tabaco genéticamente modificadas para contener un contenido de Cd reducido
60
Diversas modalidades descritas en la presente proporcionan plantas transgénicas, en las cuales el nivel de expresión de los miembros de la familia génica de NtHMA está sustancialmente reducido para restringir o impedir el transporte de Cd hacia la lámina foliar. La lámina foliar derivada de plantas transgénicas de tabaco, producidas de acuerdo con los métodos descritos, puede incorporarse a diversos productos de consumo que contienen Cd a un nivel sustancialmente por debajo del de productos de consumo obtenidos mediante incorporación de hojas de 65 tabaco derivadas de plantas del mismo genotipo que se cultivaron en condiciones idénticas, pero no genéticamente
modificadas con respecto a la reducción del nivel de expresión de los miembros de la familia génica de NtHMA ("contrapartes no transgénicas").
En algunas modalidades descritas en la presente, estas plantas transgénicas que muestran reducción del contenido de Cd en comparación con las contrapartes no transgénicas pueden incorporarse a productos de consumo, que 5 incluyen diversos artículos para fumar, tales como puros, cigarrillos, y productos de tabaco sin humo (es decir, no combustible). Los artículos para fumar y los productos de tabaco sin humo, producidos mediante la incorporación de hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener una reducción de los niveles de Cd de acuerdo con los métodos descritos, pueden proporcionar opciones más saludables en comparación con las contrapartes no transgénicas. 10
Los productos de tabaco sin humo que incorporan plantas de tabaco genéticamente modificadas de acuerdo con los métodos descritos pueden fabricarse en cualquier formato adecuado para la comodidad en la cavidad bucal de un consumidor. Los productos de tabaco sin humo contienen tabaco en cualquier forma, que incluye partículas secas, fragmentos, gránulos, polvos, o una suspensión (es decir, extractos de tabaco), depositados, mezclados, rodeados 15 por, o combinados de cualquier otra manera con otros ingredientes en cualquier formato, tal como hojuelas, capas, lengüetas, espumas o perlas. Los productos de tabaco sin humo pueden envolverse con un material, que puede ser comestible (es decir, que puede desintegrarse oralmente) o no comestible. Los contenidos líquidos de los productos de tabaco sin humo pueden encerrarse en una forma, tal como perlas, para impedir la interacción con una envoltura soluble en agua. La envoltura puede tener forma de bolsa para encerrar parcial o completamente las composiciones 20 que incorporan el tabaco, o para funcionar como un adhesivo para contener una pluralidad de lengüetas, perlas, u hojuelas de tabaco. Una envoltura puede encerrar, además, una composición de tabaco moldeable que se adapta a la forma de la boca de un consumidor. Una envoltura que puede desintegrarse oralmente puede encerrar tabaco sin humo, por ejemplo, como rapé seco o tabaco soluble, y puede conformarse en un equipo de termoformación continua o conformación/llenado/sellado horizontal u otro equipo de empaque adecuado con el uso de capas 25 comestibles (que pueden contener tabaco o no). Los materiales ilustrativos para construir una envoltura incluyen composiciones de capas que comprenden HPMC, CMC, pectina, alginatos, pululano, y otros polímeros formadores de capas comestibles, comercialmente viables. Otros materiales de envoltura pueden incluir cápsulas previamente formadas producidas a partir de gelatina, HPMC, almidón/carragenina, u otros materiales comercialmente disponibles. Tales materiales de envoltura pueden incluir tabaco como un ingrediente. Las envolturas que no se 30 desintegran oralmente pueden componerse de telas tejidas o no tejidas, de papel recubierto o no recubierto, o de capas plásticas perforadas o porosas de cualquier otra manera. Las envolturas pueden incorporar agentes saborizantes y/o colorantes. Los productos sin humo pueden ensamblarse junto con una envoltura con la utilización de cualquier método conocido por los expertos en la técnica de empaques comerciales, que incluye métodos tales como el empaque de ampolla y el empaque en barras, en el cual puede formarse un pequeño empaque mediante 35 una máquina de empaque de conformación/llenado/sellado vertical.
El % de reducción de Cd en estos artículos para fumar y productos sin humo, producidos mediante la incorporación de hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener una reducción de los niveles de Cd, es un valor de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 40 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 %, cuando se compara con productos de consumo derivados de las contrapartes no transgénicas. En algunas modalidades descritas en la presente, el contenido de Cd de estos artículos para fumar y productos sin humo, producidos mediante la incorporación de hojas de tabaco derivadas de plantas de tabaco genéticamente modificadas para contener una reducción de los niveles de Cd, es un valor que está en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 45 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, y de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
El grado de acumulación de Cd en las plantas puede variar sustancialmente en dependencia de varios parámetros 50 atribuidos a la complejidad del genotipo y al ambiente de cultivo. Por ejemplo, las concentraciones de Cd en hojas de tabaco cultivado en el campo pueden variar mucho en dependencia de factores tales como el agroclima, los parámetros del suelo y los cultivares. Además, los patrones relativos de la distribución de Cd dentro de diferentes porciones de una planta de tabaco pueden variar de acuerdo con la especie, el órgano/tejido, y las condiciones de cultivo (es decir, cultivado en el campo vs. cultivado en hidropónico). Como promedio, las concentraciones de Cd 55 medidas en hojas de tabaco cultivado en el campo (que incluyen nervios centrales y venas) pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 5 ppm (partes por millón, o µg/g de peso seco de hojas de tabaco). Sin embargo, muchos niveles de Cd publicados típicamente no definen la etapa de madurez del tabaco, la variedad de tabaco, o las porciones foliares particulares (es decir, remoción a partir de la posición del tallo de la hoja) cosechadas para el análisis. En algunas variedades, las hojas inferiores pueden acumular niveles de Cd más altos 60 que las hojas medias y superiores. A nivel intracelular, el Cd puede encontrarse en diversos componentes celulares de una célula vegetal, que incluyen la pared celular, citoplasma, cloroplastos, núcleo y vacuolas.
Además, el contenido de Cd medido en las hojas de tabaco puede variar sustancialmente en dependencia de los niveles de Cd en el ambiente del suelo donde las plantas de tabaco se cultivaron. Las hojas de tabaco cultivadas en 65 zonas contaminadas con Cd pueden acumular Cd de aproximadamente 35 ppm o superior, en comparación con las
hojas de las contrapartes genéticamente idénticas cultivadas en zonas no contaminadas, que pueden acumular Cd en un intervalo de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 8 ppm. Las vacuolas dentro de las hojas de plantas cultivadas en zonas contaminadas con Cd pueden acumular concentraciones de Cd muy altas. Los métodos para modificar las composiciones descritas para que sean adecuadas para una determinada especie de planta de interés son conocidos por los expertos en la técnica. 5
Los siguientes aspectos caracterizan adicionalmente la presente descripción:
1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en:
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de 10 secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B;
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 3;
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de 15 secuencia con la sec. con núm. de ident.: 47;
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; y
un polinucleótido que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al 20 menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B.
2. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado de acuerdo con el aspecto 1.
25
3. Una planta transgénica obtenida mediante un proceso que comprende introducir el polinucleótido aislado de acuerdo con el aspecto 1 o el vector de expresión de acuerdo con el aspecto 2.
4. Una línea celular obtenida mediante un proceso que comprende introducir el polinucleótido aislado de acuerdo con el aspecto 1 o el vector de expresión de acuerdo con el aspecto 2. 30
5. Un producto de tabaco consumible que incorpora hojas cosechadas de la planta transgénica de acuerdo con el aspecto 3.
6. Un constructo de ARNi de NtHMA capaz de inhibir la expresión de un ARN mensajero de NtHMA al que 35 corresponde, el constructo comprende o consiste en:
una primera secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con una porción de la sec. con núm. de ident.:3 o 47;
una segunda secuencia; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en 40 la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia.
7. El constructo de ARNi de NtHMA de acuerdo con el aspecto 6, en donde: 45
(a) la primera secuencia tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), un fragmento del exón 1 (sec. con núm. de ident.:5), exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), un fragmento del exón 2 (sec. con núm. de ident.:7), exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), un fragmento del exón 3 (sec. con núm. de ident.:9), exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), un fragmento del exón 4 (sec. con núm. de ident.:11), exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), 50 un fragmento del exón 5 (sec. con núm. de ident.:13), exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), un fragmento del exón 6 (sec. con núm. de ident.:15), exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), un fragmento del exón 7 (sec. con núm. de ident.:17), exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), un fragmento del exón 8 (sec. con núm. de ident.:19), exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), un fragmento del exón 9 (sec. con núm. de ident.:21), exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), un fragmento del exón 10 (sec. con núm. de ident.:23), exón 11 (sec. con núm. de 55 ident.:25), y un fragmento del exón 11 (sec. con núm. de ident.:25);
(b) la segunda secuencia tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), un fragmento del intrón 1 (sec. con núm. de ident.:4), intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), un fragmento del intrón 2 (sec. con núm. de ident.:6), intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), un fragmento del intrón 3 (sec. con núm. de ident.:8), intrón 4 (sec. con 60 núm. de ident.:10), un fragmento del intrón 4 (sec. con núm. de ident.:10), intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), un fragmento del intrón 5 (sec. con núm. de ident.:12), intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), un fragmento del intrón 6 (sec. con núm. de ident.:14), intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), un fragmento del intrón 7 (sec. con núm. de ident.:16), intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), un fragmento del intrón 8 (sec. con núm. de ident.:18), intrón 9 (sec. con núm. de ident.:20), un fragmento del intrón 9 (sec. con núm. de 65 ident.:20), intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22), un fragmento del intrón 10 (sec. con núm. de ident.:22),
intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), un fragmento del intrón 11 (sec. con núm. de ident.:24), intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26), y un fragmento del intrón 12 (sec. con núm. de ident.:26);
(c) la tercera secuencia tiene al menos 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: sec. con núm. de ident.:27, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:27, sec. con núm. de ident.:28, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:28, sec. con núm. de 5 ident.:29, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:29, sec. con núm. de ident.:30, un fragmento de sec. con núm. de ident.:30, sec. con núm. de ident.:31, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:31, sec. con núm. de ident.:32, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:32, sec. con núm. de ident.:33, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:33, sec. con núm. de ident.:34, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:34, sec. con núm. de ident.:35, un fragmento de la sec. con núm. de ident.:35, sec. con núm. de ident.:36, un 10 fragmento de la sec. con núm. de ident.:36, sec. con núm. de ident.:37, y un fragmento de la sec. con núm. de ident.:37;
(d) la primera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:38, la segunda secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:39, y la tercera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:40;
(e) la primera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:42, la segunda secuencia comprende la sec. 15 con núm. de ident.:43, y la tercera secuencia comprende la sec. con núm. de ident.:44; o
(f) uno o dos o tres de (a), (b), (c), (d) y (e).
8. El constructo de ARNi de NtHMA de acuerdo con el aspecto 6, en donde cada una de la primera y la segunda secuencia tiene una longitud seleccionada del grupo que consiste en 20-30 nucleótidos, 30-50 nucleótidos, 20 50-100 nucleótidos, 100-150 nucleótidos, 150-200 nucleótidos, 200-300 nucleótidos, 300-400 nucleótidos, 400-500 nucleótidos, 500-600 nucleótidos, y 600-700 nucleótidos.
9. Una planta transgénica que comprende el ARNi de acuerdo con cualquiera de los aspectos 6 - 8 que tiene una reducción de los niveles de Cd en al menos una parte de la planta en comparación con la parte en una 25 contraparte no transgénica.
10. Un producto de tabaco consumible que incorpora hojas cosechadas de la planta transgénica de acuerdo con el aspecto 9.
30
11. El producto de acuerdo con el aspecto 10, en donde un % de reducción de Cd es un valor de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.
12. El producto de acuerdo con el aspecto 10 o el aspecto 11, en donde el contenido de Cd es un valor que está 35 en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
13. Un método para reducir los niveles de Cd en al menos una parte de una planta, que comprende: 40
reducir los niveles de un ARNm de NtHMA en la planta al provocar la expresión de un constructo de ARNi.
14. El método de acuerdo con el aspecto 13, en donde el constructo de ARNi comprende:
una primera secuencia que tiene al menos 90 % de identidad de secuencia con una porción de la sec. con núm. de ident.:3 o 47; 45
una segunda secuencia; y
una tercera secuencia que tiene una secuencia complementaria inversa de la primera secuencia, ubicada en la misma orientación que la primera secuencia,
en donde la segunda secuencia se ubica entre la primera secuencia y la tercera secuencia, y la segunda secuencia se une operativamente a la primera secuencia y a la tercera secuencia. 50
15. El método de acuerdo con el aspecto 13 o el aspecto 14, en donde después de la expresión del constructo de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd reducido en al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 %. 55
16. El método de acuerdo con cualquiera de los aspectos 13 a 15, en donde después de la expresión del constructo de ARNi, la parte de la planta tiene un contenido de Cd que está en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,05 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 ppm, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 60 1,0 ppm, o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 ppm.
17. Un polipéptido sustancialmente purificado que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia, o al menos 95 % de identidad de secuencia, con la sec. con núm. de ident.:2 o 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B. 65
18. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido como se define en los aspectos 17, tal como un polipéptido que comprende o que consiste en la sec. con núm. de ident.:2 o 49.
Ejemplos
5
Ejemplo 1
Clonación y mapeo de exones de un clon genómico de NtHMA de Nicotiana de longitud completa
Dos clones genómicos parciales que representan diferentes porciones de un gen de NtHMA endógeno se 10 identificaron independientemente, referidos como "CHO_OF96xf01.ab1" y "CHO_OF261xo09c1.ab1." En base a la información de secuencia obtenida de los clones genómicos parciales, un clon genómico de longitud completa (_HO-18-2) y 4 ADNc de NtHMA de longitud completa se identificaron posteriormente, incluido el clon P6663 (sec. con núm. de ident.:3) y el clon P6643 (sec. con núm. de ident.:47). Las subregiones de exones e intrones del clon genómico de longitud completa (_HO-18-2) (17 921 pb) se mapearon. Como se muestra en la Figura 1, el gen de 15 NtHMA endógeno de longitud completa clonado de Nicotiana comprende 11 exones que consisten en 3392 nucleótidos en total.
Ejemplo 2 (Referencia)
20
Construcción del vector de expresión de ARNi de NtHMA
PBI121-NtHMA (660-915) que codifica polinucleótidos de ARNi
La Tabla 1 proporciona una lista de las posiciones de nucleótidos mapeadas para cada exón dentro del clon 25 genómico de NtHMA aislado (sec. con núm. de ident.: 1).
Tabla 1
30
35
40
El clon genómico parcial CHO_OF96xf01.ab1 incluye una parte del intrón 4, exón 4, intrón 5, exón 5, intrón 6, y una parte del exón 6, como se muestra en la Figura 1, y se enumera en la Tabla 1. El clon genómico parcial 45 CHO_OF261xo09c1 incluye una parte del intrón 7, exón 7, intrón 8, exón 8, y una parte del exón 9, como se muestra en la Figura 1. Para producir plantas transgénicas que puedan producir establemente polinucleótidos de ARNi de NtHMA recombinantes de interés que pueden facilitar la degradación de transcritos de ARN endógenos que codifican polipéptidos de NtHMA, se obtuvieron dos conjuntos de vectores de expresión de ARNi de NtHMA, el vector de expresión de ARNi PBI121-NtHMA (660-915) como se describe en más detalle más adelante, y el vector 50 de expresión de ARNi PBI121-NtHMA (1382-1584) como se describe en más detalle en el Ejemplo 3.
La Figura 2 muestra una estrategia de subclonación ilustrativa para construir un vector de expresión de ARNi de NtHMA que permite la expresión constitutiva de polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. En base al mapeo de exones y al análisis de secuencia del clon genómico CHO_OF96xf01.ab1, se diseñaron los constructos de ARNi. 55
La Figura 3A muestra una secuencia de ARNi ilustrativa, NtHMA (660-915), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. En la Figura 3A, el constructo de ARNi de NtHMA (sec. con núm. de ident.: 41) comprende un fragmento sentido (272 pb) (sec. con núm. de ident.:38) compuesto del exón 4 (272 pb), que se ubica corriente arriba y unido operativamente a un fragmento espaciador (80 pb) (sec. con núm. de ident.:39) compuesto del intrón 60 5, que se ubica corriente arriba y unido operativamente a un fragmento complementario inverso (272 pb) (sec. con núm. de ident.:40) compuesto del exón 4 ubicado en la orientación antisentido. Los constructos de ARNi que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés se insertaron en el vector de clonación PBKCMV, y se situaron corriente abajo y unidos operativamente a un promotor de citomegalovirus (CMV). Se incorporaron sitios XbaI e HindIII en los extremos 5′ y 3′ del fragmento sentido de NtHMA de 352 pb, que incluyó el fragmento intrónico 65 con 80 pb mediante la utilización de cebadores de PCR modificados para incorporar estos sitios de enzimas de
restricción (PMG783F: ATTCTAGACTGCTGCTATGTCATCACTGG [sec. con núm. de ident.: 50] y PMG783R: ATAAGCTTAGCCTGAAGAATTGAGCAAA [sec. con núm. de ident.: 51]). De manera similar, los sitios SpeI y SacI se incorporaron en los extremos 5′ y 3′ del fragmento complementario inverso de NtHMA correspondiente mediante la utilización de cebadores de PCR (PMG 785F: ATGAGCTCTGGTTATGTAGGCTACTGCTGCT [sec. con núm. de ident.: 52] y PMG 786R: ATACTAGTATTTGTAGTGCCAGCCCAGA [sec. con núm. de ident.: 53]) para producir el 5 plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA se construyeron mediante (a) la escisión del ORF de la β-glucuronidasa del vector de expresión binario ("pBI121" de CLONTECH), y (b) la sustitución del constructo de ARNi de NtHMA, escindido del plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA, en los sitios XbaI/SacI del plásmido PBI121 en lugar del ORF de la β-glucuronidasa eliminado. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA comprenden: (i) un fragmento sentido de NtHMA XbaI–HindIII de 352 pb que incluye (ii) 10 fragmento intrónico de 80 pb, unido operativamente al (iii) fragmento complementario inverso de NtHMA SpeII–SacI de 272 pb.
Ejemplo 3 (Referencia)
15
Construcción del vector de expresión de ARNi de NtHMA PBI121-NtHMA (1382-1584) que codifica polinucleótidos de ARNi
La Figura 4A muestra una secuencia de ARNi ilustrativa, NtHMA (1382-1584), para producir polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés. En base al mapeo de exones y el análisis de secuencia del clon genómico 20 CHO_OF261xo09c1, se diseñó un constructo de ARNi (sec. con núm. de ident.: 41) que incluye un fragmento sentido (191 pb) (sec. con núm. de ident.:42) que comprende secuencias del exón 7, que se ubica corriente arriba y unido operativamente a un fragmento espaciador de ADN (139 pb) (sec. con núm. de ident.:43) que comprende secuencias del intrón 8, que se ubica corriente arriba y unido operativamente a un fragmento complementario inverso (196 pb) (sec. con núm. de ident.:44) que comprende secuencias del exón 7 ubicadas en orientación 25 antisentido. Estos constructos de ARNi que codifican polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés se insertaron en el vector de clonación PBKCMV, y se situaron corriente abajo y unidos operativamente a un promotor de citomegalovirus (CMV). Los sitios XbaI e HindIII se incorporaron en los extremos 5′ y 3′ del fragmento sentido de NtHMA de 330 pb, que incluyó el fragmento intrónico de 139 pb mediante la utilización de cebadores de PCR modificados para incorporar estos sitios de enzimas de restricción (PMG754F: 30 ATTCTAGATGAGAGCAAGTCAGGTCATCC [sec. con núm. de ident.: 54] y PMG754R: ATAAGCTTTTCAAACATCCACCGCATTA [sec. con núm. de ident.: 55]). De manera similar, los sitios PstI y SacI se incorporaron en los extremos 5′ y 3′ del fragmento complementario inverso de NtHMA correspondiente mediante la utilización de los cebadores de PCR PMG757F: ATGAGCTCGCATTGAGAGCAAGTCAGGTC [sec. con núm. de ident.: 56] y PMG757R: ATCTGCAGCCTGTGGTACATCCAGCTCTT [sec. con núm. de ident.: 57]) para producir el 35 vector de expresión de ARNi PBKCMV-NtHMA.
Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA se construyeron mediante (a) la escisión del ORF de la β-glucuronidasa del vector de expresión binario ("pBI121" de CLONTECH), y (b) la sustitución del constructo de ARNi de NtHMA, escindido del plásmido de ARNi PBKCMV-NtHMA, en los sitios XbaI/SacI del plásmido PBI121 en lugar 40 del ORF de la β-glucuronidasa eliminado. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA comprenden: (i) un fragmento sentido de NtHMA XbaI–HindIII de 330 pb que incluye (ii) un fragmento intrónico de 139 pb, unido operativamente al (iii) fragmento complementario inverso de NtHMA SpeII–SacI de 196 pb. Los vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA, tales como los descritos en los Ejemplos 2 y 3, pueden introducirse en cualquier célula vegetal huésped de interés mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. 45
Ejemplo 4 (Referencia)
Transformación de las variedades de tabaco Burley (TN90), curado con humo (K326), y oscuro (VA359) con vectores de expresión de ARNi de NtHMA 50
Semillas de tabaco de tres variedades diferentes, Burley (TN90), curado con humo (K326), y oscuro (VA359), se esterilizaron y germinaron en una placa de Petri que contenía medio basal MS suplementado con la mezcla de preservantes para plantas (PPM) a 5 ml/L. Las plántulas, aproximadamente a los 7 a 10 días ´posteriores a la germinación, se seleccionaron para la transformación con diversos vectores de expresión de ARNi de NtHMA. Una 55 sola colonia de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 se inoculó en un medio LB líquido que contenía kanamicina a 50 mg l−1 (mono sulfato de kanamicina), y se incubaron durante 48 h a 28°C con agitación recíproca (150 ciclos min−1). Las células bacterianas cultivadas se recogieron mediante centrifugación (6000×g, 10 min), y se suspendieron a una densidad final de 0,4-0,7 OD600, con 20 ml de medio MS líquido que contenía sacarosa a 20 g−1. Los explantes de plántula de 7 a 10 días se sumergieron en una suspensión bacteriana durante 5 mins, y se 60 transfirieron a papeles de filtro estériles. Cincuenta explantes se colocaron en alícuotas de 40 ml de medio de agar de REG (medio basal MS suplementado con NAA a 0,1 mg l−1 y BAP a 1 mg l−1) en placas Petri de 100 mm X 20 mm. Los explantes se cocultivaron con Agrobacterium a 25 °C. Después de 3 días de cocultivo, los explantes se lavaron y se transfirieron a medio RCPK (medio REG con kanamicina a 100 mg-1, carbenicilina a 500 mg l−1, y 5 ml de PPM) para seleccionar los transformantes. Los explantes se subcultivaron cada 2 semanas. Después de 8-12 65 semanas de cultivo en condiciones selectivas, las plantas supervivientes, que representan los transformantes que
han integrado los constructos de expresión de ARNi de NtHMA en sus genomas, se transfirieron a un medio de enraizamiento (medio basal MS suplementado con kanamicina a 100 mg l−1). Las plantas con raíces se transfirieron a macetas para promover un crecimiento adicional.
Ejemplo 5 (Referencia)
5
Reducción de Cd en la lámina foliar de los transgénicos de la primera generación modificadas genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA sobre el transporte de Cd de la raíz a las porciones aéreas de las plantas transgénicas, los niveles de Cd se determinaron para varias líneas 10 transgénicas que se han modificado genéticamente para expresar los polinucleótidos de NtHMA (660-915) o los de ARNi (1382-1584).
Aproximadamente 40 plantas transgénicas independientes, que representan tres variedades de tabaco, se transformaron con diversos vectores de expresión de ARNi PBI121-NtHMA. Inicialmente, los transformantes se 15 cultivaron en bandejas flotantes que contenían medio Hoaglands durante 4 semanas. Las plantas positivas por PCR para NPT II se seleccionaron y se sembraron en macetas de 10” con un sistema hidropónico que contenía medio Hoaglands que contenía CdCl2 5 µM. Después de 4-8 semanas, dos muestras de hojas medias se cosecharon y se liofilizaron para el análisis de metales, o se congelaron en nitrógeno líquido para el análisis de la expresión génica. Se pesaron aproximadamente 500 mg de tabaco y se digirieron en 10 ml de HNO3 concentrado mediante un 20 sistema de reacción acelerado por microondas, sistema de digestión 5 (CEM corporation, Mathews, NC). Las concentraciones de los metales pesados se analizaron mediante el uso de espectrofotometría de masa plasma acoplada de manera inductiva ("ICP-MS," Agilent 7500A; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Como control de tabaco no transgénico, una muestra que consistió en hojas de tabaco Virginia, certificado en polonia, CTA-VTL-2, se preparó en condiciones comparables (Dybczynski y otros, 1997). 25
Las Figuras 3B-3D muestran reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de la primera generación (T0), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). En cada gráfico, la unidad del eje y es μg/mg de tejido.
30
Las Figuras 4B-4D muestran reducción de Cd en la lámina foliar de múltiples líneas transgénicas de la primera generación (T0), que representan tres variedades, que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584). En cada gráfico, la unidad del eje y es μg/mg de tejido.
Ejemplo 6 (Referencia) 35
Reducción en transcritos de ARN de NtHMA en hojas de tabaco transgénico mediante la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA sobre los niveles de estado estable 40 de los transcritos endógenos de ARN de NtHMA, el cambio relativo en los transcritos de ARN de NtHMA se midió mediante aislamiento del ARN celular total de porciones de la lámina foliar de diversas líneas transgénicas, que representan tres variedades de tabaco.
El ARN total se aisló de las hojas medias de plantas T0 mediante el uso del reactivo TRI® Reagent (Sigma-Aldrich, 45 St. Louis, MO). Para eliminar las impurezas de ADN, el ARN purificado se trató con DNAasa libre de RNAasa (TURBO ADN-free, Ambion, Austin TX). Para sintetizar la primera cadena de ADNc, aproximadamente 10 μg del ARN total se retrotranscribió con la utilización del kit High Capacity ADNc Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para medir el nivel de transcritos de NtHMA en las muestras, se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa de 2 etapas de acuerdo con la química basada en sondas Taqman MGB. La mezcla de RT contenía una mezcla de dNTP 50 4 μM, cebadores aleatorios 1X, tampón de RT 1X, 10 g de ADNc, 50U de transcriptasa inversa Multiscribe (Applied Biosystems), 2U del Inhibidor de ARNasa Superase-In (Ambion), y agua libre de nucleasas. La mezcla de PCR contenía la mezcla Taqman Universal PCR Master Mix 1X (Applied Biosystems, Foster City, CA), cebador directo 400 nM, cebador inverso 400 nM, sonda Taqman MGB 250 nM, 2 ng de ADNc, y agua libre de nucleasas. La RT-PCR se llevó a cabo con el uso de un sistema en tiempo real ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y en 55 condiciones de amplificación: 50°C durante 2 min.; 95°C durante 10 min.; 40 ciclos de 95°C durante 15 sec.; y 60°C durante 1 min. Para normalizar los niveles de transcritos de ARN de NtHMA medidos, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) se seleccionó como un transcrito de ARN endógeno de control, cuyo nivel de expresión no es sensible a la actividad de interferencia por ARN específica de la secuencia de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA en análisis. El cambio en veces en el nivel de transcritos de ARN de NtHMA provocado por la expresión de 60 polinucleótidos de ARNi de NtHMA se calculó mediante la determinación de la relación de (a)/(b), en la cual (a) representa el valor normalizado del nivel de transcritos de ARN de NtHMA determinado para muestras derivadas de plantas transgénicas transformadas con un vector de expresión de ARNi de NtHMA, y (b) representa el valor normalizado del nivel de transcritos de ARN de NtHMA determinado para muestras derivadas de plantas transgénicas transformadas con un vector de expresión control deficiente del constructo de ARNi de NtHMA. 65
Las Figuras 5A-C muestran los niveles normalizados de los transcritos de ARN de NtHMA en varias líneas transgénicas de la primera generación (T0) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se determina mediante análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de extractos de la lámina foliar. La Figura 5A muestra que para múltiples líneas transgénicas de K326 derivadas independientemente, los niveles de transcritos de ARN se redujeron por la actividad de interferencia por ARN de los 5 polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La Figura 5B muestra que para múltiples líneas transgénicas de TN90, derivadas independientemente, los niveles de transcritos de ARN se redujeron por la actividad de interferencia por ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La Figura 5C muestra que para múltiples líneas transgénicas de VA359 derivadas independientemente, los niveles de transcritos de ARN se redujeron por la actividad de interferencia por ARN de los polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). La reducción en los niveles 10 de transcritos de ARN de NtHMA es consistente con la reducción en el contenido de Cd medido en las hojas medias para las mismas líneas transgénicas evaluadas. "PBI121" representa un vector de expresión deficiente en el constructo de ARNi que codifica polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915).
Ejemplo 7 (Referencia) 15
Distribución de Cd y Zn en líneas transgénicas modificadas genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915) sobre la distribución de 20 Cd y Zn dentro de la lámina foliar y la raíz, se analizó el contenido de metales de las plantas transgénicas de tres variedades. Cinco líneas transgénicas de cada variedad, es decir, curado con humo (K326), Burley (TN90), y oscuro (VA359), se seleccionaron para mostrar el contenido de Cd en el menor intervalo en la lámina foliar. Las hojas medias y raíces de estas plantas transgénicas y plantas control se cosecharon para un análisis de metales mediante ICP_MS. Durante 8 semanas, todas las plantas se cultivaron en medio Hoaglands suplementado con CdCl2 5 μM 25 antes de la cosecha.
La Tabla 2 presenta los niveles de Cd y Zn medidos en la lámina foliar y la raíz de varias líneas transgénicas, que representan tres variedades de tabaco, como se proporciona más adelante. En la Tabla 2, la distribución de Cd entre la lámina foliar y la raíz se modificó sustancialmente por la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-30 915) para las tres variedades, curado con humo (K326), Burley (TN90), y oscuro (VA359). Para las líneas transgénicas de K326, el % de reducción de Cd varió de 97,16 a 98,54 % cuando se comparó con los niveles de Cd observados en las plantas control de K326. Para las líneas transgénicas de TN90, el % de reducción de Cd varió de 85,12 - 90,96 % cuando se comparó con los niveles de Cd observados en el control de TN90. Para las líneas transgénicas de VA359, el % de reducción de Cd varió de 93,24 - 99,07 % cuando se comparó con los niveles de Cd 35 observados en el control de VA359. La línea transgénica de VA359 NtHMA-11 mostró el nivel de Cd más bajo (1,62 µg/g) y el mayor % de reducción de Cd (99,07 %), cuando se comparó contra dos líneas de control deficientes del transgén de ARNi de NtHMA ("VA359 PBI121") que mostró niveles de Cd en 158,3 - 205,96 µg/g. Un análisis comparable en raíces de las líneas transgénicas mostró que una cantidad sustancial de Cd puede acumularse en la raíz, lo que da lugar a un aumento en veces en los niveles de Cd de las raíces que está en el intervalo de 6,90 - 40 15,38, con respecto a los niveles de Cd observados en los controles respectivos.
A diferencia de la reducción de Cd significativa en la lámina foliar de las líneas transgénicas, el contenido de Zn de la lámina foliar no se redujo sustancialmente, aunque se observó alguna reducción en la mayoría de las líneas transgénicas, provocada por la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915). El contenido de Zn 45 dentro de la raíz (última columna de la Tabla 3) aumentó en todas las líneas transgénicas, lo que da lugar a un aumento de 4-6 veces en las líneas transgénicas de las variedades K326 y VA359, y un aumento de 3-5 veces en la variedad de TN90.
La Figura 6 muestra la distribución de Cd y Zn entre la lámina foliar y la raíz de diversas líneas transgénicas de 50 primera generación que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la Tabla 2. En cada gráfico de la Figura 6, la unidad del eje y es μg/mg de tejido.
Tabla 2
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Ejemplo 8 (Referencia)
Distribución de Cd en diversos tejidos de líneas transgénicas genéticamente modificadas para expresar 25 polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (1382-1584) sobre la distribución de Cd dentro de diversos tejidos (es decir, la corteza, lámina, brea, y raíz), se analizó el contenido de metales de varias líneas transgénicas que representan dos variedades, Burley (TN90) y curado con humo (K326). Las plantas 30 transgénicas y las plantas de control totalmente maduras se cosecharon para el análisis de metales mediante ICP_MS. Durante 8 semanas, todas las plantas se cultivaron en CdCl2 5 μM en medio Hoaglands antes de la cosecha.
La Tabla 3 presenta el contenido de Cd en tejidos de la corteza, lámina, brea, y raíz de varias líneas transgénicas, 35 como se proporciona más adelante. En la Tabla 3, los niveles de Cd se redujeron sustancialmente en los tejidos de corteza, lámina y brea de todas las líneas transgénicas evaluadas cuando se compararon con las plantas control. El "Control" representa plantas no transgénicas. El "PBI121" representa plantas transgénicas transformadas con un vector de expresión deficiente en el constructo de ARNi de NtHMA. El grado de reducción de Cd en la corteza, brea, y lámina foliar de líneas transgénicas de K326 fue significativamente mayor que el observado en las líneas 40 transgénicas de TN90. La expresión de polinucleótidos de ARNi (1382-1584) en plantas transgénicas de K326 resultó en una reducción de Cd de 9-11 veces en la corteza, una reducción de Cd de 6-13 veces en la brea, y una reducción de Cd de 31-32 veces en la lámina foliar. La expresión de polinucleótidos de ARNi (1382-1584) en plantas transgénicas de TN90 resultó en una reducción de Cd de 4-7 veces en la corteza, una reducción de Cd de 5-8 veces en la brea, y una reducción de Cd de 6-20 veces en la lámina foliar. Por el contrario, se observaron incrementos más 45 modestos (5-6 veces) en el contenido de Cd en la raíz de estas líneas transgénicas cuando se comparó con el de las plantas control.
La Figura 7 muestra la distribución de Cd entre la corteza (“B”), la lámina foliar (“L”), la brea (“P”), y la raíz (“R”) de diversas líneas transgénicas de la primera generación que se han modificado genéticamente para expresar 50 polinucleótidos de ARNi de NtHMA de interés, como se presenta en la Tabla 3. En cada gráfico de la Figura 7, la unidad del eje y es μg/mg de tejido.
Tabla 3
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Ejemplo 9 (Referencia) 10
Reducción de Cd en la lámina foliar de las líneas transgénicas de la segunda generación modificadas genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA
Para determinar el efecto de la expresión de polinucleótidos de ARNi de NtHMA (660-915) sobre el contenido de Cd 15 en la lámina foliar, el contenido de metales de dos líneas transgénicas (T1) de la variedad de VA359 se cultivaron en un suelo que contenía concentraciones variables de Cd durante 4 semanas. Dos líneas transgénicas, 06T498 y 06T506, seleccionadas como positivas para kanamicina se evaluaron mediante PCR. Varias macetas de 10” rellenas con una mezcla de arena:suelo se saturaron con 0, 0,1, 0,5, o 5µM de CdCl2. Tres plantas por tratamiento por línea transgénica se cultivaron durante 4 semanas mediante la adición de medio Hoaglands al platillo. Se registró la 20 cantidad total de hojas, el índice del área foliar, el peso de las hojas, el peso de los tallos, y el peso de las raíces. Dos hojas medias y muestras de las raíces se liofilizaron y se sometieron a análisis de metales pesados.
La Figura 8 muestra la distribución de Cd entre la lámina foliar (“L”) y la raíz (“R”) de diversas líneas transgénicas de la segunda generación (T1) que se han modificado genéticamente para expresar polinucleótidos de ARNi de NtHMA 25 de interés. En cada gráfico de la Figura 8, la unidad del eje y es μg/mg de tejido. En la Figura 8 puede observarse que el contenido de Cd de las plantas transgénicas fue consistentemente menor que el de las plantas control en todas las concentraciones de Cd evaluadas (0, 0,1, 0,5, y 5µM). Se observó una reducción en el contenido de Cd de la lámina foliar (2-4,7 veces) en varias líneas transgénicas evaluadas. El nivel de Cd para la línea 06T498 fue solo de ~20 % el de las plantas control a 5 µM de CdCl2. Se observó un aumento en el contenido de Cd de las raíces (4-30 16 veces) en varias líneas transgénicas evaluadas. El mayor contenido de Cd en las raíces (un aumento de 16 veces) se observó para la línea 06T498 a 5 µM de CdCl2. Así, la reducción del contenido de metales pesados en la lámina foliar/brotes en las líneas transgénicas, que expresan un polinucleótido de ARNi de NtHMA (660-915), sugirió que la translocación de una cantidad sustancial de metales pesados de la raíz a la lámina foliar/brotes puede interrumpirse mediante interferencia por ARNi. Los resultados son consistentes con la reducción de Cd observada 35 en la lámina foliar de las líneas transgénicas de la primera generación, en el hecho de que las líneas transgénicas de la segunda generación además demostraron (a) reducción de los niveles de Cd en la lámina foliar, y (b) aumento de Cd en las raíces. Las líneas transgénicas no demostraron diferencias fenotípicas en el aspecto general, el crecimiento y el desarrollo con respecto a las plantas control.
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Ejemplo 10
Polinucleótidos de NtHMA
Un polinucleótido de NtHMA generalmente contendrá enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos, se incluyen 45 análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternativas, que comprenden, por ejemplo, enlaces fosforamidato, fosforotioato, fosforoditioato, u O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); y cadenas principales y enlaces de ácidos nucleicos peptídicos. Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen cadenas principales positivas; cadenas principales no iónicas, y cadenas principales diferentes de la ribosa, que incluyen las descritas en las patentes de 50 Estados Unidos núms. 5,235,033 y 5,034,506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui y Cook, eds. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos. Las modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden realizarse por una variedad de razones, por ejemplo, para aumentar la estabilidad y el tiempo de vida media de tales moléculas en ambientes fisiológicos o como sondas en un biochip. Pueden 55 obtenerse mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural; alternativamente, pueden obtenerse mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, y mezclas de ácidos nucleicos y análogos de origen natural.
Una serie de referencias describe tales análogos de ácidos nucleicos, que incluyen, por ejemplo, enlaces fosforamidato (Beaucage y otros, Tetrahedron 49(10):1925 (1993) y las referencias en él; Letsinger, J. Org. Chem. 60 35:3800 (1970); Sprinzl y otros, Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger y otros, Nucl. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai y otros, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger y otros, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); y Pauwels y otros, Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag y otros, Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); y la patente de Estados Unidos núm. 5,644,048), fosforoditioato (Briu y otros, J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989), O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleótidos y Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), y 65 cadenas principales y enlaces de ácidos nucleicos peptídicos (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992);
Meier y otros, Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson y otros, Nature 380:207 (1996), todos los cuales se incorporan como referencia). Otros ácidos nucleicos análogos incluyen los que tienen cadenas principales positivas (Denpcy y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); cadenas principales no iónicas (patentes de Estados Unidos núms. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 y 4,469,863; Kiedrowshi y otros, Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger y otros, J. Am. Chem. Soc. 110:4470 5 (1988); Letsinger y otros, Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker y otros, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs y otros, J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales diferentes de ribosa, que incluyen las descritas en las patentes de Estados Unidos núms. 5,235,033 y 5,034,506, y los capítulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications 10 in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui y P. Dan Cook. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también se incluyen dentro de una definición de ácidos nucleicos (ver Jenkins y otros, Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176). Varios análogos de ácidos nucleicos se describen en Rawls, C & E News, 2 de junio de 1997, pág. 35. Estas referencias se incorporan expresamente de esta manera como referencia.
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Otros análogos incluyen ácidos nucleicos peptídicos (PNA) que son análogos de ácidos nucleicos peptídicos. Estas cadenas principales son esencialmente no iónicas en condiciones neutras, a diferencia de la cadena principal de fosfodiéster altamente cargada de los ácidos nucleicos de origen natural. Esto tiene dos ventajas. En primer lugar, la cadena principal de PNA muestra una mejor cinética de hibridación. Los PNA tienen cambios más grandes en la temperatura de fusión (Tm) para los pares de bases con error de apareamiento vs. los apareados perfectamente. El 20 ADN y el ARN típicamente muestran una caída de 2-4 °C en la Tm durante un error de apareamiento interno. Con la cadena principal de PNA no iónica, la caída es cercana a 7-9 °C. Similarmente, debido a su naturaleza no iónica, la hibridación de las bases unidas a estas cadenas principales es relativamente insensible a la concentración de sales. Además, los PNA no se degradan por las enzimas celulares, y por lo tanto pueden ser más estables.
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Entre los usos de los polinucleótidos de NtHMA descritos, y las combinaciones de fragmentos de estos, está el uso de fragmentos como sondas o cebadores o en el desarrollo de moléculas de ARNi. Tales fragmentos generalmente comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. En otras modalidades descritas en la presente, un fragmento de ADN comprende al menos 30, o al menos 60 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para 30 proyectar las condiciones adecuadas se describen por Sambrook y otros, 1989, y se describen más detalladamente más adelante. Con el uso del conocimiento del código genético en combinación con las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, pueden prepararse conjuntos de oligonucleótidos degenerados. Tales oligonucleótidos son útiles como cebadores, por ejemplo, en las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), en donde los fragmentos de ADN se aíslan y se amplifican. En determinadas modalidades descritas en la presente, los cebadores 35 degenerados pueden usarse como sondas para las genotecas no humanas. Tales genotecas incluirían pero no se limitan a genotecas de ADNc, genotecas genómicas, e incluso genotecas de ADN o EST (etiquetas de secuencias de expresión) electrónicas. Las secuencias homólogas identificadas por este método podrían usarse después como sondas para identificar homólogos no humanos de la secuencia de NtHMA identificada en la presente descripción.
40
Esta descripción incluye además polinucleótidos y oligonucleótidos que hibridan en condiciones de rigurosidad reducidas, típicamente condiciones moderadamente rigurosas, y comúnmente condiciones altamente rigurosas (también denominadas en la presente como “alta rigurosidad”), a un polinucleótido de NtHMA descrito en la presente. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y la guía para proyectar las condiciones adecuadas se describen por Sambrook, J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A 45 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel y otros, eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4, que se incorporan en la presente como referencia), y pueden determinarse fácilmente por los expertos en la técnica basados, por ejemplo, en la longitud y/o la composición de bases del polinucleótido. Una manera de lograr condiciones moderadamente rigurosas implica el uso de una solución de prelavado que contiene 5xSSC, SDS al 0,5 50 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente 50 % de formamida, 6xSSC, y una temperatura de hibridación de aproximadamente 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contenga aproximadamente 50 % de formamida, con una temperatura de hibridación de aproximadamente 42 °C), y condiciones de lavado de aproximadamente 60 °C, en 0,5xSSC, SDS al 0,1 %. Generalmente, las condiciones altamente rigurosas se definen como condiciones de hibridación como las anteriores, pero con un lavado a 55 aproximadamente 68 °C, 0,2xSSC, SDS al 0,1 %. SSPE (1x SSPE es NaCl 0,15M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse por SSC (1x SSC es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de completar la hibridación. Debe entenderse que la temperatura del lavado y la concentración de sales del lavado pueden ajustarse según sea necesario para lograr un grado de rigurosidad deseado al aplicar los principios básicos que gobiernan las reacciones 60 de hibridación y la estabilidad de los híbridos, como se conoce por los expertos en la técnica y se describe adicionalmente más adelante (ver, por ejemplo, Sambrook y otros, 1989). Cuando un ácido nucleico se hibrida a un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del ácido nucleico que se hibrida. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridan, la longitud del híbrido puede determinarse al alinear las secuencias de los polinucleótidos e identificar la región o regiones de óptima complementariedad de 65 secuencias. La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa que sean menores que 50 pares de
bases de longitud debe ser de 5 a 10 °C menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm se determina de conformidad con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos menores de 18 pares de bases de longitud, Tm (°C)=2(# de bases A+T)+4(# de bases G+C). Para los híbridos por encima de 18 pares de bases de longitud, Tm (°C)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), donde N es la cantidad de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+] para el 1x SSC=0,165M). 5 Típicamente, cada ácido nucleico que se hibrida tiene una longitud que es al menos 25 % (comúnmente al menos 50 %, 60 %, o 70 %, y más comúnmente al menos 80 %) de la longitud de un polinucleótido de la descripción al cual se hibrida, y tiene al menos 60 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, o al menos 99 %) con un polinucleótido de la descripción al cual se hibrida.
10
Ejemplo 11
Polipéptidos de NtHMA
Un polipéptido de la descripción puede prepararse al cultivar células huésped transformadas o recombinantes en 15 condiciones de cultivo adecuadas para expresar un polipéptido de la descripción. El polipéptido expresado resultante puede purificarse después a partir de tal cultivo con el uso de procesos de purificación conocidos. La purificación del polipéptido puede incluir además una columna de afinidad que contiene agentes que se unirán al polipéptido; una o más etapas en columna sobre tales resinas de afinidad como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl® o Cibacron blue 3GA Sepharose®; una o más etapas que implican cromatografía por interacción hidrofóbica mediante 20 el uso de dichas resinas como fenil éter, butil éter, o propil éter; o cromatografía por inmunoafinidad. Alternativamente, el polipéptido de la descripción puede expresarse, además, en una forma que facilite la purificación. Por ejemplo, puede expresarse como un polipéptido de fusión, tal como el polipéptido de unión a maltosa (MBP), glutatión-5-transferasa (GST) o tioredoxina (TRX). Los kits para la expresión y purificación de dichos polipéptidos de fusión están disponibles comercialmente de New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia 25 (Piscataway, N.J.), e InVitrogen, respectivamente. El polipéptido puede marcarse con un epítopo y posteriormente purificarse mediante el uso de un anticuerpo específico dirigido a dicho epítopo. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrofóbicos, por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo colgantes u otros grupos alifáticos, pueden emplearse para purificar adicionalmente el polipéptido. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en varias 30 combinaciones, también pueden emplearse para proporcionar un polipéptido recombinante esencialmente homogéneo. El polipéptido así purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos de mamíferos y se define de acuerdo con esta descripción como un "polipéptido sustancialmente purificado"; dichos polipéptidos purificados incluyen polipéptido de NtHMA, fragmento, variante, y lo similar. La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la descripción pueden llevarse a cabo mediante cualquier técnica adecuada, que 35 incluye pero no se limita a los métodos descritos en la presente.
Es posible además utilizar una columna de afinidad tal como un anticuerpo monoclonal generado contra los polipéptidos de la descripción, para purificar por afinidad los polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de una columna de afinidad con el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, en un tampón de elución 40 con alto contenido de sales y después separar mediante diálisis en un tampón con bajo contenido de sales para el uso o al cambiar el pH u otros componentes en dependencia de la matriz de afinidad utilizada, o retirarse de manera competitiva con el uso del sustrato de origen natural del motivo de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la descripción.
45
Un polipéptido de la descripción puede producirse, además, mediante síntesis química convencional conocida. Los métodos para construir los polipéptidos de la descripción o fragmentos de estos mediante medios sintéticos se conocen por los expertos en la técnica. Las secuencias de polipéptidos construidas sintéticamente, en virtud de compartir características conformacionales y/o estructurales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos nativos pueden poseer propiedades biológicas en común con ellos, incluida la actividad biológica. 50
Ejemplo 12 (Referencia)
Anticuerpos anti-NtHMA
55
En otra modalidad descrita en la presente, se proporcionan anticuerpos que son inmunorreactivos con los polipéptidos de la descripción. Los polipéptidos de NtHMA, fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión, y similares, como se exponen en la presente descripción, pueden emplearse como "inmunógenos" para la producción de anticuerpos inmunorreactivos con ellos. Tales anticuerpos se unen específicamente a los polipéptidos mediante los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Los anticuerpos de unión específica son los que reconocerán 60 específicamente y se unirán con polipéptidos de la familia de NtHMA, homólogos y variantes, pero no con otras moléculas. En una modalidad descrita en la presente, los anticuerpos son específicos para los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de NtHMA de la descripción como se expone en la sec. con núm. de ident.:2 y no reaccionan de manera cruzada con otros polipéptidos.
65
Más específicamente, los polipéptidos, fragmento, variantes, polipéptidos de fusión, y similares contienen determinantes antigénicos o epítopos que producen como respuesta la formación de anticuerpos. Estos determinantes antigénicos o epítopos pueden ser lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopos lineales están compuestos de una sola sección de aminoácidos del polipéptido, mientras que los epítopos conformacionales o discontinuos están compuestos de secciones de aminoácidos de diferentes regiones de la cadena del polipéptido 5 que quedan en una proximidad cercana tras el plegamiento del polipéptido. Los epítopos pueden identificarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Adicionalmente, los epítopos de los polipéptidos de la descripción pueden usarse como reactivos de investigación, en ensayos, y para purificar anticuerpos de unión específica a partir de sustancias tales como sueros policlonales o sobrenadantes a partir de hibridomas cultivados. Tales epítopos o variantes de estos pueden producirse con el uso de técnicas conocidas en la técnica tales como 10 síntesis en fase sólida, escisión química o enzimática de un polipéptido, o con el uso de la tecnología de ADN recombinante.
Tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales para los polipéptidos de la descripción pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in 15 Biological Analyses, Kennet y otros (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988); Kohler y Milstein, (patente de Estados Unidos núm. 4,376,110); la técnica de hibridomas de células B humanas (Kosbor y otros, Immunology Today 4:72, 1983; Cole y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026, 1983); y la técnica de hibridoma EBV (Cole y otros, 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las líneas 20 celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la descripción también se incluyen en la presente descripción. Tales hibridomas pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped pueden inmunizarse mediante inyección con un polipéptido de NtHMA, fragmento, variante, o mutantes de estos. Tales animales huéspedes pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Varios adyuvantes pueden 25 usarse para aumentar la respuesta inmunológica. En dependencia de la especie huésped, tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes potencialmente útiles en humanos tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos monoclonales pueden 30 recuperarse mediante técnicas convencionales. Tales anticuerpos monoclonales pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, y cualquier subclase de estas.
Los anticuerpos de la descripción pueden usarse, además, en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la descripción, lo mismo in vitro que in vivo. Los anticuerpos pueden emplearse además en la 35 purificación de polipéptidos o fragmentos de la descripción mediante cromatografía por inmunoafinidad.
Ejemplo 13 (Referencia)
ARN bicatenarios 40
En una modalidad descrita en la presente, la descripción proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (dsARN) para inhibir la expresión del gen de NtHMA en una célula (por ejemplo, una célula vegetal), en donde el dsARN comprende una cadena antisentido que comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión del gen de NtHMA, y en donde la región 45 de complementariedad es menor que 30 nucleótidos de longitud y en donde dicho dsARN, tras el contacto con una célula que expresa dicho gen de NtHMA, inhibe la expresión de dicho gen de NtHMA en al menos 20 %. El dsARN comprende dos cadenas de ARN que son suficientemente complementarias para hibridar para formar una estructura de híbrido. Una cadena del dsARN (la cadena antisentido) comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y típicamente totalmente complementaria, a una secuencia diana, derivada de la 50 secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen de NtHMA, la otra cadena (la cadena sentido) comprende una región que es complementaria a la cadena antisentido, de manera que las dos cadenas hibridan y forman una estructura de híbrido cuando se combinan en condiciones adecuadas. La estructura de híbrido tiene entre aproximadamente 15 y 30 (por ejemplo, entre aproximadamente 18 y 25), típicamente entre aproximadamente 19 y 24 (por ejemplo, entre 21 y 23) pares de bases de longitud. De manera similar, la región de complementariedad 55 a la secuencia diana tiene entre 15 y 30 (por ejemplo, entre aproximadamente 18 y 25), típicamente entre aproximadamente 19 y 24 (por ejemplo, entre 21 y 23) pares de bases de longitud. El dsARN de la descripción puede comprender adicionalmente uno o más extremo(s) no apareado(s) de nucleótidos monocatenarios. El dsARN puede sintetizarse por métodos estándar conocidos en la técnica como se analiza adicionalmente más adelante, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como los que están disponibles 60 comercialmente de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En otro aspecto, un vector de expresión puede usarse para expresar una molécula de ARNi in vivo.
El dsARN de la descripción puede contener uno o más errores de apareamiento con la secuencia diana. En una modalidad descrita en la presente, el dsARN de la descripción contiene más de 3 errores de apareamiento. Si la 65 cadena antisentido del dsARN contiene errores de apareamiento con una secuencia diana, es típico que el área del
error de apareamiento no se ubique en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena antisentido del dsARN contiene errores de apareamiento con la secuencia diana, es típico que el error de apareamiento se restrinja a 5 nucleótidos de cualquier extremo, por ejemplo 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótido del extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una cadena de dsARN de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen de NtHMA, preferentemente el dsARN no contiene ningún error de apareamiento dentro de los 13 5 nucleótidos centrales. Los métodos descritos dentro de la descripción pueden usarse para determinar si un dsARN que contiene un error de apareamiento con una secuencia diana es eficaz para inhibir la expresión del gen de NtHMA.
En una modalidad descrita en la presente, al menos un extremo del dsARN tiene un extremo no apareado de 10 nucleótidos monocatenarios de 1 a 4 (por ejemplo, 1 o 2 nucleótidos). Los dsARN que tienen al menos un extremo no apareado de nucleótidos tienen propiedades inhibitorias. El dsARN también puede tener un extremo romo, típicamente ubicado en el extremo 5' de la cadena antisentido.
Aún en otra modalidad descrita en la presente, el dsARN se modifica químicamente para mejorar la estabilidad. Los 15 ácidos nucleicos de la descripción pueden sintetizarse y/o modificarse por métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S. L. y otros (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, N.Y., Estados Unidos, que se incorpora de esta manera en la presente descripción como referencia. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones en 2', introducción de bases no naturales, unión covalente a un ligando, y reemplazo de enlaces fosfato con enlaces tiofosfato. En esta 20 modalidad descrita en la presente, la integridad de la estructura de híbrido se fortalece mediante al menos uno, y típicamente dos, enlaces químicos. La unión química puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo al introducir enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones de van der Waals o de apilamiento; por medio de una coordinación metal-ion, o a través del uso de análogos de purina. 25
Aún en otra modalidad descrita en la presente, los nucleótidos en una o ambas de las dos cadenas sencillas pueden modificarse para evitar o inhibir la activación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, determinadas nucleasas. Las técnicas para inhibir la activación de enzimas celulares se conocen en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, modificaciones del 2'-amino, modificaciones del 2'-fluoro, modificaciones de 2'-alquilo, 30 modificaciones de la cadena principal no cargada, modificaciones con morfolino, modificaciones de 2'-O-metilo, y fosforamidato (ver, por ejemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Así, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos en un dsARN se reemplaza por un grupo químico. Además, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Tal nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno o etileno que conecta el oxígeno 2' de la ribosa con el carbono 4' de la ribosa. Los oligonucleótidos que contienen el nucleótido 35 bloqueado se describen en Koshkin, A. A., y otros, Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) y Obika, S. y otros, Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404). La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por las secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados (Braasch, D. A. y D. R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).
40
La conjugación de un ligando a un dsARN puede aumentar su absorción celular. En determinados casos, un ligando hidrofóbico se conjuga al dsARN para facilitar la permeación directa de la membrana celular. Alternativamente, un ligando conjugado al dsARN es un sustrato para la endocitosis mediada por receptor. Estos enfoques se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos antisentido. En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos frecuentemente resulta en una resistencia mejorada a las nucleasas. Los ejemplos 45 representativos de ligandos catiónicos incluyen propilamonio y dimetilpropilamonio. De manera interesante, se informó que los oligonucleótidos antisentido retienen su alta afinidad de unión al ARNm cuando el ligando catiónico se dispersó con el oligonucleótido. Ver M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 y referencias en él.
50
Ejemplo 15 (Referencia)
Métodos para identificar agentes moduladores de NtHMA
La descripción proporciona métodos para identificar agentes que pueden modular el nivel de expresión y/o actividad 55 de NtHMA. Los candidatos ("un agente de prueba") que pueden evaluarse para identificar una actividad moduladora específica de NtHMA incluyen moléculas pequeñas, sustancias químicas, peptidomiméticos, anticuerpos, péptidos polinucleótidos (por ejemplo, ARNi, siARN, moléculas antisentido o ribozimas) y agentes desarrollados mediante diseño basado en computadora. La modulación de NtHMA incluye un aumento o disminución en su actividad o expresión. Por ejemplo, un método para identificar candidatos que puedan modular la expresión y/o actividad de 60 NtHMA, comprende: poner en contacto una muestra que contiene un polipéptido o polinucleótido de NtHMA con un agente de prueba en condiciones que permitan que el agente de prueba y el polipéptido o polinucleótido de NtHMA interactúen, y medir la expresión y/o actividad del polipéptido de NtHMA en presencia o ausencia del agente de prueba.
65

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para reducir los niveles de Cd en una planta de tabaco, que comprende modificar genéticamente 5 la planta mediante la reducción de la expresión génica de la ATPasa de metales pesados de Nt (NtHMA), en donde el gen de NtHMA en forma modificada o no modificada se selecciona del grupo que consiste en:
    un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:1, y que codifica un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; 10
    un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 3;
    un gen que comprende o que consiste en una secuencia que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 47;
    un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al 15 menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.:2, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; y
    un gen que comprende o que consiste en una secuencia que codifica un polipéptido que tiene al menos 70 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident.: 49, en donde el polipéptido es un transportador de NtHMA que tiene actividad ATPasa tipo P1B; 20
    en donde la reducción de la expresión génica de NtHMA se logra mediante modificación a través de mutagénesis del gen de NtHMA o a través de inactivación del gen de NtHMA, y en donde la inactivación se logra mediante la introducción de transposones y/o elementos de secuencias de inserción (IS) en el genoma de la planta, mediante Direccionamiento a Lesiones Locales Inducidas en Genomas (“TILLING”), o mediante la introducción de ribozimas específicas de la diana. 25
  2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mutagénesis del gen de NtHMA se logra mediante mutagénesis dirigida a un sitio, mutagénesis dirigida a un oligonucleótido, mutagénesis inducida químicamente o mutagénesis inducida por radiación.
    30
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