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ES2644839T3 - Procedimiento, composiciones y kits para determinar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) - Google Patents

Procedimiento, composiciones y kits para determinar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) Download PDF

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Publication number
ES2644839T3
ES2644839T3 ES12801310.9T ES12801310T ES2644839T3 ES 2644839 T3 ES2644839 T3 ES 2644839T3 ES 12801310 T ES12801310 T ES 12801310T ES 2644839 T3 ES2644839 T3 ES 2644839T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
sequence
hiv
indicated
nucleic acid
Prior art date
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Active
Application number
ES12801310.9T
Other languages
English (en)
Inventor
Danuta Wronska
Katherine SCHOUEST
Leslie TREMLETT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Grifols Therapeutics LLC
Original Assignee
Grifols Therapeutics LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Grifols Therapeutics LLC filed Critical Grifols Therapeutics LLC
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Publication of ES2644839T3 publication Critical patent/ES2644839T3/es
Active legal-status Critical Current
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description

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DESCRIPCION
Procedimiento, composiciones y kits para determinar el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) SECTOR DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere al VIH y comprende procedimientos, composiciones y kits para detectar el mismo. ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es un virus geneticamente diverso debido a la mutacion frecuente en su material genetico. Existen dos genotipos principales y se designan como 1 y 2. El VIH de tipo 1 (VIH-1) es el mas predominante en todo el mundo y se divide en grupos y subtipos, de los cuales el grupo M, subtipo B es el mas comun. En los Estados Unidos, otros subtipos comunes del grupo M del VIH-1 son: A, C, D, F, y G. Ademas, ocurren recombinaciones geneticas de estos subtipos de forma natural creando formas recombinantes circulalantes del virus (VIH FRCs). Las dos FRCs mas comunes son CRF01 (AE) y CRF02 (AG). Se cree que el VIH-1 del grupo O es menos comun que el grupo M y que el VIH-2 es escaso.
Un enfoque comunmente utilizado para lograr la deteccion de variantes geneticas multiples es disenar sondas a partir de regiones genomicas que se conservan o, si eso no es posible, disenar sondas multiples, cada una con una especificidad diferente. Sin embargo, este ultimo enfoque puede disminuir la sensibilidad del ensayo.
La capacidad de un analisis biologico para detectar una amplia gama de variantes geneticas del patogeno se define como especificidad. Los analisis con una elevada especificidad pueden detectar un gran numero de variantes geneticas en una sola prueba y, por lo tanto, son deseados ya que ofrecen un elevado nivel de seguridad patogenica y ahorro de costes. La sensibilidad del analisis se define como la concentracion mas baja de un patogeno que puede ser detectada por unidad de muestra y, a menudo, se expresa numericamente como LOD (llmite de deteccion). Mientras menor sea el LOD, mas sensible es el analisis. A menudo, se considera que la sensibilidad y especificidad del analisis son exclusivas, ya que puede ser diflcil de desarrollar un analisis biologico que tenga alta sensibilidad y especificidad.
Por lo tanto, aun existe la necesidad de disponer de composiciones y procedimientos para detectar el VIH. RESUMEN DE LA INVENCION
En el presente documento se da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, o un complemento de la misma, tal como se indica en:
5'-agg ccc tgc atg tac tgg gtg-3' 5'-agg tcc tgc ctg tac tgg atg-3' 5'-agg ccc tgc ctg ctg tgg atg-3' 5'-agg tcc tgc atg cac tgg atg-3' 5'-agg ccc tgc atg tac tgg atg-3'
5'-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3’
(SEQ ID NO:1); (SEQ ID NO:2); (SEQ ID NO:3); (SEQ ID NO:4); (SEQ ID NO:5); o (SEQ ID NO:6).
En el presente documento da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en:
5'-agg pcc tgc mtg pwc tgg atg-3' (SEQ ID NO:7); en la que p = un nucleotido universal; m = a o c; y w = a o t.
En el presente documento tambien da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en:
5'-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3' (SEQ ID NO:8); o 5'-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3' (SEQ ID NO:9);
en la que p = un nucleotido universal y n = una citidina o un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5.
La presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en:
5'-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3' (SEQ ID NO:10); o 5'-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3' (SEQ ID NO:11);
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en la que p = un nucleotido universal y n = un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5.
En el presente documento se da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en:
5'-agg pcc tgc atg pac tgg atg-3' (SEQ ID NO:12); o 5'-agg pcc tgc ctg ptc tgg atg-3' (SEQ ID NO:l3);
en la que p = un nucleotido universal.
En el presente documento tambien da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos, tal como se indica en:
5'
gac atc aag cag cca tgc aaa t -3' (SEQ ID NO:14);
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agt agt tcc tgc tat gtc act tc-3' (SEQ ID NO:15);
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- gag gac atc aag ggg ctt tac a -3' (SEQ ID NO:16);
5'
- cag caa tgt cac ttc ctg ttg -3' (SEQ ID NO:17);
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- ggc aga ggt agt gcc ag -3' (SEQ ID NO:18);
5'
- ggt cgc cca cac aat taa gc-3' (SEQ ID NO:19);
5'
- agg cac tct cag aag gct gca cg-3' (SEQ ID NO:20);
5'
-acc atc aat gag gaa gct gca gaa tgg gat-3' (SEQ ID NO:21); o
5'-tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg-3' (SEQ ID NO:22).
La presente invencion tambien da a conocer una composicion que comprede la molecula de acido nucleico aislada de la presente invencion, en la cual la composicion comprende ademas un primer cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID nO:14 y un primer cebador inverso que tiene una secuencia tal como se establece en SEQ ID NO:15, en la que el primer cebador directo y el primer cebador inverso cada uno son capaces de hibridizarse con una secuencia diana bajo unas condiciones de pCr, para amplificar as! la secuencia diana. En una realizacion de la presente invencion la composicion tambien comprede: una sonda de oligonucleotido que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:6, un segundo cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un segundo cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17.
En el presente documento tambien da a conocer un procedimiento para aplificar una secuencia diana. El procedimiento comprende poner en contacto una composicion con la secuencia diana bajo unas condiciones de PCR, en la cual la composicion comprende un primer oligonucleotido que tiene una secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:10) y un segundo oligonucleotido que tiene una secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:11), en la que p = un nucleotido universal y n = un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5, en la que la composicion ademas comprende un primer cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en sEq ID NO:14 y un primer cebador indirecto que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15, en la que el primer cebador directo y el primer cebador inverso cada uno son capaces de hibridizarse con una secuencia diana bajo unas condiciones de pCr, para amplificar as! la secuencia diana.
En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para determinar un VIH en una muestra. El procedimiento comprende:
(a) llevar a cabo una PCR con un acido nucleico de plantilla en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15; y
(b) poner en contacto un amplicon generado por los cebadores directo e inverso con un primer oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:10 y un segundo oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:11, en el que la deteccion del amplicon es indicativa de la presencia del VIH en la muestra.
En otros aspectos adicionales, la presente invencion da a conocer un kit que comprende las composiciones y/o la una o mas moleculas de acido nucleico de la presente invencion.
DESCRIPCION DETALLADA
En el presente documento se proporciona, una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6, o un complemento de las mismas.
En el presente documento tambien se da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO:7, en la que p = un nucleotido universal; m = a o c; y w = a o t.
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En el presente documento se proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO:8 o 9, en la que p = un nucleotido universal y n = una citidina o un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5.
La presente invencion proporciona una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO:10 u 11, en la que p = un nucleotido universal y n = un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5.
Ademas, el presente documento da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO:12 o 13, en la que p = un nucleotido universal.
En una realizacion, el nucleotido universal es 3-nitropirrol, 2'-deoxinucleosido y 5-nitroindol. En otras realizaciones, el nucleotido universal es 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona.
En otras realizaciones, el analogo de citidina que tiene la modificacion en C-5 es un C-5-propino o analogo metilado de dC. Por ejemplo, en realizaciones preferentes, el analogo de citidina que tiene la modificacion en C-5 es un analogo de C-5-propino de dC (por ejemplo, [5-(1-propinil)-2'-deoxiCitidina (pdC)].
En algunas realizaciones, las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion tienen una longitud no mayor de aproximadamente 100 nucleotidos, de forma ilustrativa, no mayor de aproximadamente: 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, y 10 nucleotidos.
En otra realizacion, la presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que consiste o esencialmente consiste en una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que comprende: SEQ ID NOs: 1011.
El termino “molecula de acido nucleico” en el presente documento incluye pollmeros compuestos de bases nucleotldicas de origen natural, azucares y enlaces internucleosidos (esqueleto) covalentes, as! como moleculas de acidos nucleicos que tienen partes de origen no natural que funcionan de forma similar. Ademas, el termino “molecula de acido nucleico” tambien incluye pollmeros que son de cadena doble, de cadena simple, que comprenden ARN, ADN, ARN o ADN modificados, ARN o ADN mimeticos o cualquier combinacion de los mismos.
En algunas realizaciones, los cebadores y sondas de oligonucleotidos pueden derivarse de secuencias de acidos nucleicos que se dan a conocer en el presente documento. En varias realizaciones, los cebadores y sondas se utilizan en combinacion unas con otras. La presente invencion tiene su aplicacion en una variedad de diferentes aplicaciones entre las que se incluyen, sin constituir limitacion, aplicaciones de investigacion, medicas y de diagnostico del VIH. Por ejemplo, las moleculas de acido nucleico pueden proporcionar reactivos para utilizar, por ejemplo, en un ensayo o kit de deteccion de VIH, expandiendo de esta manera el repertorio de variantes de VIH que pueden detectasrse mediante el ensayo o kit.
Generalmente, una sonda es un oligonucleotido que es complementario o sustancialmente complementario a una secuencia de nucleotidos de un acido nucleico diana. Las sondas son utiles para una variedad de aplicaciones entre las que se incluyen, sin constituir limitacion, detectar o capturar el acido nucleico diana o un amplicon correspondiente a la diana. Por ejemplo, pueden ser disenadas sondas adecuadas para utilizar en los procedimientos de deteccion basados en la amplificacion a partir de cualquier secuencia ubicada en la secuencia de un producto de amplificacion que podrla prepararse utilizando dos cebadores seleccionados y/o que comprende la misma.
La sonda puede comprender la secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NOs:1-22, o un complemento de la misma.
En una realizacion, la sonda comprende la SEQ ID NO:6, o un complemento de la misma.
En otra realizacion, la sonda comprende las SEQ ID NO:10 o 11, en las que p = un nucleotido universal y n = un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5. En una realizacion, p es 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5- c][1,2]oxazin-7-ona; y n es [5-(1-propinil)-2'-deoxyCytidina (pdC).
Un experto en la materia reconocera que las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion, incluyendo cebadores y/o sondas, se pueden obtener mediante tecnicas de biologla molecular estandares descritas en Current Protocols in Molecular Biology (1999. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K, editors. John Wiley & Sons, Inc.) o mediante slntesis qulmica o mediante analogos de acidos nucleicos. Los procedimientos que implican slntesis qulmica pueden estar automatizados y disponibles comercialmente y pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de fosfodiester, fosfotrieester o fosforamidita. Las Patentes de Estados Unidos Num. 4.458.066; 4.415.732 y Meth. Enzymol. 1979 68:90 y 109, dan a conocer ejemplos de procedimientos de slntesis qulmica. La slntesis qulmica de acidos nucleicos permite la incorporacion de bases no naturales o modificadas, as! como una variedad de fracciones de marcaje, en una molecula de acido
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nucleico. Ademas, las modificaciones qulmicas del esqueleto tales como enlaces peptldicos, fosforotioatos, fosforoamidatos, fosfotriesteres, 2'-O-Metil ARN, 2'-O-Mt ARN, P-Etoxi ADN y P-Etoxi 2'-O-Mt ARN estan facilmente disponibles y son conocidas en la tecnica. Ademas, la utilizacion de sondas reticulables en la hibridizacion de acidos nucleicos para reticular secuencias diana tambien es conocida en la tecnica. Por ejemplo, se describen compuestos basados en furocumarina o psoraleno unidos a moleculas de acido nucleico mediante la formacion de aductos en las Patentes de Estados Unidos Num. 4.826.967 y 5.082.934, las cuales refieren a un analogo de nucleosido fotoactivable que comprende una fraccion de cumarina enlazada mediante su anillo fenilo a la posicion 1 de una fraccion de azucar ribosa o desoxiribosa en ausencia de participacion de una fraccion de base.
Los analogos y mimeticos de acidos nucleicos tienen estructuras qulmicas similares que las moleculas de acidos nucleicos nativas pero con modificaciones unicas. Los analogos de acidos nucleicos, tales como acidos nucleicos bloqueados (LNAs), acidos nucleicos peptldicos (PNAs) y morfolinos, mejoran las capacidades de las moleculas de acidos nucleicos tradicionales mas alla de las limitaciones asociadas con la qulmica de los acidos nucleicos estandares (Karkare S y Bhatnagar D. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 71:575-586.) Dichos analogos de acidos nucleicos expanden y mejoran mucho las capacidades para detectar e identificar secuencias de acidos nucleicos relacionadas.
En algunos aspectos, una molecula de acido nucleico aislada de la presente invencion comprende ademas uno o mas nucleotidos heterologos. El termino “nucleotidos heterologos” en el presente documento se refiere a un nucleotido o nucleotidos que no son una parte natural de la molecula de acido nucleico aislada, pero que estan unidos de forma natural o artificial a la molecula de acido nucleico aislada. Entre los ejemplos de secuencias de acido nucleico heterologas se incluyen, sin constituir limitacion, una secuencia vector, una secuencia que es complementaria a una secuencia de bases de una sonda de purificacion y una secuencia que comprende uno o mas sitios de enzimas de restriccion.
En una realizacion, el uno o mas nucleotidos heterologos comprende una secuencia que es complementaria a una secuencia de bases de una sonda de purificacion. La sonda de purificacion puede estar unida a soportes solidos tales como, por ejemplo, una matriz o partlculas libres en solucion. Entre los ejemplos no limitativos de un soporte solido se encuentran nitrocelulosa, nailon, vidrio, poliacrilato, mezcla de pollmeros, poliestireno, silano polipropileno y partlculas con atraccion magnetica. Por ejemplo, la sonda de purificacion, que puede comprender una secuencia de ADN o ARN, puede marcarse con amina o biotina a traves de un reticulador. Estas sondas de purificacion marcadas con biotina o amina se pueden someter a continuacion a estrategias de inmovilizacion y deteccion que permiten las interacciones in vitro acido nucleico:acido nucleico o protelna:acido nucleico. De esta manera, la hibridizacion del segmento heterologo de la molecula de acido nucleico aislada con secuencia de bases complementaria de la sonda de purificacion puede facilitar la purificacion de la muestra de moleculas que se hibridizan con el segmento de secuencia especlfico del virus de la molecula de acido nucleico aislada. La Patente de Estados Unidos Num. 6.534.273, describe un procedimiento para capturar una molecula de acido nucleico diana en una muestra sobre un soporte solido.
En una realizacion, las moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion estan unidas a un soporte solido, tales como los descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, el uno o mas nucleotidos heterologos comprenden una o mas secuencias de bases de repeticion, por ejemplo, comprenden una o mas secuencias de bases de repeticion que son complementarias a una o mas secuencias de bases de repeticion de la sonda de purificacion. Una secuencia de bases de repeticion puede ser una secuencia de bases de repeticion de forma regular, tales como las formadas, por ejemplo, por homopollmeros de acidos nucleicos de poli-adenina (An), poli-timina (Tn), poli-citosina (Cn), poli-guanina (Gn) y poli- uridina (Un). Las secuencias de repeticion tambien pueden incluir mezclas de pollmeros, tales como repeticiones de AT ([AT] n), y similares.
El numero de bases de la secuencia de bases de repeticion del uno o mas nucleotidos heterologos de la molecula de acido nucleico aislada puede ser igual, superior o inferior al numero de bases de la secuencia de bases de repeticion de la sonda de purificacion. Las longitudes de las secuencias de repeticion complementarias pueden determinar la temperatura de fusion (Tm) del complejo segmento heterologo:sonda de purificacion. En una realizacion, la secuencia de bases de repeticion del segmento heterologo es mayor que la secuencia de bases de repeticion complementaria de la sonda de purificacion. En otra realizacion, la secuencia de bases de repeticion del segmento heterologo o de la sonda de purificacion pueden ser, como mlnimo, de aproximadamente 5 bases de longitud, de forma ilustrativa, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30, o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 y similares.
En otras realizaciones, el uno o mas nucleotido heterologo comprende una secuencia de control unida de forma funcional. En una realizacion, la secuencia de control es una secuencia potenciadora o promotora que es reconocida especlficamente por una ARN polimerasa que se une a dicha secuencia e inicia la transcripcion para producir transcriptos de ARN. Entre los ejemplos no limitativos de promotores reconocidos por una ARN polimerasa se incluyen promotores tales como T3, T7 o SP6. De esta manera, una molecula de acido nucleico aislada se puede utilizar en una variedad de ensayos en base a acidos nucleicos incluyendo ensayos que utilizan una ARN polimerasa para producir transcriptos de ARN multiples tales como, por ejemplo, el ensayo de amplificacion
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mediada por transcripcion (TMA) tal como se describe en Nature 350:91-92 (1991); y en la Patente de Estados Unidos Num. 5.399.491.
En una realizacion, las secuencias de acidos nucleicos aisladas de la presente invencion se marcan, por ejemplo, se marcan de forma radioactiva, de forma quimioluminiscente, de forma fluorescente, de forma fosforescente o con colorantes infrarrojos o con un marcaje Raman de superficie amplificada o partlculas de resonancia de plasmon (PRP). Por ejemplo, entre las modificaciones de los nucleotidos se incluyen la adicion de acridina o derivados de la misma, Acrydite™, amina, biotina, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, borano dNTPs, espaciadores de carbono (por ejemplo, C3, C6, C7, Cg, C12 o C18), cascade blue, colesterol, cumarina o derivados de los mismos, Cy3®, Cy3.5®, Cy5 , Cy5.5 , Cy7 DABCYL, dansilcloruro, digoxigenina, dinitrofenilo, biotina dual, EDANS, 6-FAM, fluorescelna, 3'-glicerilo, hEx, IAEDANS, dA invertido, dG invertido, dC invertido, dG invertido, |Rd-700, |Rd-800, JOE, La Jolla Blue, aglomerados metalicos tales como nanopartlculas de oro, acido fenilboronico, fosfato psoraleno, 3'- o 5'- fosforilacion, pireno, 3' ribo-adenosina, 3' ribo-guanosina, 3' ribo-citidina, (LC)Red640, (LC)Red705, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Oregon Careen®, Pacific Blue®, QSY7™, Rhodamine Careen , Rhodamine Red , Rhodol Careen , tetrametilrodamina, Texas Red , Uni-Link NH2-
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modificador, radiomarcajes (por ejemplo, I, I, S, C, P, P, H) y nanopartlculas. Una variedad de tecnicas de marcaje son conocidas por un experto en la materia.
El marcaje se puede realizar directamente o indirectamente a la molecula de acido nucleico aislada. El marcaje de un acido nucleico se puede llevar a cabo mediante la union de forma covalente de un grupo detectable (marca) ya sea a una posicion interna o terminal, por ejemplo. Un experto en la material conoce que existen una variedad de maneras para derivatizar oligonucleotidos con funcionalidades reactivas que permiten la adicion de una marca. Existen varios enfoques para unir directamente las marcas a las moleculas de acidos nucleicos y para biotinilar sondas de manera radioactiva, fluorescente, quimioluminiscente, enzimatica o se pueden enlazar marcar densas en electrones a traves de la avidina. Entre los ejemplos no limitativos de referencias que describen marcas y procedimientos de marcaje de acidos nucleicos se incluyen la Patente de Estados Unidos Num. 4.605.735; la Patente de Estados Unidos Num. 4.757.141; la Patente de Estados Unidos Num. 6.965.020; Nucl. Acids Res. 5:363 (1978); Nucl. Acids Res. 13:1529 (1985); Nucl. Acids Res. 15:3131 (1987); Nucl. Acids Res. 15:6455 (1987); Nucl. Acids Res. 13:4485 (1985); Nucl. Acids Res. 15:4837 (1987); y Anal. Biochem. 169:1-25 (1988), que dan a conocer divulgacion en referencia al marcaje de acidos nucleicos.
En algunas realizaciones, las moleculas de acidos nucleicos aisladas se marcan para procedimientos de deteccion que utilizan transferencia de energla por resonancia fluorescente (FRET). FRET implica el uso de dos colorantes, un colorante donador y uno aceptador. FRET se puede detectar ya sea por fluorescencia del colorante aceptador (“fluorescencia sensibilizada”) si dicho aceptador por si mismo es fluorescente, o por disminucion de la fluorescencia del colorante donador si dicho aceptador es un colorante inhibidor no fluorescente. FRET se puede demorar si el colorante donador libera su fluorescencia en el tiempo. Este proceso se denomina "TR-FRET" o "FRET de tiempo resolutivo". Los colorantes donador y aceptador tambien pueden ser los mismos, en cuyo caso FRET se detecta mediante la despolarizacion de la fluorescencia resultante. Los colorantes tambien pueden estar acoplados de forma covalente para forma un colorante fluorescente de tandem o colorante de tandem o conjugado de tandem. Por ejemplo, un unico colorante donador es entonces capaz de excitar dos colorantes aceptores de forma simultanea, provocando la emision de luz de multiples longitudes de onda. Preferentemente, el perfil de longitudes de onda de emision del donador, como mlnimo parcialmente, debe superponerse con el perfil de longitudes de onda de absorcion del aceptador.
Entre los colorantes fluorescentes que se pueden emplear se incluyen, sin constituir limitacion, Quasar® (por ejemplo, Quasar® 670), BODIPY FL, Cy3®, Cy3.5®,Cy5.RTM., Cy5.5®, EDANS, FAM, fluorescelna, HEX, IAEDANS, JOE, Oregon Careen®, (LC)Red640, (LC)Red705, ROX, TAMRA, TET, tetrametilrodamina y Texas Red®.
Quasar® 670 (Biosearch Technologies, Inc., Novato, CA) es una indocarbocianina que fluoresce en la region del rojo del espectro visible.
Entre los colorantes inhibidores se incluyen, sin constituir limitacion, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, DABCYL, aglomerados metalicos tales como nanopartlculas de oro y QSY7™.
Entre los pares donador/aceptador que se pueden utilizar se incluyen, sin constituir limitacion, FAM/BHQ-1, Quasar®/BHQ-2, TET/BHQ-1, JOE/BHQ-1, HEX/BHQ-1, Oregon Green/BHQ-1, TAMRA/BHQ-2, ROX/BHQ-2, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Texas Red/BHQ-2, Cy5/BHQ-3, Cy5.5/BHQ-3
fluorescelana/tetrametilrodamina, fluorescelna/fluorescelna, fluorescelna/QSY7, fluorescelna/LC RED640, fluorescelna/LC Red705 lAEDANS/fluorescelna, EDANS/DABCYL y BODIPY FLI/BODIPY FL.
En una realizacion, la presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en SEQ ID NO: 10 o 11, en la que la molecula de acido nucleico comprende ademas una marca detectable.
En algunas realizaciones, la marca detectable se corresponde con un par donador/aceptador adecuado para la deteccion utilizando FRET.
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En otras realizaciones, el par donador/aceptador es FAM/BHQ-1.
En otras realizaciones, el par donador/aceptador es Quasar 670/BHQ-2.
Tambien se da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en (SEQ ID NO:6), o un complemento de las mismas, en la que la molecula de acido nucleico comprende Quasar 670 en el extremo 5' y BHQ-2 en el extremo 3'.
En una realizacion, la presente invencion da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en (SEQ ID NO:10) o (SEQ ID NO:11), en las que p es 6H, 8H-3, 4- dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona y n es [5-(1-propinil)-2'-deoxiCytidina (pdC), en la que la molecula de acido nucleico comprende FAM en el extremo 5' y bHQ-1 en el extremo 3'.
En otras realizaciones, las moleculas de acidos nucleicos de la presente invencion pueden proporcionar una utilizacion simultanea de dos o mas sondas utilizando la transferencia de energla donador/aceptador en la que, por ejemplo, se preparan balizas moleculares que poseen fluoroforos coloreados de forma diferente, permitiendo que el ensayo a llevar a cabo detecte de forma simultanea diferentes dianas en la misma reaccion. Por ejemplo, ensayos multiples pueden contener un numero de conjuntos de cebadores diferentes, permitiendo cada conjunto la amplificacion de una secuencia genica unica a partir de un VIH diferente y pueden estar presentes un numero de balizas moleculares correspondientes, que contiene cada uno una sonda especlfica de secuencia para uno de los amplicones y cada uno marcado con un fluoroforo de diferente color. El color de la fluorescencia resultante, si existe alguno, identifica el VIH en la muestra y el numero de ciclos de amplificacion requeridos para generar una fluorescencia detectable proporciona una medida cuantitativa del numero de organismos diana presentes. Si hay presente en la muestra mas de un tipo de VIH, los colores fluorescentes que se producen identifican cual esta presente.
Generalmente, un par de cebadores que comprenden un cebador directo y un cebador inverso, pueden proporcionar una amplificacion especlfica (por ejemplo, mediante PCR) de un acido nucleico diana flanqueado por los cebadores para producir un producto de amplificacion (tambien nombrado como "amplicon"). En este sentido, cada cebador se une a su secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria, proporcionando as! un lugar para la union de una polimerasa y la extension de cada extremo 3' de los cebadores mediante la adicion de nucleotidos, proporcionando as! una copia complementaria de la secuencia diana.
En una realizacion, un par de cebadores comprende un cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un cebador inverso que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15.
En otra realizacion, un par de cebadores comprende un cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un cebador inverso que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17.
Un par de cebadores puede comprender un cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un cebador inverso que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19.
En una realizacion, el acido nucleico diana, como mlnimo, es un segmento de un ADNc preparado a partir de transcribir de forma inversa el ARN de un VIH (por ejemplo, VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O, VIH-2). Un experto en la materia reconocera que el ARN puede transcribirse de forma inversa utilizando procedimientos conocidos en la tecnica para proporcionar una plantilla para la amplificacion mediante cebadores.
En otra realizacion, el acido nucleico diana, como mlnimo, es un segmento de un ADN proviral de VIH (por ejemplo, VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O, VIH-2) integrado en el ADN de una celula hospedadora (por ejemplo, licnfocito T, macrofago, celula dendrltica). La preparacion de ADN cellular que comprende ADN proviral es conocida en la tecnica.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer una composicion que comprende una o mas moleculas de acido nucleico aisladas de la presente invencion. En algunas realizaciones, la composicion es una solucion tamponada. En otras realizaciones, la composicion esta liofilizada.
La composicion puede comprender un par de cebadores que tienen la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15); (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17); o (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19). La composicion puede comprender dos de los pares de cebadores. La composicion puede comprender los tres pares de oligonucleotidos.
La composicion puede comprender una sonda de acido nucleico que tiene la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:10) o (SEQ ID NO:11), en la que la composicion puede comprender ademas un par de cebadores que tienen la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15) o (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17).
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Se da a conocer una composicion que comprende un primer, un segundo y un tercer par de cebadores, en la que el primer par de cebadores tiene la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15), en la que el segundo par de cebadores tiene la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:16 / SEQ ID NO:17), en la que el tercer par de cebadores tiene la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19). La composicion puede comprender ademas una primera, una segunda y una tercera sonda, en la que la primera, la segunda y la tercera sonda comprenden respectivamente la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO:10) y (SEQ ID NO:11), en la que la primera, la segunda y la tercera sonda comprenden cada una una marca detectable adecuada para utilizar en una PCR a tiempo real multiple.La composicion puede comprender ademas una cuarta sonda que tiene la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:20).
En una realizacion, la composicion comprende, ademas de la una o mas moleculas de acido nucleico de la presente invencion, reactivos adicionales tales como ADN polimerasa, cofactores y desoxiribonucleosido-5'- trifosfatos en concentraciones adecuadas para proporcionar la amplificacion del acido nucleico diana. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, en las que la composicion es una solucion para PCR, la cantidad minima de ADN polimerasa puede ser, como mlnimo, de aproximadamente 0,5 unidades/100 pl de solucion, de forma ilustrativa, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 25 unidades/100 pl de solucion y de aproximadamente 7 a aproximadamente 20 unidades/100 pl de solucion. Otras cantidades pueden ser utiles para una reaccion o sistema de amplificacion en concreto. La "unidad" se puede definir como la cantidad de actividad enzimatica requerida para incorporar 10 nmoles de nucleotidos totales (dNTP's) en una cadena de acido nucleico que se extiende en 30 minutos a 74 °C. A modo de otro ejemplo, en otras realizaciones, la cantidad de cada cebador utilizado en la amplificacion puede ser, como mlnimo, de aproximadamente 0,075 pmolar, de forma ilustrativa, de aproximadamente 0,075 a aproximadamente 2 pmolar, pero otras cantidades pueden ser utiles para un sistema o reaccion de amplificacion en concreto. A modo de otro ejemplo adicional, en algunas realizaciones, la cantidad de cada dNTP en la solucion puede ser de aproximadamente 0,25 a aproximadamente 3,5 mmolar, pero otras cantidades pueden ser utiles para un sistema o reaccion de amplificacion en concreto.
La presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana que corresponde a un VIH. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la secuencia diana puede ser un ADN celular que comprende un ADN proviral de VIH o la secuencia diana puede ser un ADNc preparado a partir de ARN del VIH. Por ejemplo, llevar a cabo una PCR con la secuencia diana y, como mlnimo, un cebador directo y un cebador inverso, cada uno siendo capaz de hibridizarse con la secuencia diana bajo condiciones de PCR adecuadas que puedan proporcionar la amplificacion de la secuencia diana.
La presente invencion tambien da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15. En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo M.
La presente invencion tambien da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17. En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo O.
La presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19. En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-2.
La presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un primer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14, un primer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15, un segundo cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17. En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo M y/o VIH-1 del grupo O.
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La presente invencion tambien da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un primer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14, un primer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15, un segundo cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19. En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo M y/o VIH-2.
La presente invencion da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un primer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16, un primer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17, un segundo cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19 En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo O y/o VIH-2.
La presente invencion tambien da a conocer un procedimiento de amplificacion de una secuencia diana, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo una PCR con la secuencia diana como plantilla, en el que la realizacion comprende proporcionar la PCR con un primer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14, un primer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15, un segundo cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16, y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17, un tercer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19 En una realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la secuencia diana se corresponde con un ADN proviral de un VIH. En algunas realizaciones, el VIH es VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y/o VIH-2.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un procedimiento para determinar VIH en una muestra. Por ejemplo, la muestra puede comprender ARN de VIH y/o ADN proviral o se puede sospechar que la muestra comprende los mismos.
En una realizacion, la presente invencion da a conocer un procedimiento para determinar VIH en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. llevar a cabo una PCR con una plantilla de acido nucleico en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15; y
b. detectar un amplicon generado por los cebadores directo e inverso, con un primer oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:10 y un segundo oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:1, en el que la deteccion del amplicon is indicativa de la presencia del VIH en la muestra.
En una realizacion, la plantilla es un ADNc preparado a partir de ARN de una muestra que comprende un VIH. En otra realizacion, la plantilla comprende ADN proviral de un VIH.
En algunas realizaciones, el VIH es un VIH-1 del grupo M. En una realizacion, el VIH-1 del grupo M tiene una secuencia de acido nucleico tal como se da a conocer, por ejemplo, en los numeros de acceso a GENBANK AF033819, AY173953 o AY214024.
El cebador directo puede comprender la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y el cebador inverso puede comprender la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17. El VIH puede ser un VIH-1 del grupo O.El VIH del grupo O puede tener una secuencia de acido nucleico tal como se da a conocer, por ejemplo, en los numeros de acceso a GENBANK AY169802, AB485669.1 o GQ351296.2.
El cebador directo puede comprender la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y el cebador inverso puede comprender la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19. El VIH puede ser un VIH-2. El VIH-2 puede tener una secuencia de acido nucleico tal como se da a conocer, por ejemplo, en los numeros de acceso a GENBANK X52223, AJ011222.1.
La etapa de deteccion se puede llevar a cabo mediante una serie de tecnicas conocidas por el experto en la materia. En una realizacion, el amplicon se puede detectar utilizando una sonda que esta marcada para la
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deteccion y puede ser hibridizada directa o indirectamente con el amplicon. La sonda puede ser soluble o estar unida a un soporte solido.
La sonda puede comprender una marca detectable que se corresponde con un par donador/aceptador adecuado para la deteccion utilizando FRET, en la que la sonda comprende una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o sEq ID NO:20 o complementos de las mismas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el par donador/aceptador puede ser FAM/BHQ-1, Quasar®/BHQ-2, o cualquier combinacion de los mismos.
En otra realizacion, se pueden marcar uno o mas de los cebadores utilizados para amplificar el acido nucleico diana, por ejemplo, con una fraccion de union especlfica. El producto de extension del cebador resultante en el que se ha incorporado el cebador marcado se puede capturar con una sonda. La deteccion de la diana amplificada hibridizada a la sonda se puede lograr mediante la deteccion de la presencia de la sonda marcada o la diana amplificada marcada utilizando un equipo de deteccion adecuado y procedimientos que son muy conocidos en la tecnica.
En otras realizaciones, uno o mas de los cebadores utilizados para amplificar acidos nucleicos diana esta marcado con biotina y los acidos nucleicos diana amplificados biotinilados son hibridizados con sondas unidas a un soporte solido. Las dianas unidas se detectan, a continuacion, poniendolas en contacto con un conjugado estreptavidina- peroxidasa en presencia de un oxidante, tal como peroxido de hidrogeno, y una composicion formadora de colorante adecuada.
Otras tecnicas de deteccion son conocidas por un experto en la materia entre las que se incluyen, sin constituir limitacion, procedimientos que involucran transferencia “southern”, tecnicas de “dot blot” o deteccion por captura no isotopica con una sonda marcada.
La presente invencion da a conocer un procedimiento para determinar VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y/o VIH-2 en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. llevar a cabo una PCR unica con la muestra utilizando (i) un primer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un primer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15; (ii) un segundo cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un segundo cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17; y (iii) un tercer cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:18 y un tercer cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:19; y
b. detectar un amplicon generado por (i) el primer cebador directo y el primer cebador inverso, (ii) el segundo cebador directo y el segundo cebador inverso, y/o (iii) el tercer cebador directo y el tercer cebador inverso, en el que la presencia del amplicon determina el VIH en la muestra.
La etapa de deteccion puede comprender incluir en la PCR una sonda de oligonucleotidos que comprende una marca detectable que se corresponde con un par donador/aceptador adecuado para la deteccion utilizando FRET, en el que la sonda comprende una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, o complementos de las mismas. Por ejemplo, el par donador/aceptador puede ser FAM/BHQ-1, Quasar®/BHQ-2, o cualquier combinacion de los mismos.
La etapa de deteccion puede comprender incluir en la PCR una primera sonda que comprende una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:6, una segunda sonda que comprende una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:10 y una tercera sonda que comprende una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:11. La primera, la segunda y la tercera sondas pueden comprender cada una el mismo par donador/aceptador como marca. Por ejemplo, el par donador/aceptador puede ser, sin constituir limitacion, FAM/BHQ-1. La primera, la segunda y la tercera sondas pueden comprender cada una pares donador/aceptador diferentes como marca. Por ejemplo, el par donador/aceptador de la primera sonda puede ser Quasar®/BHQ-2, en la que la segunda y la tercera sonda comprende cada una FAM/BHQ-1.
Por lo tanto, las moleculas de acidos nucleicos de la presente invencion se pueden utilizar solas o en combinacion en diferentes procedimientos de amplificacion y/o determinacion de VIH. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las composiciones, procedimientos y kits de la presente invencion proporcionan ensayos de PCR en tiempo real multiples que comprenden uno, dos o tres conjuntos de los cebadores y sondas que se describen en el presente documento, cada uno especlfico para un VIH diana, en la misma mezcla madre de PCR. Por ejemplo, un ensayo de PCR en tiempo real multiple segun la presente invencion puede detectar 3 genotipos de VIH (es decir, VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O, VIH-2) utilizando un unico ensayo. En este sentido, los cebadores y sondas son capaces de interactuar solamente con su diana especlfica y no con otros cebadores y sondas presentes en la mezcla madre (por ejemplo, no forman dlmeros de cebadores), proporcionando as! una amplificacion de la diana y una deteccion en PCR eficientes, por ejemplo, PCR multiple.
En otros aspectos, la presente invencion da a conocer un kit que comprende las moleculas de acido nucleico aisladas incluyendo los cebadores y sondas de la presente invencion. El kit se puede desarrollar utilizando las
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secuencias de acidos nucleicos que se dan a conocer en el presente documento. Estas secuencias se pueden utilizar como cebadores en reacciones de amplificacion de acidos nucleicos y/o como sondas en un procedimiento de hibridizacion de acidos nucleicos. Los kits son utiles para determinar la presencia de un VIH, en particular secuencias de acidos nucleicos de VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y/o VIH-2 en una muestra. Los componentes en el kit se pueden obtener comercialmente o se pueden preparar segun procedimientos conocidos en la tecnica. Ademas, los componentes del kit pueden estar en solucion o liofilizados de forma adecuada. En una realizacion, los componentes estan en el mismo compartimiento y, en otra realizacion, los componentes estan en compartimientos separados. En algunas realizaciones, el kit comprende ademas instrucciones de uso.
En una realizacion, el kit comprende un cebador directo, un cebador inverso y una sonda, en el que el cebador directo comprende una secuencia de acido nucleico del cebador directo tal como se indica en (SEQ ID NO: 14), (SEQ ID NO: 16) o (SEQ ID NO:18), en el que el cebador inverso comprende una secuencia de acido nucleico del cebador inverso tal como se indica en (SeQ ID NO: 15), (SEQ ID NO: 17) o (SEQ ID NO:19), en el que la sonda comprende una secuencia de acido nucleico de la sonda tal como se indica en (SEQ ID NO:6), (SEQ ID NO: 10), (SEQ ID NO:11) o (SEQ ID NO:20).
En otra realizacion, el kit comprende un primer par de cebadores para utilizar en combinacion con una primera y segunda sondas para determinar VIH-1 del grupo M, un segundo par de cebadores para utilizar en combinacion con una tercera sonda para determinar VIH-1 del grupo O y un tercer par de cebadores para utilizar en combinacion con una cuarta sonda para determinar VIH-2, en la que el primer par de cebadores comprende la secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:14 / SEQ ID NO:15), en el que la primera y segunda sondas comprenden respectivamente la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11, en el que el segundo par de cebadores
comprende la secuencia tal como se indica en (sEq ID NO:16 / SEQ ID NO:17), en el que la tercera sonda
comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:6, en el que el tercer par de cebadores comprende la
secuencia tal como se indica en (SEQ ID NO:18 / SEQ ID NO:19), en el que la cuarta sonda comprende la
secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:20.
Los siguientes ejemplos se proporcionan solamente a modo ilustrativo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Determinacion de VIH mediante PCR Multiple
Para determinar la presencia de ARN de VIH en una muestra de plasma, se llevo a cabo un ensayo de PCR simultaneo utilizando cebadores y sondas de manera que se proporcionaron los cebadores para la amplificacion de una plantilla de ADNc preparada a partir de ARN de VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y/o VIH-2, que puede estar presente en la muestra y se detectaron en tiempo real los amplicones resultantes mediante la hibridizacion de las sondas especlficas de amplicon, que fueron marcadas para la deteccion mediante FRET.
Se seleccionaron tres conjuntos de cebador/sonda para asegurar la amplificacion y deteccion eficientes de ARN de VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y/o VIH-2. Para la deteccion, cada sonda comprende un donador en el extremo 5' y un aceptador en el extremo 3'.
Para determinar la presencia de VIH-1 del grupo M en la muestra, se emplearon cebadores y sondas de deteccion que tienen las siguientes secuencias:
Cebador Directo 1: 5'- gac atc aag cag cca tgc aaa t -3 Cebador Inverso 2: 5'- agt agt tcc tgc tat gtc act tc -3' Sonda 1: 5'-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3'
Sonda 2: 5'-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3'
(SEQ ID NO:14); (SEQ ID NO:15); (SEQ ID NO:10); y (SEQ ID NO:11);
en las que p es 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona y n es [5-(1-propinil)-2'-deoxiCitidina (pdC).
Para determinar la presencia de VIH-1 del grupo O en la muestra, se emplearon cebadores y sondas de deteccion que tienen las siguientes secuencias:
Cebador Directo 3: 5'- gag gac atc aag ggg ctt tac a -3' (SEQ ID NO:16);
Cebador Inverso 4: 5'- cag caa tgt cac ttc ctg ttg -3' (SeQ ID NO:17); y
Sonda 3: 5'- tcc ctt atc tgc cct ggt ggt aac gg -3' (SEQ ID NO:6).
Para determinar la presencia de VIH-2 en la muestra, se emplearon cebadores y sondas de deteccion que tienen las siguientes secuencias:
Cebador Directo 5: 5'- ggc aga ggt agt gcc ag -3' (SEQ ID NO:18);
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Cebador Inverso 6: 5'- ggt cgc cca cac aat taa gc-3' (SEQ ID NO:19); y
Sonda 4: 5'- agg cac tct cag aag gct gca cg-3' (SEQ ID NO:20).
Se preparo una mezcla madre de PCR (MMX) que comprende lo siguiente: tampon de PCR 1x (Bicina 50 mM, acetato potasico 115 mM, glicerol al 8%, pH 8,2) (se puede utilizar de forma alternativa un tampon base de Tris; dNTPs 300 pM; DMSO al 3%; MgCh 3,5 mM; colorante de referencia ROX 1x (0,5 pM) (el Colorante de Referencia ROX es suministrado a una concentracion de 50X. Esta compuesto de un conjugado de glicina de 5-carboxi-X- rodamina, succinimidil ester (25 pM) en Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), EDTA 0,1 mM, Tween® 20 al 0,01% (Invitrogen, Carlsbad, CA)) (se puede utilizar de forma alternativa una formulacion diferente de referencia ROX denominada “bajo ROX” (Eurogentec, Seraing, Belgica)); cebador directo de VIH-1 del grupo M 100 nM (cebador directo 1); cebador inverso de VIH-1 del grupo M 300 nM VIH-1 (cebador inverso 2); sonda de VIH-1 del grupo M 100 nM (soda 1); sonda de VIH-1 del grupo M 100 nM (sonda 2); cebador directo de VIH-1 del grupo O 100 nM (cebador directo 3); cebador inverso de VIH-1 del grupo O 300 nM VIH-1 (cebador inverso 4); sonda de VIH-1 del grupo O 100 nM (sonda 3); cebador directo de VIH-2 (cebador directo 5); cebador inverso de VIH-2 (cebador inverso 6); sonda de VIH-2 100 nM (sonda 4); sonda de Control Interno 100 nM; Transcriptasa Inversa 20 Unidades/reaccion (RT); y Taq ADN polimerasa 2,5 Unidades/reaccion.
La MMX se combino con ARN viral aislado de muestras de plasma que contienen el virus utilizando un procedimiento de extraccion de virus conocido en la tecnica. El ARN de VIH + MMX se sometio a una PCR de una sola etapa, en la que la transcripcion inversa, la amplificacion del ADNc y la deteccion se llevaron a cabo en el mismo tubo, utilizando un instrumento de PCR en tiempo real disponible comercialmente (Applied Biosystems 7300 o 7500). Las condiciones de los ciclos termicos se muestran en la tabla 1:
Tabla 1: Condiciones de los ciclos de PCR.
Etapa
Temperatura Tiempo Ciclos
Transcripcion Inversa (RT)
55°C 60 minutos 1
Activacion de Taq
95°C 2 minutos 1
Desnaturalizacion
90°C 15 segundos 15
Hibridizacion / Extension
52°C 1 minuto
Desnaturalizacion
90°C 15 segundos 30
Hibridizacion / Extension
58°C 1 minuto
A continuacion de la amplificacion por PCR, se analizaron las senales generadas utilizando el programa SDS del instrumento. Los resultados muestran curvas de amplificacion fuertes con valores de Ct inferiores a 30. Por lo tanto, fue posible detectar los tres genotipos de VIH, VIH-1 del grupo M, VIH-1 del grupo O y VIH-2, a partir de muestras de plasma mezcladas. Las sondas presentes en el ensayo para la deteccion de VIH-1 del grupo M y VIH-2 se marcaron con el mismo colorante fluorescente en cuyo caso se detectaron los dos genotipos pero sin diferenciarlos. La sonda para la deteccion de VIH-1 del grupo O se marco con un colorante fluorescente diferente que permite la diferenciacion del VIH del grupo O del grupo M y VIH-2.
La tabla 2 es una alineacion de secuencias en base a regiones genomicas de varios subtipos de VIH-1 del grupo M and FRCs.
Tabla 2: Alineacion de secuencias que son complementarias a las secuencias de variantes de VIH _______________________________correspondientes._______________________________
FRC01
5'-agg ccc tgc atg tac tgg gtg-3' (SEQ ID NO:1)
FRC02
5'-agg tcc tgc ctg tac tgg atg-3' (SEQ ID NO:2)
Subtipo G
5'-agg ccc tgc ctg ctg tgg atg-3' (SEQ ID NO:3)
Subtipo F1
5'-agg tcc tgc atg cac tgg atg-3' (SEQ ID NO:4)
Subtipo A
5'-agg ccc tgc atg tac tgg atg-3' (SEQ ID NO:5)
Sonda 1
5'-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3' (SEQ ID NO:10)
Sonda 2
5'-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3' (SEQ ID NO:11)
Las Sondas 1 y 2, para la deteccion de VIH-1 del grupo M, tienen dos inserciones de pirimidina universal (tabla 2, en las posiciones 4 y 13), 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona, que funcionan como “parches” en los sitios de parche de la secuencia de la sonda de la falta de coincidencia (polimorfismo) entre las variantes del VIH-1 del grupo M. Estos dos sitios de polimorfismo en particular, que se corresponden con el complemento de las posiciones 4 y 13 de la secuencia en la tabla 2, corresponden a sitios de polimorfismo en el genoma de VIH que estan determinados por una base purina (A o G). La colocacion de una pirimidina universal en la sonda en estos sitios permite la deteccion de cualquiera de las bases, aumentando as! la especificidad del ensayo. Las Sondas 1 y 2 se disenaron a partir de la misma secuencia genomica, sin embargo, la Sonda 1 tiene una mayor homologla con el VIH del grupo M subtipos A, B, C, D, F, y FRC01, mientras que la Sonda 2 tiene una mayor homologla con el subtipo G y FRC02. Utilizar ambas sondas en el mismo ensayo puede proporcionar la deteccion de los 6 subtipos del grupo M, as! como de FRC01 y FRC02.

Claims (9)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos tal como se indica en:
    5'-agg pnn tgn atg pan tgg atg-3' (SEQ ID NO:10); o 5'-agg pnn tgn ntg ptn tgg atg-3' (SEQ ID NO:11);
    en las que p = un nucleotido universal y n = un analogo de citidina que tiene una modificacion en C-5.
  2. 2. Molecula aislada, segun la reivindicacion 1, en la que p es 6H, 8H-3, 4-dihidropirimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-ona, en la que n es 5-(1-propinil)-2'-deoxiCitidina.
  3. 3. Molecula aislada, segun la reivindicacion 1, en la que la molecula esta marcada con FAM/BHQ-1.
  4. 4. Composicion que comprende la molecula, segun la reivindicacion 1, en la que la composicion comprende ademas un primer cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un primer cebador inverso que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15, en la que el primer cebador directo y el primer cebador inverso cada uno es capaz de hibridizarse con una secuencia diana bajo condiciones de PCR para amplificar as! la secuencia diana.
  5. 5. Composicion, segun la reivindicacion 4, en la que la composicion comprende ademas: una sonda de oligonucleotidos que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:6, un segundo cebador directo que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:16 y un segundo cebador inverso que tiene una secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:17.
  6. 6. Procedimiento para la determinacion de un VIH en una muestra, comprendiendo el procedimiento:
    (a) llevar a cabo una PCR con una plantilla de acido nucleico en la muestra utilizando un cebador directo que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:14 y un cebador inverso que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:15; y
    (b) poner en contacto un amplicon generado por los cebadores directo e inverso con un primer oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:10 y un segundo oligonucleotido que comprende la secuencia tal como se indica en SEQ ID NO:11, en el que la deteccion del amplicon es indicativa de la presencia del VIH en la muestra.
  7. 7. Kit que comprende la molecula aislada segun la reivindicacion 1.
  8. 8. Kit que comprende la composicion segun la reivindicacion 4.
  9. 9. Kit que comprende la composicion segun la reivindicacion 5.
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