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ES2641254T3 - Procedimiento de producción continúa de celulasas por un hongo filamentoso utilizando un sustrato carbonado obtenido de un pretratamiento ácido - Google Patents

Procedimiento de producción continúa de celulasas por un hongo filamentoso utilizando un sustrato carbonado obtenido de un pretratamiento ácido Download PDF

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ES2641254T3
ES2641254T3 ES12775738.3T ES12775738T ES2641254T3 ES 2641254 T3 ES2641254 T3 ES 2641254T3 ES 12775738 T ES12775738 T ES 12775738T ES 2641254 T3 ES2641254 T3 ES 2641254T3
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carbon
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production
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ES12775738.3T
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English (en)
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Fadhel Ben Chaabane
Bernard Chaussepied
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Original Assignee
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Abstract

Procedimiento de producción de celulasas y hemicelulasas por una cepa perteneciente a un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y aireado, que comprende al menos dos fases: - una fase a) de crecimiento de dicha cepa en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento en un reactor cerrado, llevándose a cabo dicha fase de crecimiento con una concentración de sustrato carbonado de crecimiento comprendida entre 10 y 90 g/l - una fase b) de producción continua de celulasas en la que se suministra al menos un sustrato carbonado inductor con un caudal de suministro al menos constante durante un periodo al menos superior a 200 h, siendo dicho sustrato carbonado inductor al menos una solución acuosa de un hidrolizado hemicelulósico procedente de un pretratamiento ácido de un sustrato lignocelulósico, no experimentando dicha solución acuosa del hidrolizado hemicelulósico ninguna esterilización previa ni ninguna rectificación del pH, estando dicho pH de la solución acuosa comprendido entre 0,5 y 3, manteniéndose la masa del volumen de reacción constante mediante la extracción de una fracción de dicho volumen de reacción, operando dicha fase b) a un índice de dilución comprendido entre 0,001 y 0,008 h-1, en el que el sustrato carbonado inductor utilizado en la fase b) es una solución acuosa de un hidrolizado hemicelulósico procedente de un pretratamiento ácido de un sustrato lignocelulósico en una mezcla con al menos otro sustrato carbonado elegido entre azúcares inductores o no inductores, en el que el caudal de suministro de dicho sustrato carbonado inductor está comprendido entre 35 y 140 mg de sustrato carbonado inductor por gramo de peso seco de cepa y por hora.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de produccion continua de celulasas por un hongo filamentoso utilizando un sustrato carbonado obtenido de un pretratamiento acido
Ambito de la invencion
La presente invencion concierne a la produccion de celulasas y de hemicelulasas, particularmente en el marco de la produccion de etanol a partir de materiales lignocelulosicos. En particular, la presente invencion concierne a un procedimiento de produccion continua de celulasa a partir de un hongo filamentoso.
Tecnica anterior
La puesta a punto de procedimientos economicamente viables de produccion de biocarburantes de 2a generacion es hoy en dfa un asunto de gran actualidad. Estos ultimos son producidos a partir de biomasa lignocelulosica y presentan menos problemas de competencia de uso de las tierras agncolas con las alimentarias, con respecto a los biocarburantes denominados de primera generacion, que son producidos a partir de la cana de azucar, el mafz, el trigo o la remolacha.
La biomasa lignocelulosica se caracteriza por una estructura compleja constituida por tres fracciones principales: la celulosa, las hemicelulosas y las ligninas. De forma clasica, el procedimiento de transformacion en etanol comprende varias etapas. El pretratamiento permitfa hacer que la celulosa fuera accesible a las enzimas, que son las celulasas. La etapa de hidrolisis enzimatica permite la transformacion de la celulosa en glucosa, que a continuacion es transformada en etanol durante la etapa de fermentacion, en general, por parte de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, la etapa de destilacion permitira separar y recuperar el etanol del mosto de fermentacion.
Los diferentes estudios tecnico-economicos demuestran que la reduccion del coste de las celulasas es uno de los puntos clave de los procedimientos de produccion biologica de etanol a partir de materias primas lignocelulosicas.
En el momento actual, las celulasas industriales son producidas principalmente por un hongo filamentoso, Trichoderma reesei, debido a su elevado poder de secrecion. Trichoderma reesei es el microorganismo mas utilizado para la produccion de celulasas. Las cepas salvajes tienen la facultad de excretar, en presencia de un sustrato inductor, celulosa, por ejemplo, considerado el coctel enzimatico como el mejor adaptado a la hidrolisis de la celulosa. Las enzimas del coctel enzimatico contienen tres principales tipos de actividades: las endoglucanasas, las exoglucanasas y las celobiasas. Otras protemas que poseen unas propiedades indispensables para la hidrolisis de los materiales lignocelulosicos son igualmente producidas por Trichoderma reesei, las xilanasas, por ejemplo. La presencia de un sustrato inductor es indispensable para la expresion de las enzimas celuloltticas y/o hemicelulolfticas.
La regulacion de los genes de las celulasas sobre diferentes fuentes de carbono se ha estudiado con detalle. Son inducidas en presencia de celulosa, de sus productos de hidrolisis (ejemplo: celobiosa) o de algunos oligosacaridos, como la lactosa o la soforosa (limen et al., 1997; Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Las tecnicas de genetica clasicas de mutacion han permitido la seleccion de cepas de Trichoderma reesei hiperproductoras de celulasas, tales como las cepas MCG77 (Gallo - patente US 4275 167), MCG 80 (Allen, A. L. y Andreotti, R. E., Biotechnol- Bioengi 1982, 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, B. S. y Eveleigh, D. E., Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782) y CL847 (Durand et al, 1984, Proc. Colloque SFM "Genetique des microorganismes industriels". Pans. H. HESLOT Ed, pags. 39-50).
El procedimiento de produccion de celulasas por parte de Trichoderma reesei ha sido objeto de importantes mejoras en vista de la extrapolacion a escala industrial. La estrategia que se aplica industrialmente es realizar un rapido crecimiento del hongo hasta una concentracion dada en una etapa denominada fase de crecimiento de dicho hongo, despues inducir la produccion de celulasas a partir de dicho hongo con el fin de maximizar la productividad y el rendimiento en una etapa denominada fase de produccion. Dicha fase de crecimiento se lleva a cabo el general en un reactor cerrado, es decir, en modo "batch" segun la terminologfa anglosajona. Dicha fase de produccion se lleva a cabo en general en un reactor con un suministro continuo, durante la cual no se realiza ninguna extraccion del contenido del reactor, es decir, en modo "fed batch" segun la terminologfa anglosajona. Para obtener unas buenas productividades de enzimas, es necesario aportar una fuente de carbono rapidamente asimilable para el crecimiento de Trichoderma reesei en la fase de crecimiento, y un sustrato inductor que permita la expresion de las celulasas y la secrecion en el medio de cultivo en la fase de produccion. La celulosa puede jugar dos papeles; no obstante, es diffcil de utilizar en el estadio industrial y ha sido sustituida por otras fuentes de carbono solubles, tales como la lactosa, que permite la expresion de las celulasas. Otros azucares solubles como la celobiosa y la soforosa se han descrito como sustratos inductores, pero son demasiado caros para ser utilizados en el estadio industrial. No obstante, las producciones de celulasas por parte de Trichoderma reesei, con los sustratos solubles, son muy inferiores a las obtenidas con la celulosa en modo "batch". Esto es debido al efecto represor de los azucares facilmente asimilables, a elevada concentracion. El suministro continuo en el modo "fed-batch" de los sustratos
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carbonados inductores solubles ha permitido elevar la represion catabolica limitando la concentracion residual de sustrato carbonado en los cultivos y optimizando la cantidad de azucar, permitiendo la obtencion de un mejor rendimiento y una mejor productividad enzimatica. Por ejemplo, la patente FR-B-2 881 753 describe un procedimiento de produccion de celulasas que comprende dos etapas:
- una fase de crecimiento en modo "batch" en la que es necesario aportar una fuente de carbono rapidamente asimilable para el crecimiento de Trichoderma reesei, despues
- una fase de produccion en modo "fed-batch" utilizando un sustrato inductor tal como, por ejemplo, la lactosa, que permite la expresion de las celulasas y su secrecion en el medio de cultivo. El suministro del sustrato carbonado soluble se realiza de forma continua, con un caudal espedfico optimo aplicado, expresado en mg de sustrato por gramo de peso seco del hongo filamentoso y por hora, comprendido entre 35 y 45 mg.g'1.h'1.
En esta patente, la etapa de produccion de las protemas no se lleva a cabo mas alla de aproximadamente 170 h. Este protocolo permite alcanzar una concentracion de protemas del orden de entre 35 y 40 g/l, con una productividad del orden de 0,2 gT1.h'1.
No obstante, el reactor debe ser limpiado y debe realizarse una nueva cadena de siembra. El inconveniente de este modo operativo es una productividad demasiado baja, que hace aumentar la inversion inicial en numero de fermentadores de produccion de enzimas. La concentracion de protemas obtenida es igualmente poco elevada y a menudo necesita una etapa de concentracion despues de la filtracion del micelio. Todo esto contribuye a hacer que el procedimiento de produccion de etanol de segunda generacion sea poco competitivo. El documento WO2009/026716 describe un cultivo continuo de Trichoderma para la produccion de celulasa y de hemicelulasa. La fuente de carbono es una mezcla de azucares derivados de la hemicelulosa y azucares inductores de la celulasa. El mdice de dilucion del cultivo continuo es de 0.025 h' .
Un objeto de la presente invencion es proporcionar un procedimiento de produccion de celulasas y de hemicelulasas utilizando al menos un sustrato carbonado inductor espedfico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico que permite aumentar, incluso duplicar, la productividad y la concentracion de las celulasas y de las hemicelulasas producidas con respecto a los procedimientos de la tecnica anterior, y producir estas celulasas de forma continua durante un periodo mas largo. El procedimiento segun la presente invencion permite aumentar, incluso duplicar, la productividad y la concentracion de las celulasas y de las hemicelulasas producidas, manteniendo constante el rendimiento de la produccion de celulasas con respecto al sustrato carbonado utilizado con respecto a los procedimientos de la tecnica anterior.
Resumen e interes de la invencion
La presente invencion concierne a un procedimiento de produccion de celulasas y de hemicelulasas por parte de una cepa perteneciente a un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y aireado, que comprende al menos dos fases:
- una fase a) de crecimiento de dicha cepa en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento en un reactor cerrado, llevandose a cabo dicha fase de crecimiento con una concentracion de sustrato carbonado de crecimiento comprendida entre 10 y 90 g/l
- una fase b) de produccion continua de celulasas en la que al menos un sustrato carbonado inductor es suministrado con un caudal de suministro al menos constante durante un periodo al menos superior a 200 h, siendo dicho sustrato carbonado inductor al menos una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico, no experimentando dicha solucion acuosa de hidrolizado hemicelulosico ninguna estabilizacion previa ni ninguna rectificacion del pH, estando dicho pH de la solucion acuosa comprendido entre 0,5 y 3, siendo mantenida la masa del volumen de reaccion constante mediante la extraccion de una fraccion de dicho volumen de reaccion, operando dicha fase b) a un mdice de dilucion comprendido entre 0,001 y 0,008 h-1,
en el que el sustrato carbonado inductor utilizado en la fase b) es una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico en una mezcla con al menos otro sustrato carbonado elegido entre azucares inductores o no inductores,
en el que el caudal de suministro de dicho sustrato carbonado inductor esta comprendido entre 35 y 140 mg de sustrato carbonado inductor por gramo de peso seco de cepa y por hora.
Ventaja de la invencion
Una ventaja de la presente invencion es que permite mejorar la productividad y la concentracion de las protemas producidas en un periodo de funcionamiento mas largo. En particular, el procedimiento segun la invencion permite la obtencion de una concentracion de protemas superior a 100 g l-1. Estos rendimientos se han mantenido experimentalmente en modo continuo durante mas de 400 h.
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La gran productividad obtenida permite reducir los costes de inversion en el biorreactor. El periodo prolongado permite reducir el tiempo consagrado a la limpieza de los biorreactores y a las cadenas de siembra. La gran concentracion de celulasas permite reducir los costes del post-tratamiento.
Otra ventaja del procedimiento continuo segun la invencion es que necesita una baja k_a, de hecho, a la vez la aplicacion de un bajo mdice de dilucion en la fase b) de produccion continua y la utilizacion de una solucion de sustrato carbonado inductor espedfico en dicha fase b), lo que permite mantener una baja viscosidad en el medio de reaccion.
Descripcion detallada_de la invencion
El procedimiento segun la invencion opera preferiblemente a un pH comprendido entre 3 y 6, a una temperatura comprendida entre 20 y 35 °C, a un vvm, es decir, a un mdice de aireacion expresado en volumen de aire, en las condiciones normales de temperatura y de presion, por volumen de medio de reaccion y por minuto, comprendido entre 0,3 y 1,5 min-1, preferiblemente entre 0,3 y 1 min-1 y con una agitacion que permite la obtencion de una presion parcial de oxfgeno en el medio de reaccion comprendida entre el 20 % y el 60 %, y preferiblemente comprendida entre el 20 y el 40 %.
Preferentemente, el procedimiento segun la invencion opera a un vvm de 0.5 min-1 y con una agitacion que permite regular la presion parcial de oxfgeno al 30 %.
Segun la invencion, dicho procedimiento comprende una fase a) de crecimiento de la cepa perteneciente a un hongo filamentoso, preferiblemente el hongo Trichoderma reesei, en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento en un reactor cerrado, llevandose a cabo dicha fase de crecimiento con una concentracion de sustrato carbonado de crecimiento comprendida entre 10 y 90 g/l.
Dicha cepa implementada en el procedimiento segun la invencion es una cepa de un hongo filamentoso perteneciente preferiblemente a los generos Trichoderma, Aspergillus, Penicillium o Schizophillum, y de forma preferida, dicha cepa pertenece a la especie Trichoderma reesei.
La cepa utilizada perteneciente preferiblemente a la especie Trichoderma reesei, puede ser ventajosamente modificada para mejorar las enzimas celuloltticas y/o hemiceluloltticas mediante procedimientos de mutacion- seleccion, como por ejemplo, la cepa IFP CL847. Igualmente puede utilizarse una cepa mejorada mediante las tecnicas de recombinacion genetica. Dicha cepa se cultiva en reactores agitados y aireados en unas condiciones compatibles con su crecimiento y la produccion de celulasas. Pueden utilizarse otras cepas de microorganismos productores de celulasas segun unos procesos similares a los utilizados para Trichoderma.
De una forma muy preferida, la cepa utilizada es una cepa de Trichoderma reesei modificada mediante una mutacion, una seleccion o una recombinacion genetica.
La cepa puede elegirse ventajosamente entre las cepas CL847, RutC30, MCG77 o MCG80.
El sustrato carbonado de crecimiento utilizado en dicha fase de crecimiento se elige ventajosamente entre azucares solubles industriales, y preferiblemente entre la glucosa, la lactosa, la xilosa, los residuos obtenidos despues de una fermentacion etanolica de los azucares monomeros de los hidrolizados enzimaticos del sustrato lignocelulosico y los extractos de la fraccion hemicelulosica en forma de monomeros procedentes del sustrato lignocelulosico pretratado, utilizado solo o en una mezcla.
Segun su naturaleza, dicho sustrato carbonado es introducido ventajosamente en el reactor antes de la esterilizacion de dicho reactor, o es estilizado por separado e introducido en el reactor previamente esterilizado.
Preferentemente, la concentracion del sustrato carbonado de crecimiento esta comprendida entre 30 y 70 g/l.
Preferentemente, la fase a) de crecimiento se lleva a cabo durante un periodo comprendido entre 30 y 70 h, y preferiblemente entre 40 y 60 h.
Preferentemente, la fase a) de crecimiento opera a un pH de 4,8 y a una temperatura de 27 °C.
Segun la invencion, dicho procedimiento comprende una fase b) de produccion continua de celulasas en la que al menos un sustrato carbonado inductor es introducido con un caudal de suministro al menos constante, durante un periodo al menos superior a 200 h, siendo dicho sustrato carbonado al menos una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico, no experimentando dicha solucion acuosa de hidrolizado hemicelulosico ninguna esterilizacion previa ni ninguna rectificacion del pH, estando dicho pH de la solucion acuosa comprendido entre 0,5 y 3, manteniendose la masa del volumen de reaccion constante mediante la extraccion de una fraccion de dicho volumen de reaccion, operando dicha fase b) a un mdice de dilucion comprendido entre 0,001 y 0,008 h-1.
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Dicha fase continua se lleva a cabo ventajosamente en un reactor de suministro continuo, durante la cual se extrae una fraccion del volumen de reaccion, de forma que la masa del volumen de reaccion se mantenga constante. Dicha fase continua se denomina modo "chemostat" segun la terminolog^a anglosajona.
El sustrato lignocelulosico, que permite la obtencion de la solucion acuosa de hidrolizado hemicelulosico utilizada en la fase b) del procedimiento segun la invencion, es una fuente de hidratos de carbono formados principalmente por tres constituyentes: la celulosa (del 35 al 50 %), las hemicelulosas (del 20 al 30 %), que son polisacaridos constituidos esencialmente por pentosas y hexosas, y la lignina (del 15 al 25%), que es una macromolecula de estructura compleja y de elevado peso molecular, formada por alcoholes aromaticos unidos por enlaces eter. Dicho sustrato se elige ventajosamente entre paja, madera, cultivos forestales, residuos de plantas productoras de alcohol, de azucar y de cereales, residuos de la industria papelera y los productos de la transformacion de los materiales lignocelulosicos.
El pretratamiento acido experimentado por dicho sustrato lignocelulosico es implementado segun los pretratamientos acidos conocidos por el experto en la materia. Preferentemente, el pretratamiento acido es una hidrolisis acida, una coccion acida o una explosion de vapor con una impregnacion previa de dicho sustrato lignocelulosico con una solucion acuosa de acido sulfurico.
La solucion acuosa del hidrolizado hemicelulosico asf obtenida presenta un pH comprendido entre 0,5 y 3, y es utilizada sin ninguna etapa de esterilizacion ni de rectificacion del pH.
Preferentemente, dicha solucion acuosa del hidrolizado hemicelulosico presenta un pH comprendido entre 0,5 y 2.
El sustrato carbonado inductor utilizado de la fase b) del procedimiento segun la invencion es ventajosamente una solucion acuosa de hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico, solo o en una mezcla con al menos otro sustrato carbonado que no haya experimentado una esterilizacion.
Preferentemente, dichos sustratos carbonados se eligen entre azucares inductores o no inductores, de forma preferida se eligen entre la lactosa, la glucosa, la celobiosa y la xilosa, solos o en una mezcla.
Dichos sustratos se disuelven en dicha solucion acuosa del hidrolizado hemicelulosico.
En el caso en el que el sustrato carbonado inductor sea una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico en una mezcla con al menos otro sustrato carbonado que haya experimentado una esterilizacion, dicho sustrato carbonado inductor presenta una concentracion comprendida entre 200 y 600 g/l, segun el grado de solubilidad de los sustratos carbonados utilizados.
En el caso en el que el sustrato carbonado inductor sea una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un unico sustrato lignocelulosico, dicho sustrato carbonado inductor presenta una concentracion comprendida entre 40 y 400 g/l, despues de haber sido eventualmente concentrado.
La utilizacion de dicho sustrato carbonado inductor espedfico procedente del pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico permite la implementacion de la fase b) de produccion de celulasas durante un periodo mas largo, preferiblemente superior a 200 h, con respecto al procedimiento de la tecnica anterior.
Segun la invencion, dicho sustrato carbonado inductor es suministrado con un caudal de suministro al menos constante. Preferentemente, el caudal de suministro de dicho sustrato carbonado inductor esta comprendido entre 35 y 140, y preferiblemente entre 35 y 60 mg de sustrato carbonado inductor por gramo de peso seco de cepa y por hora.
De forma preferida, el caudal de suministro se aumenta gradualmente en la fase b), de forma mas preferida se aumenta gradualmente hasta ser duplicado en las primeras horas de implementacion de la fase b), preferiblemente despues de al menos 24 h y de forma preferida despues de al menos 48 h de la implementacion de la fase b).
Segun la invencion, el periodo de la fase b) de produccion continua de celulasas es al menos superior a 200 h, preferiblemente al menos superior a 300 h y de forma preferida al menos superior a 400 h.
En la fase b), la masa del volumen de reaccion se mantiene constante mediante la extraccion de una fraccion de dicho volumen de reaccion.
Preferentemente, la extraccion se lleva a cabo segun los metodos de extraccion conocidos por el experto en la materia, tales como, por ejemplo, gracias a un sistema de regulacion y a una bomba de extraccion controlable.
Preferentemente, el caudal de extraccion es al menos igual al caudal de suministro de la fase b).
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Segun la invencion, el mdice de dilucion, definido como la proporcion entre el caudal de extraccion y el volumen de reaccion del reactor durante la fase b) de produccion continua, esta ventajosamente comprendido entre 0,001 h-1 y 0,008 h-1, y de forma preferida entre 0,002 y 0,008 h-1. El mdice de dilucion muy preferido es de 0,004 h-1. Preferentemente, la fase b) opera a un pH comprendido entre 3 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 20 y 30 °C.
Una fase opcional a') de produccion llevada a cabo en un reactor de suministro continuo de al menos un sustrato carbonado inductor, durante la cual no se realiza ninguna extraccion del contenido del fermentador, es decir, en modo "fed batch", es implementada ventajosamente entre la fase a) y la fase b).
La implementacion de dicha fase a') permite no extraer la fraccion de volumen de reaccion que contiene la cepa de hongo filamentoso mientras las concentraciones de protemas producidas son todavfa bajas. Dicho sustrato carbonado inductor utilizado en la fase a') es identico al sustrato carbonado inductor utilizado en la fase b) de produccion.
Preferentemente, el caudal de suministro de dicho sustrato carbonado inductor esta comprendido entre 35 y 140, y preferiblemente entre 35 y 60 mg de sustrato carbonado inductor por gramo de peso seco de cepa y por hora. Dicho caudal de suministro se mantiene constante durante todo el periodo de la fase a').
Preferentemente, la fase a') es implementada durante un periodo comprendido entre 50 y 150 h y preferiblemente entre 70 y 130 h.
Preferentemente, la fase a') opera a un pH comprendido entre 3 y 5,5 y a una temperatura comprendida entre 20 y 30 °C. El procedimiento segun la presente invencion permite aumentar, incluso duplicar, la productividad, asf como la concentracion de las celulasas y de las hemicelulasas producidas con respecto a los procedimientos de la tecnica anterior, y la produccion de estas celulasas de forma continua durante un periodo mas largo.
Ejemplos
Ejemplo 1: no conforme
El ejemplo 1 presenta un cultivo que utiliza las condiciones de referencia de la patente FR-B-2 881 753. El ejemplo 1 ilustra un procedimiento de produccion de celulasas y de hemicelulasas que comprende una fase de crecimiento y una fase de produccion en modo "fed batch" implementadas durante 167 h
La produccion de celulasas y de hemicelulasas se lleva a cabo en un reactor agitado mecanicamente de 3 l. El medio mineral tiene la siguiente composicion: KOH 1,66 g/l, H3PO4 al 85 % 2 ml/l, (NH^SO4 2,8 g/l, MgSO4, 7 H2O 0,6 g/l, CaCl2 0,6 g/l, MnSO4 3,2 mg/l, ZnSO4, 7 H2O 2,8 mg/l, CoCl210 4,0 mg/l, FeSO4, 7 H2O 10 mg/l, Corn Steep 1,2 g/l, antiespumante 0,5 ml/l.
Se lleva a cabo un precultivo lfquido de la cepa de Trichoderma reesei CL847. El medio mineral del precultivo, es identico al del reactor, aparte de la adicion de ftalato de potasio a 5 g/l para tamponar el pH. El crecimiento del hongo en el precultivo se lleva a cabo utilizando glucosa como sustrato carbonado, a una concentracion de 30 gl-1.
El crecimiento del inoculo dura entre 2 y 3 dfas y se lleva a cabo a 28 °C en un incubador agitado a la presion atmosferica.
El reactor que contiene el medio mineral es esterilizado a 120 °C durante 20 minutos, la fuente carbonada glucosa es esterilizada aparte a 120 °C durante 20 minutos, y despues anadida de forma esteril al reactor, de forma que se obtenga una concentracion final de 30 g/l. El reactor es sembrado con un 10 % (v/v) de dicho precultivo de la cepa de Trichoderma reesei CL847 en cuanto la concentracion residual de glucosa del precultivo es inferior a 15 g/l.
El experimento llevado a cabo en el biorreactor comprende dos fases:
- una fase de crecimiento en el sustrato carbonado glucosa (concentracion inicial = 30 g/l) a una temperatura de 27 °C y un pH de 4,8 (regulado con amomaco 5,5 M). La aireacion es de 0,5 vvm y la agitacion se aumenta a entre 200 y 800 rpm en funcion de la pO2 (presion de oxfgeno disuelto), que se regula al 30 %.
- una fase de produccion de protemas en modo "fed batch". Despues de 30 horas, se inyecta una solucion del sustrato carbonado lactosa a 250 gl-1 de forma continua con un caudal de 4 ml/h a 35 mg de lactosa por g de cepa de Trichoderma reesei CL847 y por hora, hasta 167 horas. La temperatura se reduce a 25 °C y el pH a 4 hasta el final del cultivo. El pH es regulado mediante la adicion de una solucion de amomaco a 5,5 N, que aporta el nitrogeno necesario para la smtesis de las celulasas y de las hemicelulasas excretadas. El contenido en oxfgeno disuelto se mantiene al 30 % por la accion de la agitacion
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La produccion de celulasas se sigue mediante el analisis de las protemas extracelulares mediante el metodo de Lowry y el patron BSA, despues de la separacion del micelio mediante una filtracion o una centrifugacion. Las actividades celulolrticas determinadas son:
- la actividad de papel de filtro (UPF: unidad de papel de filtro) que permite analizar la actividad global del conjunto enzimatico de endoglucanasas y exoglucanasas
- la actividad de p-glucosidasa para las actividades espedficas.
La actividad UPF se mide con papel Whatman n° 1 segun el procedimiento recomendado por la comision biotecnologica IUPAC, a una concentracion inicial de 50 g l-1; se determino la muestra del ensayo de la solucion enzimatica que se va a analizar, que libera el equivalente a 2 g.l-1 de glucosa (analisis colorimetrico) en 60 minutos.
El principio de la actividad de papel de filtro es determinar, mediante un analisis con acido dinitrosalidlico (DNS), la cantidad de azucares reducidos procedente de un papel de Whatman n° 1. El sustrato utilizado para la determinacion de la actividad de la p-glucosidasa es el p-nitrofenil-p-D-glucopiranosido (PNPG). Es escindido por la p-glucosidasa, que libera p-nitrofenol. Una unidad de actividad de p-glucosidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para la produccion de 1 pmol de nitrofenol a partir de PNPG por minuto, y se expresa en lU/ml.
Las actividades espedficas se obtienen dividiendo las actividades expresadas en lU/ml por la concentracion de celulasas. Se expresan en lU.mg-1.
La productividad final se calcula teniendo en cuenta toda la masa de las celulasas y las hemicelulasas producidas durante la fase de produccion (incluyendo las muestras) y dividiendola por el periodo de la fase de produccion y el volumen util del reactor.
El termino "Biomasa" caracteriza la cepa de Trichoderma reesei CL847.
El termino "Protema" se define como el coctel enzimatico obtenido que comprende las celulasas y las hemicelulasas producidas.
Las determinaciones analtticas sobre el mosto final del ejemplo 1 proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa g/l: 14,4 Protemas g/l: 35,7 Productividad = 0,21 g/l/h UPF 22,1 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica: 0,8 lU/mg Ejemplo 2: no conforme
El ejemplo 2 presenta un cultivo analogo al del ejemplo 1, salvo que se sigue el modo "fed-batch" hasta mas alla de 200 h con el mismo sustrato de suministro. Se constata que hay una detencion en la produccion de celulasas y de hemicelulasas despues de 200 h. Estas incluso comienzan a degradarse cuando la concentracion se reduce desde 37 g/l hasta 35 g/l. En lo que respecta a la biomasa, esta aumenta durante este periodo justo hasta alcanzar una concentracion de 20,9 g/l. Los analisis demuestran que ha habido una carencia de azufre.
La evolucion de la concentracion de biomasa y de protemas (g/l) esta representada en la figura 1.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa g/l: 20,9 Protemas g/l: 35,1
Productividad = 0,13 g/l/h (era de 0,17 g/l/h despues de 216 h)
UPF 16,1 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica 0,7 lU/mg Ejemplo 3: conforme a la invencion.
El ejemplo 3 se pone en marcha en las mismas condiciones que las del ejemplo 1, pero comprende 3 fases:
- una fase a) en modo "batch" en las mismas condiciones que las del ejemplo 1, pero con una concentracion de glucosa de 60 g/l. Esta fase dura 50 h,
- una segunda fase a') en modo "fed-batch". El fedbatch se pone en marcha en el momento en el que se agota el sustrato carbonado glucosa con una solucion del hidrolizado hemicelulosico procedente de una paja pretratada mediante una explosion de vapor con una impregnacion previa de H2SO4 en la que se ha disuelto glucosa y lactosa, para llegar a una concentracion global de sustrato carbonado de 500 g/l. Esta solucion no es
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esterilizada, y su pH no ha aumentado, y es de 1. Se aplica un caudal de 4 ml/h (es dedr, un flujo de 35 mg de azucares por g de cepa de Trichoderma reesei CL847 y por hora). Esta fase dura 100 h.
- una fase b) de produccion continua de celulasas y de hemicelulasas se pone en marcha a continuacion. El caudal de suministro se mantiene constante a 4 ml/h durante todo el experimento. El reactor se mantiene con un peso constante mediante la extraccion continua del mosto gracias a un sistema de regulacion y a una bomba de extraccion controlable. El mdice de dilucion es de 0,002 h-1.
Hemos producido de forma continua a partir de 400 h una solucion enzimatica que tiene una concentracion superior a 100 g/l y una productividad superior a 0,2 g/l/h. Esto permite, por lo tanto, triplicar la concentracion de protemas y tener una productividad superior a la del ejemplo 1 (+20 %).
La evolucion de la concentracion de biomasa y de protemas (g/l) con el tiempo para el ejemplo 3, en el que la fase continua se pone en marcha despues de 150 h con un caudal de 4 ml/h, esta representada en la figura 2.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa g/l: 36,7 Protemas g/l: 107,2 Productividad final = 0,26 g/l/h UPF 76,8 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica 1,2 lU/mg Ejemplo 4: conforme
El ejemplo 4 es analogo al ejemplo 3 salvo porque la fase b) de produccion continua se pone en marcha directamente despues de la fase a) de crecimiento en modo "batch", y porque el caudal de suministro del sustrato carbonado inductor en la fase b) de produccion continua se aumenta gradualmente desde 4 ml/h hasta 8 ml/h, es decir, aumenta en 1 ml cada 12 h despues del lanzamiento de dicha fase b). El sustrato carbonado inductor utilizado es el mismo que el del ejemplo 3, es decir, una solucion de hidrolizado hemicelulosico procedente de una paja pretratada mediante una explosion de vapor con una impregnacion previa de H2SO4 en la que se ha disuelto glucosa y lactosa. Esta solucion no ha sido esterilizada, y su pH no ha aumentado, y es de 1. Las condiciones operativas utilizadas en las fases a) y b) son identicas a las utilizadas en el ejemplo 3. Con respecto al aumento en el caudal de suministro del sustrato carbonado inductor, el mdice de dilucion es de 0,004 h-1. La masa del volumen de reaccion se mantiene constante.
La productividad final del experimento es de 0,39 g l'1.h'1. Practicamente se ha duplicado con respecto al ejemplo 1.
Esto permite reducir los costes de inversion. La concentracion final de protemas practicamente se ha triplicado. Esto permite reducir los costes del post-tratamiento, particularmente, dado el caso, la concentracion de las protemas producidas. El cultivo no necesita una k_a elevada (aproximadamente 75 h"1) gracias al bajo mdice de dilucion aplicado, que permite asf tener unos bajos costes operativos relacionados con la agitacion y la aireacion.
La evolucion de la productividad (rp) de las celulasas y de las concentraciones de las cepas de T. reesei y de las celulasas para el ejemplo 4, en el que la fase continua es lanzada despues de 150 h y el caudal de fed-batch se aumenta desde 4 hasta 8 ml/h, esta representada en la figura 3.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados
Biomasa g/l: 58,1 Protemas g/l: 102,9 Productividad final = 0,39 g/l/h UPF 77,6 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica: 1,3 lU/mg
La productividad practicamente se ha duplicado con respecto al ejemplo 1, y la concentracion de protemas practicamente se ha triplicado. Dicha concentracion se mantiene durante mas de 300 h
Ejemplo 5: no conforme
El ejemplo 5 permite mostrar el efecto de la no esterilizacion de la solucion del hidrolizado hemicelulosico procedente de una paja pretratada mediante una explosion de vapor con una impregnacion previa de H2SO4 sobre los rendimientos del procedimiento.
El ejemplo 5 es lanzado en las mismas condiciones que las del ejemplo 4, salvo porque la solucion de hidrolizado es esterilizada antes de su utilizacion. La concentracion de dicha solucion es de 250 g/l. El cultivo dio lugar a una
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elevada acumulacion de la cepa de T. reesei y a una baja a produccion de celulasas. La demanda de ox^geno es muy importante al final del cultivo, con una k_a necesaria superior a 170 h-1.
El rendimiento de la produccion de protema con respecto al sustrato carbonado es inferior a 0,1 g/g, mientras que es de 0,3 g/g para los ejemplos 1 hasta 4.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados
Biomasa: g/l: 99,8 Protemas: g/l: 24,2 UPF: 14,5 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica: 1,1 lU/mg Ejemplo 6: no conforme
El ejemplo 6 muestra el inconveniente de la implementacion de la fase continua con un elevado mdice de dilucion, que conduce a un medio viscoso y a problemas de taponamientos en la bomba de extraccion a causa de la morfologfa del hongo cuando esta en la fase de crecimiento. La k_a, y por lo tanto, el coste operativo unido a la agitacion y la aireacion del medio, son elevados.
El ejemplo 6 se lleva a cabo en las mismas condiciones que las del ejemplo 4, con una primera fase a) de crecimiento en modo "batch" que dura 50 h, y una fase b) de produccion continua de celulasas y de hemicelulasas.
La solucion suministrada a la fase de produccion es una solucion de hidrolizado hemicelulosico que no ha sido esterilizada en la que se ha disuelto lactosa a 250 g/l. El caudal de suministro del sustrato carbonado inductor es de 13 ml/h, lo que se corresponde con 54 mg de azucares por g de cepa de Trichoderma reesei CL847 y por hora. La masa del volumen de reaccion se mantiene constante y el mdice de dilucion aplicado es de 0,025 h-1. La realizacion del experimento ha sido muy diffcil, con unos taponamientos repetidos de la bomba de extraccion, siendo el medio muy viscoso cuando el hongo esta en crecimiento. Se ha producido una elevada produccion de hongo y la consigna de pO2 no ha podido mantenerse por encima del 0 %. No ha podido alcanzarse el estado estacionario. La k_a del biorreactor no sido suficiente para proporcionar el oxfgeno necesario que permite consumir todo el azucar del suministro. Han podido medirse unas k_a de 700 h-1 en agua con este reactor.
Ejemplo 7: no conforme
El ejemplo 7 se lleva a cabo en las mismas condiciones que las del ejemplo 3, salvo por la diferencia de que la fase en modo "batch" se lleva a cabo con una concentracion de glucosa de 65 g/l. La fase a') en modo "fed-batch" y la fase b) de produccion en modo continuo se llevan a cabo en las mismas condiciones, con la diferencia de que la solucion suministrada en las fases a') y b) es una solucion de lactosa a 250 g/l acidificada mediante la adicion de acido sulfurico H2SO4 de forma que dicha solucion tema un pH de 1,5. Las evoluciones de las concentraciones de biomasa celular y de protemas se presentan en la figura 4. Igualmente en la figura 4 se representa la evolucion de las concentraciones de sulfatos y de iones amonio, que no son limitantes. El experimento no permite obtener una concentracion de protemas superior a 50 g/l. La concentracion de protemas se estabiliza a 50 g/l despues de 400 horas.
Los resultados obtenidos demuestran la importancia de la utilizacion de una solucion de hidrolizados hemicelulosicos en la fase de produccion continua, y que los rendimientos obtenidos no son debidos al aumento en la carencia de azufre y de nitrogeno.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa: g/l: 23 Protemas: g/l: 48,3 UPF: 31,2
p-Glucosidasa espedfica: 1,1 Ejemplo 8: no conforme
El ejemplo 8 se lleva a cabo en las mismas condiciones que las del ejemplo 3, salvo por la diferencia de que la solucion de hidrolizado hemicelulosico procedente de una paja pretratada mediante una explosion de vapor con una impregnacion previa de H2SO4 en la que se ha disuelto glucosa y lactosa, no es esterilizada, sino que experimenta una rectificacion de su pH mediante la adicion de NaOH. Su pH se eleva hasta 4. La produccion de protemas se detiene despues de 160 h y permanece estable a una concentracion proxima a 20 g/l.
Las determinaciones analfticas sobre el mosto final proporcionan los siguientes resultados:
Biomasa: g/l: 25,1 Protemas: g/l: 19,8 5 UPF: 15,8 lU/ml
p-Glucosidasa espedfica: 1,2 lU/mg

Claims (11)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de produccion de celulasas y hemicelulasas por una cepa perteneciente a un hongo filamentoso, en un biorreactor agitado y aireado, que comprende al menos dos fases:
    - una fase a) de crecimiento de dicha cepa en presencia de al menos un sustrato carbonado de crecimiento en un reactor cerrado, llevandose a cabo dicha fase de crecimiento con una concentracion de sustrato carbonado de crecimiento comprendida entre 10 y 90 g/l
    - una fase b) de produccion continua de celulasas en la que se suministra al menos un sustrato carbonado inductor con un caudal de suministro al menos constante durante un periodo al menos superior a 200 h, siendo dicho sustrato carbonado inductor al menos una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico, no experimentando dicha solucion acuosa del hidrolizado hemicelulosico ninguna esterilizacion previa ni ninguna rectificacion del pH, estando dicho pH de la solucion acuosa comprendido entre 0,5 y 3, manteniendose la masa del volumen de reaccion constante mediante la extraccion de una fraccion de dicho volumen de reaccion, operando dicha fase b) a un mdice de dilucion comprendido entre 0,001 y 0,008 h-1,
    en el que el sustrato carbonado inductor utilizado en la fase b) es una solucion acuosa de un hidrolizado hemicelulosico procedente de un pretratamiento acido de un sustrato lignocelulosico en una mezcla con al menos otro sustrato carbonado elegido entre azucares inductores o no inductores, en el que el caudal de suministro de dicho sustrato carbonado inductor esta comprendido entre 35 y 140 mg de sustrato carbonado inductor por gramo de peso seco de cepa y por hora.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha cepa es una cepa de Trichoderma reesei modificada mediante una mutacion, una seleccion o una recombinacion genetica.
  3. 3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el sustrato carbonado de crecimiento utilizado en dicha fase de crecimiento se elige entre la glucosa, la lactosa, la xilosa, los residuos obtenidos despues de una fermentacion etanolica de azucares monomeros de los hidrolizados enzimaticos del sustrato lignocelulosico y los extractos de la fraccion hemicelulosica en forma de monomeros procedentes del sustrato lignocelulosico pretratado, utilizado solo o en una mezcla.
  4. 4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el pretratamiento acido es una hidrolisis acida, una coccion acida o una explosion de vapor con una impregnacion previa de dicho sustrato lignocelulosico con una solucion acuosa de acido sulfurico.
  5. 5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el periodo de la fase b) de produccion continua de celulasas es al menos superior a 300 h.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 5, en el que el periodo de la fase b) de produccion continua de celulasas es al menos superior a 400 h.
  7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el caudal de suministro se aumenta gradualmente en la fase b).
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha fase b) opera a un mdice de dilucion comprendido entre 0,002 y 0,008 h-1.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que se implementa una fase opcional a') de crecimiento y de produccion llevada a cabo en un reactor de suministro continuo de al menos un sustrato carbonado inductor, durante la cual no se efectua ninguna extraccion del contenido del fermentador, entre la fase a) y la fase b).
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que dicho sustrato carbonado inductor utilizado en la fase a') es identico al sustrato carbonado inductor utilizado en la fase b) de produccion.
  11. 11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la fase a') es implementada durante un periodo comprendido entre 50 y 150 h.
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