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ES2640975T3 - Métodos y productos relacionados con heparina de peso molecular bajo - Google Patents

Métodos y productos relacionados con heparina de peso molecular bajo Download PDF

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ES2640975T3
ES2640975T3 ES08172045.0T ES08172045T ES2640975T3 ES 2640975 T3 ES2640975 T3 ES 2640975T3 ES 08172045 T ES08172045 T ES 08172045T ES 2640975 T3 ES2640975 T3 ES 2640975T3
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heparin
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lmwh
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ES08172045.0T
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Mallikarjun Sundaram
Ganesh Venkataraman
Zachary Shriver
Dongfang Liu
Yi Mei Qi
Ram Sasisekharan
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Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
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Abstract

Un método para analizar una muestra, que comprende las etapas de: aplicar un método de separación a heparina en la muestra para producir un polisacárido modificado que tiene un componente de firma; evaluar cuantitativamente el componente de firma en la muestra; y comparar la heparina en la muestra con una base de datos de referencia de polisacáridos de tamaño idéntico como la heparina, en el que los polisacáridos de la base de datos de referencia también se han sometido al mismo método de separación que la heparina en la muestra, para analizar de ese modo la muestra; en el que el componente de firma es: (a) un tetrasacárido del dominio de unión a AT-III de heparina; (b) un tetrasacárido del dominio de unión a FGF de heparina; (c) ΔUHNAc,6SGHNS,3S,6S; (d) ΔUHNS,6SGHNS,3S,6S; (e) ΔUHNAc,6SGHNS,3S; o (f) ΔUHNS,6SGHNS,3S.

Description

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Los HLGAGs y otros polisacáridos tienen todos ellos componentes de firma. Un “componente de firma” es un oligosacárido que está presente en y es característico de un polisacárido particular. Las propiedades de la firma seleccionada pueden depender del tipo de polisacárido que se estudia y del tipo de restricción experimental aplicada al polisacárido. La firma es un elemento reproducible de un polisacárido particular que se manipula con una restricción experimental particular. Por ejemplo, algunas firmas de los HLGAGs que han sido identificadas y cuya utilidad se ha demostrado son UHNAC,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S; UHNAC,6SGHNS,3S; o UHNS,6SGHNS,3S. Cuando una muestra que contiene HLGAG se somete a electroforesis capilar después de tratamiento con heparinasa, esta firma será identificada y es susceptible de ser cuantificada.
El componente de firma puede ser biológicamente activo o inactivo. Puede derivarse una información importante del componente de firma tanto si el mismo es un componente activo como si se trata de un componente inactivo. Una firma que tiene actividad biológica es un oligosacárido que se sabe que produce una función biológica específica. Por ejemplo, se sabe que los tetrasacáridos UHNAC,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S; UHNAC,6SGHNS,3S; o UHNS,6SGHNS,3S de HLGAGs forman parte de las secuencias que poseen actividad anticoagulante, dando como resultado la inhibición del factor Xa. Por tanto, la presencia de este componente en una muestra es directamente indicativa de la actividad anti-coagulante del HLGAG.
Las firmas que tienen actividad biológica pueden utilizarse para una diversidad de propósitos. Por ejemplo, estos tipos de firmas son útiles para monitorizar la variabilidad lote-a-lote de una preparación de polisacárido. La pureza de cada lote puede determinarse determinando la cantidad de componente activo de firma en el lote. Estas firmas son útiles también para monitorizar la presencia de componentes activos en la muestra, cuando la presencia del componente de firma en la muestra es indicativa de un componente activo en la muestra. Por ejemplo, el componente de firma puede utilizarse para seguir el componente activo a lo largo de un procedimiento de procesamiento. Utilizando este método, es posible evaluar los productos después de cada etapa de separación para determinar qué fracción contiene el componente biológicamente activo. La cantidad de componentes activos en la muestra puede cuantificarse también determinando la cantidad de componente de firma en la muestra.
Los métodos pueden realizarse también sobre al menos dos muestras a fin de determinar qué muestra tiene la actividad máxima o comparar de algún otro modo la pureza de las muestras. En este caso, se determinan las cantidades relativas de componente de firma en cada una de las al menos dos muestras. El nivel máximo relativo de componente de firma es indicativo de la muestra más activa.
Adicionalmente, la firma activa puede utilizarse para identificar moléculas biológicamente activas cribando compuestos o genotecas de compuestos. Las genotecas incluyen, por ejemplo, genotecas de presentación de fago, genotecas combinatorias, genotecas de peptoides y restos de síntesis no peptídicos. La presentación de fago puede ser particularmente eficaz en la identificación de péptidos que interaccionan con los componentes de firma, incluyendo anticuerpos humanos. Resumidamente, se prepara una genoteca de fagos (utilizando por ejemplo los fagos m13, fd, o lambda), presentando inserciones de 4 a aproximadamente 80 restos de aminoácidos utilizando procedimientos convencionales. Las inserciones pueden representar, por ejemplo, una matriz totalmente degenerada o sesgada. Es posible seleccionar luego inserciones portadoras de fago que se unen al componente de firma. Este proceso puede repetirse a lo largo de varios ciclos de reselección de fago que se une al componente de firma. Las tandas repetidas conducen al enriquecimiento de secuencias particulares portadoras del fago. El análisis de secuencias de ADN puede llevarse a cabo para identificar las secuencias de los polipéptidos expresados. Puede determinarse la porción lineal mínima de la secuencia que se une al componente de firma. Es posible repetir el procedimiento utilizando una genoteca sesgada que contiene inserciones que contienen parte o la totalidad de la porción lineal mínima más uno o más restos degenerados adicionales aguas arriba o aguas abajo de la misma. Pueden utilizarse también métodos de cribado de levadura de dos híbridos para identificar polipéptidos que se unen al componente de firma. Genotecas peptídicas y no peptídicas que están basadas en un componente de firma conocido pueden ser generadas fácilmente por los expertos en la técnica. Entidades comerciales tales como ArQule (Woburn, MA) preparan genotecas preparadas por encargo para la generación de compuestos miméticos.
Ejemplos de porciones biológicamente activas de un polisacárido incluyen, pero sin carácter limitante, un tetrasacárido del dominio de unión a AT-III de heparina, un tetrasacárido del dominio de unión a FGF de heparina, UHNAC,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S, UHNAC,6SGHNS,3S, o UHNS,6SGHNS,3S.
Las firmas que son biológicamente inactivas son oligosacáridos que no están asociados con una función biológica específica conocida. Estos oligosacáridos pueden tener alguna función biológica, pero no la función específica que se analiza. Por ejemplo, el oligosacárido puede causar realmente una inhibición del crecimiento de las células tumorales, pero no tener efecto alguno sobre la cascada de la coagulación. Si la muestra de polisacárido está siendo evaluada con el propósito de identificar la presencia o la cantidad de polisacáridos que son útiles para fines de anticoagulación, se considera que el oligosacárido que se detecta es una firma biológicamente inactiva. Por el contrario, si la muestra de polisacárido está siendo evaluada con el fin de identificar la presencia o cantidad de polisacáridos que son útiles para la prevención de la proliferación de las células tumorales, se considera que el oligosacárido que se detecta es una firma biológicamente activa.
Las firmas que son biológicamente inactivas pueden utilizarse para algunos de los mismos fines que las firmas biológicamente activas, así como para otros fines. Las firmas biológicamente inactivas pueden utilizarse también
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para monitorizar la variabilidad lote a lote de una preparación de polisacáridos. Puesto que se están comparando dos lotes entre sí, pueden utilizarse tanto firmas inactivas como firmas activas. Los componentes de firma inactivos pueden utilizarse también para monitorizar la presencia de componentes activos en la muestra cuando la presencia del componente de firma en la muestra es indicativa de una muestra que carece de una actividad específica o que tiene niveles menores de esta actividad. Así, si la presencia de un componente de firma inactivo es inversamente proporcional a la presencia de un componente activo, entonces la presencia del componente inactivo puede proporcionar información importante acerca de la actividad de la muestra. Por ejemplo, si el componente de firma inactivo es un producto de degradación de un componente activo de un polisacárido, entonces la presencia del componente inactivo indica que algo del componente activo se ha descompuesto y por tanto la muestra es menos activa de que lo sería en el caso de que no estuviera presente el componente inactivo.
Una “restricción experimental”, como se utiliza en esta memoria, es un proceso bioquímico realizado sobre una muestra de polisacárido que da como resultado una modificación de la muestra que permite que se detecte la firma. Restricciones experimentales incluyen, pero sin carácter limitante, métodos de separación, por ejemplo espectrometría de masas, electroforesis capilar, cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), cromatografía de permeación en gel, resonancia magnética nuclear; digestión enzimática, por ejemplo con una exoenzima, una endoenzima; digestión química; modificación química; desprendimiento químico (es decir, eliminación de una unidad de monosacárido); y modificación enzimática, por ejemplo sulfatación en una posición particular con una sulfotransferasa de sulfato de heparano.
La firma puede identificarse por cualquier medio que sea coherente con la restricción experimental utilizada. El peso molecular de un componente de firma, por ejemplo, puede determinarse por varios métodos que incluyen espectrometría de masas. El uso de espectrometría de masas para determinar el peso molecular de los polisacáridos es bien conocido en la técnica. La espectrometría de masas ha sido utilizada como una herramienta potente para caracterizar polisacáridos debido a su exactitud (± 1 Dalton) a la hora de dar las masas de fragmentos generadas (por ejemplo, por escisión enzimática), y también debido a que se requieren únicamente concentraciones de muestra del orden de pM. Por ejemplo, se ha descrito la espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-MS) para identificar el peso molecular de fragmentos de polisacáridos en publicaciones tales como Rhomberg, A. J. et al, PNAS, USA, v. 95, p. 4176-4181 (1998); Rhomberg, A. J. et al, PNAS, USA, v. 95, p. 12232-12237 (1998); y Ernst, S. et. al., PNAS, USA, v. 95, p. 4182-4187 (1998). Otros tipos de espectrometría de masas conocidos en la técnica, tales como MS con pulverización electrónica, espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos (FAB-MS) y espectrometría de masas con disociación activada por colisión (CAD) pueden utilizarse también para identificar el peso molecular de los fragmentos de polisacáridos.
Los datos de espectrometría de masas pueden ser un instrumento valioso para averiguar información acerca del componente de firma del polisacárido solo o después de que el polisacárido ha sufrido degradación con enzimas o productos químicos. Después de que se ha identificado el peso molecular de un polisacárido, puede compararse el mismo con pesos moleculares de otros polisacáridos conocidos (por ejemplo utilizando los métodos de las Solicitudes de Patente de U.S. nos de Serie 09/557.997 y 09/558.137 presentadas el 24 de abril de 2000). Como se muestra en estas solicitudes de patente, una técnica para comparar pesos moleculares consiste en generar una línea de masas y comparar el peso molecular del polisacárido desconocido con la línea de masas a fin de determinar una subpoblación de polisacáridos que tienen el mismo peso molecular. Una “línea de masas” es una base de datos de información, preferiblemente en forma de un gráfico o diagrama que almacena información para cada tipo posible de polisacárido que tenga una secuencia única basada en el peso molecular del polisacárido. Dado que los datos de espectrometría de masas indican la masa de un fragmento con exactitud de 1 Da, puede asignarse una longitud únicamente a un fragmento por consulta de una masa en la línea de masas. Adicionalmente, puede determinarse a partir de la línea de masas que, dentro de un fragmento de una longitud particular mayor que un disacárido, existe un mínimo de 4,02 Da diferente en masas que indica que dos grupos acetato (84,08 Da) han reemplazado a un grupo sulfato (80,06 Da). Por tanto, puede determinarse un número de sulfatos y acetatos de un fragmento de polisacárido a partir de la masa proporcionada por los datos de espectrometría de masas, y puede asignarse dicho número al fragmento de polisacárido.
Además del peso molecular, pueden determinarse otras propiedades de un componente de firma. Las relaciones de composición de los sustituyentes o unidades químicas (cantidad y tipo de sustituyentes o unidades químicas totales) pueden determinarse utilizando metodología conocida en la técnica, tal como electroforesis capilar. Un polisacárido puede someterse a una primera restricción experimental tal como degradación enzimática o química para separar el polisacárido en fragmentos más pequeños. Estos fragmentos pueden someterse luego a una segunda restricción experimental, es decir, pueden separarse utilizando electroforesis capilar para determinar la cantidad y tipo de sustituyentes o unidades químicas presentes en el polisacárido. Alternativamente, el polisacárido puede someterse a una sola restricción experimental tal como electroforesis capilar, sin degradación enzimática previa.
En el método de electroforesis capilar en gel, pueden analizarse muestras de reacción por capilares de pequeño diámetro llenos de gel. El pequeño diámetro de los capilares (50 m) permite la disipación eficiente del calor generado durante la electroforesis. Así, pueden utilizarse altas intensidades de campo sin calentamiento Joule excesivo (400 V/m), reduciendo el tiempo de separación a aproximadamente 20 minutos por experimento de reacción, aumentando con ello la resolución con respecto a la electroforesis en gel convencional. Adicionalmente,
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AUC%R = AUC relativa en porcentaje [(100 x AUCC)/AUCT)]
AUCC = área bajo la curva para un componente
AUCT = la suma del área bajo la curva para todos los componentes.
Los datos pueden procesarse individualmente o por medio de un ordenador. Por ejemplo, puede realizarse de acuerdo con la invención un método implementado por ordenador para generar una estructura de datos, materializada tangiblemente en un medio legible por ordenador, que representa un valor cuantitativo de un componente de un polisacárido. La determinación cuantitativa se efectúa realizando el cálculo anterior.
Un sistema de ordenador que puede realizar lo anterior como un programa de ordenador puede incluir típicamente una unidad principal conectada a la vez a un dispositivo de salida que presenta la información a un usuario y a un dispositivo de entrada que recibe la entrada de un usuario. La unidad principal incluye generalmente un procesador conectado a un sistema de memoria por un mecanismo de interconexión. El dispositivo de entrada y el dispositivo de salida pueden estar conectados también al procesador y al sistema de memoria por el mecanismo de interconexión.
Pueden estar conectados al sistema de ordenador uno o más dispositivos de salida. Ejemplos de dispositivos de salida incluyen una presentación por tubo de rayos catódicos (CRT), presentaciones de cristal líquido (LCD), impresoras, dispositivos de comunicación tales como un módem, y salida de audio. Pueden estar conectados también al sistema de ordenador uno o más dispositivos de entrada. Dispositivos de entrada ilustrativos incluyen un teclado convencional, teclado numérico, esfera de control, ratón, pluma y tableta, dispositivo de comunicación, y dispositivos de entrada de datos tales como sensores. La materia que constituye el objeto descrito en esta memoria no se limita a los dispositivos particulares de entrada o salida utilizados en combinación con el sistema de ordenador
o a los descritos en esta memoria.
El sistema de ordenador puede ser un sistema de ordenador de uso general que puede programarse utilizando un lenguaje de programación de ordenador, tal como C++, Java, u otro lenguaje, tal como un lenguaje de programación
o lenguaje ensamblador. El sistema de ordenador puede incluir también hardware para fines especiales, programado especialmente, tal como, por ejemplo, un Circuito Integrado de Aplicación Específica (ASIC). En un sistema de ordenador de uso general, el procesador es típicamente un procesador disponible comercialmente, del que son ejemplos las series de procesadores x86, Celeron, y Pentium, disponibles de Intel, y dispositivos similares de AMD y Cyrix, los microprocesadores de la serie 680X0 disponibles de Motorola, el microprocesador PowerPC de IBM, y los procesadores de la serie Alpha de Digital Equipment Corporation. Están disponibles muchos otros procesadores. Un microprocesador de este tipo ejecuta un programa denominado sistema operativo, del que son ejemplos Windows NT, Linux, UNIX, DOS, VMS y OS8, que controla la ejecución de otros programas de ordenador y proporciona programación, depuración de fallos, control de entrada/salida, contabilidad, compilación, asignación de almacenamiento, tratamiento de los datos y gestión de la memoria, así como control de las comunicaciones y servicios análogos. El procesador y el sistema operativo definen una plataforma de ordenador para la cual pueden escribirse programas de aplicación en lenguajes de programación de alto nivel.
Un sistema de memoria incluye típicamente un medio de registro no volátil legible por ordenador y susceptible de escritura, del cual son ejemplos un disco magnético, una memoria flash y una cinta. El disco puede ser movible, tal como un “disco flexible”, o permanente, conocido como un disco duro. Un disco tiene cierto número de pistas en las cuales se almacenan señales, típicamente en forma binaria, es decir, una forma interpretada como una secuencia de unos y ceros. Señales de este tipo pueden definir un programa de aplicación a ejecutar por el microprocesador, o información almacenada en el disco que debe ser procesada por el programa de aplicación. Típicamente, durante la operación, el procesador hace que los datos sean leídos del medio de registro no volátil a un elemento de memoria de circuito integrado, que es típicamente una memoria volátil de acceso aleatorio tal como una memoria dinámica de acceso aleatorio (DRAM) o memoria estática (SRAM). El elemento de memoria de circuito integrado permite típicamente un acceso más rápido que el disco a la información por el procesador. El procesador manipula generalmente los datos contenidos en la memoria de circuito integrado y copia luego los datos al disco después de que se ha completado el procesamiento. Se conoce una diversidad de mecanismos para gestionar el movimiento de los datos entre el disco y el elemento de memoria de circuito integrado, y el objeto descrito en esta memoria no se limita a tales mecanismos. Adicionalmente, el objeto descrito en esta memoria no se limita a un sistema de memoria particular.
El objeto descrito en esta memoria no está limitado a una plataforma de ordenador particular, procesador particular,
o lenguaje de programación de alto nivel particular. Adicionalmente, el sistema de ordenador puede ser un sistema de ordenador multiprocesador o puede incluir ordenadores múltiples conectados a una red de ordenadores. Debe entenderse que cada módulo (por ejemplo 110, 120) en FIG. 1 puede ser módulos separados de un programa de ordenador, o puede tratarse de programas de ordenador separados. Tales módulos pueden ser operativos en ordenadores separados. Los datos (por ejemplo, 104, 106, 110, 114, y 116) pueden almacenarse en un sistema de memoria o transmitirse entre sistemas de ordenadores. El objeto descrito en esta memoria no está limitado a ninguna implementación particular que utilice software o hardware o firmware, o cualquier combinación de los mismos. Los diversos elementos del sistema, sea individualmente o en combinación, pueden implementarse como un producto de programa de ordenador materializado tangiblemente en un dispositivo de almacenamiento legible por
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la máquina para ejecución por un procesador de ordenador. Se pueden realizar diversas etapas del proceso por un procesador de ordenador que ejecute un programa materializado tangiblemente en un medio legible por ordenador para realizar funciones trabajando sobre una entrada y generando una salida. Los lenguajes de programación de ordenador adecuados para implementar un sistema de este tipo incluyen lenguajes de programación de procedimientos, lenguajes de programación orientados a objetos, y combinaciones de ambos.
También se descubrieron métodos mejorados para preparar composiciones de LMWH. Los métodos actuales para purificar heparina de bajo peso molecular (LMWH) para uso clínico incluyen la precipitación de una mezcla de glucosaminoglucanos y la recuperación de una fracción que contiene fragmentos de heparina que oscilan en tamaño desde 1 a 14.000 Da. En N. Volpi, Biochemica t Diophysica Acta 1290 (1996) 299-307 se describe un método estándar utilizado en la purificación de heparina:
... los componentes de movimiento lento y de movimiento rápido de heparina se purificaron como sus sales de bario a diferentes temperaturas, como se dio a conocer previamente. La heparina purificada de mucosa intestinal bovina se disolvió en agua, y se añadió lentamente con agitación acetato de bario (5%) (el pH de la disolución se ajustó a 6,0-7,0). Tras calentar hasta 50º-70ºC, la disolución se dejó a temperatura ambiente (20-25ºC) durante 24 h. El precipitado obtenido se solubilizó en agua y se transformó en su sal sódica en resina de Amberlite IR-120. La sal sódica de la especie de heparina de movimiento lento bruta se recogió por precipitación con 2,0 volúmenes de acetona y se secó. El sobrenadante se mantuvo a 5ºC durante 24 h, y el precipitado se recogió por centrifugación a 5ºC. La sal de bario de la especie de movimiento rápido se purificó como se dio a conocer para la especie de movimiento lento.
El producto obtenido mediante esta metodología es una mezcla heterogénea de fragmentos de heparina que tiene numerosas dificultades cuando se administra a pacientes, debido a la naturaleza heterogénea del producto así como la falta de capacidad para cuantificar los niveles de componentes activos en la mezcla. Por el contrario, la nueva estrategia de purificación descrita aquí proporciona una fracción sustancialmente pura de LMWH que es cuantificable y reproducible, y de este modo carece de muchos de los efectos secundarios asociados con el producto de la técnica anterior. Sorprendentemente, se descubrió según la invención que la fracción citada como el componente de movimiento rápido (la segunda fracción), que se desechó en los métodos de la técnica anterior, realmente tiene cantidades significativas de actividad terapéutica. De este modo, el presente método implica un tipo similar de reacción de precipitación, pero implica el aislamiento y manipulación del material desechado previamente.
En general, el método implica una precipitación de la muestra de HLGAG con una sal de cationes divalentes y aniones débiles. En algunas realizaciones, la sal de los cationes divalentes y aniones débiles se selecciona de entre el grupo que incluye: bario, calcio, magnesio, estroncio, cobre, níquel, cadmio, cinc, mercurio, berilio, níquel, paladio, platino, hierro, y estaño. En algunas realizaciones, la sal de cationes divalentes y aniones débiles son acetatos de cationes de elementos de la tabla periódica que tienen valencia divalente. En realizaciones preferidas, la sal de cationes divalentes y aniones débiles es acetato de bario. En otras realizaciones, la sal de cationes divalentes y aniones débiles es acetato de calcio o cloruro de calcio. En algunas realizaciones, se pueden usar otros métodos de precipitación con acetato que son conocidos por los expertos en la técnica.
La precipitación se puede llevar a cabo en el intervalo de temperaturas de 0ºC a 70ºC. La temperatura para la precipitación puede ser 0ºC, 2ºC, 5ºC, 10ºC, 15ºC, 20ºC, 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC, o 70ºC, o puede ser cualquier temperatura dentro de este intervalo. En una realización preferida, la temperatura de la precipitación es 4ºC. En otras realizaciones, la temperatura de la precipitación será la temperatura ambiente, que incluye temperaturas en el intervalo de 18ºC a 22ºC.
El disolvente usado en la precipitación es un disolvente polar. En algunas realizaciones, el disolvente polar es H2O, etanol, acetona, H2O mezclado con etanol, H2O mezclado con acetona, acetona. En algunas realizaciones, el disolvente polar tiene una relación volumen a volumen de H2O:etanol en el intervalo de: 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 65:35, 55:45, 50:50, 45:55, 35:65, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, o 1:99. En otras realizaciones, el disolvente polar tiene una relación volumen a volumen de H2O:acetona en el intervalo de 99:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 65:35, 55:45, 50:50, 45:55, 35:65, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, o 1:99. En todavía otras realizaciones, el disolvente polar es una mezcla de H2O, etanol, y acetona.
Tras la etapa de la precipitación, la muestra (segunda fracción) se puede someter opcionalmente a un proceso de intercambio iónico antes de ser procesada adicionalmente. En algunos casos, la muestra se hace pasar a través de una columna de intercambio iónico, tal como una columna de amberlite IR-120. El uso de este tipo de columna es útil para eliminar la sal usada en la etapa de precipitación, y sustituirla por otra tal como sodio.
La muestra que contiene glucosaminoglucano es una muestra, de la cual al menos una fracción está compuesta de glucosaminoglucanos o HLGAGs. Como se ha expuesto anteriormente, los términos glucosaminoglucano o HLGAG incluyen, pero sin carácter limitante, heparina, análogos de heparina, LMWH, heparina biotecnológica, heparina modificada químicamente, o heparina sintética.
El glucosaminoglucano se puede fraccionar en heparina de un tamaño específico variando las condiciones descritas aquí para temperatura, disolvente, y enzima. Los ejemplos de resultados de variaciones de temperatura, aunque no
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realizaciones, la preparación de LMWH tiene al menos 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 15,0, o 20,0% de UHNAC,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S; UHNAC,6SGHNS,3S; or UHNS,6SGHNS,3S.
Las composiciones de LMWH se pueden formular opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones se pueden formular además en dispositivos de suministro específicos. Así, en algunas realizaciones, las composiciones se formulan específicamente para la forma de suministro intravenosa, subcutánea, oral, en aerosol, u otra forma de suministro mucosal. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan en dispositivos de liberación sostenida como se describe más abajo.
Alguien de pericia normal en la técnica, a la luz de la presente descripción, está capacitado para producir preparaciones sustancialmente puras de composiciones de LMWH. Las preparaciones de LMWH se preparan a partir de fuentes de HLGAG. Una “fuente de HLGAG”, como se utiliza en esta memoria, hace referencia a una composición de glucosaminoglucano semejante a heparina que puede manipularse para producir LMWH utilizando tecnología estándar, incluyendo degradación enzimática, etc. Como se ha descrito arriba, los HLGAGs incluyen, pero sin carácter limitante, heparina aislada, heparina modificada químicamente, heparina preparada por biotecnología, heparina sintética, sulfato de heparano, y LMWH. Así pues, pueden aislarse HLGAGs de fuentes naturales, prepararse por síntesis directa, mutagénesis, etc. Los HLGAGs pueden ser sustancialmente puros en algunas realizaciones. Como se utiliza en esta memoria, la expresión “sustancialmente puro” significa que los polisacáridos están esencialmente exentos de otras sustancias en una proporción práctica y apropiada para su uso propuesto. En particular, los polisacáridos son suficientemente puros y están suficientemente exentos de otros constituyentes biológicos de sus ambientes hospedantes, de tal modo que son útiles en, por ejemplo, producción de preparaciones farmacéuticas.
Las preparaciones de LMWH como se utilizan en esta memoria son sales de GAGs sulfatados que tienen un peso molecular (MW) medio inferior a 8.000 Da y para las cuales al menos 60% de todas las moléculas tienen un MW inferior a 8.000 Da. Por definición, las preparaciones de LMWH se producen a partir de una muestra de HLGAG. El término LMWH no abarca polisacáridos que se sintetizan directamente como LMWHs, tales como SR90107A. SR90107A es un polisacárido sintético que tiene un peso molecular de aproximadamente 1500 Da. Estos tipos de compuestos, que se preparan directamente como compuestos de peso molecular bajo en lugar de prepararse a partir de una fuente de HLGAGs, no se consideran comprendidos dentro de la clase de LMWH. El término LMWH sí incluye, sin embargo, HLGAGs sintéticos que se procesan para producir LMWHs.
Se han utilizado varios métodos diferentes para la preparación comercial de LMWHs. El fraccionamiento directo por tamaños se ha utilizado para preparar LMWH (Fraxiparin) en una escala experimental, pero su deficiente rendimiento ha impedido por regla general su utilización en escala industrial. Para fines de producción industrial, se han utilizado cierto número de procesos químicos o enzimáticos. Los procesos químicos aprovechan la ventaja de un amplio intervalo de reacciones tales como despolimerización parcial con ácido nitroso (Fragmin), escisión oxidantiva con H2O2 (Normiflo y Fluxum), escisión oxidantiva con Cu++ y H2O2, o por bencilación seguida por eliminación e hidrólisis alcalina (Enoxaparin). Se han descrito también métodos enzimáticos para generar LMWH utilizando despolimerización parcial -eliminadora por heparinasa I (Logiparin).
Las LMWHS producidas según la presente descripción tienen propiedades funcionales mejoradas con respecto a las preparaciones de LMWH de la técnica anterior. Una ventaja de las composiciones de la descripción es que se puede alterar la cantidad de actividad anticoagulante para fines terapéuticos. Dependiendo del sujeto que se esté tratando y/o de la afección del sujeto, puede ser deseable incrementar o disminuir la actividad anticoagulante de los compuestos. Por ejemplo, si un sujeto sufre un suceso de coagulación agudo, a menudo es deseable administrar al sujeto una preparación de LMWH que tiene una actividad anticoagulante elevada, tal como una de las composiciones que tiene una actividad de al menos 150 UI/mg. Otros sujetos pueden estar solamente en riesgo de desarrollar un trastorno trombótico. Generalmente es deseable administrar a estos sujetos una preparación de LMWH que tiene una menor actividad anticoagulante. La capacidad de identificar el porcentaje de región de unión a AT no escindida, tal como el decasacárido que tiene la estructura U2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S, o uno de los tetrasacáridos UHNAc,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S; UHNAC,6SGHNS,3S; o UHNS,6SGHNS,3S (o compuestos relacionados), en una muestra, permite que se formulen composiciones con cantidades específicas de región no escindida de unión a AT intacta. Esta capacidad de preparar LMWH con porcentajes conocidos de la región de unión a AT intacta proporciona un método para cuantificar la actividad de composiciones terapéuticas de LMWH. Así pues, los métodos de la invención hacen posible que una persona con experiencia en la técnica prepare
o identifique una composición apropiada de LMWH, dependiendo del sujeto y del trastorno que se esté tratando.
Como se utiliza en esta memoria, el término “intacto” significa no escindido y completo. La expresión “regiones de unión a AT” hace referencia a una región de HLGAG que interacciona específicamente con AT-III. La región de unión a AT incluye el compuesto decasacárido que tiene la estructura: U2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S y los tetrasacáridos UHNAC,6SGHNS,3S,6S, UHNS,6SGHNS,3S,6S; UHNAC,6SGHNS,3S; y UHNS,6SGHNS,3S. En algunas realizaciones, la preparación de LMWH es una composición en la cual al menos 20% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de unión a AT intacto. En otras realizaciones, al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o 55% de la secuencia del polisacárido en la composición es región de unión a AT intacto. Como se ha expuesto anteriormente, el porcentaje óptimo de AT-10 intacto en una composición para tratamiento variará
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adecuadas para administraciones subcutáneas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, etc., se pueden encontrar en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Hay disponible una variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del porcentaje particular de LMWH seleccionado, de la afección particular que se esté tratando, y de la dosis requerida para la eficacia terapéutica. De forma general, los métodos se pueden poner en práctica usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, queriendo decir cualquier modo que produzca niveles eficaces de un efecto biológico sin provocar efectos adversos clínicamente inaceptables.
Para uso en terapia, una cantidad eficaz de la preparación de LMWH se puede administrar a un sujeto mediante cualquier modo que suministre la LMWH a la superficie deseada, por ejemplo mucosal, sistémico. La “administración” de la composición farmacéutica se puede lograr por cualquier medio conocido por el experto. Las vías preferidas de administración incluyen, pero no se limitan a, oral, parenteral, intramuscular, intranasal, intratraqueal, por inhalación, ocular, vaginal y rectal.
Para la administración oral, los compuestos (es decir, las preparaciones de LMWH) se pueden formular fácilmente combinando el compuesto o compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, y similares, para ingestión oral por el sujeto a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener como excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, tras añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular en disolución salina o amortiguadores para neutralizar condiciones ácidas internas, o se pueden administrar sin vehículos.
Los núcleos de las grageas se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar disoluciones de azúcares concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Se pueden añadir materias colorantes o pigmentos a los comprimidos o revestimientos de grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas de dos partes hechas de gelatina, así como cápsulas blandas cerradas herméticamente hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol
o sorbitol. Las cápsulas de dos partes pueden contener los ingredientes activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. También se pueden usar microesferas formuladas para administración oral. Tales microesferas se han definido bien en la técnica. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para tal administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar, formulados de manera convencional.
Para la administración mediante inhalación, los compuestos para uso según la presente invención se pueden suministrar convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol de paquetes a presión o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presión, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de por ejemplo gelatina para uso en un inhalador o insuflador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Cuando es deseable suministrarlos sistémicamente, los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampollas o en recipientes de múltiples dosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tener formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen
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aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes adecuados o agentes que incrementan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones muy concentradas.
Como alternativa, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes del uso.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados apenas solubles, por ejemplo como una sal apenas soluble.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase de gel adecuados. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Tales formas de preparación farmacéutica líquidas o sólidas adecuadas son, por ejemplo, disoluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, revestidas sobre partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, peletes para implante en la piel, o secadas sobre un objeto afilado para ser rayado sobre la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación extendida de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, saborizantes, edulcorantes o solubilizantes como se describen anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para uso en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Para un repaso breve de los métodos para el suministro de fármacos, véase Langer, Science 249:1527-1533, (1990).
Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria, y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar la LMWH activa con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el polisacárido con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y entonces, si es necesario, conformando el producto. El polisacárido se puede almacenar liofilizado.
Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación en el tiempo, de liberación retrasada o de liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar las administraciones repetidas de la LMWH, incrementando las ventajas para el sujeto y el médico. Existen muchos tipos de sistemas de suministro de liberación, y son conocidos por los expertos normales en la técnica. Incluyen sistemas a base de polímeros tales como poliácido láctico y poliácido glicólico, polianhídridos y policaprolactona; sistemas sin polímeros que son lípidos, incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono, di-y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas a base de péptidos; revestimientos de cera, comprimidos prensados que usan aglutinantes y excipientes convencionales, implantes parcialmente fusionados, y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas erosionales, en los que el polisacárido está contenido en una forma dentro de una matriz, encontrados en las patentes U.S. nos 4.452.775 (Kent); 4.667.014 (Nestor et al.); y 4.748.034 y 5.239.660 (Leonard), y (b) sistemas difusionales, en los que un componente activo permea a una velocidad controlada a través de un polímero, encontrados en las patentes U.S. nos 3.832.253 (Higuchi et al.) y 3.854.480 (Zaffaroni). Además, se puede utilizar un sistema de suministro de hardware a base de una bomba, algunos de los cuales están adaptados para el implante.
Cuando se administran a un paciente que sufre tratamiento contra el cáncer, las composiciones de LMWH se pueden administrar en cócteles que contienen otros agentes anticancerosos. Las composiciones también se pueden administrar en cócteles que contienen agentes que tratan los efectos secundarios de la terapia de radiación, tales como antieméticos, protectores de la radiación, etc.
Los fármacos anticancerosos que se pueden coadministrar con los compuestos de la invención incluyen, pero no se limitan a Acivicina; Aclarrubicina; Hidrocloruro de Acodazol; Acronina; Adriamicina; Adozelesina; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlina; Azacitidina; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Hidrocloruro de Bisantreno; Dimesilato de Bisnafida; Bizelesina; Sulfato de Bleomicina; Brequinar Sódico; Bropirimina; Busulfán; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetimer; Carboplatino; Carmustina; Hidrocloruro de Carubicina;
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Carzelesina; Cedefingol; Clorambucilo; Cirolemicina; Cisplatino; Cladribina; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabina; Dacarbazina; Dactinomicina; Hidrocloruro de Daunorrubicina; Decitabina; Dexormaplatino; Dezaguanina; Mesilato de Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel; Doxorrubicina; Hidrocloruro de Doxorrubicina; Droloxifeno; Citrato de Droloxifeno; Propionato de Dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Hidrocloruro de Eflornitina; Elsamitrucina; Enloplatino; Enpromato; Epipropidina; Hidrocloruro de Epirrubicina; Erbulozol; Hidrocloruro de Esorrubicina; Estramustina; Fosfato de Estramustina y Sodio; Etanidazol; Etopósido; Fosfato de Etopósido; Etoprina; Hidrocloruro de Fadrozol; Fazarabina; Fenretinida; Floxuridina; Fosfato de Fludarabina; Fluorouracilo; Flurocitabina; Fosquidona; Fostriecina Sódica; Gemcitabina; Hidrocloruro de Gemcitabina; Hidroxiurea; Hidrocloruro de Idarrubicina; Ifosfamida; Ilmofosina; Interferón Alfa-2a; Interferón Alfa-2b; Interferón Alfa-n1; Interferón Alfa-n3; Interferón Beta-Ia; Interferón Gamma-Ib; Iproplatino; Hidrocloruro de Irinotecán; Acetato de Lanreotida; Letrozol; Acetato de Leuprolida; Hidrocloruro de Liarozol; Lometrexol Sódico; Lomustina; Hidrocloruro de Losoxantrona; Masoprocol; Maitansina; Hidrocloruro de Mecloretamina; Acetato de Megestrol; Acetato de Melengestrol; Melfalán; Menogaril; Mercaptopurina; Metotrexato; Metotrexato Sódico; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcina; Mitocromina; Mitogilina; Mitomalcina; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Hidrocloruro de Mitoxantrona; Ácido Micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatino; Oxisuran; Paclitaxel; Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustina; Sulfato de Peplomicina; Perfosfamida; Pipobromán; Piposulfán; Hidrocloruro de Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimer Sódico; Porfiromicina; Prednimustina; Hidrocloruro de Procarbazina; Puromicina; Hidrocloruro de Puromicina; Pirazofurina; Riboprina; Rogletimida; Safingol; Hidrocloruro de Safingol; Semustina; Simtrazeno; Esparfosato Sódico; Esparsomicina; Hidrocloruro de Espirogermanio; Espiromustina; Espiroplatino; Estreptonigrina; Estreptozocina; Sulofenur; Talisomicina; Tecogalán Sódico; Tegafur; Hidrocloruro de Teloxantrona; Temoporfina; Tenipósido; Teroxirona; Testolactona; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurina; Tirapazamina; Hidrocloruro de Topotecán; Citrato de Toremifeno; Acetato de Trestolona; Fosfato de Triciribina; Trimetrexato; Glucuronato de Trimetrexato; Triptorrelina; Hidrocloruro de Tubulozol; Mostaza de Uracilo; Uredepa; Vapreotida; Verteporfina; Sulfato de Vinblastina; Sulfato de Vincristina; Vindesina; Sulfato de Vindesina; Sulfato de Vinepidina; Sulfato de Vinglicinato; Sulfato de Vinleurosina; Tartrato de Vinorrelbina; Sulfato de Vinrosidina; Sulfato de Vinzolidina; Vorozol; Zeniplatino; Zinostatina; Hidrocloruro de Zorrubicina.
Las composiciones de LMWH también se pueden enlazar a una molécula seleccionadora de dianas. Una molécula seleccionadora de dianas es cualquier molécula o compuesto que es específico para una célula o tejido particular y que se puede usar para dirigir la LMWH a la célula o tejido. Preferiblemente, la molécula seleccionadora de dianas es una molécula que interacciona específicamente con una célula cancerosa o un tumor. Por ejemplo, la molécula seleccionadora de dianas puede ser una proteína u otro tipo de molécula que reconoce e interacciona específicamente con un antígeno tumoral.
Los antígenos tumorales incluyen Melan-A/MART-1, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno asociado a carcinoma colorrectal (CRC)--C017-1A/GA733, Antígeno Carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6; aml1, Antígeno Específico de la Próstata (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2, y PSA-3, Antígeno de Membrana Específico de la Próstata (PSMA), cadena zeta del receptor de células T/CD3, familia de MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia de GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia de MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, fetoproteína, E-cadherina, catenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, glicógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1, CT-7, cdc27, proteína de Adenomatous polyposis coli (APC), fodrina, P1A, Conexina 37, idiotipo de Ig, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos víricos tales como proteínas del virus del papiloma humano, familia de Smad de antígenos tumorales, Imp-1, antígeno nuclear codificado por el EBV (EBNA)-1, y cerbB-2.
Para ejemplos de antígenos tumorales que se unen a moléculas de MHC clase I y MHC clase II, o a ambas, véanse las siguientes referencias: Coulie, Stem Cells 13:393-403, 1995; Traversari et al., J. Exp. Med. 176:1453-1457, 1992; Chaux et al., J. Immunol. 163:2928-2936, 1999; Fujie et al., Int. J. Cancer 80:169-172, 1999; Tanzarella et al., Cancer Res. 59:2668-2674, 1999; van der Bruggen et al., Eur. J. Immunol. 24:2134-2140, 1994; Chaux et al., J. Exp. Med. 189:767-778, 1999; Kawashima et al, Hum. Immunol. 59:1-14, 1998; Tahara et al., Clin. Cancer Res. 5:22362241, 1999; Gaugler et al., J. Exp. Med. 179:921-930, 1994; van der Bruggen et al., Eur. J. Immunol. 24:3038-3043, 1994; Tanaka et al., Cancer Res. 57:4465-4468, 1997; Oiso et al., Int. J. Cancer 81:387-394, 1999; Herman et al., Immunogenetics 43:377-383,1996; Manici et al., J. Exp. Med. 189:871-876, 1999; Duffour et al., Eur. J. Immunol. 29:3329-3337, 1999; Zorn et al., Eur. J. Immunol. 29:602-607, 1999; Huang et al., J. Immunol. 162:6849-6854, 1999; Boël et al., Immunity 2:167-175, 1995; Van den Eynde et al., J. Exp. Med. 182:689-698, 1995; De Backer et al., Cancer Res. 59:3157-3165, 1999; Jäger et al., J. Exp. Med. 187:265-270, 1998; Wang et al., J. Immunol. 161:35963606, 1998; Aarnoudse et al., Int. J. Cancer 82:442-448, 1999; Guilloux et al., J. Exp. Med. 183:1173-1183, 1996; Lupetti et al., J. Exp. Med. 188:1005-1016, 1998; Wölfel et al., Eur. J. Immunol. 24:759-764, 1994; Skipper et al., J. Exp. Med. 183:527-534, 1996; Kang et al., J. Immunol. 155:1343-1348, 1995; Morel et al., Int. J. Cancer 83:755-759, 1999; Brichard et al., Eur. J. Immunol. 26:224-230, 1996; Kittlesen et al., J. Immunol 160:2099-2106, 1998; Kawakami et al., J. Immunol. 161:6985-6992, 1998; Topalian et al., J. Exp. Med. 183:1965-1971, 1996; Kobayashi et
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La descripción siguiente de experimentos realizados es ilustrativa y no limitante del alcance de la invención reivindicada.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Secuenciación de los decasacáridos que contienen 3-O-sulfato con un sitio de unión a antitrombina III parcial.
Introducción:
La heparina y los glucosaminoglucanos de sulfato de heparano representan una clase importante de moléculas que interaccionan con y modulan la actividad de factores de crecimiento, enzimas, y morfógenos. De las muchas funciones biológicas para esta clase de moléculas, una de sus funciones más importantes es su interacción con antitrombina III (AT-III). La unión de AT-III a una secuencia específica del pentasacárido de heparina, que contiene un 3O-sulfato extraño en una glucosamina N-sulfatada, 6-O-sulfatada, aumenta 1000 veces la capacidad de AT-III para inhibir proteasas específicas en la cascada de coagulación. De esta manera, los glucosaminoglucanos similares a la heparina (HLGAGs) juegan un papel biológico y farmacológico importante en la modulación de la coagulación de la sangre. Recientemente, se ha desarrollado una metodología de secuenciación (Solicitudes de Patente US nos de Serie 09/557.997 y 09/558.137, presentadas el 24 de abril de 2000, de los mismos inventores, y Venkataraman, G., Shriver, Z., Raman, R. y Sasisekharan, R. (1999) Science 286, 537-42.) para impulsar las relaciones de estructurafunción de esta clase importante de moléculas. Esta metodología combina un esquema de nomenclatura codificado por propiedades (PEN), para manipular el gran contenido de información (propiedades) de los HLGAGs, con la espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-MS) y la degradación enzimática y química como restricciones experimentales para secuenciar rápidamente cantidades de picomoles de los oligosacáridos de HLGAG. Utilizando el enfoque de PEN-MALDI anterior, los autores de la presente invención han encontrado que la secuencia del decasacárido utilizada en este estudio es U2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S (±DDD4-7). Los autores de la presente invención han confirmado sus propios resultados utilizando Secuenciación Integral de Glucanos y resonancia magnética nuclear unidimensional de protón. Adicionalmente, los autores de la presente invención han demostrado que este enfoque es flexible y es capaz de deducir información de secuencia a partir de una mezcla de oligosacáridos. Así pues, esta metodología hace posible tanto el análisis de otras secuencias extrañas en polisacáridos tales como heparina/sulfato de heparano con actividades biológicas importantes, al mismo tiempo que proporciona la base para el análisis estructural de este grupo farmacológicamente importante de heparina/sulfatos de heparano.
Métodos
Abreviaturas: HLGAG, glucosaminoglucanos similares a heparina; AT-III, antitrombina III; AT-10, decasacárido fraccionado de AT-III aislado por digestión parcial de heparina; IGS, Secuenciación Integral de Glucanos; PEN, nomenclatura codificada por propiedades; MALDI-MS, espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz; CE, electroforesis capilar; abreviaturas de las secuencias de HLGAG como sigue, I, ácido -L-idurónico; G, ácido -D-glucurónico; U, ácido 4,5-urónico; 2S, 3S, y 6S, sulfatación en 2-O, 3-O, o 6-O respectivamente; NS y NAc, N-sulfatación y N-acetilación de la glucosamina.
Materiales. El decasacárido AT-10 es el mismo sacárido utilizado en estudios previos (Rhomberg, A. J., Shriver, Z., Biemann, K. y Sasisekharan, R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 12232-7 y Ernst, S., Rhomberg, A. J., Biemann,
K. y Sasisekharan, R. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4182-7). Los oligosacáridos se disolvieron en agua desionizada a concentraciones de 10-35 M. Las heparinasas I-III de Flavobacterium heparinum se purificaron como se ha descrito previamente. Las exoenzimas -L-iduronato-2-O-sulfatasa, -L-iduronidasa, -D-glucuronidasa y Nacetilglucosamina-6-sulfatasa se adquirieron de Oxford Glycosciences. Una disolución acuosa al 40% de nitrito de
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sodio se adquirió de Aldrich Chemical. Los estándares de disacáridos para el análisis de composición se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Análisis de la composición. El análisis de la composición de los oligosacáridos se completó por digestión exhaustiva de una muestra 30 M de AT-10 seguida por electroforesis capilar (CE) como se ha descrito previamente (Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81). De modo resumido, se añadieron a 1 nmol de oligosacárido 200 nM de heparinasas I, II y III en acetato de sodio 25 mM, NaCl 100 mM, y tampón de acetato de calcio 5 mM, de pH 7,0. Se dejó que la reacción transcurriera a 30ºC durante una noche, y luego se analizó por CE en polaridad inversa con un tampón de paso de tris-fosfato 50 mM y sulfato de dextrano 10 M de pH 2,5.
Digestiones. Se diseñaron digestiones con heparinasa I cortas o exhaustivas. Para digestión corta, se incubó heparinasa 50 nM con el sustrato durante 10 minutos antes del análisis. Las digestiones exhaustivas se completaron con enzima 200 nM durante una noche. Las reacciones enzimáticas se realizaron por adición de 1 l de disolución de enzima en un tampón que contenía ovoalbúmina 10 M, sulfato de dextrano 1 M, acetato de calcio 5 mM y tampón de etilendiamina 10 mM a pH 7,0 a 4 l de disolución acuosa de sustrato; se dejó que la digestión transcurriera a la temperatura ambiente como se ha descrito anteriormente (Venkataraman, G., Shriver, Z., Raman,
R. y Sasisekharan, R. (1999) Science 286, 537-42 y Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81). Se completó la escisión parcial con ácido nitroso utilizando una modificación de procedimientos publicados (Turnbull, J. E., Hopwood, J. J. y Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96,2698-703). Las digestiones con exoenzimas se completaron simultánea o secuencialmente. Las concentraciones finales de enzima estaban comprendidas en el intervalo de 20-40 miliunidades/ml, y la digestión se llevó a cabo a 37ºC.
Espectrometría de masas. Los análisis espectrales de masas se realizaron en un equipo PerSeptive Biosystems Voyager Elite de tiempo de vuelo con reflectrón en el modo lineal con extracción retrasada. Se prepararon muestras de los materiales digeridos tomando 0,5 l de la mezcla de reacción y añadiéndolos a 4,5 l de disolución matriz (12 mg/ml de ácido cafeico en acetonitrilo al 30%) que contenía un exceso molar de 2 veces del péptido básico (RG)19R (masa calculada del ión (M+H)+ = 4226,8). La adición del péptido básico para formar específicamente quelatos con los oligosacáridos HLGAG y los parámetros de recogida de los espectros de masa permiten el análisis directo de la muestra sin necesidad de repurificación de la muestra (Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81). Las muestras se aplicaron por puntos sobre la diana y se recogieron los espectros de masas utilizando los parámetros reseñados previamente (Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan,
R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81). Se observan en cada espectro de masas los iones (M+H)+ del péptido básico y el ión (M+H)+ de un complejo 1:1 péptido:sacárido, y se determina la masa del sacárido restando el valor m/z medido del ión (M+H)+ del péptido del correspondiente del complejo 1:1 (Juhasz, P. y Biemann,
K. (1995) Carbohydr Res 270, 131-47). Todos los espectros en una placa se calibraron externamente utilizando un estándar de (RG)19R y su complejo con un hexasacárido derivado con ácido nitroso de la secuencia I2SHNS,6SI2SHNS,6SI2SMan6S (masa calculada de 1655,4) con parámetros instrumentales idénticos. Esta metodología requiere sulfatación suficiente del sacárido para asegurar una complejación eficiente. Como tal, los sacáridos pequeños infrasulfatados (es decir, mono-y disacáridos) no se observan con esta metodología (Juhasz, P. y Biemann, K. (1995) Carbohydr Res 270, 131-47).
Secuenciación Integral de Glucanos. La secuenciación integral de glucanos (IGS) utilizando separación electroforética se llevó a cabo como se ha descrito (Tumbull, J. E., Hopwood, J. J. y Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 2698-703). Las condiciones de escisión parcial con ácido nitroso se modificaron utilizando HCL 25 mM y nitrito de sodio 2,5 mM y tiempos de parada de 5, 10, 20, 30, 120, y 240 minutos.
Espectroscopía de RMN 1H. La espectroscopía RMN 1H se realizó utilizando las condiciones descritas previamente (Nadkarni, V. D., Toida, T., Van Gorp, C. L., Schubert, R. L., Weiler, J. M., Hansen, K. P., Caldwell, E. E. y Linhardt,
R. J. (1996) Carbohydr Res 290, 87-96). Se sometió AT-10 a cromatografía de intercambio iónico para separar las impurezas paramagnéticas. Una columna (1 cm x 10 cm) de AG 50W-X8 (Bio-Rad Japan, Tokio) se convirtió en la forma sódica por tratamiento con 5 ml de NaOH 0,1M y se lavó con agua durante 12 horas antes de su utilización. La muestra para los experimentos de RMN se aplicó a la columna, se eluyó con 20 ml de agua y se liofilizó. La muestra (1 mg) se liofilizó luego tres veces a partir de 99,8% de D2O (Merck, Alemania) y se disolvió en 0,5 ml de D2O 100% (Aldrich Japan, Tokio) para espectroscopía de RMN en un tubo de 5 mm. La espectroscopía de RMN 1H 1D de AT-10 se realizó en un espectrómetro JEOL GSX500A equipado con una sonda sintonizable de 5 mm en gradiente de campo a 298 K.
Resultados
Introducción a la Metodología de la Secuenciación
Se ha desarrollado recientemente una técnica de espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI-MS) que hace posible la determinación de la masa de oligosacáridos complejos de HLGAG (desde di-a decasacáridos) con una exactitud mejor que ±1 Da (Juhasz, P. y Biemann, K. (1995) Carbohydr Res 270,131-47 y Juhasz, P. y Biemann, K. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91, 4333-7). Debido a la exactitud de la
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El código hexadecimal derivado para las unidades de disacáridos existentes en AT-10 se muestra en la Tabla 1. La columna 1 es la posición binaria que codifica el estado isomérico del ácido urónico. Las columnas 2 a 5 codifican las modificaciones en las posiciones 2-O, 6-O, 3-O y N-de la unidad de disacárido. La columna 6 muestra los códigos hexadecimales representados por los dígitos binarios en las columnas 2 a 5. La columna 7 muestra la unidad de disacárido representada por el código en la columna 6. La columna 8 muestra las masas teóricas calculadas de la unidad de disacárido presente internamente en una secuencia. Para las modificaciones químicas o enzimáticas de estos disacáridos, se utiliza la nomenclatura siguiente: ácido urónico con un enlace insaturado A4-5 (U) = ±; unidad de disacárido del extremo reductor con una etiqueta másica = t; unidad de disacárido con un anillo de anhidromanosa de cinco miembros = ’.
De este modo, la estrategia para la asignación de secuencias de los oligosacáridos de HLGAG por PEN-MALDI implica esencialmente las etapas siguientes. En primer lugar, se utiliza MALDI-MS del oligosacárido intacto para asignar la longitud y el número total de sulfatos y acetatos presentes en el oligosacárido. Se utiliza luego el análisis de la composición para determinar el número y tipo de los bloques de construcción de los disacáridos. Con esta información, se construye una lista maestra de todas las secuencias posibles que contienen dichas unidades de disacárido. De esta manera, no se excluye secuencia alguna del análisis, por extraña que pueda ser una secuencia dada. La masa de fragmentos de oligosacáridos generados por digestión enzimática o degradación química se aplica como restricciones experimentales, y se eliminan las secuencias que no satisfacen estas restricciones. De manera iterativa, moviéndose desde las restricciones experimentales a la lista maestra de secuencias posibles cada vez menor, puede llegarse rápidamente a una solución de secuencia única utilizando un mínimo de material. Es importante que pueden utilizarse caminos múltiples utilizando restricciones experimentales separadas para converger en una sola secuencia, asegurando la exactitud de la asignación.
Análisis de AT-10
AT-10 y todos los oligosacáridos derivados del mismo por tratamiento enzimático o químico se detectan con MALDI-MS como complejos no covalentes con el péptido básico (RG)19R (Rhomberg, A. J., Ernst, S., Sasisekharan, R. y Biemann, K. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 4176-81 y Juhasz, P. y Biemann, K. (1995) Carbohydr Res 270,13147). Utilizando esta metodología, se observan dos especies, un ión (M+H)+ de (RG)19R y un ión (M+H)+ para el complejo péptido:sacárido. La masa molecular de un oligosacárido se obtiene restando el valor (M+H)+ del péptido del valor (M+H)+ del complejo 1:1 sacárido:péptido. La Tabla 2 enumera todos los fragmentos observados en este estudio, sus valores de masa calculados y derivados experimentalmente, y la estructura deducida de los fragmentos después de la asignación de secuencias de AT-10. La Figura 1 muestra que el componente principal de AT-10 tiene un valor m/z de 6999,3. Cuando se resta el valor m/z del péptido protonado, se encuentra que el valor experimental para la masa de este oligosacárido es 2770,2, que puede asignarse de forma única a un decasacárido con 13 sulfatos y 1 grupo acetato. El espectro de masas de AT-10 indica la presencia de otra especie (a la que se hace referencia en lo sucesivo como el contaminante) de masa 2690,1 (después de restar la contribución del péptido), que corresponde a un oligosacárido con 12 sulfatos y 1 grupo acetato.
Tabla 2: Valores m/z para los picos en los espectros de masas y sus estructuras deducidas 5
(M+H)+ del complejo
Sacárido (observado) Estructura deducida Masa (calculada)
6999,3
2770,2 U2SHNS[RS1],6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S (Fig.1) 2769,3
6919,2
2690,1 U2SHNS[RS2],6SI/GHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S (Fig.1) 2689,2
6899,6
2673,0 U2SHNS[RS3],6SI2SHNS,6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGMan3S,6S (Fig.4) 2672,2
6435,8
2209,2 I2SHNS[RS4],6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S (Fig. 4) 2209,8
6419,7
2192,2 U2SHNS[RS5],6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S (Fig.2a) 2191,8
6339,8
2113,2 I2SHNS[RS6],6SI2SHNS,6SIHNAc,6SGMan3S,6S (Fig.4) 2112,7
5899,9
1671,4 U2SHNS[RS7],6SIHNAc,6SGHNS,3S,6Sd* (etiquetada másicamente, Fig. 2c) 1670,4
5859,8
1633,2 I2SHNS[RS8],6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S Fig. 4) 1632,3
5842,1, 5842,2, 5843,6
1614,6, 1614,4, 1615,1 U2SHNS[RS9],6SIHNAc,6SGHNS,3S,6S(Fig. 2a,b,c) 1614,3
5383,1, 5382,5
1155,6, 1154,0 U2SHNS[RS10],6SI2SHNS,6S (Fig. 2a,c) 1154,9
5301,7
1073,9 U2SHNS[RS11],6SI/GHNS,6S (Fig. 2b) 1074,9
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(M+H)+ del complejo
Sacárido (observado) Estructura deducida Masa (calculada)
5284,5
1057,9 U2SHNS[RS12],6SI2SMan6S (Fig.4) 1057,8
5241,5
1013,8 IHNAc,6SMan3S,6Sd (etiquetada másicamente, Fig. 3) 1013,9
5186,5
958,8 IHNAc,6SGMan3S,6S (Fig. 3) 957,8
5007,8
780,8 HNAc,6SGMan3S,6S (Fig. 3) 780,7
4805,2, 4805,3, 4805,2
577,7, 577,5 576,7 U2SHNS[RS13],6S (Fig. 2a,b,c) 577,5
* d-representa la etiqueta másica de semicarbazida ( = 56,1 daltons)
En la columna 1 se muestra el valor de m/z del complejo protonado 1:1 del sacárido y el péptido básico (RG)19R. La columna 2 muestra la masa observada del sacárido obtenida restando el valor del péptido protonado observado en el espectro del complejo protonado 1:1. Las estructuras químicas deducidas de los sacáridos para los picos correspondientes en los espectros de masas se muestran en la columna 3. En la columna 4 se muestran las masas teóricas calculadas para las estructuras deducidas. Obsérvese que la masa observada (col. 2) está siempre dentro de ±1 Dalton de la masa calculada (col. 4).
El análisis de composición utilizando CE indica la presencia de cuatro bloques de construcción disacáridos, que corresponden a U2S-HNS,6S (±D), U-HNAc,6S (±4), U-HNS,6S (± 5), y U-HNS,3S,6S (±7), en la relación relativa de 2,90:1,00:1,05:0,15, respectivamente. Así, el análisis de composición de esta muestra confirmó que existen dos especies, una principal (85%) y la otra menos importante (15%). AT-10 tiene que ser un decasacárido que consiste en los bloques de construcción U2S-HNS,6S (±D), U-HNAc,6S (±4), y U-HNS,3S,6S (±7) en una relación de
3:1:1. Juntos, los datos de CE y MALDI-MS se utilizaron para construir una lista maestra de posibles secuencias para AT-10. Los autores de la invención han encontrado que existen 320 secuencias que pueden justificar los datos de CE y MS (Tabla 2). Estas 320 secuencias constituyen la lista maestra de la que se eliminaron secuencias sobre la base de las restricciones experimentales hasta convergencia en una solución única.
Adicionalmente, el análisis de composición confirmó que existe un contaminante presente que era estructuralmente similar a AT-10, excepto por la presencia de U-HNS,6S (± 5). A partir de los datos de CE, se determinó que la composición del contaminante era U2S-HNS,6S (±D), U-HNAc,6S (±4), U-HNS,3S,6S (±7), y U-HNS,6S (± 5) en la relación relativa de 2:1:1:1 por resta sucesiva.
Una vez construida la lista maestra de posibilidades de secuencia, se utilizó una combinación de PEN-MALDI, IGS (Tumbull, J. E., Hopwood, J. J. y Gallagher, J. T. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96, 2698-703), y análisis de RMN para secuenciar AT-10 y analizar luego la secuencia del contaminante.
Secuenciación de AT-10 por MALDI-MS
De la lista de 320 secuencias posibles generadas a partir de los datos de composición, se han utilizado una serie de restricciones experimentales, que incluyen el uso de heparinasa I y ácido nitroso, respectivamente, para asignar la secuencia de AT-10.
La digestión corta (incompleta) de AT-10 con la heparinasa I da como resultado cinco fragmentos de masa molecular 577,7, 1073,9, 1155,6, 1614,6 y 2192,2 (Figura 2a). El fragmento con masa 577,7 corresponde a ±D. El fragmento de 1155,6 corresponde a un tetrasacárido hexasulfatado que debe tener una de las estructuras siguientes: ±DD, ±D-D, ±D7, ±D-7, ±7D, o ±7-D. El fragmento con 1614,6 corresponde a un hexasacárido heptasulfatado y monoacetilado, y el fragmento con 2192,2 corresponde a un octasacárido decasulfatado y monoacetilado. El último pico, a 1073,9, fue asignado inequívocamente al contaminante (véase más adelante para análisis). Cuando se investigó la lista de 320 secuencias respecto a estos fragmentos formados por digestión simulada con heparinasa I, se redujo la lista a 52 secuencias (Tabla 2).
La tasa de escisión del sustrato por heparinasa I depende del tamaño (Linhardt, R. J., Turnbull, J. E., Wang, H. M., Loganathan, D. y Gallagher, J. T. (1990) Biochemistry 29, 2611-7). Para identificar la totalidad de los enlaces sulfatados en 2-O que contenían iduronato en AT-10, se trató con heparinasa I en condiciones que dieron como resultado la escisión completa de todos los enlaces susceptibles. En estas condiciones, el hexasacárido y el tetrasacárido, del contaminante, se mantenían intactos (Figura 2b). Sin embargo, el tetrasacárido hexasulfatado (masa de 1155,6 de la Figura 2a) se escindió. Por tanto, este sacárido tiene la secuencia ±DD. De las 52 asignaciones de secuencia posibles para AT-10, únicamente 28 pueden satisfacer los datos de la digestión exhaustiva con heparinasa I.
A continuación, se trató AT-10 con semicarbazida para producir una semicarbazona en la posición anomérica. De esta manera se introdujo una etiqueta másica ( = 56,1) para diferenciar fragmentos derivados del extremo reductor en oposición al extremo no reductor. El tratamiento con heparinasa I de AT-10 etiquetado produjo cinco fragmentos (Figura 2c). A partir de una comparación de AT-10 no derivatizado tratado con heparinasa I (Figura 2a), el hexasacárido heptasulfatado y monoacetilado aparece etiquetado y por tanto tiene que derivarse del extremo reductor de AT-10. La aplicación de esta restricción a las 28 secuencias restantes elimina todas ellas excepto 12 (Tabla 3).
Tabla 3: Convergencia de la secuencia de AT-10
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10 La estrategia por etapas utilizada para secuenciar la muestra de decasacárido se presenta en la Tabla 3. La aplicación de restricciones experimentales para eliminar las secuencias de la lista maestra de 320 * secuencias se utilizó para converger hacia la secuencia final. En los recuadros de la izquierda se muestra el número de secuencias que satisfacían las restricciones experimentales. Los recuadros a la derecha muestran las secuencias que satisfacen las restricciones experimentales junto con los posibles fragmentos formados para las masas representadas entre
15 paréntesis en la parte superior de la tabla.
* Para obtener todos los decasacáridos posibles con la composición de 3 ±Ds, necesitamos un +4 y un +7 para disponer las unidades de disacárido anteriores de todas las maneras posibles, a fin de formar un decasacárido. Asimismo, cada unidad de disacárido puede ser un + o un -correspondiente a iduronato o glucuronato. El número de secuencias posibles = 5C3 (disposición de 3Ds en 5 posiciones) * 2C1 (disposición de las 4 en las dos posiciones
20 restantes) * 24 (para justificar el + o -en todas las posiciones excepto el extremo no reductor, dado que el sacárido se deriva de heparinasa) = 10*2*16 = 320.
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Tabla 5
Compuesto
Respuesta por 57 ng de disacáridos Factor de respuesta (RF)
1 (U2S,HNS,6S)
10421,1 1
2 (U2S,HNS)
13551,45 0,769
3 (UHNS,6S)
14595,3 0,714
4 (U2S,HNAC,6S)
13551,45 0,769
5 (U,HNS)
23956,35 0,435
6 (U2S,HNAC)
32363,55 0,322
7 (U,HNAC,6S)
22903,35 0,455
8 (UHNAC,6SGHNS,3S,6S)
10421,1 (suposición) 1
En la tabla 5, se calculó el factor de respuesta (RF) para los picos 1-8. La segunda columna da la absorbancia UV a 232 nm para la inyección de 57 nl de concentración 1 ng/nl, es decir, 57 ng de los disacáridos (1-7) comerciales
5 estándar. No pudo medirse la absorbancia UV a 232 nm para la concentración conocida de 8 por falta de disponibilidad de muestra en cantidad suficiente. Se supone que 8 tiene la misma respuesta que la del menos sensible de los 7 disacáridos, a saber, 1. La tercera columna da el RF para cada uno de los siete picos, definiéndose el RF para un disacárido como la fracción de un ng del mismo que proporciona la misma respuesta que un ng de 1 (U2S,HNS,6S).
10 Ejemplo 5: Determinación de los sacáridos no sulfatados en la heparina
Introducción
Aunque la heparina se ha clasificado como un glucosaminoglucano sulfatado, contiene una cantidad menor de sacáridos no sulfatados. Se llevaron a cabo procedimientos para determinar la cantidad de sacáridos no sulfatados en la heparina. Después de esta determinación, puede utilizarse el valor RF calculado para los picos 1-8 para
15 estimar el % en peso de los bloques de construcción sulfatados de heparina a partir de la AUC medida por CE.
Métodos
Un peso conocido de heparina sometida a digestión exhaustiva con el cóctel de enzimas se inyectó en la CE. El área bajo la curva (AUC) medida para los picos 1-8 en la figura 11 se convierte en el peso de sacáridos sulfatados utilizando la respuesta para cantidades conocidas de los picos 1-8. La diferencia entre la cantidad total de sacáridos
20 de heparina inyectada en la CE, y la cantidad total de disacáridos y tetrasacáridos sulfatados, da la cantidad de sacáridos no sulfatados en la digestión completa de UFH. Multiplicando el % de AUC relativo por el RF se obtiene la concentración relativa corregida o el % de AUC relativo de los picos 1-8 en términos de U2S,HNS,6S.
Resultados
La tabla 6 muestra la estimación de los sacáridos no sulfatados en la heparina. Como se muestra en la tabla 6, se
25 determinó que los sacáridos no sulfatados constituyen menos del 2% de la heparina. Los sacáridos no sulfatados no se tienen en cuenta en la construcción de la tabla de análisis de la composición de la heparina como se explica más adelante. La columna 1 de la tabla 7 da el valor de AUC medido para los picos 1-8. La columna 2 da el % relativo de
AUC. Multiplicando el % relativo de AUC por el RF se obtiene la concentración relativa corregida o el % relativo de AUC de los picos 1-8 en términos de U2S,HNS,6S. Éstos se normalizan luego para obtener el % en peso de los picos de disacáridos 1-7 y el pico de tetrasacárido 8. Como se demuestra en esta memoria, la construcción de esta tabla de análisis de composición es independiente de la concentración o del peso de la digestión de heparina analizado por la CE.
Tabla 6
Compuesto
AUC Respuesta por 57 ng de muestra Cantidad de sacárido en ng
1 (U2S,HNS,6S)
7294,5 10421,1 39,9
2 (U2S,HNS)
1040,8 13551,45 4,4
3 (UHNS,6S)
1437,9 14595,3 5,3
4 (U2S,HNAC,6S)
379,3 13551,45 1,6
5 (U,HNS)
685,1 23956,35 1,7
6 (U2S,HNAC)
502,9 32363,55 0,9
7 (U,HNAC,6S)
482,3 22903,35 1,1
8 (UHNAC,6SGHNS,3S, 6S)
184,7 10421,1 (suposición) 1
Cantidad total de los sacáridos sulfatados de 1-8
55,9
Cantidad de sacáridos no sulfatados
57-55,9 = 1,1 ng (1,9%)
La tabla 6 muestra una estimación de la cantidad de sacáridos no sulfatados en la digestión exhaustiva de UFH con las heparinasas I, II, y III. Los picos 1-7 se muestran como disacáridos conocidos, como se explica en las Figuras 2
10 6. El pico 8 es el tetrasacárido UHNAC,6SGHNS,3S,6S que es resistente a la degradación ulterior por las heparinasas I, II o III. La segunda columna da el área bajo la curva (AUC) medida para cada uno de los picos para una inyección de 57 nl de concentración 1 ng/nl de la digestión del análisis de composición de UFH. La tercera columna da la absorbancia UV a 232 nm para la inyección de 57 nl de concentración 1 ng/nl de cada uno de los 7 disacáridos comerciales estándar (1-7). La columna 4 da el peso de los diversos sacáridos sulfatados en ng. La diferencia entre
15 su suma (55,9 ng) y la cantidad de heparina inyectada (57 x 1 = 57 ng) da la cantidad de sacáridos no sulfatados presentes en la digestión del análisis de composición de UFH.
Ejemplo 6: Comprobación de la instrumentación y terminación de la digestión
Introducción
Para comprobar la reproducibilidad del instrumento y averiguar si la digestión del análisis de composición es
20 realmente completa a las concentraciones de enzima utilizadas, se digirieron por duplicado muestras de UFH y se analizaron dos veces por CD. Los resultados se compararon entonces para determinar si existía variabilidad entre los experimentos.
Métodos
Se digirió UFH como se describe en el Ejemplo 1A, métodos con 1 l o 5 l de cóctel de enzimas (EC). Cada muestra se digirió por duplicado, y cada digestión se analizó dos veces por CE.
Resultados
La comparación del análisis duplicado de la misma muestra (UFH 1/1 con UFH 1/2, UFH 2/1 con UFH 2/2, y UFH 3/2
5 con UFH 3/2) indica que existe una reproducibilidad instrumental satisfactoria. La comparación de UFH 1/1 o UFH 1/2 con UFH 2/1 o UFH 2/2 demuestra que existe una variación mínima de experimento a experimento. La comparación de UFH digerida con 1 l de EC con UFH digerida con 5 l de EC ilustra que el aumento de la cantidad de enzima no cambia apreciablemente el perfil de disacáridos. Esto confirma que se consigue una digestión exhaustiva utilizando 1 l de EC como se muestra en la Figura 11. El análisis de composición de LMWH realizado
10 por CE de acuerdo con el protocolo reseñado en la Figura 11 y la tabla 7 puede utilizarse para comparar rigurosamente diferentes lotes de LMWH.
Tabla 7
Compuesto
AUC % Relativo de AUC Factor de respuesta (RF) Concentración relativa corregida % en peso
1 (U2S,HNS,6S)
7294,5 60,7 1 60,7 70,9
2 (U2S,HNS)
1040,8 8,7 0,769 6,7 7,8
3 (UHNS,6S)
1437,9 12,0 0,714 8,6 10,0
4 (U2S,HNAC,6S)
379,3 3,2 0,769 2,5 2,9
5 (U,HNS)
685,1 5,7 0,435 2,5 2,9
6 (U2S,HNAC)
502,9 4,2 0,322 1,4 1,6
7 (U,HNAC,6S)
482,3 4,0 0,455 1,8 2,1
8 (UHNAC,6SGHNS,3S,S)
184,7 1,5 1 1,5 1,8
La tabla 7 muestra los valores para el Análisis de la Composición para UFH. Se midió el área bajo la curva (AUC)
15 para cada pico del espectro de CE de UFH digerida con el cóctel de enzimas como se muestra en la Figura 11. Se utilizó el factor de respuesta calculado para cada sacárido como se muestra en la tabla 6 para calcular su concentración relativa corregida en la digestión enzimática. La última columna da el porcentaje en peso de cada uno de los bloques de construcción de UFH. Los sacáridos no sulfatados, que constituyen <2% de UFH, no se tienen en cuenta en la construcción de esta tabla de análisis de composición. Como se demuestra en esta memoria, la
20 construcción de esta tabla de análisis de composición mostrada por este método es independiente de la concentración o del peso de la digestión de heparina analizada por la CE.
Ejemplo 7: Determinación de la eficiencia de la acción anticoagulante anti-factor Xa de la heparina mediada por AT-III: Correlación entreIHNAC,6SGHNS,3S,6S y la actividad anti-Xa
Introducción
25 La cuantificación del tetrasacárido UHNAC,6SGHNS,3S,6S por CAM tiene un papel adicional en la estimación de la eficacia de la acción anticoagulante anti-factor Xa de la heparina mediada por AT-III. UHNAC,6SGHNS,3S,6S forma
10
15
20
25
30
parte del pentasacárido de unión a AT-III. La cuantificación de UHNAC,6SGHNS,3S,6S es una medida de la determinación de la cantidad de pentasacárido que se une a AT-III presente en la heparina, y por tanto ayuda a la medida directa de la anticoagulación mediada por el anti-factor Xa de la heparina que es dependiente del dominio del pentasacárido de unión a AT-III de la heparina.
Métodos
Se fraccionó UFH por tamaños mediante una columna de exclusión de tamaños P10. Se realizó el análisis de composición sobre las fracciones resultantes para estimar su contenido de UHNAC,6SGHNS,3S,6S. Estas fracciones se ensayaron también respecto a su actividad anti-factor Xa.
Resultados
Una gráfica de actividad anti-factor Xa de diferentes fracciones en función de su UHNAC,6SGHNS,3S,6S da como resultado una línea recta con r = 0,91, como se muestra en la Figura 11. Esto indica que la acción anticoagulante mediada por el anti-factor Xa de las heparinas puede medirse directamente por su contenido de UHNAC,6SGHNS,3S,6S. Los datos se presentan también en la Tabla 8.
Tabla 8
Muestra
1 2 3 4 5 6 7 8
U2S,HNS, 6S
U2S,H NS U,HNS,6S U2S,HNAC,6S U,HNS U2S,HNAC UHNAC,6S UHNAC,6SGH NS,3S,6S
UFH 1/1 1 l EC
70,9 7,8 10,0 2,9 2,9 1,6 2,1 1,8
UFH ½ 1l EC
71,0 7,7 10,2 3,0 2,8 1,5 2,0 1,8
UFH 2/1 1l EC
71,5 7,5 10,1 2,9 2,7 1,5 2,1 1,7
UFH 2/2 1l EC
71,3 7,5 10,3 2,8 2,8 1,5 2,0 1,8
UFH 3/1 5l EC
72,0 7,3 10,0 2,8 2,8 1,6 1,8 1,7
UFH 3/2 5l EC
72,2 7,5 9,9 2,7 2,7 1,6 1,7 1,7
La tabla 8 muestra un análisis de composición de UFH realizado por CE de acuerdo con el protocolo reseñado en la Figura 11, y la tabla 7 puede utilizarse para comparar rigurosamente diferentes lotes de LMWH. Se digirió UFH con 1 l o 5 l de cóctel de enzimas (EC). Cada muestra se digirió por duplicado, y cada digestión se analizó por duplicado mediante CE. En todas las muestras, los picos de los sacáridos 1-8 tenían el mismo tiempo de migración. La comparación de los análisis duplicados de la misma muestra (UFH 1/1 con UFH 1/2, UFH 2/1 con UFH 2/2, y UFH 3/1 con UFH 3/2) demuestra que existe una reproducibilidad instrumental satisfactoria. La comparación de UFH 1/1
o UFH 1/2 con UFH 2/1 o UFH 2/2 demuestra que existe una variación mínima de experimento a experimento. La comparación de UFH digerida con 1 l de EC con UFH digerida con 5 l de EC ilustra que el aumento de la cantidad de enzima no cambia apreciablemente el perfil de disacáridos, lo que demuestra que se alcanza una digestión exhaustiva utilizando 1 l de EC como se representa en la Figura 11.
Ejemplo 8: Generación de fracciones de LMWH y caracterización de la actividad biológica
Métodos
Se prepararon las fracciones de LMWH MS 57-1 a MS 57-4 y MS 59-1 a MS 59-4 tratando UFH con 200 g de heparinasa III (como se ha descrito arriba) y haciendo pasar el producto resultante a través de una columna P10.
Se prepararon las fracciones de LMWH MS56-1 a MS56-4 tratando UFH con 1000 g de heparinasa III, y haciendo pasar el producto resultante a través de una columna P10.
Se generaron las fracciones de LMWH MS60-1 a MS60-3, y MS55-1 a MS55-4 tratando la Fracción 2 con 200 g de heparinasa III, y haciendo pasar el producto resultante a través de una columna P10.
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Tabla 9 Generación de Heparina de MW/Carga/Propiedades biológicas seleccionadas
Método
Muestra Peso.(mg) MW medio PD anti-Xa UI/mg anti-IIa UI/mg Xa/IIa % en pesode 1 % en pesode 8 % en pesode 2 % en pesode 3 % en pesode 4 % en pesode 5 % en pesode 6 % en pesode 7
Fracción 2
300 <8000 400,0 75 5,3 70,0 4,5 7,8 11,1 3,2 2,4 1,4 0
Fracción 1
150 8000-14,000 106,6 54,5 2,0 87,2 0 9,0 1,6 0,4 1,8 0 0
UFH, 200 gHepIII, P10
MS57-1 130 8743 ± 177 1,1 292,9 72,3 4,0 77,8 3,5 3,0 10,7 1,4 0,3 0,2 3,0
MS57-2
140 6010 ± 138 1,1 186 33,33 5,6 75,5 3,5 4,0 10,7 1,6 0,5 0,4 3,8
MS57-3
60 3000-5000 70,8 0 73,9 2,8 4,9 10,2 1,8 1,2 0,6 5,0
MS57-4
10 <3000 42,6 0 73,9 1,5 4,4 10,0 13 2,0 0,9 0,4
MS59-1
130 8800 255 29,2 8,7 73,1 4,3 5,8 11,5 2,5 0 0,5 2,4
MS59-2
130 6500 255 54,5 4,7 77,8 3,8 3,2 10,3 1,3 0,4 0,3 3,4
MS59-3
70 3000-5000 54 0 75,3 2,3 4,6 10,2 1,9 0,8 0,8 3,8
MS59-4
30 < 3000 15 0 71,3 1,9 5,7 9,4 1,9 1,8 2,0 6,2
UFH, 1000g HepIII, -P10
MS56-1 60 9204 ± 192 1,2 261,4 50 5,2 78,8 4,7 3,3 9,3 1,7 0,2 0,3 2,2
MS56-2
40 6000 ± 146 1,2 123,8 75 1,7 70,7 3,8 7,0 10,5 2,8 1,2 1,0 2,9
MS56-3
100 3000-5000 126,9 36,4 3,5 76,4 3,0 4,1 11,0 1,5 0,5 0,3 3,6
MS56-4
80 < 3000 31 0 78,7 0 5,0 12,0 2,1 0 0 0
Fracción 2, 200 gHepIII, P10
MS60-1 110 7224 ± 139 1,2 347,4 58,33 6,0 68,8 5,0 6,0 13,1 2,8 0,4 0,5 3,0
MS60-2
140 5736 ± 238 1,1 353,6 75 1,5 69,9 3,8 6,2 13,0 2,1 0,8 0,7 3,8
MS60-3
140 < 5000 51 0 65,9 0 5,7 12,7 2,2 3,7 1,7 8,4
MS55-1
140 6505 ± 100 1,1 335 60,0 5,6 68,6 6,5 5,5 13,9 3,3 0,3 0,3 2,1
MS55-2
130.0 5964 ± 87 1,1 201,2 54,6 3,7 74,4 4,9 3,7 11,3 2,6 0 0 3,5
Método
Muestra Peso.(mg) MW medio PD anti-Xa UI/mg anti-IIa UI/mg Xa/IIa % en pesode 1 % en pesode 8 % en pesode 2 % en pesode 3 % en pesode 4 % en pesode 5 % en pesode 6 % en pesode 7
MS55-3
50.0 3000-5000 11,6 0 76,1 2,3 4,4 9,8 1,7 0,8 0,6 4,2
Facción 2, 1000 gHepIII, P10
MS55-4 30 <3000 15,6 0 73,4 0 5,0 9,8 2,0 1,8 1,0 6,5
MS66-1
150 6470 ± 142 1,2 250,1 100 2,5 75,0 3,6 7,5 8,6 8,6 3,8 1,0 0,3
MS66-2
150 5592 ± 159 1,1 206,0 20,8 6,0 74,0 3,6 7,8 9,2 3,4, 1,1 1,0 0,2
imagen23

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