ES2538036T3 - Uso de anticuerpo a M-CSF - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-M-CSF humanizado para su utilización en el tratamiento en un sujeto humano con enfermedad arteriosclerótica, o para la utilización en el tratamiento de infección de VIH en un sujeto humano, o para la utilización en el tratamiento de una enfermedad asociada a la infección de VIH en un sujeto humano con infección de VIH., en la que: (i) la cadena pesada comprende la secuencia de la región variable de la cadena pesada expuesta en la SEC con ID nº. 43 y en la región constante de IgG1; y (ii) y la cadena ligera incluye la secuencia de región variable de la cadena ligera presentada en la SEC con ID nº. 53..

Description

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La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácido (SEC con ID nº 119) y nucleótidos (cADN (SEC con ID nº 118) y ADN genómico (SEC con ID nº 117)) para heRX1-1.IgG4 con cambios de aminoácidos de bajo riesgo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0026] El factor estimulador de colonias (CSF-1), también conocido como factor estimulador de colonias macrófagas (M-CSF) se expresa por medio de células estromales de la médula, osteoclastos y otras células. Se ha demostrado que M-CSF estimula la producción y proliferación de macrófagos y osteoclastos, entre otras células. Aunque la actividad macrófaga es beneficiosa en muchas situaciones, la actividad macrófaga es nociva en otras. Se ha demostrado que los macrófagos tienen un papel en la formación de placas ateroescleróticas, desestabilización de placas y restenosis tras angioplastia. También se ha demostrado que los macrófagos y la producción de M-CSF están asociados con la replicación de VIH, y los macrófagos infectados podrían servir como reservorio del virus.

[0027] Los anticuerpos anti-M-CSF podrían usarse para prevenir o tratar enfermedades asociadas a los macrófagos. La expresión "enfermedades asociadas a los macrófagos" en este texto quiere decir enfermedades o trastornos asociados con o provocados por la actividad macrófaga nociva. Entre los ejemplos de enfermedades asociadas a los macrófagos se incluyen las enfermedades ateroescleróticas o la infección del VIH y las afecciones relacionadas con él. Los anticuerpos anti-M-CSF contemplados para su uso en dichos métodos incluyen cualquier anticuerpo descrito en el presente documento, incluidos los anticuerpos derivados de RX-1, anticuerpos que compiten con RX-1, anticuerpos derivados de 5H-4, anticuerpos que compiten con 5H4, anticuerpos derivados de MC1, anticuerpos que compiten con MC1, anticuerpos derivados de MC3 y anticuerpos que compiten con MC3.

[0028] Las "enfermedades ateroescleróticas incluyen ateroesclerosis en cualquier vaso sanguíneo, enfermedades o afecciones resultantes de ateroesclerosis y afecciones asociadas con el aumento del riesgo de oclusión venosa o trombosis, por ejemplo, hipertensión, diabetes y otros factores de riesgo de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular. Entre los ejemplos de enfermedades ateroescleróticas se incluye la trombosis arterial, estenosis o isquemia, enfermedad cardiovascular, incluidas las enfermedades cardiovasculares oclusivas como la angina; trombosis arterial, como trombosis arterial coronaria o isquemia de miocardio o infarto de miocardio; restenosis, concretamente tras angiografía o angioplastia; trombosis arterial cerebral o isquemia cerebral o accidente cerebrovascular derivado; trombosis intracardiaca (debido, por ejemplo, a fibrilación atrial) o accidente cerebrovascular derivado; enfermedad vascular periférica o trombosis arterial periférica u oclusión; hiperplasia neoíntima, trastorno de confluencia intercelular en el endotelio vascular o daño venoso.

[0029] Las enfermedades o afecciones asociadas con el VIH incluyen, entre otras, la neumonía, Pneumocystis carinii, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Rhodococeus equi, Nocardia asteroids, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Candida species, Aspergillus species, complejo Mycobacterium avium, Toxoplasma gondii, Strongyloides stercoralis, citomegalovirus, virus del herpes simple, neumonitis intersicial linfoide, odinofagia, leucoplasia pilosa, gingivitis erosiva, úlceras aftosas, gastrointestinal/colitis, especies de Salmonella, especies de Shigella, Campylobacter jejuni, especies de Cryptosporidium, Isospora belli, Blastocystis hominis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Microsporida, Strongyloides stercoralis, adenovirus, enteropatía no específica, proctitis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, colecistitis, obstrucción extrahepática y colangitis esclerosante, hepatitis peliosis bacilar, encefalitis o demencia, encelopatía subaguda, leuceoencefalopatía multifocal progresiva, virus varicela-zoster, Treponema pallidum, neoplasma, sarcoma de kaposi, linfoma primario o metastático, Cryptococcus neoformans, Coccidioides immitis, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, Nocardia asteroids, meningitis, Listeria rrionocytogenes, Lymphomatous meningitis, mielitis o neuropatía, mielopatía vacuolar, polineuropatía inflamatoria crónica, neuropatía motora sensorial simétrica distal, radiculitis del virus de la varicela-zoster, retinitis, queratoconjuntivitis, enfermedad por arañazo de gato, linfoma no Hodgkin.

[0030] El mARN humano de longitud completa M-CSF codifica una proteína precursora de 554 aminoácidos. A través de la división de mRNA alternativo y del procesamiento proteolítico post-translacional diferencial, M-CSF puede o bien segregarse a la circulación en forma de glucoproteína o sulfato de condroitina que contiene proteoglucano o bien expresarse en forma de glucoproteína de membrana en la superficie de células de producción de M-CSF. La estructura tridimensional de los 150 aminoácidos terminales expresados de forma bacteriana de M-CSF humano, la secuencia mínima necesaria para la actividad in vitro biológica completa, indica que esta proteína es un dímero unido a disulfido con cada monómero que consta de cuatro paquetes alfa helicoidales y una hoja beta anti-paralela (Pandit et al., Science 258: 1358-62 (1992)). Se producen tres especies M-CSF distintas a través de la división e mARN alternativo. Los tres precursores polipéptidos son M-CSFα de 256 aminoácidos, M-CSFβ de 554 aminoácidos y M-CSFγ de 438 aminoácidos. M-CSFβ es una proteína segregada que no se produce en una forma unida a la membrana. M-CSFα se expresa en forma de proteína de membrana integral que se libera lentamente por división proteolítica. M-CSFα se divide en los aminoácidos 191-197 de la secuencia establecida en la Figura 5. La forma unida a la membrana de M-CSF puede interactuar con receptores en células cercanas y por lo tanto media

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contactos específicos célula-a-célula. El término "M-CSF" también podría incluir los aminoácidos 36-438 de la Figura

7.

[0031] Varias formas de M-CSF funcionan uniéndose a su M-CSFR receptor (también conocido como CSF-1R) en las células diana. M-CSFR es una molécula de membrana con cinco dominios extracelulares similares a la inmunoglobulina, un dominio de la transmembrana y un dominio de tirosina quinasa relacionado con Src intracelular interrumpido. M-CSFR se codifica por el protooncogen c-fms. La unión de M-CSF al dominio extracelular de M-CSFR produce la dimerización del receptor, que activa el dominio de la quinasa citoplásmica, provocando la autofosforilación y la fosforilación de otras proteínas celulares (Hamilton J. A., J Leukoc Biol., 62(2):145-55 (1997); Hamilton J, A., Immuno Today., 18(7): 313-7(1997).

[0032] Las proteínas celulares fosforiladas inducen una cascada de eventos bioquímicos que producen respuestas celulares: mitosis, secreción de citoquinas, alteración de membranas y la regulación de la transcripción de sus propios receptores (Fixe y Praloran, Cytokine 10: 32-37 (1998)).

[0033] Se descubrió que un murino RX1 designado por el anticuerpo anti-M-CSF y que tiene la secuencia establecida en la SEC con ID nº 1 tiene propiedades de neutralización de M-CSF superiores en comparación con otros anticuerpos. El anticuerpo murino RX1 se modificó para ser menos inmunogénico en humanos basado en el método Human Engineering™ de Studnicka et al. Preferiblemente, entre 8 y 12 residuos de aminoácidos de superficie expuesta de la región variable de cadena pesado y entre 16 y 19 residuos de superficie expuesta de la región de cadena ligera se modificaron a residuos humanos en posiciones que se ha determinado que no es probable que afecten de manera adversa a la unión de antígenos ni al plegamiento de proteínas, al mismo tiempo que reducen su inmunogenicidad a respecto del entorno humano. Los genes sintéticos que contienen regiones variables modificados de cadena pesada y/o cadena ligera se construyeron y unieron a regiones constantes de cadena pesada γ humana y/o cadena ligera kappa. Cualquier región constante de cadena pesada y cadena ligera humana pueden usarse en combinación con las regiones variables de anticuerpo Human Engineered™. Los genes humanos de cadena pesada y ligera se introdujeron a células mamíferas y los productos resultantes de inmunoglobulina recombinante se obtuvieron y caracterizaron. Otros anticuerpos anti-M-CSF a modo de ejemplo como 5H4, MC1 o MC3 son Human Engineered™ de forma similar.

[0034] El término "anticuerpo derivado de RX 1" incluye a cualquiera de los siguientes:

1) una variante de aminoácido de anticuerpo murino RX1 que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 3, que incluye variantes que comprenden una secuencia de aminoácido de cadena pesada variable, que por lo menos será homóloga en un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % a la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 3, y/o comprende una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable que es homóloga en por lo menos un 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % a la secuencia de aminoácido como se establece en la Figura 3, teniendo en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología;

2) Los polipéptidos de unión a M-CSF (excluido el anticuerpo murino RX 1) que incluyen una o más regiones determinantes complementarias (CDRs) de anticuerpo murino RX 1 que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 3, que preferiblemente incluyen por lo menos CDR3 de la cadena pesada de RX 1, y preferiblemente incluyen uno o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más o los seis CDRs;

3) Los anticuerpos Human Engineered™ que tiene la cadena pesada y ligera de secuencias de amino acidos expuestas en las figuras desde la Figura 13B a la Figura 16B o variantes que comprenden una cadena pesada o ligera de secuencia de amino acidos de al menos un 60% de identidad con respecto a la cadena original de Human Engineered™ pesada o ligera de las figuras desde la 13B hasta la 16B, siendo más preferible al menos un 80%, siendo más preferible al menos un 85%, siendo más preferible al menos un 90%, siendo más preferible al menos un 95%, incluyendo por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100% identicas;

4) M-CSF-polipeptidos de unión (excluyendo el anticuerpo murino RX1) comprendiendo los residuos de alto riesgo de uno o mas CDRs de los anticuerpos Human Engineered™ desde la Figura 13B hasta la 16B, y preferiblemente comprendiendo dos o más residuos de alto riesgo, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todos los seis CDRs.

5) Los anticuerpos Human Engineered™ o variantes que retienen los residuos de aminoácido de alto riesgo que se establecen en la Figura 3B, y que incluyen uno o más cambios en los residuos de riesgo bajo o moderado establecidos en la Figura 3B; por ejemplo, que incluyen un cambio o más en un residuo de riesgo bajo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo moderado establecido en la Figura 3B, o por ejemplo, que conservan los residuos de aminoácido de riesgo alto y moderado establecidos en la Figura 3B y que incluyen un cambio o más en el residuo de bajo riesgo, donde los cambios incluyen inserciones,

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eliminaciones o sustituciones y podrían ser sustituciones conservadoras o podrían provocar que el anticuerpo manipulado está más cerca en la secuencia de una secuencia humana de cadena ligera o cadena pesada, una secuencia de cadena ligera o pesada de línea germinal humana, una secuencia de cadena ligera o pesada de consenso humano, o una secuencia de cadena ligera o pesada de línea germinal humana de consenso;

que mantenga capacidad de unir M-CSF. Dichos anticuerpos se unen preferiblemente a M-CSF con una afinidad de por lo menos 10-7, 10-8 o 10-9 o más alta y preferiblemente neutralizan la actividad biológica deseada de M-CSF.

[0035] De forma similar, el término "anticuerpo derivado de MC3" incluye cualquiera de los siguientes:

1) una variante de aminoácido de anticuerpo murino MC3 que tenga la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 10, que incluye variantes que comprenden una secuencia de aminoácido de cadena pesada variable que sea por lo menos homóloga al 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % a la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 10 y/o que comprenda una secuencia de aminoácido de cadena ligera variable que sea homóloga por lo menos al 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % a la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 10, teniendo en cuenta aminoácidos similares para la determinación de la homología;

2) Los polipéptidos de unión a M-CSF (que podrían incluir o excluir el anticuerpo murino MC3) que comprendan una o más regiones determinantes complementarias (CDRs) del anticuerpo murino MC3 que tiene la secuencia de aminoácido establecida en la Figura 10, que preferiblemente incluya por lo menos CDR3 de la cadena pesada MC3, y preferiblemente incluya dos o más, o tres o más, o cuatro o más, o cinco o más, o todos los CDRs;

3) Los anticuerpos Human Engineered™ generados por la modificación de la secuencia de murinos de acuerdo con los métodos establecidos en Studnicka et al., patente de los EE. UU. Nº. 5.766.886 y el Ejemplo 3 de este documento, usando la numeración Kabat establecida en las figuras 18C-18E para identificar los residuos de riesgo bajo, moderado y alto; dichos anticuerpos que comprenden por lo menos una de las siguientes cadenas pesadas y por lo menos una de las siguientes cadenas ligeras: (a) una cadena pesada en la que todos los residuos e riesgo bajo se han modificado, si es necesario, para ser los mismos residuos de la secuencia de inmunoglobulina de referencia humana o (b) una cadena pesada en la que todos los residuos bajos y moderados se han modificado, si es necesario, para ser los mismos residuos que en la secuencia de inmunoglobina de referencia humana, (c) una cadena ligera en la que todos los residuos de riesgo bajo se han modificado, si fuese necesario, para ser los mismos residuos que en la secuencia de inmunoglobulina de referencia humana o (b) una cadena ligara en la que todos los residuos de riesgo bajo y moderado se han modificado, cuando es necesario, para ser los mismos residuos que en la secuencia de inmunoglobulina de referencia humana

4) variantes de los anticuerpos anteriormente mencionados en el párrafo anterior (3) que incluyan una cadena pesada o ligara que tenga por lo menos una identidad de secuencia de aminoácido del 60 % con el Human Engineered™ original de la cadena pesada o ligera, más preferiblemente por lo menos 80 %, más preferiblemente por lo menos 85 %, más preferiblemente por lo menos 90 % y más preferiblemente por lo menos 95 %, incluido por ejemplo, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e idénticos al 100 %;

5) los polipéptidos de unión de M-CSF (que podrían incluir o excluir anticuerpo murino MC3) que comprende los residuos de alto riesgo de un CDR o más del anticuerpo murino MC3 de la Figura 10, y que preferiblemente incluyen residuos de alto riesgo de dos o más, tres o más, o cuatro o más, o cinco o más o todos los CDRs;

6) Los anticuerpos Human Engineered™ o variantes que retienen el residuos de aminoácidos de anticuerpo murino MC3, y comprenden un cambio o más en los residuos de riesgo bajo o moderado; por ejemplo, comprende un cambio o más en el residuo de riesgo bajo y sustituciones conservadoras en un residuo de riesgo moderado, o por ejemplo, que conserve los residuos de aminoácidos de riesgo alto o moderado y comprendan un cambio o más en un residuo de riesgo bajo, donde los cambios incluyen inserciones, eliminaciones o sustituciones y podrían ser sustituciones conservadoras o podrían provocar que el anticuerpo modificado estuviese más cerca en la secuencia de una secuencia de cadena pesada o cadena ligera humana, una secuencia de cadena ligera o cadena pesada de línea germinal humana, una secuencia de cadena pesada o cadena ligera de consenso humano, o una secuencia de cadena pesada o cadena ligera de línea germinal humana de consenso; que mantienen la capacidad de unir M-CSF. Dichos anticuerpos se unirían preferiblemente a M-CSF con una afinidad de por lo menos 10-7, 10-8 o 10-9 o más alta y preferiblemente neutralizan la actividad biológica deseada de M-CSF.

[0036] El término "anticuerpo derivado de 5H4" o "anticuerpo derivado de MC1" se define de forma similar de acuerdo con la descripción anterior.

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[0037] Los anticuerpos anti-M-CSF, como anticuerpos RX1, 5H4, MC1 derivados de MC3, incluidos anticuerpos Human Engineered™ o sus variantes, podrían ser de isotipos diferentes, como IgG, IgA, IgM o IgE. Los anticuerpos de la clase IgG podrían incluir una región constante diferente, por ejemplo, un anticuerpo IgG2 podría modificarse para mostrar una región constante IgG1 o IgG4. En este documento se presentan anticuerpos Human Engineered™

o variantes que incluyen región constante IgG1 o IgG4 modificada o no modificada. En el caso de IgG1, las modificaciones de la región constante, concretamente la región de la articulación o CH2, podrían aumentar o disminuir la función efectora, incluida la actividad ADCC y/o CDC. Una región constante IgG2 podría modificarse para disminuir la formación de agregados de anticuerpos-antígenos. En el caso de IgG4, las modificaciones de la región constante, concretamente la región de la articulación, podría reducir la formación de medios anticuerpos. En un ejemplo concreto, se presenta la mutación de la secuencia de articulación de IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys a la secuencia IgG1 de articulación Cys-Pro-Pro-Cys.

[0038] Los anticuerpos Human Engineered™ que contienen regiones constantes IgG1 o IgG4 tienen propiedades mejoradas en comparación con los anticuerpos Human Engineered™ que contienen regiones constantes IgG2. La elección de la afinidad de unión mejorada de región IgG1 o IgG4 Fc y la actividad de neutralización M-CSF. Además, la elección de la región IgG1 o IgG4 Fc produjo complejos de anticuerpo antígeno que se parecen más a los formados por el anticuerpo murino inicial.

[0039] La movilidad en la región de la articulación parece entonces afectar claramente a la unión del anticuerpo al antígeno dimérico MCSF, así como a la actividad de neutralización del anticuerpo. Se contempla que la preparación de los anticuerpos que contengan una cadena pesada que incluya una región constante IgG1 o IgG4 modificada o no modificada, concretamente los dominios de la articulación y CH2, o preferiblemente por lo menos los dominios de la articulación, mejora la afinidad de unión y/o ralentiza la disociación de anticuerpos a partir de antígenos diméricos.

[0040] El término "anticuerpo de competición de RX1" incluye

1) un anticuerpo monoclonal no roedor o no murino que se une al mismo epítopo de M-CSF como RX1 murino con las secuencias de cadena pesada y ligera completas establecidas en la Figura 3;

2) un anticuerpo monoclonal no murino o no roedor que se une a por lo menos 4 aminoácidos contiguos de los aminoácidos 98-105 de M-CSF de la Figura 7; y

3) un anticuerpo monoclonal no murino o no roedor que compite con el anticuerpo murino RX1 que tiene la secuencia completa establecida en la Figura 3 para la unión de M-CSF, por más del 75 %, más del 80 % o más del 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %. Dichos anticuerpos se unen preferiblemente a MCSF con una afinidad de por lo menos 10-7, 10-8 o 10-9 o más alta y preferiblemente neutralizan la actividad biológica deseada de M-CSF.

[0041] El término "anticuerpo de competición con MC1" o "anticuerpo de competición con MC3" o "anticuerpo de competición con 5H4" se define de forma similar con referencia al murino 5H4, MC1 o anticuerpos MC3 que tienen las secuencias de cadena pesada y ligera completas establecidas en la Figura 8, 9 o 10, respectivamente y con referencia al epítopo de M-CSF unido por el anticuerpo, por ejemplo aminoácidos 65-73 o 138-144 de la Figura 7 (correspondiendo a los epítopos M-CSF reconocidos por 5H4 o MC3).

[0042] Opcionalmente, cualquier anticuerpo quimérico, humano o humanizado M-CSF que se haya descrito públicamente antes de la fecha de solicitud del presente documento, se excluye del ámbito de la invención.

[0043] Un anticuerpo monoclonal "no-roedor" es cualquier anticuerpo, como se ha definido ampliamente en el presente documento, que no sea un anticuerpo monoclonal roedor intacto completo generado por un hibridoma de roedor. Así, los anticuerpos no-roedores incluyen, de forma específica, entre otros, variantes de anticuerpos de roedores, fragmentos de anticuerpos de roedores, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos Human Engineered™ y anticuerpos humanos, incluidos anticuerpos humanos producidos a partir de animales transgénicos o por medio de tecnología por medio de tecnología de identificación de fagos. De forma similar, los anticuerpos no murinos incluyen, entre otros, variantes de anticuerpos murinos, fragmentos de anticuerpos murinos, anticuerpos lineales, anticuerpos quiméricos, humanizados, Human Engineered™ y humanos.

[0044] "Tratamiento " es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. En consecuencia, el "tratamiento" se refiere a ambos, el tratamiento terapéutico y las medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen a aquellos que tienen el trastorno como a aquellos en los que el trastorno se va a prevenir. El tratamiento de pacientes que sufren síntomas clínicos, bioquímicos, radiológicos o subjetivos de la enfermedad, tal como una enfermedad de macrófagos asociada, puede incluir el aliviar todos o algunos de tales síntomas o reducir la predisposición a la enfermedad. La "patología" de la enfermedad incluyen todos los fenómenos que comprometen el bienestar del paciente.

[0045] "Mamífero" para fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos los

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humanos, los animales domésticos y de granja y de zoológico, deportivos o mascotas tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente, el mamífero es un humano.

[0046] Tal como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" pretende referirse a la cantidad de anticuerpo M-CSF terapéutico o profiláctico que sería adecuada, que provocará la respuesta o efecto terapéutico o profiláctico esperado, incluido el aliviar todos o algunos de tales síntomas o reducir la predisposición a la enfermedad, cuando se administra en concordancia con el régimen de tratamiento deseado.

[0047] El "M-CSF" humano tal como se usa en este documento, se refiere a un polipéptido humano que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácido que los polipétidos M-CSF, M-CSF, or M-CSF de un hombre maduro descritos en Kawasaki et al., Science 230:291 (1985), Cerretti et al., Molecular Immunology, 25:761 (1988),

o Ladner et al., EMBO Journal 6:2693 (1987. Tal terminología refleja la comprensión que los tres M-CSFs maduros tienen diferentes secuencias de aminoácidos, como se describió anteriormente, y que la forma activa del M-CSF is a dímero unido por disulfuro; por lo tanto, cuando el término "M-CSF" se refiere a la forma biológicamente activa, se pretende la forma dimérica. "Dímero M-CSF" se refiere a dos monómeros polipéptidos M-CSF que han dimerizado e incluye ambos homodímeros (que consta de dos del mismo tipo de monómero M-CSF) y heterodímeros (que constan de dos diferentes monómeros). Los monómeros M-CSF pueden convertirse en dímeros M-CSF in vitro como se describe en la Patente Estadounidense Nº 4,929,700.

Anticuerpos anti-M-CSF

[0048] La presente descripción proporciona métodos de tratamiento de sujetos que padecen de enfermedades asociadas a los macrófagos que usan los anticuerpos M-CSFespecíficos como se describe aquí, incluida la preparación de un medicamento para tratar sujetos que padecen enfermedades asociadas a los macrófagos. El término "anticuerpo" es utilizado en el sentido más amplio e incluye los anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ej., anticuerpos biespecíficos), fragmentos de anticuerpo que pueden unirse al antígeno (por ej., Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos de cadena individual, dianticuerpos), y péptidos recombinantes que comprende lo anterior siempre y cuando ellos presenten la actividad biológica deseada. Además de intactas, las moléculas de larga duración, el término "anticuerpo" se refiere también a frangmentos de los mismos (tal como, por ej., los fragmentos scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' y F(ab)'2) o multímeros o agregados de moléculas intactas y/o fragmentos que se unen al M-CSF (o M-CSFR). Esos fragmentos de anticuerpos se unen al antígeno y pueden ser derivatizados para exhibir características estructurales que facilitan la separación y la absorción, por ej., mediante incorporación de residuos de galactosa.

[0049] El término "anticuerpo monoclonal" como se usa aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales estos son típicamente incluidos diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un único determinante en el antígeno. Adicionalmente a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan mediante el cultivo homogeneo, no contaminado por otras inmunoglobulinas con diferentes especificidades y características.

[0050] El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como que requiere una producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para ser utilizados con la presente descripción puede ser hecho por el método hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature, 256:495 [19751, o ser realizados mediante métodos de DNA recombinantes (ver, por ej., Patente Norteamericana Nº 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de las “biblioitecas” de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature,352:624628[1991] y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

[0051] Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus pesadas cadenas, inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, y varias de ellas pueden, además, dividirse en subclases o isotipos, por ej. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Los dominios constantes de pesadas cadenas que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alpha, delta, epsilon, gamma y mu respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Diferentes isotipos tienen diferentes funciones efectoras; por ejemplo, los isotipos IgG1 y IgG3 tienen actividad ADCC.

[0052] "Fragmentos de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto de longitud completa, preferiblemente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluye los fragmentos Fab, Fab’,F(ab)2 y Fv; dianticuerpos, anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062(1995)); moléculas de anticuerpos de cadena individual y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de

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unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual “Fc”, cuyos nombres reflejan su habilidad para cristalizar 35 fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos fragmentos de anticuerpos “Fv de cadena individual” o “sFV” que comprenden los campos de anticuerpo VH y VL, donde esos campos se presentan en una cadena de polipéptidos individual. Preferentemente, el polipétido Fv comprende, además, un enlazador polipéptido entre los campos VH y VL que permite al Fv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para la revisión de sFv vea Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 29-315 (1994).

[0053] El término región "hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables por la unión al antígeno. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácidos a partir de una región determinante de complementariedad o CDR [por ej., residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) in el campo variable de cadena pesada como lo describe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethseda, Md. (1991)] y/o esos residuos a partir de un bucle hipervariable (por ej., residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como lo describe [Chothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)].

[0054] Los residuos FR o “Framework” son esos residuos de dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable.

[0055] El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de una cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de una cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptida (VH VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de conexión al antígeno. Los diacuerpos son descritos más detalladamente en, por ejemplo, EP 404, 097; WO 93/11161; y 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0056] Puede ser conveniente generar anticuerpos monoclonales multiespecíficos (por ej., biespecíficos) incluidos los monoclonales, humanos, humanizados, Humann EngineeredTM o variantes de anticuerpos anti-M-CSF que tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes epítopos. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos diferentes epítopos de M-CSF. Alternativamente, un brazo anti-M-CSF puede estar combinado con un brazo que se une a una molécula de activación en un leucocito tal como molécula receptora de células T (por ej., CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG (FcγR), tal como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16) así como a enfocar los mecanimos de defensa celulares en la célula que expresa el M-CSF. Los anticuerpos biespecíficos pueden también utilizarse para localizar agentes terapéuticos para células que exmpresan M-CSF. Esos anticuerpos poseen un brazo de unión M-CSF y un brazo que une al agente terapéutico. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ej., anticuerpos biespecíficos F(ab’).sub.2).

[0057] De acuerdo con otro enfoque para la fabricación de anticuerpos biespecíficos, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, uno o más pequeñas cadenas laterales de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con grandes cadenas laterales (por ej., tirosina o triptófano). Las “cavidades” compensatorias de indéntico o similar tamaño a la cadena lateral grande se crean en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo mediante la sustitución de la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) de aminoácidos por una de las pequeñas (por ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanimos para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como los homodímeros. Ver WO96/27011 publicado en Sept. 6, 1966.

[0058] Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrecruzados o “heteroconjugados”. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acomplarse a la avidina, el otro a la biotina. Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualquier método de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la Patente Estadounidense Nº 4.676.980, junto con una serie de técnicas de entrecruzamiento.

[0059] Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo se ha descrito también en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en el cual los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab’)2. Esos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante de ditiol arsénito sódico para estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados del Fab’-TNB reconvertido, entonces, en Fab’-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se

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mezcla con una cantidad de equimolar del otro derivado del Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmobilización selectiva de las enzimas. Los fragmentos Fab’-SH recuperados a partir de E. coli pueden acoplarse químicamente in vitro para formar anticuerpos biespecíficos. (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)).

[0060] Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab’ será secretado de manera separada a partir de la E. coli y sometido a acomplamiento químico in vitro dirigido para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y las células T humanas normales, así como de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra un foco de tumores de mama humano.

[0061] Se describen también diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos directamente a partir del cultivo de célula recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. (Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)) Los péptidos de las cremalleras de leucina a partir de las proteinas Fos y Jun fueron enlazados a las porciones Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los hodorímeros de anticuerpos fueron reducidos a la región bisagra para formar monómeros y luego, reoxidizado para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología “diacuerpo” descrita por Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico.

[0062] Los fragmentos comprenden una región variable de cadena pesada (VH) conectada a una región variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir en emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios (VH) y (VL) son forzados a emparejar con los dominios (VH) y (VL) complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión al antígeno. Se ha informado acerca de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv(sFv) de cadena individual. Ver Gruber et al. J. Inmunol 152:5368 (1994).

[0063] Alternativamente, el anticuerpo biespecífico puede ser un “anticuerpo lineal” producido como se describe en Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd tamdem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de conexión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

[0064] También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. (Tutt et al., J. Inmunol. 147:60 (1991).

[0065] El anticuerpo monoclonal, humano, humanizado, Human EngineeredTM o variante anti M-CSF puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo RX1, 5H4, MC1 o MC3. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, esos fragmentos eran derivados mediante la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ej., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science 229:81 (1985). Sin embargo, esos fragmentos pueden producirse ahora mediante células huésped recombinantes, Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) revela la secreción del anticuerpo funcional de la bacteria (ver, por ej., Better et al., Skerra et al., Science 240:10381041 (1988). Por ejemplo, los fragmentos Fb’-SH pueden recuperarse directamente a partir de la E. coli y químicamente acoplados para formar fragmentos F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Techology 10:163-167 (1992)). El F(ab’)2 se forma utilizando la cremallera de leucina GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab’)2. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos Fv, Fab o F(ab’)2 pueden aislarse directamente a partir del cultivo de la célula huésped recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el experto en la materia.

[0066] Un anticuerpo aislado es aquel que ha sido identificado y separado y recuperado a partir de un componente de su medio natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos y no proteínicos. El anticuerpo puede purificarse (1) a más de 95% por peso de anticuerpo de acuerdo a lo determinado por el método de Lowry, y más preferiblemente a más de 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de N-terminal o condiciones no reductoras utilizando azul de Coomassie o, de preferencia, tinción argéntica. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes desde que por lo menos uno de los componentes del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Por lo general, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

[0067] Para una descripción detallada de la estructura y generación de anticuerpos, ver Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998) y la Patente Estadounidense Nº 6.255.458. Brevemente, el proceso para la generación de ADN que codifica los genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera se produce principalmente en el desarrollo de las células-B. Antes de la reordenación y unión varios segmentos de genes de inmunoglobulina, los segmentos de gen V, D, J y constante (C) se encuentran generalmente en proximidad relativamente estrecha en un

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solo cromosoma. Durante la diferenciación de la célula-B, uno de cada uno de los miembros de la familia apropiados de los segementos den gen V, D, J (o solo V y J en el caso de genes de cadena ligera).son recombinados para formar funcionalmente genes de inmunoglobulina ligeros y pesados reordenados. Este proceso de segmento de gen reordenado parece ser secuencial. En primer lugar, se hace las articulaciones de la cadena pesada de la D a la J seguidas por las articulaciones de la cadena pesada de la V a la DJ y las articulaciones de la cadena ligera de la V a la J.

[0068] La recombinación de los segmentos de gen de región variable para formar regiones variables de cadena ligera y pesada funcionales es mediada por secuencias de señal de recombinación (RSS’s) que flanquean recombinacionalmente los segmentos competentes V, D y J, los RSS necesarios y suficientes para recombinación directa, comprende un heptámero diada simétrico, un nonámero rico en AT y una región espaciadora intermedia de 12 o 23 pares de bases cada una. Esas señales se conservan entre los diferentes loci y especies que llevan a cabo la recombinación D-J (o V-J) y son funcionalmente intercambiables. Ver Oettinger et al. (1990), Science, 248, 15171523 y las referencias citadas en el mismo. El hetámero comprende la secuencia CACAGTC o su análogo seguido por un espaciador de secuencia no conservada y luego, un nonámero que tiene la secuencia ACAAAAACC o su análogo. Esas secuencias se encuentran en la J, o el lado descendente, de cada segmento de gen V y D. Inmediatamente antes de la línea germinal, los segmentos D y J son nuevamente dos secuencias de señal de combinación, primero el nonámero y luego el heptámero nuevamente separados mediante una secuencia no guardada. Las secuencias heptaméricas y nonaméricas siguientes a un segmento VL, VH o D son complementarias a las que precen los segmentos JF, D O JH con las que ellas se recombinan. Los espaciadores entre las secuencias heptaméricas y nonaméricas son o bien 12 pares de bases o entre 22 y 24 pares de base de longitud.

[0069] Adicionalmente al reordenamiento de los segmentos V, D y J, se genera más diversidad en el repertorio primario de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera por medio de recombinación variable en las ubicaciones donde los segmentos V y J en la cadena ligera se unen y donde los segmentos D y J de la cadena pesada se unen. Tal variación en la cadena ligera ocurre normalmente dentro del último codón del segmento de gen V y el primer codón del segmento J. Imprecisión similar ocurre al unirse en el cromosoma de la cadena pesada entre los segmentos D y JH y puede extenderse sobre un máximo de 10 nucleótidos. Además, pueden insertarse varios nucléotidos entre los segmentos de genes D y JH y entre el VH y D que no están codificados por el ADN genómico. La adición de esos nucléotidos es conocida como región-N de la diversidad.

[0070] El efecto neto de tal reordenamiento en los segmentos de gen de región variable y la recombinación que puede ocurrir durante tal unión es la producción de un repertorio de anticuerpo primario.

[0071] “Fv” es fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión al antígeno completo. Esta región consta de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada ajustados, asociación no covalente. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH VI. De forma conjunta los seis CDRs confieren especificidad de unión de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o medio de un Fv comprende solo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión.

[0072] El fragmento Fab contiene también el dominio constante de la cadena ligera y el primer domionio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab’ por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada incluidos uno o más cisteínas a partir de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en el presente documento para el Fab’ en el cual el (los) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo de tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos Fab’ que tienen cisteínas bisagras entre ellos.

[0073] Por “anticuerpo neutralizante” se entiende una molécula de anticuerpo que es capaz de eliminar o reducir significativamente una función efectora de un antígeno objetivo al cual está unido. En consecuencia, un antígeno anti objetivo “neutralizante” es capaz de elimianr o reducir significativamente una función efectora, tal como la actividad enzimática, la unión ligando o señalización intracelular.

[0074] Como se describe en el presente documento, las composiciones para y los métodos para tratar enfermedades de macrófagos asociadas pueden utilizar uno o más anticuerpos utilizados individualmente o en combinación con otras terapias para alcanzar los efectos deseados. Los anticuerpos de acuerdo con la presente descripción pueden aislarse a partir de un animal que produce el anticuerpo como un resultado ya sea del contacto directo con un antígeno del medio ambiente o la inmunización con el antígeno. Alternativamente, los anticuerpos pueden producirse mediante la metodología de ADN recombinante utilizando uno de los sistemas de expresión del anticuerpo bien conocidos en la técnica (Ver, por ej., Harlow and Lane, Anticuerpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Tales anticuerpos pueden incluir IgGs recombinantes, proteinas de fusión quimérica que tienen secuencias derivadas de inmunoglobulina o anticuerpos “Human EngineeredTM” que pueden todos utilizarse para el tratamiento de enfermedades de macrófagos asociadas de acuerdo con la presente descripción.

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[0075] Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse esencialmente como se describe en Halenbeck et al. Patente Estadounidense Nº 5.491.065 (1997). Los anticuerpos monoclonales M-CSF ejemplares incluyen aquellos que unen a un epítopo conformacional aparente con dimérico M-CSF nativo o recombinante con neutralización concomitante de actividad biológica. Esos anticuerpos son sustancialmente no reactivos con formas biológicamente inactivas de M-CSF, incluidos los M-CSF monoméricos y diméricos químicamente derivatizados.

[0076] Los anticuerpos monoclonales anti-M-CSF Human EngineeredTM se describen en el presente documento. La frase “anticuerpo Human EngineeredTM” se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo no humano, generalmente un anticuerpo monoclonal de rata. Alternativamente, un anticuerpo Human EngineeredTM puede derivarse de un anticuerpo quimérico que retiene o conserva sustancialmente las propiedades de unión del antígeno del anticuerpo parental, no humano, pero que muestra inmunogenicidad en comparación con el anticuerpo parental cuando se administra a seres humanos. La frase “anticuerpo quimérico” como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que contiene secuencia derivada a partir de dos anticuerpos diferentes (ver, por ej., Patente Estadounidense Nº 4.816.567) que se origina normalmente a partir de diferentes especies. Más normalmente los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpo de murinos y de seres humanos, generalmente regiones variables de ratón y constante humana.

[0077] La frase “región determinante de complementariedad” o el término “CDR” se refiere a las secuencias de aminoácidos que juntas definen la afinidad de unión y especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión a inmunoglobulina nativa (Ver, por ej., Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication Nº 91 3242 (1991)). La frase “región constante) se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que confiere funciones efectoras. En la presente descripción, las regiones constantes del ratón son preferentemente sustituidas por regiones constantes de humanos. Las regiones constantes de los anticuerpos sujetos de derivan a partir de inmunoglobulinas humanas. La región constante de la cadena pesada puede seleccionarse a partir de cualquiera de los cinco isotipos: alfa, delta, épsilon, gama o mu.

[0078] Los anticuerpos de la presente descripción se dice que son inmunoespecíficos o específicamente de unión si ellos unen al antígeno con una Ka mayor o igual a 106M-1 preferentemente mayor o igual a 107M-1, más preferentemente mayor o igual a aproximadamente 108M-1, y más preferentemente mayor o igual a aproximadamente 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 o 1012M-1. Los anticuerpos anti-M-CSF pueden unirse a diferentes formas de origen natural de M-CSF. Los anticuerpos monoclonales descritos en este documento, tales como los anticuerpos RX1, 5H4, MC1 o MC3, tienen afinidad con el M-CSF y se caracterizan por una constante de equilibrio de disociación (Kd) de al menos 104M, preferentemente al menos aproximadamente 10-7 p a aproximadamente 10-8 , más preferentemente al menos a aproximadamente 109M-1, 1010M-1, 1011M-1 o 1012M-1. Tales afinidades pueden determinarse fácilmente utilizando técnicas convencionales, tales como por diálisis de equilibrio; utilizando el instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales descritos por el fabricante; mediante radioinmunoensayo utilizando el M-CSF etiquetado 125| o mediante otro método conocido por el técnico experto. Los datos de afinidad pueden analizarse, por ejemplo, mediante el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci.,

51:660 (1949). Por lo tanto, será evidente que los anticuerpos M-CSF preferidos mostrarán un alto grado de especificidad por el M-CSF y se unirá con afinidad sustancialmente menor a otras moléculas. Los anticuerpos preferidos se unen al M-CSF con una afinidad similar a la de los modelos animales murinos RX1. Otros anticuerpos ejemplares se unen al M-CSF con una afinidad similar a la de los murinos 5H4, MC1 o MC3 de la Figura 8, 9 o 10, respectivamente, une al M-CSF.

[0079] El antígeno que se usará para la producción de anticuerpos puede ser, por ej., el M-CSF intacto o un fragmento de M-CSF que retiene el epítopo deseado, opcionalmente fusionado a otro polipéptido que permite que el epítopo sea mostrado en su conformación original. Alternativamente, las céluldas que expresan M-CSF en su superficie celular pueden utilizarse para generar anticuerpos. Tales células pueden transformarse para expresar M-CSF o pueden ser otras células de origen natural que expresan M-CSF. Otras formas de M-CSF útiles para generar anticuerpos serán evidenes para el experto en la materia.

Anticuerpos Policlonales

[0080] Los anticuerpos policlonales se cultivan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un coadyuvante. Una respuesta de anticuerpos mejorada puede obtenerse conjugando el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies a ser inmunizadas, por ej., hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster sulfosuccinimida maleimido benzoilo (conjugación mediante residuos de cisteína), hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina), glutaraldeído, anhídrido succínico y otros agentes conocidos en la técnica.

[0081] Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados mediante la combinación, por ej., 100 µg o 5 µg de la proteía o conjugado (para conejos o ratas, respectivamente) con tres volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a {fracción (1/10)} la cantidad original de péptido o conjugado de adyuvante completao de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples lugares. A 7-14 días de la inyección de

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post-refuerzo, los animales son desangrados y el suero se ensaya para el título de anticuerpo. Los animales se refuerzan hasta que el título se estabiliza. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una diferente proteína y/o a través de un diferente reactivo de entrecruzamiento. El conjugado puede hacerse en un cultivo de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, agentes agregantes como el alumbre son adecuados en la aplicación para potenciar la respuesta inmune.

Anticuerpos Monoclonales

[0082] Los anticuerpos monoclonales pueden hacerse utilizando el método hibridoma descritos primero por Kolher et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden obtenerse por medio de métodos de ADN recombinante.

[0083] En el método hibridoma, se inmuniza al ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, tal como se describe en el presente documento, para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Los linfocitos luego se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado tal como el glicol polietileno, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

[0084] Las células de hibridoma así preparadas se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT O HPRT), el medio de cultivo para las hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y tiamidina (medio HAT), cuyas sustancias previenen el crecimiento de las células HGPRT deficientes.

[0085] Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente sostienen la producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles al medio. El mieloma humano y la línea celular del heteromieloma humano-ratón también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques an Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). Las líneas de mieloma de murino ejemplares incluyen aquellos derivados a partir de los tumores MOP-21 y M.C.-11 disponibles a partir del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles a partir del American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA.

[0086] El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma están creciendo es probado para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o mediante ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante análisis de Scatchard (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).

[0087] Después que se han indentificado las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, se pueden subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse por medio de métodos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medios D-MEM o RPMI-1640. Adicionalmente, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo con tumores de ascitis en un animal.

Anticuerpos Monoclonales

[0088] La codificación de ADN se puede aislar y secuenciar desde las células híbridoma utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente a la codificación de genes de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monoclonales). La determinación de la secuencia generalmente requerirá el aislamiento de por lo menos una porción de los genes o del ADNc de interés. La clonación se lleva a cabo usando técnicas estándar (referirse, por ejemplo, a Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide (Clonación Molecular: Una Guía para Laboratorios), Volúmenes 1 -3, Cold Spring Harbor Press). Por ejemplo, una biblioteca de ADNc podría construirse por una transcripción reversa de Poli A + ARNm, preferiblemente un ARNm asociado con las membranas, y la biblioteca seleccionada usando sondas específicas para las secuencias genéticas de polipéptido de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, sin embargo, se utiliza la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para amplificar la ADNc (o porciones dentro de la longitud completa de los ADNcs) codificando el segmento genético de interés de la inmunoglobulina (por ejemplo, el segmento variable de una cadena ligera). Las secuencias amplificadas se pueden clonar enseguida en cualquier vector apropiado, por ejemplo, vectores de expresión, vectores de mini genes, o vectores de expresión en fagos. No Se considera crítica la selección del método de clonación, mientras se pueda determinar la secuencia de una porción del polipéptido de inmunoglobulina de interés. Como se denomina aquí, una molécula “aislada” de ácido nucleico o una secuencia “aislada” de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que (1) se ha identificado y separado de por lo menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la cual se le relaciona normalmente en su fuente natural de ácido nucleico o (2) se clonó, amplificó, marcó, o se distinguió de

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de restricción convenientes. Si esos sitios no existen, los adaptadores o vinculantes de oligonucleótidos sintéticos se utilizaran de acuerdo a la práctica convencional.

[0095] Las células, líneas de células, y cultura celular a menudo se usan de forma intercambiable y todas las designaciones mencionadas aquí incluyen a la progenie. Los transformantes y células transformadas incluyen a las células sujetos primarias y los cultivos que se deriven de ellas sin importar el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie no tiene que ser precisa idénticamente en lo que se refiere al contenido ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye el progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como la que se examinó el la célula transformada originalmente. Será claro, a partir del contexto, cuando se utilicen diferentes designaciones.

[0096] Las secuencias de aminoácidos de una inmunoglobulina en específico podrían determinarse por las secuenciaciones directas de proteínas. Las secuencias apropiadas de codificaciones de nucleótidos pueden ser diseñadas de acuerdo a una tabla universal de códigos genéticos.

[0097] Las variaciones de secuencia de los aminoácidos de un anticuerpo deseado pueden ser reparadas al introducir apropiadamente cambios de los nucleótidos a la codificación del ADN, o por síntesis de péptidos. Aquellas variaciones incluyen, por ejemplo, eliminación de, y / o inserciones a y / o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos. Cualquier combinación de eliminación, inserción, y sustitución se la hace para llegar a la estructura final, siempre y cuando la estructura final posea las características deseadas. Los cambios en los aminoácidos también pueden alterar los procesos post transferencia del TM Diseñado Humano, humanizado, humano, monoclonal o de la variación del anticuerpo, como por ejemplo el cambio del número de posición de los lugares de glicosilación.

[0098] Las moléculas de ácido nucleico que codifican variaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos se preparan mediante una variedad de métodos comúnmente usados. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la aislación de una fuente natural (en el caso de que ocurran naturalmente variaciones de secuencias de aminoácidos) o la preparación por una mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o controlada por el sitio), mutagénesis de PCR, y mutagénesis de casete de una variación preparada anteriormente o una variación que no varíe del anticuerpo.

[0099] También se incluye aquí las codificaciones aisladas de ácidos nucleicos de la presentación, opcionalmente operativas vinculadas a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped, vectores y varias células huésped que conforman los ácidos nucleicos, y las técnicas de recombinación para la producción de anticuerpos que podría involucrar cultivos de células huésped para qué el ácido nucleico se presente y, opcionalmente, se pueda recuperar el anticuerpo del cultivo de células huésped o del entorno donde se encuentra el cultivo.

[0100] Para asegurar la producción recombinante del anticuerpo, se aísla la codificación de ácido nucleico y se la inserta en un vector replicable para que se la siga clonando (amplificación del ADN) o para su presentación. La codificación del ADN del anticuerpo monoclonal se aísla y se secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de vincular específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Existen muchos vectores. Los componentes de vectores incluyen generalmente, pero no se limitan a, una o más de las siguientes: una secuencia de señales, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos, un elemento de potenciación, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

(1) El componente de Secuencia de Señales

[0101] El anticuerpo de la exposición podría producirse de forma recombinante no solo directamente, pero también como una fusión de un polipéptido con un polipéptido heterólogo, lo cual sería preferiblemente una secuencia de señales u otro polipéptido que tiene un sitio de corte específico en el N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. La secuencia de señal seleccionada debería ser preferiblemente una que este reorganizada y procesada (por ejemplo, cortada por una peptidasa de señalización) por una célula huésped. Si las células huésped procariotas no reconociesen ni procesasen la secuencia nativa de señalización de los anticuerpos, la secuencia de señalización podría ser sustituida por una secuencia de señalización seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina liasa pectata (por ejemplo, peIB), betalactamasa, lpp, o controladores termo estables de enterotoxina II. Para la secreción de levadura la secuencia de señalización natural podría ser sustituida por, por ejemplo, el controlador de invertasa de levaduras, un controlador de factores α (incluyendo controladores de factor α Saccharomyces y Kluyveromyces), o controladores de ácido de fosfatasa, el controlador de glucoamylases cándida albicans, con la señal descrita en WO90/13646. En la presentación de células de mamíferos se encuentran presente, las secuencias de señalización de mamíferos así como los controladores de secretores virales, por ejemplo, la señal gD simplex de herpes.

[0102] El ADN para aquella región precursora se vincula para facilitar la codificación del ADN del anticuerpo.

(2) Origen de la replicación del componente

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[0103] Tanto en los vectores de expresión, así como en los vectores de clonación está presente una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es la que permite que el vector replique inmediatamente el ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma, esas secuencias son bien conocidas por una variedad de bacterias, hongos y virus. El origen de réplica del plásmido pBR322 es apropiado para la mayoría de bacterias Gram negativas, el origen de la plásmida 2 P es apropiado para hongos, y varios orígenes virales son útiles para clonar vectores en las células de mamíferos. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario en los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 podría ser usado normalmente sólo porque contiene el promotor temprano).

(3) Componente de marcador selectivo

[0104] Los vectores de expresión y de clonación podrían contener genes selectivos, también denominados como marcadores seleccionables. Éstos genes de selección común codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, tetraciclina, G418, geneticina, histidinol, o ácido micofenólico (b) complementan deficiencias auxotyróficas, o (c) suministran nutrientes importantes que no están disponibles en entornos complejos, por ejemplo, la codificación genética racemase D-alanina para Bacili.

[0105] Un ejemplo del esquema de selección utiliza una droga para detener el crecimiento de una célula huésped.Éstas células que se transforman exitosamente con un gene heterólogo que produce una proteína que otorga resistencia a la droga y por tanto sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de una selección dominante como esta usan las drogas metotrexato, neomicina, histidinnol, puromicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0106] Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células aptas para absorber la codificación de anticuerpos del ácido nucleico, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-I y –II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

[0107] Por ejemplo, las células transformadas con el gene de selección DHFR se identifican por primera vez al hacer cultivos de todos los transformantes en un entorno de cultivos que contiene métotrexato (Mtx), antagonista competitivo del DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza un tipo salvaje de DHFR, la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que es deficiente en actividad DHFR.

[0108] Alternamente, las células huésped (particularmente de huéspedes de tipo salvaje que contiene DHFR endógeno) transformadas o co -transformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpos de la exposición, proteínas DHFR de tipo salvaje, y otros marcadores seleccionables tales como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados por crecimiento de células en entornos que contienen un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418. Refiérase a la Patente de Estados Unidos No. 4,965,199.

[0109] Una selección apropiada de gene para el uso en levadura es el gene trp1 presente en levadura plásmida YRp7 (Stinchcomb et al., Nature (Naturaleza), 282: 39 (1979)). El gene trp1 suministra un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene la habilidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics (Genética), 85: 12 (1977). La presencia de la lesion trp1 en el genoma de levadura de la célula huésped suministra entonces un entorno efectivo para detectar la transformación por crecimiento cuando existe la ausencia de triptófano. Similarmente sepas de levadura que tienen deficiencia de Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plásmidos conocidos que tienen el gene Leu2. Cepas de levadura que tienen deficiencia de Ura3 se complementan con plásmidos que tienen el gene ura3.

[0110] Adicionalmente, los vectores derivados del pKD1 plásmido circular 1.6 Pm pueden ser utilizados para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternamente, un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina recombinante de novillo fue reportada para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology (Bio/Tecnología), 8: 135 (1990). Vectores de expresión con múltiples copias estables para la secreción de albúmina humana madura sérica recombinante por cepas industriales de Kluyveromyces también han sido revelados. Fleer et al, Bio/Tech-nology (Bio/Tecnología), 9: 968-975 (1991).

(4) Componente promotor

[0111] Los vectores de expresión y de clonación usualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y es vinculado cooperativamente a la codificación de anticuerpos del ácido nucleico. Promotores apropiados para su utilización en huéspedes procariotas incluyen las promotoras arabinosas (por ejemplo, araB) el promotor phoA, betalactamasa y los sistemas promotores de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son apropiados. Promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) vinculada operativamente al ADN codificando los anticuerpos de la exposición.

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[0112] Las secuencias promotoras son conocidas para los Eucariotes. Virtualmente todos los genes Eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases ascendentes desde el sitio donde la transcripción fue iniciada. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases sobre el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En los últimos 3’ de la mayor parte de genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA, que puede ser señal de la poliadenilización del extremo 3’ de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias pueden ser insertadas en la expresión vectorial eucariota.

[0113] Algunos ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso en receptores de levadura incluyen a los promotores de 3-fósfoglicerato quinasa u otras enzimas y glicolíticas, como la enolasa, Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3fosfoglicerato mutasa, piruvirato quinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glocoquinasa.

[0114] Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles, tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por condiciones de crecimiento; estas son las regiones promotoras para el alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneinas, Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores apropiados para el uso en expresiones de levadura se describen con más detalle en EP 73,657. Los potenciadores de levadura también son utilizados favorablemente con promotores de levadura.

[0115] La transcripción de anticuerpos en células anfitrionas de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de genoma del virus , por ejemplo el virus leucemia Abelson, el virus papiloma, la viruela aviar, el adenovirus (como por ejemplo adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, de preferencia citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B, papovirus SV-40, desde mamíferos promotores heterólogos, por ejemplo el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, desde los promotores de choque térmico, provisto que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula anfitriona.

[0116] Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que contiene adicionalmente el origen viral de replicación del virus SV40. El promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. En la patente de EE.UU. No. 4,419,446, se presenta un sistema para expresar el ADN en anfitriones mamíferos utilizando el papiloma virus bovino como un vector. Una modificación a este sistema se describe en la Patente de EE.UU. No. 4,601,978.

Vea también Reyes et al., Nature (Naturaleza) 297: 598-601 (1982) sobre la expresión β-interferón humana cADN en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simple. Alternativamente la repetición terminal larga del virus sarcoma de rous puede ser usada como el promotor.

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Componente potenciador

[0117] La transcripción de un ADN codificando el anticuerpo por medio de eucariotas superiores se incrementa frecuentemente insertando una secuencia potenciadora en el vector. Se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utiliza un potenciador de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluye el potenciador SV40 en la parte final del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador de promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador polioma en la parte final del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. Vea también Yaniv, Nature (Naturaleza) 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. El potenciador puede ser empalmado al vector en una posición 5’ o 3’ a la secuencia de codificación de anticuerpos, pero preferiblemente deberá estar localizado en una ubicación 5’ del promotor.

(6)

Componente de terminación de transcripción

[0118] Los vectores de expresión usados en células eucariotas anfitrionas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del mARN. Estas secuencias se encuentran comúnmente disponibles en las regiones no transferidas 5’ y, ocasionalmente 3’, del ADN o cADN de células eucariota o virus. Estas regiones contienen segmentos nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no transferida del anticuerpo codificador mARN. Un componente de transcripción de terminación muy útil es la región de poliadenilación de la hormona bovina de crecimiento. Refiérase a WO94/11026 y el vector de expresión expuesto en el mismo. Otro componente de transición de terminación es el terminador de transcripción de cadena ligera de inmunoglubolina de ratón.

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Selección y transformación de células huésped

[0119] Las células huésped adecuadas para donación o presentación del ADN en los vectores mencionados aquí son las células de procarionte, levadura o eucarionte superior. Procariontes adecuados para este objetivo incluyen eubacterias tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como la Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteo, salmonela, por ejemplo, Salmonella

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previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y será aparente para el artesano ordinario con experiencia.

(9) Purificación del anticuerpo

[0126] Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplasmático, o directamente secretado (el anticuerpo) al entorno, incluyendo desde cultivos microbiales. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como un primer paso, los escombros de partículas, ya sean de células huésped o fragmentos lisados, son removidas, por ejemplo, por medio de centrifugación o ultrafiltración. Better et al. Science (Ciencia) 240: 1041-1043 (1988); ICSU Short Reports (Informes Cortos) 10: 105 (1990); y Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 457-461 (1993) describe un procedimiento para aislar anticuerpos los cuales son secretados al espacio Periplasmático de E. coli. (Refiérase también, [Carter et al., Bio/Technology (Bio/Tecnología) 10: 163-167 (1992)].

[0127] La composición de anticuerpos preparada a partir de células microbiales o de mamíferos puede ser purificada usando, por ejemplo, catión cromatográfico hidroxiapatito o cromatografía de intercambio de aves, y cromatografía de afinidad, siendo la técnica preferida la cromatografía de afinidad. La sostenibilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotopos de cualquier dominio de inmunoglobulina Fc que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede ser utilizada para purificar los anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas γ1, γ2, o γ4 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isótopos de ratón y para los humanos y3 (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). La matriz más común a la cual el ligando de afinidad está adjunto es agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de porosidad controlada o poli (estirenodivinil) benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de proceso más cortos de los que se pueden lograr con agarosa. En los casos en que los anticuerpos comprenden un dominio CH 3, el Bakerbond ABXTMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) es útil para purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación de etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSETM cromatografía en un ion o resina de intercambio de catión (tal como una columna ácida poliaspártica), cromatoenfoque, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y precipitaciones de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo que va a ser recuperado.

Anticuerpos quiméricos y humanizados

[0128] Puesto que los anticuerpos quiméricos o humanizados son menos inmunogénicos en humanos que los anticuerpos monoclonales provenientes del ratón, ellos pueden ser usados para el tratamiento de humanos con mucho menor riesgo a anafilaxia. Por lo tanto, estos anticuerpos podrían ser preferidos en aplicaciones terapéuticas que involucran la administración directa a humanos.

[0129] Los anticuerpos monoclonales quiméricos, en los cuales los dominios Ig variables de un anticuerpo monoclonal de ratón se fusionan a los dominios Ig constantes de humanos, se pueden generar usando procedimientos estándar comúnmente usados (referirse a Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains (Moléculas de Anticuerpos Humanos Quiméricos; Dominios de Vinculación Antigénica de Ratón; Dominios de Región Constante de Humanos, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81, 6841-6855; y, Boulianne, G. L., et al, Nature (Naturaleza) 312, 643-646. (1984)). Aunque algunos anticuerpos quiméricos monoclonales han probado ser menos inmunogénicos en humanos, los dominios Ig variables de ratón todavía pueden conllevar a una respuesta significativa humana anti ratón.

[0130] Anticuerpos humanizados pueden lograrse por medio de una variedad de medios incluyendo, por ejemplo: (1) insertando las regiones determinantes de complementación que no son humanas (CDRs -Complementarity Determining Regions) en un marco de trabajo humano y una región constante (un proceso referido en la práctica como humanizar por medio de “enjertación CDR”), o alternamente, (2) transplantar todos los dominios variables que no son humanos, pero “encubriéndolos” con una superficie parecida a la humana al reemplazar los residuos en la superficie (un proceso al que el registró se refiere como “enchapado” en la industria). En esta presentación, los anticuerposhumanizados incluirán los anticuerpos “humanizados” y “enchapados”. Éstos métodos se presentan en, por ejemplo, Jones et al., Nature (Naturaleza) 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 81:6851 6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science (Ciencia) 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); y Kettleborough, C.A. et al., Proteína Eng. 4(7):773 83 (1991).

[0131] En particular, un anticuerpo de roedor en una administración de repetición en vivo en un hombre solo o en conjunto provocará una respuesta de inmunidad en el receptor en contra del anticuerpo del roedor; la denominada respuesta HAMA (Anticuerpo Humano Anti Ratón -Human Anti Mouse Antibody). La respuesta HAMA podría limitar la efectividad del farmacéutico si se requiriese una dosis repetida. La inmunogenocidad del anticuerpo podría ser reducida por medio de modificaciones químicas del anticuerpo con un polímero hidrofílico tal como glicol polietileno o al usar los métodos de ingeniería genética para hacer una estructura de vinculación de anticuerpos más parecida a la humana. Por

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ejemplo, las secuencias genéticas para los dominios variables del anticuerpo del roedor los cuales vinculan a CEA pueden ser sustituidos por dominios variables de una proteína de mieloma humana, provocando por lo tanto, un anticuerpo quimérico recombinante. Estos procedimientos están detallados en EP 194276, EP 0120694, EP 0125023, EP 0171496, EP 0173494 y WO 86/01533. Alternamente, las secuencias genéticas de los CDRs del anticuerpo del roedor podrían ser aisladas o sintetizadas y sustituidas por las correspondientes regiones de secuencia de un gene de anticuerpo homólogo humano, generando un anticuerpo humano con la especificidad del anticuerpo de roedor original. Estos procedimientos se describen en EP 023940, WO 90/07861 y WO91/09967. Alternamente un gran número de residuos en la superficie del dominio variable del anticuerpo del roedor pueden ser cambiados a esos residuos encontrados normalmente en un anticuerpo homólogo humano, generando un anticuerpo de roedor que tiene una superficie ‘enchapada’ de residuos y la cual por lo tanto será reconocida como propia por el cuerpo humano. Este método ha sido demostrado por Padlan et.al. (1991) Mol. Immunol. 28, 489.

[0132] Injertar CDRs involucra el introducir uno o más de los seis CDRs de los dominios Ig variables de las cadenas pesadas y ligeras del ratón en las cuatro regiones apropiadas del marco de trabajo de los dominios Ig variables humanos. También se le llama injertar CDRs. Esta técnica (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323 (1988)), utiliza las regiones del marco de trabajo conservadas (FR1-FR4) como un andamio que da soporte a las vueltas CDR que son los contactos primarios con antígenos. Una desventaja de injertar CDRs, sin embargo, es que puede resultar en un anticuerpo humanizado que tiene una afinidad de vinculación sustancialmente más baja que el anticuerpo original de ratón, porque los aminoácidos de las regiones del marco de trabajo pueden contribuir a la vinculación antígena, y puesto que los aminoácidos de las vueltas CDR pueden influenciar la asociación de dos dominios Ig variables. Para mantener la afinidad del anticuerpo monoclonal humanizado, la técnica de enjertación de CDRs puede ser mejorada al escoger regiones del marco de trabajo humanas que se parezcan más a las regiones de marco de trabajo del anticuerpo original del ratón, y por una mutagénesis dirigida por el sitio de aminoácidos individuales dentro del marco de trabajo o CDRs asistidos por computadora modelando el sitio de vinculación de antígenos (por ejemplo, Co, M. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 29682976).

[0133] Un método para humanizar anticuerpos se basa en alinear las secuencias de cadenas pesadas y ligeras no humanas a secuencias de cadenas pesadas y ligeras humanas, seleccionando y reemplazando el marco de trabajo no humano con un marco de trabajo humano basándose en aquella alineación, modelación molecular para predecir la conformación de la secuencia humanizada y comparar la a la conformación del anticuerpo padre. Después de completar este proceso, se repite una mutación de regreso de los residuos en la región CDR que altera la estructura de los CDRs hasta que la conformación prevista del modelo de secuencia humanizada se aproxime de cerca a laconformación de CDRs no humanos del anticuerpo padre no humano. Ésos anticuerpos humanizados podrían ser derivados aún más para facilitar la asimilación y holgura, por ejemplo, por medio de los receptores Ashwell (referirse, por ejemplo, a las Patentes de Estados Unidos números 5,530,101 and 5,585,089).

[0134] Se han reportado varias humanizaciones de anticuerpos monoclonales de ratón por diseño racional (referirse, por ejemplo, a EE.UU. 20020091240 publicado el 11 de julio de 2002, WO 92/11018 y la Patente de Estados Unidos Número, 5,693,762, la Patente de Estados Unidos Número 5,766,866.

Variaciones de las secuencias de aminoácidos

[0135] Un método útil de identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo, las cuales son ubicaciones preferidas para la mutagénesis, se le llama “detección de alanina para la mutagénesis”, como se describe en Cunningham y Wells Science (Ciencia), 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o un grupo de residuos son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por un aminoácido neutro o cargado negativamente (preferiblemente de alanina o polanina) para influenciar la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Aquellas ubicaciones de los aminoácidos que muestran la sensibilidad funcional a las sustituciones en ese momento se refinan al introducir aún más u otras variaciones en, o para, los lugares de sustitución. Por lo tanto, mientras el lugar para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación en sí no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en cualquier sitio, se realiza una detección de alanina o una mutagénesis aleatoria en el codón objetivo o la región y las variaciones del anticuerpo expresadas se examinan para la actividad deseada.

[0136] Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino – y / o carboxilo – terminal que varían en largo desde un residuo a polipéptidos que contienen 100 o más residuos, así como inserciones intra-secuencia de uno o varios residuos de aminoácidos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionil N-terminal o el anticuerpo (incluyendo el fragmento del anticuerpo) fusionado con una marcación de epítope o un epítope receptor de salvamento. Otras variaciones de inserciones de moléculas de anticuerpos incluyen la fusión de un polipéptido que aumenta la media vida del suero del anticuerpo, por ejemplo en N – terminal o C -terminal.

[0137] El término “epítope marcado” se refiere al anticuerpo fusionado a una marcación del epítope. El polipéptido que marca el epítope tiene suficientes residuos para suministrar al epítope en contra de cualquier anticuerpo, sin embargo su cantidad no llega a interferir con la actividad del anticuerpo. La marcación del epítope preferiblemente es lo suficientemente única como para que el anticuerpo no reaccione sustancialmente en forma cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos de marcación adecuados generalmente tienen por lo menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente

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entre 8-50 residuos de aminoácidos (preferiblemente entre alrededor de 9-30 residuos). Ejemplos incluyen el polipéptido de marcación HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165 (1988)]; la marcación cmyc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 incluidos ahí [Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616 (1985)]; y la marcación de la glicoproteína D (gD) del virus herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990)]. Otras marcaciones ejemplares son una secuencia de poli-histidina, generalmente alrededor de seis residuos de histidina, que permiten el aislamiento de un compuesto etiquetado de esa forma usando quelación de níquel. Otras marcaciones y etiquetas, como la FLAG® tag (Eastman Kodak, Rochester, NY), muy conocidas y usadas rutinariamente en esta práctica, se discuten aquí.

[0138] Cómo se designa aquí, el término “epítope de vinculación receptor de salvamento” se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4) que está a cargo de incrementar la semivida en suero de la molécula IgG.

[0139] Otro tipo de variación es una variación de la sustitución del aminoácido. Estas variaciones tienen por lo menos un residuo de aminoácido en la molécula del anticuerpo el cual es removido y otro residuo diferente es insertado en su lugar. Se contempla una mutagénesis de sustitución adentro de cualquiera de las regiones hiper variables o de CDR o regiones del marco de trabajo. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1. Las sustituciones más conservadoras se encuentran bajo el título de “sustituciones preferidas”. Si aquellas sustituciones no causasen ningún cambio en la actividad biológica, entonces se deben considerar cambios más sustanciales, denominados “sustituciones ejemplares” en la tabla 1, o más aún, como se describe más abajo en referencia a las clases de aminoácidos.

TABLA 1

Original Ejemplar Sustituciones Preferidas de Residuos

Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; asp, lys; gln arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala His (H) asn; gln; lys; arg Ile (I) leu; val; met; ala; phe; leu norleucine Leu (L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu

[0140] Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar substituciones que se diferencian significativamente en sus efectos de mantener (a) la estructura base del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Residuos que ocurren naturalmente se dividen en grupos basándose en propiedades laterales de las cadenas:

(1)

hidrofóbicas: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrofílicas neutros: cys, ser, thr;

(3)

ácidas: asp, glu;

(4)

básicas: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro; and

(6)

aromáticas: trp, tyr, phe.

[0141] Las sustituciones conservadoras involucran el reemplazo de un aminoácido con otro miembro de su clase. Sustituciones no conservadoras involucran el reemplazo de un miembro de estas clases con un miembro de otra clase.

[0142] Cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo DiseñadoTM o el anticuerpo con variación monoclonal, humano, humanizado, Humano también pueden ser sustituidos, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir entre cruzamientos aberrantes.

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Por otro lado, los vínculos de cisteína podrían ser añadidos al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en los lugares en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

[0143] La maduración de la afinidad involucra preparar y examinar las variaciones de los anticuerpos que tienen sustituciones dentro de los CDRs de un anticuerpo padre y seleccionar las variaciones que tienen propiedades biológicas mejoradas tales como una afinidad de vinculación relativa al anticuerpo padre. Una forma conveniente para generar aquellas variaciones sustituciones es la maduración de la afinidad usando muestras de fagos. Brevemente, varios sitios de regiones hiper variables (por ejemplo de seis a siete sitios) son mutados para generar todas las sustituciones posibles de aminos en cada sitio. Las variaciones de anticuerpos que se hayan generado se muestran en una forma monovalente desde partículas de fagos filamentosos como fusiones del gene III que es producto de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variaciones mostradas en fagos se examinan entonces para apreciar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de vinculación).

[0144] Se puede realizar una mutagénesis para detectar alanina para identificar residuos en regiones hiper variables que contribuyan significativamente a la vinculación antígeno. Alternamente, o adicionalmente, podría ser beneficioso el analizar una estructura de cristal del complejo anticuerpo antígeno para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos de sustitución de acuerdo a las técnicas aquí elaboradas. Una vez que esas variaciones hayan sido generadas, el panel de variaciones está sujeto a la examinación tal como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos serán seleccionados para un mayor desarrollo.

[0145] También pueden producirse variaciones de anticuerpos que tienen una tendencia de glicosilación modificada en relación a su anticuerpo padre, por ejemplo, eliminando uno o más de las fracciones de carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo, y / o más sitios de glicoscilación que no están presentes en el anticuerpo.

[0146] La glicosilación de los anticuerpos es típico en vinculaciones – N o vinculaciones-O. Las vinculaciones-N se refieren a la adhesión de la mitad de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. El tripéptido secuencia la asparagina – X – serina y la asparagina – X – treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la adhesión enzimática de la mitad del carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. La presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un lugar potencial de glicosilación. Por lo tanto, sitios de glicosilación de vinculación – N podrían ser añadidos al anticuerpo alterando la secuencia de aquellos aminoácidos que contienen uno o más de estas secuencias tripéptidas. La glicosilación de vinculación – O se refiere a la adhesión de uno de los azúcares acetilgalactosamina – N, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se podrían usar 5–hidroxiprolina o 5–hidroxilisina. Se pueden añadir sitios de glicosilación de vinculación-O a un anticuerpo al insertar o sustituir uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original. Como un ejemplo, los aminoácidos de RX1 en las posiciones 41-43 de la figura 3A (NGS) podrían ser retenidos. Alternamente sólo los aminoácidos 41 y 42 (NG) pueden ser retenidos.

[0147] Normalmente, las variaciones de secuencias de los aminoácidos en los anticuerpos humanos DiseñadosTM tendrán una secuencia de aminoácidos que contenga por lo menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 60% en común con las secuencias de aminoácidos del anticuerpo DiseñadoTM humano original ya sea de la cadena pesada o ligera (por ejemplo, como en cualquiera de las figuras 13B a la 16B) más preferiblemente por lo menos un 80%, más preferiblemente por lo menos un 85%, más preferiblemente por lo menos un 90%, y más preferiblemente por lo menos un 95%, incluyendo por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. La identidad u homología en referencia a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos DiseñadosTM humanos, después de alinear las secuencias e introducir vacíos, si fuese necesario, para lograr el porcentaje máximo de una identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora (como se definió en la Tabla 1) como parte de la identidad de la secuencia. No se deberá considerar que ninguna de las N-terminal, C-terminal o extensiones, eliminaciones o inserciones internas a la secuencia del anticuerpo afecten la identidad de la secuencia o su homología. Por lo tanto, la identidad de la secuencia puede ser determinada por métodos estándar que son usados comúnmente para comparar la semejanza en posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Usando un programa de computadora tal como BLAST o FASTA, se alinean dos polipéptidos para maximizar su emparejamiento de sus respectivos aminoácidos (ya sea a lo largo de la longitud total de una o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Los programas suministran una penalidad de apertura predeterminada y una penalidad de vacíos predeterminada, y una matriz de puntaje tal como PAM 250 [una matriz de puntaje estándar; refiérase a Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure (Atlas de la Secuencia y Estructura de las Proteínas), Volumen 5, supp. 3 (1978)] puede ser usada en conjunto con el programa informático. Por ejemplo, el porcentaje de la identidad puede ser calculado como: el número total de contrapartidas idénticas multiplicada por 100 y divididas para la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del tramo comparado y el número de vacíos introducidos a las secuencias más largas para alinear las dos secuencias.

[0148] Se contemplan también otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, podría desearse modificar el anticuerpo en relación a su función de efector, para incrementar su efectividad para tratar enfermedades asociadas con macrófagos. Por ejemplo, los residuos de cisteína podrían ser introducidos en la región Fc, permitiendo esa

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Cadena Pesada

Plásmido

Cadena Ligera Kappa Región V Región C Marcador Selectivo

pMXC17

Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC18

Bajo Riesgo (Kabat) R54 a S Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC19

Bajo Riesgo+Mod (Kabat)-RAT54,55,56 a SIS Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC20

Bajo Riesgo (Kabat) -R54 a S Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC21

Bajo Riesgo + Mod (Kabat)-RAT54,55,56 a SIS Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC25

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC47

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 2 his

pMXC26

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 2 neo

pMXC42

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 1 neo

pMXC43

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 1 neo

pMXC50

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Baja Riesgo + Mod(Kabat) Gamma 1 his

pMXC48

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo + Riesgo Mod (Kabat) Gamma 4 (cADN) Neo

pMXC49

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 4 (genómica) neo

La preparación de Vectores de Expresión para la Expresión Transitoria

[0263] Los vectores que contienen tanto genes de la cadena ligera como pesada descritos anteriormente también

45 se construyen para transfección transitoria. Estos vectores son similares a los descritos anteriormente para transfecciones permanentes, excepto que en lugar de los genes neo o his, que contienen el oriP del virus de Epstein-Barr para replicación en células HEK293 que expresan el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr. Los vectores de transfección transitoria son descritos en las Tablas 5 y 6.

50 Tabla 5. Vectores transitorios de cadena ligera Kappa.

55

60

Plásmido

Región V

pMXC1

Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

pMXC2

Bajo Riesgo (Kabat)

pMXC10

Bajo Riesgo + Mod (Kabat)-RAT54,55,56 a SIS

pMXC11

Bajo Riesgo (Kabat) -R54 a S

pMXC15

Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal)

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Tabla 6. Vectores de cadena pesada transitoria.

Plásmido

Región V Región C

pMXC3

Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 2

pMXC4

Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 2

pMXC29

Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 1

pMXC38

Bajo Riesgo (Kabat) Gamma 4 (genómica)

pMXC39

Bajo Riesgo + Mod (Kabat) Gamma 1

15

Expresión transitoria de anticuerpo para PRLR Human-Engineered™ en células HEK293E

[0264] Vectores separados que contiene cada uno oriP del virus de Epstein-Barr y genes de la cadena ligera o cadena pesada descritos anteriormente se transfectan transitoriamente en células HEK293E. Células transitoriamente transfectadas se dejan incubar durante hasta 10 días después de que el sobrenadante se recupere y el anticuerpo se purifica usando cromatografía en proteína A. Las proteínas producidas por transfección transitoria de células 293E son descritas en la Tabla 7 a continuación.

25 Tabla 7. Anticuerpos RX1 preparados por Human-Engineered™.

35

45

55

Cadena Ligera

Cadena Pesada

Anticuerpo

Plásmido Proteína Plásmido Proteína

heRX1-1.G2

pMXC2 Bajo Riesgo (Kabat) pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-2.G2

pMXC2 Bajo Riesgo (Kabat) pMXC3 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

heRX1-3.G2

pMXC1 Bajo Riesgo + Mod (Kabat) pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-4.G2

pMXC1 Bajo Riesgo + Mod (Kabat) pMXC3 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

heRX1-5.G2

pMXC11 Bajo Riesgo (Kabat) -R54 a S pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-6.G2

pMXC11 Bajo Riesgo (Kabat) -R54 a S pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-7.G2

pMXC10 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)-RAT54,55,56 a SIS pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-8.G2

pMXC10 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)-RAT 54,55,56 a SIS pMXC3 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

heRX1-9.G2

pMXC15 Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) pMXC4 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-10.G2

pMXC15 Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) pMXC3 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

heRX1-1.G1

pMXC2 Bajo Riesgo (Linea Germinal) pMXC29 Bajo Riesgo (Kabat)

heRX1-10.G1

pMXC15 Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) pMXC39 Bajo Riesgo + Mod (Kabat)

heRX1-9.G4

pMXC15 Bajo Riesgo + Mod (Linea Germinal) pMXC38 Bajo Riesgo (Kabat)

Desarrollo de Células CHO-K1 Permanentemente Transfectadas

[0265] Los vectores descritos anteriormente (cuadro 4) que contiene una copia cada uno de los genes ligeros y pesados juntos se transfectan en células CHO-K1 adaptadas a Ex-Cell 302. Las células CHO-K1 adaptadas a crecimiento en suspensión en medio Ex-Cell 302 se transfectan normalmente con 40 ug de vector linealizado. Alternativamente, el ADN linealizado puede ser complementado con polietilenimina lineal (PEI) y utilizado para la transfección. Las células se siembran en placas de 96 pocillos que contienen medio Ex-Cell 302 complementado con 1 % de SBF y G418. Los clones son se seleccionan en placas 96 pocillos y el 10% de clones superiores de cada

65 transfección se transfieren a placas de 24 pocillos profundas que contienen medio Ex-Cell 302.

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Claims (1)

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