ES2537649T3 - Método para producir selectivamente plantas estériles masculinas o femeninas - Google Patents

Abstract

Un método para producir selectivamente plantas estériles femeninas, que comprende las etapas de: a. proporcionar plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas que comprenden un transgén que codifica una D-fosfinotricina oxidasa expresada por un promotor floral femenino específico de tejido; b. aplicar exógenamente a las plantas transgénicas condicionalmente estériles femeninas una cantidad de Dfosfinotricina en un momento apropiado; c. seleccionar las plantas transgénicas estériles femeninas que producen poca o ninguna semilla tras la aplicación de D-fosfinotricina, y que producen al menos niveles casi normales de polen viable.

Description

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R-Fenoxaprop-CoA  R-Fenoxaprop + CoA y/o

R-Diclofop-CoA  R-Diclofop + CoA y/o

R-Cyhalofop-CoA  R-Cyhalofop + CoA y/o

R-Clodinafop-CoA  R-Clodinafop + CoA

5 (para fines comparativos)

(8) Acil-CoA sintetasas capaces de catalizar la reacción:

S-Fluazifop + CoA + ATP  S-Fluazifop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Quizalofop + CoA + ATP  S-Quizalofop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Propaquizafop + CoA + ATP  S-Propaquizafop-CoA + PPi + AMP y/o

10 S-Haloxyfop + CoA + ATP  S-Haloxyfop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Fenoxaprop + CoA + ATP  S-Fenoxaprop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Diclofop + CoA + ATP  S-Diclofop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Cyhalofop + CoA + ATP  S-Cyhalofop-CoA + PPi + AMP y/o

S-Clodinafop + CoA + ATP  S-Clodinafop-CoA + PPi + AMP

15 (para fines comparativos)

La enzima carboxilesterasa se puede seleccionar de enzimas de tipo carboxilesterasa B (EC 3.1.1.1), especialmente aquellas que derivan de Arthrobacter sp, Bacillus sp, hígado de cerdo, Saccharomyces sp o Synechocystis sp. Tales enzimas preferidas se pueden seleccionar entre proteínas que tienen los números de acceso Swissprot Q01470, P37967, Q29550 (la secuencia peptídica madura de 60-1703), P40363 o SEC ID número 2 (esta solicitud); y la 20 secuencia de ADN que codifica la enzima carboxilesterasa se puede seleccionar entre secuencias de ADN comprendidas en los accesos de EMBL M94965, BS06089, SSCE, Z34288 y SEC ID número 1 (esta solicitud). Otras enzimas carboxilesterasas y secuencias codificantes de ADN adecuadas para trabajar con la invención se seleccionan entre plantas y microorganismos que, en un medio mínimo, se encuentra que exhiben sensibilidad similar a la inhibición del crecimiento por imazametabenz metilo como por imazametabenz. Los genes de esterasas 25 candidatos procedentes de bibliotecas de ADN de tales organismos se identifican usando sondas de ADN adecuadas, y se aíslan mediante subclonación. Como alternativa, los genes que codifican enzimas adecuadas se identifican y se seleccionan de bibliotecas de expresión en organismos hospedantes adecuados insensibles a imazametabenz metilo vía la identificación sistemática para la transformación al fenotipo sensible a imazametabenz metilo. Igualmente, los genes y enzimas adecuados y mejorados se seleccionan en base a la expresión de E. coli y

30 el ensayo, ya sea in vivo o in vitro, en busca de la actividad de esterasa de éster de flamprop o éster de imazametabenz vía los métodos habituales que incluyen detección de imazapyr o flamprop mediante inhibición de enzimas diana tales como acetohidroxiácido sintasa, mediante HPLC/UV y/o mediante derivatización y GC MS.

La enzima D-aminoácido oxidasa (DAMOX) se puede seleccionar entre aquellas producidas por Rhodosporidium sp. (Rhodotorula sp.), Trigonopsis sp, pig. Fusarium sp, Candida sp, Shizosaccharomyces sp y Verticillium sp, y se

35 puede seleccionar de proteínas que tienen secuencias correspondientes a los números de acceso de Swissprot P80324, Q99042, P00371, P24552 o números de SPTREMBL Q9HGY3 y Q9Y7N4. Las secuencias de ADN que codifican la D-aminoácido oxidasa se pueden seleccionar de secuencias comprendidas en los números de acceso de EMBL A56901, RGU60066, Z50019, SSDA04, D00809, AB042032, RCDAAOX, A81420 y SPCC1450. Las Daminoácido oxidasas son flavoenzimas ubicuas.

40 Cuando la sustancia no fitotóxica es D-fosfinotricina o (con fines comparativos) D-bialafós o D-aspartato o Dgitamato, entonces las D-aminoácido oxidasas particularmente preferidas se obtienen de mutantes de Rhodotorula gracilis o es una D-aspartato oxidasa. Tales mutantes, cualquiera que sea la sustancia no fitotóxica, pueden comprender sustituciones de aminoácidos individuales o dobles en las posiciones 213 y 238 cuando se comparan con la secuencia de tipo salvaje. Preferiblemente, en posición 213, la metionina de tipo salvaje se sustituye por Arg,

45 Lys, Ser, Cys, Asn o Ala, y la Tyr de tipo salvaje en posición 238 se sustituye por His, Ser, Gys, Asn o Ala.

Sin embargo, la enzima puede comprender sustituciones además de, o en otras posiciones que las mencionadas en el párrafo anterior. En particular, la Phe en posición 58 en la secuencia de tipo salvaje se puede sustituir por un resto seleccionado del grupo que consiste en His, Ser, Lys, Ala, Arg y Asp, y, preferiblemente, es His, Ser o Ala. Además,

o alternativamente, la Met en posición 213 en la secuencia de tipo salvaje se puede sustituir por un resto 50 seleccionado del grupo que consiste en His, Ser, Lys, Ala, Arg y Asp, y preferiblemente es Ser o Ala. Además, o

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b) Selección de células transformadas capaces de utilizar la propia D-PPT como única fuente de N. Para que esta selección funcione, la célula hospedante tiene que transformarse también con un gen capaz de invertir el efecto inhibidor de la L-fosfinotricina sobre la glutamina sintetasa. Por ejemplo, el vector lanzadera puede comprender también un gen que codifica una enzima como PAT, que inactiva L-PPT.

Los ciclos de mutación y selección se pueden repetir. Las D-aminoácido oxidasas se pueden clonar, expresar, purificar parcialmente y caracterizar cinéticamente a fin de identificar genes y DAMOX con las propiedades más adecuadas (por ejemplo, estabilidad enzimática, valor elevado de kcat/Km para oxidación de D-PPT, oxidación mínima de cualquier sustrato vegetal endógeno, pH óptimo, etc.).

Cuando la sustancia no fitotóxica es D-fosfinotricina (PPT), se puede obtener de una mezcla de D-y L-PPT. Por ejemplo, DL-PPT se puede añadir a un medio de cultivo (preferiblemente mínimo) de células de E. coli (opcionalmente un mutante arg E para minimizar el nivel del fondo de actividad de N-acetil-PPT desacetilasa) transformado e inducido para expresar un gen PAT (que codifica una enzima que transfiere un grupo acetilo de acetil CoA a L-PPT) a niveles elevados. Tras permitir un tiempo adecuado para que se N-acetile sustancialmente todo el Lcomponente (valorado, por ejemplo, mediante monitorización de la conversión usando RMN 31-P), D-PPT se recupera y se purifica a partir del medio exento de células, usando sucesivas etapas, por ejemplo, de extracción con disolvente a pH elevado y bajo, cromatografía de intercambio de aniones y cationes, cristalización selectiva con cationes quirales como quincocina, u otros procedimientos conocidos en la técnica, como extracciones líquido/líquido con dos fases acuosas no miscibles como el sistema de fases (véanse los métodos en el documento USP 5.153.355). Típicamente, una última etapa es la cromatografía de intercambio catiónico, de la cual se recupera D-PPT en forma de sal de amonio.

Alternativamente, D-PPT se puede obtener mediante un método enzimático en el que DL PPT + 2 cetoglutarato se convierte principalmente en una mezcla de D PPT, 2-oxo PPT (y sus productos de descarboxilación) y GABA mediante las acciones combinadas de (I) L-aminotransferasa (por ejemplo de E. coli) y (II) glutamato descarboxilasa. La D-PPT pura deseada se resuelve de la mezcla de reacción usando métodos conocidos en la técnica, según se esbozó anteriormente.

La D-PPT también se puede obtener usando un método enzimático en el que DL-PPT + 2 cetoglutarato + NAD se convierte primeramente en una mezcla de D-PPT, 2-oxo PPT (y sus productos de descarboxilación, NADH y amoníaco mediante las acciones combinadas de (I) L-aminotransferasa y (II) glutamato deshidrogenasa. La D-PPT deseada se purifica de la mezcla de reacción.

En un método todavía adicional de obtención de D-PPT, DL-PPT se trata con una L-aminoácido oxidasa de forma que el aminoácido que queda está en la forma D deseada. Esta D-PPT se purifica luego de la mezcla de reacción.

Aún otro método adicional implica (I) conversión de DL PPT en N-acetil DL PPT (usando anhídrido acético u otros reactivos y métodos acetilantes bien conocidos en la técnica) y (II) tratamiento de N-acetil DL PPT con D-amino

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proteínas. El experto en la técnica reconocerá la necesidad de elegir tales genes, y los promotores que dirigen su expresión, cuidadosamente, teniendo en cuenta la naturaleza de la enzima utilizada para convertir la sustancia no fitotóxica. En caso de que el polinucleótido proporcione resistencia a múltiples herbicidas, tales herbicidas se pueden seleccionar del grupo que consiste en un herbicida de tipo dinitroanilina, triazolo-pirimidinas, un uracilo, una fenilurea, una tricetona, un ixoxazol, una acetanilida, un oxadiazol, una triazinona, una sulfonanilida, una amida, una anilida, un isoxaflutol, una fluorocloridona, un norflurazón y un herbicida de tipo triazolinona, y el herbicida postemergencia se selecciona del grupo que consiste en glifosato y sus sales, glufosinato, asulam, bentazón, bialafos, bromacilo, setoxidim u otra ciclohexanodiona, dicamba, fosamina, flupoxam, fenoxi-propionato, quizalofop u otro ariloxi-fenoxipropanoato, picloram, fluormetrón, butafenacilo, atrazina u otra triazina, metribuzina, clorimurón, clorosulfurón, flumetsulam, halosulfurón, sulfometrón, imazaquina, imazetrapir, isoxabén, imazamox, metosulam, piritrobac, rimsulfurón, bensulfurón, nicosulfurón, fomesafén, fluroglicofén, KIH9201, ET751, carfentrazona, mesotriona, sulcotriona, paraquat, diquat, bromoxinilo y fenoxaprop.

En el caso de que el polinucleótido comprenda secuencias que codifiquen proteínas insecticidas, estas proteínas se pueden seleccionar del grupo que consiste en toxinas cristalinas derivadas de Bt, incluyendo toxinas Bt secretadas, como aquellas conocidas como “VIP”, inhibidores de proteasa, lectinas y toxinas de Xenhorabdus/Photorhabdus. Los genes que confieren resistencia a hongos pueden seleccionarse del grupo que consiste en los que codifican AFPs, defensinas, quitinasas, glucasasas y Avr-Cf9 conocidas. CryIAc, cryIAb, cry3A, Vip 1A, Vip 1B, Vip 3A, Vip 3B, inhibidores de cisteína proteasas, y lectinas en copo de nieve son proteínas insecticidas particularmente preferidas. En el caso de que el polinucleótido comprenda genes que confieren resistencia a bacterias, éstos se pueden seleccionar del grupo formado por aquellos que codifican cecropinas y tequiplesina y sus análogos. Los genes que confieren resistencia a virus se pueden seleccionar del grupo que consiste en aquellos que codifican proteínas de la cubierta del virus, proteínas de movimiento, replicasas virales y secuencias antisentido y de ribozima, que se sabe que proporcionan resistencia a virus, mientras que los genes que confieren resistencia al estrés, sal y sequía se pueden seleccionar de aquéllos que codifican Glutationa-S-transferasa y peroxidasa, cuya secuencia constituye la secuencia reguladora CBF1 conocida y genes que se sabe que permiten la acumulación de trehalosa.

Los polinucleótidos usados según la presente invención se pueden haber “modificado” para potenciar la expresión de las secuencias codificantes de proteínas comprendidas por los mismos, de forma que los motivos y/o regiones de escisión fortuitas de inestabilidad del ARNm se pueden haber eliminado, o los codones preferidos del cultivo se pueden haber usado de forma que la expresión del polinucleótido así modificado en una planta, produzca una proteína sustancialmente similar que tenga una actividad/función sustancialmente similar a la obtenida mediante la expresión de las regiones codificantes de la proteína del polinucleótido sin modificar en el organismo en el que tales regiones del polinucleótido sin modificar son endógenas. El grado de identidad entre el polinucleótido modificado y un polinucleótido contenido endógenamente en dicha planta y que codifica sustancialmente la misma proteína puede ser tal que evite la cosupresión entre las secuencias modificada y endógena. En este caso, el grado de identidad entre las secuencias debería de ser preferiblemente inferior a aproximadamente el 70%. Además, la secuencia alrededor de una posición de inicio de la traducción se puede modificar de forma que sea “preferida por Kozack”. Lo que significa esto es bien conocido por el experto.

La invención incluye también plantas completas condicionalmente fértiles, morfológicamente normales, que resultan del cruzamiento de plantas que se han regenerado a partir de material que se ha transformado con el ácido nucleico según la presente invención y que por lo tanto proporciona tal rasgo. La invención incluye así mismo la progenie de las plantas resultantes, sus semillas y partes.

Las plantas de la invención se pueden seleccionar del grupo que consiste en cultivos de campo, frutas y vegetales, tales como cánola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, remolacha forrajera, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, fresas, plátano, melón, patata, zanahoria, lechuga, col, cebolla, especies de soja, caña de azúcar, guisantes, habas pequeñas, álamos, uvas, cítricos, alfalfa, centeno, avena, césped y pastos de forraje, lino y colza, y plantas productoras de nueces, siempre que no se hayan mencionado específicamente, su progenie, semillas y partes.

Tales plantas específicamente preferidas incluyen trigo, cebada, avena, arroz, maíz, mijo y sorgo.

Las plantas estériles masculinas de la presente invención son útiles en un método para producir semilla de trigo híbrido, que comprende las etapas de:

(i)

transformar material vegetal con un polinucleótido o vector que comprende un gen que confiere esterilidad masculina condicional tras la aplicación exógena de un proherbicida u otra sustancia no fitotóxica;

(ii)

seleccionar el material así transformado; y

(iii) regenerar el material así seleccionado en plantas completas condicionalmente estériles masculinas, morfológicamente normales;

(iv)

obtener una línea parental femenina, condicionalmente estéril masculina homozigótica;

(v)

transformar el material vegetal con un polinucleótido o vector que comprende un gen que confiere

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La presente invención estará más clara a partir de los siguientes ejemplos no limitantes, tomados junto con el listado de secuencias y los dibujos asociados.

SEC ID NO: 1 muestra una secuencia de ADN, aislada de Synechocystis sp. que codifica una enzima (representada como SEC ID NO: 2) que tiene la actividad de una esterasa B.

SEC ID NO: 3 muestra una secuencia de ADN, aislada de Neurospora crassa que codifica una enzima (representada como SEC ID NO: 4) que tiene la actividad de una secuencia de acil-metilacil-CoA racemasa.

SEC ID NO: 5 y 6 representan los cebadores de PCR usados para obtener la región promotora TA29

SEC ID NO: 7 representa una secuencia de ADN, aislada de (Rhodotorula gracilis, que codifica una enzima con actividad de D-aminoácido oxidasa.

SEC ID NO: 8 y 9 representan oligos degenerados usados para proporcionar una D-amino oxidasa variante.

SEC ID NO: 10 y 11 representan motivos en los que aminoácidos alternativos se pueden sustituir a fin de proporcionar D-aminoácido oxidasas variantes.

La Figura 1 es una representación esquemática de una construcción para la transformación de tabaco, que tiene D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula bajo el control operable de la región promotora stig 1. Los componentes indicados son LB (secuencia del límite izquierdo), AOPRE1 (promotor AoPR1, PSTIG1 (nº de acceso de EMBL X77823), RGDAO (OPT) (SEC ID NO: 7), PROMOTOR PC (nº de acceso de EMBL X16082), PAT (nº de acceso de EMBL A02774), NOS (terminador nos obtenido del nº de acceso de EMBL atu237588) y RB (secuencia del límite derecho).

La Figura 2 es una representación esquemática de una construcción para la transformación de tabaco, en la que una secuencia codificante de D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula se trunca mediante 3 codones en el extremo 3’, y en el extremo 5’ (RGDAO(OPT)-SKL) se fusiona a una región que codifica un péptido de tránsito optimizado (documento FR2673643).

La Figura 3a es un mapa de Ubi-CoA sintetasa plasmídica, en el que PUB11-01-01 tiene el número de acceso de EMBL SM29159 y Coa sintetasa tiene el número J05439.

La Figura 3b es un mapa de la Ubi-Epimerasa, en el que epimerasa tiene un número de acceso de EMBL Y0817Z.

Los métodos de biología molecular general se realizan según métodos bien establecidos.

En su mayor parte, los siguientes ejemplos comprenden cada uno ejemplificaciones múltiples de la presente invención o ejemplos para fines comparativos. Cuando se usa la expresión “región promotora de un gen”, se considera que significa secuencias de ADN que comprenden el promotor, secuencias en dirección 5’ del promotor, y también, opcionalmente, toda o parte de la secuencia de ADN que codifica la región líder no traducida en 5’ del ARNm.

Ejemplo 1. Plantas de tabaco que son condicionalmente estériles femeninas, dependientes de la aplicación exógena de D-fosfinotricina o, para fines comparativos, D-alanina o D-leucina o D-metionina o D-asparagina

o D-aspartato o D-glutamato

La secuencia de ADN que codifica la secuencia de la proteína D-aminoácido oxidasa Q99042 (Swissprot) comprendida en la secuencia EMBL Z50019 se obtiene, bien mediante RT-PCR a partir de ARNm de Trigonopsis variabilis, o se obtiene sintéticamente. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la secuencia de la proteína D-aminoácido oxidasa P80324 (Swissprot) incluida en la secuencia de EMBL A56901, se obtiene, bien mediante RT-PCR del ARNm de Rhodosporidium toruloides (Rhodotorula gracilis) o se obtiene sintéticamente (lo que hace más fácil controlar qué sitios internos de enzimas de restricción están presentes y crear sitios flanqueantes para facilitar la clonación) como por ejemplo SEC ID NO 7, que se diseña para dar cuenta del uso del codón de la planta (en este caso trigo), y para minimizar las características del ADN potencialmente desfavorables para la expresión. Alternativamente, la secuencia de ADN (por ejemplo derivada de la de nº de acceso de EMBL X95310) codifica una “D-aspartato oxidasa” como P31228 (Swiss Prot) y, de nuevo, se sintetiza para dar cuenta del uso del codón de la planta y para minimizar las características desfavorables para la expresión. Alternativamente, las secuencias codificantes de D-aminoácido oxidasa obtenidas son las mismas que en el ejemplo 2. Las secuencias flanqueantes del cebador de PCR y las secuencias de ADN sintéticas se diseñan para establecer sitios de restricción únicos útiles para la clonación. Preferiblemente, y en el caso en que la secuencia codificante de oxidasa no contenga sitios internos confusos, se coloca un sitio Nco1 o Nde 1 en el extremo 5’, para facilitar la clonación de fusiones en el marco de lectura con secuencias añadidas al ORF en 5’, como secuencias codificantes del péptido de tránsito cloroplástico. En algunas variantes del ejemplo, el gen de la D-aminoácido oxidasa (denominada en algunas variantes “D-aspartato oxidasa”) se clona de tal forma que los aminoácidos 3 terminales están truncados y la enzima codificada, por tanto, ya no es dirigida al peroxisoma. En una serie adicional de variantes del método, el gen se

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obtiene mediante ingeniería genética por PCR, para codificar la D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis con aminoácidos alternativos en posiciones 213 y 238 y, en particular con una arginina, serina, cisteína, lisina, asparagina o alanina que sustituye a la metionina en posición 213, y/o una histidina, serina, cisteína, asparagina o alanina que sustituye a la tirosina en posición 238. La metionina en posición “213” se identifica como M en el motivo de la secuencia de la proteína nativa RCTMDSS. La tirosina en posición 238 se identifica como “Y” en el motivo de la secuencia de la proteína nativa GGTYGVG. Estas variantes de la D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula o la “Daspartato oxidasa” se usan cuando la esterilidad femenina se tiene que hacer condicional tras la aplicación de Daspartato, D-glutamato o D-fosfinotricina.

Se pueden colocar sitios de restricción en dirección 5’ de las secuencias intervinientes del sitio de inicio de la traducción ATG que concuerden con las secuencias consenso de traducción de la planta, como aquéllas según Kozak.

El promotor “delta S13” es una región promotora útil para obtener expresión preferente en partes de la flor femeninas. Éste comprende una región -339 a -79 desde la región promotora SLG13, fusionada con la que va de -46 a + 8 del promotor nuclear CMV 35S (Dzelkains et al (1993) Plant Cell, 5, 833-863). Esta región promotora S13 se clona en el plásmido bluescript sk, el cual se somete nuevamente a restricción y se liga con fragmentos de restricción que comprenden la región terminadora transcripcional nos 3’ y una u otra de las secuencias codificantes de aminoácido oxidasa, de forma que se cree un casete de expresión “delta S13-D-aminoácido oxidasa-terminador Nos” dentro de un plásmido bluescript sk. Éste se elimina entonces mediante restricción adecuadamente como, por ejemplo, en forma de fragmento EcoR1 y, como tal, se vuelve a ligar en un sitio adecuado en un vector como Pbin19 (Bevan (1984) Nucleic Acids Res.) o pCIB200 o pCIB2001 (documento WO 98/39462) a fin de usarlo para transformación usando Agrobacterium. Como se describe en el documento WO 98/39462, pCIB200 contiene los siguientes sitios de restricción de poliligador únicos: EcoR1, Sst1, Kpn1, BgIII, Xaba1 y SaII. PCIB 2001 contiene una inserción en el poliligador, que añade sitios de restricción únicos adicionales, que incluyen MluI, BcII, AvrII, ApaI, HpaI y StuI. PCIB200 y pCIB2001 también proporcionan genes marcadores seleccionables para selección vegetal y bacteriana en kanamicina, límites izquierdo y derecho de ADN-T, la función trfA derivada de RK2 para movilización entre E. coli y otros hospedantes y las funciones oriT y oriV de RK2. Alternativamente, se usa el vector binario Pcib10, que incorpora secuencias del plásmido Prk252 de amplio ámbito de hospedantes (Rothstein et al (1987) Gene 53, 153-161), o se usa uno de sus derivados que incorpora genes de resistencia a kanamicina y el gen de higromicina fosfotransferasa, como Pcib715 (Gritz et al (1983) Gene 25, 179-188).

Alternativamente, se usa la región promotora Stig 1 ~ 1,6 kb (derivada del nº de acceso de EMBL X77823). Por ejemplo, la región codificante del gen GUS en la construcción stg1-GUS, descrita por Goldman et al (1994) en EMBO J., 13, 2976-2984, se reemplaza por la secuencia de ADN que codifica las secuencias codificantes P80324 o Q99042, usando enzimas de restricción adecuadas, y la construcción de expresión stig1-D-aminoácido oxidasa resultante se clona en un vector adecuado como pCIB200 en una posición en dirección 5’ de una secuencia terminadora en 3’ adyacente a un gen marcador adecuado y entre secuencias límite de ADN-T.

En un ejemplo particular adicional, el inserto de ADN-T comprendido en el vector binario se construye según la figura

1. Se clona una construcción que comprende la secuencia de ADN sintética (SEC ID NO 7) que codifica la Daminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis bajo el control operable de la región promotora stig1 y también la secuencia de ADN (A02774) que codifica la L-fosfinotricina-N-acetil transferasa (PAT) bajo el control operable de la región promotora de plastocianina de guisante, en un sitio entre el gen LB/upt II y el RB del ADN-T del vector binario. En resumen, la secuencia ID NO 7 se clona en el plásmido pFse4-Stig1nos (descrito en el doc WO9942598) detrás del promotor Stig1 y frente a la región terminadora nos (comprendida en EMBL ATU237588), como un fragmento NcoI/PstI. La región promotora de plastocianina de guisante (derivada del nº de acceso de EMBL X16082), se obtiene del ADN genómico de guisante mediante PCR y se clona frente al gen PAT/terminador nos. El casete PCPAT-nos resultante se clona detrás del Stig 1 -RGDAMOX-nos, como un fragmento NotI, y esta construcción completa de dos genes se transfiere a un vector binario (Pvb6, un derivado de Bin19), como un fragmento FseI.

En una variante adicional del método, la construcción usada está de acuerdo con la representación esquemática de la figura 2. La secuencia codificante de la D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula, SEC ID NO 7, opcionalmente mutada mediante mutación dirigida para codificar la forma M213R, se trunca mediante 3 codones en el extremo 3’, y en el extremo 5’ se clona para colocarla inmediatamente en dirección 3’ de una región que codifica un péptido de tránsito cloroplástico, de forma que se codifica una proteína de fusión de péptido de tránsito cloroplástico/Daminoácido oxidasa. La secuencia codificante del péptido de tránsito cloroplástico deriva del gen de Arabidopsis que codifica la subunidad pequeña de la EPSP sintasa (Klee et al, 1987 en Mol-Gen. Genet., 210, 437). Opcionalmente, ésta está modificada para incluir un sitio Sph1 en el sitio de procesamiento de CTP, reemplazando por tanto la Glu-Lys en este sitio por Cys-Met (SEC en Fig. 9 del documento WO 92044490). Correspondientemente, se puede incorporar mediante ingeniería genética un sitio SPh1 en el término N de la secuencia codificante de D-aminoácido oxidasa (convirtiendo el aminoácido a continuación de la metionina en una Leu). Alternativamente, la secuencia codificante del péptido de tránsito cloroplástico deriva del gen de Petunia que codifica EPSP sintasa (Fig. 11 del documento WO 92044490). Alternativamente, la secuencia codificante del péptido de tránsito cloroplástico es una de un gran número de posibilidades que incluyen aquéllas derivadas de genes que codifican la subunidad pequeña de Rubisco y que incluye la así denominada secuencia del péptido de tránsito quimérica “optimizada” (documento FR 2673643). En todos los casos, más que basarse en la subclonación, la secuencia de ADN deseada total que codifica

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transferasa, como el gen “PAT”, bajo el control operable de una región promotora, como la del gen de plastocianina (en este caso la región del gen de plastocianina de Pisum sativum). A tiempos y tasas de pulverización apropiados entre 250 g/ha y 5 kg/ha de DL-fosfinotricina, las plantas tratadas no están dañadas visiblemente, pero se vuelven condicionalmente estériles masculinas, mientras que permanecen fértiles femeninas normales, o casi normales.

Ejemplo 3 Comparativo. Genes quiméricos expresados preferentemente en estructuras reproductivas masculinas y que codifican enzimas capaces de hidrolizar imazametabenz metilo o flamprop M metilo o flamprop M isopropilo en sus ácidos carboxílicos respectivos

La secuencia de ADN que codifica la secuencia de la proteína carboxilesterasa Q01470 (Swissprot) de la secuencia de EMBL M94965 mediante PCR a partir de ADN genómico de Arthrobacter oxydans o se obtiene sintéticamente. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la secuencia de proteína carboxilesterasa P37967 (Swissprot) en la secuencia de EMBL BS06089 se obtiene mediante PCR a partir de ADN genómico de Bacillus subtilis o se obtiene sintéticamente. Alternativamente, la secuencia de ADN que codifica la secuencia de proteína P40363 (Swissprot) en la secuencia de EMBL Z34288 se obtiene mediante RT-PCR a partir de ARNm de Saccharomyces cervisiae o se obtiene sintéticamente. Las secuencias de flanqueo del cebador de PCR o de ADN sintéticas se diseñan para colocar sitios de restricción únicos útiles para la clonación. Preferiblemente, y en el caso en el que la secuencia codificante de carboxilesterasa no contenga sitios internos confusos, se coloca un sitio Nco1 o Nde 1 en el extremo 5’, para facilitar la clonación de fusiones en el marco de lectura con secuencias añadidas al ORF en 5’. Alternativamente, cuando los sitios de restricción se colocan en dirección 5’ del sitio de inicio de la traducción ATG, se diseñan secuencias intervinientes para que estén de acuerdo con secuencias consenso de traducción de plantas según Kozak.

El plásmido pGK73 porta el fragmento EcoR1-BamH1 de la región promotora TA29s desde -810 hasta +54 (Kriete et al (1996), 9, 809-818). Este fragmento de restricción o un fragmento generado mediante PCR adecuado similar se clona, preferiblemente como una fusión en el marco, en una posición en dirección 5’ de la secuencia de ADN que codifica carboxilesterasa Q01470 o P37967 en bluescript sk. Usando una serie adecuada de etapas de restricción, ligación y subclonación, se añade un terminador transcripcional nos 3’ de la región codificante para generar, según la secuencia codificante, casetes de expresión alternativos del tipo TA29-carboxilesterasa-nos en plásmidos Bluescript sk, pBLTA_Q01470, pBLTA_P37967 y pBLTA_P40363.

En un ejemplo adicional, se usa la región promotora SGB6 específica delantera, sec ID número 1 del documento USP 5470359. Por ejemplo, pSGBNE1 que contiene un fragmento subclonado EcoR1-Nhe1 genómico de 3 kb procedente de pSGB6g1 (documento USP 5470359) se subclonó adicionalmente para colocar un fragmento ApalI/Xba1 de 1558 pb clonado de forma roma en bluescript ks en el sitio SmaI. Como antes, a través de etapas adicionales de restricción y clonación, este fragmento se fusiona en dirección 5’ en el marco de las secuencias codificantes de ADN P37967, Q01470 o P40363. Nuevamente, se añade un terminador nos 3’ de la región codificante para crear plásmidos Bluescript sk alternativos, pBLB6_Q01470, pBLB6_P37967 y pBLB6_P40363, que comprenden los casetes de expresión alternativos SGB6-carboxilesterasa-nos.

En un conjunto similar de ejemplos, la región promotora específica delantera RA8 del arroz (acceso EMBL/genbank AF042275; Jean Js et al (1999) PMB, 39, 35-44) se fusiona también de forma similar en un sitio en el marco y en dirección 5’ de una u otras de las secuencias de ADN que codifican carboxilesterasa y un terminador nos en 3’ para comprender casetes de expresión alternativos de RA8-carboxilesterasa-nos en una serie de vectores bluescript sk, pBLRA8_Q01470, pBLRA8_P37967 y pBLRA8_P40363.

Ejemplo 4. Genes quiméricos expresados preferentemente en estructuras reproductivas femeninas y que codifican enzimas capaces de oxidar D-fosfinotricina y/o D-alanina y/o D-leucina y/o D-metionina y/o Dasparagina y/o D-aspartato y/o D-glutamato

Se obtienen secuencias de ADN que codifican la proteína D-aminoácido oxidasa, según se describe en los ejemplos 1 y2.

El clon genómico pSH64 se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest el 27/02/1998 con NRRL y se le asignó el número NRRL B-21920. Se detectó como un clon genómico que hibridaba con el clon de ADNc específico de la seda B200i4-2 (documento WO 98/39462). Se construyen genes quiméricos que se expresan preferentemente en estructuras reproductivas femeninas como sigue. Se construyó un plásmido derivado de Bluescript ks, similar a pSH70 que tiene un casete de expresión “vacío”, que comprende, de 5’ a 3’, la región promotora en 5’ B200i, que consiste en los nucleótidos 1-3790 de SEC ID NO 11 del documento WO 98/39462, un sitio BamH1 y la región terminadora no traducida B200i en 3’, que comprende los nucleótidos 4427-6397 de la SEC ID NO 11 del documento WO 98/39462, según se describe en el documento WO 98/39462. Usando una digestión parcial con BamH1 o, alternativamente, mediante nuevas etapas de subclonación, PCR y ligamiento, se ligan secuencias codificantes alternativas de D-aminoácido oxidasa en la posición del sitio BamH1 o adyacentes al mismo, de forma que están en posición inmediatamente 3’ respecto de la región promotora B200i y 5’ de la región terminadora B200i. Consecuentemente, se crean una serie de vectores Bluescript pBLB200_Q99042, pBLB200_P80324, pBLB200_Q9HGY3 y pBLB200_P24552, que codifican los casetes de expresión alternativos B200i-D-aminoácido oxidasa-B200i.

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Alternativamente, según se describe en el documento WO 98/39462, se escinde un fragmento Pst I/Nco I de la región promotora en 5’ del gen P19, del clon genómico X2-1, que se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest el 27/02/1998 en NRRL y al cual se asignó el número de acceso B-21919. El sitio Nco I en el nucleótido 1088 de SEC ID NO 14 del documento WO 98/39462 corresponde al inicio de la traducción ATG del gen P19. Usando etapas apropiadas de subclonación, restricción, ligamiento y PCR, este fragmento se liga para formar una fusión en marco de lectura con una u otra de las secuencias de ADN que codifican D-aminoácido oxidasa y se añade una secuencia terminadora nos en posición 3’ respecto de la secuencia codificante. Consecuentemente, se crea una serie de vectores Bluescript pBLP19_Q99042, pBLP19_P80324, pBLP19_Q9HGY3 y pBLP19_P24552, etc., que codifican los casetes de expresión alternativos P19-D-aminoácido oxidasa-nos. Alternativamente, usando métodos estándar similares, se obtienen plásmidos similares que tienen la región promotora en 5’ (que comprende algunos o todos los nucleótidos 1-3987 de SEC ID NO 2 del documento WO 98/39462) del gen P26 en lugar de la región promotora de P19. El clon P26-A4 genómico, pCIB10302, depositado bajo los términos del Tratado de Budapest el 21 de enero de 1997 con el nº de acceso de la colección de cultivos de patentes del Agricultural Research Service (NRRL) NRRL B-21655, se subclonó según se describe en el documento WO 98/39462. Consecuentemente, se crea una serie de vectores Bluescript pBLP26_Q99042, pBLP26_P80324, pBLP26_Q9HGY3 y pBLP26_P24552, que codifican los casetes de expresión alternativos P19-D-aminoácido oxidasa-nos.

Ejemplo 5. Genes quiméricos expresados preferentemente en estructuras reproductivas masculinas y que codifican enzimas capaces de oxidar D-fosfinotricina y/o D-alanina y/o D-leucina y/o D-metionina y/o Dasparagina y/o D-aspartato y/o D-glutamato

Se obtienen secuencias de ADN que codifican secuencias de la proteína D-aminoácido oxidasa, según se describe en los ejemplos 1 y 2.

El plásmido pGK73 porta el fragmento EcoR1-BamH1 de la región promotora TA29s desde -810 hasta +54 (Kriete et al (1996), 9, 809-818). Este fragmento de restricción o un fragmento generado mediante PCR adecuado similar se clona, preferiblemente como una fusión en el marco, en una posición en dirección 5’ de la secuencia de ADN que codifica la D-aminoácido oxidasa en bluescript sk. Usando una serie adecuada de etapas de restricción, ligación y subclonación, se añade un terminador transcripcional nos 3’ de la región codificante para generar, según la secuencia codificante, casetes de expresión alternativos del tipo TA29-D-aminoácido oxidasa-nos en plásmidos Bluescript sk.

En un ejemplo adicional, se usa la región promotora SGB6 específica delantera, sec ID número 1 del documento USP 5470359. Por ejemplo, pSGBNE1 que contiene un fragmento subclonado EcoR1-Nhe1 genómico de 3 kb procedente de pSGB6g1 (documento USP 5470359) se subclonó adicionalmente para colocar un fragmento ApalI/Xba1 de 1558 pb clonado de forma roma en bluescript ks en el sitio SmaI. Como antes, a través de etapas adicionales de restricción y clonación, este fragmento se fusiona en dirección 5’ en el marco de las secuencias codificantes de D-aminoácido oxidasa. Nuevamente, se añade un terminador nos 3’ de la región codificante para crear plásmidos Bluescript sk alternativos, que comprenden los casetes de expresión alternativos SGB6-Daminoácido oxidasa-nos.

En un conjunto similar de ejemplos, la región promotora específica delantera RA8 del arroz (acceso EMBL/genbank AF042275; Jean Js et al (1999) PMB, 39, 35-44) se fusiona también de forma similar en un sitio en el marco y en dirección 5’ de una u otras de las secuencias de ADN que codifican D-aminoácido oxidasa y un terminador nos en 3’ para comprender casetes de expresión alternativos de RA8-D-aminoácido oxidasa-nos en una serie de vectores bluescript.

Ejemplo 6. Un par de construcciones complementarias útiles en un método para proporcionar (a) una línea parental consanguínea femenina, que es condicionalmente estéril masculina, dependiente de la aplicación de DL-fosfinotricina y (b) una línea parental consanguínea masculina complementaria, que es condicionalmente estéril femenina, dependiente de la aplicación de DL-fosfinotricina.

La primera construcción de ADN adecuada para proporcionar una línea parental consanguínea femenina de plantas de arroz o cereal, que es condicionalmente estéril masculina, dependiente de la aplicación de DL-fosfinotricina, comprende tres genes A), B) y C). A) consiste en una secuencia de ADN que codifica una enzima PAT, capaz de Nacetilar L-fosfinotricina bajo el control operable de la región promotora de ~ 1 kb del gen de plastocianina de cebada (EMBL Z28347) y una región terminadora adecuada como la del gen nos o 35S, B) consiste en una secuencia codificante de PAT similar a la primera, pero esta vez bajo el control operable de una región promotora floral femenina específica de tejido (como P19 o P26, según se describe en el ejemplo 4), más un terminador adecuado; y C) consiste en una secuencia codificante de DAMOX adecuada, según se describe en los ejemplos 1, 2, 12 y 13, por ejemplo, un mutante de la D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis que tiene una arginina, serina, cisteína, lisina, asparagina o alanina que sustituye a la metionina en la posición 213 y/o una histidina, serina, cisteína, asparagina o alanina que sustituye a la tirosina en posición 238, bajo el control operable de una región promotora floral masculina específica de tejido (como SGB6 o RA8, según se describió en el ejemplo 5), y una región terminadora adecuada. Esta construcción se ensambla usando métodos que son estándar en la técnica y se describen en los ejemplos previos.

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Maxi-prep (Qiagen), usando los protocolos proporcionados por el fabricante.

Ejemplo 8. Tranformación/regeneración de trigo con polinucleótidos que comprenden genes quiméricos expresados preferentemente en estructuras reproductivas masculinas o femeninas, y que codifican enzimascapaces de oxidar D-fosfinotricina y/o D-alanina y/o D-leucina y/o D-metionina y/o D-asparagina y/o Daspartato y/o D-glutamato

En un ejemplo, se siembran en placa embriones inmaduros (0,75-1,0 mm de longitud) de genotipo UC703, sobre medio MS que contiene 3 mg/l de 2,4-D y sacarosa al 3%. Tras aproximadamente 4 h, los embriones se siembran en placa en medio MS que contiene maltosa al 15%, sacarosa al 3% y 3 mg/l de 2,4-D, cubierto con una capa de agarosa soportada sobre papel de filtro, que contiene los mismos componentes. Los embriones se dejan plasmolizar durante 2-3 h antes del bombardeo.

El ADN preparado según se describe en el ejemplo 7 y en los ejemplos posteriores, se precipita sobre partículas de oro de tamaño micrométrico, usando procedimientos estándar. Cuatro placas diana con 16 embriones por diana se bombardean dos veces con un dispositivo de helio de DuPont Biolistics, usando una presión de estallido de 1100 psi. Las placas se bombardean con un tamiz de malla 80 colocada entre la etapa portadora y la diana. Tras el bombardeo, las dianas se colocan en la oscuridad a 25ºC durante 24 h antes de que las capas con los embriones se depositen sobre placas de medio MS que contiene sacarosa al 3% y 3 mg/l de 2,4-D. Los embriones individuales se eliminan de las láminas y se colocan directamente en medio recién preparado de la misma composición tras otras 48

h. Aproximadamente 6 semanas después del suministro de genes, el tejido se coloca sobre medio MS con 3 mg/l de 2,4-D, sacarosa al 3% y 0,2 mg/l de metotrexato, durante un período de 3 semanas. El tejido se coloca luego en medio de regeneración que comprende medio MS que contiene 1 mg/l de ribósido de zeatina y 1 mg/l de metotrexato. Tras 2 semanas de regeneración, las plántulas se colocan en contenedores estériles con medio MS de fuerza media que contiene sacarosa al 2%, 1 mg/l de ácido naftil-acético y 4 mg/l de metotrexato.

En variantes particulares del ejemplo, los vectores que comprenden genes quiméricos expresados preferentemente en estructuras reproductivas masculinas se cobombardean con genes marcadores seleccionables alternativos. Así, por ejemplo, se prepara ADN de plásmidos como pBLRA8_P24552, obtenido de modo análogo al Ejemplo 3 (pero que expresa una secuencia de D-aminoácido oxidasa en lugar de una carboxilesterasa), bajo el control operable de la región promotora RA8 y se reviste sobre partículas de oro junto con pUbiHyg (un plásmido que codifica higromicina fosfotransferasa bajo el control operable del promotor de poliubiquitina de maíz). En este caso, la transformación y regeneración se realiza según se describió anteriormente excepto que, a continuación del bombardeo, el medio de regeneración contiene concentraciones crecientes de higromicina entre 2 y 20 mg/l.

En un ejemplo adicional, el trigo se transforma con pZEN18_BLB200_Q99042, seleccionado usando glifosato y regenerado según se describe en el ejemplo 15 del documento WO 00/66748.

Se extrae ADN de tejidos de hojas de plantas derivados de transformación y se realiza la PCR para la presencia del gen marcador seleccionable y del gen que codifica la D-aminoácido oxidasa. Las plantas positivas para PCR se propagan. Durante la floración, se recogen los pistilos y anteras y se prepara ARN. La expresión de ADN se confirma mediante análisis Northern. Además, los genes de D-aminoácido oxidasa se expresan usando vectores pET en E. coli y se purifican parcialmente. Las bandas proteicas de la proteína expresada se cortan de un gel de SDS y se usan para generar anticuerpos policlonales. Estos anticuerpos se usan para detectar la expresión en tejidos florales y otros tejidos mediante análisis Western.

Ejemplo 9. Se aplica un método de producción eficiente de cultivos de cereal híbrido en los que se aplica DLfosfinotricina para control de malas hierbas y, al mismo tiempo, como sustancia química hibridante, y en el que la generación híbrida F1 de plantas resultante de semilla híbrida así producida es sustancialmente tolerante, tanto vegetativa como reproductivamente, a la aplicación de DL-fosfinotricina.

Los agentes hibridantes químicos son caros. Sería deseable usar una sustancia relativamente barata, como un herbicida comercial, como hibridante químico. Esto lograría también mayor eficiencia, ya que el control de las malas hierbas se podría combinar con la hibridación química. Sin embargo, existen diversos problemas a solventar a fin de lograr este propósito. Primeramente, se necesitaría establecer líneas parentales masculina y femenina que sean tolerantes al herbicida en cuestión. Además, a fin de lograr la fertilidad “condicional” deseada en respuesta a la aplicación del herbicida, se necesitaría que las dos líneas se transformen por ingeniería genética de tal forma que la tolerancia al herbicida no se extienda a todos los tejidos, sino que se exprese de forma específica del tejido, de manera que cada uno de los tejidos florales requeridos permanezca susceptible selectivamente. Por tanto, en una línea (la línea parental femenina), el grueso de la planta más el tejido femenino se tiene que volver tolerante, mientras que alguna parte crítica del tejido floral femenino tiene que permanecer susceptible a la aplicación, mientras que en la otra (la línea parental masculina), se precisa lo contrario, permaneciendo susceptible sólo alguna parte crítica del tejido formador de gametos femeninos. Incluso aunque esto se pudiese conseguir, queda un problema adicional por solventar respecto a la semilla híbrida y a la producción de F1. Dado que esta generación del cultivo contendría, necesariamente, al menos dos genes capaces de conferir resistencia al herbicida, sería deseable que este mismo herbicida pudiese usarse para el control de las malas hierbas en el cultivo. Sin embargo, es muy difícil concebir una combinación de herbicidas, regiones promotoras específicas de tejido y genes de tolerancia que

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permita este uso del mismo herbicida en la generación F1. Sería probable que el cultivo híbrido presentase tolerancia vegetativa, pero poco o ningún rendimiento de grano, tras la aplicación de herbicida a la generación F1. Por ejemplo, para el herbicida glifosato, el mecanismo usual de resistencia es la expresión de una forma resistente de EPSP sintasa. Es difícil identificar una región promotora o combinación de regiones promotoras que permita una expresión suficiente de un R-EPSPS en todos los tejidos y momentos distintos de, digamos, en una etapa crítica en el desarrollo de los estambres o estigmas. La forma más directa a este respecto sería usar un enfoque antisentido o similar, en el que la expresión del R-EPSPS esté dirigida por un promotor inespecífico de tejido/constitutivo y suprimido sólo local y transitoriamente, por ejemplo, en los estambres, debido a la expresión de un gen EPSPS antisentido (véase por ejemplo el documento WO 9946396). Sin embargo, en este caso la supresión de expresión en el estambre (o estigma) estaría dirigida por un gen dominante. Está claro que, para cualquier mecanismo de este tipo, la aplicación del herbicida a la generación F1 produciría un cultivo estéril, no productivo, debido a los efectos aditivos de los genes de esterilidad condicional dominantes masculinos y femeninos.

La presente invención proporciona un método para solventar el problema de permitir el uso de un herbicida comercial barato, DL-fosfinotricina, como control de malas hierbas y agente hibridante en la producción de cereales híbridos y, proporcionando tal método además, cereales o arroz híbridos resultantes, en el que se puede usar DLfosfinotricina (o L-fosfinotricina) de forma segura para el control de malas hierbas sin pérdida sustancial de rendimiento. Como ventaja adicional, la semilla autofecundada de la generación F1, que puede crecer más tarde como planta de regeneración natural en cultivos posteriores, será más fácil de manejar ya que, será por sí misma generalmente estéril si se pulveriza con cantidades controladas de DL-fosfinotricina. Lo mismo ocurrirá con la progenie del polen entrecruzado de las plantas F1 para malas hierbas (por ejemplo arroz rojo) u otros cereales. La presente invención proporciona genes y enzimas que convierten un componente no fitotóxico, D-fosfinotricina, de una formulación herbicida comercial de DL-fosfinotricina, en la forma L activa. El gen PAT, que convierte Lfosfinotricina en N-acetil L-fosfinotricina ya es conocido y se usa comercialmente para proporcionar tolerancia a DLfosfinotricina en cultivos. Una observación adicional crítica que guarda relación con el presente ejemplo es que, sorprendentemente, se descubrió que el trigo que contenía el gen PAT bajo el control de expresión operable de la región promotora de plastocianina de cebada, es sustancialmente tolerante reproductivamente a la aplicación de DLfosfinotricina en tasas de al menos 2 kg/ha. Por tanto, una característica crítica de las construcciones descritas en el ejemplo 6, que se usan para proporcionar las plantas del presente ejemplo, es que el gen PAT, que proporciona el rasgo de resistencia, se expresa bajo el control operable de una región promotora que proporciona la expresión sustancialmente sólo en los tejidos verdes. Una característica de tal región promotora útil es que debería expresar PAT de tal forma que proteja adecuadamente todos los tejidos florales no verdes de la DL-fosfinotricina aplicada foliarmente, mientras que proporcione, al mismo tiempo, sólo un nivel mínimo de expresión de PAT en el tejido floral propiamente dicho, y especialmente baja en aquellas partes a las que se dirige la esterilidad condicional. Con PAT expresado bajo el control de la región promotora de plastocianina de cebada, esta condición parece cumplirse, ya que sustancialmente toda la L-fosfinotricina que se pulveriza entra vía las hojas, se intercepta y se convierte en Nacetil L-fosfinotricina no tóxica, antes de ser translocada a los tejidos florales en desarrollo. Por tanto, en la presente invención, la L-fosfinotricina que produce los efectos de esterilidad selectiva de tejido en las líneas parentales, se genera sólo transitoria y localmente de D-fosfinotricina no fitotóxica móvil a través del floema, vía D-aminoácido oxidasa. Asociando exactamente los elementos de control florales que dirigen la expresión de PAT con aquellos elementos que dirigen la expresión de la D-aminoácido oxidasa en el par complementario de construcciones (ejemplo 6), se asegura que, en el híbrido de F1, la explosión transitoria de L-fosfinotricina en el tejido floral diana sea rápidamente neutralizada por una explosión correspondiente de la expresión de PAT al mismo tiempo y en el mismo tejido local. Por tanto, la aplicación del herbicida no induce efecto de esterilidad en el híbrido. Sin embargo, en las generaciones siguientes, el PAT y la D-aminoácido oxidasa floralmente correspondientes del híbrido, se segregarán y por tanto, una vez más, las plantas resultantes serán estériles masculinas o femeninas con la aplicación de cantidades controladoras de DL-fosfinotricina.

Usando los métodos descritos en los ejemplos 7 y 8, las construcciones descritas en el ejemplo 6 se transforman en trigo o (usando métodos de vectores superbinarios estándar) arroz, que se selecciona y regenera en plántulas. Usando métodos esencialmente como los descritos en los ejemplos 1 y 2, se seleccionan los eventos transformantes de T0 (usando propagación clonal de retoños para mantener las líneas sin tratar) y eventos adecuados para reproducir, alternativamente, líneas parentales consanguíneas masculinas que son condicionalmente estériles femeninas dependientes de la aplicación de DL-fosfinotricina, o líneas consanguíneas femeninas que son condicionalmente estériles masculinoas dependientes de la aplicación de DL-fosfinotricina. Las mejores líneas presentan la mejor tolerancia a herbicida, mínima perdida de rendimiento, el fenotipo más claro de esterilidad condicional, etc. Se seleccionan las líneas parentales alternativas masculina y femenina y, opcionalmente, se retrocruzan en líneas de élite adecuadas durante varias generaciones. Los insertos genéticos en estos eventos seleccionados finalmente están totalmente caracterizados como lo está la genética de la herencia de los rasgos de fertilidad condicional y resistencia a herbicida, y las características de los productos génicos expresados.

Las líneas parentales femenina y masculina así seleccionadas, se plantan entonces juntas de forma intercalada, en proporciones adecuadas en un terreno, y se pulverizan con DL-fosfinotricina en una tasa adecuada entre 0,05 y 5 kg/ha y a un ritmo hasta el período de floración temprana, seleccionado para optimizar la producción de semilla híbrida. La semilla así producida tiene la ventaja de que originará plantas que no se benefician sólo del vigor de los híbridos, sino que son también tolerantes a las formulaciones herbicidas que contienen DL-fosfinotricina, que pueden

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usar, por tanto para el control de las malas hierbas. La semilla híbrida tiene también la ventaja de que el rasgo de tolerancia a herbicida que expresa sólo se transmitirá de forma incompleta a las generaciones homogéneas futuras autofecundadas o exocruzadas en malas hierbas relacionadas. Por tanto, por ejemplo, el arroz híbrido resultante de esta invención se puede cultivar usando DL-fosfinotricina como sustancia de control de malas hierbas, sin pérdida significativa de rendimiento. Sin embargo, las generaciones futuras de plantas de arroz rojo que se generen como la progenie de polen procedente del exocruzamiento de arroz híbrido con progenitores femeninos de arroz rojo, serán tolerantes vegetativamente al tratamiento con DL-fosfinotricina, pero tienen autofertilidad reducida (debido a la expresión de una D-aminoácido oxidasa en el tejido floral) y, por tanto, producen poco grano. Por tanto, usando el arroz híbrido de la presente invención, se puede usar DL-fosfinotricina para el control de las malas hierbas con un riesgo futuro muy reducido de contaminación del grano con arroz rojo, como resultado de que el rasgo de resistencia a herbicida se haya exocruzado hacia el arroz rojo estrechamente relacionado. De forma similar, las plantas de regeneración natural de la segunda generación de arroz o trigo, que se generan del cultivo híbrido, no producirán grano, en su mayor parte, tras pulverización con DL-fosfinotricina.

Ejemplo 10 Comparativo. Transformación/regeneración de maíz con un polinucleótido que comprende un gen quimérico expresado preferentemente en tejido reproductivo masculino y que codifica una enzima capazde hidrolizar imazametabenz metilo o flamprop metilo o flamprop isopropilo en sus ácidos respectivos

Los casetes de expresión de RA8-carboxilesterasa-nos se clonan en una serie de vectores bluescript sk, pBLRA8_Q01470, pBLRA8_P37967 y pBLRA8_P40363 como se describe anteriormente. Opcionalmente, estos se cobombardean con ADN que comprende marcadores de selección tales como pUbiHyg o pSOG35, se seleccionan y se regeneran usando higromicina o metotrexato como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 11 del documento WO 98/39462.

Alternativamente, pZEN18_BLRA8_Q01470 se bombardea directamente o se transfiere sobre filamentos de carburo de silicio en células de maíz, y las plantas de maíz se seleccionan y se generan en glifosato, por ejemplo, como se describe en los ejemplos 12 y 13 del documento WO 00/66748.

Alternativamente, la transformación del maíz se lleva a cabo usando Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector superbinario. Por ejemplo, el casete de expresión pZEN18 y el gen quimérico BLRA8_Q01470 se cortan de pZEN18_ BLRA8_Q01470 y se clonan en posiciones entre los límites derecho e izquierdo de T-ADN de un vector superbinario derivado de pSB1 a través de una serie de subclonación y recombinación homóloga en una serie de etapas similares a las descritas en el documento WO 00/66748. El material vegetal derivado de embriones inmaduros se infecta con Agrobacterium que contiene vector superbinario que comprende el gen marcador de glifosato y el gen quimérico de la presente invención. Las plantas se seleccionan y se regeneran usando glifosato como se describe en el documento WO 00/66748.

El ADN se extrae de tejidos de hojas de plantas derivados de la transformación, y se realiza la PCR en busca de la presencia del gen marcador seleccionable y el gen que codifica carboxilesterasa. Las plantas positivas para PCR se propagan. Durante la floración, se recogen los pistilos y anteras y se prepara ARN. La expresión de ADN se confirma mediante análisis Northern. Además, los genes de carboxilesterasa se expresan usando vectores pET en E. coli y se purifican parcialmente. Las bandas proteicas de la proteína expresada se cortan de un gel de SDS y se usan para generar anticuerpos policlonales. Estos anticuerpos se usan para detectar la expresión en tejidos florales y otros tejidos mediante análisis Western.

Ejemplo 11 Comparativo. Transformación de células de maíz a un fenotipo que exhibe sensibilidad incrementada a la inhibición del crecimiento por S-Fluazifop ácido.

Las secuencias de ADN que codifican la secuencia de la proteína 2-arilpropionil-CoA epimerasa AAR49827 en la base de datos Derwent GENESEQP, o P70473 (Swissprot) comprendida en las secuencias de ADN del acceso AAQ44447 de la base de datos Derwent GENESEQN o del acceso RN2ARYLCO de EMBL, respectivamente se obtienen mediante RT-PCR o sintéticamente para optimizar la expresión en tejidos vegetales. Las secuencias flanqueantes del cebador de PCR o de ADN sintéticas se diseñan para situar sitios de restricción único útiles para la clonación. Preferiblemente, y en el caso en el que la secuencia codificante de epimerasa no contenga sitios internos confusos, se coloca un sitio Nco1 o Nde1 en el extremo 5’ para facilitar la clonación de fusiones dentro del marco de lectura con secuencias añadidas 5’ al ORF. Alternativamente, cuando los sitios de restricción se colocan en dirección 5’ del sitio de inicio de la traducción ATG, se diseñan secuencias intervinientes para que estén de acuerdo con secuencias consenso de traducción de plantas según Kozak.

Las secuencias de ADN que codifican la secuencia proteica de acil CoA sintetasas “de cadena larga” P18163 o P39518 (Swissprot) comprendidas en las secuencias de ADN de los accesos J05439 o X77783 de EMBL, respectivamente se obtienen mediante RT-PCR o sintéticamente. Las secuencias flanqueantes del cebador de PCR

o de ADN sintéticas se diseñan para situar sitios de restricción único útiles para la clonación. Preferiblemente, y en el caso en el que la secuencia codificante de epimerasa no contenga sitios internos confusos, se coloca un sitio Nco1 o Nde1 en el extremo 5’ para facilitar la clonación de fusiones dentro del marco de lectura con secuencias añadidas 5’ al ORF. Alternativamente, cuando los sitios de restricción se colocan en dirección 5’ del sitio de inicio de la traducción ATG, se diseñan secuencias intervinientes para que estén de acuerdo con secuencias consenso de

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traducción de plantas según Kozak.

Similar a los Ejemplos 1 y 2, las secuencias codificantes anteriores se clonan inicialmente en pUC19 o en bluescript sk. Las secuencias codificantes se cortan entonces con enzimas de restricción adecuadas, preferiblemente usando un sitio Nco1 en el extremo 5’ de la secuencia codificante, en pMJB1, para crear casetes de expresión de fusión en el marco alternativos, que comprenden en una dirección 5’ a 3’, el promotor de CaMV35S, el potenciador traduccional TMV, la secuencia codificante de acil CoA sintetasa o epimerasa-terminador nos. pMJB1 es un plásmido derivado de pUC19 que contiene un promotor de CaMV35S potenciado doble operable vegetal; un potenciador de TMV omega y una secuencia de terminador nos. En la Figura 2 del documento WO 98/20144 se da una representación esquemática de pMJB1.

De este modo se crea una serie de derivados de pMJB1, pMJ35S_ AAR49827 etc. y pMJ35S_ P18163 etc. que comprenden casetes de expresión alternativos de epimerasa y acil CoA sintetasa, respectivamente. Usando técnicas estándar, estos se clonan opcionalmente además en vectores tales como pUbiHyg que comprenden genes marcadores seleccionables vegetales.

Alternativamente, dos construcciones, una para la expresión de acil CoA sintetasas de “cadena larga” y la otra para la expresión de 2-arilpropionil-CoA epimerasa, se construyen según los diseños esquemáticos de Fig. 3A y Fig. 3B. En 3A, la construcción de ADN comprende, en la dirección 5’ a 3’, una región del promotor de poliubiquitina de maíz (EMBL: ZM29159), la secuencia de ADN que codifica acil-CoA sintetasa (EMBL: J05439), una región del terminador nos, una región del promotor de CMV 35S, una región que codifica una secuencia líder no traducida en 5’ que comprende el intrón de ADH de maíz, una secuencia de ADN que codifica fosfinotricina acetil transferasa, y un terminador nos. Como siempre, esta construcción de ADN completa se clona en un sitio adecuado en un vector (por ejemplo un derivado de pUC) que comprende un origen de replicación de E. coli y un gen de resistencia a ampicilina. La construcción 3B es la misma, excepto que la secuencia de ADN que codifica acil-CoA sintetasa se sustituye por una secuencia de ADN que codifica 2-arilpropionil-CoA epimerasa (EMBL: Y08172).

Estos vectores, individualmente o en combinación, se transforman en cultivo de células vegetales de maíz usando filamentos. Por ejemplo, suspensiones celulares de células BMS se transforman poniendo en contacto células con filamentos de carburo de silicio revestidos con ADN usando métodos esencialmente como se describe por Frame et al (1994), Plant J., 6, 941-948. El callo transformado así generado se selecciona en base al crecimiento diferencial en medio que contiene un intervalo de concentraciones de agente de selección que, dependiendo del ADN usado para la transformación, puede ser, por ejemplo, glifosato, higromicina, L-fosfinotricina o kanamicina. En el caso de las construcciones representadas en las Figuras 3A y 3B, la selección se lleva a cabo en DL fosfinotricina o un derivado de la misma. Las líneas transformadas de forma estable se seleccionan como callo, que se propaga y continúa creciendo en agente de selección.

Por ejemplo, tras la transformación usando filamentos de carburo de silicio, las células se hacen crecer en medio MS suplementado con 1 mg/l de Bialaphos. Después de 2 semanas, las células se transfieren a medio a base de MS suplementado con 5 mg/l de Bialaphos, donde permanecen durante 6-8 semanas. Los callos resistentes se forman y se transfieren a medio MS suplementado con 2 mg/l de Bialaphos. Los callos transformados de forma estable se transfieren a un medio a base de MS líquido, en el que se dejan crecer durante 2 semanas. Después de este período, las células se peletizan y se resuspenden en una dilución 1:10 de medio. Entonces se distribuyen uniformemente en una placa de ensayo de 6 pocillos y se exponen a 2,5 ppm y 10 ppm del R o S fluazifop. Después de 4 días en presencia de R o S fluazifop, se eliminan de los pocillos 0,1 ml del volumen sedimentado de células, se lava con medio MS líquido reciente y se colocan en placa sobre medio sólido a base de MS. La capacidad de las células para crecer y dividirse de forma activa se puntuó después de 7 días.

Las líneas transformadas se comparan con líneas sin transformar con respecto de la sensibilidad a S-fluazifop, Sfluazifop butilo o S-ariloxifenoxipropionatos similares y derivados. Las secuencias codificantes de ADN que codifican enzimas preferibles para uso en el método de la invención se seleccionan de aquellas secuencias que, cuando se expresan en células BMS, codifican una enzima o combinación de enzimas para transformar el fenotipo de las células de maíz transformadas desde solamente sensibles a la inhibición del crecimiento por concentraciones relativamente elevadas de S-fluazifop o S-fluazifop butilo a ser sensibles a concentraciones mucho más bajas (al menos 2-3 veces).

Las secuencias codificantes de ADN así seleccionadas se usan entonces, como se describe en los otros ejemplos, para crear líneas de plantas de trigo que son estériles masculinas o femeninas dependiendo de la aplicación exógena de S-fluazifop o ésteres de S-fluazifop.

Ejemplo 12. Mutagénesis dirigida al sitio para generar genes que codifican D-aminoácido oxidasas que oxidan D-fosfinotricina.

Este ejemplo se refiere a la producción de genes que codifican variantes de D-aminoácido oxidasa de R. gracilis que tienen una capacidad mejorada para oxidar D-fosfinotricina. Estos genes se usan en realizaciones preferidas de la invención, descritas en los otros ejemplos, en las que la esterilidad se hace condicional tras la aplicación de Dfosfinotricina. En el presente ejemplo, estos genes codifican enzimas que tienen un único cambio de aminoácido en

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la posición “213” y/o en la posición “238”. La metionina en posición “213” se identifica como M en el motivo de la secuencia de la proteína nativa RCTMDSS. La tirosina en posición 238 se identifica como la “Y” en el motivo de la secuencia de la proteína nativa GGTYGVG. Hay muchos enfoques conocidos en la técnica para proporcionar una serie de genes que codifican una serie de variantes de D-aminoácido oxidasa con cambios de aminoácido en una o ambas de estas posiciones. La elección del molde de ADN para la mutagénesis depende también del uso. Así, por ejemplo, cuando el uso al que se destina el gen mutante es para expresión en plantas, entonces un punto de partida adecuado es un ADN sintético que codifica una D-aminoácido oxidasa de R. gracilis, como SEC ID NO 7. Por otra parte, cuando el uso inmediato al que se destina el gen mutante es para rondas posteriores de mutagénesis y mejora en un sistema de selección basado en levaduras (como en el ejemplo 13), entonces la secuencia de ADN nativa (opcionalmente mejorada para expresión en S. cerevisiae) es más adecuada.

Un método preferido para proporcionar variantes adecuadas de D-aminoácido oxidasa de R. gracilis es a través del uso de oligonucleótidos degenerados, usando el kit de mutagénesis Quickchange de Stratagene. Los métodos se usan según las instrucciones del fabricante.

Por ejemplo, (en el caso en el que la secuencia de ADN nativa de R. gracilis que codifica D-aminoácido oxidasa sea el ADN molde para mutagénesis), parejas de oligonucleótidos degenerados “inicial” (RGMUTTOP) y “final” (RGMUTBOT) pueden tener de forma adecuada 50-250 nucleótidos de longitud y estar diseñadas para comprender en su seno, regiones de secuencia como sigue:

RGMUTTOP comprende en él una secuencia (SEC ID NO 8)

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RGMUTBOT comprende en él una secuencia (SEC ID NO 9)

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Además, estos dos oligonucleótidos RGMUTTOP y RGMUTBOT comprenden en cada extremo secuencias que, una vez que los dos oligonucleótidos están hibridados entre sí, constituyen extremos 5’ y 3’ que se corresponderán exactamente con los extremos creados cuando el ADN molde se corta en un par adecuado de sitios de restricción únicos (es decir, diseñados de forma que los oligonucleótidos hibridados pueden reemplazar un fragmento de restricción único cortado del ADN molde que codifica la D-aminoácido oxidasa).

Se transfieren 0,5 a 1,0 ug de cada oligonucleótido a un tubo de centrífuga de Eppendorf de 0,5 ml y se calienta a una temperatura adecuada (por ejemplo, 94ºC, dependiendo de los puntos de fusión calculados), durante 5 minutos, y se hibrida lentamente enfriando hasta temperatura ambiente. El ADN molde (por ejemplo el vector lanzadera de levadura pYES6/CT) se corta entonces con dos enzimas de restricción (según los dos únicos sitios de restricción en el ADN molde que abarcan la región que incluye los dos codones a reemplazar y que caracterizan los extremos del ADN hibridado), se purifica en gel, se liga con el oligonucleótido hibridado y se transforma en levadura como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 13, de forma que las D-aminoácido oxidasas alternativas, creadas por mutagénesis, se expresan en levadura. Luego, según se describe, se seleccionan los clones de levadura que producen el mejor rendimiento en análogos de D-fosfinotricina (como ácido D-homocistéico) o en D-fosfinotricina (cuando se coexpresa el gen PAT) como única fuente de nitrógeno, como aquéllos que contienen las secuencias que codifican D-aminoácido oxidasa variantes con las propiedades deseadas. Alternativamente, la expresión de Daminoácido oxidasa se realiza en algún microorganismo distinto de levadura y, por ejemplo, bajo el control de expresión del promotor t7 de un vector pET en un lisógeno de E. coli. En este caso, tras la transformación, se pueden recoger colonias individuales, sembrar réplicas en placa, cultivar, inducir, lisar y seleccionar para la actividad de sustrato deseada frente a D-fosfinotricina, usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, una selección fluorimétrica para generación de peróxido o un ensayo colorimétrico para generación de amoníaco). Los clones de levadura u otros microorganismos así seleccionados se cultivan, se prepara ADN y se clona la secuencia de ADN completa de D-aminoácido oxidasa vía PCR de corrección y clonación en pCRBluntII, usando el kit Zero Blunt TOPO de Invitrogen. Se determinan las secuencias codificantes de D-aminoácido oxidasa que caracterizan los clones seleccionados. Estas secuencias codificantes de D-aminoácido oxidasa se subclonan nuevamente para expresión en un vector pET (por ejemplo Novagen pET 24a), y se transforman en E. coli BL21 DE3. Las células se hacen crecer en un fermentador en medio LCM50 que contiene 100 ug/ml de kanamicina, se inducen con IPTG, se recogen, se rompen y el extracto se purifica parcialmente y se ensaya para actividad D-aminoácido oxidasa (según se detalla más adelante). Se seleccionan genes de D-aminoácido oxidasa que codifican enzimas D-aminoácido oxidasas que producen una estabilidad aceptable y la actividad más elevada (kcat/Km) por mg de proteína pura frente a D-fosfinotricina a pH 7,0.

Adicionalmente, se genera una serie de secuencias de ADN particulares, que codifican enzimas D-aminoácido oxidasa particularmente dirigidas a diana. En particular, genes que codifican D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula

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gracilis con una arginina, serina, cisteína, lisina, asparagina o alanina que sustituye a la metionina en posición 213 y/o una histidina, serina, cisteína, asparagina o alanina que sustituye a la tirosina en posición 238. Los métodos usados son los mismos que los descritos anteriormente, excepto porque, más que una mezcla de oligonucleótidos, se diseñan pares individuales de oligonucleótidos, y se usan para efectuar cada cambio sencillo o doble de aminoácidos. Cada secuencia codificante de D-aminoácido oxidasa mutante resultante se clona para expresión (no etiquetada) detrás del promotor T7 en pET 24A de Novagen, y se transforman en E. coli BL21 DE3. Las células se hacen crecer en un fermentador de 1,0 l, en medio LCM50 complementado con 100 ug/ml de kanamicina, se inducen para expresión con IPTG 1 mM y se recogen mediante centrifugación a baja velocidad.

El medio LCM50 contiene (en 1 litro) KH2PO4 (3 g), Na2HPO4 (6 g), NaCl (0,5 g), hidrolizado de caseína (Oxoid) (2 g), (NH4)2SO4 (10 g), extracto de levadura (Difco (10 g), glicerol (35 g) (estos ingredientes se obtienen en disolución y se esterilizan en autoclave). Los siguientes ingredientes adicionales se esterilizan por filtración en forma de disoluciones y se añaden a los medios: MgSO4 (2,5 ml de disolución 246,5 mg/ml), tiamina.HCl (1 ml de disolución 8 mg/ml); CaCl2.2H2O (0,2 ml de disolución 147 g/l); *FeSO4.7H2O/ácido cítrico madre (2 ml);

** disolución de oligoelementos (5 ml), y se completa hasta 1 litro.

*FeSO4.7H2O/ácido cítrico madre por 100 ml consiste en FeSO4.7H2O (0,415 mg), ácido cítrico (0,202 mg).

** La composición de la disolución de oligoelementos por 1 ml es AlCl3.6 H2O (20 mg), CoCl2.6 H2O (8 mg), KCo(SO4)2.12 H2O (2 mg), CuCl2.H2O (2 mg), H3BO3 (1 mg), KI (20 mg), MnSO4.H2O (0,8 mg), Na2MoO4.2H2O (4 mg), ZnSO4.7H2O (4 mg).

Se lavan en agua aproximadamente 7 g de peso húmedo de células. Las células se vuelven a suspender en un volumen igual de tampón KOH/Mops 50 mM a pH 7,0, que contiene EDTA 2 mM, DTT 2 mM y FAD 0,01 mM. Las células se ponen en suspensión uniformemente usando un homogeneizador de vidrio y luego se disgregan usando una cabeza golpeadora del disgregador Basic Z cell de Constant Systems (BudBrooke Rd., Warwick, U.K.), a 93.079 KPa (13500 psi). El extracto bruto se mantiene frío (~ 4ºC), se centrifuga a 30.000 gav durante 1 h y se desecha el pelete. Algo de la proteína extraída se corre sobre un gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie y, mediante comparación lado a lado con extractos de células preparados de forma similar que contienen sólo vector pET “vacío” se estima que 2-50% de la proteína soluble total en el extracto es D-aminoácido oxidasa. Algo de la proteína extraída se intercambia en tampón Mops/KOH 50 mM a pH 7,0 que contiene FAD 0,01 mM. Ésta se diluye con el mismo tampón en una celda de electrodo de oxígeno estándar (calibrada a 25ºC entre cero y una concentración de oxígeno saturada). Opcionalmente, la D-aminoácido oxidasa se purifica nuevamente usando intercambio de iones, fenil-sefarosa, precipitación fraccionada en sulfato amónico y filtración en gel. Los ensayos, a 25ºC, se inician mediante adición de una disolución 200 mM de la sal de amonio de DL-fosfinotricina a la enzima diluida. El volumen de reacción final en la celda del electrodo de oxígeno es 2 ml. Se miden las velocidades de consumo de oxígeno (tras eliminación de cualquier deriva en la línea de bases). La forma mutante M213R (sustitución de arginina por metionina) de la D-aminoácido oxidasa de R. gracilis oxida la DL-fosfinotricina a una tasa de ~14 nmoles/min/mg de proteína del extracto bruto (siendo la pureza estimada de la D-aminoácido oxidasa en el extracto de 35 +/-15% de la proteína total). La forma mutante M213S (sustitución de arginina por metionina) de la D-aminoácido oxidasa de R. gracilis oxida la DL-fosfinotricina a una tasa de ~4 nmoles/min/mg de proteína del extracto bruto (siendo la pureza estimada de la D-aminoácido oxidasa en el extracto de 35 +/-15% de la proteína total). En experimentos de control, la forma L pura no se oxida nada y, dependiendo de la concentración, la forma D pura se oxida hasta dos veces la velocidad en que se oxida la forma DL. Bajo condiciones similares, la D-aminoácido oxidasa de R. gracilis nativa (sin mutar), no presenta ninguna capacidad significativa (<0,4 nmoles/min/mg) de oxidar DL-o D-fosfinotricina.

Ejemplo 13. Mutación y selección para generar genes de D-aminoácido oxidasa que codifican enzimas con especificidad mejorada (kcat/Km) para la oxidación de D-fosfinotricina.

La secuencia que codifica D-aminoácido oxidasa nativa de Rhodotorula gracilis se clona en el vector lanzadera pYES6/CT de Invitrogen, como un fragmentos HindIII/PmeI, en dirección 3’ del promotor GAL1. De forma similar, la secuencia que codifica la D-aminácido oxidasa nativa de Rhodotorula, se clona en el vector lanzadera de expresión de proteína pAUR123 (Panvera) como un fragmento XhaI, en dirección 3’ del promotor constitutivo ADH1. La construcción de estos vectores se realiza en E. coli, seguida de transformación en Saccharomyces cerevisiae S288C. Cuando sea apropiado, el gen PAT se usa para reemplazar los genes de resistencia a antibióticos blasticidina o aureobasidina en los vectores pYES6/CT/pAUR123, respectivamente, y la DL-fosfinotricina en vez del antibiótico usado para mantener la selección. Además, las secuencias que codifican los genes M213R o M213S, o las formas mutantes M213S, Y238S de D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula se clonan en lugar de la secuencia que codifica la forma salvaje.

Se crean variantes mutantes adicionales de D-aminoácido oxidasa, usando varios métodos de mutagénesis. Por ejemplo, se generan múltiples variantes de la secuencia que codifica D-aminoácido oxidasa, mediante PCR envenenada con Mn2+, la población mixta se clona frente a los promotores GAL1 o ADH1 de los dos vectores lanzadera, se transforma en levadura y se realiza la selección basada en la capacidad de la nueva secuencia para conferir a la levadura la capacidad de crecer en ácido D-homocistéico como única fuente de nitrógeno. Alternativamente, la mutación y selección se realiza directamente sobre la levadura transformada. Por ejemplo, se

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