ES2536907T3

ES2536907T3 - Métodos para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular

Info

Publication number: ES2536907T3
Application number: ES12179595.9T
Authority: ES
Inventors: Xin Wei Wang; Junfang Ji; Taro Yamashita; Carlo M. Croce
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Ohio State University Research Foundation
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Ohio State University Research Foundation
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2008-06-09
Publication date: 2015-05-29
Anticipated expiration: 2028-06-09
Also published as: EP2559773A1; US20140018409A1; WO2008153987A3; ES2527648T3; JP5690588B2; US8465917B2; EP2152900A4; EP2152900A2; EP2559773B1; JP2010528659A; AU2008262252B2; EP2559772A1; CA2690144A1; US20100197770A1; AU2008262252A1; CN103602724A; EP2152900B1; CN101711287A; CN105950706A; CN101711287B

Abstract

Un método para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular (CHC) en un sujeto, que comprende: a) obtener una muestra de tejido hepático de un sujeto que tiene un subtipo de CHC, seleccionado de uno o más de: carcinoma hepatocelular del tipo epitelio del conducto biliar (BDE-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo células madre hepáticas (HSC-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC); y, carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC); b) llevar a cabo un análisis de laboratorio de la muestra para determinar la expresión de uno o más de los biomarcadores de la familia de biomarcadores miR-181 en la muestra, c) correlacionar la expresión de uno o más biomarcadores de la familia de miR-181 en la muestra con el subtipo de CHC en el sujeto, y d) determinar el subtipo del CHC en la muestra a partir de la correlación, en donde; i) la sobreexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo epitelio de conducto biliar (BDE-CHC); ii) la sobreexpresión de uno o más de miR-181b-1 y miR-181b-2, y la ausencia o infraexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de células madre hepáticas (HSC-CHC); iii) la infraexpresión de uno o más de miR-181a-2, miR-181b-1 y miR-181b-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, y la ausencia de sobreexpresión e infraexpresión de miR-181a1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC); y iv) la infraexpresión de miR-181a-1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC).

Description

Métodos para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular

5 Antecedentes de la invención

El carcinoma hepatocelular (CHC) es la tercera causa más importante de muerte por cáncer alrededor del mundo. El CHC es muy heterogéneo en términos de su presentación clínica y patrones genómicos y transcriptómicos. La heterogeneidad en CHC y la falta de biomarcadores apropiados para su detección e identificación de subtipo han obstaculizado el pronóstico de los pacientes y la estratificación del tratamiento.

Por consiguiente, existe un deseo de uno o más biomarcadores que puedan identificar el subtipo de CHC en un mamífero, así como de métodos para proporcionar un tratamiento apropiado basándose en el subtipo de CHC. MURAKAMI Y et al: "Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non

15 tumorous tissues", Oncogene, nature Publishing group, RU Vol. 25, Nº. 17, 1 de Abril de 2006, páginas 2537-2545 se refiere a la identificación de marcadores biológicos para una "mejor detección del CHC" En este estudio se examinaron las expresiones de los miARN en especímenes de CHC en comparación con los especímenes no tumorales adyacentes, y se descubrieron 30 genes de miARN que se expresaron de forma significativamente diferencial en el CHC y los tejidos no tumorales correspondientes.

Breve sumario de la invención

La presente divulgación proporciona un método para determinar el subtipo de CHC en el sujeto, comprendiendo el método a) obtener una muestra del sujeto, b) ensayar la muestra para detectar al menos 1 biomarcador y c) 25 correlacionar los biomarcadores detectados con un subtipo de CHC en el sujeto. A este respecto, los biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-39.

La presente divulgación también proporciona un método de detección de una célula madre de CHC en una muestra. En una realización el método de la invención comprende a) obtener una muestra, b) ensayar la muestra para detectar la presencia de un biomarcador mir-181, y c) correlacionar la presencia o ausencia del biomarcador mir-181 con la presencia o ausencia de la célula madre de CHC en la muestra.

La presente divulgación también proporciona métodos y composiciones para tratar a sujetos con CHC que aprovechan los biomarcadores asociados con células madre de CHC. 35

Breve descripción de las distintas vistas de las figuras

La Figura 1A muestra la expresión de mir-181a1 en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC-CHC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1B muestra la expresión de mir-181a2 en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células de HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1C muestra la expresión de mir-181b1 en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1D muestra la expresión de mir-181b2 en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral)

45 en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1E muestra la expresión de mir-181c en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-HCC basándose en el análisis de micro ARN. La Figura 1F muestra la expresión de mir-181a en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-HCC como se determina por RT-PCR. La Figura 1G muestra la expresión de mir-181b en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC como se determina por RT-PCR. La Figura 1H muestra la expresión de mir-181c en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 1I muestra la expresión de mir-181d en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en

55 células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 1J muestra la expresión de mir-213 en una relación log(2) (de tejido tumoral respecto a no tumoral) en células HSC, DBE, HP, y MH-CHC tal como se determina por RT-PCR. La Figura 2A muestra una gráfica de dispersión de mir-181a1. La Figura 2B muestra una gráfica de dispersión de mir-181a2. La Figura 2C muestra una gráfica de dispersión de mir-181b1. La Figura 2D muestra una gráfica de dispersión de mir-181b2. La Figura 2E muestra una gráfica de dispersión de mir-181 c. La Figura 3A una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular.

65 La Figura 3B es una gráfica que muestra la multiplicidad de CAR y UGT2B7 a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular.

La Figura 3C es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CCND1 y TACSTD1 a 0, 2 y 8 días en medio ESC frente a cultivo regular. La Figura 3D es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir181d a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC.

5 La Figura 3E es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CAR y UGT2B7 a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC. La Figura 3F es una gráfica que muestra la multiplicidad de producción de CCND1 y TCSTD1 a 0, 1, 2 y 8 días después de la retirada del medio ESC. La Figura 4 es una gráfica de la expresión relativa de mir-181b en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 5 es una gráfica de la expresión relativa de mir-181s en células HuH7 transfectadas con antisentido 2’O-metil frente a control. La Figura 6A es una gráfica de la expresión relativa de CCND1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1.

15 La Figura 6B es una gráfica de la expresión relativa de TACTD1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 6C es una gráfica de la expresión relativa de DKK1 en células HuH1 tratadas con pMSCV-hTR y pMSCV-mir-181b1. La Figura 6D es una gráfica de la expresión relativa de CCND1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 6E es una gráfica de la expresión relativa de TACSTD1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 6F es una gráfica de la expresión relativa de DKK1 en células HuH7 tratadas con control y antisentido. La Figura 7A muestra los sitios de unión predichos de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d al 3’-UTR 611

25 632 de DKK1. La Figura 7B muestra los sitios de unión predichos de mir-181a, mir-181b, mir-181c y mir-181d al 3’-UTR 771799 de DKK1. La Figura 8A es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181a1 y mir-181b1. La Figura 8B es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181a2 y mir-181b2. La Figura 8C es un sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181c y mir-181d. La Figura 8D es otro sitio de unión predicho a TCF-4 para mir-181c y mir-181d La Figura 9 es una gráfica de la multiplicidad de mir-181a, mir-181b, mir-181c, y mir-181d en cada línea celular (Hep3b tipo B (HSC-CHC), MHCC97 tipo C (HP-CHC), Smmc7721 tipo D (MH-CHC)) frente a hepatocitos primarios.

35 La Figura 10 es una gráfica del número de miARN con expresión aumentada y disminuida en los subtipos HSC-CHC, BDE-CHC, HP-CHC y MH-CHC.

Descripción detallada de la invención

Los micro ARN (o miARN) son productos génicos de ARN pequeños no codificantes (por ejemplo, ∼22 nt) que existen en numerosos organismos y desempeñan papeles reguladores importantes en la traducción del ARNm y la degradación mediante la formación de pares de bases con sitios parcialmente complementarios del ARNm, predominantemente en la región 3’ no traducida. Lee, Science, 294(5543):862-864 (2001); Lau, Science, 294(5543):858-862 (2001); Lagos, Science, 294(5543):853-858 (2001). Los miARN se expresan como precursores

45 de ARN largos que se procesan por Drosha, una nucleasa celular, y posteriormente se transportan al citoplasma por un mecanismo dependiente de Exportina 5. Yi, Genes Dev, 17(24):3011-3016 (2003); Gregory, Cancer Res., 65(9):3509-3512 (2005). Después, la enzima DICER escinde los miARN, dando como resultado miARN de aproximadamente 17-24 nt que se asocian con un complejo de tipo silenciamiento inducido por ARN. Lee, EMBO J, 21(17):4663-4670 (2002); Hutvagner, Science, 297(5589):2056-2060 (2002).

El estudio se basa en el hallazgo de que los biomarcadores de miARN se asocian con subtipos de CHC. Para los fines de la invención, los subtipos de CHC de la invención se refieren a CHC de tipo células madre hepáticas (HSC-CHC), que son moléculas de adhesión a células epiteliales (EpCAM)+ alfa-fetoproteína (AFP)+; CHC de tipo epitelio de conducto biliar (BDE-CHC), que es EpCAM+ AFP-; CHC de tipo progenitores de hepatocitos (HP-CHC), que es

55 EpCAM-AFP+; y CHC de tipo hepatocitos maduros (MH-CHC), que es EpCAM-AFP-. La invención proporciona un conjunto de biomarcadores útiles para identificar cada subtipo de CHC.

En una realización, la presente divulgación proporciona un método para determinar el subtipo de CHC en un sujeto que comprende a) obtener una muestra del sujeto, b) analizar la muestra para la expresión de 1 o más biomarcadores, y c) correlacionar la expresión del uno o más biomarcadores con el subtipo de CHC en el sujeto. La expresión de los biomarcadores puede estar disminuida o aumentada respecto al control normal. Los biomarcadores se identifican por las SEC ID Nº: 1-39 (véase la Tabla 1). En el método inventivo, es preferente que se analicen 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, o 35 o más biomarcadores. Más preferentemente, se analizan los 39 biomarcadores. Para la determinación del subtipo HSC-CHC, preferentemente 65 se analizan al menos los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-19. Para la determinación del subtipo BDE-CHC, preferentemente se analizan al menos los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 2, 9-17, y 19

35. Para la determinación del subtipo HP-CHC, preferentemente se analizan al menos los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-8, 11-13, 17-18, 23, 28-29 y 33-39. Para la determinación del subtipo MH-CHC, preferentemente se analizan al menos los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1, 8-12, 14-17 y 19-39.

5 Además, se ha descubierto que a diferencia de las células hepáticas maduras, las células madre de CHC se asocian con (es decir, expresan) biomarcadores de miARN de la familia mir-181, particularmente mir-181a1, mir-181a2, mir181b1, mir-181b2 y mir-181c, y que la presencia de células madre de CHC en una muestra es indicativa del subtipo HSC-CHC, que se asocia con mal pronóstico. Por consiguiente, en una realización, la presente divulgación proporciona un método para detectar la presencia de células madre de CHC en una muestra que comprende a) obtener una muestra, b) ensayar la muestra para detectar la presencia de un biomarcador mir-181, y c) correlacionar la presencia o ausencia del biomarcador mir-181 con la presencia o ausencia de la célula madre de CHC en la muestra. Por ejemplo, como alternativa, las células madre de CHC EpCAM+AFP+ se pueden detectar por cualquier método adecuado, por ejemplo, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, separación celular activada por congelación, métodos de población lateral, métodos de detección de los marcadores de superficie celular o

15 hibridación in situ. Por ejemplo, en la técnica de población lateral, se carga el colorante de unión a ADN permeable para células Hoechst 33342 dentro de la población celular de interés; las células madre y progenitores tempranos posteriormente bombean al exterior este colorante por medio de un mecanismo dependiente de la bomba de membrana del casete de unión a ATP, dando como resultado una “cola” de baja fluorescencia cuando las células se analizan por citometría de flujo. En una realización, el método además comprende correlacionar la presencia de la célula madre de CHC en la muestra con la presencia del subtipo HSC-CHC en la muestra. Ventajosamente, la detección de células madre de CHC en una muestra puede permitir la detección más temprana del subtipo HSC-CHC en un sujeto y por lo tanto conduce a una mayor probabilidad de éxito en el tratamiento y supervivencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término "biomarcadores" se usa indistintamente con "miARN" y se

25 refiere a los marcadores asociados con CHC, que incluyen los al menos 39 biomarcadores de la Tabla 1. En el método de la invención, se pueden detectar algunos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o 35) o los 39 biomarcadores. Preferentemente, se detectan al menos 2 o más, más preferentemente al menos 5 o más biomarcadores. En realizaciones donde se detecta el biomarcador mir-181, el biomarcador puede ser uno o más de mir-181a1, mir-181a2, mir-181b1, mir-181b2 y mir-181c, preferentemente. A este respecto, se detectan algunos (es decir, 1, 2, 3 o 4) o los 5 biomarcadores mir-181.

Las técnicas adecuadas para determinar la presencia y el nivel de expresión de los biomarcadores en las muestras se encuentran dentro de la experiencia de la técnica. De acuerdo con uno de dichos métodos, el ARN celular total se puede purificar a partir de las células por homogenización en presencia de un tampón de extracción de ácidos

35 nucleicos, seguida de la centrifugación. Los ácidos nucleicos se precipitan, y el ADN se elimina por tratamiento con DNAsa y precipitación. Las moléculas de ARN se separan después por electroforesis en gel en geles de agarosa de acuerdo con las técnicas convencionales, y se transfieren a filtros de nitrocelulosa, por ejemplo, por la técnica denominada transferencia de “Northern”. Después se inmoviliza el ARN en los filtros mediante calentamiento. La detección y cuantificación del ARN específico se lleva a cabo usando sondas apropiadamente marcadas de ADN o ARN complementarias al ARN en cuestión. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulo 7.

Los métodos para la preparación de las sondas de ADN y ARN marcadas, y las condiciones de hibridación de las mismas con las secuencias de nucleótidos diana, se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J.

45 Sambrook et al., eds., 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Capítulos 10 y 11. Por ejemplo, la sonda de ácido nucleico se puede marcar con, por ejemplo, un radionúclido tal como 3H, 12P, 33P, 14C o 35S; un metal pesado; o un ligando capaz de funcionar como un miembro de un par de unión específico para un ligando marcado (por ejemplo, biotina, avidina o un anticuerpo), una molécula fluorescente, una molécula quimioluminiscente, una enzima o similares.

La sondas se pueden marcar para una actividad específica alta bien por el método de traslación de muesca de Rigby et al, J. Mol. Biol., 113:237-251(1977) o bien por el método de cebado aleatorio de Fienberg, Anal. Biochem., 132:613 (1983). El último puede ser un método para sintetizar sondas marcadas con 32P de actividad específica alta a partir de moldes de ARN. Por ejemplo, reemplazando nucleótidos ya existentes con nucleótidos altamente

55 radiactivos de acuerdo con el método de traslación de muesca, es posible preparar sondas de ácidos nucleicos marcadas con 32P con una actividad específica muy por encima de 108 cpm/microgramo. La detección autorradiográfica de la hibridación se puede realizar después exponiendo los filtros hibridados a una película fotográfica. El escaneo densitométrico de las películas fotográficas expuestas a los filtros hibridados proporciona una medida exacta de los niveles de biomarcador. Usando otro enfoque, los niveles de biomarcador se pueden cuantificar por sistemas de imagen computarizada, tales como el capturador de fosfo-imagen de dinámica molecular 400-B 2D (Amersham Biosciences, Piscataway. N.Y).

Cuando el marcaje con radionúclido de sondas ADN o ARN no es práctico, se puede usar el método de cebado aleatorio para incorporar un análogo, por ejemplo, el análogo de dTTP 5-(N-(N-biotinil-épsilon-aminocaproil)-365 aminoalil)desoxi-uridina trifosfato, en la molécula de la sonda. La sonda oligonucleotídica biotinilada se puede detectar por reacción con proteínas de unión a biotina, tales como avidina, estreptavidina y anticuerpos (por ejemplo,

anticuerpos anti-biotina) acoplados a colorantes fluorescentes o enzimas que producen reacciones de color.

Además del Northern y otras técnicas de hibridación de transferencias de ARN, la determinación de los niveles de expresión de ARN se puede llevar a cabo usando la técnica de hibridación in situ. Esta técnica requiere menos

5 células que la técnica de transferencia de Northern, e involucra la deposición de células completas en un cubreobjetos de microscopía y la exploración del contenido en ácidos nucleicos de la célula con una solución que contenga sondas de ácidos nucleicos radiactivos o marcados de otro modo (por ejemplo, ADNc o ARN). Esta técnica se adapta particularmente bien al análisis de muestras de biopsias de tejidos de sujetos. La práctica de la técnica de hibridación in situ se EE.UU. Nº 5.427.916.

El número relativo de ARN-pi en una muestra también puede determinarse por retrotranscripción, seguida de la amplificación de los transcritos de la retrotranscripción por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Los niveles de transcritos de ARN se pueden cuantificar en comparación con un patrón interno, por ejemplo, el nivel de ARNm de un gen convencional presente en la misma muestra. Un gen adecuado para el uso como un patrón interno

15 incluye, por ejemplo, miosina o gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH). Los métodos para la RT-PCR cuantitativa y las variaciones de los mismos están dentro de la experiencia de la técnica.

En algunos casos, se desearía determinar simultáneamente el nivel de expresión de varios genes biomarcadores distintos en una muestra. En ciertos casos, se desearía determinar el nivel de expresión de los transcritos de todos los genes biomarcadores conocidos correlacionados con CHC. La evaluación de los niveles de expresión específicos de cáncer para cientos de genes biomarcadores es lenta y requiere una gran cantidad de ARN total (al menos 20 mg para cada transferencia de Northern) y técnicas autorradiográficas que requieren isótopos radiactivos. Para superar estas limitaciones, se puede construir una biblioteca de oligos en formato de microplaca que contenga un conjunto de sondas oligonucleotídicas específicas para un conjunto de genes biomarcadores. Por ejemplo, la biblioteca de

25 oligos puede contener sondas que corresponden a todos los biomarcadores conocidos del genoma humano. La biblioteca de oligos de microplaca puede expandirse para incluir miARN adicionales a medida que se descubran.

La microplaca se prepara a partir de sondas oligonucleotídicas específicas de genes generadas a partir de miARN conocidos. Por ejemplo, la matriz puede contener dos sondas oligonucleotídicas distintas para cada miARN, una que contiene la secuencia activa y otra que es específica para el precursor de miARN. La matriz también puede contener controles tales como una o más secuencias murinas que difieren de los ortólogos humanos en solamente unas pocas bases, que pueden servir como controles de la rigurosidad de las condiciones de hibridación. También se pueden imprimir en la microplaca ARNt de ambas especies, proporcionando un control positivo interno, relativamente estable para hibridación específica. También se pueden incluir en la microplaca uno o más controles

35 apropiados para hibridación no específica. Para este fin, las secuencias se seleccionan basándose en la ausencia de cualquier homología con cualquier miARN conocido.

La microplaca se puede fabricar por técnicas que se conocen en la materia. Por ejemplo, sondas oligonucleotídicas de una longitud apropiada, por ejemplo, 20 nucleótidos, se modifican en el amino 5’ en la posición C6 y se imprimen usando sistemas de micromatriz adecuados disponibles, por ejemplo, La impresora de micromatrices GENEMACHINE OmniGrid 100 y los portaobjetos activados CODELINK de Amersham. El oligómero marcado de ADNc correspondiente a los ARN diana se prepara por retrotranscripción transcribiendo el ARN diana con cebador marcado. Después de la síntesis de la primera cadena, los híbridos ARN/ADN se desnaturalizan para degradar los moldes de ARN. Los ADNc diana marcados preparados de este modo se hibridan después con la microplaca de la 45 micromatriz en condiciones de hibridación, por ejemplo, 6 veces de SSPE/formamida al 30 % a 25 grados C durante 18 horas, seguido de lavados en 0,75 veces de TNT a 37 grados C, durante 40 minutos. En las posiciones de la matriz en las que la sonda de ADN inmovilizada reconoce una diana complementaria de ADNc en la muestra, se produce la hibridación. El ADNc diana marcado marca la posición exacta de la micromatriz donde se produce la unión, permitiendo la detección y cuantificación automática. Los datos de salida consisten en una lista de acontecimientos de hibridación, que indican la abundancia relativa de secuencias específicas de ADNc, y por lo tanto la abundancia relativa del correspondiente biomarcador complementario, en la muestra del sujeto. En un ejemplo, el oligómero de ADNc marcado es un ADNc marcado con biotina, preparado a partir de un cebador marcado con biotina. Después se procesa la micromatriz por detección directa de los transcritos que contienen biotina usando, por ejemplo, el conjugado estreptavidina-Alexa647, y se escanea utilizando métodos de escaneo convencionales. Las

55 intensidades de imagen de cada punto de la matriz son proporcionales a la abundancia del biomarcador correspondiente en la muestra del sujeto.

El uso de la matriz tiene una o más ventajas para la detección de la expresión de miARN. Primero, la expresión global de varios cientos de genes se puede identificar en una misma muestra en un punto temporal. Segundo, a través del diseño cuidadoso de las sondas oligonucleotídicas, se puede identificar la expresión tanto de las moléculas maduras como de las precursoras. Tercero, en comparación con los análisis de transferencia de Northern, la microplaca requiere una cantidad pequeña de ARN, y proporciona resultados reproducibles usando una cantidad tan pequeña como 2,5 mg de ARN total. El número relativamente limitado de miARN (unos pocos cientos por especie) permite la construcción de una micromatriz común para varias especies, con distintas sondas

65 oligonucleotídicas para cada una. Dicha herramienta permitiría el análisis de la expresión trans-específica para cada biomarcador conocido en distintas condiciones.

El sujeto puede ser un ser humano o animal que presente síntomas de CHC. Preferentemente, el sujeto es un ser humano. El sujeto puede tener o no también el virus de la hepatitis B o cirrosis (tal como la inducida por alcohol, cirrosis biliar primaria, hemocromatosis genética, hepatitis autoinmune, colangitis esclerosante primaria). El CHC

5 puede ser un tumor solitario, tumor multinodular y/o una lesión metastásica.

La muestra obtenida a partir del sujeto puede ser tejido hepático, que puede ser tejido tumoral o tejido normal. Como alternativa, la muestra puede ser del plasma o suero del sujeto, tejido de biopsias congelado, tejido de biopsias incluido en parafina, y combinaciones de los mismos.

La invención además proporciona un método para determinar el pronóstico de un sujeto determinando si el sujeto tiene el subtipo HSC-CHC, BDE-CHC, HP-CHC o MH-HCC. El método de pronóstico de la invención se puede utilizar en lugar de los métodos actuales de pronóstico. Como alternativa, el método de la invención se puede utilizar junto con métodos convencionales de pronóstico. Cuando se utiliza un enfoque combinado, los enfoques pronósticos

15 tradicionales pueden incluir la tomografía computarizada (TC) espiral del hígado y tórax, imagen de resonancia magnética (IRM) con potenciación del contraste o angiografía con inyección de lipiodol, y biopsia, así como sistemas de estadificación actuales.

El método además proporciona un régimen de tratamiento que puede idearse para el sujeto basándose en el subtipo de CHC en el sujeto. A este respecto, el método de la invención permite un enfoque más personalizado para la medicina ya que se puede adaptar la agresividad del tratamiento al subtipo de CHC en el sujeto.

En una realización, la invención aprovecha la asociación entre los biomarcadores y los subtipos de CHC. Por consiguiente, la invención proporciona métodos de tratamiento que comprenden administrar una cantidad

25 terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un reactivo que comprende un ácido nucleico complementario de al menos uno de los biomarcadores asociados con HSC-CHC, BDE-CHC, HP-CHC o MH-CHC.

En otra realización, la invención toma ventaja de la asociación entre los biomarcadores mir-181 y las células madre de CHC a fin de determinar el subtipo de CHC en un sujeto y, opcionalmente, correlacionar el subtipo de CHC en el paciente con un pronóstico. Los biomarcadores mir-181 se asocian con el subtipo de CHC de tipo células madre hepáticas (HSC), que es positivo para EpCAM y AFP. EpCAM es una proteína transmembrana que contiene tres dominios extracelulares y un dominio citoplasmático. La función de EpCM y el mecanismo de regulación de su expresión se desconocen bastante, pero se piensa que implica la adhesión célula-célula (Winter, Exp. Cell. Res., 285(1): 50-58 (2003)). EpCAM y AFP no se expresan en tejido hepático maduro. El subtipo HSC CHC normalmente

35 tiene un mal pronóstico y supervivencia resultante (Lee, Hepatology, 40(3): 667-676 (2004); Lee, Nat. Med., 12(4): 410-416 (2006)). Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para determinar si el CHC detectado es del subtipo HSC-CHC. La determinación del subtipo de CHC es particularmente útil en la determinación del tratamiento apropiado para el sujeto, particularmente porque el CHC EPCAM+ AFP+ se asocia con la señalización de Wnt-β-catenina. La señalización de Wnt-β-catenina es crítica para el mantenimiento de la función de las células madre y la activación anómala se ha asociado a numerosos cánceres humanos, incluyendo el CHC. Los mir-181 pueden contribuir a la activación de la señalización de Wnt-β-catenina, posiblemente a través de Dickkopf-1 (es decir, DKK1) y quinasa de tipo nemo (es decir, NLK), que son inhibidores de la ruta de Wnt-β-catenina. La divulgación aprovecha la relación entre la regulación de mir-181 y las células madre de CHC, y proporciona métodos de pronóstico, y tratamiento basados en los mismos.

45 Las opciones de tratamiento pueden incluir tratamientos tradicionales así como enfoques de terapia génica que se dirijan específicamente a los miARN descritos en el presente documento. El tratamiento tradicional del CHC incluye, por ejemplo, inyección percutánea de etanol (IPE), ablación por radiofrecuencia, quimioembolización, y quimioterapia. El tratamiento se determina basándose en el estado del sujeto y las directrices se conocen en la técnica. (Véase por ejemplo, Ryder, Gut, 52: 1-8 (2003)).

La divulgación además proporciona composiciones farmacéuticas para el uso en los métodos del tratamiento de la invención. En este aspecto, la divulgación proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un reactivo que comprende un ácido nucleico o ácidos nucleicos complementarios de al 55 menos uno, preferentemente al menos dos de los biomarcadores seleccionados de los que se identifican por las SEC ID Nº: 1-39 y un transportador farmacéuticamente aceptable. Como alternativa, el reactivo puede comprender ácidos nucleicos complementarios de al menos 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, o 35 o más de los biomarcadores. El reactivo puede comprender solamente los ácidos nucleicos o los ácidos nucleicos en combinación con reactivos de suministro tales como plásmidos recombinantes, vectores virales, liposomas, etc. Preferentemente, para el tratamiento de HSC-CHC, la composición comprende ácidos nucleicos complementarios de los biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-19, incluso más preferentemente, la composición comprende ácidos nucleicos complementarios de mir-181a1, mir-181a2, mir-181b1, mir-181b2 y mir-181c, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, para el tratamiento de BDE-CHC, la composición comprende ácidos nucleicos complementarios de al menos uno, preferentemente al menos dos biomarcadores identificados por las 65 SEC ID Nº: 2, 9-17, y 19-35, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, para el tratamiento de HP-CHC, la composición comprende ácidos nucleicos complementarios de al menos uno, preferentemente al

menos dos biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1-8, 11-13, 17-18, 23, 28, 29 y 33-39, y un transportador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, para el tratamiento de MH-CHC, la composición comprende ácidos nucleicos complementarios de al menos uno, preferentemente al menos dos biomarcadores identificados por las SEC ID Nº: 1, 8-12, 14-17 y 19-39, y un transportador farmacéuticamente aceptable. La composición puede unirse

5 y/o hacer que los biomarcadores sean ineficaces (es decir, inhibirlos), o como alternativa, alterar la expresión del gen codificante de los biomarcadores, alterando de ese modo las cantidades o niveles de biomarcadores producidos, la tecnología para los cuales se conoce bien en la técnica.

En la práctica de los presentes métodos de tratamiento, también se puede administrar al sujeto una cantidad eficaz de al menos una composición que inhiba al menos uno de los biomarcadores. Como se usa en el presente documento, "inhibir" significa que los niveles de biomarcador y/o producción del producto del gen biomarcador del gen correspondiente en la célula cancerosa después del tratamiento es menor que la cantidad producida antes del tratamiento. En otra realización, se puede administrar una composición que aumenta la expresión de uno o más de los biomarcadores. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si los niveles de biomarcador o expresión

15 génica se inhiben o aumentan en una célula cancerosa, usando por ejemplo las técnicas para determinar el nivel de los transcritos de los biomarcadores que han analizado anteriormente.

Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de una composición que inhibe la expresión de los biomarcadores o del gen biomarcador es una cantidad suficiente para inhibir la proliferación de una célula cancerosa en un sujeto que padece CHC. Un experto en la materia puede determinar fácilmente una cantidad eficaz de una composición inhibidora para administrar a un sujeto dado, teniendo en cuenta factores tales como la talla y el peso del sujeto; el grado de penetración de la enfermedad, la edad, salud y sexo del sujeto; la vía de administración; y si la administración es regional o sistémica.

25 Por ejemplo, una cantidad eficaz de la composición que altera la expresión se puede basar en el peso aproximado de una masa tumoral para tratar. Se puede determinar el peso aproximado de una masa tumoral calculando el volumen aproximado de la masa, en el que un centímetro cúbico de volumen es aproximadamente equivalente a un gramo. Por lo tanto, en una realización, se puede utilizar una cantidad eficaz basada en el peso de una masa tumoral. Como alternativa, una cantidad eficaz de la composición se puede basar en el peso corporal aproximado o estimado de un sujeto para tratar. Preferentemente, dichas cantidades eficaces se administran por vía parenteral o entérica.

Un experto en la materia también puede determinar fácilmente un régimen de dosificación apropiado para administrar una composición que altera los niveles de biomarcador o expresión génica a un sujeto dado. Por

35 ejemplo, se puede administrar la composición al sujeto una vez (por ejemplo, como una única inyección o deposición). Como alternativa, se puede administrar la composición una o dos veces al día a un sujeto durante un periodo de aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho días, más preferentemente de aproximadamente siete a aproximadamente diez días. Como alternativa, se puede administrar la composición una vez al día durante siete días. Cuando un régimen de dosificación comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad eficaz de la composición administrada al sujeto puede comprender la cantidad total de la composición administrada a lo largo del régimen de dosificación completo.

Las composiciones adecuadas para inhibir la expresión de gen biomarcador incluyen ARN bicatenario (tal como ARN de interferencia corto o pequeño o "ARNip"), ácidos nucleicos antisentido y moléculas de ARN enzimáticas

45 tales como ribozimas. Cada una de estas composiciones se puede dirigir a un producto génico de un biomarcador dado y destruir o inducir la destrucción del producto génico del biomarcador.

Por ejemplo, la expresión de un gen marcador dado se puede inhibir induciendo el ARN de interferencia del gen biomarcador con una molécula de ARN bicatenario ("ARNbc") que tiene al menos el 90 %, por ejemplo el 95 %, 98 %, 99 % o 100 %, de homología de secuencia con al menos una parte del producto del gen biomarcador. En una realización preferente, la molécula de ARNbc es un "ARN de interferencia corto o pequeño" o "ARNip".

Los ARNip útiles en los métodos de la presente invención comprenden ARN bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, preferentemente de aproximadamente 19 a

55 aproximadamente 25 nucleótidos de longitud. El ARNip comprende una cadena sentido de ARN y una cadena de ARN complementaria antisentido hibridadas conjuntamente por medio de interacciones de pares de bases de Watson y Crick convencionales (en lo sucesivo en el presente documento "formación de pares de bases"). La cadena sentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una secuencia de ácido nucleico contenida en el producto del gen biomarcador diana.

Como se usa en el presente documento, el ARNip es "sustancialmente idéntico" a una secuencia diana contenida en la secuencia de ácido nucleico diana, es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia diana, o que difiere de la secuencia diana en uno o dos nucleótidos. Las cadenas sentido y antisentido del ARNip pueden comprender dos moléculas de ARN monocatenarias complementarias, o pueden comprender una única molécula en

65 la que dos partes complementarias forman pares de bases y que se unen covalentemente por un área de "horquilla" monocatenaria.

El ARNip también puede ser un ARN alterado que difiere del ARN de origen natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el/los extremo(s) del ARNip o en uno o más nucleótidos internos del ARNip, o

5 modificaciones que hagan el ARNip resistente a la digestión por nucleasas, o la sustitución de uno o más nucleótidos del ARNip con desoxirribonucleótidos.

Una o ambas cadenas del ARNip también pueden comprender un saliente 3’. Como se usa en el presente documento, un "saliente 3’" se refiere al menos a un nucleótido desapareado que se extiende desde el extremo 3’ de un ARN bicatenario. Por lo tanto, en una realización, el ARNip comprende al menos un saliente 3’ de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) de longitud, preferentemente de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, y particularmente preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En una realización preferente, el saliente 3’ está presente en ambas cadenas de ARNip, y tiene 2 nucleótidos de

15 longitud. Por ejemplo, cada cadena del ARNip puede comprender salientes 3’ de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu").

El ARNip se puede producir química o biológicamente, o se puede expresar a partir de un plásmido recombinante o vector viral para los productos del gen biomarcador aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas de ARNbc o miARN en la publicación de solicitud de patente de los EE.UU. Nº 2002/0173478 y la patente de los EE.UU. Nº 7.148.342.

La expresión de un gen biomarcador dado también se puede inhibir por medio de un ácido nucleico antisentido. Como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico antisentido" se refiere a una molécula de ácido nucleico

25 que se une al ARN diana por medio de interacciones ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-ácido nucleico peptídico, que altera la actividad del ARN diana. Los ácidos nucleicos antisentido adecuados para el uso en los métodos de la presente invención son ácidos nucleicos monocatenarios (por ejemplo, ARN, ADN, quimeras ARN-ADN, ANP) que generalmente comprenden una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia contigua de ácido nucleico en un producto del gen biomarcador. Preferentemente, el ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de ácido nucleico que es 50-100 % complementaria, más preferentemente 75-100 % complementaria, y más preferentemente 95-100 % complementaria de una secuencia contigua de ácido nucleico en un producto del gen biomarcador.

Los ácidos nucleicos antisentido también pueden contener modificaciones de la cadena principal del ácido nucleico o

35 de los restos de azúcar y base (o sus equivalentes) para potenciar la especificidad de diana, resistencia a nucleasas, suministro u otras propiedades relacionadas con la eficacia de la molécula. Dichas modificaciones incluyen restos de colesterol, intercalantes dobles tales como acridina o la inclusión de uno o más grupos resistentes a las nucleasas.

Los ácidos nucleicos antisentido se pueden producir química o biológicamente, o pueden expresarse a partir de un plásmido recombinante o vector viral, como se ha descrito anteriormente para los productos de los genes biomarcadores aislados. Los métodos ejemplares para producirlos y ensayarlos están dentro de la experiencia de la técnica; véase, por ejemplo, Stein, Science, 261:1004 (1993) y patente de los EE.UU. Nº 5.849.902 de Woolf et al.

La expresión de un gen biomarcador dado también se puede inhibir por medio de un ácido nucleico enzimático.

45 Como se usa en el presente documento, un "ácido nucleico enzimático" se refiere a un ácido nucleico que comprende una región de unión a sustrato que tiene complementariedad con una secuencia contigua de ácido nucleico de un producto del gen biomarcador, y que es capaz de escindir específicamente el producto del gen biomarcador. Preferentemente, la región de unión a sustrato del ácido nucleico enzimático es 50-100 % complementaria, más preferentemente 75-100 % complementaria, y más preferentemente 95-100 % complementaria de una secuencia contigua de ácido nucleico en un producto del gen biomarcador. Los ácidos nucleicos enzimáticos pueden comprender además modificaciones en los grupos base, azúcar y/o fosfato. Un ácido nucleico enzimático para su uso en los métodos de la presente invención es una ribozima.

Los ácidos nucleicos enzimáticos se pueden producir química o biológicamente, o pueden expresarse a partir de un

55 plásmido recombinante o vector viral, como se ha descrito anteriormente para los productos de los genes biomarcadores aislados. Se describen métodos ejemplares para producir y ensayar moléculas ARNbc o ARNip en Werner, Nucl. Acids Res., 23:2092-96 (1995); Hammann, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9:25-31 (1999); y patente de los EE.UU. Nº 4.987.071.

La administración de al menos una composición para inhibir al menos un biomarcador o expresión de un gen biomarcador inhibirá la proliferación de las células de cáncer en un sujeto que tiene CHC. Como se usa en el presente documento, "inhibir la proliferación de una célula cancerosa" significa matar la célula, o detener o ralentizar permanentemente o temporalmente el crecimiento de la célula. La inhibición de la proliferación de células cancerosas puede inferirse si el número de dichas células en el sujeto permanece constante o disminuye después

65 de la administración de la composición de la invención. También se puede inferir una inhibición de la proliferación de células cancerosas si el número absoluto de dichas células aumenta, pero la tasa de crecimiento tumoral disminuye.

El número de células cancerosas en el cuerpo de un sujeto se puede determinar por medición directa, o por estimación del tamaño de las masas tumorales primarias o metastásica. Por ejemplo, el número de células cancerosas en un sujeto se puede medir por métodos inmunohistológicos, citometría de flujo, u otras técnicas

5 diseñadas para detectar marcadores de superficie característicos de células cancerosas.

El tamaño de una masa tumoral puede averiguarse por observación visual directa, o por métodos diagnósticos directos de imagen, tales como rayos X, imagen de resonancia magnética, ultrasonido y gammagrafía. Los métodos de imagen que se usan para averiguar el tamaño de la masa tumoral se pueden emplear con o sin agentes de contraste, como se conoce en la técnica. El tamaño de una masa tumoral también puede averiguarse por medios físicos, tales como la palpación de la masa de tejido o medición de la masa de tejido con un instrumento de medida, tal como un calibrador.

Las composiciones de la invención se pueden administrar a un sujeto por cualquier método adecuado para

15 suministrar estas composiciones a las células cancerosas del sujeto. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar por métodos adecuados para transfectar células del sujeto con estas composiciones. Preferentemente, las células se transfectan con un plásmido o vector viral que comprende secuencias que codifican al menos un producto del gen biomarcador o composición ihnibidora de la expresión del gen biomarcador.

Se conocen bien en la técnica métodos de transfección para células eucarióticas, e incluyen, por ejemplo, inyección directa del ácido nucleico en el núcleo o pronúcleo de una célula; electroporación; transferencia por liposomas o transferencia mediada por materiales lipofílicos; distribución de ácido nucleico mediada por receptor, biobalística o aceleración de partículas; precipitación con fosfato de calcio, y transfección mediada por vectores virales.

25 Por ejemplo, las células pueden transfectarse con una composición de transferencia liposómica, por ejemplo, DOTAP (metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio, Boehringer-Mannheim) o un equivalente, tal como LIPOFECTIN. La cantidad de ácido nucleico usada no es crítica para la práctica de la invención; se pueden alcanzar resultados aceptables con 0,1-100 microgramos de ácido nucleico/105 células. Por ejemplo, se puede usar una relación de aproximadamente 0,5 microgramos de vector plasmídico en 3 microgramos de DOTAP por cada 105 células.

La composición también se puede administrar a un sujeto por cualquier vía de administración entérica o parenteral adecuada. Las vías de administración entérica adecuadas para los presentes métodos incluyen, por ejemplo, suministro oral, rectal o intranasal. Las vías de administración parenteral adecuadas incluyen, por ejemplo,

35 adminstración intravascular (por ejemplo, inyección de embolada intravenosa, infusión intravenosa, inyección de embolada intraarterial, infusión intraarterial e instilación de catéter en la vasculatura); inyección peri e intra tisular (por ejemplo, inyección peritumoral e intratumoral, inyección retiniana o inyección subretiniana); inyección o deposición subcutánea, incluyendo infusión subcutánea (tal como mediante bombas osmóticas); aplicación directa en el tejido de interés, por ejemplo por un catéter u otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un gránulo retiniano o un supositorio o un implante que comprenda un material poroso, no poroso o gelatinoso); e inhalación. Las vías preferentes de administración son inyección, infusión e inyección directa en el tumor.

En los presentes métodos, se puede administrar la composición al sujeto bien como ARN desnudo, en combinación con un reactivo de suministro, o como un ácido nucleico (por ejemplo, un plásmido recombinante o vector viral) que

45 comprende las secuencias que expresan el producto del gen biomarcador o composición inhibidora de la expresión. Los agentes de distribución adecuados incluyen, por ejemplo, el agente lipófilo Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (por ejemplo, polilisina), y liposomas.

Los plásmidos recombinantes y vectores virales que comprenden secuencias que expresan el biomarcador o las composiciones inhibidoras de la expresión del gen biomarcador, y técnicas para distribuir dichos plásmidos y vectores a las células cancerosas, se han analizado anteriormente.

En una realización preferente, los liposomas se usan para distribuir un biomarcador o composición inhibidora de la expresión del biomarcador (o ácidos nucleicos que comprenden secuencias que los codifican) a un sujeto. Los

55 liposomas también pueden incrementar la semivida en sangre de los productos génicos o ácidos nucleicos.

Los liposomas adecuados pueden formarse a partir de lípidos que forman vesículas convencionales, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o con carga negativa y un esterol, tal como colesterol. La selección de lípidos se guía generalmente considerando factores tales como el tamaño deseado del liposoma y la semivida de los liposomas en el torrente sanguíneo. Se conoce diversos métodos para preparar liposomas, por ejemplo, como se describe en Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467 (1980); y patentes de los EE.UU. Nº 4.235.871. 4.501.728,

4.837.028 y 5.019.369.

Los liposomas para su uso en los presentes métodos pueden comprender una molécula ligando que dirija el

65 liposoma a las células cancerosas. Se prefieren los ligandos que se unen a receptores prevalentes en células cancerosas, tales como anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos de células tumorales.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir un transportador farmacéuticamente aceptable. La expresión "transportador farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento significa uno o más materiales de carga, diluyentes, otros excipientes o sustancias enscapsulantes sólidos o líquidos compatibles que

5 son adecuados para la administración a un paciente humano o veterinario. El término "transportador" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de comezclarse con las moléculas de la presente invención, y entre ellos, de un modo que no altere sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada. Los materiales "farmacéuticamente aceptables" pueden administrarse a un paciente sin la producción de efectos fisiológicos no deseados tales como náuseas, mareos, erupciones o molestias gástricas. Por ejemplo, se desea que una composición terapéutica que comprende excipientes farmacéuticamente aceptables no sea inmunogénica cuando se administra a un paciente humano para fines terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes tamponadores adecuados, incluyendo: ácido acético en

15 una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener, opcionalmente, conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos incluyen la etapa de asociar el principio activo con un transportador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan asociando uniformemente e íntimamente la composición activa con un transportador líquido, un transportador sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, se le da forma al producto.

25 Las composiciones adecuadas para la administración parenteral convenientemente comprenden una preparación acuosa estéril de la composición de la invención, que es preferentemente isotónica con respecto a la sangre del receptor. Esta preparación acuosa se puede formular de acuerdo con métodos conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión. La preparación inyectable también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están el agua, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier mezcla de aceite no volátil incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos tales como el

35 ácido oleico en la preparación de inyectables. Se pueden encontrar formulaciones transportadoras adecuadas para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc. en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, FA.

Los sistemas de suministro de la presente divulgación están diseñados para incluir sistemas de suministro de liberación temporalizada, liberación retardada o liberación sostenida tales que la distribución de la composición de la invención ocurra antes, y con suficiente tiempo, para causar sensibilización del sitio para tratar. La composición de la invención se puede usar junto con otros agentes terapéuticos o terapias. Dichos sistemas pueden evitar las administraciones repetidas de la composición de la invención, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico, y pueden ser particularmente adecuados para ciertas composiciones de la presente invención.

45 Numerosos tipos de sistemas de suministro están disponibles y se conocen por los expertos habituales en la materia. Estos incluyen sistemas basados en polímeros tales como poli(láctido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico y polianhídridos. Se describen microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos en, por ejemplo, Patente de los EE.UU. Nº

5.075.109. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-di-y triacilgliréridos; sistemas de liberación en hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos prensados que usan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero sin limitación: (a) sistemas de erosión

55 en los que la composición activa está contenida en una forma dentro de una matriz tales como los que se describen en las patentes de los EE.UU. Nº 4.452.775, 4.667.014, 4.748.034 y 5.239.660 y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo permea a una velocidad controlada desde un polímero tal como se describe en las patentes de los EE.UU. Nº 3.832.253 y 3.854.480. Además, se pueden usar sistemas de distribución en un soporte físico basado en una bomba, algunos de los cuales están adaptados para la implantación.

La divulgación además proporciona un método para evaluar la eficacia del tratamiento del CHC en un sujeto determinando si queda alguna célula madre de CHC en el hígado del sujeto que sigue un ciclo de tratamiento. A este respecto, se obtiene una muestra a partir del sujeto y se ensaya para detectar la presencia o ausencia de un biomarcador mir-181. Después se correlaciona la presencia o ausencia de un biomarcador mir-181 con la presencia

65 o ausencia, respectivamente, de CHC EpCAM+ AFP+ en un sujeto. Esta información se usa para determinar si el tratamiento del CHC en el sujeto ha sido eficaz o no.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deberían interpretarse de ningún modo como limitaciones de su alcance.

5 Ejemplos

Se usaron las siguientes técnicas para los ejemplos que se exponen a continuación.

Muestras de ensayo clínicas. Se obtuvieron tejidos hepáticos con consentimiento informado de sujetos que se sometieron a una resección radical entre 2002 y 2003 en el Instituto del Cáncer de Hígado y el Hospital Zhongshan (Fudan University, Shanghai, China). El estudio se aprobó por el Consejo de Revisión Institucional del Instituto del Cáncer de Hígado y el Instituto Nacional de Salud. Los criterios de inscripción de muestras incluyeron aquellos con un historial de infección por VHB o cirrosis relacionada con VHB, CHC diagnosticado por dos patólogos independientes, información detallada de la presentación clínica y las características patológicas, así como los datos 15 del seguimiento detallados de al menos 3 años, que incluyeron reaparición intrahepática, metástasis venosa intrahepática, implicación de ganglios linfáticos, metástasis extrahepática, libres de la enfermedad, supervivencia total y causa de la muerte. La clasificación TNM actualizada es superior a otros sistemas de estadificación, incluyendo CLIP y OKUDA, para sujetos con CHC que se sometieron a una resección y por lo tanto se eligió para estratificar los sujetos en estadio temprano (estadio temprano TNM I y II) para el análisis de la capacidad de predicción de los miARN. Varotti, Eur J. Surg Oncol, 31(7):760-767 (2005); Huang et al., J. Gastroenterol Hepatol, 20(5):765-771 (2005). Un estudio prospectivo reveló que el sistema BCLC es superior al nuevo sistema de clasificación TNM actualizado en 2002, por lo tanto, también se realizó el modelado de riesgos proporcionales de Cox basado en sujetos en estadios tempranos categorizados por BCLC (estadio 0 y A). Se realizaron perfiles de expresión génica en los CHC primarios y tejidos hepáticos no cancerosos correspondientes de 244 sujetos chinos 25 con CHC. Entre ellos, el 93 % tenía cirrosis subyacente y el 68 % tenía un nivel sérico de alfa-fetoproteína (AFP) > 20 ng/ml. Se usó un total de 134 casos bien definidos como el grupo de capacitación. Entre ellos, 30 tenían lesiones primarias de CHC acompañadas por émbolos tumorales en las ramas principales de la vena porta (n=25), la vena cava inferior (n=2), o el conducto biliar común (n=4; uno también tenía trombos tumorales en la vena cava inferior) y 104 tenían un CHC solitario sin que se encontrase metástasis/reaparición en el seguimiento (3 años). En el análisis de validación, se usó un grupo de ensayo de 110 casos independientes cuyo pronóstico no pudo determinarse con exactitud en el momento de la resección por varios mecanismos de estadificación del CHC. Los casos de ensayo incluyeron 43 CHC multinodulares y 67 solitarios. De los 43 casos de CHC multinodular, 18 desarrollaron reaparición intrahepática y uno desarrolló metástasis extrahepática además de una recurrencia intrahepática. De los 67 casos de CHC solitario, 4 sujetos tenían un tumor solitario con una apariencia de nódulos agregados, 10 desarrollaron

35 metástasis intra-y/o extrahepática, mientras que 49 desarrollaron reaparición intrahepática que se confirmó en el seguimiento (3 años). Además, se incluyeron como controles normales ocho tejidos hepáticos normales de sujetos sin la enfermedad (descrito en Budhu, Cancer Cell, 10(2):99-111 (2006)).

Aislamiento del ARN y matrices de miARN El aislamiento del ARN y la metodología de matrices de miARN se llevaron a cabo como se ha descrito en Ye, Nat Med, 9(4):416-423 (2003); Calin, N Engl J. Med, 353(17):1793-1802 (2005). En el análisis de los 244 casos de CHC, se aisló el ARN por pares a partir de tejido tumoral o no tumoral y las muestras se seleccionaron en orden aleatorio para el análisis de miARN para evitar el sesgo grupal. Se realizaron un total de 488 micromatrices. La plataforma de micromatrices (V 2.0) estaba compuesta de 250 miARN no redundantes humanos y 200 murinos. Para examinar la robustez de la plataforma de micromatrices de miARN, se 45 analizó el miARN para determinar si la expresión podría diferenciar los 244 tejidos de sus tejidos hepáticos no cancerosos circundantes correspondientes. Usando un método de comparación de clase supervisado con un ensayo de t para muestras relacionadas univariante y un ensayo multivariante con 1000 permutaciones de la marca de clase con la tasa de falsos descubrimientos ajustada a ≤1 con el 99 % de confianza, se identificaron 209 miARN no redundantes que podrían diferenciar significativamente tejidos tumorales de CHC (T) de sus tejidos no tumorales (NT) correspondientes. Estos miARN significativos separaron claramente las muestras T y NT, ilustradas mediante análisis de agrupación jerárquica. El algoritmo de predicción de clase multivariante con el 10 % de validación cruzada y 100 permutaciones aleatorias indicó que estos miARN pueden proporcionar una predicción estadísticamente significativa de las muestras T y NT (p<0,01) con una precisión superior al 97 % mediante el predictor del valor más próximo. Estos análisis iniciales indicaron que las matrices de miARN eran robustas y

55 podrían identificar una diferencia significativa entre el tumor y el tejido hepático no canceroso.

Análisis estadístico. Se realizó un análisis de agrupación jerárquica no supervisado por medio del programa informático GENESIS versión 1.5 desarrollado por Alexander Sturn (IBMT-TUG, Graz, Austria). Se usó el programa informático BRB ArrayTools V3.3 para el análisis supervisado como se ha descrito previamente (Ye, Nat Med, 9(4):416-423 (2003); Budhu, Cancer Cell, 10(2):99-111 (2006)). Se usó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para comparar la supervivencia de los sujetos basándose en los resultados de predicción, usando el programa basado en Excel WinSTAT. El valor p estadístico se generó por medio de la prueba de rango logarítmico de Cox-Mantel. La regresión de riesgos proporcionales de Cox se usó para analizar el efecto de dieciséis variables clínicas en la supervivencia o reaparición usando STATA 9.2 (College Station, TJ). La significación estadística se definió 65 como p < 0,05. El análisis TargetScan se basó en una herramienta web desarrollada por Ben Lewis (Lewis, Cell, 120(1):15-20 (2005)). La regresión de riesgos proporcionales de Cox se usó para analizar el efecto de las variables

clínicas en supervivencia de los sujetos total y sin recaídas, incluyendo edad, sexo, estado activo del VHB, AFP preresección, cirrosis, alanina transferasa (ALT), puntuación de Child-Pugh, tamaño tumoral, encapsulación tumoral, tipo nodular, estado de la invasión microvascular, grado Edmonson, y varios sistemas de estadificación pronóstico del CHC, incluyendo la estadificación BCLC (Lovet, Semin Liver Dis, 19(3):329-338 (1999)); la clasificación CLIP

5 ("The Cancer of the Liver Italian Program", Hepatology, 28(3):751-755 (1998)), la estadificación Okuda (Okuda, Cancer, 56(4):918-928 (1985)), y la clasificación TNF (American Joint Committee on Cancer (AJCC)/International Union Against Cancer (UICC)’s TNM Classification of Malignant Tumours, 6ª edición, Hoboken, NY, John Wiley & Sons 2002).

10 qRT-PCR. Se extrajo el ARN total usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). La expresión de TACSTD1, BAMBI, DKK1, CCND1, CTNNB1 y MYC se midió por triplicado usando un sistema de detección de secuencias Applied Biosystems 7700 (Foster City, CA). Las sondas usadas fueron: TACSTD1, Hs00158980_ml; CTNNB1, HS00170025_ml; BAMBI, HS00180818, DKK1, Hs00183740_ml, CCND1, Hs00277039_ml, CTNNB1, MYC, Hs00153408_ml; 18S, Hs999999901_s1 (Applied Biosystems). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo

15 con las sugerencias del fabricante.

Análisis inmunohistoquímico. El análisis inmunohistoquímico se realizó usando kits Envision+ (DAKO EE.UU., Carpinteria, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos primarios se usaron del siguiente modo: anticuerpo monoclonal clon 14 anti-β-catenina (BD Transduction Laboratories, San José, CA) y anticuerpo

20 monoclonal clon VU-1d9 anti-EpCAM (Oncogene Research Products, San Diego, CA).

Inmunofluorescencia. Las células se cultivaron en portaobjetos con cámaras y se trataron con los productos químicos indicados durante 48 h. Después se fijaron las células con formaldehído al 4 % durante 10 min, metanol durante 20 min y se incubaron en solución salina tamponada con fosfato. Las muestras se bloquearon con suero

25 normal de asno al 10 % durante una 1 h a temperatura ambiente y se tiñeron con los anticuerpos primarios durante 1 h a 37 ºC, seguidos de anticuerpos Alexa 568 anti ratón conjugados con Texas Red (Molecular Probes, Eugene, OR).

EMSA. El Tcf-4 recombinante se expresó en E. coli como una proteína de fusión GST y se extrajo. El EMSA se

30 realizó usando el kit de EMSA quimioluminiscente LightShift (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se construyeron los oligonucleótidos de ADN bicatenario que contenían los sitios potenciales de unión a Tcf del promotor de EpCAM y 10 nucleótidos adyacentes corriente arriba y corriente abajo y se usaron como sondas. También se usaron sondas mutantes TBE1 y TBE2.

35 Líneas celulares, antisentido y plásmidos. Se cultivaron rutinariamente líneas celulares conocidas Hep3B tipo B, MHCC97 tipo C, Smmc7721 tipo D, HUH1 y HUH7 de CHC. Las células se transfectaron con pMSCV-mir-181b-1 para los ensayos funcionales. También se trataron las células HUH7 con antisentido 2’-O-metil mir-181s, un inhibidor de mir-181.

40 Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que la expresión de miARN puede diferenciar el tejido de CHC del tejido no canceroso y puede distinguir entre cuatro subtipos de CHC.

45 Utilizando pares de muestras de tejido de CHC y no-CHC circundante de un total de 230 pacientes de CHC, se descubrió que un total de 209 miARN no redundantes proporcionaba el 97 % de precisión en la identificación correcta de las muestras (multivariante p<0,01). La heterogeneidad de las muestras era evidente y las muestras se agruparon basándose en los cuatro subtipos de CHC (HSC, BDE, HP y MH).

50 Se buscó la expresión de miARN significativos entre los cuatro subtipos de CHC. La agrupación jerárquica reveló que 39 genes de pre-miARN mostraron alteraciones significativas de la expresión en los cuatro subtipos de CHC (p<0,002, FDR <0,05) de los genes solapantes basándose tanto en la comparación de clase como en la predicción de clase con una validación cruzada con multiplicidad de 10 para establecer la exactitud de predicción (Tabla 1). De los 39 miARN, algunos estaban regulados positivamente y otros estaban regulados negativamente en cada subtipo

55 (Fig.10).

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que los mir-181 s están asociados con HSC-CHC y contribuyen a la función de las células madre de cáncer de hígado.

5 Los niveles de expresión de los mir-181 tanto en los miARN precursores (A) como en los maduros (B) aumentaron significativamente en HSC-CHC y BDE-CHC pero disminuyeron en los CHC HP y MH, frente a sus tejidos no CHC correspondientes. HSC-CHC y BDE-CHC se refieren a CHC con características de tipo células madre y características de tipo epitelio de conducto biliar, respectivamente. La expresión de mir-181, basándose en el análisis de micromatrices de precursores de miARN en cada subtipo de CHC frente a los tejidos no CHC correspondientes de 230 pacientes se muestra en la Figura 1A-E para mir-181a1, mir-181a2, mir-181b1, mir-181b2 y mir-181c, respectivamente. Las relaciones de expresión génica se muestran (media ± 95 % IC) en escala log2. Las figuras 1F-J muestran el análisis de RT-PCR de todos los mir-181 maduros en 40 pares de muestras de CHC y no CHC. El análisis de la gráfica de dispersión de los pre-mir-181 y de los mir-181 maduros se muestra en la Figura 2,

15 representando los valores de r el coeficiente de correlación de Spearman.

A continuación, se correlacionó positivamente la expresión de mir-181 con la activación de la señalización de Wnt-βcatenina y se correlacionó negativamente con la expresión de numerosos genes de hepatocitos maduros tanto en muestras de ensayo clínicas como en líneas celulares de CHC cultivadas. Se realizó análisis de agrupación jerárquica de 5 pre-mir-181, 15 genes específicos de hepatocitos y 5 genes asociados con beta-catenina cuyas expresiones se correlacionaban significativamente entre sí (p <0,001) a partir del análisis de correlación entre los datos de las micromatrices y datos de una matriz de ARNm. En 3 tipos distintos de líneas celulares de CHC, la expresión de mir-181 se correlacionaba positivamente con el nivel de proteína beta-catenina (Fig.9).

25 Después de cultivar las células HuH1 con medio de cultivo ESC, que es un medio basal optimizado para el crecimiento de células madre embrionarias indiferenciadas (ES), la expresión de los genes regulados por mir-181 y beta-catenina aumentó y la expresión de los genes específicos del hepatocito disminuyó tal como se analizó por RT-PCR (Figs. 3A-C) así como por inmunotransferencia usando anticuerpos para beta-catenina y actina (como un control). Después de la retirada de los medios ESC, la expresión de los genes anteriores se revirtió, tal como se analizó por qRT-PCR (Figs. 3D-F). La expresión génica se midió por triplicado y se muestra como la media + DT.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que la expresión de mir-181 está involucrada en la activación de la señalización de wnt35 beta-catenina.

Después de transfectar las células HuH1 con pMSCV-mir-181b-1, se detectó mir-181-b por RT-PCR y la expresión se comparó con la de las células pMSCV-hTR. La expresión génica se midió por triplicado y se muestra como la media + DT en la Fig. 4. Como se muestra, mir-181 se sobreexpresó en las células HuH1.

Se trataron las células HuH7 con antisentido 2’-O-metil mir-181s y posteriormente se detectó la expresión de todos los mir-181. Una disminución significativa en la expresión génica (en comparación con el oligo control), que se midió por triplicado, se muestra como media + DT en la Fig.5.

45 Después de la sobreexpresión de mir-181 en las células HuH1, se detectó la expresión de los genes regulados por beta-catenina (CCND1, TACSTD1 y DKK1) por RT-PCR y se comparó con la expresión de las células pMSCV-hTR (Figs. 6A-C). Los lisados celulares de las líneas celulares también se analizaron por inmunotransferencias con anticuerpos para β-catenina y actina.

Después de la regulación negativa de mir-181 en las células HuH7, se detectó la expresión de los genes regulados por beta-catenina (CCND1, TACSTD1 y DKK1) por RT-PCR y se comparó con la expresión de las células pMSCV-hTR (Figs. 6D-F). Los lisados celulares de las líneas celulares también se analizaron por inmunotransferencias con anticuerpos para β-catenina y actina.

55 Los mir-181 afectaron a la expresión de wnt-beta-catenina. Es posible que esto ocurra a través de una conexión funcional de retroalimentación. DKK1 es un inhibidor de beta-catenina. Beta-catenina induce a los mir-181 así como DKK1, lo que posteriormente inhibe la beta-catenina. Se cree que mir-181 actúa inhibiendo la actividad inhibidora de DKK1. Los sitios de unión de los mir-181 predichos en el 3’-UTR de DKK1 se muestran en la Fig. 7A-B.Se usó el ADNc homólogo 1 de dickkopf de Homo sapiens BC001539. La Figura 7A muestra los sitios de unión en la posición 611-632 del 3’-UTR de DKK1. La Figura 7B muestra los sitios de unión predichos en la posición 771-799 del 3’-UTR de DKK1.

Los sitios de unión predichos del factor de transcripción 4 (TCF-4) ((A/T)(A/T)CAAAG) o (CTTTG(A/T)(A/T)) en los promotores de los mir-181 se muestran en las Figs. 8A-D. Se analizaron 6.060 pares de bases, aguas arriba del sitio 65 de inicio de la transcripción. La Figura 8A muestra el promotor de mir-181a1 y mir-181b1 en el cromosoma 1, para los cuales se usó el cóntigo genómico NW_926128, del cromosoma 1 de Homo sapiens. La Figura 8B muestra el

promotor de mir-181 a2 y mir-181b2 en el cromosoma 9, para los cuales se usó el cóntigo genómico NT_008470 del cromosoma 9 de Homo sapiens. En la base de datos Sanger, ambos genes EST se han predicho en la región de localización de mir-181c y mir-181d, que tienen distintos sitios de inicio de la transcripción (Figs. 8C-D). El promotor de mir-181c y mir-181d en el cromosoma 19 en la Fig. 8C es el promotor de ENSESTT00000290819. El promotor de

5 mir-181c y mir-181d en el cromosoma 19 en la Fig. 8D es el promotor de ENSESTT00000290818.

Se interpretará que el uso de los términos "un" y "una" y "el" y "la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que contradiga claramente el contexto. Los términos "comprender", "tener", "incluir" y "contener" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, significa que "incluyen, pero no se limitan a,") a menos que se indique otra cosa. La repetición de intervalos de valores del presente documento tiene simplemente la intención de servir como método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara

15 individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o que se contradiga claramente de otro modo por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") que se proporciona en el presente documento, pretende simplemente clarificar mejor la invención y no supone una limitación del alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ningún lenguaje de la memoria descriptiva debería interpretarse como indicativo de que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS

25 <110> WANG, Xin Wei JI, Junfang

<120> MÉTODOS PARA DETERMINAR EL SUBTIPO DE CARCINOMA HEPATOCELULAR Y DETECTAR CÉLULAS MADRE DE CÁNCER HEPÁTICO

<130> 701608

<160> 39

<170> PatentIn versión 3.4 35

<210> 1

<211> 21

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 1 ugagguagua gguuguauag u 21

<210> 2 45 <211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 2 ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 22

<212> ARN 55 <213> Homo sapiens

<400> 3 ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 4

<211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

65 <400> 4 ugagguagua gguugugugg uu 22

5: <210> 5 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 5 ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 6 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

15: <400> 6 agagguagua gguugcauag u 21

<210> 7 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 7 ugagguagua gauuguauag u: 21

25: <210> 8 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 8 ugagguagua guuuguacag u: 21

35: <210> 9 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 9 cuuuuugcgg ucugggcuug cu: 22

45: <210> 10 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 10 cuuuuugcgg ucugggcuug cu 22

<210> 11 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

55: <400> 11 aacauucauu gcugucggug gg 22

<210> 12 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

65: <400> 12 aacauucauu gcugucggug gg <210> 13 <211> 21 <212> ARN 22

<213> Homo sapiens

<400> 13 uagguaguuu cauguuguug g 21 5

<210> 14

<211> 23

<212> ARN

<213> Homo sapiens 10

<400> 14 uccagcuccu auaugaugcc uuu 23

<210> 15 15 <211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 15 20 aaagugcugu ucgugcaggu ag 22

<210> 16

<211> 24

<212> ARN 25 <213> Homo sapiens

<400> 16 caaagugcuu acagugcagg uagu 24

30 <210> 17

<211> 22

<212> ARN

<213> Homo sapiens

35 <400> 17 aacauucaac cugucgguga gu 22

<210> 18

<211> 23 40 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 18 cagugcaaua guauugucaa age 23 45

<210> 19

<211> 21

<212> ARN

<213> Homo sapiens 50

<400> 19 uauugcacuu gucccggccu g 21

<210> 20 55 <211> 24

<212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 20 60 aaaagugcuu acagugcagg uagc 24

<210> 21

<211> 21

<212> ARN 65 <213> Homo sapiens

<400> 21 uaaagugcug acagugcaga u: 21

5: <210> 22 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 22 aacauucaac gcugucggug agu: 23

15: <210> 23 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 23 aacauucaac gcugucggug agu: 23

<210> 24 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

25: <400> 24 uaaagugcuu auagugcagg uag 23

<210> 25 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

35: <400> 25 agcuacauug ucugcugggu uu <210> 26 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens 22

<400> 26 agcuacaucu ggcuacuggg ucuc: 24

45: <210> 27 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 27 cauugcacuu gucucggucu ga: 22

55: <210> 28 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 28 uauugcacau uacuaaguug c: 21

<210> 29 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

65: <400> 29 gcacauuaca cggucgaccu cu 22

5: <210> 30 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 30 uauugcacuu gucccggccu g: 21

<210> 31 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

15: <400> 31 uggaguguga caaugguguu ugu 23

<210> 32 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

25: <400> 32 ucccugagac ccuaacuugu ga <210> 33 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens 22

<400> 33 ucccugagac ccuaacuugu ga: 22

35: <210> 34 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 34 uagcaccauc ugaaaucggu u: 21

45: <210> 35 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

<400> 35 uagcaccauu ugaaaucagu guu: 23

<210> 36 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens

55: <400> 36 cgcauccccu agggcauugg ugu 23

<210> 37 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens

65: <400> 37 cacccguaga accgaccuug cg <210> 38 22

<211> 23

<212> ARN

<213> Homo sapiens

5 <400> 38 uagcaccauu ugaaaucagu guu 23

<210> 39

<211> 20 10 <212> ARN

<213> Homo sapiens

<400> 39 uagcaccauu ugaaaucggu 20 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el subtipo de un carcinoma hepatocelular (CHC) en un sujeto, que comprende:

5 a) obtener una muestra de tejido hepático de un sujeto que tiene un subtipo de CHC, seleccionado de uno o más de: carcinoma hepatocelular del tipo epitelio del conducto biliar (BDE-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo células madre hepáticas (HSC-CHC); carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC); y, carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC); b) llevar a cabo un análisis de laboratorio de la muestra para determinar la expresión de uno o más de los

10 biomarcadores de la familia de biomarcadores miR-181 en la muestra, c) correlacionar la expresión de uno o más biomarcadores de la familia de miR-181 en la muestra con el subtipo de CHC en el sujeto, y d) determinar el subtipo del CHC en la muestra a partir de la correlación, en donde;

15 i) la sobreexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo epitelio de conducto biliar (BDE-CHC); ii) la sobreexpresión de uno o más de miR-181b-1 y miR-181b-2, y la ausencia o infraexpresión de uno o más de miR-181a-1 y miR-181a-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de células madre hepáticas (HSC-CHC);

20 iii) la infraexpresión de uno o más de miR-181a-2, miR-181b-1 y miR-181b-2, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, y la ausencia de sobreexpresión e infraexpresión de miR-181a1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de progenitores hepatocíticos (HP-CHC); y iv) la infraexpresión de miR-181a-1, en comparación con los niveles de expresión en tejido no tumoral, es

25 indicativa de carcinoma hepatocelular del tipo de hepatocitos maduros (MH-CHC).
2. El método de la reivindicación 1, que comprende uno o más de:

seleccionar la muestra de tejido del grupo que consiste en tejido tumoral de hígado, tejido de biopsia congelado,

30 tejido de biopsia incluido en parafina y combinaciones de los mismos; y analizar la muestra mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en técnicas de micromatriz, amplificación por PCR, hibridación de ARN, hibridación in situ, electroforesis en gel y combinaciones de las mismas.

35 3. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM+ alfa fetoproteína AFP+ en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM+ AFP+ con la presencia del subtipo HSC-CHC en la

40 muestra, en donde la presencia de EpCAM+ AFP+ indica la presencia del HSC-CHC en la muestra.
4. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM+ alfa

45 fetoproteína AFP-en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM+ AFP-con la presencia del subtipo BDE-CHC en la muestra, en donde la presencia de EpCAM+ AFP-indica la presencia del BDE-CHC en la muestra.
5. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

50 la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM-AFP+ en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM-AFP+ con la presencia del subtipo HP-CHC en la muestra, en donde la presencia de EpCAM-AFP+ indica la presencia del HP-CHC en la muestra.

55 6. El método de la reivindicación 1, que además comprende determinar el subtipo de CHC en la muestra mediante:

la detección de la presencia de células madre molécula de adhesión de células epiteliales EpCAM-alfa fetoproteína AFP-en la muestra, y la correlación de la presencia de células madre EpCAM-AFP-con la presencia del subtipo MH-CHC en la

60 muestra, en donde la presencia de EpCAM-AFP-indica la presencia del MH-CHC en la muestra.
7. El método de la reivindicación 3, que además comprende determinar el pronóstico del sujeto, en donde el subtipo HSC-CHC es indicativo de mal pronóstico.