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ES2535153T3 - Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide - Google Patents

Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide Download PDF

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ES2535153T3
ES2535153T3 ES08761599.3T ES08761599T ES2535153T3 ES 2535153 T3 ES2535153 T3 ES 2535153T3 ES 08761599 T ES08761599 T ES 08761599T ES 2535153 T3 ES2535153 T3 ES 2535153T3
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ES
Spain
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βfib
cit
peptides
fibrin
rheumatoid arthritis
Prior art date
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Active
Application number
ES08761599.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Isabel Haro Villar
Mª José GOMARA ELENA
Raimon SANMARTÍ SALA
Mª Luisa PÉREZ RODRÍGUEZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Fundacio Clinic per a la Recerca Biomedica FCRB
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Fundacio Clinic per a la Recerca Biomedica FCRB
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Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide, que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas:(i) una procedente de la cadena a o ß de la fibrina y (ii) una segunda procedente de la filagrina. Además, la invención comprendeuna composición antigénica, un método y un kit para el diagnóstico de la artritis reumatoide, a partir de la detección de los auto- anticuerpos generados durante el curso de dicha enfermedad.

Description

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Tabla 1b. Secuencias de los péptidos derivados de la β –fibrina
Nombre
Péptido Secuencia
p25
βfib(40-57) F F S A R G H R P L D K K R E E A P
p26
[Cit 53]βfib(40-57) F F S A R G H R P L D K K X E E A P
p27
[Cit 47]βfib(40-57) F F S A R G H X P L D K K R E E A P
p28
[Cit 47,53]βfib(40-57) F F S A R G H X P L D K K X E E A P
5
p29 [Cit 44,47,53]βfib(40-57) F F S A X G H X P L D K K X E E A P
p30
[Cit 44,47]βfib(40-57) F F S A X G H X P L D K K R E E A P
p31
[Cit 44,53]βfib(40-57) F F S A X G H R P L D K K X E E A P
p32
[Cit 44]βfib(40-57) F F S A X G H R P L D K K R E E A P
10
p33
βfib(43-62) A R G H R P L D K K R E E A P S L R P A
p34
[Cit 60] βfib(43-62) A R G H R P L D K K R E E A P S L X P A
p35
[Cit 53]βfib(43-62) A R G H R P L D K K X E E A P S L R P A
15
p36 [Cit 53,60]βfib(43-62) A R G H R P L D K K X E E A P S L X P A
p37
[Cit 47,53,60]βfib(43-62) A R G H X P L D K K X E E A P S L X P A
p38
[Cit 47,60]βfib(43-62) A R G H X P L D K K R E E A P S L X P A
p39
[Cit 47,53]βfib(43-62) A R G H X P L D K K X E E A P S L R P A
20
p40 p41 [Cit 47]βfib(43-62) [Cit 44,47,53,60]βfib(43-62) A R G H X P L D K K R E E A P S L R P A A X G H X P L D K K X E E A P S L X P A
p42
[Cit 44,47,53]βfib(43-62) A X G H X P L D K K X E E A P S L R P A
p43
[Cit 44,47,60]βfib(43-62) A X G H X P L D K K R E E A P S L X P A
p44
[Cit 44,47]βfib(43-62) A X G H X P L D K K R E E A P S L R P A
25
p45 [Cit 44,53,60]βfib(43-62) A X G H R P L D K K X E E A P S L X P A
p46
[Cit 44]βfib(43-62) A X G H R P L D K K R E E A P S L R P A
p47
[Cit 44,53]βfib(43-62) A X G H R P L D K K X E E A P S L R P A
p48
[Cit 44,60]βfib(43-62) A X G H R P L D K K R E E A P S L X P A
30
p49 βfib(72-89) R A R P A K A A A T Q K K V E R K A
p50
[Cit 87]βfib(72-89) R A R P A K A A A T Q K K V E X K A
p51
[Cit 74]βfib(72-89) R A X P A K A A A T Q K K V E R K A
p52
[Cit 74,87]βfib(72-89) R A X P A K A A A T Q K K V E X K A
35
p53 [Cit 72,74,87]βfib(72-89) X A X P A K A A A T Q K K V E X K A
p54
[Cit 72,74]βfib(72-89) X A X P A K A A A T Q K K V E R K A
p55
[Cit 72,87]βfib(72-89) X A R P A K A A A T Q K K V E X K A
p56
[Cit 72] βfib(72-89) X A R P A K A A A T Q K K V E R K A
40
p57 p58 βfib(151-168) [Cit 158]βfib(151-168) L K D L W Q K R Q K Q V K D N E N V L K D L W Q K X Q K Q V K D N E N V
p59
βfib(365-383) ANKYQISVNKYRGTAGNAL
p60
[Cit 376]βfib(365-383) ANKYQISVNKYXGTAGNAL
45
p61 βfib(365-390) ANKYQISVNKYRGTAGNALMDGASQL
p62
[Cit 376]βfib(365-390) ANKYQISVNKYXGTAGNALMDGASQL
p63
βfib(367-396) KYQISVNKYRGTAGNALMDGASQLMGENRT
p64
[Cit 395]βfib(367-396) KYQISVNKYRGTAGNALMDGASQLMGENXT
50
p65 p66 [Cit 376]βfib(367-396) [Cit 376,395]βfib(367-396) KYQISVNKYXGTAGNALMDGASQLMGENRT KYQISVNKYXGTAGNALMDGASQLMGENXT
p67
βfib(373-390) NKYRGTAGNALMDGASQL
p68
[Cit 376]βfib(373-390) NKYXGTAGNALMDGASQL
p69
βfib(373-390)* NKYRGTAGNALMDGASQL
55
p70 [Cit 376]βfib(373-390)* NKYXGTAGNALMDGASQL
p71
palm-βfib(373-390) palm-NKYRGTAGNALMDGASQL
p72
palm-[Cit 376]βfib(373-390) palm-NKYXGTAGNALMDGASQL
Citrulina = X
* péptidos acídicos
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Muestras de suero
Las muestras de suero analizadas procedieron de pacientes del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico de
35 Barcelona. Se trabajó con un total de 193 muestras de suero, de las cuales 111 correspondían a pacientes diagnosticados con AR, según los criterios revisados de la Asociación Americana de Reumatología de 1987 (ahora Colegio Americano de Reumatología). Las muestras fueron previamente testadas por ELISA con el kit con anticuerpos CCP-2 (Immunoscan RA; Eurodiagnostica, distribuído por Diasorin, Madrid, Spain) para conocer la presencia o ausencia de anticuerpos anti-CCP2. Los 82 sueros restantes se obtuvieron de pacientes diagnosticados
40 de PsA no preseleccionados y se emplearon como control negativo.
Ensayos de ELISA
Las secuencias peptídicas se unieron covalentemente a placas de titulación de ELISA (Costar Corp., DNA-bind N
45 oxysuccinimide surface, Cambrigde, MA), como se ha descrito previamente (Pérez, T.; Gómez, et al. Lett. Peptide Sci. 2002, 9, 291-300).
Brevemente, se diluyeron los péptidos a una concentración de 10 mg/mL en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6)
0.05 M. Se adicionaron 100 μL de solución peptídica a cada pocillo de la placa de microtitulación y se incubó toda la
50 noche a 4ºC. Cada placa contenía pocillos control que incluían todos los reactivos excepto la muestra de suero, para estimar el ruido de fondo, y pocillos que incluían todos los reactivos excepto el péptido, para evaluar así las reacciones no específicas del suero. En los controles, los pocillos se bloquearon con 2 mg BSA/pocillo. Tras la incubación, las placas se bloquearon con 2% de BSA en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9.6) 0.05 M durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sueros se diluyeron 200 veces en tampón RIA (1% BSA, 350 mM NaCl, 10 mM
55 Tris-HCl, pH 7.6, 1% vol/vol Triton X-100, 0.5% wt/vol Na-deoxicolato, 0.1% SDS) suplementado con suero fetal bovino al 10%. Se adicionaron 100 μL/pocillo y se incubaron durante 1.5 horas a temperatura ambiente. Tras realizar seis lavados con PBS/0.05% Tween-20, se adicionaron 100 μL/pocillo de IgG anti-humana conjugada a peroxidasa, diluida 1:1000 en tampón RIA. Tras 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron las placas seis veces con PBS/0.05% Tween-20 y los anticuerpos unidos se detectaron con dihidrocloruro de o-fenilenodiamina (OPD,
60 Sigma Chemical Company) y 0.8 mL/mL de 30% de peróxido de hidrógeno. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 50 mL de H2SO4 2N y los valores de absorbancia obtenidos fueron medidos a una longitud de onda de 492 nm. Todos los sueros se testaron por duplicado. También se incluyeron sueros control para monitorizar las variaciones inter-e intra-ensayos.
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Los ensayos de ELISA llevados a cabo con el lipopéptido p66 o con las mezclas físicas de péptidos de fibrina, se realizaron tras la adsorción pasiva de las secuencias a la superficie sólida (Maxisorp, 96F Nunc, Roskilde, Denmark), siguiendo la metodología ya descrita (Gomara, M. J. at al J Immunol Methods 2000, 234 (1-2), 23-34.). El péptido p65 se analizó empleando placas Covalink NH (Nunc, Roskilde, Denmark), que permiten la unión covalente de los péptidos a través de su región C-terminal. El procedimiento general fue el siguiente:
Se preparó una solución de péptido de 10 μg/mL en agua destilada que contenía sulfo-N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) a concentración 8 mM. Se adicionaron 100 μL de la solución de péptido/sulfo-NHS a cada pocillo. Asimismo se preparó una solución de un 2% de BSA/sulfo-NHS para adicionar al pocillo control. La reacción covalente se inició tras la adición de 50 μL de una solución 16 mM de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) a cada pocillo. Se incubaron las placas durante la noche a temperatura ambiente y se realizó el resto del ensayo ELISA siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para las placas Costar.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SPSS versión 12.0. Para establecer la sensibilidad/especificidad de los diferentes tests ELISA en las distintas patologías se realizó un estudio de curvas ROC. Para la comparación de proporciones se usó el test de ji cuadrado (Chi-square test) o el test de Fischer y para el análisis bivariante de las variables continuas el test de la t de Student o el de Wilcoxon-Mann-Whitney. Para las comparaciones múltiples, se utilizó el análisis de la varianza o el test de Kruskal-Wallis. Para la aplicación de las pruebas paramétricas se realizaron previamente contrastes de normalidad (Kolmogorov-Smirnov) y de homocedasticidad (tets de Levene).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1: Identificación de epítopos de α-fibrina y β-fibrina
Con el objeto de detectar aquéllos péptidos de la proteina fibrina que fuesen más reactivos frente a sueros positivos para AR (en adelante sueros AR), se procedió a analizar la influencia del grado de deiminización mediante la síntesis de péptidos derivados de la fibrina con distinta relación arginina/citrulina. La identificación de las regiones de las cadenas α-fibrina y β-fibrina que serían empleadas en los ensayos fue llevada a cabo por predicciones de antigenicidad realizadas por ordenador. Se emplearon las escalas de hidrofilia de Hopp y Woods, de accesibilidad de Janin y de antigenicidad de Welling. Además se tuvo en cuenta qué regiones presentaban una mayor probabilidad de formar giros beta y que por tanto se deberían localizar en una zona más externa de la proteína, teniendo con ello una mayor facilidad para interaccionar con los anticuerpos. Los péptidos finalmente fueron sintetizados en fase sólida y caracterizados por su secuencia, HPLC y espectrometría de masas MALDI-Tof.
Estos péptidos fueron ensayados mediante inmunoensayo (ELISA) para determinar su capacidad de reconocer autoanticuerpos presentes en sueros positivos para AR. Para identificar qué péptidos eran el mejor sustrato para los auto-anticuerpos todos los péptidos sintetizados fueron inicialmente ensayados con 33 sueros positivos para AR y con 40 sueros control. Tal y como se muestra en la Figura 4 se observó un considerable aumento de la sensibilidad para los péptidos p18, p19 y p22 derivados de la cadena α-fibrina, donde la arginina había sido sustituida en la posición 630. Aunque p24 también presenta una citrulina en esta posición específica, se trata de una versión totalmente citrulinada de la región 617-631. De acuerdo con resultados anteriores de los inventores de la presente invención, una carga neta positiva podría ser un factor adicional que contribuyera a la reactividad del péptido. Según la experiencia de los inventores, un adecuado balance de residuos Arg/Cit en los péptidos puede favorecer una conformación con mayor capacidad de unión a los auto-anticuerpos, lo cual mejora su utilidad analítica, diagnóstica y pronóstica.
El resto de péptidos correspondientes a la región 617-631 de la α-fibrina con una arginina sin modificar en la misma posición mostraron una reactividad menor. Para los péptidos derivados de la cadena de β-fibrina, de aquellos obtenidos a partir de la región definida entre las posiciones 43-62, el p38 fue el que ofreció los mejores resultados de absorbancia (DO492), es decir una mayor unión a los auto-anticuerpos.
EJEMPLO 2: Ensayos de detección de auto-anticuerpos mediante péptidos ciclados
Péptidos ciclados de la β-fibrina.
A partir de la región 43-62 de la β-fibrina se procedió a la ciclación de péptidos derivados de dicha región para determinar si este tratamiento, la ciclación, conseguía aumentar su afinidad por los auto-anticuerpos. Así, se prepararon dos versiones de péptidos cíclicos a partir de la región 43-62 de la β-fibrina (Tabla 2). La primera de estas versiones, p38HT (del inglés “head to tail” o cabeza-cola), se correspondía con el péptido p38 ciclado, que fue obtenido en fase sólida mediante la formación de un enlace amida entre el extremo N-terminal del péptido y el grupo
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Anti-CCP2: 29 Ul/l Anti-quimérico fb/f – p18: 0.241 Anti-quimérico fb/f – p19: 0.229 Anti-quimérico fb/f – p22: 0.280
A continuación se detallan las curvas ROC para el diagnóstico de AR entre las poblaciones con AR (n = 322) y población control del banco de sangre (n= 307).
Tabla 6: Curva ROC para anti CCP2
Sensibilidad
238/322 73.91%
Especificidad
301/307 98.05%
Valor predictivo positivo
238/244 97.54%
Valor predictivo negativo
301/385 78.18%
Ver fig. 10 Tabla 7: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p18
Sensibilidad
232/322 72.05%
Especificidad
301/307 98.05%
Valor predictivo positivo
232/238 97.48%
Valor predictivo negativo
301/391 76.98%
Ver fig. 11 Tabla 8: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p19
Sensibilidad
251/322 77.95%
Especificidad
301/307 98.05%
Valor predictivo positivo
251/257 97.67%
Valor predictivo negativo
301/372 80.91%
Ver fig. 12 Tabla 9: Curva ROC para antiquimérico fb/f-p22
Sensibilidad
230/322 71.43%
Especificidad
303/307 98.70%
Valor predictivo positivo
230/234 98.29%
Valor predictivo negativo
303/395 76.71%
Ver fig. 13
Con este ensayo, se vuelve a demostrar que en el suero de pacientes con AR existen anticuerpos que reaccionan contra péptidos citrulinados quiméricos fibrina/filagrina, reforzando la idea de que los epítopos de la cadena alfa de la fibrina humana, presente en la sinovial reumatoide podrían constituirse en los principales antígenos que desencadenen la respuesta inmunológica con la formación de estos auto-anticuerpos, en pacientes con AR.
En el análisis de sensibilidad/especificidad de estos anticuerpos, se ha demostrado que tienen una alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de AR. De hecho, empleando una población de 322 pacientes con AR y 307 controles (banco de sangre) y manteniendo una especificidad del 98%, la sensibilidad de los tres péptidos quiméricos fibrina/filagrina (fb/f) (p18, p19, p22) ha sido del 72%, 78% y 71% respectivamente, una sensibilidad pareja a la observada con los anti-CCP-2 comerciales (74%). De forma interesante, y aunque la correlación entre los diferentes anticuerpos es muy estrecha, hay un porcentaje notable de discrepancias entre ellos (entre 13-15% de sueros discordantes), lo que manifiesta que la determinación de más de un anticuerpo incrementa la sensibilidad (hasta un 81%) sin prácticamente perder especificidad (96-97%).
De hecho, se observa un número relativamente importante de pacientes con valores no concordantes. El 13.9% de los pacientes tienen discrepancias en la positividad del anticuerpo CCP-2 y el antiquimérico fb/f p-18.
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radiológica a los dos años de seguimiento.
No obstante, es muy importante resaltar que que aquellos pacientes anti CCP-2 negativos pero positivos para los antiquiméricos, mostraban un grado de destrucción articular similar a los antiCCP positivos, demostrando que estos 5 anticuerpos pueden dar información pronóstica adicional.
A continuación se aportan los datos obtenidos para llegar a las conclusiones ya comentadas. En primer lugar se aportan las diferentes características de los pacientes analizados:
10 Mujeres (%) 82.2 Edad (años), ± S.D. 53.8 ± 15 Duración enfermedad (meses), X ± S.D. 10 ± 6.7 Dolor EAV (mm), X ± S.D 50.6 ± 21 VGPaciente (mm), X ± S.D. 57.6 ± 15.8
15 VGMedio (mm), X ± S.D. 55.7 ± 14 NAD28, X ± S.D. 9.8 ± 5.5 NAI28, X ± S.D. 8.1 ± 4.2 DAS 28, X ± S.D. 5.7 ± 0.9 DAS 28 > 5.1 (%) 75.4
20 mHAQ, X ± S.D. 0.9 ± 0.5 VSG (mm/h), X ± S.D. 39.7 ± 24.4 CRP (mm/dL), X ± S.D. 2.8 ± 2.3 Hemoglobina (mg/dL), X ± S.D. 12.7 ± 1.4 Factor reumatoide positivo (>25U) 73.7
25 Anti-CCP-2 positivo (>50 U) (%) 69.7 Epitopo reumatoide (%) 72.5 Epitopo reumatoide homocigoto (%) 19.3 HLA-DRB1-04 (%) 44.5
30 En cuanto a la detección de anticuerpos específicos frente a péptidos citrulinados sintéticos quiméricos en este ensayo (antiquiméricos fb/f) (ELISA), los resultados fueron los siguientes:
Tabla 13
imagen12
En la Tabla 14 se pueden observar los valores del daño radiológico (basal y a los dos años) en función de la presencia o ausencia de los diferentes auto-anticuerpos específicos frente a los péptidos citrulinados.
Tabla 14
CCP-2+ (n=74)
CCP-2– (n=35) Q-p18+ (n=84) Q-p18(n=17 ) Q-p19+ (n=80) Q-p19(n=18 ) Q-p-22+ (n=85) Q-p-22(n=13 )
Larsen basal
1.5±0.3 0.7±0.3 1.6±0.4* 0.3±0.2* 1.5±0.2 1.5±0.3 1.5±0.3 0.5±0.3
Larsen final
6.9±1.2* 3.5±1.3 7±1.2** 3.±1.1** 6.5±1.1 4.3±1.9 6.1±1 5.4±2.2
Delta Larsen
5.4±1.1 2.8±1.2 5.4±1.1 2.6±1.1 5±1.8 3.8±1.8 5±2.2 4.6±0.9
*:p=0.006; **p=0.022. Delta: valor de la diferencia entre Larsen final y basal.
45 Tal y como ya se ha mencionado para valorar la capacidad pronóstica de las diferentes variables a la hora de predecir la destrucción articular, se catalogó la presencia de progresión de la destrucción, cuando al final del seguimiento (24 meses) hubo un incremento en el valor de Larsen superior o igual a 4 puntos (entre el mes 0 y el mes 24). Siguiendo este criterio, 39 de los 118 pacientes (33%) presentaron progresión de la destrucción articular y 79 (67%) no.
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24-04-2015
Por otro lado, el análisis bivariante de los tres anticuerpos contra péptidos citrulinados quiméricos (antiquiméricos fb/f) dio lugar a los resultados que se exponen en la Tabla 15.
5
Tabla 15
Anti péptidos quiméricos No progresión progresión valor de p
Antiquimérico fb/f-p18+ 65.7% 85.3% 0.037
Antiquimérico fb/f-p19+ 70.8% 84.8% 0.126
Antiquimérico fb/f-p22+ 69.2% 81.8% 0.182
10 Estos resultados demuestran que la proporción de pacientes con anticuerpos contra péptidos citrulinados quiméricos fibrina/filagrina es más elevada en pacientes con progresión radiológica que en pacientes que no la presentan. Es más, si atendemos a los resultados ya expuestos en el ejemplo 5 cuando se analizan los datos de progresión radiológica entre pacientes antiCCP-2 positivos y negativos (con antiquiméricos fb/f positivos o negativos), se observa cómo el comportamiento del grupo CCP-2-/quimérico+ es similar al grupo CCP-2+ (es decir, con mayor
15 progresión radiológica) y no al grupo CCP-2-Esto indica que la presencia de estos anticuerpos quiméricos determinan una mayor progresión radiológica, también en pacientes antiCCP-2 negativos. De ahí, la importancia en el diagnóstico y en el pronóstico de la enfermedad de la utilización de los péptidos quiméricos de la presente invención.
20 Por tanto, se puede comprobar a raíz de estos datos, como los anticuerpos contra péptidos citrulinados cíclicos, especialmente los anticuerpos anti CCP-2 y el antiquimérico fb/f p18, están asociados a una mayor destrucción articular y como su presencia en el momento basal va asociada a una mayor lesión radiológica a los dos años de seguimiento.
25
EJEMPLO 8: Análisis de la asociación entre anticuerpos contra péptidos citrulinados y genotipo HLADRB.
En la Tabla 16 se puede observar la frecuencia de los diferentes alelos DRB04 y DRB03, así como del epitopo reumatoide en pacientes con anticuerpos específicos frente a péptidos citrulinados.
30
Tabla 16
CCP-2+
CCP-2 p Quiméricofb/f-p18 + Quiméricofb/f-p18 p
DRB04
54.2% 17.2% 0.001 52.2% 20.8% 0.008
DRB04 homocigoto
6.9% 0% NS 5.8% 0% NS
Epitopo reumatoide
81.9% 48.3% 0.001 78.3% 62.5% NS
Epitopo reumatoide homozigoto
25% 3.4% 0.012 23.2% 0% 0.009
DRB03
11.6% 14.3% NS 11.9% 13% NS
En la tabla 16 se demuestra la asociación entre DRB04 y los anticuerpos antiCCP-2 y antiquimérico fb/f p18.

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  1. imagen1
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