ES2501190T3

ES2501190T3 - Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2501190T3
Application number: ES04821802.8T
Authority: ES
Inventors: Kathleen A. Clarkson; Fred Fenel
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2003-09-15
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2014-10-01
Anticipated expiration: 2024-09-10
Also published as: BRPI0414370A; EP1668125B1; CN101415823B; EP1668125A2; DK1668125T3; CA2538837C; CN101415823A; CA2538837A1; US7314743B2; EP1668125A4; US20060270006A1; WO2005108565A3; WO2005108565A2

Abstract

Un ácido nucleico, codificando una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácidos según se presenta en SEQ ID NO:1; donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D ; y donde la secuencia tiene mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en: (i) F93W, N97R y H144K, (ii) H144C y N92C, (iii) F180Q, H144C y N92C, (iv) V108H, (v) S65C y S 186C, (vi) H22K, F180Q, H144C y N92C; donde la posición de los aminoácidos sustituidos está numerada desde el aminoácido después de la señal y la prosecuencia.

Description

Enzimas modificadas, métodos para producir enzimas modificadas y usos de las mismas

CAMPO

[0001] Esta publicación afecta a las enzimas modificadas con una estabilidad aumentada en entornos duros 5 industriales, como una temperatura y/o un pH aumentado.

ANTECEDENTES

[0002] Las xilanasas se han descubierto en al menos cien organismos diferentes. Las xilanasas son glicosil hidrolasas que hidrolizan cadenas de xilopiranósido con uniones β-1,4. Dentro de la clasificación basada en secuencia de las familias glicosil hidrolasas establecidas por Henrissat y Bairoch (1993), la mayoría de xilanasas 10 se encuentran en las familias 10 y 11. Las características comunes para los miembros de la familia 11 incluyen una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento (Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). Las familias se han agrupado ahora, basándose en similitudes de estructura, en Clanes (Henrissat and Davies, 1995). La familia 11 de glicosil hidrolasas, que son principalmente xilanasas, residen en el Clan C junto con la familia 12 de enzimas, conocidas todas por ser

15 celulasas.

[0003] Las xilanasas pueden utilizarse a menudo para aplicaciones importantes como el blanqueamiento de la pulpa, la modificación de fibras textiles y en la alimentación animal (p.ej., las xilanasas pueden ayudar la digestión de un animal, Prade, 1996). Las xilanasas son útiles para la producción de comida para seres humanos también. Por ejemplo, la xilanasa mejora las propiedades de la masa de pan y la calidad del pan. Las xilanasas

20 también pueden ayudar en el proceso de elaboración de cerveza mejorando la filtrabilidad de las cervezas que contienen xilano. Las xilanasas pueden emplearse en la descomposición de la materia vegetativa incluyendo la eliminación/el uso de residuos agrícolas y de residuos que resultan del procesamiento de los productos agrícolas, incluyendo la producción de fueles u otros productos/materiales de base biológica a partir de la biomasa.

25 [0004] Sin embargo, a menudo las condiciones extremas en estas aplicaciones, como una temperatura y/o pH altos, etc, hacen que las xilanasas rindan con menos efectividad que bajo condiciones normales. Durante el blanqueo de pulpa, por ejemplo, el material que viene de una fase de lavado alcalino puede tener una temperatura alta, a veces mayor a 80ºC y un pH alto, como un pH más alto de 10. Ya que la mayoría de xilanasas no funcionan bien bajo esas condiciones, la pulpa debe enfriarse y el pH alcalino neutralizarse antes de

30 que la xilanasa normal pueda funcionar. Tomando algunos de estos pasos en cuenta, el proceso puede volverse más caro ya que debe alterarse para adaptar la xilanasa.

[0005] En otro ejemplo, las xilanasas también son útiles en las aplicaciones de alimentos para animales. Ahí, las enzimas pueden enfrentarse a condiciones de temperaturas altas durante un periodo corto de tiempo (p.ej. -0,5 – 5 min a 95ºC o más) durante la preparación de la alimentación. La inactivación de la enzima puede ocurrir bajo

35 estas condiciones de temperatura y las enzimas resultan inservibles cuando se necesitan a una temperatura más baja como, por ejemplo, ~37 ºC.

[0006] Se han descubierto xilanasas con cualidades mejoradas. Varias xilanasas termoestables, alcalofilas y acidofilas se han descubierto y clonado a partir de organismos termófilos (Bodie et al., 1995; Fukunaga et al., 1998). Sin embargo, suele resultar difícil producir las enzimas en cantidades económicamente eficientes. T. 40 reesei, por otra parte, produce xilanasas, que no son termoestables como las xilanasas de los organismos termófilos. T. reesei es conocido por producir xilanasas diferentes de las que las xilanasas I y II (Xynl y Xynll, respectivamente) son las mejor caracterizadas (Tenkanen et al., 1992). XynI tiene un tamaño de 19 kDa, un pl de 5,5 y un pH entre 3 y 4. Xynll tiene un tamaño de 20 kDa, un pl de 9,0 y un pH óptimo de 5,0-5,5 (Törrönen y Rouvinen, 1995). Estas xilanasas presentan un perfil de pH, especificidad y actividad específica favorables en

45 una cantidad de aplicaciones y puede producirse de manera económica en procesos de producción a gran escala.

[0007] Se han realizado esfuerzos para producir una xilanasa con cualidades favorables. Por ejemplo, algunos han intentado mejorar la estabilidad de la xilanasa Bacillus circulans añadiendo puentes de disulfuro que unen el N-término de la proteína al C-término y la parte N-terminal de la hélice-α a la hebra-β cercana (Wakarchuk et al., 50 1994). Además, Campbell et al. (1995) modificó la xilanasa Bacillus circulans mediante enlaces inter e intra moleculares de disulfuro con tal de aumentar la termoestabilidad. De manera similar, la estabilidad de la T. reesei xilanasa II ha sido mejorada al cambiar la región N-terminal a una parte respectiva de una xilanasa termófila (Sung et al., 1998). Además de la termoestabilidad mejorada, el intervalo de actividad de la enzima se amplió

para incluir un pH alcalino. Las mutaciones de punto único también se han utilizado para aumentar la estabilidad de la xilanasa Bacillus pumilus (Arase et al., 1993).

[0008] Al comparar las estructuras de las enzimas termófilas y mesófilas se ha obtenido mucha información (Vogt et al., 1997). El análisis estructural de las xilanasas termófilas también ha dado información sobre los 5 factores que influyen la termoestabilidad de la xilanasas (Gruber et al., 1998; Harris et al., 1997).

[0009] Kimura T. et al. (Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, Japan Society for Bioscience and Agrochemistry, TOKYO, JAPÓN, vol. 64, núm. 6, 1 Junio 2000, páginas 1230-123) publica la purificación, caracterización y clonación molecular de una xilanasa acidófila a partir de Penicillium sp.40.

[0010] WO02/38746 publica la secuencia de una xilanasa alcalófila a partir de Aspergillus kawachii.

10 [0011] Sin embargo, actualmente, existe una necesidad de enzimas, especialmente xilanasas con propiedades mejoradas en condiciones industriales.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0012] La presente publicación hace referencia a enzimas modificadas. Específicamente, la invención hace referencia a enzimas modificadas con un funcionamiento mejorado en condiciones extremas de pH y 15 temperatura.

[0013] En un primer aspecto, la publicación describe una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácido según se establece en la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 20 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. Preferiblemente, la sustitución se selecciona del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. Preferiblemente, la xilanasa modificada tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Además, preferiblemente, la xilanasa modificada muestra una termofilicidad, alcalofilicidad o una combinación de las mismas mejorada, en comparación con un

25 tipo silvestre de xilanasa. [0014] En un segundo aspecto, la publicación describe una enzima modificada, la enzima modificada comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia establecida en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10 , 11, 16, 19, 22,

30 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a la posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido

35 seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. [0015] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una glicosilhidrolasa del Clan C comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia establecida en SEQ ID NO:1 la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido

40 en una posición equivalente a la posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10 , 11, 16,19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38 , 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un

45 modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Las enzimas modificadas preferidas se publican aquí. [0016] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una xilanasa de familia 11 que comprende una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ

50 ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del

55 grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido

seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Las enzimas modificadas preferidas de la familia 11 se publican aquí.

[0017] En otro modo de realización preferido, la enzima modificada es una celulasa de familia 12 comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ 5 ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10 , 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38 , 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160,162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición

10 seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144,162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C, donde la posición es una posición equivalente, según se define aquí. Las enzimas modificadas preferidas de familia 12 son las publicadas aquí.

15 [0018] En un modo de realización preferido, la celulasa de familia 12 es celulasa Trichoderma EGIII según se presenta en SEQ ID NO:3, la modificación comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: 2, 13, 28, 34, 77, 80, 86, 122, 123, 134, 137, 140, 164, 174, 183, 209, 215 y 218, la numeración de posición siendo con respecto a SEQ ID NO:3. En un modo de realización preferido, la sustitución es al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en T2C, N13H, S28K, T34C, S77C, P80R, S86C, G122C,

20 K123W, Q134H, Q134K, Q134R, V137H, G140C, N164C, N164K, N174C, K183H, N209C, A215D y N218C, la numeración de posición siendo con respecto a SEQ ID NO:3.

[0019] Los modos de realización del primer y segundo aspecto, según se publica arriba, también proporcionan ácidos nucleicos codificando cualquiera de las enzimas modificadas, según se presenta arriba, así como complementos. En otro modo de realización preferido, la publicación proporciona composiciones que

25 comprenden al menos una enzima modificada, según se publica aquí y otro ingrediente. En otro modo de realización preferido, la publicación describe vectores que comprenden una enzima modificada, según se publica aquí, las células comprendiendo la enzima modificada y métodos de expresar la enzima modificada.

[0020] En un tercer aspecto, la publicación describe un método para modificar una enzima que comprende modificar un primer sitio en la enzima para que el primer sitio pueda unirse a un segundo sitio en la enzima. En

30 un modo de realización preferido, el primer sitio es un lazo o secuencia adyacente a una lámina-β. En un modo de realización preferido, el segundo sitio se sitúa en una lámina-β.

[0021] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una xilanasa. Por ejemplo, en un modo de realización favorito, la publicación describe una xilanasa modificada, donde la xilanasa está modificada por al menos uno de los siguientes métodos: (i) modificando una secuencia N-terminal para que la secuencia N35 terminal se una mediante un puente de disulfuro a una hebra-β adyacente; (ii) modificando una secuencia Cterminal para que la secuencia C-terminal se una se una a una hebra-β adyacente; (iii) modificando una hélice-α

o secuencia adyacente a una hélice-α, para que la hélice-α, o una secuencia adyacente a la hélice-α se una más firmemente al cuerpo de la proteína; (iv) modificando una secuencia adyacente a la hebra-β para que la secuencia adyacente a la hebra-β pueda unirse más firmemente a una secuencia adyacente. Por ejemplo, en un

40 modo de realización preferido, la modificación puede ocurrir en una hebra-β cerca del cordón.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0022]

La figura 1 muestra una alineación de aminoácido entre la familia 11 de xilanasas. La numeración de aminoácido se compara con la T.Reesei xilanasa II, según se indica en la parte superior de las secuencias. 45 Los residuos comunes al menos a un 75% de la familia 11 de xilanasas están subrayados. Los siguientes están alineados (por abreviatura) en la figura: XYN2_TRIRE Endo-1,4-betaxilanasa 2 precursor (EC 3.2.1.8) (Xilanasa 2) (1,4-beta-D-xilano xilanohidrolasa 2) -Trichoderma reesei (Hypocreajecorina) >sp|P36217|; XYN1_TRIRE Endo-1,4-beta-xilanasa 1 precursor (EC 3.2.1.8) (Xylanase 1) (1,4-beta-Dxylan xylanohydrolase 1) -Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) >sp|P36218|; XYN2_BACST Endo-1,450 betaxilanasa precursor (EC 3.2.1.8) (Xilanasa) (1,4-beta-D-xilano xilanohidrolasa) -Bacillus stearothermophilus >sp|P457031; XYN1_HUMIN Endo-1,4-beta-xilanasa 1 precursor (EC 3.2.1.8) (Xilanasa 1) (1,4-beta-D-xylan xilanohidrolasa 1) -Humicola insolens >sp|P55334|; XYN1_ASPAW Endo-1,4-betaxilanasa I precursor (EC 3.2.1.8)(Xilanasa I) (1,4-beta-D-xilano xilanohidrolasa I) -Aspergillus awamori >sp|P55328|; XYNA_BACST Endo-1,4-beta-xilanasa A precursor (EC 3.2.1.8) (Xilanasa A) (1,4-beta-D-xylan

55 >sp|P45705|.

La figura 2 muestra una alineación de aminoácido de la familia 12 de celulasas con Xynll. Las siguientes se alinean (por abreviatura) en la figura: 1ENX XylanaseII Trichoderma reesei, y miembros de la familia cel12 Q8NJY2 Aspergillus awamori, Q8NJY3 Humicola grisea, Q8NJY4 Trichoderma viride, Q8NJY5 Hypocrea koningii, Q8NJY6 Hypocrea schweinitzii, Q8NJY7 Stachybotrys echinata, Q8NJY8 Bionectria ochroleuca,

5 Q8NJY9 Bionectria ochroleuca, Q8NJZ0 Bionectria ochroleuca, Q8NJZ1 Bionectria ochroleuca, Q8NJZ2 Fusarium solani (subsp. Cucurbitae), Q8NJZ3 Fusarium solani (subsp. cucurbitae), Q8NJZ4 Fusarium equiseti (Fusarium scirpi), Q8NJZ5 Emericella desertorum, Q8NJZ6 Chaetomium brasiliense, Q9KIH1 Streptomyces sp. 11AG8. En la figura, las dos flechas indican la posición de los puentes de disulfuro (secuencia de señal no eliminada).

10 La figura 3 muestra la secuencia nucleótida de Trichoderma reesei oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis de la xilanasa, con los cambios de codón subrayados.

La figura 4 muestra un gráfico que compara la actividad con respecto a la temperatura del tipo-silvestre Xynll con las xilanasas mutadas Y2 e Y5. Las xilanasas mutadas tienen las siguientes mutaciones: K58R y un ácido aspártico añadido a la serina C-terminal en la posición 190 (+191D) (=Y2); T2C, T28C, K58R +191D,

15 (=Y5). La figura ejemplifica que un puente salino, sólo, no aumenta la termofilicidad ni la estabilidad térmica. En su lugar, la introducción de un puente de disulfuro aumenta la estabilidad y temperatura dependiendo de la actividad. La actividad se mide según Bailey at el., 1992.

La figura 5 muestra un gráfico comparando la actividad con respecto al pH del tipo silvestre de Xynll con la xilanasa mutada Y5 con las siguientes mutaciones: T2C, T28C, K58R con un ácido aspártico añadido a la

20 serina C-terminal posición 190 (+191D). La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 6 muestra un gráfico que compara la actividad con respecto a la temperatura del tipo silvestre de Xynll con la xilanasa mutada Y5 con las siguientes mutaciones: T2C, T28C, K58R con un ácido aspártico añadido a la serina C-terminal posición 190 (+191D). La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 7 muestra un gráfico comparando la actividad residual con pH 5,0, con la inactivación con pH 8 con

25 respecto a la temperatura del tipo silvestre de Xynll xilanasa con la xilanasa mutada Y5 teniendo las siguientes mutaciones: T2C, T28C, K58R con un ácido aspártico añadido a la serina C-terminal posición 190 (+191D). La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 8 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5,3, con la inactivación en pH 8 con respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una Xynll xilanasa (SS105/162) teniendo las

30 siguientes mutaciones adicionales Q162C y L105C. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 9 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5, con la inactivación en pH 9 con respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una Xynll xilanasa (P9) teniendo las siguientes mutaciones adicionales: F93W, N97R y H144K. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 10 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5, con inactivación en pH 5 con

35 respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una Xynll xilanasa (P12) teniendo las siguientes mutaciones adicionales H144C y N92C. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 11 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5, con la inactivación en pH 9 con respecto a una temperatura de la xilanasa Y5 con una Xynll xilanasa (P12) teniendo las siguientes mutaciones adicionales H144C y N92C. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

40 La figura 12 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5,2 con la inactivación en pH 8 respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una xilanasa Xynll (P15) teniendo las siguientes mutaciones adicionales: F180Q, H144C y N92C. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 13 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5, con la inactivación en pH 8 con respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una xilanasa Xynll (P21) teniendo las siguientes

45 mutaciones adicionales: H22K, F180Q, H144C y N92C. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 14 muestra un gráfico comparando la actividad residual en pH 5,17, con la inactivación en pH 7,8 con respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una Xynll xilanasa (P20) teniendo las siguientes mutaciones adicionales: H22K y F180Q. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 15 muestra un gráfico comparando la actividad en pH 8, con respecto a la temperatura de la

50 xilanasa mutada Y5 con una xilanasa Xynll (J17) teniendo las siguientes mutaciones adicionales: V108H. La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 16 muestra un gráfico comparando la actividad en pH 8, con respecto a la temperatura de la xilanasa mutada Y5 con una xilanasa Xynll (J21) teniendo las siguientes mutaciones adicionales: S65C y S186C (J21 en el gráfico). La actividad se mide según Bailey et al., 1992.

La figura 17 muestra una alineación estructural de Trichoderma reesei xylanaseII (XynII, PDB 1 ENX, en 5 azul;) y Trichoderma reesei endoglucanaseIII (Cal12A, PDB 1H8V, en rojo).

La figura 18 establece un aminoácido nucleótido de secuencia de Xynll.

La figura 19 establece un aminoácido nucleótido de secuencia de EGIII.

La figura 20 establece un aminoácido nucleótido de secuencia de Xynll.

Descripción detallada de los modos de realización preferidos

10 [0023] A no ser que se defina lo contrario aquí, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se suele entender por alguien con un conocimiento normal de la técnica. Singleton. et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan un diccionario general de muchos términos utilizados en esta publicación. Pese a que cualquier

15 método y material similar o equivalente a aquellos aquí descritos pueden utilizarse en la práctica o en los ensayos, se describen los métodos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A no ser que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los practicantes se dirigen particularmente a Sambrook et al., 1989, y

20 Ausubel FM et al., 1993, para definiciones y términos de la técnica. Debe entenderse que esta publicación no está limitada a la metodología particular, protocolos y reactivos descritos, ya que pueden cambiar.

[0024] Los títulos aquí proporcionados no son limitaciones de los varios aspectos o modos de realización que pueden tenerse como referencia a la especificación en su totalidad. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente debajo son definidos con más detalle con referencia a la especificación en su totalidad.

25 [0025] Según se utiliza aquí, el término “polipéptido” hace referencia a un compuesto elaborado de una única cadena de residuos de aminoácidos unidos por enlaces péptidos. El término “proteína” aquí puede ser sinónimo del término “polipéptido” o puede hacer referencia, además, a un complejo de dos o más polipéptidos.

[0026] Según se utiliza aquí, el término “expresión” hace referencia al proceso por el que un polipéptido se produce basándose en la secuencia de ácido nucleico del gen. El proceso incluye tanto la transcripción como la

30 traducción.

[0027] Según se utiliza aquí, el término “gen” se refiere al segmento de ADN involucrado en producir una cadena de polipéptido, que puede incluir o no regiones que preceden o siguen a la región de codificación.

[0028] Según se utiliza aquí, con referencia a una numeración de posición, el término “equivalente” hace referencia a posiciones según se determina mediante las alineaciones de secuencia y estructura con 35 Trichoderma reesei xilanasa II (xynII) como una secuencia de referencia o una estructura de referencia, según se proporciona aquí (véase, por ejemplo, la figura 2 para una alineación de secuencia múltiple y Trichoderma reesei xilanasaII con otras secuencias y la figura 17 para una alineación estructural de Trichoderma reesei Xyn II con Trichoderma reesei endoglucanasaIII). La numeración de posición deberá ser con respecto a Trichoderma reesei xynII, según se establece en SEQ ID NO:1. El sistema de numeración, pese a que puede utilizar una secuencia

40 específica como un punto de referencia base, también es aplicable a todas las secuencias homólogas relevantes. La homología de secuencia entre proteínas puede determinarse utilizando programas de alineación reconocidos y según se describe aquí utilizando técnicas de hibridación aquí descritas.

[0029] Según se utiliza aquí, el término “adyacente” hace referencia a una proximidad cercana lineal y/o espacial cercana entre los residuos de aminoácido o regiones o áreas de una proteína. Por ejemplo, un primer residuo o 45 una primera región o una primera área que es adyacente a un segundo residuo o una segunda región o una segunda área (en un sentido lineal), respectivamente, deberá tener preferiblemente aproximadamente 7, preferiblemente aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 2 residuos de aminoácido que intervienen entre ellos. De manera alternativa, por ejemplo, cuando un primer conjunto de residuos o una primera región o un primer área es adyacente a un segundo conjunto de residuos o una segunda región o un segundo 50 área, entonces el primer conjunto de residuos o primera región o primer área puede ser proximal (en espacio, según se muestra, por ejemplo, mediante la estructura terciaria de una proteína) al segundo conjunto de residuos

o segunda región o segunda área. Alguien especializado en la técnica, cuando fuera posible, sabría cómo solucionar la estructura terciaria de una proteína.

[0030] Según se utiliza aquí, con referencia a las posiciones de secuencia, la designación “+” seguida por un entero significa que un polipéptido ha sido modificado para incluir aminoácidos adicionales en la posición 5 putativa, según se especifica mediante el entero. Por ejemplo, la designación +191 significa que un polipéptido que normalmente tiene 190 aminoácidos en la secuencia de aminoácido tiene un aminoácido añadido.

[0031] Según se utiliza aquí, el término “molécula de ácido nucleico” incluye moléculas de ARN, ADN y ADNc. Se entenderá que como resultado de la degeneración del código genético, pueden producirse una multitud de secuencias nucleótidas que codifican una proteína dada, como las proteínas mutantes aquí descritas.

10 [0032] Según se utiliza aquí, el término “puente de disulfuro” o “enlace de disulfuro” hace referencia al enlace formado entre los átomos de sulfuro y los residuos de cisteína en un polipéptido o una proteína. En esta publicación, un puente de disulfuro o enlace de disulfuro puede no ocurrir de manera natural y ser introducido mediante mutación de punto.

[0033] Según se utiliza aquí, el término “puente salino” hace referencia al enlace formado entre residuos

15 cargados de manera opuesta, los aminoácidos en un polipéptido o proteína. En esta publicación, un puente salino puede no ocurrir de manera natural e introducirse mediante mutación de punto.

[0034] Según se utiliza aquí, una “enzima” hace referencia a una proteína o polipéptido que cataliza una reacción química.

[0035] Según se utiliza aquí, el término “actividad” hace referencia a una actividad biológica asociada a una

20 proteína particular, como una actividad enzimática asociada a una proteasa. La actividad biológica hace referencia a cualquier actividad que normalmente le atribuiría a esa proteína alguien especialista en la técnica.

[0036] Según se utiliza aquí, el término “xilanasa” hace referencia a glicosil hidrolasas que hidrolizan cadenas de xilopiranosida con uniones β-1,4.

[0037] Según se utiliza aquí, el término “Xynl” hace referencia a Trichoderma reesei xilanasa, xilanasa I. Xynl 25 tiene el tamaño de 19 kDa, un pl de 5,5 y un pH óptimo entre 3 y 4.

[0038] Según se utiliza aquí, “Xynll” hace referencia a Trichoderma reesei xilanasa, xilanasa II. Xynll tiene un tamaño de 20 kDa, un pl de 9,0 y un pH óptimo entre 5 y 5,5.

[0039] Según se utiliza aquí, “xilopiranosida” hace referencia a un polímero de xilosa con uniones β-1,4, incluyendo polímeros sustituidos de xilosa, es decir, polímeros de xilofiranosa ramificados con uniones β-D-1,4,

30 altamente sustituidos con grupos acetilo, arabinosil y uronil (véase, por ejemplo, Biely, P. (1985) Microbial Xylanolytic Systems. Trends Biotechnol., 3, 286-290.).

[0040] Según se utiliza aquí, el término “glicosil hidrolasa” hace referencia a una enzima que hidroliza el enlace glicosidico entre dos o más carbohidratos o entre un carbohidrato y una fracción no carbohidrato. La hidrólisis enzimática del enlace glicosídico se produce mediante la catálisis de ácido general y requiere dos residuos

35 críticos: un donante protón y un nucleófilo/base. La nomenclatura enzimática IUB-MB de las glicosil hidrolasas se basa en la especificidad del sustrato y ocasionalmente en el mecanismo molecular.

[0041] Según se utiliza aquí, el término “hidrolizar” hace referencia a una enzima que cataliza una reacción donde un enlace químico se adhiere de manera enzimática con la adición de una molécula de agua.

[0042] Según se utiliza aquí, “hidrólisis” hace referencia al proceso de reacción por la que un enlace químico se 40 adhiere con la adición de una molécula de agua.

[0043] Según se utiliza aquí, “Clan C” hace referencia a agrupaciones de familias que comparten un pliegue tridimensional y una maquinaria catalítica idéntica (véase, por ejemplo, Henrissat, B. y Bairoch, A., (1996) Biochem. J.,316, 695-696).

[0044] Según se utiliza aquí, “familia 11” hace referencia a una familia de enzimas según se establece por

45 Henrissat y Bairoch (1993) Biochem J.,293, 781-788 (véase también, Henrissat y Davies (1997) Current Opinion in Structural Biol. 1997, &:637-644). Las características comunes para los miembros de la familia 11 incluyen una alta homología genética, un tamaño de aproximadamente 20 kDa y un mecanismo catalítico de doble desplazamiento (véase Tenkanen et al., 1992; Wakarchuk et al., 1994). La estructura de la familia 11 de xilanasas incluye dos grandes láminas-β elaboradas con hebras-β y hélices-α. La familia 11 de xilanasas

incluyen lo siguiente: Aspergillus niger XynA, Aspergillus kawachii XynC, Aspergillus tubigensis XynA, Bacillus circulans XynA, Bacillus pumilus XynA, Bacillus subtilis XynA, Neocallimastix patriciarum XynA, Streptomyces lividans XynB, Streptomyces lividans XynC, Streptomyces thermoviolaceus XynII, Thermomonospora fusca XynA, Trichoderma harzianum Xyn, Trichoderma reesei XynI, Trichoderma reesei XynII, Trichoderma viride Xyn.

5 [0045] Según se utiliza aquí, la “familia 12” hace referencia a una familia de enzimas establecida por Henrissat y Bairoch (1993) en la que glicosil hidrolasas conocidas se clasificaron en familias basadas en similitudes de las secuencias de aminoácido. Hasta la fecha, todas las enzimas de la familia 12 son celulasas. Las enzimas de la familia 12 hidrolizan el enlace glucosídico con uniones β-1,4 en la celulosa mediante una reacción de doble desplazamiento y un intermediario de glucosil-enzima que resulta en una retención de la configuración anomérica

10 del producto. Los estudios estructurales de los miembros de familia 12 revelan una estructura compacta tipo sándwich-β que se curva para crear un extenso sitio de enlace en el sustrato sobre la cara cóncava de la láminaβ.

[0046] Según se utiliza aquí, el término “proteasa” hace referencia a una enzima que se degrada hidrolizando al menos algunos de sus enlaces péptidos.

15 [0047] Según se utiliza aquí, “enlace péptido” hace referencia al enlace químico entre el grupo carbonil de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido.

[0048] Según se utiliza aquí, “tipo silvestre” hace referencia a una secuencia o una proteína que es nativa u ocurre de manera natural.

[0049] Según se utiliza aquí, “mutación de punto” hace referencia a un cambio en un único nucleótido de ADN, 20 especialmente donde ese cambio resulta en un cambio en una proteína.

[0050] Según se utiliza aquí, “mutante” hace referencia a una versión de un organismo o proteína donde la versión es otra diferente al tipo silvestre. El cambio puede verse afectado por métodos bien conocidos por aquellos especialistas en la técnica, por ejemplo, mediante mutación de punto en la que la proteína resultante puede referirse como una mutante.

25 [0051] Según se utiliza aquí, “mutagénesis” hace referencia al proceso que produce un cambio de tipo silvestre a mutante.

[0052] Según se utiliza aquí, “sustituido” y “modificado” se utilizan de manera intercambiable y se refieren a una secuencia, como una secuencia de aminoácido que comprende un polipéptido, que incluye la supresión, inserción, reemplazo o interrupción de una secuencia que ocurre de manera natural. A menudo en el contexto de

30 la invención, una secuencia sustituida se refiere, por ejemplo, al reemplazo de una secuencia que ocurre de manera natural.

[0053] Según se utiliza aquí, “enzima modificada” hace referencia a una enzima que incluye la supresión, inserción, reemplazo o interrupción de una secuencia que ocurre de manera natural.

[0054] Según se utiliza aquí, “hebras-β” hace referencia a esa parte de una secuencia de aminoácido que forma 35 una secuencia lineal que ocurre en una lámina-β.

[0055] Según se utiliza aquí, “láminas-β” hace referencia a una estructura de tipo lámina que resulta cuando los aminoácidos de hidrógeno se enlazan entre ellos para formar una estructura tipo lámina.

[0056] Según se utiliza aquí, “hélice-α” hace referencia a la estructura que resulta cuando una única cadena de polipéptido gira sobre sí misma regularmente para hacer un cilindro rígido en el que cada enlace péptido es

40 hidrógeno regular unido a otros enlaces péptidos en la cadena cercana.

[0057] Según se utiliza aquí, “pulgar” hace referencia a un lazo entre las hebras-β B7 y B8 en Xynl y en XynlI (véase, por ejemplo, en Torronen, A. y Rouvinen, J.; Biochemistry 1995, 34, 847-856).

[0058] Según se utiliza aquí, “cordón” hace referencia a un lazo entre las hebras-β B7 y B8 que hacen un pulgar y una parte del lazo entre las hebras-β B6a y B9 que cruzan la grieta en un lado (véase, por ejemplo, Torronen,

45 A. y Rouvinen, J.; Biochemistry 1995, 34, 847-856).

[0059] Según se utiliza aquí, “alcalino” hace referencia al estado o cualidad de ser básico.

[0060] Según se utiliza aquí, “alcalofilo” hace referencia a la cualidad de ser más robusto en una atmósfera alcalina que un miembro no alcalofilo. Por ejemplo, un organismo alcalofilo hace referencia a un organismo que

sobrevive o prospera bajo condiciones alcalinas donde un organismo normal no puede, y una proteína alcalofila es una cuya actividad es activa o más robusta bajo condiciones alcalinas donde una proteína normal sería menos activa.

[0061] Según se utiliza aquí, “ácido” hace referencia al estado o cualidad de ser ácido.

5 [0062] Según se utiliza aquí, “acidófilo” hace referencia a la cualidad de ser más robusto en una atmósfera ácida que un miembro no acidófilo. Por ejemplo, un organismo acidófilo hace referencia a un organismo que sobrevive

o prospera bajo condiciones ácidas donde un organismo normal no puede, y una proteína acidófila es una cuya actividad es activa o más robusta bajo condiciones ácidas donde una proteína normal sería menos activa.

[0063] Según se utiliza aquí, “termoestable” hace referencia a la cualidad de ser estable en una atmósfera que 10 implica temperatura. Por ejemplo, un organismo termoestable es uno que es más estable bajo condiciones de temperatura específicas que un organismo no termoestable.

[0064] Según se utiliza aquí “termoestabilidad” hace referencia a la cualidad de ser termoestable.

[0065] Según se utiliza aquí “termófilo” hace referencia a la cualidad de ser más robusto en una atmósfera caliente que un miembro no termófilo. Por ejemplo, un organismo termófilo hace referencia a un organismo que

15 sobrevive o prospera bajo condiciones calientes donde un organismo normal no puede, y una proteína termófila es una cuya actividad es activa o más robusta bajo condiciones calientes donde una proteína normal sería menos activa.

[0066] Según se utiliza aquí, “mesófilo” hace referencia a la cualidad de ser más robusto en una atmósfera normal que un miembro no mesófilo. Por ejemplo, un organismo mesófilo hace referencia a un organismo que 20 sobrevive o prospera bajo condiciones normales donde otro organismo no puede, y una proteína mesófila es una cuya actividad es activa o más robusta bajo condiciones normales donde otra proteína sería menos activa.

[0067] Según se utiliza aquí, “oligonucleótidos” hace referencia a una secuencia nucleótida corta que puede utilizarse, por ejemplo, como un cebador en una reacción utilizada para crear proteínas mutantes.

[0068] Según se utiliza aquí “codón” hace referencia a una secuencia de tres nucleótidos en una molécula de 25 ADN o de ARNm que representa la instrucción para incorporar un aminoácido específico en una cadena de polipéptido.

[0069] Según se utiliza aquí “Y5” hace referencia a una xilanasa mutante según se publica, por ejemplo, en la publicación número WO 01/27252.

[0070] Según se utiliza aquí, las siguientes designaciones hacen referencia a los siguientes mutantes:

30 "P2" = N97R + H144K / Y5 "P3" = F93W + H144K en Y5 "P8" = F180Q en Y5 "P9" = N97R in F93W + H144K en Y5 "P12" = H144C + N92C en Y5

35 "P15" = F180Q en H144C + N92C en Y5 "P16" = N97R en H144C + N92C en Y5 "P18" = H22K en Y5 "P20" = H22K + F 180Q in Y5 "P21" = H22K + F180Q + H144C + N92C en Y5

40 "J17" = V108H en Y5 "J21" = S65C + S186C en Y5

donde la numeración de posición es con respecto a Xynll.

[0071] La presente publicación hace referencia a enzimas modificadas con un funcionamiento mejorado en condiciones extremas, como la temperatura y el pH.

45 [0072] En un primer aspecto, la publicación describe una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácido según se presenta en SEQ ID NO:1, donde la secuencia tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191, donde la numeración de posición es con respecto a

50 SEQ ID NO:1. Preferiblemente, la sustitución se selecciona del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93,

97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. Preferiblemente, la xilanasa modificada tiene al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Además, preferiblemente, la xilanasa modificada muestra una termofilia, alcalofilia o una combinación de estas mejoradas, en comparación con una xilanasa de tipo silvestre.

5 [0073] En un segundo aspecto, la publicación describe una enzima modificada, la enzima modificada comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a la posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 44, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149,

10 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191, donde la numeración de posición es con respecto a SEQ ID NO:1. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición

15 seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C.

[0074] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una glicosil hidrolasa del Clan C

20 comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, , 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 110, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la

25 secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Las enzimas modificadas preferidas son según se publican aquí.

30 [0075] En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una xilanasa de familia 11 que comprende una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160,

35 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y

40 S186C. Las enzimas de familia 11 modificadas preferidas son según se publican aquí.

[0076] En otro modo de realización preferido, la enzima modificada es una celulasa de familia 12 comprendiendo una secuencia de aminoácido, la secuencia de aminoácido siendo homóloga a la secuencia presentada en SEQ ID NO:1, la secuencia de aminoácido teniendo al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 5, 7, 10, 11, 16, 19, 22, 26, 28, 29, 30, 34, 45 36, 38, 57, 58, 61, 63, 65, 67, 92, 93, 97, 105, 108, 110, 111, 113, 132, 143, 144, 147, 149, 151, 153, 157, 160, 162, 165, 169, 180, 184, 186, 188, 190 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido en una posición equivalente a una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2, 22, 28, 58, 65, 92, 93, 97, 105, 108, 144, 162, 180, 186 y +191. En un modo de realización preferido, la secuencia de aminoácido tiene al menos un residuo de aminoácido sustituido

50 seleccionado del grupo que consiste en: H22K, S65C, N92C, F93W, N97R, V108H, H144C, H144K, F180Q y S186C. Las enzimas de familia 12 modificadas preferidas son según se publicada aquí.

[0077] En un modo de realización preferido, la celulasa de familia 12 es Trichoderma EGIII celulasa según se presenta en SEQ ID NO:3, la modificación comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: 2, 13, 28, 34, 77, 80, 86, 122, 123, 134, 137, 140, 164, 174, 183, 209, 215 y 218, la numeración de

55 posición siendo con respecto a SEQ ID NO:3. En un modo de realización preferido, la sustitución es al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en T2C, N13H, S28K, T34C, S77C, P80R, S86C, G122C, K123W, Q134H, Q134K, Q134R, V137H, G140C, N164C, N164K, N174C, K183H, N209C, A215D y N218C, , la numeración de posición siendo con respecto a SEQ ID NO:3.

[0078] Xynll muestra una homología de aminoácido significativa con otros miembros de familia 11, aproximadamente 20-90%, así como una similitud estructural general. La homología, según se utiliza aquí, puede estar determinada por alguien especializado en la técnica; específicamente, se contemplan las homologías de al menos 20%, preferiblemente 30% o más, preferiblemente 40% o más, preferiblemente 50% o más, 5 preferiblemente 60% o más, preferiblemente 70% o más, preferiblemente 80% o más, preferiblemente 90% o más, preferiblemente 95% o más y preferiblemente 97% o más (según se calcula en el nivel de aminoácido y el nivel nucleótido y según se utiliza aquí). Existen similitudes estructurales entre las enzimas de familia 11 y de familia 12. Las proteínas beta tienen dos láminas beta apiladas y una hélice alfa envasada contra una de las láminas beta formando una estructura de rollo llamada “beta-jelly”. (véase Stirk, H.J., Woolfson, D.N., Hutchison,

10 E.G. y Thornton, J.M. (1992) Depicting topology and handedness in jellyroll structures. FEBS Letters 308 p1-3).

[0079] Basándose en esta similitud estructural, ambas familias de enzimas han sido asignadas a una “súper familia” llamada Clan C (véase Sandgren, M. et. al., J. Mol. Bio. (2001) 308, 295-310.)).

[0080] Pese a que la homología de secuencia entre las familias 11 y 12 es baja, la similitud estructural general de las dos familias es destacable según se ve al comparar las figuras 2 y 16. La longitud de los lazos que 15 conectan las dos láminas-beta comprende las mayores diferencias estructurales entre las familias (Sandgren et. al., J. Mol., Biol., 2001). Actualmente, ninguna enzima de familia 11 es conocida por contener puentes de disulfuro N terminal mientras que muchas celulasas de familia 12, en general parecen contener un puente de disulfuro cerca del N-término (p.ej., entre los residuos 4 y 32 en T. reesei Cel 12A). Ese puente de disulfuro en las enzimas de familia 12 se sitúa cerca de la posición donde un disulfuro se introdujo en la VARIANTEe 20 Trichoderma (Y5), pese a estar lejos del N-término (véase, por ejemplo, la publicación WO 01/27252). La importancia de una restricción que estabilice la región N-terminal de las enzimas de familia 11 se examinó en Trichoderma reesei xylanase II (XynII). Al insertar un puente de disulfuro no natural entre los residuos (TSC y T28C), se consiguió un aumento en Tm de 11ºC. En estas dos familias de estructura similar, la familia 11 y la familia 12, los puentes de disulfuro N-terminal juegan roles similares en cuanto a la estabilidad. Esto se ha

25 demostrado reemplazando la cisteína en la posición 32 con una alanina en Cel12A resultando en una disminución significativa en Tm de 18,5ºC. De manera interesante, la magnitud del cambio en la estabilidad por añadir un disulfuro N-terminal no natural en Xynll es comparable a la de extraer uno natural de Cel 12A (véase la tabla A).

Tabla A

Enzima: Delta Tm Tm (grados C)

WT Cel12A: 54,4

C32A: -18,5 35,9

WT xynII: 58,6

Y5: +10,7 69,3

30 La tabla A muestra las temperaturas de fundición, Tm del tipo silvestre de Cel12A comparado con la VARIANTEe con la sustitución en la posición 32 y el tipo silvestre XynlI comparado con la VARIANTEe Y5 de esta enzima.

[0081] Las estructuras tridimensionales de los puentes de disulfuro N-terminal de las tres estructuras públicamente conocidas para las glicosil hidrolasas de familia 12 (Trichoderma reesei-PDB 1H8V, Aspergillus niger-PDB 1KS5, Streptomyces lividans-PDB 2NLR), muestran un cambio en la posición del puente de disulfuro 35 en comparación con el puente de disulfuro no natural en los sitios 2 y 28 en xilanasa Y5. La Tabla B muestra la posición del puente de disulfuro en una xilanasa Y5 (“PDB 1ENX" siendo una xilanasa Xynll de tipo silvestre) y en las tres estructuras de familia conocidas 12. Las posiciones estructurales de las mutaciones en 2 y 28 de xilanasa Y5 pueden traducirse en los residuos correspondientes en las estructuras Cel 12. En cada caso, el disulfuro no nativo de Y5 está más cercano al N-término; y para la estructura de A. niger (PDB 1KS5) un disulfuro

40 podría diseñarse para utilizar el residuo N-terminal por sí mismo (en residuos Q1C, V35C, de acuerdo con la numeración de A. niger). En lugar de estar limitado por la secuencia natural, los datos de rayos x podrían utilizarse para diseñar extensiones y truncamientos del N-término para facilitar disulfuros no nativos que se adhieren específicamente a los nuevos residuos N-terminal.

Tabla B

Código: WTN-terminal S-S posición Sitio correspondiente a 228 en xynll Donde(de acuerdo con la estructura) podría una S-S insertarse en la Nterminal

PDB 1ENX: No -

Y5: C2-C28 T2-T28 T2C-T28C

PDB 1H8V: C4-C32 T2-T34 T2C-T34C

PDB 1KS5: C4-C32 T2-Y34 Q1C-V35C

PDB 2NLR: C5-C31 T3-T33 T3C-T33C

[0082] Un gran número de secuencias de familia 12 (Tabla C) son conocidas por poder estar estabilizadas potencialmente a través de un puente de disulfuro N-terminal, particularmente aquellas moléculas donde un puente de disulfuro no nativo podría introducirse o un disulfuro nativo podría moverse más cerca de un N5 término. La Tabla C enumera una serie de secuencias donde la extracción predecible se la secuencia de señal produce secuencias de proteína madura muy similares a aquellas de la conocida familia 12 de estructuras. La Tabla C también enumera la distancia entre las dos cisteínas N-terminal (26-28 aminoácidos) similares al enlace de disulfuro de Y5. En las predicciones de división de sitio, unas secuencias de señal se eliminan en teoría mediante parámetros conocidos declarados (véase, por ejemplo, "Identification of prokaryotic and eukaryotic

10 signal peptides and prediction of their cleavage sites". Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak and Gunnar von Heijne, Protein Engineering 10, 1-6 (1997)).

[0083] Un gran grupo de secuencias de estructuras tridimensionales desconocidas en la Tabla C caen dentro del grupo estructuralmente similar de las enzimas de familia 12, que tienen de manera similar un residuo de cisteína en la N-terminal en el sitio 5 +/-2 residuos, formando un puente de disulfuro con residuo 32 +/-7, para que la

15 primera hebra beta o hebras de la lámina beta puedan unirse a la lámina beta adyacente. Todas estas secuencias podrían tratarse de la manera descrita en el debate en torno a la Tabla B para mejorar la estabilidad.

Tabla C

ID: Secuencia Eucariota/Gram/Gram+ Sitio de división pronosticada Número de cisteína adecuada (1ª en enlace ss) aa’s hacia la 2ª cisteína en el enlace ss

Q8NJY2: Endoglucanasa{GEN:CEL12B} Aspergillus awamori (var. kawachi) Eu 16-17 6 28

Q8NJY4: Endoglucanasa{GEN:CEL12A} -Trichoderma viride Eu 16-17 4 28

Q8NJY5: Endoglucanasa{GEN:CEL12A} -Hypocrea koningii Eu 16-17 4 28

Q8NJY6: Endoglucanasa{GENE:CEL12A} -Hypocrea schweinitzii Eu 16-17 4 28

Q8NJY7: Endoglucanasa{GENE:CEL12A} -Stachybotrys echinata Eu 16-17 4 28

Q8NJY8: Endoglucanasa{GEN:CEL12D} -Bionectria ochroleuca Eu 17-18 4 28

Q8NJY9: Endoglucanasa{GEN:CEL12C} -Bionectria ochroleuca Eu 17-18 3 28

Q8NJZ1: Endoglucanasa{GEN:CEL12A} -Bionectria ochroleuca Eu 18-19 4 28

Q8NJZ4: Endoglucanasa{GEN:CEL12A} -Fusarium equiseti (Fusarium scirpi) Eu 17-18 4 28

Q9KIH1: Cellulasa 12A{GEN:CEL12A} -Streptomyces sp. 1AG8 Gram+ 31-32 5 26

[0084] La tabla D enumera además un número de secuencias de enzimas de familia 12 con una secuencia de

20 señal sin descomponerse. Todas tienen cisteínas 30-39 aminoácidos aparte, y tras la extracción de la secuencia de señal (la extracción puede realizarse como en la tabla C) son capaces estructuralmente de formar un puente de disulfuro en la N-terminal (según se muestra en las estructuras públicamente conocidas, véase la tabla B). El sitio de mutación propuesto tiene correlación con el sitio correspondiente del puente de disulfuro entre los sitios 2-28 del mutante Y5. Las secuencias de glicosil hidrolasa se alinearon utilizando el programa MOE (de Chemical

25 Computing Corp) utilizando métodos de casación de secuencia estándar.

Tabla D

Código de secuencia: Enzima Especies Mutaciones

Tr O94218: Cel 12 Aspergillus aculeatus D22C/ G52C

Sp P22669: Cel 12 Aspergillus aculeatus Q20C/ T52C

Sp Q12679: Cel 12 Aspergillus awamori T18C/ Y50C

Tr O13454: Cel 12 Aspergillus oryzae E18C/ Y50C

Sp P16630: Cel 12 Erwina carotovora A32C/ I68C

Tr O31030: Cel 12 Pectobacterium carotovora A32C/ V68C

Tr Q9V2TO: Cel 12 Pyrococcus furiosus P57C/ T96C

Tr O33897: Cel 12 Rhodothermus marinus E40C / E70C

Tr Q9RJY3: Cel 12 Streptomyces coelicolor T43C/ T73C

Tr O08468: Cel 12 Streptomyces halstedii L40C/ T70C

Tr Q59963: Cel 12 Streptomyces rochei T40C/ T70C

Tr Q9KIH1: Cel 12 Streptomyces sp. 11AG8 Q34C/ N64C

Tr Q60032: Cel 12 Thermotoga maritima V2C/ K38C

Tr Q60033: Cel 12 Thermotoga maritime V20C/ K56C

Tr O08428: Cel 12 Thermotoga neopolitana V2C/ R38C

Tr P96492: Cel 12 Thermotoga neopolitana V20C / K56C

AF435072: Cel12A Aspergillus Kawachi Q20C / T52C

AF434180: Cel12A Chaetium brasilience S28C/ Y61C

AF434181: Cel12A Emericella desertorum D30C/ G63C

AF434182: Cel12A Fusarium equiseti D19C/ H51C

AF434183: Cel12A Nectria ipomoeae Q25C / T58C

AF434184: Cel12B Nectria ipomoeae T32C / T65C

AF435063: Cel12A Bionectria ochroleuca T20C / Y52C

AF435064: Cel12B Bionectria ochroleuca T34C / T66C

AF435065: Cel12C Bionectria ochroleuca A18C / T50C

AF435066: Cel12D Bionectria ochroleuca S19C / Y51C

AF435071: Cel12A Humicola grisea S34C / Y67C

AF435068: Cel12A Hypochrea schweinitzii T18C / T50C

AF435067: Cel12A Stachybotrys echinata S 18C / Y50C

[0085] No sólo muestra la región N-terminal una alta similitud estructural entre familias 11 y 12; ambas familias

5 muestran una estructura similar a una mano, la de una “mano derecha parcialmente cerrada” según se describe en Törrönen et al. 1997. Las dos láminas-β forman “dedos” y un par retorcido de una lámina-β y la hélice-α forma una “palma”. El lazo largo entre las hebras-β B7 y B8 hace el “pulgar” y una parte del lazo entre las hebras-β B6b (residuos 95-102 en xynll y 125-131 en Cel12A) y B9 forma un “cordón”, que cruza la grieta en un lado (Torronen

A. y Rouvinen, J. Biochem. 1995, 34, 847-0856). El efecto estabilizador de insertar sustituciones de agentes

10 especiales que le dan rigidez entre la hebra beta B6b y el lazo adyacente y/o el “cordón” se ve en la mutación en los sitios 92, 93, 144 (N92C-H144C, al menos una de las siguientes mutaciones N97R, F93W + H144K (XynII), y puede de manera similar ser introducido en los sitios correspondientes en la familia 12. La tabla E muestra la numeración de una selección de sitios equivalentes estructuralmente entre xynll y Cel12A. La alta similitud estructural entre las dos familias permite un gran número de sustituciones similares (véase

15 Sandgren et. al., Mol., Biol., 2001 para la comparación estructural).

Tabla E

Ejemplos de ubicaciones equivalentes

Xynll: Cel12A

T2C
T2C

T28C: T34C

N92C: G122C

H144C, K: N164C, K

F93W: K123W

Q162H: K183H

[0086] Las enzimas modificadas pueden comprender una o más mutaciones además de aquellas presentadas

20 arriba. Otras mutaciones como las supresiones, inserciones, sustituciones, transversiones, transiciones e inversiones, en una o más ubicaciones, también pueden incluirse. De manera similar, la enzima modificada puede no tener al menos una de las sustituciones arriba expuestas.

[0087] La enzima modificada también puede comprender una sustitución conservadora que puede ocurrir como una sustitución de comparación (p.ej., básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc.). Las sustituciones no conservadoras también pueden ocurrir, es decir, de una clase de residuo a otra o alternativamente involucrando la inclusión de aminoácidos antinaturales como ornitina, ornitina de acido diaminobutirico, ornitina

5 norleucina, pirilalanina, tienilalanina, naftil alanina y fenilglicina.

[0088] Las secuencias también pueden tener supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y resultan en una sustancia equivalente funcionalmente. Las sustituciones de aminoácido deliberadas pueden estar hechas sobre la base de similitud en las propiedades en aminoácido (como la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los 10 residuos) y por lo tanto resulta útil agrupar aminoácidos juntos en grupos funcionales. Los aminoácidos pueden agruparse basándose en las propiedades sólo de su cadena lateral. Sin embargo, resulta más útil incluir los datos de mutación también. Es probable que se conserven los conjuntos de aminoácidos derivados así por razones estructurales. Estos conjuntos pueden describirse en la forma de un diagrama Venn (Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein secuencia alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue

15 conservation" Comput.Appl Biosci. 9: 745-756) (Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J.Theor.Biol. 119; 205-218). Las sustituciones conservadoras pueden llevarse a cabo, por ejemplo de acuerdo con la tabla abajo que describe un diagrama Venn generalmente aceptado para agrupar aminoácidos.

Conjunto: Subconjunto

Hidrofóbico: F W Y H K M I L V A G C Aromático F W Y H

Alifático: I L V

Polar: W Y H K R E D C S T N Q Cargado H K R E D

Cargado positivamente: H K R

Cargado negativamente: E D

Pequeño: V C A G S P T N D Diminuto A G S

20 [0089] Las secuencias de aminoácido VARIANTEes también pueden incluir grupos espaciadores adecuados insertados entre cualquier dos residuos aminoácidos de la secuencia incluyendo los grupos alquil como los grupos metil, etil o propil además de los espaciadores aminoácidos como los residuos de alanina-β o glicina. Una forma adicional de variación incluye la presencia de uno o más residuos de aminoácido en forma peptoide.

[0090] Las comparaciones de homología pueden llevarse a cabo con la vista, o más generalmente, con la ayuda

25 de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias. El % de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia un residuo cada vez. Esto se llama un alineamiento “sin espacios”. Normalmente, dichos alineamientos sin espacios se

30 llevan a cabo sólo con un número relativamente corto de residuos.

[0091] Pese a que este es un método muy simple y consistente, falla al no tener en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias de otra manera idénticas, una inserción o eliminación provocará que los siguientes residuos de aminoácido se pongan fuera del alineamiento, potencialmente resultando así en una gran reducción en % de homología cuando se lleva a cabo un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de métodos de

35 comparación de secuencia están diseñados para producir alineamientos óptimos que tienen en cuenta posibles inserciones y eliminaciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología total. Esto se consigue insertando “espacios” en la alineación de secuencia para intentar maximizar la homología local.

[0092] Sin embargo, estos métodos más complejos asignan “penalizaciones de espacio” a cada espacio que ocurre en la alineación para que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencia 40 con el menor número de espacios posible -reflejando una afinidad mayor entre las dos secuencias comparadas

– conseguirá una puntuación más alta que uno con muchos espacios. Suelen utilizarse “costes de espacios afines” que cargan un coste relativamente alto por la existencia de un espacio y una penalización más pequeña por cada residuo posterior en el espacio. Este es el sistema de puntuación de espacio más comúnmente utilizado. Las altas penalizaciones de espacio producirán por supuesto alineaciones optimizadas con menos

45 espacios. La mayoría de programas de alineación permiten modificar las penalizaciones de espacio. Sin embargo, es preferible utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho software para comparaciones de secuencia. Por ejemplo cuando se utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización del espacio por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 por un espacio y -4 por cada extensión.

[0093] El cálculo de máximo % de homología por lo tanto requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones de espacio. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc. Acids Research 12 p387). Ejemplos de otro software que puede ejecutar comparaciones de secuencia incluyen, sin carácter limitativo, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª Ed– capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y la suite GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas offline y online (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, es preferible utilizar el programa GCG Bestfit. BLAST 2 Secuencias también está disponible para comparar una secuencia nucleótida y una proteína (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

[0094] Pese a que el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el proceso de alineación por sí mismo no está comúnmente basado en una comparación de par todo-o-nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación del tipo par basándose en una similitud química o en la distancia evolutiva. Un ejemplo de dicha matriz comúnmente utilizada es la matriz BLOSUM62 – la matriz por defecto para la suite de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente utilizan valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolo personalizada si se suministra (véase el manual de usuario para detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, es preferible utilizar los valores de defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro software, la matriz de defecto, como BLOSUM62.

[0095] De manera alternativa, el porcentaje de homologías puede calcularse utilizando la función de alineamiento múltiple en ADNSIS™ (Hitachi Software), basada en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gen 73(1), 237-244).

[0096] Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferiblemente un % de identidad de secuencia. El software normalmente hace esto como parte de la comparación de secuencia y genera un resultado numérico.

[0097] Los modos de realización del primer y segundo aspecto, según se publican arriba, proporcionan un ácido nucleico que codifica cualquiera de las enzimas modificadas, según se establece arriba, así como los complementos de la misma. En otro modo de realización preferido, la publicación proporciona composiciones que comprenden al menos una enzima modificada, según se publica aquí y otro ingrediente. En otro modo de realización preferido, la publicación proporciona vectores comprendiendo una enzima modificada, según se publica aquí, las células comprendiendo la enzima modificada y métodos de expresar la enzima modificada.

[0098] Alguien especializado en la técnica tendrá en cuenta la relación entre la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de polipéptido, en particular, el código genético y la degeneración de este código, y será capaz de construir dichas enzimas modificadas sin dificultad. Por ejemplo, alguien especializado en la técnica tendrá en cuenta que para cada sustitución de aminoácido en la secuencia de enzima modificada puede haber uno o más codones que codifican el aminoácido sustituto. En consecuencia, será evidente que, dependiendo de la degeneración del código genético con respecto a ese residuo de aminoácido particular, una o más secuencias de ácido nucleico de enzima modificada pueden generarse correspondiendo con esa secuencia de polipéptido de enzima modificada.

[0099] Las mutaciones en la secuencia de aminoácido y la secuencia de ácido nucleico pueden realizarse mediante cualquier número de técnicas, según se conoce en el campo. En los modos de realización particularmente preferidos, las mutaciones se introducen en secuencias parentales mediante una PCR (reacción en cadena de la polimerasa) utilizando cebadores apropiados, como se ilustra en los Ejemplos. Las enzimas parentales pueden modificarse en el nivel de aminoácido o en el nivel de ácido nucleico para generar las secuencias de enzima modificada aquí descritas. Por lo tanto, un modo de realización preferido proporciona la generación de enzimas modificadas introduciendo uno o más cambios de codón correspondiente en la secuencia nucleótida que codifica una enzima modificada.

[0100] Se apreciará que los cambios de codón arriba podrían realizarse en cualquier secuencia de ácido nucleico de enzima modificada. Por ejemplo, los cambios de secuencia pueden realizarse en cualquiera de las secuencias homólogas aquí descritas.

[101] La enzima modificada puede comprender la enzima “completa”, es decir, en su longitud total como ocurre en la naturaleza (o como mutada), o puede comprender una forma truncada de la misma. La enzima modificada derivada de esta puede por lo tanto ser truncada o ser de “longitud-completa”: El truncamiento puede estar en el

extremo N-terminal o en el extremo C-terminal. La enzima modificada puede carecer de una o más partes, como sub-secuencias, secuencias de señal, dominios y fracciones, tanto activas como no.

[0102] Una secuencia nucleótida que codifica una enzima que tiene las propiedades específicas según se definen aquí o una enzima que es adecuada para la modificación, como una enzima modificada, puede ser

5 identificada y/o aislada y/o purificada a partir de cualquier célula u organismo que produce dicha enzima. Varios métodos son conocidos en la técnica para identificar y/o aislar y/o purificar las secuencias nucleótidas. Como modo de ejemplo, las técnicas de amplificación PCR para preparar más de una secuencia pueden utilizarse una vez que una secuencia adecuada se haya identificado y/o aislado y/o purificado.

[0103] Como modo de ejemplo adicional, un banco de datos ADNc y/o ADN genómico puede construirse

10 utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero a partir del organismo que produce la enzima. Si la secuencia de aminoácido de la enzima o una parte de la secuencia de aminoácido de la enzima se conoce, las sondas etiquetadas de oligonucleótidos pueden estar sintetizadas y utilizadas para identificar los clones de codificaciónenzima a partir del banco de datos genómico preparado a partir del organismo. De manera alternativa, una sonda etiquetada de oligonucleótido que contiene secuencias homólogas a otro gen de enzima conocido podría

15 utilizarse para identificar clones de codificación-enzima. En el último caso, se utilizan condiciones de lavado y de hibridación menos exigentes.

[0104] De manera alternativa, los clones de codificación-enzima podrían identificarse insertando fragmentos de ADN genómico en un vector de expresión, como un plásmido, transformando las bacterias de enzima-negativa con el banco de datos de ADN genómico resultante y después revistiendo la bacteria transformada sobre placas

20 de agar que contienen un sustrato para la enzima permitiendo así identificar los clones que expresan la enzima.

[0105] En una alternativa adicional, la secuencia nucleótida que codifica la enzima modificada puede prepararse de manera sintética estableciendo los métodos estándar, p.ej., el método fosforamidita descrito por Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869 o el método descrito por Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805. En el método fosforamidita, los oligonucleótidos se sintetizan, p.ej., en un sintetizador de ADN

25 automático, purificado, recocido, ligado y clonado en vectores apropiados.

[0106] La secuencia nucleótida puede ser de origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y ADNc

o de origen mixto genómico y ADNc, preparado al ligar fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc de acuerdo con técnicas estándar. Cada fragmento ligado corresponde con varias partes de la secuencia nucleótida entera. La secuencia de ADN también puede prepararse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

30 utilizando cebadores específicos, por ejemplo los descritos en US 4,683,202 o en Saiki R K et al., (Science (1988) 239, pp 487-491).

[0107] Las secuencias nucleótidas aquí descritas y adecuadas para el uso en los métodos y composiciones aquí descritos pueden incluir dentro de ellas nucleótidos modificados o sintéticos. Un número de diferentes tipos de modificación a los oligonucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen los ejes centrales de

35 metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de acridina o cadenas de polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la molécula. A los efectos de este documento, debe entenderse que las secuencias nucleótidas aquí descritas pueden ser modificadas por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para aumentar la actividad in vivo o la esperanza de vida de las secuencias nucleótidas.

[0108] Un modo de realización preferido proporciona secuencias nucleótidas y el uso de secuencias nucleótidas

40 que son complementarias a las secuencias aquí presentadas, o cualquier derivado, fragmento o derivado de la misma. Si la secuencia es complementaria a un fragmento de la misma entonces esa secuencia puede utilizarse como sonda para identificar secuencias de codificación similares en otros organismos, etc.

[0109] Los polinucleótidos que no son 100% homólogos a las secuencias de enzima modificada pueden obtenerse de muchas maneras. Otras VARIANTEes de las secuencias aquí descritas pueden obtenerse por 45 ejemplo investigando bancos de datos de ADN elaborados a partir de un intervalo de individuos, por ejemplo individuos de diferentes poblaciones. Además, otros homólogos pueden obtenerse y tales homólogos y fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridarse de manera selectiva a las secuencias mostradas en la lista de secuencia aquí. Dichas secuencias pueden obtenerse investigando los bancos de datos de ADNc elaborados de bancos de datos de ADN genómico a partir de otras especies e investigando dichos 50 bancos de datos con sondeos que comprenden toda o parte de cualquiera de las secuencias en los listados de secuencia adheridos bajo condiciones de exigencia mediana a alta. Consideraciones similares se aplican para obtener especies homólogas y VARIANTEes alélicas de las secuencias nucleótidas o polipéptidas aquí descritas.

[0110] Las VARIANTEes y variedades/especies homólogas también pueden obtenerse utilizando una PCR degenerada que utilizará cebadores diseñados para apuntar a las secuencias dentro de las VARIANTEes y

homólogas codificando secuencias de aminoácido conservadas. Los cebadores utilizados en la PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se utilizará en condiciones de exigencia menor a aquellas utilizadas para las secuencias de clonación con cebadores de secuencia única contra las secuencias conocidas. Las secuencias conservadas pueden pronosticarse, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácido a

5 partir de algunas VARIANTEes/homólogos. Las alineaciones de secuencia pueden realizarse utilizando un software de ordenador conocido en la técnica aquí descrita.

[0111] De manera alternativa, dichos polinucleótidos pueden obtenerse mediante mutagénesis dirigida al sitio de secuencias caracterizadas, según se proporcionan aquí. Esto puede resultar útil cuando, por ejemplo, los cambios de secuencia de codón se requieren para optimizar las preferencias de codón para una célula anfitriona

10 particular en la que las secuencias polinucleótidas se expresan. Otros cambios de secuencia pueden desearse con tal de introducir sitios de reconocimiento de restricción de enzima, o para alterar la propiedad o función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos.

[0112] Los polinucleótidos pueden utilizarse para producir un cebador, p.ej. un cebador PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda p.ej. etiquetada con una etiqueta de identificación mediante

15 un medio convencional utilizando etiquetas radioactivas o no radioactivas o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo al menos 25, 30 o 40 nucleótidos en longitud y también están abarcados por el término polinucleótidos.

[0113] Los polinucleótidos como los polinucleótidos de aDN y sondas pueden producirse de manera recombinante o sintética o mediante cualquier medio disponible para aquellos especialistas en la técnica.

20 También pueden clonarse mediante técnicas estándar. En general, los cebadores se producirán mediante medios sintéticos, incluyendo una fabricación gradual de la secuencia de ácido nucleico deseada con un nucleótido cada vez. Las técnicas para conseguir esto utilizando técnicas automatizadas están fácilmente disponibles en la técnica.

[0114] Los polinucleótidos más largos se producirán generalmente utilizando medios recombinantes, por ejemplo

25 utilizando técnicas de clonación PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios de reconocimiento de restricción de enzima adecuados para que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación adecuado. Preferiblemente, las secuencias VARIANTEes son al menos tan biológicamente activas como las secuencias aquí presentadas.

[0115] Un modo de realización preferido incluye secuencias que son complementarias a la enzima modificada o

30 secuencias que son capaces de hibridar tanto en secuencias nucleótidas de las enzimas modificadas (incluyendo secuencias complementarias de aquellas aquí presentadas), así como secuencias nucleótidas que son complementarias a secuencias que pueden hibridar en secuencias nucleótidas de las enzimas modificadas (incluyendo secuencias complementarias de aquellas aquí presentadas. Un modo de realización preferido proporciona secuencias polinucleótidas que son capaces de hibridar en secuencias nucleótidas aquí presentadas

35 bajo condiciones de exigencia intermedia a máxima.

[0116] Un modo de realización preferido incluye secuencias nucleótidas que pueden hibridar en la secuencia nucleótida del ácido nucleico de enzima modificada, o el complemento del mismo, bajo condiciones exigentes (p.ej., 50ºC y 0,2xSSC). Más preferiblemente, las secuencias nucleótidas pueden hibridar en la secuencia nucleótida de la enzima modificada, o el complemento de la misma, bajo condiciones de exigencia alta (p.ej.,

40 65ºC y 0,1xSSC).

[0117] Puede resultar deseable mutar la secuencia con tal de preparar una enzima modificada. Por consiguiente, un mutante puede prepararse a partir de las enzimas modificadas aquí proporcionadas. Las mutaciones pueden introducirse utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias nucleótidas acompañando los sitios de mutación deseados. Un método adecuado se publica en Morinaga et al.,

45 (Biotechnology (1984) 2, p646-649). Otro método de introducir mutaciones en secuencias nucleótidas de codificación-enzima se describe en Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151). Un método adicional se describe en Sarkar and Sommer (Biotechniques (1990), 8, p404-407 -"The megaprimer method of site directed mutagenesis"). Otros métodos para mutar la secuencia se emplean y publican aquí.

[0118] En un modo de realización preferido, la secuencia para su uso en los métodos y composiciones aquí

50 descritos es una secuencia recombinante – es decir, una secuencia que ha sido preparada utilizando técnicas de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican, por ejemplo, en la bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0119] Otro modo de realización proporciona composiciones y formulaciones que comprenden enzimas modificadas. Las composiciones incluyen la enzima modificada junto con otro componente.

[0120] Otro modo de realización proporciona vectores que comprenden la enzima modificada, células que comprenden la enzima modificada y métodos para expresar la enzima modificada. La secuencia nucleótida para 5 su uso en métodos y composiciones aquí descritas pueden incorporarse en un vector replicable recombinante. El vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia nucleótida, en forma de enzima, en y/o desde una célula anfitriona compatible. La expresión puede controlarse utilizando secuencias de control, p.ej., secuencias reguladoras. La enzima producida por una célula recombinante anfitriona mediante la expresión de la secuencia nucleótida puede segregarse o puede contenerse de manera intra celular dependiendo de la secuencia y/o del 10 vector utilizado. Las secuencias de codificación pueden diseñarse con secuencias de señal que dirigen la secreción de las secuencias de codificación de sustancia a través de una membrana de célula procariota o eucariota particular. Los polinucleótidos pueden incorporarse en un vector replicable recombinante. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula anfitriona compatible. El vector comprendiendo la secuencia polinucleótida puede transformarse en una célula anfitriona adecuada. Las anfitrionas adecuadas

15 pueden incluir células bacterianas, de levadura, de insecto y fúngicas.

[0121] Las enzimas modificadas y sus polinucleótidos pueden expresarse introduciendo un polinucleótido en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula anfitriona compatible y cultivando la célula anfitriona bajo condiciones que provocan la réplica del vector. El vector puede recuperarse de la célula anfitriona.

[0122] El ácido nucleico de enzima modificada puede estar unido de manera operativa a elementos reguladores

20 de transcripción y traducción activos en una célula anfitriona de interés. El ácido nucleico de enzima modificada también puede codificar una proteína de fusión que comprende secuencias de señal como, por ejemplo, aquellas derivadas del gen de glucoamilasa a partir de Schwanniomyces occidentalis, gen del tipo acoplamiento al factorα a partir de Saccharomyces cerevisiae y la amilasa-TAKA a partir de Aspergillus oryzae. De manera alternativa, el ácido nucleico de enzima modificada puede codificar una proteína de fusión que comprende un dominio

25 vinculante a la membrana.

[0123] La enzima modificada puede expresarse en los niveles deseados en un organismo anfitrión utilizando un vector de expresión. Un vector de expresión comprendiendo un ácido nucleico de enzima modificada puede ser cualquier vector capaz de expresar el gen que codifica el ácido nucleico de enzima modificada en el organismo anfitrión seleccionado y la elección del vector dependerá de la célula anfitriona en la que se va a introducir. Así,

30 el vector puede ser un vector que se replica de manera autónoma, es decir un vector que existe en una entidad episomal, cuya replicación es independiente a la replicación cromosomal, como, por ejemplo, un plásmido, un bacteriófago o un elemento episomal, un minicromosoma o un cromosoma artificial. De manera alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula anfitriona, se integra en el genoma de célula anfitriona, se integra en un genoma de célula anfitriona y se replica junto con el cromosoma.

35 [0124] El vector de expresión típicamente incluye los componentes de un vector de clonación, como, por ejemplo, un elemento que permite la replicación autónoma del vector en el organismo anfitrión seleccionado y uno o más marcadores detectables fenotípicamente con el objetivo de la selección. El vector de expresión normalmente comprende secuencias nucleótidas de control codificando un promotor, operador, sitio vinculante de ribosoma, señal de iniciación de traducción y opcionalmente, un gen represor o uno o más genes de

40 activación. De manera adicional, el vector de expresión puede comprender una secuencia que codifica una secuencia de aminoácido capaz de dirigir la enzima modificada a un orgánulo celular anfitrión como un peroxisoma o a un compartimento de célula anfitriona particular. Dicha secuencia dirigida incluye, sin carácter limitativo, la secuencia SKL. Para la expresión bajo la dirección de secuencias de control, la secuencia de ácido nucleico la enzima modificada está enlazada de manera operable a las secuencias de control de una manera

45 apropiada respecto a la expresión.

[125] Preferiblemente, un polinucleótido en un vector está enlazado de manera operable a una secuencia de control que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación mediante la célula anfitriona, es decir, el vector es un vector de expresión. Las secuencias de control pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de elementos reguladores transcripcionales adicionales para hacer que el nivel de

50 transcripción dirigido por las secuencias de control sea más receptivo a los moduladores transcripcionales. Las secuencias de control pueden comprender en particular promotores.

[0126] En el vector, la secuencia de ácido nucleico de codificación para la enzima modificada está combinada de manera operable con una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN con una actividad de transcripción en el organismo anfitrión de elección y puede derivarse de los genes que son 55 homólogos o heterólogos al organismo anfitrión. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia nucleótida modificada, como los ácidos nucleicos de enzima modificada, en un

anfitrión bacteria incluyen el promotor del lac operon de E. coli, los promotores dagA del gen agarasa Streptomyces coelicolor, los promotores del Bacillus licheniformis α-amilasa gen (amyL), el promotor aprE de Bacillus subtilis, los promotores del Bacillus stearothermophilus gen amilasa maltogénica (amyM), los promotores del Bacillus amyloliquefaciens α-gen amilasa (amyQ), los promotores de los Bacillus subtilis xylA y xylB genes y 5 un promotor derivado de un Lactococcus sp.-promotor derivado incluyendo el promotor P170. Cuando el gen que codifica la enzima modificada se expresa en una especie bacteria como E. coli, un promotor adecuado puede seleccionarse, por ejemplo, de un promotor bacteriófago incluyendo un promotor T7 un promotor lambda fago. Para la transcripción en una especie fúngica, ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados de los genes que codifican la Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Aspergillus niger

10 neutral α-amilasa, A. niger ácido estable α-amilasa, A. niger glucoamylase, Rhizomucor miehei lipase, Aspergillus oryzae proteasa alcalina, Aspergillus oryzae isomerasa fosfato triosa o Aspergillus nidulans acetamidasa. Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en especies de levadura incluyen, sin carácter limitativo, los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharomyces cerevisiae y los promotores Pichia pastoris AOX1 o AOX2.

15 [0127] Ejemplos de organismos anfitriones bacteriales son especies bacteriales positivas gram como Bacillaceae incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium y Bacillus thuringiensis, especies Streptomyces como Streptomyces murinus, especies bacteriales de ácido láctico incluyendo Lactococcus spp. como Lactococcus lactis, Lactobacillus spp. incluyendo Lactobacillus reuteri,

20 Leuconostoc spp., Pediococcus spp. y Streptococcus spp. De manera alternativa, las VARIANTEes de especies bacteriales de gram negativo que pertenecen a Enterobacteriaceae incluyendo E. coli, o Pseudomonadaceae pueden seleccionarse como el organismo anfitrión. Un organismo anfitrión de levadura adecuado puede seleccionarse de las especies de levaduras relevantes en la biotecnología como, sin carácter limitativo, las especies de levadura como Pichia sp., Hansenula sp o Kluyveromyces, especies Yarrowinia o una especie de

25 Saccharomyces incluyendo Saccharomyces cerevisiae o una especie que pertenece a Schizosaccharomyce como por ejemplo, especie S. Pombe. Preferiblemente una variedad de especies de levadura metilotrófica Pichia pastoris se utiliza como el organismo anfitrión. Preferiblemente el organismo anfitrión es una especie Hansenula. Los organismos anfitriones adecuados entre los hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus, p.ej. Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tubigensis, Aspergillus awamori o Aspergillus nidulans. De

30 manera alternativa, variedades de una especie Fusarium, p.ej. Fusarium oxysporum o de una especie Rhizomucor como Rhizomucor miehei puede utilizarse como organismo anfitrión. Otras VARIANTEes adecuadas incluyen especies Thermomyces y Mucor.

[0128] Las células anfitrionas que comprenden polinucléotidos pueden utilizarse para expresar polipéptidos, como las enzimas modificadas aquí publicadas, fragmentos, homólogos, VARIANTEes y derivados de los 35 mismos. Las células anfitrionas pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas que permiten la expresión de las proteínas. La expresión de los polipéptidos puede ser constitutiva para que se produzcan continuamente, o inducible, requiriendo un estímulo para iniciar la expresión. En el caso de expresión inducible, la producción de proteína puede iniciarse cuando sea requerida, por ejemplo, mediante adición de una sustancia inductora al medio de cultivo, por ejemplo dexametasona o IPTG. Los polipéptidos pueden extraerse de células anfitrionas

40 mediante una variedad de técnicas conocidas en el campo, incluyendo la lisis enzimática, química y/u osmótica y la disrupción física. Los polipéptidos también pueden producirse de manera recombinante en un sistema libre de células in vitro, como el sistema de reticulocitos de conejo TnT™ (Promega).

[0129] En un tercer aspecto, la publicación describe un método para modificar una enzima comprendiendo modificar un primera sitio en la parte de enzima de una región definida estructuralmente para que el primer sitio

45 pueda vincularse al segundo sitio. En un modo de realización preferido, el primer sitio está en un lazo o secuencia adyacente a la lámina-β. En un modo de realización preferido, el segundo sitio se sitúa en una láminaβ. En un modo de realización preferido, la enzima modificada es una xilanasa o Clan C.

[0130] En un modo de realización preferido, la publicación describe una xilanasa modificada o un método para modificar una xilanasa (o enzima modificada), de acuerdo con al menos uno de los siguientes: (i) modificar la 50 secuencia N-terminal para que la región N-terminal esté vinculada mediante un puente de disulfuro a una hebra-β adyacente (véase Gruber, et al., 1998 en T. reesei XynII los aminoácidos 1-4 y 24-30 respectivamente); (ii) modificar la C-terminal (en T. reesei XynII aminoácidos 183-190, véase Gruber, et al., 1998) para que se vincule a una hebra-β adyacente; (iii) modificar una hélice-α de la enzima para que pueda vincularse de manera más firme al cuerpo de la proteína; (iv) modificar al menos un lazo adyacente para que vincule la hebra beta

55 adyacente B6a (en T. reesei XynII aminoácidos 91-94, Gruber, et al., 1998) o (v) modificar el residuo equivalente a Xynll, según se presenta arriba.

[0031] Según otro modo de realización (por los ejemplos) la mutagénesis puede utilizarse para crear puentes de disulfuro, puentes salinos y mutaciones de punto separadas en diferentes regiones. Por ejemplo, la enzima

puede modificarse para crear al menos un puente de disulfuro, para que al menos un puente de disulfuro pueda: 1) estabilizar la región N-terminal o vincular la hebra beta N-terminal a la lámina beta adyacente (posiciones 2-28, 5-19, 7-16, 10-29 en XynII, o una posición equivalente, según se publica aquí); 2) estabilizar la región de hélice alfa (posiciones 105-162, 57-153, 110-151, 111-151, en XynII, o una posición equivalente según se publica

5 aquí); 3) estabilizar la región C-terminal (posiciones 63-188, 61-190, 36-186 or 34 -188 en XynII, o una posición equivalente según se publica aquí); o 4) estabilizar el lazo vinculándolo a la hebra beta como B6b (92-144, 113143 en XynII o una posición equivalente a la publicada aquí) y/o 5) estabilizar la lámina beta (posiciones 26-38, 61-149, 63-147, 65-186, 67-184 en XynII, o una posición equivalente, según se proporciona aquí).

[0132] Los puentes salinos pueden crearse en diferentes sitios de la enzima (p.ej., posiciones 22, 180, 58 or

10 +191D en XynII, o una posición equivalente, según se proporciona aquí) y mutaciones de punto único pueden introducirse en diferentes sitios de la molécula (p.ej., posiciones 108, 26, 30, 67, 93, 97, 132, 157, 160, 165, 169 or 186 en XynII, o una posición equivalente, según se proporciona aquí) aumentando así la termoestabilidad y/o termofilia y o alcalofilia la proteína. En cuanto al Y5 mutante, el término-C puede vincularse de manera más firme al cuerpo de la enzima añadiendo como un cambio recombinante un aminoácido (p.ej., ácido aspértico o ácido

15 glutámico) que entonces puede formar un puente salino desde el término-C hasta el cuerpo de la enzima. Si resulta apropiado, un reemplazo de aminoácido adecuado puede llevarse a cabo en el cuerpo de la proteína, para permitir la formación de un puente salino o para estabilizar la enzima en la parte C-terminal mediante la hélice-α o una región cercana a la hélice-α.

[0133] Pueden crearse mutantes adicionales. La estructura de la hebra beta N-terminal A1 o el lazo N-terminal

20 en las enzimas de familia 11 y 12 se describen como la hebra beta, una parte de la lámina beta A anterior a/hasta una estructura de curva beta que lleva hasta la hebra beta B1 o el lazo N-terminal anterior a la primera hebra beta de la lámina beta. (véase, Törrönen et al., Biochemistry 1995, 34, 847-856; Sandgren, et. al., J. Mol. Bio. (2001) 308, 295-310; Gruber, et al., 1998). La hebra beta B1 de la región N-terminal se describe como la parte de hebra beta de la lámina beta B anterior a/hasta una estructura de curva beta que lleva a la hebra beta

25 B2 o el lazo anterior a la primera hebra beta o la lámina beta. La región de hebra beta A1 está vinculada preferiblemente a la hebra beta A2 o a cualquier otra región adyacente (Xynll o un equivalente del mismo). La región de hebra beta B1 está vinculada preferiblemente a la hebra beta B2 o a cualquier otra región adyacente (Xynll o un equivalente del mismo). En Xynll A1 comprende residuos 1-4, A2 residuos 25-30, B1 residuos 6-10 y B2 residuos 13-19.

30 [0134] La estructura de la hebra beta C-terminal A4 o el lazo C-terminal en las enzimas de familia 11 y 12 es la parte de hebra beta de la lámina beta A entre las hebras beta A3 y A5 o el lazo que sigue a la lámina beta A4 (véase Törrönen et al., Biochemistry 1995, 34, 847-856; Sandgren, et. al., J. Mol. Bio. (2001) 308,295-310; Gruber, et al., 1998). La región de hebra beta A4 está vinculada preferiblemente a la hebra beta A3 o A5, o a cualquier otra región adyacente. En Xynll A4 es residuos 183-190, A3 es residuos 33-39 y A5 es residuos 61-69.

35 El cordón de la familia 11 y 12 se describe como el lazo que conecta las hebras beta B6b y B9. La hebra beta de la familia 11 y 12 B6b se describe como la hebra beta anterior al cordón (Törrönen et al., Biochemistry 1995, 34, 847-856; Sandgren, et. al., J. Mol. Bio. (2001) 308, 295-310; Gruber, et al., 1998). La hebra beta B6b puede estar vinculada al cordón o al lazo entre las hebras beta A6 y B7, o a cualquier otra región adyacente. En Xynll, B6b es residuos 90-94 y B9 es residuos 103-110, el cordón es 95-102, la hebra beta A6 es residuos 148-152, la hebra

40 beta B7 es residuos 134-142 y el lazo entre las hebras beta A6 y B7 es residuos 143-147.

[0135] La hélice de las enzimas de familia 11 y 12 se describe como la región que sigue a la hebra beta A6 y forma una estructura helicoidal paralela a la hebra beta B9 (Törrönen et al., Biochemistry 1995, 34, 847-856; Sandgren, et. al., J. Mol.). La hélice de las enzimas de familia 11 y 12 está vinculada preferiblemente a la hebra beta B9 o a cualquier otra región adyacente. En Xynll la hélice es residuos 153-162, la hebra beta A6 es residuos

45 148-152 y la hebra beta B9 es residuos 103-110.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1.

Plásmidos utilizados para la expresión de xilanasa II y patrón de mutagénesis

[0136] El marco abierto de lectura que codifica el producto de gen Trichoderma reesei XYNII se amplió mediante

50 la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del banco de datos ADNc T. reesei. XYNII ADNc se clonó en pKKtac (VTT, Espoo, Finlandia) o de manera alternativa en pALK143 (ROAL, Rajamäki, Finlandia).

EJEMPLO 2.

Mutagénesis dirigida al sitio para la generación de un mutante de xilanasa II

[0137] Los vectores de expresión que contienen ADNc-codificando xilanasa II según se describe en el Ejemplo 1 se utilizaron como patrón en la mutagénesis dirigida al sitio de tipo gradual en consecutivas ampliaciones PCR. Los cebadores oligonucleótidos sintéticos que contienen codones alterados para las mutaciones X-Y se utilizaron para la inserción de la alteración deseada en la secuencia de aminoácido primaria de xilanasa II nativa. Mediante 5 este enfoque los residuos de los sitios 92, 93 y 144 de los mutantes de enzima de tipo silvestre se generaron para vincular el lazo N143-S146 de xynll a la hebra-β cercana. De manera adicional, la mutagénesis se llevó a cabo para generar las mutaciones en los sitios 22, 65, 97 y 108 en la secuencia primaria de xilanasa. Las secuencias oligonucleótidas utilizadas en la mutagénesis se muestran en la Figura 3. La PCR se llevó a cabo según se ha descrito en la mutagénesis dirigida al sitio Quick Change Site-directed mutagenesis (Stratagene, La 10 Jolla, Ca, EEUU) de acuerdo con los procedimientos estándar de PCR. PfuTurbo (Stratagene) se utilizó como ADN polimerasa para amplificar el ADN plásmido. El ADN plásmido de la amplificación PCR de mutagénesis dirigida al sitio se transformó en E. coli XL-1 azul y las células de bacteria transformadas se propagaron entonces en LB, con ampicilina 100 ug/ml por selección de ADN plásmido y amplificación del ADN mutado. Los plásmidos se aislaron y secuenciaron para confirmar que contienen las mutaciones deseadas. El ADN plásmido mutado que

15 codifica las VARIANTEes mutantes se sobreexpresa en E. coli para examinar la incluencia de la mutagénesis en las propiedades enzimáticas de los mutantes Y5 T. reesei xilanasa.

EJEMPLO 3.

Producción de los productos de gen XYNII modificados en la variedad E. coli y ensayo para la actividad de xilanasa

20 [0138] Las variedades de E. coli sobreexpresando las VARIANTEes mutadas de xilanasa II se cultivaron sobre placas complementadas con 1% xilano de abedul (Sigma, Steinheim, Alemania) acopladas con Rhemazol Brilliant Blue. Rhemazol Brilliant Blue acoplado al xilano se utilizó para detectar la actividad de xilanasa que era fácilmente visualizada por una característica formación de halo debido a la desaparición del color azul alrededor de las colonias de bacteria que expresan la actividad de la xylanasa (Biely et al., 1985).

25 [0139] Los genes de xilanasa mutada (véase arriba; Ejemplo 2) se expresaron en E. coli a +37ºC en frascos de agitación en un medio de cultivo LB. Los cultivos de células expresando las VARIANTEes de enzima se centrifugaron y el sedimento celular se separó del sobrenadante que alberga la enzima que se secretó de las células hacia el medio de cultivo. El ensayo de la actividad de enzima xilanasa se llevó a cabo de acuerdo con métodos estándar. El medio de crecimiento que contiene los mutantes de xilanasa secretados se incubaron

30 durante 10 min en 1% xilano de abedul (Sigma) a 50ºC en 50mM de buffer citrato-fosfato (ph 5,0 –t) y 50 mM Tris-HCI en pH 7-9. (Bailey et al., 1992). Si fue necesario, el medio de crecimiento inactivado por calor se utilizó para diluir las muestras. La actividad enzimática de las VARIANTEes mutantes se examinó en comparación con el tipo silvestre y la enzima de mutación Y5 en condiciones variadas (véase, para Bailey et al., 1992).

EJEMPLO 4.

35 Determinación de la estabilidad dependiente de la temperatura y la actividad dependiente del pH de los mutantes de xilanasa II

Actividad como una función de temperatura;

[0140] La actividad xilanasa de las VARIANTEes mutantes se determinó a temperaturas variadas y se seleccionaron los valores pH (véase las figuras aquí). Los mutantes se incubaron durante 10 min con 1% xilano

40 de abedul (Sigma) en 50mM buffer citrato-fosfato (ph 4,5-7) o 50 mM Tris-HCl en pH 7-9. La cantidad relativa de azúcares reductores liberados se detectó con el ensayo de método DNS según se describe en el ejemplo 3.

Actividad residual

[0141] Las VARIANTEes mutantes se incubaron durante 10 minutos a temperaturas variadas sin sustrato. Después de la inactivación, las muestras se enfriaron con hielo y la actividad residual se determinó mediante un

45 método DNS según se describe en el ejemplo 3.

Actividad dependiente del pH

[0142] La actividad de xilanasa dependiente del pH se determinó detectando la actividad de enzima en un pH variado que oscila entre XX – YY durante 10 min en 1% xilano de abedul a temperaturas seleccionadas (véase las imágenes) en 50mM buffer citrato-fosfato (ph 4,5-7) y 50 mM Tris-HCl con pH 7,5-9. Esto estuvo seguido por

50 un ensayo DNS según se describe en el ejemplo 3.

EJEMPLO 5.

Preparación y muestreo de xilanasas mutantes para propiedades mejoradas

[0143] Las xilanasas mutantes se prepararon con sustituciones en una o más sustituciones de diferentes regiones de la molécula. Las sustituciones eran mutaciones de punto separado en contacto con otras mutaciones de punto separado o estaban preparadas para actuar sobre un elemento estructural descubierto de manera

5 común tanto en las enzimas de familia 11 como de familia 12. Los ensayos de enzima se llevaron a cabo según se perfila en los ejemplos. Los ejemplos de sustituciones “estructurales” se publican aquí y se muestran en los ejemplos.

[0144] El puente de disulfuro puede situarse entre los sitios 2 y 28 (T2c, T28C). La figura 4 muestra la importancia de la región N-terminal al sustituir los residuos del wt por una VARIANTEe más termófila. De manera

10 similar, la eliminación del puente de disulfuro nativo (residuos C4 y C32, numeración Cel12A) de T.reesei EGIII afecta ampliamente la estabilidad de la enzima, según se muestra en las figuras proporcionadas y las tablas aquí (véase, especialmente, la Tabla A).

[0145] La región de la lámina beta común para ambas familias 11 y 12 nombrada hebra beta B6b (según Gruber et al), se muestra importante para la estabilidad, especialmente en condiciones álcali. Este efecto se observa en

15 las sustituciones (al comparar con la VARIANTEe Y5) como estabilidad mejorada en pH 9 vs pH5 para P12, según se muestra en las figuras (véase, por ejemplo, la figura 9, la figura 10 y la figura 11).

[0146] La importancia de la región está claramente demostrada por un conjunto diferente de mutaciones (aunque en la misma región) afectando a la misma hebra beta. Cuando los sitios 93, 97 y 144 se sustituyen (F93W, N97R, H144K, P9 en el gráfico), puede observarse en la figura 9 un efecto similar en la estabilización de la enzima que

20 aquel cuando se substituyen los sitios 92 y 144 (N92C, H144C= P12 en el gráfico.)

[0147] Un ejemplo de las características mejoradas de sustituciones separadas en los sitios 22 y 180 se muestra abajo. La VARIANTEe que contiene las sustituciones H22K y F180Q (P20 en la figura 14) muestra una estabilidad térmica mejorada sobre Y5 con pH 7,8.

[0148] Además, la región C-terminal es importante para la estabilidad. En la sustitución S65C, S186C (J21 en el 25 gráfico) la enzima muestra una actividad mejorada con respecto a la temperatura con pH 8.

[0149] Alguien especializado en la técnica apreciaría fácilmente que la presente publicación está bien adaptada para realizar los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes a ella. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos aquí descritos son presentemente representativos de modos de realización preferidos, son ejemplares y no pretenden

30 ser limitativos. Será fácilmente aparente para alguien especializado en la técnica que pueden realizarse sustituciones y modificaciones variadas.

[0150] Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la especificación son indicativas de los niveles de aquellos especializados en la técnica.

[0151] La publicación descrita aquí de manera ilustrativa y adecuada puede practicarse en la ausencia de

35 cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones que no se haya publicado aquí específicamente. Los términos y expresiones que se han empleado se utilizan como términos de descripción y no de limitación y no existe intención de que al usar dichos términos y expresiones se excluyan equivalentes de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, sino que se reconoce que son posibles varias modificaciones. Así, debe entenderse que pese a que la presente publicación ha sido publicada específicamente con modos de

40 realización preferidos y características opcionales, la modificación y variación de los conceptos aquí publicados puede llevarse a cabo por aquellos especialistas en la técnica y que dichas modificaciones y variaciones están bajo consideración.

LISTADO DE SECUENCIA.

[0152]

45 <110> Genencor International, Inc .

<120> Enzimas modificadas, Métodos para producir enzimas modificadas y sus usos

<130> SMK/FP6360325 50

<140> EP 04821802.8

<141> 2004-09-10

5: <150> PCT/US2004/029575 <151> 2004-09-10 <150> US 60/503,251 <151> 2003-09-15

10: <160> 51 <170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

15: <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Trichoderma reesei

<400> 1

<210> 2

<211> 781

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

<210> 3 10 <211> 234

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 3

<210> 4

<211> 826

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 4

10 <210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 5

<210> 6

<211> 227

<212> PRT

<213> Humicola insolens

<400> 6

<210> 7

<211> 210

<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus

<400> 7

<210> 8

<211> 229

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 8

<210> 9

<211> 211 10 <212> PRT

<213> Aspergillus awamori

<400> 9

<210> 10

<211> 330

<212> PRT

<213> Bacillus stearothermophilus

<400> 10

<210> 11

<211> 190

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 11

<210> 12

<211> 237

<212> PRT

<213> Aspergillus awamori

<400> 12

10 <210> 13

<211> 233

<212> PRT

<213> Trichoderma viride

<400> 13

<210> 14

<211> 234

<212> PRT

<213> Hypocrea koningii

<400> 14

<210> 15

<211> 234

<212> PRT

<213> Hypocrea schweinitzii

<400> 15

<210> 16

<211> 237

<212> PRT

<213> Stachybotrys echinata

<400> 16

<210> 17

<211> 238

<212> PRT

<213> Fusarium equiseti

<400> 17

<210> 18

<211> 237

<212> PRT

<213> Bionectria ochroleuca

<400> 18

<210> 19

<211> 236

<212> PRT

<213> Bionectria ochroleuca

<400> 19

<210> 20

<211> 240

<212> PRT

<213> Bionectria ochroleuca

<400> 20

10 <210> 21

<211> 254

<212> PRT

<213> Humicola grisea

<400> 21

<210> 22

<211> 247

<212> PRT 10 <213> Chaetomium brasiliense

<400> 22

<210> 23

<211> 357

<212> PRT

<213> Bionectria ochroleuca

<400> 23

<210> 24

<211> 247

<212> PRT

<213> Emericella desertorum

10 <400> 24

<210> 25

<211> 244

<212> PRT

<213> Fusarium solani

<210> 26

<211> 250

<212> PRT

<213> Fusarium solani

<400> 26

<210> 27

<211> 371

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. 11AG8

<400> 27

<210> 28

<211> 221

<212> PRT 5 <213> conSecuencia Artificial

<220>

<223> consensus secuencia

<221> VARIANTE

<222> (1)...(221) 10 <223> Xaa = cualquier Amino Acid

<400> 28

<210> 29

<211> 25

5: <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 29

10: gaacgatggc aagggcggcg tgacg 25

<210> 30

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

15: <220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 30

cttctcgggc tgctacaacc caaacgg: 27

<210> 31

20: <211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 31 acatcgtcga gtgttttggc acctac 26

<210> 32

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 32 catcgtcgag aactggggca cctacaacc 29

<210> 33

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 33 ggcacctacc gaccgtccac g 21

<210> 34

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 34 caagctgggc gagcacacct ccgac 25

<210> 35

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 35

cgccgcaact gtcgctcgag c 21

<210> 36

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 36

gtggagggtt accaaagctc tggctctgc: 29

<210> 37

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 37

tctggctctg cttgcatcac cgtcagc: 27

<210> 38

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 38

gagaagcgcc agtgcattca gcccggc: 27

<210> 39

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 39

gtgacgtact gcaatggtcc cggcggg 27

<210> 40

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 40

ggcaccaaga acagggtcat caacttctcg ggc: 33

<210> 41

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 41

tccatcaccg tcagcgatta aagggggctc ttc: 33

<210> 42

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 42

cccagacgat tcagtgcggc acgggctaca ac: 32

<210> 43

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 43

cttctactcg tactggtgcg atggccacgg cg: 32

<210> 44

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 44 cgattcagcc cggctgcggc tacaacaacg gc

<210> 45

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 45 caacggctac ttctactgct actggaacga tggcc

<210> 46

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 46 ccggcacggg ctactgcaac ggctacttct actc

<210> 47

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 47 ggcgtgacgt acacctgcgg tcccggcggg c

<210> 48

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 48

5: ggcgccacca agtgcggcga ggtcacc 27

<210> 49

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

10: <220>

<223> oligonucleotido sintético

<400> 49

gcgtgggctc agtgcggcct gacgctcg: 28

<210> 50

15: <211> 752

<212> ADN

<213> Trichoderma reesei

<400> 50

20 <210> 51

<211> 248

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 51

Claims

Reivindicaciones

1. Un ácido nucleico, codificando una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia

de aminoácidos según se presenta en SEQ ID NO:1;

donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D ;

5 y donde la secuencia tiene mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en:

(i)

F93W, N97R y H144K,

(ii)

H144C y N92C,

(iii) F180Q, H144C y N92C,

(iv) V108H, 10 (v) S65C y S 186C,

(vi) H22K, F180Q, H144C y N92C;

donde la posición de los aminoácidos sustituidos está numerada desde el aminoácido después de la

señal y la prosecuencia.
2. Una xilanasa modificada comprendiendo un polipéptido con una secuencia de aminoácido según se

15 presenta en SEQ ID NO:1;

donde la secuencia tiene las mutaciones T2C, T28C, K58R y +191D;

y donde la secuencia comporta las mutaciones adicionales seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) F93W, N97R y H144K, 20 (ii) H144C y N92C,

(iii) F180Q, H144C y N92C,

(iv)

V108H,

(v)

S65C y S 186C,

(vi)

H22K, F180Q, H144C y N92C;

25 donde la posición del aminoácido sustituido está numerada a partir del aminoácido después de la señal y la prosecuencia.

Figura 1