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ES2500918T3 - Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta - Google Patents

Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta Download PDF

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ES2500918T3
ES2500918T3 ES10075466.2T ES10075466T ES2500918T3 ES 2500918 T3 ES2500918 T3 ES 2500918T3 ES 10075466 T ES10075466 T ES 10075466T ES 2500918 T3 ES2500918 T3 ES 2500918T3
Authority
ES
Spain
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fusion proteins
albumin fusion
disorders
cancer
disease
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES10075466.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Craig A. Rosen
William A. Haseltine
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Human Genome Sciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27586544&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2500918(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Human Genome Sciences Inc filed Critical Human Genome Sciences Inc
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Abstract

Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de albúmina IFN-beta, en donde la proteína de fusión tiene la proteína IFN-beta de longitud completa que incluye la secuencia líder de IFN-beta nativa fusionada al extremo amino de la forma madura de la seroalbúmina humana, y en donde el vector de expresión es el vector de expresión NSO pEE12.

Description

Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere en general a proteínas terapéuticas (incluyendo, entre otros, al menos un polipéptido, anticuerpo, péptido o fragmento y variante del mismo) condensadas a albúmina o fragmentos o variantes de la 5 albúmina. La invención abarca polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, proteínas terapéuticas de fusión de albúmina, composición, composiciones farmacéuticas y kits. Las células huésped transformadas con los polinucleótidos que codifican proteínas terapéuticas de fusión de albúmina también entran dentro de la invención, así como los procedimientos para fabricar las proteínas de fusión de albúmina de la invención usando estos polinucleótidos y/o células huésped. 10
La seroalbúmina humana (HSA o HA), una proteína de 585 aminoácidos en su forma madura (como se muestra en la Figura 1 (SEC ID Nº 1038)), es responsable de una proporción significativa de la presión osmótica de suero y también funciona como vehículo de ligandos endógenos y exógenos. En la actualidad, la HA para uso clínico se produce mediante extracción de sangre humana. La producción de HA recombinante (rHA) en microorganismos se ha divulgado en los documentos EP 330 451 y EP 361 991. 15
Las proteínas terapéuticas en su estado nativo o cuando se producen de forma recombinante, tales como interferones y hormonas de crecimiento, normalmente son moléculas lábiles que exhiben semividas cortas, en particular cuando se formulan en soluciones acuosas. La inestabilidad en estas moléculas cuando se formulan para administración dicta que muchas de las moléculas se deben liofilizar y refrigerar en todo momento durante el almacenamiento, de modo que hace que las moléculas sean difíciles de transportar y/o almacenar. Los problemas 20 de almacenamiento son particularmente agudos cuando las formulaciones farmacéuticas se deben almacenar y dispensar fuera del entorno hospitalario.
Se han propuesto pocas soluciones prácticas a los problemas de almacenamiento de las moléculas proteicas lábiles. De acuerdo con lo anterior, existe la necesidad de formulaciones de larga duración estabilizadas de moléculas terapéuticas proteináceas que se dispensan fácilmente, preferentemente con una sencilla formulación que requiere 25 una mínima manipulación posterior a la conservación.
Sumario de la invención
La expresión “una proteína terapéutica” usado en esta memoria descriptiva hace referencia a la forma madura de interferón-beta (IFN-beta/IFN-β).
La presente invención proporciona un vector de expresión que codifica la secuencia líder del IFN-beta nativo 30 condensada con una proteína de fusión de la albúmina IFN-beta que tiene la forma madura de la proteína IFN-beta condensada con el extremo amino de la forma madura de la HSA, en el que el vector de expresión es el vector de expresión de NS0 pEE12,1. En una realización, el vector de expresión codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1 a 772 de la SEC ID Nº. 322. La presente invención también proporciona una célula huésped de mamífero que comprende el vector de expresión de la invención. La presente invención también proporciona un 35 procedimiento de producción de una proteína de fusión de la albúmina que comprende cultiva una célula huésped de la presente invención en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina y aislar la proteína de fusión de la albúmina.
La presente invención también proporciona una proteína de fusión albúmina - interferón beta madura codificada por el vector de expresión de la reivindicación 1. La presente invención también proporciona proteínas de fusión 40 albúmina – interferón-beta para su uso en medicina, por ejemplo para usar en el tratamiento de esclerosis múltiple; cáncer, tal como melanoma, cáncer renal, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, un sarcoma, un linfoma, cáncer de cerebro, glioma, displasia cervical, leucemia, preleucemia, mieloma múltiple; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; neoplasias malignas y trastornos hematológicos; infecciones bacterianas; trombocitopenia; infecciones virales, tales como 45 infecciones por VIH, infecciones por hepatitis, infecciones por papilomavirus humano, infecciones por el virus del herpes simple; fibrosis pulmonar; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; colitis ulcerosa; osteoporosis: osteopenia, fibromialgia; síndrome de Sjögren; síndrome de fatiga crónica; fiebres, tales como fiebres hemorrágicas virales; diabetes, tales como diabetes insipidus y diabetes mellitus; hiperglucemia; resistencia a la insulina, deficiencia de insulina, hiperlipidemia; hipercetonemia; afecciones asociadas con la 50 diabetes, incluyendo, entre otros, obesidad, cardiopatía, hiperglucemia, infecciones retinopatía y/o úlceras; trastornos metabólicos, trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito; síndrome X.
En el presente documento también se divulgan formulaciones farmacéuticas que comprenden una proteína de fusión de la albúmina de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas formulaciones pueden 55 estar en un kit o recipiente. Dicho kit o recipiente puede estar envasado con instrucciones pertenecientes a la semivida prolongada de la proteína terapéutica. Dichas formulaciones se pueden usar en procedimientos de
tratamiento, prevención, mejora o diagnóstico de una enfermedad o síntomas de enfermedades en un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, que comprende la etapa de administrar la formulación farmacéutica al paciente.
En el presente documento también se divulgan procedimientos de prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad o trastorno. En realizaciones preferidas, la presente invención abarca proteínas de fusión de la albúmina 5 para usar en el tratamiento de una enfermedad o trastorno enumerado en la columna “Indicación Preferida: Y”, de la Tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de la albúmina de la invención que comprende una proteína terapéutica o una porción correspondiente a una proteína terapéutica (o fragmento o variante de la misma) divulgada en a columna de “Proteína terapéutica: X" de la Tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en 10 la columna "Indicación preferida: Y" de la Tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 tiene una semivida ampliada.
La proteína de fusión de la albúmina descrita en la Tabla 1 o 2 es más estable que la correspondiente molécula terapéutica sin condensar descrita en la Tabla 1. 15
En el presente documento también se divulgan organismos transgénicos modificados para que contengan moléculas de ácido nucleico de la invención (los polinucleótidos descritos en las Tablas 1 y 2), preferentemente, modificados para que expresen una proteína de fusión de la albúmina de la invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1A-D muestra la secuencia de aminoácidos de la forma madura de la albúmina humana (SEC ID Nº 20 1038) y un polinucleótido que la codifica (SEC ID Nº 1037).
La Figura 2 muestra el efecto de varias diluciones de las proteínas de fusión de albúmina e IFNb codificadas por el ADN comprendido en las CID 2011 y 2053, sobre la actividad SEAP en las células indicadoras ISRE-SEAP/293F (véase el Ejemplo 4). Las proteínas se diluyeron en serie de 5e-7 a le-14 g/ml en DMEM/10 % de FBS y se usan para tratar las células indicadoras ISRE-SEAP/293F. Tras 24 horas se extrajeron los 25 sobrenadantes de las células indicadoras y se analizó su actividad SEAP. La proteína de fusión de albúmina e IFNb se purificó a partir de tres clones estables. 293F/#2011, CHO/#2011 y NSO/#2053. IFNb derivado de mamífero, Avonex, procedían de Biogen y se comunicó que tenían una actividad específica de 2,0 e5 UI/ug.
Descripción detallada Definiciones 30
Las definiciones siguientes se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados en esta memoria.
Como se usa en el presente documento, “polinucleótido” hace referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de albúmina unida en el marco a una proteína terapéutica X; una molécula de ácido nucleico que 35 tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende, o, como alternativa que consiste en, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº Y (como se describe en la columna 6 de la Tabla 2); una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que comprende, o, como alternativa que consiste en, la secuencia mostrada en la SEC ID Nº X; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende, o, como alternativa que consiste en, la secuencia de 40 aminoácidos de SEC ID Nº Z; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de albúmina de la invención generada como se describe en la Tabla 2 o en los ejemplos; una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de albúmina terapéutica de la invención, una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos contenida en una construcción de fusión de albúmina descrita en la Tabla 2, o una molécula de ácido nucleico que tiene una 45 secuencia de nucleótidos contenida en una construcción de fusión de albúmina depositada en la ATCC (como se describe en la Tabla 3).
Como se usa en el presente documento, “construcción de fusión de albúmina" hace referencia a una molécula de ácido nucleico que comprende o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica, una molécula 50 de ácido nucleico que comprende, o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica generada como se describe en la Tabla 2 o en los Ejemplos; o una molécula de ácido nucleico que comprende, o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica que codifica una molécula de albúmina unida 55 en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica que además comprende, por
ejemplo, uno o más de los elementos siguientes: (1) un vector de autorreplicación funcional (incluido, entre otros, un vector lanzadera, un vector de expresión, un vector de integración y/o un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como, por ejemplo, un promotor regulable o inducible, un promotor constitutivo), (3) una región para la terminación de la transcripción, (4) una secuencia líder y (5) un marcador seleccionable. El polinucleótido que codifica la proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez parte 5 de la construcción de fusión de albúmina, puede, cada uno, denominarse “porción”, “región” o “resto” de la construcción de fusión de albúmina.
La presente invención se refiere, en general, a polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina – interferón-beta y a su uso en el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades o trastornos. Como se usa en el presente documento, “proteína de fusión de alúmina” se refiere a una proteína formada por la fusión de una 10 molécula de albúmina a una molécula de una proteína terapéutica. Una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende una proteína terapéutica y seroalbúmina humana, que se asocian entre sí mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica una proteína terapéutica está unido en el marco con un polinucleótido que la albúmina). La proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez que forman parte de la construcción de fusión de 15 albúmina, pueden, cada una, denominarse “porción”, “región” o “resto” de la proteína de fusión de albúmina (p. ej., una “porción de la proteína terapéutica” o una “porción de la proteína albúmina”). -
En una realización preferida adicional, una proteína de fusión de albúmina de la invención es procesada por una célula huésped y secretada al medio de cultivo que la rodea. El procesamiento de la proteína de fusión de albúmina naciente que se produce en las vías secretoras del huésped usadas para la expresión pueden incluir, entre otros, 20 escisión del péptido señal, formación de enlaces disulfuro, plegamiento adecuado, adición y procesamiento de hidratos de carbono (tales como, por ejemplo, glucosilación unida a N y O), escisiones proteolíticas específicas y ensamblaje en proteínas multiméricas. Una proteína de fusión de albúmina de la invención está, preferentemente, en forma procesada. En una realización más preferida, la "forma procesada de una proteína de fusión de albúmina" hace referencia a un producto de la proteína de fusión de albúmina que ha sufrido escisión del péptido señal en N-25 terminal, en el presente documento también se denomina "proteína de fusión de albúmina madura".
En varios casos, un clon representativo que contiene una construcción de fusión de albúmina de la invención se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (en el presente documento denominada "ATCC®"). Además, es posible recuperar una construcción de fusión de albúmina dada del depósito mediante técnicas conocidas en la materia y se describen en otros lugares del presente documento. La ATCC® se encuentra en 10801 University 30 Boulevard, Manassas, Virginia 201102209, EE.UU. Los depósitos en la ATCC® se han hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente.
En una realización, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina que comprende, o, como alternativa, que consiste en, una proteína terapéutica y una proteína de seroalbúmina. En una 35 realización adicional, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o, como alternativa, que consiste en, una proteína terapéutica y una proteína de seroalbúmina. En una realización preferida, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, una proteína terapéutica y una proteína seroalbúmina codificada por un polinucleótido descrito en la Tabla 2. En una realización preferida adicional, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de 40 albúmina cuya secuencia se muestra como SEC ID Nº Y en la Tabla 2. El componente de proteína de seroalbúmina de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la seroalbúmina. La invención abarca además polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina. La porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la proteína terapéutica.
Proteínas terapéuticas 45
Como se ha indicado anteriormente, un polinucleótido de la invención codifica una proteína que comprende, o, como alternativa, que consiste en, una proteína terapéutica y seroalbúmina humana, que se asocian entre sí, preferentemente mediante fusión genética.
Como se usa en el presente documento, “proteína terapéutica” hace referencia a una proteína IFN-β que tiene una o más actividades terapéuticas y/o biológicas. 50
Con proteína que es “terapéuticamente activa” se quiere decir un polipéptido que posee una o más actividades biológicas y/o terapéuticas conocidas asociadas con la proteína terapéutica, tal como una o más de las proteínas terapéuticas descritas en el presente documento o, por otro lado, conocida en la técnica. Como ejemplo no limitante, una “proteína terapéutica” es una proteína que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad, afección o trastorno. Como ejemplo no limitante, una “proteína terapéutica” puede ser una que se une específicamente a un 55 tipo de célula concreta (normal (p. ej., linfocitos) o anormal (p. ej., células de cáncer)) y, por tanto, se puede usar para dirigir un compuesto (fármaco o agente citotóxico) a dicho tipo de célula específicamente.
En otro ejemplo no limitante, una “proteína terapéutica” es una proteína que tiene una actividad biológica y, en
concreto, una actividad biológica que es útil para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad. Una lista no incluyente de actividades biológicas que puede poseer una proteína terapéutica incluye potenciar la respuesta inmunitaria, inhibir la angiogénesis, regular la función endocrina, regular las funciones hematopoyéticas, estimular el crecimiento neural, potenciar una respuesta inmunitaria, inhibir una respuesta inmunitaria o una cualquiera o más de las actividades biológicas descritas en la sección “Actividades biológicas” más adelante y/o como se divulga para una 5 proteína terapéutica dada en la Tabla 1 (columna 2).
Como se usa en el presente documento, “actividad terapéutica" o "actividad" puede hacer referencia a una actividad cuyo efecto es consistente con un desenlace terapéutico deseable en seres humanos o a los efectos deseados en mamíferos no humanos o en otras especies u organismos. La actividad terapéutica se puede medir in vivo o in vitro. Por ejemplo, se puede analizar un efecto deseable en un cultivo celular. Ejemplos de ensayos incluyen, entre otros, 10 los descritos en el presente documento en la sección de Ejemplos o en la columna “Ejemplo de ensayo de actividad” (columna 3) de la Tabla 1
Las proteínas terapéuticas correspondientes a la porción de una proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, tales como proteínas de superficie celular y secretoras, a menudo se modifican mediante la unión de uno o más grupos de oligosacáridos. La modificación, denominada glucosilación, puede afectar 15 espectacularmente a las propiedades físicas de las proteínas y puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización de proteínas. La glucosilación se produce en localizaciones específicas en la estructura del polipéptido. Normalmente hay dos tipos principales de glucosilación: glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a O, que están unidos a residuos de serina o treonina; y glucosilación caracterizada por oligosacáridos unidos a N que están unidos a residuos de asparagina en una secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que X puede ser cualquier 20 aminoácido excepto prolina. Normalmente, el ácido N-acetilneuramínico (también conocido como ácido siálico) es el residuo terminal de los oligosacáridos unidos a N y unidos a O. Variables tales como la estructura de la proteína y el tipo celular influyen sobre el número y la naturaleza de las unidades de carbohidrato dentro de las cadenas en diferentes sitios de glucosilación. Los isómeros de glucosilación también son habituales en el mismo sitio dentro de un tipo celular dado. 25
Por ejemplo, varios tipos de interferón humano están glicosilados. Los oligosacáridos en la asparagina 80 en el interferón -β1α natural pueden desempeñar un factor importante en la solubilidad y la estabilidad de la proteína, pero pueden no ser esenciales para su actividad biológica. Esto permite la producción de un análogo no glicosilado (interferón -β1b) modificado por ingeniería con modificaciones de la secuencia para potenciar la estabilidad (Hosoi et al., J. Interferon Res. 8:375 (1988; Karpusas et al., Cell Mol Life Sci 54:1203 (1998); Knight, J. Interferon Res. 2:421 30 (1982); Runkel et al., Pharm Res 15:641 (1998); Lin, Dev. Biol. Stand. 96:97 (998)).
La célula huésped en la que se expresan puede modificar las proteínas terapéuticas correspondientes a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención, de un modo tal que la glucosilación en uno o más sitios se altera como resultado de manipulación(es) de su secuencia de ácidos nucleicos, o se pueden modificar debido a otras condiciones de su expresión. Por ejemplo, se pueden producir los isómeros de glucosilación 35 anulando o introduciendo sitios de glucosilación, por ejemplo mediante sustitución o deleción de residuos de aminoácidos, tal como la sustitución de glutamina por asparagina, o se pueden producir proteínas recombinantes no glucosiladas mediante la expresión de proteínas en células huésped que no las glucosila, por ejemplo en E. coli o en levaduras con glucosilación deficiente. Estos abordajes se describen más detalladamente más adelante y se conocen en la técnica. 40
Las proteínas terapéuticas, particularmente las divulgadas en la Tabla 1, y sus secuencias de ácido nucleico y aminoácidos son bien conocidas en la técnica y están disponibles en las bases de datos públicas, tales como las bases de datos de servicios de abstraes químicos (p. ej., el registro CAS), GenBank, y bases de datos con suscripción como GenSeq (p. ej., Derwent). Ejemplos de secuencias de nucleótidos de las proteínas terapéuticas que se puede usar para derivar un polinucleótido de la invención se muestran en la columna 7, “SEC ID Nº X" de la 45 tabla 2. Las secuencias mostradas como SEC ID Nº X pueden ser una secuencia de polinucleótidos silvestre que codifica una proteína terapéutica dada (p. ej., de longitud larga o madura) o, en algunos casos, la secuencia puede ser una variante de dicha secuencia de polinucleótidos silvestre (p. ej., un polinucleótido que codifica la proteína terapéutica silvestre en la que la secuencia de ADN de dicho polinucleótido se ha optimizado, por ejemplo para la expresión en una especie concreta; o un polinucleótido que codifica una variante de la proteína terapéutica silvestre 50 (es decir, un mutante dirigido a sitio; una variante alélica)). Está dentro de la capacidad del experto en la técnica usar la secuencia mostrada como SEC ID Nº X para derivar la construcción descrita en la misma fila. Por ejemplo, si la SEC ID Nº X corresponde a una proteína de longitud larga, pero solo una porción de dicha proteína se usa para generar la CID específica, entra dentro de la experiencia en la técnica usar técnicas de biología molecular, tales como PCR, para amplificar el fragmento específico y clonarlo en el vector adecuado. 55
La tabla 1 proporciona una lista de proteínas terapéuticas que corresponden a una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina de la invención o una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido de la invención.
La primera columna “Proteína terapéutica X” divulga moléculas de proteína terapéutica a la que le puede seguir entre paréntesis nombres científicos y de marcas de proteínas que comprenden o, como alternativa, consisten en, la 60
molécula de proteína terapéutica o un fragmento o variante de la misma. La “proteína terapéutica X” como se usa en el presente documento, puede hacer referencia a una molécula proteína terapéutica individual o a todo el grupo de proteínas terapéuticas asociadas con una molécula proteína terapéutica dada divulgada en esta columna. La columna de “actividad biológica” (columna 2) describe las actividades biológicas asociadas con la molécula proteína terapéutica. La columna 3, “Ejemplo de ensayo de actividad” proporciona referencias que describen ensayos que se 5 pueden usar para analizar la actividad terapéutica y/o biológica de una proteína terapéutica X o una proteína de fusión de albúmina que comprende una porción de la proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma). Cada una de las referencias citadas en la columna “Ensayo de actividad de ejemplo” se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad, en particular con respecto a la descripción del ensayo de actividad respectivo descrito en la referencia (véase la sección Procedimientos en ella, por ejemplo) para analizar la correspondiente actividad 10 biológica expuesta en la columna “Actividad biológica” de la Tabla 1. La cuarta columna, “Indicación preferida: Y”, describe enfermedades, trastornos y/o afecciones que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o mejorar mediante la proteína terapéutica X o una proteína de fusión de albúmina que comprende la porción de una proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma). La columna “ID de la construcción” (columna 5) proporciona un enlace a un ejemplo de construcción de fusión de la albúmina divulgado en la tabla 2 que codifica una proteína de fusión de 15 albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en la porción de la proteína terapéutica X (o un fragmento de la misma) de referencia.
Tabla 1
Proteína terapéutica: X
Actividad biológica Ejemplo de ensayo de actividad Indicación preferida: Y ID de la construcción Proteína terapéutica: Z
Interferón beta (Interferón beta-1a; Interferón beta 1b; Interferón-beta-serina; SH 579; ZK 157046; BCDF; beta-2 IF; Interferón-beta-2; rhIL-6; SJ0031;
Modula la expresión del antígeno MHC, actividad de las células NK y producción de IFNg y producción de IL12 en monocitos. Ensayo antiviral: Rubinstein S, Familletti PC, Pcatka S. (1981) Convenient assay for interferons. J. Virol. 37(2):755 - 8; Ensayo antiproliferación: Cao Y, et al (1999) sensitivity of an epatein-barr virus-positive tumor line, Daudi, to alpha interferon correlates Esclerosis múltiple, oncología, cáncer; tumores sólidos; melanoma; melamoma maligno; cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales; cáncer pulmonar (p. ej., cáncer pulmonar macrocítico o cáncer pulmonar microcítico); cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de vejiga urinaria; cáncer gástrico; sarcoma; sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA; linfoma; linfoma de linfocitos T; linfoma cutáneo de linfocitos T; linfoma no Hodgkin; cáncer de cerebro; glioma; Véase la Tabla 2, SEC ID Nº 2 para una construcción concreta.
DL 8234; FERON; IFNbeta; EETASERON; AVONEX; REBIF; EETAFERON; SIGOSIX)
with expression of a GC-rich viral transcript Mol Cell Biol. 19(11):7305 - 13, Glioblastenia Multiforme: displasia cervical; leucemia; proleucemia; trastornos de la médula ósea; trastornos óseos; leucemia de células peludas; leucemia mielógena crónica; neoplasias malignas hematológicas; trastornos hematológicos; mieloma múltiple; infecciones bacterianas; quimioprotección; trombocitopenia; infecciones virales; infecciones por VIH; hepatitis; hepatitis crónica; hepatitis B; hepatitis C crónica; hepatitis D, hepatitis D crónica; papilomavirus humano; infección por el virus del herpes simple; condilomata acuminata externo; VIH; VIH infeccioso; fibrosis pulmonar; degeneración macular relacionada con la edad; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; artritis reumatoide; colitis ulcerosa; osteopenia; osteoclastogénesis;
Proteína terapéutica: X
Actividad biológica Ejemplo de ensayo de actividad Indicación preferida: Y ID de la construcción Proteína terapéutica: Z
Fibromialgia; síndrome de Sjogren; síndrome de fatiga crónica; fiebre; fiebre hemorrágica; fiebre hemorrágica viral hiperglicémica; diabetes; diabetes insipidus; diabetes mellitus, diabetes de tipo 1: Diabetes de tipo 2; resistencia a la insulina; deficiencia de insulina, hiperlipidemia, hipercetonemia; diabetes mellitas no dependiente de insulina (DMNDI); DIABETES MELLITUS DEPENDIENTE DE INSULINA (dmdi); una afección asociad con la diabetes, incluyendo, entre otros, obesidad, cardiopatía, hiperglucemia, retinopatía infecciosa y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión del peso corporal; supresión del apetito, síndrome
Tabla 2
Nº de fusión
ID de la construcción Nombre de la construcción Descripción Vector de expresión SEC ID Nº Y SEC ID Nº: X SEC ID Nº Z SEC ID Nº: A SEC ID Nº B Secuencia líder
pEE12:IFNb-HSA también denominado pEE12,1:IFNβ-HSA IFNb de longitud completa condensado cadena arriba de la HSA madura pEE12,1 Líder de IFNb nativo
La Tabla 2 proporciona el polinucleótido de la invención que comprende o, como alternativa que consiste en, moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de albúmina. La primera columna, “Nº de fusión” da un número de fusión al polinucleótido. La columna 2, “ID de la construcción” proporciona un identificador numérico único para el polinucleótido de la invención. Las ID de las construcciones se pueden usar para identificar el polinucleótido que codifican proteínas de fusión de albúmina que comprenden o, como alternativa que consisten en, 5 una porción de la proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica: X indicada en la fila correspondiente de la tabla 1, en la que dicha ID de construcción se indica en la columna 5. La columna "Nombre de la construcción" (columna 3) proporciona el nombre de una construcción o polinucleótido de fusión de albúmina dada.
La cuarta columna de la tabla 2, “Descripción”, proporciona una descripción general de una construcción de fusión 10 de albúmina y la quinta columna, “Vector de expresión”, indica el vector en el cual se clonó un polinucleótido que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina dada. En la técnica se conocen vectores y están disponibles comercialmente o se describen en otros lugares. Por ejemplo, como se describe en los Ejemplos, un “casete de expresión” que comprende o, como alternativa que consiste en, uno o más de (1) un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina 15 dada, (2) una secuencia líder, (3) una región promotora y (4) un terminador de la transcripción, se puede ensamblar en un vector de clonación conveniente y, después, pasarse a un de expresión de mamífero. Para la expresión en células NS0 , un casete de expresión que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de albúmina se clona en pEE12. El experto en la técnica conocerá otros vectores de clonación y/o de expresión útiles. 20
La columna 6, “SEC ID Nº Y”, proporciona la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína de fusión de albúmina de la invención. En la mayoría de los casos, la SEC ID Nº Y muestra la forma no procesada de la proteína de fusión de albúmina codificada, en otras palabras la SEC ID Nº Y muestra la secuencia señal, en la porción de HSA, y una porción terapéutica, todo ello codificado por la construcción concreta. Específicamente contemplado en la presente invención están todos los polinucleótidos que codifican la SEC ID Nº Y. Cuando estos 25 polinucleótidos se usan para expresar la proteína codificada de una célula, la secreción natural de la célula y las etapas de procesamiento producen una proteína que carece de la secuencia señal indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal indicada se muestra más adelante en la memoria o es bien conocida en la técnica. Por tanto, la mayoría de las realizaciones preferidas de la presente invención incluye la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder 30 mostrada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2). Asimismo, los más preferidos son polipéptidos que comprenden la SEC Nº Y sin la secuencia líder específica indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. También se prefieren las composiciones que comprenden estas dos realizaciones preferidas, incluyendo las composiciones farmacéuticas. Además, está bien dentro de la capacidad del experto en la técnica sustituir la secuencia señal indicada en las columnas 4 y/u 1 de la tabla 2 con una secuencia señal diferente, tales como las descritas más adelante en la 35 memoria para facilitar la secreción de la proteína de fusión de albúmina procesada.
La séptima columna, “SEC ID Nº X", proporciona la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende la 40 secuencia génica silvestre que codifica una proteína terapéutica que se muestra en la tabla 1. En una realización alternativa, la secuencia de ácido nucleico parental a partir de la cual se puede derivar un polinucleótido que codifica una porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina comprende una variante o derivado de una secuencia génica silvestre que codifica la proteína terapéutica mostrada en la tabla 1, tal como, por ejemplo, una variante optimizada por codón sintética de una secuencia génica silvestre que codifica una proteína terapéutica. 45
La octava columna, “SEC ID Nº Z", proporciona una traducción predicha de la secuencia de ácido nucleico parental (SEC ID Nº X). Esta secuencia parental puede ser una proteína parental de longitud completa usada para derivar la construcción concreta, la porción madura de una proteína parental, una variante o fragmento de una proteína silvestre, o una secuencia artificial que se puede usar para crear la construcción descrita. Un experto en la técnica puede usar esta secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº Z para determinar qué residuos de 50 aminoácidos de una proteína de fusión de albúmina codificada por una construcción dada se proporcionan mediante la proteína terapéutica. Además, está dentro de la capacidad del experto en la técnica usar la secuencia mostrada como SEC ID Nº Z para derivar la construcción descrita en la misma fila. Por ejemplo, si la SEC ID Nº Z corresponde a una proteína de longitud completa, pero solo una porción de dicha proteína se usa para generar la CID específica, está dentro de la experiencia en la técnica usar técnicas de biología molecular, tales como PCR, para amplificar el 55 fragmento específico y clonarlo en el vector adecuado.
Los cebadores para amplificación proporcionados en las columnas 9 y 10, “SEC ID Nº A" y “SEC ID Nº B", respectivamente, son ejemplos de cebadores usados para generar un polinucleótido que comprende o, como alternativa que consiste en, una molécula de ácido nucleico que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina dada. Los cebadores oligonucleotídicos que tienen las secuencias mostradas en las 60 columnas 9 y/o 10 (SEC ID Nº A y/o B) se pueden usar para amplificar mediante PCR un polinucleótido que codifica la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina usando una molécula de ácido nucleico
que comprende o, como alternativa que consiste en, la secuencia de nucleótidos proporcionada en la columna 7 ( SEC ID Nº X) de la correspondiente fila como molde de ADN. Los procedimientos de PCR están bien establecidos en la técnica. Los expertos en la técnica podrían prever fácilmente las secuencias de cebadores útiles adicionales.
Los cebadores oligonucleotídicos pueden usarse en reacciones de PCR solapantes para generar mutaciones dentro de una secuencia de ADN molde. En la técnica se conocen procedimientos de PCR. 5
Como se muestra en la tabla 3, la construcción de fusión e albúmina de la invención se ha depositado en la ATCC®.
Tabla 3
ID de la construcción
Nombre de la construcción Nº de depósito en la ATCC/Fecha
pEE12:IFNb-HSA también denominado pEE12,1:IFNβ-HSA PTA-3764 Oct. 4.2001
Es posible recuperar una construcción de fusión de albúmina dada del depósito mediante técnicas conocidas en la materia y se describen en otros lugares del presente documento (véase el ejemplo 40). La ATCC se encuentra en 10 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201102209, EE.UU. Los depósitos en la ATCC se han hecho bajo los términos del Tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para propósitos de procedimiento de patente.
En una realización adicional de la invención se describe un “casete de expresión” que comprende o, como alternativa que consiste en, uno o más de (1) un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina 15 dada, (2) una secuencia líder, (3) una región promotora y (4) un terminador de la transcripción se puede mover o “subclonar” de un vector a otro. Los fragmentos que se van a subclonar se pueden generar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, amplificación por PCR (p. ej., usando cebadores oligonucleotídicos que tienen la secuencia mostrada en la SEC ID Nº A o B) y/o digestión mediante enzimas de restricción. 20
Actividad funcional
“Un polipéptido que tiene actividad funcional” hace referencia a un polipéptido capaz de mostrar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con la proproteína de longitud completa y/o forma madura de una proteína terapéutica. Dichas actividades funcionales incluyen, entre otros, la actividad biológica, la antigenicidad [capacidad para unirse (o competir con un polipéptido por la unión) a un anticuerpo anti-polipéptido], la 25 inmunogenicidad (capacidad para generar anticuerpos que se unen a un polipéptido específico de la invención), la capacidad para formar multímeros con polipéptidos de la invención y la capacidad para unirse a un receptor o ligando por un polipéptido.
“Un polipéptido que tiene actividad biológica” hace referencia a un polipéptido que exhibe actividad similar, aunque no necesariamente idéntica, a una actividad de una proteína terapéutica de la presente invención, como se mide en 30 un ensayo biológico concreto, con o sin dependencia de la dosis. En el caso de en el que exista dependencia de la dosis, no tiene que ser idéntica a la del polipéptido, sino sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no más de aproximadamente diez veces menos actividad y, más preferentemente, no más de aproximadamente tres veces 35 menos actividad con respecto al polipéptido de la presente invención).
Se puede analizar la actividad funcional (p. ej., la actividad biológica) de las proteínas de fusión de albúmina usando o modificando de forma rutinaria los ensayos conocidos en la técnica, así como ensayos descritos en el presente documento. Adicionalmente, un experto en la técnica pude analizar de forma rutinaria la actividad de fragmentos de una proteína terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina 40 usando ensayos a los que se hace referencia en su correspondiente fila de la tabla 1 (p. ej., en la columna 3 de la tabla 1). Adicionalmente, un experto en la técnica pude analizar de forma rutinaria la actividad de fragmentos de una proteína de albúmina correspondiente a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina usando ensayos conocidos en la técnica y/o como se ha descrito en la sección Ejemplos más adelante.
Por ejemplo, cuando se analiza la capacidad de una proteína de fusión de albúmina para unirse o competir con una 45 proteína terapéutica por la unión a un anticuerpo anti-polipéptido terapéutico y/o a un anticuerpo anti-albúmina se pueden usar varios inmunoensayos conocidos en la técnica, incluidos, entre otros, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos usando técnicas tales como radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitación con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (usando, por ejemplo, oro coloidal, marcadores 50
enzimáticos o radioisótopos), transferencias de tipo western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej., ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis etc. En una realización de la divulgación, la unión del anticuerpo se puede detectar detectando un marcador sobre el anticuerpo primario. El anticuerpo primario se puede detectar detectando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo frente al 5 anticuerpo primario. El anticuerpo secundario puede estar marcado. En la técnica se conocen muchos medios para detectar la unión en un inmunoensayo.
Cuando se identifica una pareja de unión (p. ej., un receptor o un ligando) de una proteína terapéutica, se puede analizar la unión a dicha pareja de unión mediante una proteína de fusión de albúmina que comprende dicha proteína terapéutica como porción de proteína terapéutica por medio de, por ejemplo, medios bien conocidos en la 10 técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gen reductora o no reductora, cromatografía de afinidad por proteínas y transferencia de afinidad. Véase, en general, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94123 (1995). En otra realización, la capacidad de la correlación fisiológica de una proteína de fusión de albúmina para unirse a uno o más sustratos del polipéptido terapéutico correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la fusión se puede analizar de forma rutinaria usando técnicas conocidas en la materia. 15
Cuando se está evaluando la capacidad de la proteína de fusión de albúmina, se puede analizar la asociación con otros componentes del multímero, por ejemplo por medios conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, cromatografía en gel reductora o no reductora, cromatografía por afinidad de proteínas y transferencia de afinidad. Véase, generalmente, Phizicky et al., ant.
Los ensayos de la capacidad de las proteínas de fusión de albúmina para unirse (específicamente) a una proteína o 20 epítopo específico se pueden realizar en solución (p. ej., Houghten, Bio/Techniques 13:412421(1992)), sobre perlas (e.g., Lam, Nature 354:8284 (1991)), cobre chips (p. ej., Fodor, Nature 364:555556 (1993)), sobre bacterias (p. ej., patente de EE.UU. nº 5.223.409), sobre esporas (p. ej., patente de EE.UU. nº 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), sobre plásmidos (p. ej., Cull y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18651869 (1992)) o sobre fagos (p. ej., Scott and Smith, Science 249:386390 (1990); Devlin, Science 249:404406 (1990); Cwirla y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 25 87:63786382 (1990); y Felici, J. Mol. Biol. 222:301310 (1991)).
Los inmunoensayos que se pueden usar para analizar la unión (inmunoespecífica) y la reactividad cruzada incluyen, entre otros, sistemas de ensayo competitivo y no competitivo usando técnicas tales como transferencias de tipo western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunosorción ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con precipitina de difusión en 30 gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunoradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, por citar algunas. Dichos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York). Ejemplos de inmunoensayos se describen brevemente más adelante (pero no re pretende que sean limitantes). 35
Generalmente, los protocolos de inmunoprecipitación comprenden lisar una población de células en un tampón de lisis, tal como tampón RIPA (1 % de NP-40 o Triton X-100, 1 % de desoxicolato sódico, 0,1 % de SDS, NaCl 0,15 M, fosfato sódico 0,01 M a pH 7,2, 1 % de Trasylol) suplementado con fosfatasa proteica y/o inhibidores de la proteasa (p. ej., EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato sódico), añadir la proteína de fusión de albúmina de la invención (p. ej., que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína terapéutica) al lisado 40 celular, incubar durante un periodo de tiempo (p. ej., de 1 a 4 horas) a 40 ºC, añadir perlas de sefarosa acopladas a un anticuerpo antialbúmina, por ejemplo, al lisado lisado celular, incubar durante aproximadamente una hora o más a 40 ºC, lavar las perlas en tampón de lisis y resuspender las perlas en tampón de SDS/muestra. La capacidad de la proteína de fusión de albúmina para inmunoprecipitar un antígeno concreto se puede evaluar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo western. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar 45 para aumentar la unión de la proteína de fusión de albúmina a un antígeno y disminuir el fondo (p. ej., aclarar previamente el lisado celular con perlas de sefarosa). Para una discusión adicional sobre los protocolos de inmunoprecipitación, véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 10.16.1.
El análisis de transferencia de tipo Western generalmente comprende preparar muestras de proteínas, electroforesis 50 de las muestras de proteínas en un gel de poliacrilamida (p. ej., 8 % - 20 % de SDS-PAGE dependiendo del peso molecular del antígeno), transferir la muestra proteica desde el gel de poliacrilamida a una membrana, tal como nitrocelulosa, PVDF o nailon, bloquear la membrana en solución de bloqueo (p. ej., PBS con 3 % de BSA o leche desgrasada), lavar la membrana en tampón de lavado (p. ej., PBS-Tween 20), aplicar la proteína de fusión de albúmina de la invención (diluida en tampón de bloqueo) a la membrana, lavar la membrana en tampón de lavado, 55 aplicar un anticuerpo secundario (que reconoce la proteína de fusión de albúmina, por ejemplo anticuerpo anti-seroalbúmina humana) conjugado con un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) o molécula radioactiva (p. ej., 32P o 125I) diluida en tampón de bloqueo, lavar la membrana en tampón de lavado y detectar la presencia del antígeno. Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar para aumentar la señal detectada y para reducir el ruido de fondo. Para una discusión adicional sobre los protocolos de 60 transferencia de tipo western, véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology,
Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 10.8.1.
Los ELISA comprenden preparar el antígeno, revestir el pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos con el antígeno, eliminar mediante lavado el antígeno que no se ha unido a los pocillos, añadir la proteína de fusión de albúmina (p. ej., que comprende al menos un fragmento o variante de un anticuerpo que se une a una proteína terapéutica) de la invención conjugada a un compuesto detectable, tal como un sustrato enzimático (p. ej., 5 peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina) a los pocillos e incubar durante un periodo de tiempo, eliminar mediante lavado las proteínas de fusión de albúmina no unidas o unidas de forma inespecífica y detectar la presencia de las proteínas de fusión de albúmina. En los ELISA, la proteína de fusión de albúmina no tiene que estar conjugado con un compuesto detectable; en su lugar, se puede añadir al pocillo un segundo anticuerpo (que reconoce la proteína de fusión de albúmina ) conjugado a un compuesto detectable. Adicionalmente, en lugar de revestir el pocillo con el 10 antígeno, se puede revestir el pocillo con la proteína de fusión de albúmina. En este caso, la molécula detectable podría ser el antígeno conjugado con un compuesto detectable tal como un sustrato enzimático (p. ej., peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina). Un experto en la técnica conocerá los parámetros que se pueden modificar para aumentar la señal detectada, así como otras variaciones de ELISA conocidas en la técnica. Para una discusión adicional sobre los ELISA, véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, 15 Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York en 11.2.1.
La afinidad de unión de una proteína de fusión de albúmina a una proteína, antígeno o epítopo y la tasa de disociación de una interacción proteína de fusión de albúmina – antígeno/epítopo se puede determinar mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de antígenos marcados (p. ej., 3H o 125I) con la proteína de fusión de albúmina de la 20 invención en presencia de cantidades crecientes de antígeno sin marcar y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad de la proteína de fusión de albúmina por una proteína, antígeno o epítopo específico y las tasas de disociación de la unión se pueden determinar a partir de los datos obtenidos mediante análisis del gráfico del trazado. La competición con una segunda proteína que se une a la misma proteína, antígeno o epítopo como la proteína de fusión de albúmina también se puede determinar usando radioinmunoensayos. En este caso, la 25 proteína, antígeno o epítopo se incuba con una proteína de fusión de albúmina conjugada con un compuesto marcado (p. ej., 3H o 125I) en presencia de cantidades crecientes de una segunda proteína sin marcar que se une a la misma proteína, antígeno o epítopo como la proteína de fusión de albúmina de la invención.
Se puede usar el análisis cinético BIACORE para determinar la unión y las tasas de disociación de las proteínas de fusión de albúmina de la invención a una proteína, antígeno o epítopo. El análisis cinético BIACORE™ comprende 30 analizar la unión y la disociación de las proteínas de fusión de albúmina o polipéptidos, antígenos o epítopos específicos de los chips con polipéptidos, antígenos o epítopos o proteínas de fusión de albúmina específicos inmovilizados, respectivamente, sobre su superficie.
Albúmina
Como se ha descrito anteriormente, una proteína de fusión de albúmina de la invención una proteína terapéutica y 35 seroalbúmina humana, que se asocian entre sí, preferentemente mediante fusión genética.
Los términos seroalbúmina humana (HSA) y albúmina humana (HA) se usan en el presente documento de forma intercambiable. Los términos “albúmina” y “seroalbúmina” son más amplios y abarcan la seroalbúmina humana.
Como se usa en el presente documento, “albúmen” hace referencia en conjunto a la proteína albúmina o a la secuencia de aminoácidos que tienen una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de albúmina. 40 En concreto, “albúmina” hace referencia a albúmina humana (véase, por ejemplo, los documentos EP 201 239, EP 322 094 WO 97/24445, WO95/23857), especialmente la forma madura de la albúmina humana como se muestra el la Figura 1 y la SEC ID Nº 1038.
Como se usa en el presente documento, una porción de albúmina suficiente para prolongar la actividad terapéutica o la semivida de la proteína terapéutica hace referencia a una porción de albúmina de suficiente longitud o estructura 45 para estabilizar o prolongar la actividad terapéutica de la proteína de modo que la semivida de la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina se prolonga o se extiende en comparación con la semivida en estado de no fusión. La porción de albúmina de las proteínas de fusión de albúmina comprende la longitud completa de la secuencia de HA como se ha descrito anteriormente. El fragmento de HA es la forma madura de HA.
Administración y composición terapéutica/profiláctica 50
En el presente documento también se divulgan procedimientos de tratamiento, inhibición y profilaxis mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de la invención. El compuesto está sustancialmente purificado (p. ej. sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). Preferentemente, el sujeto es un animal, incluyendo, entre otros, animales tales como vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros etc. y, preferentemente, es un mamífero y, más 55 preferentemente, un ser humano.
Anteriormente se han descrito formulaciones y procedimientos de administración que se pueden usar cuando el
compuesto comprende un ácido nucleico, formulaciones y vías de administración adecuadas adicionales se pueden seleccionar de entre las descritas en el presente documento más adelante.
Se conocen varios sistemas de liberación y se pueden usar para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu, y Wu, J. Biol. Chem. 262:44294432 (1987)), 5 construcción de un ácido nucleico como parte de un retrovirus u otro vector etc. Los procedimientos de introducción incluyen, entre otros, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Los compuestos o composiciones se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo mediante infusión o inyección en bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epitelial o mucocutáneo (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente 10 activos. La administración puede ser sistémica u oral. Además, puede ser deseable introducir los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluida la inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede facilitarse mediante in catéter intraventricular, por ejemplo fijado a un depósito, tal como un depósito de Ommaya. La administración pulmonar también se puede emplear mediante, por ejemplo, el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente 15 formador de aerosoles.
Puede ser deseable administrar los compuestos o composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesite dicho tratamiento, esto se puede conseguir mediante, por ejemplo y sin limitaciones, infusión local durante cirugía, aplicación tópica, por ejemplo junto con un vendaje para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, o por medio de un supositorio o por medio de un implante, siendo dicho implante 20 un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluidas membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferentemente, guando se administra una proteína se deben tomar precauciones para usar materiales que no absorban la proteína.
El compuesto o la composición se pueden liberar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:15271533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein 25 and Fidler (eds.), Liss, New York, pág. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pág. 317327; véase, en general, ibid.)
El compuesto o composición se puede liberar en un sistema de liberación controlada. Se puede usar una bomba (véase, Langer, ant.; Sefton. CRC Crit. Ref. Biomed Eng. 14:201 (1987); Buchwald, y col., Surgery 88:507 (1980); Saudek, y col., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications 30 of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., MacromoL Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); see also Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J.Neurosurg. 71:105 (1989)). Un sistema de liberación controlada se puede colocar cerca de la diana terapéutica, es decir el cerebro, de modo que sólo se requiera una fracción de la 35 dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, voL 2, pág.115 - 138 (1984)).
Otros sistemas de liberación controlada se tratan en la recapitulación de Langer (Science 249:15271533 (1990)).
En una realización específica en la que el compuesto de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para estimular la expresión de su proteína codificada, construyéndola 40 como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y administrarla de modo que pase a ser intracelular, por ejemplo mediante el uso de un vector retroviral (véase la patente de EE.UU. nº 4.980.286) o mediante inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (p. ej., una pistola génica; Biolistic, Dupont), o revistiendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o mediante administración en unión con un péptido similar a la homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase, por 45 ejemplo, Joliot y coI., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:18641868 (1991)), etc. Como alternativa, un ácido nucleico se puede introducir intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula huésped para expresión mediante recombinación homóloga.
En el presente documento también se divulgan composiciones farmacéuticas. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión 50 “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la terapéutica. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen en petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite 55 de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Un vehículo preferido es agua, cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Como vehículos líquidos se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, caliza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada desecada, glicerol, propileno, glicol, 60
agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede también contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como supositorio, con aglutinantes tradicionales y vehículos, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir vehículos estándar, tales como calidades farmacéuticas de 5 manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, a menudo en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración. 10
La composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar el dolor en el punto de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria como, por 15 ejemplo, polvo liofilizado seco o concentrado sin agua, en un envase sellado herméticamente, tal como una ampolla o un sobre, indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar mediante infusión, se puede dispensar con un bote de infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyectables o solución salina de modo que los ingredientes se pueden mezclar antes de la administración. 20
Los compuestos de la invención se pueden formular como formas salinas o neutras. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., y las formadas con cationes, tales como los que derivan de sodio, potasio, amoniaco, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína etc.
La cantidad del compuesto de la invención que será eficaz en el tratamiento, inhibición y prevención de una 25 enfermedad o trastorno asociado con la expresión aberrante y/o actividad de una proteína terapéutica se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. Además, los ensayos in vitro pueden emplearse, opcionalmente, para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y la gravedad de la enfermedad o trastorno y se decidirá de acuerdo con el juicio del médico encargado y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a 30 partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo con modelos animales o in vitro.
Proteínas de fusión de la albúmina
La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión de albúmina y a dichas proteínas de fusión para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de las enfermedades o trastornos. Como se usa en el presente documento, “proteína de fusión de alúmina” se refiere a una proteína formada por la fusión de una molécula de 35 albúmina a una molécula de una proteína terapéutica. Una proteína de fusión de albúmina de la invención comprende al menos una proteína terapéutica y al menos seroalbúmina humana, que se asocian entre sí mediante fusión genética (es decir, la proteína de fusión de albúmina se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica una proteína terapéutica está unido en el marco con un polinucleótido que la albúmina) o entre sí. La proteína terapéutica y la proteína albúmina, una vez parte de la proteína de fusión de 40 albúmina, puede, cada uno, denominarse “porción”, “región” o “resto” de la proteína de fusión de albúmina.
La invención proporciona una proteína de fusión de albúmina codificada por un polinucleótido o construcción de fusión de albúmina descrita en la tabla 1 o la tabla 2. Los polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión de albúmina también entran en la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina son proteínas de fusión de albúmina codificadas por una molécula de ácido 45 nucleico que comprende o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica, una molécula de ácido nucleico que comprende, o, como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica generada como se describe en la Tabla 1 o la Tabla 2 o en los Ejemplos; o una molécula de ácido nucleico que comprende, o, 50 como alternativa, que consiste en, un polinucleótido que codifica una molécula de albúmina unida en el marco a un polinucleótido que codifica una molécula de una proteína terapéutica que comprende además, por ejemplo, uno o más de los elementos siguientes: (1) un vector de autorreplicación funcional (incluido, entre otros, un vector lanzadera, un vector de expresión, un vector de integración y/o un sistema de replicación), (2) una región para el inicio de la transcripción (p. ej., una región promotora, tal como, por ejemplo, un promotor regulable o inducible, un 55 promotor constitutivo), (3) una región para la terminación de la transcripción, (4) una secuencia líder y (5) un marcador seleccionable.
En una realización, la invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende, o, como alternativa, que consiste en, una proteína terapéutica (p. ej., como se describe en la Tabla 1) y una proteína
seroalbúmina. El componente de proteína seroalbúmina de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la seroalbúmina. La porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es la porción madura de la proteína terapéutica.
La invención proporciona una proteína de fusión de albúmina que comprende o, como alternativa, que consiste en, la porción madura de la proteína terapéutica y la porción madura de la seroalbúmina 5
La proteína de fusión de albúmina comprende HA como la porción en el extremo C y una proteína terapéutica como la porción en el extremo N.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención que comprenden una proteína terapéutica tienen una semivida prolongada en comparación con la semivida de la misma proteína terapéutica cuando no está fusionada con la albúmina. Normalmente, semivida se refiere al periodo de tiempo durante el cual la actividad terapéutica de una 10 proteína terapéutica en solución o en alguna otra formulación de conservación es estable sin una pérdida indebida de actividad terapéutica. Muchas de las proteínas terapéuticas son muy lábiles en su estado sin fusionar. Como se ha descrito más adelante, la semivida típica de estas proteínas terapéuticas es marcadamente prolongada tras la incorporación en la proteína de fusión de albúmina de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención con una semivida “prolongada” o “extendida” exhiben mayor 15 actividad terapéutica con respecto a un patrón que se ha sometido a las mismas condiciones de almacenamiento y de manipulación. El patrón puede ser la proteína terapéutica de longitud completa sin fusionar. Cuando la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de albúmina es un análogo, una variante o, por otro lado, está alterada o no incluye la secuencia completa para dicha proteína, la prolongación de la actividad terapéutica puede compararse, como alternativa, con el equivalente sin fusionar de dicho análogo, variante, péptido alterado o 20 secuencia incompleta. Como ejemplo, una proteína de fusión de albúmina de la invención puede conservar más de aproximadamente 100 % de la actividad terapéutica o más de aproximadamente 105 %, 110 %, 120 %, 130 %, 150 % o 200 % de la actividad terapéutica de un patrón cuando se somete a las mismas condiciones de almacenamiento y de manipulación que el patrón cuando se comparan en un punto de tiempo dado.
La semivida también se puede evaluar en términos de actividad terapéutica restante después del almacenamiento 25 normalizada con respecto a la actividad terapéutica cuando comenzó el almacenamiento. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención con semivida prolongada o extendida exhibida mediante una actividad terapéutica prolongada o extendida pueden conservar más de aproximadamente el 50 % de la actividad terapéutica, aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o más de la actividad terapéutica de la proteína terapéutica no fusionada equivalente cuando se somete a las mismas condiciones. Por ejemplo, como se ha tratado en el ejemplo 30 38, una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprenden la hGH fusionada con la secuencia de HA de longitud completa puede conservar aproximadamente el 80 % o más de su actividad original en solución durante periodos de hasta 5 semanas o más en varias condiciones de temperatura.
Expresión de proteínas de fusión
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden producir como moléculas recombinantes mediante 35 secreción en una línea celular humana o animal. Preferentemente, el polipéptido es secretado por las células huésped.
Los conjugados del tipo preparado por Poznansky et al., (FEBS Lett. 239:18 (1988)), en los que no se contemplan los polipéptidos preparados por separado están unidos por sobrecruzamiento químico.
La presente divulgación también incluye una célula de mamífero transformada para expresar una proteína de fusión 40 de albúmina de la invención. Además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también contempla un cultivo de dichas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonalmente homogéneo) o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Si se secreta el polipéptido, el medio contendrá el polipéptido, con las células o sin las células, si se han eliminado por filtración o centrifugación. Se conocen y se pueden usar muchos sistemas de expresión, incluyendo células animales. 45
La proteína deseada se produce de formas convencionales, por ejemplo a partir de una secuencia de codificación insertada en el cromosoma del huésped o en un plásmido libre.
Las células transformadas con éxito, es decir las células que contienen una construcción de ADN de la presente invención, se pueden identificar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de una construcción de expresión se pueden cultivar para producir el polipéptido deseado. Las células se pueden 50 recoger y lisar y analizar su contenido en ADN determinar la presencia del ADN usando un procedimiento como el descrito por Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503 o Berent et al. (1985) Biotech. 3, 208. Como alternativa, la presencia de la proteína en el sobrenadante se puede detectar usando anticuerpos.
Se han desarrollado varios procedimientos para unir funcionalmente el ADN a los vectores mediante el extremo cohesivo complementario. Por ejemplo, se pueden añadir tiras de homopolímero complementario al segmento del 55 ADN que se va a insertar en el ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se unen después mediante puentes
de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinantes.
Los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción proporcionan un procedimiento alternativo de unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN generado mediante digestión con endonucleasas de restricción se trata con la ADN polimerasa del bacteriófago T4 o la ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos monocatenarios gamma sobresalientes con sus actividades 3' 5'-exonucleolíticas y llenan los 5 extremos en 3’ rebajados con sus actividades polimerizantes.
Por tanto, la combinación de estas actividades genera segmentos de ADN con extremos romos. Después, los segmentos romos se incuban con un exceso molar grande de moléculas ligadoras en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de las moléculas de ADN de extremos romos, tal como la ADN ligasa del bacteriófago T4. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN portadores de secuencias ligadoras poliméricas 10 en sus extremos. Después, estos segmentos de ADN se escinden con la enzima de restricción adecuada y se ligan en un vector de expresión que se ha escindido con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN.
Los ligadores sintéticos que contienen diversos sitios para endonucleasas de restricción están disponibles comercialmente en una serie de fuentes, incluida International Biotechnologies Inc, New Haven, CT, EE.UU. 15
Un modo deseable de modificar el ADN de acuerdo con la invención si se van a preparar, por ejemplo, variantes de HA, es usar la reacción en cadena de la polimerasa como divulgan Saiki et al. (1988) Science 239, 497491. En este procedimiento, el ADN que se va a amplificar enzimáticamente está flanqueado por dos cebadores oligonucleotídicos específicos que son incorporados en al ADN amplificado. Los cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción que se pueden usar para clonar en vectores de 20 expresión usando procedimientos conocidos en la técnica.
La señal de terminación de la transcripción es, preferentemente, la secuencia flanqueante en 3’ de un gen eucariótico que contiene señales adecuadas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación. Secuencias flanqueantes en 3’ adecuadas pueden ser, por ejemplo, las del gen unido de forma natural a la secuencia control de la expresión usada, es decir pueden corresponder al promotor. 25
Procedimientos adicionales de la producción recombinante y sintética de las proteínas de fusión de albúmina
La presente invención también se refiere a vectores que contienen un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, células huésped y la producción de proteínas de fusión de albúmina mediante técnicas sintéticas y recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un vector fago, un plásmido, un virus o un retrovirus. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en la replicación o defectivos en la 30 replicación. En el último caso, la propagación viral generalmente solo se producirá en las células huésped de complementación.
Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden unirse a un vector que contiene un marcador seleccionable para su propagación en un huésped. En general, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico o en un complejo con un lípido cargado. Si e 35 vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una línea celular de empaquetamiento adecuada y después transducirse en las células huésped.
El inserto polinucleotídico se unirá operativamente a un promotor adecuado, tal como el promotor del fago lambda PL, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores tempranos y tardíos de SV40 y los promotores de las LTR retrovirales, por citar algunas. El experto en la técnica conocerá otros promotores adecuados. Las 40 construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio y la terminación de la transcripción, y, en la región transcrita, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción de codificación de los transcritos expresados por las construcciones incluirán, preferentemente, un codón de iniciación de la traducción al comienzo y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) colocado adecuadamente al final del polipéptido que se va a traducir. Ejemplos representativos de huéspedes adecuados incluyen, entre otros, células animales, tales como as células 45 CHO, COS, NSO, 293 y de melanoma de Bowes. Medios de cultivo adecuados y las condiciones para estas células huésped se conocen en la técnica.
Los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención se fusionan con secuencias señal que dirigirán la localización de una proteína de la invención a compartimentos concretos de una célula eucariota y/o dirigir la secreción de una proteína de la invención de una célula eucariota. 50
Los péptidos señal que se fusionan con una proteína de fusión de albúmina de la invención con el fin de dirigir su secreción en células de mamíferos son los líderes naturales de la proteína terapéutica X.
Los vectores que usan la glutamina sintasa (GS) o DHFR como marcadores seleccionables se pueden amplificar en presencia de los fármacos metionina sulfoximina o metotrexato, respectivamente. Una ventaja de los vectores basados en glutamina sintasa es la disponibilidad de líneas celulares (p. ej., la línea celular del mieloma murino 55 NSO) que son negativas para la glutamina sintasa. Los sistemas de expresión de glutamina sintasa también pueden
funcionar en las células que expresan glutamina sintasa (p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO) proporcionando inhibidor adicional para evitar el funcionamiento del gen endógeno. Un sistema de expresión de la glutamina sintasa y componentes del mismo se detallan en las publicaciones PCT: WO87/04462; WO86/05807; WO89/01036; WO89/10404; y WO91/06657. Adicionalmente, los vectores de expresión de glutamina sintasa se pueden obtener en Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH). La expresión y la producción de anticuerpos 5 monoclonales usando un sistema de expresión de GS en células de mieloma murino se describe en Bebbington y col., Bio/technology 10:169(1992) y en Biblia y Robinson Biotechnol. Prog. 11:1 (1995).
La presente invención también se refiere a células huésped que contienen las construcciones de vectores descritas con anterioridad en el presente documento y adicionalmente abarca células huésped que contienen secuencias de nucleótidos de la invención que están asociadas funcionalmente con una o más regiones control heterólogas (p. ej., 10 promotor y/o potenciador) usando técnicas conocidas en la materia. La célula huésped es una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero (p. ej., una célula derivada de ser humano). Se puede escoger una cepa huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico del modo específico deseado. La expresión de ciertos promotores se puede elevar en presencia de inductores cortina; por tanto, se puede controlar la expresión del polipéptido de ingeniería genética. Además, diferentes células 15 huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y modificación (p. ej., fosforilación, escisión) traduccional y postraduccional de proteínas. Se pueden escoger líneas celulares adecuadas para garantizar las modificaciones y procesamiento deseados de la proteína extraña expresada.
La introducción de los ácidos nucleicos y de construcciones de ácido nucleico de la invención en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección mediada por fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, 20 transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis y col., Basic Methods in Molecular Biology, (1986). Específicamente se contempla que los polipéptidos de la presente invención pueden de hecho expresarse en una célula huésped que carece de un vector recombinante.
Además de divulgar las células huésped que contienen las construcciones del vector tratadas en el presente 25 documento, también se divulgan células huésped primarias, secundarias e inmortalizadas de origen vertebrado, en particular de origen mamífero, que se han sometido a ingeniería para delecionar o reemplazar el material genético endógeno (p. ej., la secuencia de codificación correspondiente a la proteína terapéutica se puede sustituir por una proteína de fusión de albúmina correspondiente a la proteína terapéutica) y/o incluir material genético (p. ej., se pueden incluir secuencias de polinucleótidos heterólogos tales como, por ejemplo, una proteína de fusión de 30 albúmina de la invención correspondiente a la proteína terapéutica). El material genético asociado funcionalmente al polinucleótido endógeno puede activar, alterar y/o amplificar los polinucleótidos endógenos.
Además, se pueden usar técnicas conocidas en la materia para asociar funcionalmente polinucleótidos heterólogos (p. ej., polinucleótidos que codifican una proteína de albúmina) y/o regiones control heterólogas (p. ej., promotor y/o potenciador) con secuencias de polinucleótidos endógenos que codifican una proteína terapéutica mediante 35 recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Número 5.641.670, concedida el 24 de junio de 1997; la publicación internacional número WO 96/29411, la publicación internacional número WO 94/12650; Koller et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86:8932 - 8935 (1989); y Zijilstra et al., Nature 342:435 - 438 (1989)).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden recuperar y purificar de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos muy conocidos, que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, 40 extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía lectina. Más preferentemente se usa cromatografía de líquidos de alto rendimiento (“HPLC”) para purificación.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando cromatografía de intercambio 45 aniónico, incluyendo, entre otras, cromatografía en columnas de Q-sefarosa, sefarosa DEAE, poros HQ, poros DEAE, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q y DEAE, Fractogel Q y DEAE.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando cromatografía de intercambio catiónico, incluyendo, entre otros, columnas de SP-sefarosa, CM sefarosa, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toynpearl CM, Resource/Source S y CM, Fractogel S y CM, y sus equivalentes y comprables. 50
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando cromatografía de interacción hidrófoba, incluyendo, entre otras, columnas de fenilo, butilo, metilo, octilo, hexil-sefarosa, poros fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo, Toyopearl fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo Resource/Source, fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo, Fractogel fenilo, butilo, metilo, octilo, hexilo y sus equivalentes y comparables.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando cromatografía de exclusión por 55 tamaño incluyendo, entre otros, columnas de sefarosa S100, S200, S300, de resina superdex y sus equivalentes y comparables.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando cromatografía de afinidad
incluyendo, entre otros, columnas de afinidad por pigmento mimético y de afinidad por anticuerpo que son selectivos para HSA o las moléculas de “fusión diana”.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando uno o más procedimientos cromatográficos enumerados anteriormente. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se purifican usando una o más de las siguientes columnas de cromatografía. Columna Q sefarosa FF, columna SP Sefarosa FF, columna Q Sefarosa 5 de alto rendimiento, columna Blue Sefarosa FF, columna Blue, columna de fenil Sefarosa FF, columna DEAE Sefarosa FF, o columna de metilo.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden purificar usando el procedimiento descrito en la publicación internacional PCT WO 00/44772. Un experto en la técnica podría modificar fácilmente el procedimiento descrito en la misma para usar en la purificación de las proteínas de fusión de albúmina de la 10 invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden recuperar de: Productos de procedimientos de síntesis química y productos producidos mediante técnicas recombinantes de un huésped procariota o eucariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insectos y de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la 15 presente invención pueden estar glicosilado o pueden no estar glicosilados. Además, las proteínas de fusión de albúmina de al invención pueden incluir también un residuo de metionina inicial modificado, en algunos como resultado de procedimientos mediados por el huésped. Por tanto, en la técnica se conoce bien que la metionina en el extremo N codificada por el codón de iniciación de la traducción generalmente se elimina con una eficiencia elevada de cualquier proteína tras la traducción en todas las células eucariotas. Aunque la metionina en el extremo N de la 20 mayoría de las proteínas también se elimina con eficiencia en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas este procedimiento de eliminación procariota es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que está unida covalentemente la metionina en el extremo N.
También se divulgan proteínas de fusión de albúmina de la presente invención que se modifican de forma diferencial durante o después de la traducción mediante, por ejemplo, entre otros, glicosilación, acetilación, fosforilación, 25 amidación, derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a una molécula de anticuerpo o a otro ligando celular etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas, incluidas, entre otras, escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina etc. 30
Modificaciones postraduccionales adicionales incluyen, por ejemplo, cadenas de hidratos de carbono unidas a O o unidas a N, procesamiento de los extremos en N-terminal o en C-terminal), unión de restos químicos a la estructura de aminoácidos, modificaciones químicas de las cadenas de hidratos de carbono unidas a O o unidas a N, y adición o deleción de un residuo de metionina en el extremo N como resultado de la expresión en células huésped procariotas. Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como 35 un marcador enzimática, fluorescente, isotópica o de afinidad, para permitir la detección y el aislamiento de la proteína.
Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato 40 de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina, un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y acuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen yodo (111I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr,105Rh, y 45 97Ru.
Las proteínas de fusión de albúmina pueden estar unidas a quelantes macrocíclicos que se asocian con iones radiometálicos, incluidos, entre otros, 177Lu, 90Y, 166Ho, y 153Sm, a polipéptidos El ion radiometálico asociado con los quelantes macrocíclicos puede ser 111In. El ion radiometálico asociado con el quelante macrocíclico puede ser 90Y. El quelante macrocíclico puede ser ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA). Ejemplos 50 de moléculas ligadoras útiles para conjugar DOTA con un polipéptido se conocen habitualmente en la técnica, véase, por ejemplo, DeNardo y col., Clin Cancer Res. 4(10):248390 (1998); Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):5537 (1999); y Zimmerman et al, Nucl. Med. Biol. 26(8):94350 (1999).
Como se ha mencionado, las proteínas de fusión de albúmina se pueden modificar mediante procedimientos naturales, tal como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien 55 conocidas en la técnica. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o grados variables en varios sitios en un polipéptido dado. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de, por ejemplo, ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos naturales postraduccionales o pueden fabricarse mediante
procedimientos sintéticos, Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfotidilinositol, reticulación, ciclación, formación de puentes disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodinación, 5 metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas, tal como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 112 (1983); Seifter y col., 10 Meth. Enzymol. 182:626646 (1990); Rattan y col., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:4862 (1992)).
Las proteínas de fusión de albúmina también se pueden unir a soportes sólidos que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación de polipéptidos que están unidos mediante, que se unen a o se asocian con proteínas de fusión de albúmina de la invención. Dichos soportes sólidos incluyen, entre otros, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. 15
Las proteínas de fusión de albúmina, administradas solas o en combinación con factor(es) citotóxicos y/o citocina(s) se pueden usar como agente terapéutico.
Los polipéptidos de la invención se pueden recuperar y purificar a partir de síntesis química y cultivos de células recombinantes mediante procedimientos estándar, que incluyen, entre otros, precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, 20 cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción de carga hidrófoba y cromatografía con lectina. Más preferentemente se usa cromatografía de líquidos de alto rendimiento (“HPLC”) para purificación. Se pueden emplear técnicas muy conocidas para replegar proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante el aislamiento y/o la purificación. 25
La presencia y la cantidad de proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden determinar usando ELISA, un inmunoensayo bien conocido en la técnica. En un protocolo de ELISA que sería útil para detectar/cuantificar las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprende las etapas de recubrir una placa de ELISA con un anticuerpo anti-seroalbúmina humana, bloquear la placa para prevenir la unión inespecífica, lavar la placa de ELISA, añadir un anticuerpo específico anti-proteína terapéutica acoplado a un marcador detectable (como se describe en el 30 presente documento o, por otro lado, se conoce en la técnica) y detectar la presencia del anticuerpo secundario. En una versión alternativa de este protocolo, la placa de ELISA podría estar revestida con el anticuerpo específico anti-proteína terapéutica y el reactivo secundario marcado podría ser el anticuerpo específico anti-albúmina humana.
Usos de los polinucleótidos
Cada uno de los polinucleótidos identificados en el presente documento se puede usar de muchas formas como 35 reactivos. La siguiente descripción deberá considerarse de ejemplo y usa técnicas conocidas.
Los polinucleótidos de la presente invención son útiles para producir las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Como se describe con más detalle más adelante, los polinucleótidos de la invención (que codifican proteínas de fusión de albúmina) se pueden usar en procedimientos de ADN recombinante útiles en ingeniería genética para fabricar células, líneas celulares o tejidos que expresan la proteína de fusión de albúmina codificada 40 por los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Los polinucleótidos de la presente invención también son útiles en terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectivo en un esfuerzo por corregir el defecto genético. Los polinucleótidos divulgados en la presente invención ofrecen un medio para apuntar a dichos defectos génicos de un modo muy preciso. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del huésped, 45 produciendo de este modo un rasgo nuevo en la célula huésped. Ejemplos no limitantes adicionales de los procedimientos de terapia génica abarcados por la presente invención se describen más exhaustivamente en otros lugares del presente documento (véase, por ejemplo, las secciones denominadas “Terapia génica” y los ejemplos 63 y 64),
Usos de los polipéptidos 50
Cada uno de los polipéptidos identificados en el presente documento se puede usar de muchas formas. La siguiente descripción deberá considerarse de ejemplo y usa técnicas conocidas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del o los tejidos (p. ej., ensayos de inmunohistoquímica tales como, por ejemplo, inmunoperoxidasa ABC (Hsu et al., J. Histochem. Cytochem. 29:577 - 580 (1981)) o tipo(s) de células (p. ej., 55 ensayos inmunocitoquímicos).
Las proteínas de fusión de albúmina que se van a usar para analizar los niveles de polipéptidos en una muestra biológica usando procedimientos inmunohistológicos clásicos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976 - 985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087 - 3096 (1987)). Otros procedimientos útiles para detectar la expresión génica de las proteínas incluyen inmunoensayos, tales como ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA) y radioinmunoensayo (RIA). Marcadores de ensayos adecuados 5 se conocen en la técnica e incluyen marcadores enzimáticos, tales como glucosa oxidasa; radioisótopos tales como yodo (111I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn) y tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr,105Rh, y 97Ru; marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. 10
Las proteínas de fusión de albúmina e la invención también se pueden detectar in vivo mediante pruebas de imagen. Los marcadores o indicadores para las pruebas de imagen in vivo incluyen los detectables mediante radiografía X, resonancia magnética nuclear (RMN) o relajación de espín de electrones (ESR). Para la radiografía X, marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero no demasiado dañinos para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y ESR incluyen aquellos con un espín característico 15 detectable, tales como deuterio, que se puede incorporar en la proteína de fusión de albúmina marcando los nutrientes dados a una línea celular que expresa la proteína de fusión de albúmina de la invención.
Una proteína de fusión de albúmina que se ha marcado con un resto de imagen detectable adecuado, tal como un radioisótopo (por ejemplo 131I, 112In, 99mTc, (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 133In, 112In, 111mIn) y tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), 20 flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr,105Rh, 97Ru, una sustancia radiopaca o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero en el que se va a investigar el trastorno del sistema inmunológico. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de imagen usado determinarán la cantidad del resto de imagen necesaria para producir imágenes diagnósticas. En el caso de un resto radioisótopo, 25 para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada normalmente variará de aproximadamente 5 a 20 milicurios de 99mTc. La proteína de fusión de albúmina marcada preferentemente se acumulará en lugares del cuerpo (p. ej., órganos, células, espacios extracelulares o matrices) en los que se localizan uno o más receptores, ligandos o sustratos (correspondientes a los de la proteína terapéutica usada para fabricar la proteína de fusión de albúmina de la invención. La obtención de imagen del tumor in vivo se describe en S.W. Burchiel y col., 30 "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)). Un experto en la técnica podría modificar fácilmente los protocolos descritos en el mismo para usar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
También se divulga en el presente documento un procedimiento para la liberación específica de las proteínas de 35 fusión de albúmina de la invención en las células administrando las proteínas de fusión de albúmina de la invención (p. ej., polipéptidos codificados por polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o anticuerpos) asociados con polipéptidos o ácidos nucleicos heterólogos. También se divulga un procedimiento para la liberación de una proteína terapéutica en la célula diana. También se divulga un procedimiento para liberar un ácido nucleico monocatenario (p. ej., antisentido o ribozimas) o ácido nucleico bicatenario (p. ej., ADN que se 40 puede integrar en el genoma de las células o replicar episomalmente y que se puede transcribir) en la célula objetivo.
También se divulga un procedimiento para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) administrando proteínaS de fusión de albúmina en asociación con toxinas o profármacos citotóxicos.
Por “toxina” se quiere decir uno o más compuestos que se unen y activan sistemas efectores citotóxicos endógenos, 45 radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidades catalíticas de toxinas o cualquier molécula o enzima que normalmente no está presente dentro o sobre la superficie de la célula que en condiciones definidas producen la muerte de la célula. Las toxinas que se pueden usar incluyen, entre otros, radioisótopos conocidos en la técnica, compuestos tales como, por ejemplo, anticuerpos (on porciones de los mismos que contienen fijación al complemento) que se unen a un sistema efector citotóxico endógeno inherente o inducido, timidina quinasa, 50 endonucleasas, ARNasa, toxina alfa, ricina, abrina, exotoxinas A de Pseudomonas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, proteína antiviral de la hierba carmín, alfa-sarcina y toxina del cólera. “Toxina” también incluye un agente citostático o citocida, un agente teapéutico o un ion metálico radioactivo, por ejemplo emisores alfa tales como, por ejemplo, 213Bi u otros radioisótopos.
tales como, por ejemplo, 103Pd, 133Xe, 131I, 68GE, 57Co, 65Zn, 87Sr, 32P, 33S, 90Y, 153Sm,153Gd,
168Yb, 51Cr, 75Sc, 113Sn, 99Ytrio, 112Tin, 180Renio, 166Holmio y 183Renio;
marcadores luminiscentes, tales como luminol; y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina. También se divulga un procedimiento para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) administrando polipéptidos de la invención en asociación con el radioisótopo 90Y. También se divulga un procedimiento para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) administrando polipéptidos de la invención en asociación con el radioisótopo 111In. También se divulga un 5 procedimiento para la destrucción específica de células (p. ej., la destrucción de células tumorales) administrando polipéptidos de la invención en asociación con el radioisótopo 131L.
Las técnicas conocidas en la materia se pueden aplicar a polipéptidos marcadores de la invención. Dichas técnicas incluyen, entre otras, el uso de agentes de conjugación bifuncional (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425; 3.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 10 4.994.560; y 5.808.003).
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención son útiles para diagnóstico, tratamiento, prevención y/o pronóstico de varios trastornos en mamíferos, preferentemente seres humanos. Dichos trastornos incluyen, entre otros, los descritos en la sección “Actividades biológicas” del presente documento.
Se divulga un procedimiento diagnóstico de un trastorno, que implica (a) analizar el nivel de expresión de un 15 determinado polipéptido en células o fuidos corporales de un individuo usando una proteína de fusión de albúmina de la invención; y (b) comparar el nivel de expresión del polipéptido analizado con el nivel de expresión de un polipéptido patrón, de modo que un incremento o disminución del nivel de expresión del polipéptido analizado frente al nivel de expresión del polipéptido patrón es indicativo de un trastorno. Con respecto al cáncer, la presenyca de una cantidad relativamente alta del transcrito en tejido de biopsia de un individuo puede indicar una predisposición al 20 desarrollo de la enfermedad o puede proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparición de los síntomas clínicos reales. Un diagnóstico más definitivo de este tipo puede permitir que los profesionales sanitarios usen medidas preventivas o tratamiento agresivo precoz, de modo que se prevenga el desarrollo o la progresión posterior del cáncer.
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar para tratar o prevenir 25 enfermedades o afecciones, tales como, por ejemplo, trastornos neurales, trastornos del sistema inmunológico, trastornos musculares, trastornos de la reproducción, trastornos gastrointestinales, trastornos pulmonares, trastornos cardiovasculares, trastornos renales, trastornos proliferativos y/o enfermedades y afecciones cancerosas. Por ejemplo, se puede administrar a los pacientes un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo por sustituir niveles ausentes o disminuidos de un polipéptido (p. ej., un oncogén o supresor tumoral), por activar la actividad de 30 un polipéptido (p. ej., mediante la unión a un receptor), por reducir la actividad de un receptor unido a la membrana compitiendo con él por el ligando libre (p. ej., receptores solubles de TNF usados en la reducción de la inflamación) o por producir una respuesta deseada (p. ej., inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos, potenciación de la respuesta inmunitaria a células en proliferación o tejidos).
Como mímimo, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención de la presente invención se pueden 35 usar como marcadores de peso molecular sobre geles de SDS-PAGE o sobre columnas de filtración en gel para tamiz molecular usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención también se pueden usar para producir anticuerpos que, a su vez, se pueden usar para medir la expresión de proteínas de la proteína terapéutica, proteína albúmina y/o la proteína de fusión de alúmina de la invención a partir de una célula recombinante, como modo de evaluar la transformación de la célula 40 huésped o en una muestra biológica. Además, las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar para analizar las actividades biológicas descritas en el presente documento.
Actividades biológicas
Las proteínas de fusión de albúmina que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden usar en ensayos para analizar una o más actividades biológicas. Si una proteína de fusión de albúmina 45 exhibe una actividd en un ensayo concreto, es probable que la proteína terapéutica correspondiente a la proteína de fusión pueda estar implicada en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por tanto, la proteína de fusión se pidrían usar para tratar la enfermedad asociada.
En el presente documento se divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno indicado en la columna “Indicación preferida Y” de la tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho 50 tratamiento de prevención o mejora una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende la porción de proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica divulgada en la columna “Proteína terapéutica X” de la tabla 1 (en la misma fila que la enfermedad o trastorno que se va a tratar se indica en la columna "“Indicación preferida Y" de la tabla 1) en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
También se divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno indicado para una proteína 55 terapéutica concreta en la columna “Indicación preferida Y” de la tabla 1 que comprende administrar a un paciente en el que se desea dicho tratamiento, prevención o mejora una proteína de fusión de albúmina de la invención que comprende una porción de la proteína terapéutica correspondiente a la proteína terapéutica para la cual las
indicaciones en los Ejemplos están indicadas en una cantidad eficaz para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad o trastorno.
Específicamente contempladas en la presente invención están las proteínas de fusión de albúmina producidas por una célula cuando están codificadas por los polinucleótidos que codifican la SEC ID Nº Y. Cuando estos polinucleótidos se usan para expresar las proteínas codificadas de una célula, la secreción natural de la célula y las 5 etapas de procesamiento producen una proteína que carece de la secuencia señal explícitamente indicada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2. La secuencia de aminoácidos específica de la secuencia señal indicada se muestra más adelante en la memoria o es bien conocida en la técnica. Por tanto, la mayoría de las realizaciones preferidas de la presente invención incluyen la proteína de fusión de albúmina producida por una célula (que carecería de la secuencia líder mostrada en las columnas 4 y/u 11 de la tabla 2). Estas proteínas de fusión de albúmina se 10 contemplan específicamente para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad o trastorno indicado para una proteína terapéutica concreta en la columna “Indicación preferida Y" de la tabla 1.
Las proteínas de fusión de la presente invención se pueden usar en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos relacionados con enfermedades y trastornos del sistema endocrino (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos endocrinos” más adelante), el sistema nervioso (véase, por ejemplo, la 15 sección “Trastornos neurológicos” más adelante), el sistema inmunológico (véase, por ejemplo, la sección “Actividad inmunitaria” más adelante), sistema respiratorio (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos respiratorios” más adelante), sistema cardiovascular (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos cardiovasculares" más adelante), sistema reproductor (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos del sistema reproductor" más adelante), sistema digestivo (véase, por ejemplo, la sección "Trastornos gastrointestinales" más adelante), enfermedades y/o trastornos 20 relacionados con la proliferación celular (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos hiperproliferativos, más adelante) y/o enfermedades o trastornos relacionados con la sangre (véase, por ejemplo, la sección “Trastornos relacionados con la sangre”, más adelante).
Una proteína de fusión de albúmina se puede usar para diagnosticar y/o pronosticar enfermedades y/o trastornos asociados con el o los tejidos en los que se expresa el gen correspondiente a la porción de proteína terapéutica de 25 la proteína de fusión de la invención.
Por tanto, las proteínas de fusión de la invención son útiles en el diagnóstico, detección y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con actividades que incluyen, entre otros, la activación de prohormonas, la actividad de neurotransmisor, la señalización celular, la proliferación celular, la diferenciación celular y la migración celular. 30
Más generalmente, las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles para el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y/o trastornos asociados con los sistemas siguientes.
Actividad inmunitaria
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, trastornos y/o afecciones del sistema inmunitario mediante, por ejemplo, activación o 35 inhibición de la proliferación diferenciación o movilización (quimiotaxis) de las células inmunitarias. Las células inmunitarias se desarrollan a través de un proceso denominado hematopoyesis, produciendo células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotenciales. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o afecciones inmunitarias pueden ser enfermedades genéticas, somáticas, tales como cáncer y algunas enfermedades autoinmunitarias, adquiridas (p. ej., 40 mediante quimioterapia o toxinas) o infecciosas. Además, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno concreto del sistema inmunológico.
Una proteína de fusión de la invención se puede usar para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunológico y/o para inhibir o potenciar una respuesta inmunitaria generada por células asociadas con el o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención. 45
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de inmunodeficiencias, incluidas inmunodeficiencias tanto congénitas como adquiridas. Ejemplos de inmunodeficiencias de los linfocitos B en los que los niveles de inmunoglobulinas, la función de los linfocitos B y la cifra de los linfocitos B están disminuidos incluyen: agammaglobulinemia ligada cromosoma X (enfermedad de Bruton), agammaglobulinemia infantil ligada al cromosoma X, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X con hiper 50 IgM, inmunodeficiencia no ligada al cromosoma X con hiper IgM, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (XLP), agammaglobulinemia incluyendo agammaglobulinemia congénita y adquirida, agammaglobulinemia de inicio en la edad adulta, agammaglobulinemia de inicio tardío, disgammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia, hipogammaglobulinemia inespecífica, agammaglobulinemia recesiva (de tipo suizo), deficiencia selectiva de IgM, deficiencia selectiva de IgA, deficiencias selectivas de la subclase de IgG, deficiencia de la subclase de IgG (con o 55 sin deficiencia de IgA), deficiencia de Ig con deficiencia de IgM, IgG e IgA incrementada con IgM incrementada, deficiencia de anticuerpos con Ig normales o elevadas, deleciones de la cadena pesada de Ig, deficiencia de la cadena kappa, trastorno linfoproliferativo de linfocitos B (TLPLB), inmunodefIciencia variable común (IDVC),
inmunodefIciencia variable común (IVC) (adquirida), e hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia.
La ataxia telangiectasia o afecciones asociadas con ataxia telangiectasia se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando las proteínas de fusión de la invención.
Ejemplos de inmunodeficiencias congénitas en las que la función y/o el número de linfocitos T y/o linfocitos B está disminuido incluyen, entre otros: anomalía de DiGeorge, inmunodeficiencias combinadas graves (IDCG) (incluyendo, 5 entre otos, IDCG ligada al cromosoma X, IDCG autonómica recesiva, deficiencia de la adenosina desaminasa, deficiencia de la nucleósido purina fosforilasa (PNP), deficiencia del MHC de clase II (SÍNDROME del iinfocito desnudo), síndrome de Wiskott-Aldrich y ataxia telangiectasia), hipoplasia del timo, síndrome de la tercera y cuarta bolsa faríngea, deleción de 22q11,2, candidiasis mucocutánea crónica, deficiencia de células aseisnas naturales (NK), linfocitopenia T CD4+ idiopática, inunodeficiencia con defecto de linfocitos T predominantes (inespecífica) e 10 inmunodeficiencia inespecífica de inmunidad celular.
La anomalía de DiGeorge o afecciones asociadas con la anomalía de DiGeorge se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando las proteínas de fusión de la invención.
Otras inmunodeficiencias que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar usando proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, enfermedad granulomatosa crónica, síndrome de Chédiak-Higashi, deficiencia de 15 la mieloperoxidasa, deficiencia de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de leucocitos, síndrome linfoproliferativo ligado al cromosoma X (LPX), deficiencia de la adhesión de leucocitos, deficiencias del componente del complemento (incluyendo deficiencias de C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 y/o C9), disgenesia reticular, alinfoplasiaaplasia tímica, inmunodeficienia con timoma, leucopenia congénita grabe, displasia con inmunodeficiencia, neutropenia nenonatal, enanismo de extremidades cortas e inmunodeficiencia combinada con 20 síndrome de Nezelof con Ig.
Las inmunodeficiencias y/o afecciones asociadas con las inmunodeficiencias citadas anteriormente se tratan, presenta, diagnostican y/o pronostican usando las proteínas de fusión de la invención.
Las proteínas de fusión de la invención s epueden usar como agentes para reforzar la capacidad de respuesta inmunitaria entre individuos inmunodeficientes. Las proteínas de fusión de la invención s epueden usar como 25 agentes para reforzar la capacidad de respuesta inmunitaria entre individuos inmunodeficientes de linfocitos B y/o linfocitos T.
Las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o pronóstico de trastornos autoinmunitarios. Muchos trastornos autoinmunitarios son el resultado de un reconocimiento inadecuado de lo propio como material extraño por parte de las células inmunitarias. Este reconocimiento inadecuado tiene como 30 resultado una respuesta inmunitaria que conduce a la destrucción del tejido huésped. Por tanto, la administración de proteínas de fusión de la invención que puede inhibir una respuesta inmunitaria, en particular la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de linfocitos T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de trastornos autoinmunitarios.
Las enfermedades o los trastornos autoinmunitarios que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar 35 mediante las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otras, uno o más de los siguientes: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica, trombocitopenia, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, trombocitopenia neonatal autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, púrpura (p. ej., púrpura de Henloch-Scoenlein), autoinmunocitopenia, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, 40 miastenia gravis, enfermedad de Graves (hipertiroidismo) y diabetes mellitus resistente a insulina.
Trastornos adicionales que probablemente tengan un componente autoinmunitario que se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, artritis inducida por colágeno de tipo II, síndrome antifosfolípidos, dermatitis, encefalomielitis alérgica, miocarditis, policondritis recidivante, enfermedad cardíaca reumática, neuritis, uveítis, oftalmia, poliendocrinopatías, enfermedad de Reiter, 45 síndrome de Stiff-Man, inflamación pulmonar autoinmunitaria, autismo, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus dependiente de insulina y trastornos oculares inflamatorios autoinmunitarios.
Trastornos adicionales que probablemente tengan un componente autoinmunitario que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención y/o polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, esclerodermia con anticuerpos anti-50 colágeno (a menudo caracterizados por, por ejemplo, anticuerpos nucleares y otros nucleares), enfermedad del tejido conjuntivo mixto (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos frente a antígenos nucleares extraíbles (p. ej., ribonucleoproteína)), polimiositis (a menudo caracterizada por, por ejemplo, ANA no histonas), anemia perniciosa (a menudo caracterizada por, por ejemplo, células antiparietales, microsomas y anticuerpos frente al factor intrínseco), enfermedad de Addison idiopática (a menudo caracterizada por, por ejemplo, citotoxicidad 55 humoral y celular), infertilidad (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos antiespermatozoicos), glomerulonefritis (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos frente a la membrana basal glomerular o complejos inmunitarios), penfigoide ampolloso (a menudo caracterizado por, por ejemplo, IgG y complemento en la
membrana basal), síndrome de Sjogren (a menudo caracterizado por, por ejemplo, anticuerpos de múltiples tejidos y/o ANA no histonas específicos (SS-B)), diabetes mellitus (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos de las células de los islotes humorales y celulares) y resistencia a fármacos adrenérgicos (incluida la resistencia a fármacos adrenérgicos con asma o fibrosis quística) (a menudo caracterizar por, por ejemplo, anticuerpos frente a los receptores beta-adrenérgicos). 5
Trastornos adicionales que pueden tener un componente autoinmunitario que se puede tratar, prevenir, diagnosticar y/o proponer con las proteínas de fusión de la albúmina de la invención incluyen, entre otros, hepatitis crónica activa (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos del músculo liso), cirrosis biliar primaria (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos mitocondriales), otra insuficiencia de glándulas endocrinas (a menudo caracterizado por, por ejemplo, anticuerpos específicos de tejido en algunos casos), vitíligo (a menudo caracterizado 10 por, por ejemplo, anticuerpos de melanocitos), vasculitis (a menudo caracterizada por, por ejemplo, Ig y complemento en las paredes vasculares y/o complemento bajo en suro), post-M1 (a menudo caracterizadO por, por ejemplo, anticuderpos miocárdicos), síndrome de cardiotomía (a menudo caracterizado por, por ejemplo, anticuerpos miocárdicos), urticaria (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos IgG e IgM contra IgE), dermatitis atópica (a menudo caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos IgG e IgM contra IgE), asma (a menudo 15 caracterizada por, por ejemplo, anticuerpos IgG e IgM contra IgE) y muchos otros trastornos inflamatorios, granulomatosos, degenerativos y atróficos.
Las enfermedades autoinmunitarias y trastornos y/o afecciones asociadas con las enfermedades y trastornos citados anteriormente se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican usando, por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención. La artritis reumatoide se puede tratar, prevenir y/o diagnosticar usando las proteínas de fusión de la 20 invención.
El lupus eritematoso sistémico se trata, previene y/o diagnostica usando las proteínas de fusión de la invención, la púrpura trombocitopénica idiomática se trata, previene y/o diagnostica usando las proteínas de fusión de la invención.
La nefropatía por IgA se puede tratar, prevenir y/o diagnosticar usando las proteínas de fusión de la invención. 25
Las enfermedades autoinmunitarias y trastornos y/o afecciones asociadas con las enfermedades y trastornos citados anteriormente se tratan, previenen, diagnostican y/o pronostican usando, por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención.
Las proteínas de fusión de la invención se pueden usar como agente(s) inmunosupresores.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención, diagnóstico y/o 30 pronóstico de enfermedades, trastornos y/o afecciones de las células hematopoyéticas. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían usar para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo células madre pluripotenciales, en un esfuerzo para tratar o prevenir dihcas enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con una disminución de determinados (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, entre otros, leucopenia, neutropenia, anemia y trombocitopenia. Como 35 alternativa, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se podrían usar para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo células madre pluripotenciales, en un esfuerzo para tratar o prevenir dihcas enfermedades, trastornos y/o afecciones asociadas con un incremento de determinados (o muchos) tipos de células hematopoyéticas, incluyendo, entre otros, histiocirrosis.
Las reacciones alérgicas y afecciones como asma (en particular, asma alérgica) u otros problemas respiratorios 40 también se pueden tratar, prevenir, diagnosticar /o pronosticar usando las proteínas de fusión de la invención. Además, estas moléculas se pueden usar para tratar, prevenir, pronosticar y/o diagnosticar anafilaxia, hipersensibilidad a una molécula antigénica o incompatibilidad de grupo sanguíneo.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar las reacciones alérgicas mediadas por IgE. Dichas reacciones alérgicas incluyen, entre otras, asma, 45 rinitis y eccema. Las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para modular las concentraciones de IgE in vitro o in vivo.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención tienen usos en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de afecciones inflamatorias. Por ejemplo, ya que las proteínas de fusión de la invención pueden inhibir la activación, proliferación y/o diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria, estas moléculas se 50 pueden usar para prevenir y/o tratar afecciones inflamatorias crónicas y agudas. Dichas afecciones inflamatorias incluyen, entre otras, por ejemplo, inflamación asociada con infección (p. ej., shock séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica), lesión por reperfusión tras isquemia, letalidad de endotoxina, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, hiperproducción de citocinas (p. ej., TNF o IL-1.), trastornos respiratorios (p. ej., 55 asma y alergia); trastornos gastrointestinales (p. ej., enfermedad intestinal inflamatoria); cánceres (p. ej., gástrico, ovárico, pulmonar, de vejiga, hepático y de mama); trastornos de SNC (p. ej., esclerosis múltiple, lesión cerebral isquémica y/o ictus, lesión cerebral traumática, trastornos neurodegenerativos (p. ej., enfermedad de Parkinson y
enfermedad de Alzheimer); demencia relacionada con el SIDA; y enfermedad de priones); trastornos cardiovasculares (p. ej., aterosclerosis, miocarditis, enfermedad cardiovascular y complicación por derivación cardiopulmonar); así como muchas enfermedades, afecciones y trastornos adicionales que se caracterizan por inflamación (p. ej., hepatitis, artritis reumatoide, gota, traumatismo, pancreatitis, sarcoidosis, dermatitis, lesión por reperfusión tras isquemia renal, enfermeda de Grave, lupus eritematosos sistémico, diabetes mellitus y rechazo de 5 transplante alogénico).
Dado que la inflamación es un mecanismo de defensa fundamental, los trastornos inflamatorios pueden afectar a casi cualquier tejido del cuerpo. De acuerdo con lo anterior, las proteínas de fusión de la invención tienen usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios específicos de tejido, incluyendo, entre otros, adrenalitis, alveolitis, angiocolecistitis, apendicitis, balanitis, blefaritis, bronquitis, bursitis carditis, celulitis, cervicitis, colecistitis, corditis, 10 coclitis, colitis, conjuntivitis, cistitis, dermatitis, diverticulitis, encefalitis, endocarditis, esofagitis, eustaquitis, fibrositis, foliculitis, gastritis, gastroenteritis, gingivitis, glositis, hepatosplenitis, queratitis, laberintitis, laringitis, linfangitis, mastitis, otitis media, meningitis, metritis, mucitis, miocarditis, miosititis, miringitis, nefritis, neuritis, orquitis, osteocondritis, otitis, pericarditis, peritendonitis, peritonitis, faringitis, flebitis, poliomielitis, prostatitis, pulpitis, retinitis, rinitis, salpingitis, escleritis, esclerocoroiditis, escrotitis, sinusitis, espondilitis, esteatitis, estomatitis, sinovitis, siringitis, 15 tendinitis, amigdalitis, uretritis y vaginitis.
Las proteínas de fusión de la invención pueden ser útoles para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar los rechazos de transplantes de órganos y la enfermedad del injerto contra el huésped. El rechazo de órganos se produce por la destrucción de las células inmunitarias huésped de tejido transplantado a través de una respuesta inmunitaria. De un modo similar, una respuesta inmunitaria también está implicada en el EICH pero, en este caso, 20 las células inmunitarias transplantadas extrañas destruyen los tejidos del huésped. Los polipéptidos y/o agonstas o antagonistas de los mismos que inhiben una respuesta inmunitaria, en particular la atcivación, proliferación, diferenciación o quimiotaxis de linfocitos T pueden ser un tratamiento eficaz en la prevención del rechazo de órganos o la EICH. Las proteínas de fusión de la invención que inhiben una respuesta inmunitaria, en particular la activación, proliferación, diferenciación o quimiotaxis de linfocitos T pueden ser un tratamiento eficaz en la prevención de la 25 alergia experimental y el rechazo hiperagudo de xenoinjerto.
Las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar enfermedades del complejo inmunitario incluyendo, entre otras, la enfermedad del suero, glomerulonefritis postinfección por estreptococos, poliarteritis nodosa y vasculitis inducida por complejo inmunitario.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar, detectar y/o prevenir agentes 30 infecciosos. Por ejemplo, incrementando la respuesta inmunitaria, en particular incrementando la proliferación, activación y/o diferenciación de los linfocitos B y/o T, las enfermedades infecciosas se pueden tratar, detectar y/o prevenir. La respuesta inmunitaria se puede aumentar potenciando una respuesta inmunitaria existente o iniciando una respuesta inmunitaria nueva. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención también pueden inhibir directamente el agente infeccioso (consúltese la sección de la solicitud en la que se enumeran los agentes 35 infecciosos etc.) sin necesariamente provocar una respuesta inmunitaria.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan como adyuvante de vacuna que potencia la capacidad de respuesta inmunitaria a un antígeno. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan como adyuvante para potenciar las respuestas inmunitarias específicas de tumor.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan como adyuvante para potenciar las respuestas 40 inmunitarias antivirales. Las respuestas inmunitarias antivirales que se pueden potenciar usando las composiciones de la invención como adyuvante incluyen virus y enfermedades asociadas con virus o síntomas descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la técnica. En realizaciones específicas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a un virus, enfermedad o síntomas seleccionado del grupo que consiste en: SIDA, meningitis, Dengue, EBV y hepatitis (p. ej., 45 hepatitis B). Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar ula respuesta inmunitaria a un virus, enfermedad o síntoma seleccionados del grupo que consiste en: VIH/SIDA, virus sincitial respiratorio, Dengue, rotavirus, encefalitis B japonesa, gripe A y B, parainfluenza, sarampión, citomegalovirus, rabia, Junin, Chikungunya, fiebre del valle del Rift, herpes simple y fiebre amarilla.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se usan como adyuvante para potenciar las respuestas 50 inmunitarias antibacterianas o antifúngicas. Las respuestas inmunitarias antibacterianas o antifúngicas que s epueden potenciar usando las proteínas de fusión de albúmina de la invención como adyuvante incluyen bacterias u hongos y enfermedades o síntomas asociados con bacteria su hongos descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la técnica. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionados 55 del grupo que consiste en: tétanos, difteria, botulismo y meningitis de tipo B.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a una bacteria u hongo, enfermedad o síntoma seleccionados del grupo que consiste en: Vibrio cholerae, Mycobacterium leprae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Meisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,
Group B streptococcus, Shigella spp., Enterotoxigenic Escherichia coli, Enterohemorrhagic E. coli y Borrelia burgdorferi.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar adyuvante para potenciar las respuestas inmunitarias antiparasitarias. Las respuestas inmunitarias antiparasitarias que se pueden potenciar usando las proteínas de fusión de albúmina de la invención como adyuvante incluyen parásitos y enfermedades o síntomas 5 asociados con parásitos pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria descritos en el presente documento o conocidos de otro modo en la técnica. Las las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a un parásito. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como adyuvante para potenciar una respuesta inmunitaria a Plasmodio (paludismo) o Leishmania. 10
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para tratar enfermedades infecciosas, incluidas silicosis, sarcoidosis y fibrosis pulmonar idiopática; por ejemplo, impidiendo el reclutamiento y activación de fagocitos mononucleares.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como antígeno para la gneración de anticuerpos para inhibir o potenciar respuestas inmunitarias contra polipéptidos de la invención. 15
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar a un animal (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdo, cerdo enano, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano y ser humano, más preferentemente ser humano) para refirzar el sistema inmunológico para producir cantidades crecientes de uno o más anticuerpos (p ej., IgG, IgA, IgM e IgE), para inducir la producción de anticuerpos de mayor afinidad y el cambio de clase de inmunoglobulinas (p. ej., IgG, IgA, IgM e IgE), y/o aumentar una respuesta 20 inmunitaria.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como estimulantes de la respuesta de linfocitos B a los patógenos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como activadores de linfocitos T.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes que elevan el estado inmunitario 25 de un individuo antes de la recepción de las terapias inmunosupresoras.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para inducir anticuerpos de afinidad.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para incrementar las concenrtraciones en suero de inmunoglobulina. 30
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para acelerar la recuperación de los individuos inmunocomprometidos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención s epueden usar como agentes para reforzar la capacidad de respuesta inmunitaria entre poblaciones ancianas y/o neonatos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como potenciador del sistema inmunológico 35 antes, durante o después del transplante de médula ósea y/u otros transplantes (p. ej., transplante alogénico o xenogénico de órganos). Con respecto al transplante, las composiciones de la invención se pueden administrar antes de, de forma concomitante con y/o después del transplante. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se administran después del transplante, antes del comienzo de la recuperación de las poblaciones de linfocito sT. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar primero después del 40 transplante, después del comienzo de la recuperación de las poblaciones de linfocitos T, pero antes de la recuperación completa de las poblaciones de linfocitos B.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agente para reforzar la capacidad de respuesta inmunitaria entre individuos que tienen una pérdida adquirida de la función de los linfocitos B. Las afecciones que dan lugar a una pérdida adquirida de la función de los linfocitos B que se puede mejorar o tratar 45 administrando las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, infección por VIH, SIDA, transplante de médula ósea y leucemia linfocítica crónica (LLC) de linfocitos B.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para reforzar la capacidad de respuesta inmunitaria entre individuos que tienen una deficiencia inmunitaria temporal. Las afecciones que dan lugar a una deficiencia inmunitaria temporal que se puede mejorar o tratar administrando las proteínas de fusión de 50 albúmina de la invención incluyen, ente otros, recuperación de infecciones virales (p. ej., gripe), afecciones asociadas con malnutrición, recuperación de mononucleosis infeccosa o afecciones asociadas con estrés, recuperación del sarampión, recuperación de transfusión sanguínea y recuperación de cirugía.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como reguladores de la presentación de
antígenos por los monocitos, las células dendríticas y/o los linfocitos B. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención potencian la presentación de antígeno o antagonizan la presentación de antígeno in vitro o in vivo. Además, esta potenciación o antagonismo de la presentación de antígeno puede ser útil como tratamiento antitumoral o para modular el sistema inmunológico.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para dirigir el sistema 5 inmunológico del individuo al desarrollo de una respuesta humoral (es decir, TH2) frente a una respuesta celular TH1.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como medios para inducir la proliferación del tumor y, por tanto, lo hacen más susceptible a agentes antineoplásicos. Por ejemplo, el mieloma múltiple es una enfermedad de división lenta y, por tanto, resistente a casi todos los regímenes antineoplásicos. Si se obligara a 10 estas células a proliferar con mayor rapidez, probablemente cambiaría su perfil de susceptibilidad.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como estimulantes de la producción de linfocitos B en enfermedades tales como SIDA, trastorno linfocitario crónico y/o inmunodeficiencia variable común.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como terapia para la generación y/o regeneración de tejidos linfoides tras cirugía, traumatismos o defectos genéticos. Las proteínas de fusión de 15 albúmina de la invención se pueden usar en el pretratamiento de las muestras de médula ósea antes del transplante.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como terapia a base de genes para trastornos hereditarios genéticamente que dan lugara incompetencia inmunitaria/inmunodeficiencia, tal como lo observado entre los pacientes con IDCG.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como medios de activación de los 20 monocitos/macrófagos para defender contra enfermedades parasitarias que afectan a los monocitos, tales como leishmaniosis.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como medios de regulación de citocinas secretadas producidas por polipéptidos de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar en una o más de las aplicaciones descritas en 25 el presente documento, así como se pueden aplicar a medicina veterinaria.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como medios de bloqueo de varios aspectos de las respuestas inmunitarias a agentes extraños o propios. Ejemplos de enfermedades o afecciones en las que se puede desear el bloqueo de determinados aspectos de las respuestas inmunitarias incluyen trastornos autoinmunitarios, tales como lupus y artritis, así como respuestas inmunitarias a alergias cutáneas, inflamación, 30 enfermedad intestinal, lesiones y enfermedades/trasyornos asociados con patógenos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como terapia para prevenir la proliferación de linfocitos B y la secreción de Ig asociada con enfermedades autoinmunitarias tales como púrpura trombocitopénica idiomática, lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple.
Los polipéptidos de las presentes proteínas de fusión de la invención se pueden usar como inhibidores de la 35 migración de los linfocitos B y/o T en células endoteliales. Esta actividad altera la arquitectura tidular o las respuestas afine sy es útil para, por ejemplo, alterar las respuestas inmunitarias y bloquear la sepsis.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como terapia para la hipergammaglobulinemia crónica evidente en enfermedades tales como gammopatía monoclonal de significado indeterminado (GMSI), enfermedad de Waldenstrom, gammapatías monoclonales idiopáticas relacionadas y plasmacitomas. 40
La proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para, por ejemplo, inhibir la quimiotaxis del polipéptido y la activación de los macrófagos y sus precursores, y de los neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunas subpoblaciones de células T, por ejemplo células T activadas y CD8 citotóxicas y células asesinas naturales, en determinadas enfermedades autoinmunitarias, e infecciosas e inflamatorias crónicas. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias se describen en el presente documento e incluyen esclerosis múltiple y diabetes dependiente de 45 insulina.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para tratar el síndrome hipereosinófilo mediante, por ejemplo, la prevención de la producción y migración de eosinófilos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para potenciar o inhibir la lisis celular mediada por el complemento. 50
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para potenciar o inhibir la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para tratar la aterosclerosis mediante, por ejemplo, la prevención de la infiltración de monocitos en la pared arterial.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar el síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles para estimular la reparación de heridas y 5 tisular y/o estimular la reparación de enfermedades o trastornos vasculares o linfáticos. Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para estimular la regeneración de superficies mucosas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, tratar y/o prevenir un trastorno caracterizado por inmunodeficiencia primaria o adquirida, producción deficiente de inmunoglobulina en suero, infecciones recurrentes y/o disfunción del sistema inmunológico. Adicionalmente, las 10 proteínas de fusión de la invención se pueden usar para tratar o prevenir infecciones de las articulaciones, los huesos, la piel y/o las glándulas paratifoideas, infecciones transmitidas por la sangre (p. ej., sepsis, meningitis, artritis séptica y/o osteomielitis), enfermedades autoinmunitarias (p. ej., las divulgadas en el presente documento), trastornos inflamatorios y neoplasias malignas y/o cualquier enfermedad o trastorno o afección asociada con estas infecciones, enfermedades, trastornos y/o neoplasias malignas) incluyendo, entre otros, IDVC, otras 15 inmunodeficiencias primarias, enfermedad por VIH, LLC, bronquitis recurrente, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, neumonía, hepatitis, meningitis, herpes zóster (p. ej., herpes zóster grave) y/o pneumocystis carnii. Otas enfermedades y trastornos que se pueden prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otras, infección por VIH, infección por HTLV-BLV, linfopenia, anemia por disfunción bactericida de los fagocitos, trombocitopenia y hemoglobinuria. 20
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar y/o diagnosticar a un individuo con enfermedad por inmunodeficiencia variable común (“IDVC”, también conocida como “agammaglobulinemia adquirida” e “hipogammaglobulinemia adquirida”) o un subconjunto de esta enfermedad.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar cánceres o neoplasias. incluyendo cánceres o neoplasias elacionadas con las células inmunitarias o con el 25 tejido inmunitario. Ejemplos de cánceres o neoplasias que se pueden prevenir, diagnosticar o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, anemia linfocítica aguda (LLA), leicemia linfocítica crónica, plasmacitomas, mieloma múltiple, linfoma de Burkitt, enfermedades transformadas por el EBV y/o enfermedades y trastornos descritos en la sección titulada “Trastornos hiperproliferativos" en otro lugar en el presente documento. 30
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como terapia para disminuir la proliferación celular de los linfomas de linfocitos B grandes.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como medios para reducir la implicación de los linfocitos T y la Ig asociadas con la leucemia mielógena crónica.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como agentes para reforzar la capacidad de 35 respuesta inmunitaria entre los individuos inmunodeficientes de linfocitos B tales como, por ejemplo, un individuo que ha sufrido una esplenectomía parcial o completa.
Trastornos relacionados con la sangre
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para modular la actividad hemostática (cese del sangrado) o trombolítica (disolución de coágulos). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o trombolítica, 40 las proteínas de fusión de la invención se podrían usar para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y/o afecciones de la coagulación de la sangre (p. ej., afibrinogenemia, deficiencias de factores, hemofilia), enfermedades, trastornos y/o afecciones de las plaquetas sanguíneas (p. ej., trombocitopenia) o heridas resultantes de traumatismos, cirugías u otras causas. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención que pueden disminuir la actividad hemostática o trombolítica se podrían usar para inhibir o disolver los coágulos. Estas moléculas 45 podrían ser importantes en el tratamiento o prevención de ataques cardíacos (infartos), ictus o cicatrización.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar la trombosis, la trombosis arterial, la trombosis venosa, la tromboembolia, la embolia pulmonar, la aterosclerosis, el infarto de miocardio, el ataque isquémico transitorios, la angina inestable. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para la prevención de la oclusión de injertos en la safena, para reducir 50 el riesgo de la trombosis alrededor de un procedimiento que podría acompañar a procedimientos de angioplastia, para reducir el riesgo de ictus en pacientes con fibrilación auricular, incluyendo la fibrilación auricular no reumática, para reducir el riesgo de embolia asociada con válvulas cardíacas mecánicas y/o la enfermedad de la válvula mitral. Otros usos para las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, la prevención de oclusiones en dispositivos extracorpóreos (p. ej., cánulas intravasculares, derivaciones del acceso vascular en 55 pacientes en hemodiálisis, máquinas de hemodiálisis y máquinas de derivación cardiopulmonar).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para prevenir, diagnosticar, pronosticar y/o tratar enfermedades y trastornos de la sangre y/o de los órganos formadores de la sangre asociadas con el o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para modular la actividad hematopoyética (la formación de células sanguíneas). Por ejemplo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar 5 para aumentar la cantidad de todas o sibpoblaciones de células sanguíneas, tales como, por ejemplo, eritrocitos, linfocitos (linfocitos B o T), células mieloides (p. ej., basófilos, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos mastocitos) y plaquetas. La capacidad para disminuir la cantidad de las células sanguíneas o de las subpoblaciones de las células sanguíneas pueden ser útiles en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de anemias y leucopenias descritas más adelante. Como alternativa, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para 10 disminuir la cantidad de todas o subpoblaciones de células sanguíneas, tales como, por ejemplo, eritrocitos, linfocitos (linfocitos B o T), células mieloides (p. ej., basófilos, eosinófilos, neutrófilos, macrófagos mastocitos) y plaquetas. La capacidad para disminuir la cantidad de las células sanguíneas o de las subpoblaciones de las células sanguíneas pueden ser útiles en la prevención, detección, diagnóstico y/o tratamiento de leucocitosis, tales como, por ejemplo eosinofilia. 15
las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para prevenir, tratar o diagnosticar la discrasia sanguínea.
Las anemias son afecciones en las que el número de glóbulos rojos o la cantidad de hemoglobina (la proteína transpotadora del oxígeno) en ellos está por debajo de lo normal. La anemia se puede deber a una hemorragia excesiva, a disminución de la producción de células sanguíneas o al incremento de la destrucción de glóbulos rojos (hemolisis). Las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico 20 de las anemias. Las anemias que se pueden tratar, prevenir o diagnosticar mediante las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen anemia por déficit de hierro, anemia hipocrómica, anemia microcítica, clorosis, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica adquirida idiomática, aplasia de glóburlos rojos, anemia megaloblástica (p. ej., anemia perniciosa (deficiencia de vitamina B12) y anemia por deficiencia de ácido fólico), anemia aplásica, anemias hemolíticas (p. ej., anemia hemolítica autoinmunitarias, anemia hemolítica 25 micrpangiopática y hemoglobinuria nocturna paroxística). Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de anemias asociadas con enfermedades, incluyendo, entre otras, anemias asociadas con lupus eritematoso sistémico, cánceres, linfomas, enfermedad renal crónica y esplenomegalia. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de anemias que se producen por tratamienos farmacológicos tales como anemias 30 asociadas com metildopa, dapsona y sulfas. Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de anemias asociadas con una arquitectura anormal de los glóbulos rojos, incluyendo, entre otros, esferocitosis hereditaria, eliptocitosis hereditaria, deficiencia de la glucosa-6-fosfato deshidrogenada y drepanocitosis.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico 35 de anomalías de la hemoglobina (p. ej., las asociadas con la drepanocitosis, la enfermedad de la hemoglobina C, la enfermedad de la hemoglobina S-C y la enfermedad de la hemoglobina E). Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de las talasemias, incluyendo, entre otras, las formas mayoritarias y minoritarias de alfa-talasemia y beta-talasemia.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevenció y/o 40 tratamiento de trastornos hemorrágicos incluyendo, entre otros, trombocitopenia (p. ej., púrpura trombocitopénica idopática y púrpura trombocitopénica trombótica), enfermedad de Von Willebrand, trastornos plaquetarios hereditarios (p. ej., enfermedad del almacenamiento tal como síndrome de Chediak-Higashi y de Hermansky-Pudlak, disfunción del tromboxano A2, tromboastenia y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome irémico hemolótico, hemofilias tales como hemofilia A o deficiencia del factor VII y enfermedad de Christmas o deficiencia del factor IX, 45 telangiectasia hemorrágica hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.
El efecto de las proteínas de fusión de albúmina de la invención sobre el tiempo de coagulación de la sangre se puede monitorizar usando cualquiera de las pruebas de coagulación conocidas en la materia incluyendo, entre otras, el tiempo de tromboplastina parcial de sangre entera (PTT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), el 50 tiempo de coagulación activada (ACT), el tiempo de coagulación activada recalcificada o el tiempo de coagulación de Lee-White.
Varias enfermedades y diversos fármacos pueden producir disfunción plaquetaria. Por tanto, en una realización específica, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la disfunción plaquetaria adquirida, tales como la disfunción plaquetaria que 55 acompaña a la insuficiencia renal, leucemia, mieloma múltiple, cirrosis hepática y lupus eritemaroso sistémico, así como la disfunción plaquetaria asociada con tratamientos farmacológicos, incluyendo el tratamiento con aspirina, ticlopidina, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (usados para la artritis, el dolor y los esguinces)y penicilina a dosis altas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos caracterizados por o asociados con un incremento o disminución de los números de glóbulos blancos. Se produce leucopenia cuando el número de glóbulos blancos disminuye por debajo de lo normal. Las leucopenias incluyen, entre otros, neutropenia y linfocitopenia. Un incremento en el número de glóbulos blancos en comparación con lo normal se conoce como leucocitosis. El cuerpo genera números 5 incrementados de glóbulos blancos durante las infecciones. Por tanto, la leucocitosis puede simplemente ser un parámetro fisiológico que refleja la infección. Como alternativa, la leucocitosis puede ser un indicador de lesión u otra enfermedad, tal como cáncer. Las leucocitosis incluyen, entre otros, eosinofilia y acumulaciones de macrófagos. Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la leucopenia. Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, 10 pronóstico, prevención y/o tratamiento de la leucocitosis.
La leucopenia puede ser una disminución generalizada de todos los tipos de glóbulos blancos y puede ser una depleción específica de tipos concretos de glóbulos blancos. Por tanto, las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de la disminución del número de neutrófilos, conocida como neutropenia. Las neutropenias que se pueden diagnosticar, proponer, prevenir y/o 15 tratar con las proteínas de fusión de albúmina la invención incluyen, entre otras, agranulocitosis genética infantil, neutropenia familiar, neutropenia cíclica, neutropenias resultantes de o asociadas con deficiencias en la dieta (p. ej., deficiencia de vitamina B 12 o deficiencia de ácido fólico), neutropenias resultantes de o asociadas con tratamiento farmacológicos (p. ej., regímenes antibióticos tales como tratamiento con penicilina, tratamiento con sulfonamidas, tratamiento con anticoagulantes, fármacos anticonvulsivos, fármacos antitiroides y quimoterapia para el cáncer) y 20 neutropenias resultantes de la desctrucción incrementada de neutrófilos que se puede producir en asociación con algunas infecciones bacterianas o víricas, trastornos alérgicos, enfermedades autoinunitarias, afecciones en las que un individuo presenta esplenomegalia (p. ej., síndrome Felty, malaria y sarcoidosis), y algunos regímenes teraéuticos farmacológicos.
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o 25 tratamiento de linfocitopenias (número disminuido de linfocitos B y/o T), incluyendo, entre otras, linfocitopenias resultantes o asociadas con estrés, tratamientos farmacológicos (p. ej., tratamiento farmacológico con corticosteroides, quimioterapias contra el cáncer y/o radioterapias), infección por SIDA y/u otras enfermedades, tales como, por ejemplo, cáncer, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, infecciones crónicas, algunas infecciones víricas y/o trastornos hereditarios (p. ej., síndrome de DiGeorge, síndrome de Wiskott-Aldrich, 30 inmunodeficiencia combinada grave, ataxia telangiectsia).
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con los números de macrófagos y/o la función de los macrófagos incluyendo, entre otras, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Letteerer-Siwe y enfermedad de Hand-Sculler-Christian. 35
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con los números de eosinófilos y/o la función de los eosinófilos incluyendo, entre otras, síndrome hipereosinófilo idiomático, síndrome de eosinofilia-mialgia y enfermedad de Hand-Schuller-Christian.
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o 40 tratamiento de leucemias y linfomas incluyendo, entre otras, leucemia linfocítica aguda (linfoblástica) (LLA), leucemia mieloide aguda (mielocítica, mielógena, mieloblástica o mielomonocítica), leucemia linfocítica crónica (p. ej., leucemias de linfocitos B, leucemias de linfocitos T, síndrome de Sezary y leucemia de células peludas), leucemia mielocítica crónica (meilide, mielógena o granulocítica), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y fungoides mucosos. 45
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, pronóstico, prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos de células plasmáticas incluyendo, entre otras, discrasias de células plasmáticas, gammapatías monoclonales, gammapatías monoclonales, de significado indeterminad, mieloma múltiple, macroglobulinemia, macroglobulinemia de Waldenstrom, crioglobulinemia y fenómeno de Raynaud.
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de 50 trastornos mieloproliferativos, incuyendo, entre otros, policitemia vera, policitemia relativa, policitemia secundaria, mielofibrosis, mielofibrosis aguda, metaplasma mieloide agnogénica, trombocitopenia (incluyendo trombocitemia primaria y secundaria) y leucemia mielocítica crónica.
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles comotratamiento previo a la cirugía, para aumentar la producción de células sanguíneas. 55
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles como agentes para potenciar la migración, fagocitosis, producción de superóxido, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos de neutrófilos, eosinófilos y macrófagos.
Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles como agentes para aumentar el número de células madre en circulación antes de la aféresis de células madre. Las proteínas de fusión de albúmina la invención pueden ser útiles como agentes para aumentar el número de células madre en circulación antes de la aféresis de plaquetas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como agentes para incrementar la producción 5 de citocinas.
Las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en la prevención, diagnóstico y/o tratamiento de trastornos hematopoyésticos primarios.
Trastornos hiperproliferativos
Las proteínas de fusión de la invención pueden usarse para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluidas 10 las neoplasias. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden inhibir la proliferación del trastorno mediante interacciones directas o indirectas. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención pueden proliferar otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.
Por ejemplo, aumentando una respuesta inmunitaria, en particular aumentando las calidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o proliferando, diferenciando o movilizando los linfocitos T, se pueden tratar los trastornos 15 hiperproliferativos. Esta respuesta inmunitaria se puede aumentar potenciando una respuesta inmunitaria existente o iniciando una respuesta inmunitaria nueva. Como alternativa, la disminución de una respuesta inmunitaria también puede ser un procedimiento de tratar trastornos hiperproliferativos, tales como un agente quimioterapéutico.
Ejemplos de trastornos hiperproliferativos que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, neoplasias localizadas en el: colon, abdomen, huesos, mama, sistema digestivo, 20 hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, hipófisis, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, tórax y tracto urogenital.
De un modo similar, también se pueden tratar o detectar trastornos hiperproliferativos mediante las proteínas de fusión de la invención. Ejemplos de dichos trastornos hiperproliferativos incluyen, entre otros: leucemia linfoblástica 25 aguda de la infancia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma drenocortical, cáncer hepatocelular (primario) del adulto, cáncer hepático (primario) del aduto, leucemia linfocítica aguda del adulto, leucemia mieloide aguda del adulto, enfermedad de Hodgkin del adulto. linfoma de Hodgkin del adulto, leucemia linfocítica del adulto, linfoma no Hodgkin del adulto, cáncer hepático primario del adulto, sarcoma de tejidos blandos del adulto, linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, 30 cáncer anal, astrocitoma, cáncer del conducto biliar, cáncer de la vejiga urinaria, cáncer óseo, glioma cerebral, tumor cerebral, cáncer de mama, cáncer de la pelvis renal y el uréter, linfoma del sistema nervioso central (primario), astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral, cáncer cervical, cáncer hepatocelilar de la infancia (primario), cáncer hepático de la infancia (primario, leucemia linfoblástica aguda de la infancia, leucemia mieloide aguda de la infancia, glioma de células madre cerebrales de la infancia, astrocitoma cerebelar de la infancia, astrocitoma cerebral de la 35 infancia, tumores de células germinales extracraneales de la infancia, enfermedad de Hodgkin de la infancia, linfoma de Hodgkin de la infancia, glicoma de la vía visual e hipotalámica de la infancia, leucemia linfoblástica de la infancia, meduloblastoma de la infancia, linfoma no Hodgkin de la infancia, tumores neuroectodérmicos primitivos de las glándulas supratentorial y pineal, cáncer hepático primario de la infancia, rabdomiosarcoma de la infancia, sarcoma de tejidos blandos de la infancia, glioma hipotalámico y de las vías visuales de la infancia,leucemia linfocírica 40 crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, linfoma de linfocitos T cutáneo, carcinoma de los islotes del páncreas endorino, cáncer de endometrio, ependimona, cáncer epitelial, cáncer de sófago, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer del páncreas exocrino, tumor de células germinales extracraneales, tumor de células germinales extragonadales, cáncer del conducto hepático extrahepático, cáncer ocular, cáncer de mama en mujeres, enfermedad de Gaucher, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores 45 gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, leucemia de células peludas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer hipofaríngeo, cánceres intestinales, melanoma intraocular, carcinoma de las células de los islotes, cáncer de las células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer renal, cáncer de laringe, cáncer de los labios y la cavidad oral, cáncer hepático, cáncer pulmonar, trastornos linfoproliferativos, 50 macroglobulinemia, cáncer de mama en varones, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso primario oculto, cáncer de cuello escamoso primario metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, mieloma múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndrome meilodisplásico, leucemia mielógena, leicemia meiloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer del seno paranasal y de la cavida nasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin durante el 55 embarazo, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de cuello escamoso metastásico primario oculto, cáncer orofaríngeo, sarcoma osteofibrosos maligno, histicitoma/osteosarcoma fibroso maligno, histicitoma/osteosarcoma fibroso maligno de huesos, cáncer del epitelio ovárico, tumor de células germinales ovárixos, tumor de bajo potencial maligno de ovarios, cáncer pancreático, paraproteinemias, púrpura, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor hipofisario, neoplasia de células plasmáticas/meiloma múltiple, 60
linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer hepático primario, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y del uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivares, sarcoidosis, sarcomas, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer pulmonar microcítico,cáncer del intetsino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumores primitivos supratentorial, neuroectodérmico y pineal, linfoma de linfocitos T, cáncer de testículos, timoma, cáncer de tiroides, 5 cáncer de células transicionales de la pelvis renal y del uréter, tumores trofoblásticos, cáncer de las células de la pelvis renal y del uréter, cáncer de la uretra, cáncer del útero, sarcoma uterino, cáncer vaginal, glioma de las vías visuales e hipotalámico cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasias, localizadas en un sistema orgánico indicado anteriormente.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar 10 afecciones premalignas y para preveir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluyendo, entre otros, los trastornos descritos anteriormente. Dichos usos están indicados en afecciones que se sabe o se sospecha que tienen una progresión precedente a neoplasia o cáncer, en particular cuando se ha producido un crecimiento celular no neoplásico consistente en hiperplasia, metaplasma o, los más particularmente, displasia (para una revisión de dichas afecciones de crecimiento anormal, véase Robbins and Angell, 1976, Basic Pathology, 2ª Ed, W. B. Saunders 15 Co., Philadelphia, pp. 68 - 79.)
La hiperplasia es una forma de proliferación celular controlada que implia un incremento en el número de células en un tejido u órgano, sin una alteración significativa de la estructura o función. Los trastornos hiperplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, hiperplasia de los ganglios linfáticos del mediastino angioflicular, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, hiperplasia 20 melanocítica atípia, hiperplasia de células basales, hiperplasia de los ganglios linfáticos gigantes benignos, hiperplasia del cemento, hipoplasia suprarrenal congénita, hiperplasia sebácea congénita, hiperplasia quística, hiperplasia quística de la mama, hiperplasia de dentaduras, hiperplasia dictal, hiperplasia del edometrio, hiperplasia fibromuscular, hiperplasia epitelial focal, hiperplasia gingival, hiperplasia fibrosa inflamatoria, hiperplasia papilar inflamatoria, hiperplasia endotelial papilar intravascular, hiperplasia nodular de próstata, hiperplasia regenerativa 25 nodular, hiperplasia seudopeiteliomatosa, hiperplasia sebácea senil e hiperplasia verrugosa.
La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en el que un tipo de células adultas o completamente diferenciadas se sustituye por otro tipo de células adultas. Los trastornos metaplásicos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, metaplasia mieloide angiogénica, metaplasia aprocrina, metaplasia atípica, metaplasia autoparenquimatosa, metaplasia del tejido 30 conjuntivo, metaplasia epitelial, metaplasia intestinal, anemia metaplásica, osificación metaplásica, pólipos metaplásicos, metaplasma mieloide, metaplasia mieloide primaria, metaplasia mieloide secundaria, metaplasia escamisa, metaplasia escamosa del amnion y metaplasia mieloide sintomática.
La displasia con frecuencia es un indicador de cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios; es la forma más ingobernable de crecimiento de células no neoplásicas e impica una pérdida de uniformidad celular individual y 35 en la orientación de la arquitectura de las células. Las células displásicas a menudo tienen núcleos muy teñidos y anormalmente grandes, y exhiben pleomorfismo. La displasia se produce característicamente cuando existe irritación crónica o inflamación. Los trastornos displásticos que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención y/o polunucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, displasia octodérmica anhidrótica, displasia anterofacial, displasia 40 torácica asfixiante, displasia atriodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraneal, displasia ectodérmica congénita, displasia craneodiafísial, displasia craneocarpotarsal, displasia, craneometafiseal, displasia de la dentina, displasia diafisial, displasia ectodérmica, displasia del esmalte, displasia encefalo-oftálmica, displasia de la epífisis, hemimelial, displasia de la epífisis múltiple, displasia de la epífisis puntual, displasia epitelial, displasia factodigitogenital, displasia fibrosa familiar de las 45 mandíbulas, displasiaplagada blanca familiar, displasia fibromuscular, displasia fibrosa del hueso, displasia ósea florida, displasia renal-retiniana hereditaria, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica, displasia tímica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial, displasia de la metáfisis, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mucoepitelial, displasia de la epífisis múltiple, displasia oculoauriculovertebral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasiaodontogénica, displasia 50 oftalmomandibulomélica, displasia del cemento periapical, displasiafibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisial seudoacondroplástica, displasia retiniana, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisial seudoacondroplástica, displasia retiniana, displasia septo-óptica, displasia espondiloepifisial y displasia ventriculoradial.
Trastornos preneoplásicos adicionales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, trastornos disproliferativos benignos (p. ej., tumores benignos, 55 afecciones fibroquísticas, hipertrofia tisular, pólipos intestinales, pólipos del colon y displasia esofágica), leucoplaquia, queratosis, enfermedad de Bowen, piel de granjero, queilitis solar y queratosis solar.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar y/o pronosticar trastornos asociados con el o los tejidos en los que se expresa el polipéptido de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención conjugadas con una toxina o isótopo radioactivo, como se ha 60
descrito en el presente documento, se pueden usar para tratar cánceres y neoplasias, incluyendo, entre otros, los descritos en el presente documento. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención conjugadas con una toxina o isótopo radioactivo, como se ha descrito en el presente documento, se pueden usar para tratar la leucemia mielógena aguda.
Adicionalmente, las proteínas de fusión de la invención pueden efectuar apoptosis y, por tanto, serían útiles en el 5 trtamiento de una serie de enfermedades asociadas con el incremento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis. Por ejemplo, enfermedades asociadas con un incremento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con los polipéptidos de la invención incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones en p53 y tumores dependientes de hormonas, incluyendo, entre otros, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, 10 glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovarios); trastornos autoinmunitarias (tal como esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide por glomerulonefritis relacionada con el sistema 15 inmunitario) e infecciones virales (tales como virus de herpes, virus de la viruela y adenovirus), enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo agudo de un injerto y rechazo crónico de un injerto.
Las proteínas de fusión de la invención se usan para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de cánceres, en particular de los indicados anteriormente.
Enfermedades o afecciones adicionales asociadas con un incremento de la supervivencia celular que se pueden 20 diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen Los cánceres y trastornos relacionados incluyen, entre otros, cáncer de colon, cáncer cervical, leucemia (incluidas leucemias agudas (p. ej., leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluidas las leucemias mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (p. ej., leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin y 25 enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas y tumores sólidos, incluyend, entre otros, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de 30 células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebácas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma nedukar, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto colédoco, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítivo, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, 35 pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Enfermedades asociadas con un incremento de la apoptosis que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen SIDA, trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, 40 degeneración cerebelosa), tumores cerebrales o enfermedades asociadas con priones, trastornos autoinmunitarios (tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionado con el sistema inmunitario y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad del inherto contra el huésped, lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, 45 ictus y lesión por reperfusión), lesión hepática (p. ej., lesión hepática relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis (lesión del conducto colédoco) y cáncer hepático); enfermedad hepática inducida por toxinas (tal como la causada por el alcohol), shock séptico, caquexia y anorexia.
Las enfermedades y/o trastornos hiperproliferativos que se podrían diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, neoplasias localizadas en el hígado, abdomen, huesos, 50 mama, sistema digestivo, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroides, hipófisis, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojos, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejidos blandos, bazo, tórax y tracto urogenital.
De un modo similar, también se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar trastornos hiperproliferativos mediante las proteínas de fusión de la invención. Ejemplos de dichos trastornos hiperproliferativos incluyen, entre 55 otros: Hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocutosis, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasias, localizado en un sistema orgánico indicado anteriormente.
Además, las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en la inhibición de la angiogénesis de células o tejidos proliferativos, solas, como una proteína de fusión o en combinación con otros polipéptidos directa o 60
indirectamente, como se ha descrito en otro lugar del presente documento. Dicho efecto antiangiogénesis puede conseguirse indirectamente, por ejemplo mediante la inhibición de células específicas de tumores hematopoyéticos, tales como macrófagos asociados con tumores (véase, Joseph IB, et al. J Natl Cancer Inst, 90(21):1648 - 53 (1998), ).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en la inhibición de células o tejidos 5 proliferativos a través de la inducción de apoptosis. Estas proteínas de fusión pueden actuar directa o indirectamente para inducir apoptosis de células y tejidos proliferativos, por ejemplo, en la activación de un receptor del dominio de muerte, tal como el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNF), CD95 (Fas/APO-1), la proteína mediada por apoptosis relacionada con el receptor del TNF (TRAMP) y el receptor 1 y 2 del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) (véase Schulze-Osthoff K, et.al., Eur J Biochem 254(3):439 - 59 (1998)). Además, 10 estas proteínas de fusión pueden inducir apoptosis mediante otros mecanismos, tal como en la activación de otras proteínas que activarán la apoptosis, o mediante estimulación de la expresión de estas proteínas, solas o en combinación con fármacos o adyuvantes de molécula pequeña, tal como apoptonina, galectinas, tioredoxinas, proteínas antiinflamatorias (véase, por ejemplo, Mutat Res 400(1 - 2):447 - 55 (1998), Med Hypotheses.50(5):423 - 33 (1998), Chem Biol Interact Apr 24;111 - 112:23 - 34 (1998), J Mol Med. 76(6):402 - 12 (1998), Int J Tissue 15 React;20(1):3 - 15 (1998)).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en la inhibición de la metástasis de células o tejidos proliferativos. La inhibición se puede producir como resutado directo de la administración de estas proteínas de fusión de albúmina o, indirectamente, tal como activación de la expresión de proteínas que se sae que inhiben la metástasis, por ejemplo integrinas alfa-4 (véase, por ejemplo, Curr Top Microbiol Immunol 1998;231:125 - 41). 20 Dichos efectos terapéuticos de la presente invención se pueden conseguir solos o en combinación con fármacos o adyuvantes de molécula pequeña.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención son útiles en la potenciación de la inmunogenicidad y/o antigenicidad de las células o tejidos proliferativos, directamente, tal como se produciría si las proteínas de fusión de albúmina de la invención “vacunaran” la respuesta inmunitaria para responder a antígenos proliferativos e 25 inmunógenos, o indirectamente, tal como en la activación de la expresión de proteínas que se sabe que potencian la respuesta inmunitaria (p. ej., quimiocinas) a dichos antígenos e inmunógenos.
Trastornos renales
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos del sistema renal. Los trastornos renales que se pueden diagnosticar, 30 pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, insuficiencia renal, nefritis, trastornos de los vasos sanguíneos de trastornos renales, metabólicos y renales congénitos, trastornos urinarios de trastornos renales autoinmunitarios, esclerosis y necrosis, desequilibrio de elextrolitos y cánceres renales.
Enfermedades renales que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de 35 albúmina de la invención incluyen, entre otros, insuficiencia renal aguda, insuficiencia renal crónica, insuficiencia renal ateroembólica, enfermedad renal terminal, enfermedades inflamatorias del riñón (p. ej., glomerulonefritis aguda, glomerulonefritis posinfecciosa, glomerulonefritis de progresión rápida, síndrome nefrótico, glomerulonefritis membranosa, síndrome nefrótico familiar, glomerulonefritis membranoproliferativa, glomerulonefritis proliferativa mesangial I y II, glomerulonefritis crónica, nefritis tubulointersticial aguda, nefritis tubulointersticial crónica, 40 glomerulonefritis postestreptocócica aguda (PSGN), pielonefritis, nefritis lúpica, nefritis crónica, nefritis intersticial y glomerulonefritis postestreptocócica), trastornos de los vasos sanguíneos de los riñones (p. ej., infarto renal, enfermedad renal ateroembólica, necrosis cortical, nefroesclerosis maligna, trombosis de las venas renales, subperfusión renal, retinopatía renal, reperfusión por isquemia renal, embolia de las arterias renales y estenosis de las arterias renales), y trastornos renales resultante de enfermedad del tracto urinario (p. ej., pielonefritis, 45 hidronefrosis, urolitiasis (litiasis renal, nefrolitiasis), nefropatía por reflujo, infecciones del tracto urinario, retención urinaria y uropatía obstructiva unilateral aguda o crónica.)
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar los trastornos metabólicos y congénitos del riñón (p. ej., uremia, amiloidosis renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, glucosuria renal, diabetes insípida neurogénica, cistinuria, síndrome de Fanconi, osteosis 50 fiborquística renal (osteodistrofia renal), enfermedad de Hartnup, síndrome de Bartter, síndrome de Liddie, enfermedad renal poliquística, enfermedad quística medular, poliquistosis renal medular, síndrome de Alport, síndrome de uña-rótula, síndrome nefrótico congénito, síndrome de CRUSH, ríñón en herradura, nefropatía diabética, diabetes insípida nefrogénica, nefropatía analgésica, calculus renales y nefropatía membranosa) y trastornos autoinmunitarios del riñón (p. ej., lupus eritematoso sistéico (LES), syndrome de Goodpasture, nefropatía 55 por IgA y glomerulonefritis proliferative mesangial por IgM).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar trastornos escleróticos o necróticos del riñón (p. ej., glomerulonefritis, neuropatía diabética, glomeruloesclerosis segmentaria focal (FSGS), glomerulonefritis necrotizante y necrosis papilar renal), cánceres
renales (p. ej., nefroma, hipernefroma, nefroblastoma, cáncer de células renales, cáncer de células transicionales, adenocarcinoma renal, cáncer de células escamosas y tumor de Wilm) y desequilibrios de electrolitos (p. ej., nefrocalcinosis, piuria, edema, hidronefritis, proteinuria, hiponatremia, hipernatremia, hipopotasemia, hiperpotasemia, hipocalcemia, hipercalcemia, hipofosfatemia e hiperfosfatemia).
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar usando cualquier procedimiento 5 conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, inyección directa con aguja en el punto de liberación, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolístivos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de geoespuma, otros materiales depot disponibles comercialmente, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticas sólidas para supositorio u otales, aplicaciones para decantación o tópicas durante cirugía, liberación de aerosoles. Dichos procedimientos se conocen en la técnica. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención 10 se pueden administrar como parte de una terapéutica, que se describe con más detalle más adelante.
Enfermedades cardiovasculares
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos cardiovasculares, incluidos, entre otros, enfermedad de las arterias periféricas, tal como isquemia de las extremidades. 15
Las enfermedades cardiovasculares incluyen, entre otros, anomalías cardiovasculares tales como fístula arterio-arterial, fístulas arterio-venosas, malformaciones arteriovenosas cerebrales, defectos cardíacos congénitos, atresia pulmonar y síndrome de la cimitarra. Defectos cardíacos congénitos incluyen, entre otros, coartación aórtica, cor triatriatum, anomalías de los vasos coronarios, corazón entrecruzado, dextrocardia, conducto arterial persistente, anomalía de Ebstein, complejo de Eisenmenger, síndrome del corazón izquierdo hipoplástico, levocardia, tetralogía 20 de fallot, transposición de grandes vasos, doble salida del ventrículo derecho, atresia de la tricúspide, tronco arterial persistente y defectos septales cardíacos, tales como defecto septal aortopulmonar, defectos de la almohadilla endocardial, síndrome de Lutembacher, trilogía de Fallot, defectos septales cardíacos ventriculares.
Las enfermedades cardiovasculares incluyen, entre otras, enfermedad cardíaca, tales como arritmias, enfermedad cardíaca carcinoide, gasto cardíaco elevado, gasto cardíaco bajo, taponamiento cardíaco, endocarditis (incluyendo 25 la bacteriana), aneurisma cardíaco, parada cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, miocardiopatía congestiva, disnea paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, miocardiopatía congestiva, hipertrofia del ventrículo izquierdo, hipertrofia del ventrículo derecho, rotura cardíaca postinfarto, rotura del tabique ventricular, enfermedades de las válvulas cardíacas, enfermedades del miocardio, isquemia miocárdica, derrame pericárdico, pericarditis (incluyendo constrictiva y tuberculosa), neumopericardio, síndrome postpericardiotomía, enfermedad cardíaca 30 pulmonar, enfermedad cardíaca reumática, disfunción ventricular, hiperemia, complicaciones cardiovasculares de la gestación, síndrome de la cimitarra, sífilis cardiovascular y tuberculosis cardiovascular.
Arritmias incluyen, entre otros, arritmia sinusal, fibrilación auricular, aleteo auricular, bradicardia, extrasístole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueo de rama, bloqueo senoauricular, síndrome del QT largo, parasístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de preexcitación de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome 35 del seno enfermo, taquicardias y fibrilación ventricular. Taquicardias incluyen taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia de reentrada nodal auriculoventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica de la unión, taquicardia de reentrada nodal senoauricular, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes y taquicardia ventricular.
Las enfermedades de las válvulas cardíacas incluyen, entre otras, insuficiencia de la válvula aórtica, estenosis de la 40 válvula aórtica, soplos cardíacos, prolapso de la válvula aórtica, prolapso de la válvula mitral, prolapso de la válvula tricúspide, insuficiencia de la válvula mitral, estenosis de la válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiencia de la válvula pulmonar, estenosis de la válvula pulmonar, atresia de la tricúspide, insuficiencia de la válvula tricúspide y estenosis de la válvula tricúspide.
Enfermedades del miocardio incluyen, entre otras, miocardiopatía alcohólica, miocardiopatía congestiva, 45 miocardiopatía hipetrófica, estenosis subvalvular aórtica, estenosis subvalvular pulmonar, miocardiopatía restrictiva, miocardiopatía de Chagas, fibroelastosis endocárdica, fibrosis endomiocárdica, síndorme de Kearns, lesión por reperfusión del miocardio y miocarditis.
Isquemias miocárdicas incluyen, entre otras, enfermedad coronaria, tal como angina de pecho, aneurisma coronaria, arteriosclerosis coronaria, trombosis coronaria, vasoespasmo coronario, infarto de miocardio y aturdimiento 50 miocárdico.
Las enfermedades cardiovasculares también incluyen enfermedades vasculares tales como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatosis bacilar, enfermedad de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, enfermedades aórticas, arteritis de Takayasus, aortitis, síndrome de Leriche, enfermedades oclusivas arteriales, arteritis, enarteritis, poliarteritis nodosa, trastornos 55 cerebrovasculares, angiopatías diabéticas, retinopatía diabética, embolias, trombosis, eritromegalgia, hemorroides, enfermedad venooclusiva hepática, hipertensión, hipotensión, isquemia, enfermedades vasculares periféricas, flebitis, enfermedad venooclusiva pulmonar, enfermedad de Raynaud, síndrome de CREST, oclusión de la vena
retiniana, síndrome de la cimitarra, síndrome de la vena cava superior, telangiectasia, telangiectasia atacia, telangiectasia hemorrágica hereditaria, varicocele, venas varicosas, úlcera varicosa, vasculitis e insuficiencia venosa.
Los aneurismas incluyen, entre otros, aneurismas disecantes, falsos aneurismas, aneurismas infectados, rotura de aneurisma, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrales, aneurismas coronarios, aneurismas cardíacos y 5 aneurismas ilíacos.
Las enfermedades oclusivas arteriales incluyen, entre otras, arteriosclerosis, claudicación intermitente, estenosis de las carótidas, displasias fibromusculares, oclusión vascular mesentérica, enfermedad de Moyamoya, obstrucción de las arterias renales, oclusión de las arterias retinianas y tromboangitis obliterante.
Los trastornos cerebrovasculares incluyen, entre otros, enfermedades de las arterias carótidas, angiopatía amiloide 10 cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformación arteriovenosa cerebral, enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis cerebral, trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluyendo transitoria), síndrome de robo de la subclavia, leucomalazia periventricular, cefalea vascular, cefalea en racimos, migraña e insuficiencia vertebrobasilar. 15
Las embolias incluyen, entre otras, embolias gaseosas, embolias de líquido amniótico, embolia de colesterol, síndrome del pie azul, embolias grasas, embolias pulmonares y tromboembolias. Trombosis incluyen, entre otras, trombosis coronarias, trombosis de las venas hepáticas, oclusión de la vena retiniana, trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal, síndrome de Wallenberg y tromboflebitis.
Los trastornos isquémicos incluyen, entre otros, isquemia cerebral, colitis isquémica, síndromes compartimentales, 20 síndrome del compartimento anterior, isquemia miocárdica, lesiones por reperfusión e isquemia de las extremidades periféricas. Las vasculitis incluyen, entre otras, aortitis, arteritis, síndrome de Behcet, síndrome de Churg-Strauss, síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos, tromboangiitis obliterante, vasculitis por hipersensibilidad, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculitis cutánea alérgica y granulomatosis de Wegener.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar usando cualquier procedimiento 25 conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, inyección directa con aguja en el punto de liberación, inyección intravenosa, administración tópica, infusión por catéter, inyectores biolístivos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de geoespuma, otros materiales depot disponibles comercialmente, bombas osmóticas, formulaciones farmacéuticcas sólidas para supositorio u otales, aplicaciones para decantación o tópicas durante cirugía, liberación de aerosoles. En la técnica se conocen dichos procedimientos. 30
Trastornos respiratorios
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos del sistema respiratorio.
Efermedades y trastornos del sistema respiratorio incluyen, entre otros, vestibulitis nasal, rinitis no alérgica (p. ej., rinitis aguda, rinitis crónica, rinitis atrófica, rinitis vasomotora), pólipos nasales y sinusitis, angiofibromas juveniles, 35 cáncer de la nariz y papilomas juveniles, pólipos de las cuerdas vocales, nódulos (nódulos del cantante), úlceras de contacto, parálisis de cuerdas vocales, laringoceles, faringitis (p. ej., viral y bacteriana), amigdalitis, celulitis amigdalar, absceso parafaríngeo, laringitis, laringoceles, y cánceres de garganta (p. ej., cáncer de la nasofaringe, cáncer amigdalar, cáncer de laringe), cáncer de pulmón (p. ej., cárcinoma de células escamosas, cárcinoma de células pequeñas (células de avena), carcinoma de células grandes y adenocarcinoma), trastornos alérgicos 40 (neumonía eosinofílica, neumonitis por hipersensibiidad (p. ej., alveolitis alérgica extrínseca, neumonitis intersticial alérgica, pneumoconiosis orgánica, aspergilosis broncopulmonar alérgica, asma, granulomatosis de Wegener' (vasculitis granulomatosa), síndrome de Goodpasture)), neumonía (p. ej., neumonía bacteriana (p. ej., Streptococcus pneumoniae (neumonía neumocócica), Staphylococcus aureus (neumonía estafilocócica), neumonía por bacterias gramnegativas (causada por, por ejemplo, Klebsiella and Pseudomas spp.), neumonía por Mycoplasma 45 pneumoniae, neumonía por Hemophilus influenzae, Legionella pneumophila (enfermedad del legionario) y Chlamydia psittaci (Psitacosis)), y neumonía vírica (p.ej., gripe, varicela).
Enfermedades y trastornos adicionales del sistema respiratorio incluyen, entre otros, bronquiolitis, polio (poliomielitis), crup, infección por el virus sincitial respiratorio, paperas, eritema infeccioso (quinta enfermedad), roseola infantil, panencefalitis por rubeola progresiva, sarampión alemán y panencefalitis esclerosante subaguda), 50 neumonía fúngica (p. ej., histoplasmosis, coccidioidomycosis, blastomycosis, infecciones fúngicas en personas con sistemas inmunológicos gravemente suprimidos (p. ej., criptococcosis, causada por Cryptococcus neoformans, aspergilosis, causada por Aspergillus spp.; candidiasis, causada por Candida; y mucomicosis)), Pneumocystis carinii (neumonía neumoquística), neumonía atípica (p. ej., Mycoplasma y Chlamydia spp.), neumonía por infecciones oportunistas, neumonía nosocomial, neumonitis quimicas y neumonía por aspiración, trastornos de la pleura (p. ej., 55 pleurisia, derrame pleural y neumotórax (p. ej., neumotórax espontáneo simple, neumotórax espontáneo complicado, neumotórax de tensión)), enfermedades obstructivas de las vías respiratorias (p. ej., asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, bronquitis crónica o aguda), enfermedades pulmonares ocupacionales (p. ej.,
silicosis, pulmín negro (neumoconiosis del trabajador del carbón), asbestosis, beriliosis, asma ocupacional, bisinosis, y neumoconiosis benigna). Enfermedad pulmonar infiltrativa (p. ej., fibrosis pulmonar (p. ej., alveolitos fibrosante, neumonía intersticial usual), fibrosis pulmonar idiomática, neumonía intersticial descamativa, neumonía intersticial linfoide, histiocitosis X (p ej., enfemedad de Letterer-Siwe, enfemedad de Hand-Schüller-Christian, granuloma eosinofílico), hemosiderosis pulmonar idiopática, sarcoidosis y proteinosis alveolar pulmonar), síndrome de dificultad 5 respiratoria aguda (tamboén denominada, por ejemplo, síndrome de dificultad respiratoria del adulto), edema, embolia pulmonar, bronquitis (p. ej., vírica, bacteriana), bronquiextasia, atelectasia, absceso pulmonar (causado por, por ejemplo, Staphylococcus aureus o Legionella pneumophila) y fibrosis quística.
Actividad anti-angiogénesis
El equilibrio natural entre estimuladores e inhibidores endógenos de la angiogénesis es uno en el que predominan 10 las influencias inhibidoras. Rastinejad et al., Cell 56:345355 (1989). En los raros casos en los que se produce neovascularización en condiciones fisiológicas normales, como cicatrización de heridas, regeneración de órganos, desarrollo embrionario y procesos reproductores femeninos, la angiogénesis está rigurosamente regulada y delimitada en el espacio y en el tiempo. En condiciones de angiogénesis patológica tales como las que caracterizan el crecimiento de un tumor sólido, estos controles reguladores fallan. La angiogénesis regulada por incremento se 15 convierte en patológica y mantiene la progresión de muchas enfermedades neoplásicas y no neoplásicas. Una serie de enfermedades graves están dominadas por una neovascularización anormal, incluyendo el crecimiento de tumores sólidos y metástasis, artritis, algunos tipos de trastornos oculares y psoriasis. Véase, por ejemplo, las revisiones de Moses y col., Biotech. 9:630 - 634 (1991); Folkman et al., N. Engl. J. Med., 333:1751 - 1763 (1995); Auerbach et al., J. Microvase Res. 29:401 - 411 (1985); Folkman, Advances in Cancer Research, eds. Klein y 20 Weinhouse, Academic Press, New York, pág. 175 - 203 (1985); Patz, Am. J. Opthalmol. 94:715 - 743 (1982); y Folkman et al., Science 221:719 - 725 (1983). En una serie de afecciones patológicas, el proceso de angiogénesis contribuye al estado de enfermedad. Por ejemplo, se han acumulado datos significativos que sugieren que el crecimiento de tumores sólidos depende de la angiogénesis. Folkman y Klagsbrun, Science 235:442 - 447 (1987).
La presente invención proporciona el tratamiento de enfermedades o trastornos asociados con neovascularización 25 mediante la administración de las proteínas de fusión de la invención. Las afecciones malignas y metastásicas que se pueden tratar con los polipéptidos de la invención incluyen, entre otras, las neoplasias malignas, tumores sólidos y cánceres descritos en el presente documento y otros conocidos en la técnica (para una revisión de estos trastornos, véase Fishman y col., Medicine, 2ª Ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1985)). Por tanto, se divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad y/o trastorno relacionado con la angiogénesis, que comprende 30 administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar en diversos procedimientos adicionales con el fin de tratar terapéuticamente un cáncer o tumor. Los cánceres que se pueden tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, tumores sólidos, incluyendo de próstata, pulmón, mama, ovarios, estómago, páncreas, laringe, esófago, testículos, hígado, parótidas, tracto bililar, colon, 35 recto, cuello uterino, útero, endometrio, riñón, vejiga urinaria, tiroides; tumores primarios y metástasis, melanomas; glioblastoma; sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma; cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer colorrectal, neoplasias malignas vanzadas y tumores de transmisión por sangre, tales como las leucemias. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la invención se pueden administrar por vía tópica, con el fin de tratar cánceres tales como cáncer de piel, tumores de cabeza y cuello, tumores de mama y sarcoma de Kaposi. 40
En otros aspectos más, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para tratar formas superficiales de cáncer de vejiga urinaria mediante, por ejemplo, administración intravesical. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden administrar directamente en el tumor, o cerca del sitio del tumor, a través de inyección o un catéter. Por supuesto, como el experto en la técnica apreciará, el modo apropiado de administración variará según el cáncer a tratar. Otros modos de administración se discuten en el presente documento. 45
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el tratamiento de otros trastornos, además de cánceres, que implican angiogénesis. Estos trastornos incluyen, entre otros: tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; placas arteroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo de injertos corneales, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, 50 uveítis y Pterygia (crecimiento anormal de los vasos sanguíneos) del ojo, artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatricación de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas en zonas de no unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de las extremidades isquémicas; síndrome de Osler-Webber; neovascularización en placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; 55 displasia fibromuscular; granulacíón de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis.
Por ejemplo, se divulgan procedimientos para el tratamiento de cicatrices hipertróficas y queloides, que comprenden la etapa de administrar proteínas de fusión de albúmina de la invención a una cicatriz hipertrófica o queloide.
Las proteínas de fusión de la invención se inyectan directamente en una cicatriz hipertrófica o queloide, con el fin de prevenir la progresión de estas lesiones. Esta terapia es de valor concreto en el tratamiento profiláctico de 60
afecciones que se sabe que dan como resultado el desarrollo de cicatrices hipertróficas y queloides (por ejemplo, quemaduras) y se inicia preferentemente después de que la fase proliferativa ha tenido tiempo para progresar. (Aproximadamente 14 días después de la lesión inicial), pero antes del desarrollo de la cicatriz hipertrófica o queloide. Como se ha indicado anteriormente, también se divulgan procedimientos para tratar enfermedades neovasculares del ojo, incluyendo, por ejemplo, neovascularización corneana, glaucoma neovasclar, retinopatía 5 diabética proliferativa, fibroplasia retrolental y degeneración macular.
Adicionalmente, los trastornos oculares asociados con la neovascularización que se pueden tratar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros: glaucoma neovascular, retinopatía diabética, retinoblastoma, fibroplasia retrolental, uveítis, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, neovascularización de injertos corneales, así como otras enfermedades inflamatorias, tumores oculares y 10 enfermedades asociadas con neovascularización de la coroides o del iris. Véase, por ejemplo, las revisiones de Waltman et al., Am. J. Ophthal. 85. 704:71 (1978) and Gartner et al., Surv. Ophthal. 22:291 - 312(1978).
Por tanto, también se divulgan procedimientos para tratarenfermedades neovasclares del ojo tales como la neovascularización de la córnea (incluyendo neovascularización del injerto corneal), que comprende la etapa de administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto (p. ej., proteínas de fusión de 15 albúmina de la invención) en la córnea, de modo que se inhibe la formación de los vasos sanguíneos. Brevemente, la córnea es un tejido que normalmente carece de vasos sanguíneos. Sin embargo, en ciertas condiciones patológicas, los capilares se pueden extender al interior de la córnea desde el plexo vascular pericorneal del limbo. Cuando la córnea se vasculariza, también .se enturbia, dando lugar a una disminución de la agudeza visual del paciente La pérdida visual puede llegar a ser completa si la córnea cpacitates completamente. Una amplia variedad 20 de trastornos pueden dar lugar a neovascularización corneal, incluyendo, por ejemplo, infecciones de la córnea (por ejemplo, tracoma, queratitis por herpes símplex, leishmaniasis y oncocerciasis), procesos inmunológicos (por ejemplo, injerto (rechazo y síndrome de Stevens-Johnson), quemaduras alcalinas, traumatismos , la inflamación (por cualquier causa), tóxicos y estados de deficiencia nutricional y como complicación del uso de lentes de contacto.
Las proteínas de fusión de albúmina pueden prepararse para administración tópica en solución salina (combinado 25 con cualquiera de los conservantes y agentes antimicrobianos usados habitualmente en preparaciones oculares), y se administran forma de colirios. La solución o suspensión puede prepararse en su forma pura y administrarse varias veces al día. Como alternativa, las composiciones antiangiogénicas, preparadas como se ha descrito anteriormente, se pueden administrar también directamente a la córnea. En realizaciones preferidas, la composición antiangiogénica se prepara con un polímero mucoadhesivo que se une a la córnea. Los factores antiangiogénicos o 30 composiciones antangiogénicas se pueden usar como adyuvante a la terapia convencional con esteroides. La terapia tópica puede ser útil también profilácticamente en lesiones de la córnea que se sabe que tienen una alta probabilidad de inducir una respuesta angiogénica (tales como quemaduras químicas). En estos casos, el tratamiento, probablemente en combinación con esteroides, puede iniciarse inmediatamente para ayudar a prevenir complicaciones posteriores. 35
Los compuestos descritos anteriormente pueden ser inyectados directamente en el estroma de la córnea por un oftalmólogo con guía microscópica. El sitio preferido de inyección puede variar con la morfología de la lesión individual, pero el objetivo de la administración sería colocar la composición en el frente de avance de la vasculatura (es decir, intercalado entre los vasos sanguíneos y la córnea normal). En la mayoría de los casos, esto implicaría la inyección corneal perilímbica para "proteger" la córnea a partir de los vasos sanguíneos que avanzan. Este 40 procedimiento también se puede usar poco después de una lesión en la córnea con el fin de prevenir profilácticamente la neovascularización de la córnea. En esta situación el material podría inyectarse en la córnea perilímbica intercalado entre la lesión corneal y su potencial aplicación e sangre límbica no deseada. Tales procedimientos también se pueden usar de una manera similar para evitar la invasión capilar de las córneas trasplantadas. En una forma de liberación sostenida inyecciones podrían requerirse solamente 2-3 veces al año. 45 También podría añadirse un esteroide a la solución de inyección para reducir la inflamación resultante de la propia inyección.
Se divulgan procedimientos para tratar el glaucoma neovascular, que comprenden la etapa de administrar en el ojo de a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención, de tal manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe. El compuesto se puede administrar tópicamente al ojo con 50 el fin de tratar las formas precoces de glaucoma neovascular. El compuesto puede implantarse mediante inyección en la región del ángulo de la cámara anterior. El compuesto también puede colocarse en cualquier ubicación tal que el compuesto se liberae continuamente en el humor acuoso. Se divulgan procedimientos para tratar la retinopatía diabética proliferativa, que comprenden la etapa de administrar en el ojo de a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención, de tal manera que la formación de 55 vasos sanguíneos se inhibe.
La retinopatía diabética proliferativa se puede tratar mediante inyección en el humor acuoso o el vítreo, con el fin de incrementar la concentración local del polinucleótido, polipéptido, antagonista y/o agonista en la retina. Preferentemente, este tratamiento deberá iniciarse antes de la adquisición de enfermedades graves que requieren fotocoagulación. 60
Se divulgan procedimientos para tratar la fibroplasia retrolental, que comprenden la etapa de administrar en el ojo de a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de albúmina de la invención, de tal manera que la formación de vasos sanguíneos se inhibe. El compuesto se puede administrar por vía tópica, mediante inyección intravítrea y / o mediante implantes intraoculares.
Adicionalmente, trastornos que se pueden tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, 5 hemangioma, artritis, psoriasis, angiofibroma, placas ateroscleróticas, cicatrización retardada de heridas, granulaciones, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, fracturas sin unión, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, esclerodermia, tracoma y adherencias vasculares.
Además, los trastornos y/o estados que se pueden tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, tumores sólidos, tumores de transporte en sangre tales 10 como leucemias, metástasis tumorales, sarcoma de Kaposi, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, degeneración macular, rechazo de injerto corneano, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma y uveítis, cicatrización retardada de heridas, endometriosis, vasculogénesis, granulaciones, cicatrices hipertróficas (queloides), fracturas en 15 zonas que no son de unión, esclerodermia, tracoma, adherencias vasculares, angiogénesis miocárdica, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis de las extremidades isquémicas, síndrome de Osler-Webber, neovascularización en placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, displasia fibromuscular, granulación de heridas, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, agentes de control de la natalidad mediante la prevención de la vascularización requerida para la implantación de embriones controlando la 20 menstruación, enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica tal como la enfermedad del arañazo del gato (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), Bartonelosis y angiomatosis bacilar.
En un aspecto del procedimiento de control de la natalidad se administra una cantidad del compuesto suficiente para bloquear la implantación del embrión antes o después de que se hayan producido las relaciones sexuales y la fertilización, de modo que se proporciona un procedimiento efectivo de control de natalidad, posiblemente un 25 "posterior al moming”. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse en el control de la menstruación o administrarse como líquido de lavado peritoneal o para implantación peritoneal en el tratamiento de la endometriosis.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden incorporarse en suturas quirúrgicas con el fin de prevenir granulomas por los puntos. 30
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse en una amplia variedad de procedimientos quirúrgicos. Por ejemplo, una composición (en forma de, por ejemplo, una pulverización o película) se puede usar para recubrir o pulverizar un área antes de la extirpación de un tumor, con el fin de aislar los tejidos normales circundantes del tejido maligno, y / o para evitar la propagación de la enfermedad a los tejidos circundantes. Las composiciones (por ejemplo, en forma de una pulverización) puede liberarse a través de procedimientos 35 endoscópicos con el fin de recubrir tumores, o inhibir la angiogénesis en una localización deseada. Se pueden usar mallas quirúrgicas que se han recubierto con composiciones antiangiogénicas de la presente invención en cualquier procedimiento en el que pueda usarse una malla quirúrgica. Por ejemplo, una malla quirúrgica cargada con una composición antiangiogénica puede usarse durante la cirugía de resección de cáncer abdominal (por ejemplo, posterior a la resección de colon) con el fin de proporcionar apoyo a la estructura, y para liberar una cantidad del 40 factor antiangiogénico.
Se divulgan procedimientos para tratar sitios de extirpación de tumores, que comprenden administrar proteínas de fusión de albúmina de la invención a los márgenes de resección de un tumor desués de la extirpación, de tal manera que la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio se inhibe. El compuesto antiangiogénico se administra directamente al sitio de escisión del tumor (por ejemplo, aplica frotando, cepillando o, 45 de otro modo, recubriendo los bordes de resección del tumor con el compuesto antiangiogénico). Como alternativa, los compuestos antiangiogénicos pueden incorporarse en pastas quirúrgicas conocidas antes de la administración. Los compuestos ant-angiogénicos se aplican después de resecciones hepáticas de neoplasias malignas y después de operaciones neuroquirúrgicas.
Las proteínas de fusión de la invención pueden administrarse en el borde de resección de una amplia variedad de 50 tumores, incluyendo, por ejemplo, de mama, de colon, tumores cerebrales y hepáticos. .Por ejemplo, los compuestos antiangiogénicos pueden administrarse en el sitio de un tumor neurológico después de la extirpación, de tal manera que la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio se inhibe.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también se pueden administrar junto con otros factores antiangiogénicos. Ejemplos representativos de otros factores antiangiogénicos incluyen: factor antiinvasivo, ácido 55 retinoico y derivados del mismo, paclitaxel, Suramin, inhibidor tisular de la metaloproteinasa-1, inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2, inhibidor del activador del plasminógeno-1, inhibidor del activador del plasminógeno-2 , y diversas formas de los "grupos d" metales de transición más ligeros.
Los metales de transición del "grupo d" más ligeros incluyen, por ejemplo, especies de vanadio, molibdeno, tungsteno, titanio, niobio y de tántalo. Dichas especies de metales de transición pueden formar complejos de metales de transición. Complejos adecuados de las especies de metales de transición mencionadas anteriormente incluyen complejos oxo de metales de transición.
Ejemplos representativos de complejos de vanadio incluyen complejos de vanadio oxo, tales como complejos de 5 vanadato y de vanadilo. Complejos de vanadato adecuados incluyen complejos de metavanadato y ortovanadato tales como, por ejemplo, metavanadato amónico, metavanadato sódico y ortovanadato sódico. Complejos de vanadilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de vanadilo y sulfato de vanadilo, incluyendo hidratos de sulfato de vanadilo tales como mono y trihidratos de sulfato dde vanadilo.
Ejemplos representativos de complejos de tungsteno y de molibdeno también incluyen complejos oxo. Complejos 10 oxo de tungsteno adecuados incluyen complejos de tungstato y de óxido de tungsteno. Complejos de tungstato adecuados incluyen tungstato amónico, tungstato cálcico, tungstato sódico dihidrato y ácido túngstico. Óxidos de tungsteno adecuados incluyen óxido de tungsteno (IV) y óxido de tungsteno (VI). Complejos oxo de molibdeno adecuados incluyen complejos de molibdato, de óxido de molibdeno y de molibdenilo. Complejos de molibdato,adecuados incluyen molibdato amónico y sus hidratos, molibdato sódico y sus hidratos y molibdato 15 potásico y sus hidratos. Óxidos de molibdeno adecuados incluyen óxido de molibdeno (VI), óxido de molibdeno (VI) y ácido molíbdico. Complejos de molibdenilo adecuados incluyen, por ejemplo, acetilacetonato de molibdenilo. Otros complejos de tungsteno y de molibdeno adecuados incluyen derivados hidroxo derivados de, por ejemplo, glicerol, ácido tartárico y azúcares.
También se puede usar una amplia variedad de otros factores antiangiogénicos. Ejemplos representativos incluyen 20 el factor 4 de las plaquetas, sulfato de protamina, derivados de quitina sulfatados (preparados a partir de cáscaras de cangrejo reina) (Murata et al., Cancer Res. 51:2226, (1991); complejo de polisacáridos sulfatados y peptidoglucano (SP- PG) (la función de este compuesto se puede potenciar mediante la presencia de esteroides, tales como estrógenos y citrato de tamoxifeno); etaurosporina; moduladores del metabolismo de la matriz, incluyendo, por ejemplo, análogos de prolina, cishidroxiprolina, d,L-3,4-dehidroprolina, tiaprolina, alfa,alfa-dipiridilo, 25 fumarato de aminopropionitrilo; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; metotrexato; mitoxantrona; heparina; interferones; 2 macroglobulina-sérica; ChIMP-3 (Pavloff y col., J. Bio. Chem. 267:1732117326, (1992)); quimostatina (Tomkinson y col., Biochem J. 286:475480, 1992); ciclodextrina tetradecasulfato; eponemicina; camptotecina; Fumagillin (Ingber y col. Nature 348:555557, (1990)); tiomalato sódico de oto ("GST"; Matsubara y Ziff, J. Clin. Invest. 79:14401446, 1987); anticolagenasa sérica; alfa2-antiplasmina (Holmes y col., J. Biol. Chem. 30 262(4):16591664, 1987); bisantreno (National Cancer Institute); solución de lobenzarit disódico, ácido (N-(2)-carboxifenil-4- cloroantronílico disódico o "CCA"; (Takeuchi y col., Agents Actions 36:312316, 1992); e inhibidores de la metaloproteinasa tales como BB94.
Enfermedades a nivel celular
Enfermedades asociadas con un incremento de la supervivencia celular o la inhibición de la apoptosis que se 35 pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con los polipéptidos de la invención incluyen cánceres (tales como linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones en p53 y tumores dependientes de hormonas, incluyendo, entre otros, cáncer de colon, tumores cardíacos, cáncer de páncreas, melanoma, retinoblastoma, glioblastoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer testicular, cáncer de estómago, neuroblastoma, mixoma, mioma, linfoma, endotelioma, osteoblastoma, osteoclastoma, osteosarcoma, condrosarcoma, adenoma, cáncer de mama, 40 cáncer de próstata, sarcoma de Kaposi y cáncer de ovarios); trastornos autoinmunitarias (tal como esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide por glomerulonefritis relacionada con el sistema inmunitario) e infecciones virales (tales como virus de herpes, virus de la viruela y adenovirus), enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo agudo de un injerto y rechazo crónico de un injerto. 45
Las proteínas de fusión de la invención se usan para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de cánceres, en particular de los indicados anteriormente.
Enfermedades o afecciones adicionales asociadas con un incremento de la supervivencia celular que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen Los cánceres y trastornos relacionados incluyen, entre otros, cáncer de colon, cáncer cervical, leucemia (incluidas leucemias agudas 50 (p. ej., leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluidas las leucemias mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (p. ej., leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin y enfermedad de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas y tumores sólidos, incluyend, entre otros, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, 55 liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebácas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma nedukar, carcinoma broncogénico, carcinoma 60
de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto colédoco, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, tumor testicular, carcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar microcítivo, carcinoma de vejiga urinaria, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. 5
Enfermedades asociadas con un incremento de la apoptosis que se pueden diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otras, SIDA, trastornos neurodegenerativos (tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, retinitis pigmentosa, degeneración cerebelosa), tumores cerebrales o enfermedades asociadas con priones, trastornos autoinmunitarios (tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, cirrosis biliar, 10 enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, polimiositis, lupus eritematoso sistémico y glomerulonefritis relacionado con el sistema inmunitario y artritis reumatoide), síndromes mielodisplásicos (tales como anemia aplásica), enfermedad del inherto contra el huésped, lesión isquémica (tal como la causada por infarto de miocardio, ictus y lesión por reperfusión), lesión hepática (p. ej., lesión hepática relacionada con hepatitis, lesión por isquemia/reperfusión, colestosis (lesión del conducto colédoco) y cáncer hepático); enfermedad hepática inducida 15 por toxinas (tal como la causada por el alcohol), shock séptico, caquexia y anorexia.
Cicatrización de heridas y proliferación de células epiteliales
También se divulga un procedimiento para usar proteínas de fusión de la invención para fines terapéuticos, por ejemplo, para estimular la proliferación de células epiteliales y queratinocitos basales para la cicatrización de heridas, y para estimular la producción de folículos pilosos y la ciatrización de heridas dérmicas. Las proteínas de 20 fusión de la albúmina de la invención pueden ser clínicamente útiles en la estimulación de la cicatrización de heridas, incluyendo heridas quirúrgicas, heridas por escisión, heridas profundas que implican daños en la dermis y la epidermis, heridas en el tejido ocular, heridas del tejido dental, heridas de la cavidad oral, úlceras diabéticas, úlceras dérmicas, úlceras decúbito, úlceras arteriales, úlceras por estasis venosa, quemaduras resultantes de la exposición al calor o a productos químicos, y otras afecciones anormales de la cicatrización de heridas tales como uremia, 25 malnutrición, deficiencias de vitaminas y las complicaciones asociadas con el tratamiento sistémico con esteroides, la radioterapia y fármacos antineoplásicos y antimetabolitos. Las proteínas de fusión de la albúmina de la invención podrían usarse para estimular el restablecimiento dérmico posterior a la pérdida de dermis.
Las proteínas de fusión de la albúmina de la invención podrían usarse para aumentar la adherencia de los injertos de piel a un lecho de heridas y estimular la reepitelización del lecho de la herida. Los siguientes son ltipos de injerto 30 que las proteínas de fusión de la invención pueden usar para aumentar la adherencia al lecho de la herida: autoinjertos, piel artificial, aloinjertos, injertos autodérmicos, injertos autoepidérmicos, injertos avasculares, injertos de; Blair-Brown, injerto óseo, injertos brefloplásticos, injerto de cutis, injertos retardados, injerto dérmico, injerto epidérmico, injerto de fascia, injerto de espesor completo, injerto heterólogo, xenoinjerto, injerto homólogo, injerto hiperplásico, injerto lamelar, injerto de malla, injerto de mucosa, injerto de Ollier-Thiersch, injerto omenpal, injerto de 35 parche, injerto de pedículo, injerto penetrante, injerto de piel dividida, injerto de espesor dividido. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para estimular la resistencia de la piel y para mejorar el aspecto de la piel envejecida.
Se cree que las proteínas de fusión de la invención también se producen cambios en los hepatocitos, poliferation, y proliferación de células epiteliales en el pulmón, mama, páncreas, estómago, intestino delgado e intestino grueso. 40 Las proteínas de fusión de la albúmina de la invención podrían promover la proliferación de células epiteliales tales como sebocitos, folículos pilosos, hepatocitos, neumocitos de tipo II, células caliciformes productoras de mucina y otras células epiteliales y los progenitores contenidos en la piel, pulmón, hígado, y el tracto gastrointestinal. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden estimular la proliferación de las células endoteliales, queratinocitos, y queratinocitos basales. 45
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también podrían usarse para reducir los efectos secundarios de la toxicidad intestinal que resultan de la radiación, tratamientos de quimioterapia o infecciones virales. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener un efecto citoprotector sobre la mucosa del intestino delgado. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden estimular la curación de la mucositis (úlceras bucales) resultantes de la quimioterapia y las infecciones virales. 50
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención además se podrían usar en la regeneración completa de la piel en defectos de piel de espesor total y parcial, incluyendo quemaduras, (es decir, la repoblación de los folículos pilosos, glándulas sudoríparas y glándulas sebáceas), el tratamiento de otros defectos de la piel, tales como psoriasis. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían usarse para tratar la epidermolisis bullosa, un defecto en la adherencia de la epidermis a la dermis subyacente que da lugar a ampollas frecuentes, abiertas y 55 dolorosas acelerando reepitelización de estas lesiones. Las proteínas de fusión de la albúmina de la invención podrían también usarse para tratar úlceras gástricas y duodenales y ayudar a curar mediante la formación de cicatrices del revestimiento de la mucosa y la regeneración de la mucosa glandular y del revestimiento de la mucosa duodenal más rápidamente. Enfermedades inflamatorias del intestino, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, son enfermedades que resultan en la destrucción de la superficie mucosa del intestino delgado o grueso, 60
respectivamente. Por tanto, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse para estumular el rejuvenecimiento de la superficie mucosa para ayudar a una cicatrización más rápida y prevenir la progresión de la enfermedad inflamatoria intestinal. Cabe esperar que el tratamiento con proteínas de fusión de la invención tenga un efecto significativo en la producción de moco en todo el tracto gastrointestinal y podría usarse para proteger la mucosa intestinal de sustancias nocivas que se ingieran o después de la cirugía. Las proteínas de fusión de 5 albúmina de la invención,podrían usarse para tratar la enfermedad asociada con la expresión baja.
Además, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse para prevenir y curar el daño pulmonar debido a diversos estados patológicos. Las proteínas de fusión de la albúmina de la invención, que podrían estimular la proliferación y diferenciación y promover la reparación de los alvéolos y del epitelio bronquiolar para prevenir o tratar el daño pulmonar agudo o crónico, por ejemplo, enfisema, que tiene como resultado la pérdida progresiva de 10 alveolos y lesiones por inhalación, es decir, debidas a la inhalación de humo y quemaduras, que causan necrosis del epitelio bronquiolar y los alveolos, podrían tratarse eficazmente usando polinucleótidos o polipéptidos, agonistas o antagonistas de la presente invención. Asimismo, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse para estimular la proliferación y diferenciación de neumocitos tipo II, que pueden ayudar a tratar o prevenir enfermedades tales como las enfermedades de la membrana hialina, tales como el síndrome de dificultad respiratorio infantil y la 15 displasia broncopulmonar, en bebés prematuros.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían estimular la proliferación y diferenciación de hepatocitos y, por tanto, podrían usarse para aliviar o tratar enfermedades y patologías hepáticas, tales com insuficiencia hepática fulminante causada por cirrosis, daño hepático causado por hepatitis viral y sustancias tóxicas (es decir , paracetamol, tetraclorurlo de carbono y otras hepatotoxinas conocidas en la técnica). 20
Además, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse para tratar o prevenir el inicio de diabetes mellitus. En pacientes con diabetes de tipos I y II recién diagnosticada, en las que queda alguna función de las células de los islotes, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse para mantener la función d elos islotes para aliviar, retrasar o prevenir la manifestación permanente de la enfermedad. Asimismo, las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían usarse como auxiliares en el transplante de células de los islotes para mejorar o estimular la 25 función de las células de los islotes.
Actividad neural y enfermedades neurológicas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades, trastornos, daños o lesiones cerebrales y/o del sistema nervioso. Los trastornos del sistema nervioso que se pueden tratar con las composiciones de la invención (p. ej., proteínas de fusión de la invención) incluyen, 30 entre otros, lesiones del sistema nervioso y enfermedades o trastornos que tienen como resultado la desconexión de axones, una disminución o degeneración de las neuronas, o desmielinización. Las lesiones del sistema nervioso que se pueden tratar en un paciente (incluyendo pacientes mamíferos humanos y no humanos) de acuerdo con los procedimientos de la invención incluyen, entre otros, las lesiones siguientes de los sistemas nerviosos central (incluyendo la médula espinal, cerebral) o periférico. (1) lesiones isquémicas, en las que una falta de oxígeno en una 35 porción del sistema nervioso tiene como resultado una lesión neuronal o la muerte, incluyendo infarto cerebral o isquemia, o infarto de la médula espinal o isquemia; (2) lesiones traumáticas, incluyendo lesiones causadas por lesiones físicas o asociadas con cirugía, por ejemplo lesiones que afectan a una parte del sistema nervioso, o lesiones por compresión; (3) lesiones malignas, en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada por tejido maligno que es una neoplasia maligna asociada con el sistema nervioso o una neoplasia maligna derivada de 40 tejido no perteneciente al sistema nervioso; (4) lesiones infecciosas, en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de una infección, por ejemplo, por un absceso, o asociadas con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, virus de herpes zoster o de herpes simple, o por la enfermedad de Lyme, tuberculosis o sífilis; (5) lesiones degenerarías en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada como resultado de un proceso degenerativo, incluyendo, entre otros, degeneración asociada con la enfermedad de 45 Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, o esclerosis lateral amiotrófica (ELA); (6) lesiones asociadas con enfermedades o trastornos nutricionales en los que una parte del sistema nervioso es destruido o dañado por un trastorno nutricional o trastorno del metabolismo, incluyendo, entre otros, deficiencia de la vitamina B12, deficiencia de ácido fólico, enfermedad de Wernicke, ambliopía de tabaco-alcohol, enfermedad de Marchiafava-Bignami (degeneración primaria del cuerpo calloso) y degeneración cerebelar alcohólica; (7) lesiones neurológicas 50 asociadas con enfermedades sistémicas, incluyendo, entre otros, diabetes (neuropatía diabética, parálisis de Bell), lupus eritematoso sistémico, carcinoma o sarcoidosis; (8) lesiones causadas por sustancias tóxicas, incluyendo alcohol, plomo o neurotoxinas concretas; y (9) lesiones de desmielinización en las que una parte del sistema nervioso es destruida o dañada por una enfermedad de desmielinización incluyendo, entre otras, esclerosis múltiple, inmunodeficiencia humana, mielopatía asociada con virus, mielopatía asociada con virus, mielopatía transversa o 55 varias etiologías, leucoencefalopatía multifocal progresiva y mielinolisis pontina central.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para proteger las células neurales de los efectos dañinos de la hipoxia cerebral. Las composiciones de la invención se pueden usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con la hipoxia cerebral. Las proteínas de fusión de albúmina 60 de la invención se pueden usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con la isquemia cerebral. Las
proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con infarto cerebral.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con un ictus. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales cerebrales asociadas con un ictus. 5
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usan para tratar o prevenir la lesión celular neural asociada con un ataque al corazón. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usan para tratar o prevenir las lesiones celulares neurales cerebrales asociadas con un ataque al corazón.
Las composiciones de la invención que son útiles para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso se pueden seleccionar analizando la actividad biológica en la estimulación de la supervivencia o diferenciación de las neuronas. 10 Por ejemplo, y no a modo de limitación, las composiciones de la invención que provocan cualquiera de los siguientes efectos pueden ser útiles de acuerdo con la invención: (1) incremento del tiempo de supervivencia de las neuronas en cultivo en presencia o ausencia de hipoxia o condiciones hipóxicas; (2) incremento de la proliferación de neuronas en cultivo o in vivo; (3) incremento de la producción de una molécula asociada con neuronas en cultivo o in vivo, por ejemplo colina acetiltransferasa o acetilcolinesterasa con respecto a neuronas motoras; o (4) disminución 15 de los síntomas de disfunción neuronal in vivo. Dichos efectos se pueden medir mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. El incremento de la supervivencia de las neuronas se puede medir de forma rutinaria usando un procedimiento expuesto en el presente documento o, de otro modo, conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, en Zhang et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:363742 (2000) o en Arakawa et. al., J. Neurosci., 10:350715 (1990); incremento de la proliferación de neuronas se puede detectar mediante procedimientos conocidos en la 20 técnica, tales como, por ejemplo, los procedimientos expuestos en Pestronk et al., Exp. Neurol., 70:65 - 82 (1980), o Brown et al., Ann. Rev. Neurosci., 4:1742 (1981); el incremento de la producción de moléculas asociadas con neuronas se puede medir mediante bioensayo, ensayo enzimátivo, unión de anticuerpos, ensayo de transferencia de tipo Northern, etc., usando técnicas conocidas en la materia y dependiendo de la molécula que se va a medir; y la disfunción de las neuronas motoras se puede medir evaluando la manifestación física del trastorno de las neuronas 25 motoras, por ejemplo debilidad, velocidad de la conducción de las neuronas motoras o discapacidad funcional.
Los trastornos de las neuronas motoras que se pueden tratar incluyen, entre otros, trastornos tales como infarto, infección, exposición a toxinas, traumatismo, daños quirúrgicos, enfermedad degenerativa o neoplasia maligna que puede afectar a neuronas motoras, así como a otros componentes del sistema nervioso, así como trastornos que afectan de forma selectiva a neuronas tales como esclerosis lateral amiotrófica e, incuyendo, entre otros, atrofia 30 muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva de la infancia (síndrome de Fazio-Londe), poliomielitis y el síndrome pospolio y neuropatía motora-sensorial hereditaria (enfermeda de Charcot-Marie-Tooth Disease).
Además, las proteínas de fusión de la invención pueden desempeñar un papel en la supervivencia neuronal; formación de sinapsis; conductancia; diferenciación neural; etc. Por tanto, las composiciones de la invención 35 (incluyendo las proteínas de fusión de la invención) se pueden usar para diagnosticar y/o tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con estas funciones, incluyendo, entre otros, trastornos del aprendizaje y/o de la cognición. Las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de estados de enfermedad neuridegeneratva y/o trastornos de comportamiento. Dichos estados de enfermedad neurodegeneratva y/o trastornos de comportamiento incluyen, entre otros, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de 40 Parkinson, enfermedad de, Huntingtonm síndrome de Tourette, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno del pánico, discapacidades de aprendizaje, ELA, piscosis, autismo y comportamientos alterados, incluyendo trastornos de la alimentación, de los patrones de sueño, del equilibrio y la percepción. Además, las composiciones de la invenciín también pueden desempeñar un papel en el tratamiento, prevención y/o detección de trastornos del desarrollo asociados con el embrión en desarrollo o trastornos sexuales. 45
Además, las proteínas de fusión de la invención pueden ser útiles en la protección de células neurales de enfermedades, daños, trastornos o lesiones asociados con trastornos cerebrovasculares incluyendo, entre otros, enfermedades de las arterias carótidas (p. ej., trombosis de las arteris carótidas, estenosis de las carótidas o enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis 50 cerebral (p. ej., trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal o síndrome de Wallenberg), hemorragia cerebral (p. ej., hematoma epidural o subdural o hemorragia subaracnoidal), infarto cerebral, isquemia cerebral (p. ej., isquemia cerebral transitoria, síndrome del robo de la subclavia o insuficiencia vertebrobasilar), demencia vascular (p. ej., multi-infartos), leucomalacia, periventricular y cefalea vascular (p. ej., cefalea en racimos o migrañas). 55
También se divulga un procedimiento para usar proteínas de fusión de la invención para fines terapéuticos, para, por ejemplo, estimular la proliferación y/o diferenciación de las células neurológicas. Por tanto, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para tratar y/o detectar enfermedades neurológicas. Además, las proteínas de fusión de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno concreto del sistema nervioso. 60
Ejemplos de enfermedades neurológica que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención yincluyen enfermedades cerebales, tales como enfermedades cerebales metabólicas que incluyen fenilcetonuria tales como fenilcetonuria materna, deficiencia de la piruvato carboxilasa, definciencia del complejo de la piruvato deshidrogenasa, encefalopatía de Wernicke, edema cerebral, neoplasias cerebrales, tales como neoplasias cerebelosas que incluyen neoplasias infratentoriales, neoplasias del ventrículo cerebral tales como neoplasias del 5 plexo coroideo, neoplasias del hipotálamo, neoplasias supratentoriales, enfermedad de canavan, enfermedades cerebelosas tales como ataxia cerebelosa que incluyen degeneración espinocerebelosa tales como ataxia telangiectasia, disinergia cerebelosa, ataxia de Friederich, enfermedad de Machado-Joseph, atrofia olivopontocerebeosa, neoplasias cerebelosas tales como neoplasias infratentoriales, esclerosis cerebral difusa tales como encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, leucodistrofia metacromática y panencefalitis 10 esclerosante subaguda.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención incluyen trastornos cerebrovasculares (tales como enfermedades de las arterias carótidas, que incluyen trombosis de las arterias carótidas, estenosis de las carótidas y enfermedad de Moyamoya), angiopatía amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerosis cerebral, malformaciones arteriovenosas cerebrales, 15 enfermedades de las arterias cerebrales, embolia y trombosis cerebral, tales como trombosis de las arterias carótidas, trombosis sinusal o síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, tales como hematoma epidural, hematoma subdural y hemorragia subaracnoidea, infarto cerebral, isquemia cerebral, tal como isquemia cerebral transitoria, síndrome del robo de la subclavia e insuficiencia vertebrobasilar, demencia vascular, tal como multi-infartos, leucomalacia, periventricular, cefalea vascular tal como cefalea en racimos y migrañas. 20
Enfermedades neurológicas adicionales que se puedne tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención incluyen demencia, tal como el complejo de demencia por SIDA, demencia presenil tal como enfermeda de Alzheimer y el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, demencia senil tal como enfermedad de Alzheimer' y parálisis supranuclear progresiva, demencia vascular tal como demencia multiinfartos, encefalitis que incluyen encefalitis periaxial, encefalitis viral ttal como encefalitis epidémica, encefalitis japonesa, encefalitis de St. Louis, encefalitis por 25 garraparas y fiebre del Nilo occidental, encefalomielitis diseminada aguda, meningoencefalitis tal como el síndrome uveomeningoencefalítico, enfermedad de Parkinson postencefalitis y panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomalacia tal como leucomalacia periventricular, epilepsia tal como epilepsia generalizada que incluye espasmos infantiles, epilepsia de ausencia, epilepsia mioclónica que incluye el síndrome de MERRF, epilepsia tónico-clónica, epilepsia parcial tal como epilepsia parcial compleja, epilepsia del lóbulo frontal y epilepsia del lóbulo 30 temporal, epilepsia postraumática, estado epiléptico tal como epilepsia parcial continua y síndrome de Hallervorden-Spatz.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención y incluyen hidrocefalia tales como el síndrome de Dandy-Walker e hidrocefalia de presión normal, enfermedades hipotalámicas tales como neoplasias hipotalámicas, malaria cerebral, narcolepsia que incluye catapexia, poliomielitis 35 bulbar, seudotumor cerebral, síndrome de Rett, síndrome de Reye, enfermedades talámicas, toxoplasmosis cerebral, tuberculoma intracraneal y síndrome de Zellweger, infecciones del sistema nervioso central, tal como el complejo de demencia y SIDA, absceso cerebral, empiema subdural, encefalomielitis tal como encefalomielitis equina, encefalomielitis equina venezolana, encefalomielitis hemorrágica necrotizante, visna y malaria cerebral.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención 40 incluyen meningitis tales como aracnoiditis, meningitis aséptica tales como meningitis viral que incluye coriomeningitis linfocítica, meningitis bacteriana que incluye meningitis por Haemophilus, meningtitis por Listeria, meningtitis meningocócica tal como el síndrome de Waterhouse-Friderichsen, meningtitis neumocócica y tuberculosis meníngea, meningitis fúngica tal como meningtitis criptocócica, derrame subdural, meningoencefalitis tal como síndrome uveomeningoencefalítico, mielitis tal como mielitis transversa, neurosífilis tal como tabes dorsalis, 45 poliomielitis, que incluye poliomielitis bulbar y síndrome postpoliomielitis, enfermedades de priones (tal como el síndrome de Creutzfeldt-Jakob, la encefalopatía espongiforme bovina, síndrome de Gerstmann-Straussler, Kuru, encefalopatía espongiforme ovina) y toxoplasmosis cerebral.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención incluyen neoplasias del sistema nervioso central, tal como neoplasias cerebrales que incluyen neoplasias 50 cerebelosas tales como neoplasias infratentoriales, neoplasias del ventrículo cerebral tal como neoplasias del plexo coroideo, neoplasias del hipotálamo y neoplasias supratentoriales, neoplasias meníngeas, neoplasias de la médula espinal que incluyen neoplasias epidurales, enfermedades desmielinizantes tales como enfermedades de canavan, esclerosis cerebral difusa que incluye adrenoleucodistrofia, encefalitis periaxial, leucodistrofia de células globoides, esclerosis cerebral difusa tales como leucodistrofia metacromática, encefalomielitis alérgica, encefalomielitis 55 hemorrágica necrotizante, leucoencefalopatía multifocal progesiva, esclerosis múltiple, mielinolisis pontina central, mielitis transversa, neuromielitis óptica, encefalopatía espongiforme ovina, hiperlordosis, síndrome de fatiga crónica, visna, síndrome nervioso de presión alta, meningismo, enfermedades de la médula espinal tal como amiotonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal tal como la enfermedad de Werdnig-Hoffmann, compresión de la médula espinal, neoplasias d ela médula espinal, tal como neoplasias epidurales, siringomielia, 60 Tabes Dorsalis, síndrome del hombre rígido, retraso mental tal como síndrome de Angelman, síndrome de Cri-du-Chat, síndrome de De Lange, síndrome de Down, Gangliosidosis tal como gangliosidosis G(M1), enfermedad de
Sandhoff, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Hartnup, homocistinuria, síndrome de Laurence-Moon- Biedl, síndrome de Lesch-Nyhan, enfermedad de orina con olor a jarabe de arce, mucolipidosis tal como fucosidosis, lipofuscinosis neuronal ceroide, síndrome oculocerebrorrenal, fenilcetonuria tal como fenilcetonuria maternal, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, esclerosis tuberosa, síndrome WAGR, anomalías del sistema nervioso tales como holoprosencefalia, defectos del tubo neural tales como anencefalia que 5 incluye hidrangencefalia, deformidad de Arnold-Chairi, encefalocele, meningocele, meningomielocele, disrafismo espinal tal como espina bífida quística y espina bífida oculta.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la invención incluyen neuropatías sensoriales y motoras hereditarias que incluyen enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsum, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías 10 sensoriales y autónomas hereditarias tales como nalagesia congénita y disautonomía familiar, manifestaciones neurológicas (tal como agnosia, que incluyen síndrome de Gerstmann, amnesia tal como amnesia retrógrada, apraxia, vejiga neurogénica, cataplexia, trastornos de la comunicación tales como trastornos de la audición que incuyen sordera, pérdida de audición parcial, audiometría y acúfenos, trastornos del habla tales como afasia que incluyen agrafia, anomia, afasia de broca y afasia de Wernicke, dislexia, tal como dislexia adquirida, trastornos del 15 desarrollo del lenguaje, trastornos del habla tales como afasia, que incluye anomia, afasia de broca y afasia de Wernicke, trastornos de la articulación, trastornos de la comunicación tales como trastornos del habla que incluyen disartria, echolalia, mutismo e interrupción, trastornos de a voz, tales como afonía y ronquera, estado descerebrado, delirio, fasciculación, alucinaciones, meningismo, trastornos del movimiento tales como el síndrome de angelman, ataxia, atetosis, corea, distonía, hipocinesia, hipotonía muscular, mioclonos, tic, tortícolis y temblores, hipertonía 20 muscular tal como rigidez muscular tales como el síndrome del hombre rígido, espasticidad muscular, parálisis tal como parálisis facial, que incluye herpes Zoster Oticus, gastroparesia, hemiplejia, oftalmoplejia tal como diplopía, síndrome de Duane, síndrome de Horner, oftalmoplejia externa progresiva crónica tal como síndrome de Kearns, parálisis bulbar, paraparesia espástica tropical, paraplejia tal como síndrome de Brown-Sequard, tetraplejia, parálisis respiratoriay parálisis de las cuerdas vocales, paresia, extremidad fantasma, trastornos del gusto tales como ageusia 25 y disgeusia, trastornos de la visió tales como ambliopía, ceguera, defectos de la visión en color, diplopía, hemianopsia, escotoma y visión anormal, trastornos del sueño tales como hipersomnio, que incluye síndrome de Kleine-Levin, insomnio y sonambulismo, espasmo tales como trismo, inconciencia tal como coma, estado vegetativo persistente y síncope y vértigo, enfermedades neuromusculares tales como amootonía congénita, esclerosis lateral amiotrófica, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, enfermedad de las neuronas motoras, atrofia muscular tal como 30 atrofia muscular espinal, enfermedad de Charcot-Marie y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, síndrome pospoliomielitis, distrofia muscular, miastenia gravis, miotonía atrófica, miotonía congénita, mioparía menalina, parálisis periódica failiar, paramioclonos multoplex, paraparesia espástica tropical y síndrome del hombre rígido, enfermedades del sistema nervioso periférico tales como acrodinia, neuroparías amiloides, enfermedades del sistema nervioso autonómico tales como síndrome de Adie, síndrome de Barre-Lieou, disautonomía familiar, 35 síndrome de Horner, distrofia simpática refleja y síndrome de Shy-Drager, enfermedades de los nervios craneales tales como enfermedades de los nervios acústicos, tal como neuroma acústico que incluye neurofibromatosis 2, enfermedades del nervio facial tal como neuralgia facial, síndrome de Melkersson-Rosenthal, trastornos de la motilidad ocular que incluyen ambliopía, nistagmo, parálisis del nervio oculomotor, oftalmoplejia tal como el síndrome de Duane, síndrome de Horner, oftalmoplejia externa progresiva crónica que incluye síndrome de Kearns, 40 estrabismo tal como esotropía y exotropía, parálisis del nervio oculomotor, enfermedades del nervio óptico tales como atrofia óptica, que incluye atrofia óptica hereditaria, drusas de la papila óptica, neuritis óptica tal como neuromielitis óptica, edema papilar, neuralgia del trigémino, parálisis de las cuerdas vocales, enfermedades desmielinizantes tales como neuromielitis óptica e hiperlordosis y neuropatías diabéticas tales como el pie diabético.
Enfermedades neurológicas adicionales que se pueden tratar o detectar con proteínas de fusión de la incluyen 45 síndromes de compresión neural tal como el síndrome del túnel carpiano, síndrome de la salida torácica tal como el síndrme de las costillas cervicales, síndrome de compresión del nervio ulnar, neuralgia tal como causalgia, neuralgia cervico-braquial, neuralgia facial y neuralgia del trigémino, neuritis tal como neuritis alérgica experimental, neuritis óptica, polineuritis, poliradiculoneuritis y radiculitis tal como poliradiculitis, neuropatías motoras y sensoriales hereditarias tales como enfermedad de Charcot-Marie, atrofia óptica hereditaria, enfermedad de Refsam, paraplejia 50 espástica hereditaria y enfermedad de Werdnig-Hoffmann, neuropatías sensoriales y autonómicas hereditarias que incluyen analgesia congénita y disautonomía familar, síndrome de POEMS, ciática, sudoración gustatoria y tetania).
Trastornos endocrinos
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar trastornos y/o enfermedades relacionadas con el desequilibrio hormonal y/o trastornos o enfermedades 55 del sistema endocrino.
Las hormonas secretadas por las glándulas del sistema endocrino controlan el crecimiento físico, la función sexual, el metabolismo y otras funciones. Los trastornos se pueden clasificar de dos formas: alteraciones en la producción de hormonas y la incapacidad de tejidos para responder a las hormonas. La etiología de estas enfermedades, trastornos y/o afecciones de desequilibrio hormonal o del sistema endocrino pueden ser enfermedades genéticas, 60 somáticas, tales como cáncer y algunas enfermedades autoinmunitarias, adquiridas (p. ej., mediante quimioterapia, lesiones o toxinas) o infecciosas. Además, las proteínas de fusión de la invención y/o polinucleótidos que codifican
las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como marcadores o detectores de una enfermedad o trastorno relacionado con el sistema endocrino y/o el desequilibrio hormonal.
Las enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormona abarcan trastornos de la motilidad uterina, que incluyen, entre otras: complicaciones con la gestación y el parto (p. ej., parto a término, embarazo postérmino, aborto espontáneo y parto retardado o interrumpido) y trastornos y/o enfermedades del ciclo menstrual (p. ej., 5 dismenorrea y endometriosis).
Los trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal incluyen trastornos y7o enfermedades del páncreas, tales como, por ejemplo, diabetes mellitus, diabetes insípida, agenesia pancreátoca congénita, síndorme tumoral de células del islote-feocromocitoma, trastornos y/o enfermedades de las glándulas suprarrenales tales como, por ejemplo, enfermedad de Addison, deficiencia de corticosteroides, enfermedad 10 virilizante, hirsutismo, síndrome de Cushing, hiperaldosteronismo, feocromocitoma; trastornos y/o enfermedades de la hipófisis, tal como, por ejemplo, hiperpituitarismo, hipopituitarismo, enanimso hipofisario, adenoma hipofisario, panhipopituitarismo, acromegalia, gigantismo; trastornos y/o enfermedades del tiroides, incluyendo, entre otros, hipertyroidismo, hipotiroidismo, enfermedad de Plummer, enfermedad de Graves (bocito difuso tóxico), bocio nodular tóxico, tiroiditis (tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis granulomatosa subaguda y tiroiditis linfocítica silennte), síndrome de 15 Pendred, mixedema, cretinismo, tirotoxicosis, defecto de acoplamiento de hormonas tiroideas, aplasia tímica, tumores de las células de Hurthle del tiroides, cáncer de tiroides, carcinoma tiroideo, carcinoma tiroideo medular; trastornos y/o enfermedades de la paratiroides tales como, por ejemplo, hiperparatiroidismo, hipoparatiroidismo; trastornos y/o enfermedades del hipotálamo.
Además, trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal también pueden incuir 20 trastornos y/o enfermedades de los testículos u ovarios, incluido cáncer. Otros trastornos y/o enfermedades de los testículos o de los ovarios incluyen además, por ejemplo, cáncer de ovarios, síndrome del ovario poliquístico, síndrome de Klinefelter, síndrome del testíiculo ausente (anorquia bilateral), ausencia congénita de células de Leydig, criptorquidia, síndrome de Noonan, distrofia miotónica, hemangiona capilar del testículo (benigno), neoplasias del tetsículo y neo-testículo. 25
Además, trastornos y/o enfermedades del sistema endocrino y/o de desequilibrio hormonal también pueden incuir trastornos y/o enfermedades tales como, por ejemplo, síndromes de deficiencia poliglandular, feocromocitoma, neuroblastoma, neoplasia endocrina múltiple y trastornos y/o cánceres de tejidos endocrinos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diagnosticar, pronosticar, prevenir y/o tratar enfermedades y/o trastornos endocrinos asociados con el o los tejidos en los que se expresa la proteína 30 terapéutica correspondiente a la porción de proteína terapéutica de la proteína de albúmina de la invención.
Trastornos del sistema reproductor
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse para el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de enfermedades y/o trastornos del sistema reproductor. Trastornos del sistema reproductor que se pueden tratar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, lesiones del sistema 35 reproductor, infecciones, trastornos neoplásicos, defectos congénitos, y enfermedades o trastornos que producen infertilidad, complicaciones con el embarazo, el esfuerzo del parto o el parto y dificultades posparto.
Los trastornos y / o enfermedades del sistema reproductor incluyen enfermedades y / o trastornos de los testículos, que incluyen atrofia testicular, feminización testicular, criptorquidia (unilateral y bilateral), anorquia, testículos ectópicos, epididimitis y orquitis (normalmente como resultado de infecciones tales como, por ejemplo, la gonorrea, 40 las paperas, la tuberculosis y la sífilis), torsión testicular, vasitis nodosa, tumores de células germinales (por ejemplo, seminomas, carcinomas de células embrionarias, teratocarcinomas, conocarcinomas, tumores del saco vitelino, y teratomas), tumores del estroma (por ejemplo, tumores de células de Leydig), hidrocele, hematocele, varicocele, espermatocele, hemia inguinal, y trastornos de la producción de esperma (por ejemplo, el síndrome de inmovilidad ciliar, aspermia, astenozoospermia, azoospermia, oligospermia, y teratozoospermia). 45
Los trastornos del sistema reproductor también incluyen trastornos de la glándula prostática, como prostatitis aguda no bacteriana, prostatitis no bacteriana crónica, prostatitis bacteriana aguda, prostatitis bacteriana crónica, prostatodistonia, prostatosis, prostatitis granulomatosa, hipertrofia o hiperplasia prostática benigna malacoplaquia y trastornos neoplásicos de la próstata, incluyendo adenocarcinomas, carcinomas de células de transición, carcinomas ductales y carcinomas de células escamosas. 50
Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles en el diagnóstico, tratamiento y / o prevención de trastornos o enfermedades del pene y la uretra, incluyendo trastornos inflamatorios, tales como balanopostitis, balanitis xerótica obliterante, fimosis, parafimosis, sífilis, virus del herpes simple, gonorrea, uretritis no gonocócica, clamidia, micoplasma, tricomonas, VIH, SIDA, síndrome de Reiter, condiloma acuminado, condiloma latum, y pápulas perladas del pene; anomalías uretrales, como hipospadias, epispadias y fimosis; lesiones 55 premalignas, incluyendo eritroplasia de Queyrat, enfermedad de Bowen, paplosis bowenoide, condiloma gigante de Buscke-Lowenstein, y carcinoma verrugoso; cánceres de pene, incluyendo los carcinomas de células escamosas, carcinoma in situ, carcinoma verrugoso, y carcinoma de pene diseminado; neoplasias uretrales, incluyendo
carcinoma de pene uretra, carcinoma uretral bulbo-membranoso, y carcinoma de la uretra prostática; y trastornos eréctiles, tales como priapismo, enfermedad de Peyronie, disfunció eréctil e impotencia.
Por otra parte, las enfermedades y / o trastornos de los vasos deferentes incluyen vasculititis y CBAVD (ausencia bilateral congénita de los conductos deferentes); además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse en el diagnóstico, tratamiento y / o prevención de enfermedades y / o trastornos de las vesículas 5 seminales, que incluyen enfermedad hidatídica, diarrea de cloruro congénita y enfermedad renal poliquística.
Otros trastornos y/o enfermedades del sistema reproductor masculino incluyen, por ejemplo, síndrome de Klinefelter, síndrome de Young, eyaculación precoz, diabetes mellitus, fibrosis quística, síndrome de Kartagener, fiebre alta, esclerosis múltiple y ginecomastia.
Además, las proteínas de fusión de la invención pueden usarse en el diagnóstico, tratamiento y / o prevención de 10 enfermedades y / o trastornos de la vagina y la vulva, que incluyen vaginosis bacteriana, vaginitis por candida, virus del herpes simple, cancroide, granuloma inguinal, linfogranuloma venéreo, sarna, el virus del papiloma humano, traumatismo vaginal, traumatismo vulvar, adenosis, vaginitis por clamidia, gonorrea, vaginitis por tricomonas, condiloma acuminado, sífilis, molusco contagioso, vaginitis atrófica, enfermedad de Paget, liquen escleroso, liquen plano, vulvodinia, síndrome del choque tóxico, vaginismo, vulvovaginitis, vestibulitis vulvar, y trastornos neoplásicos,, 15 como la hiperplasia de células escamosas, carcinoma de células claras, carcinoma de células basales, melanomas, cáncer de la glándula de Bartholin, y la neoplasia intraepitelial vulvar.
Trastornos y / o enfermedades del útero incluyen dismenorrea, retroversión del útero, endometriosis, fibromas, adenomiosis, anovulación, amenorrea, síndrome de Cushing, moles hidatidiformes, síndrome de Asherman, menopausia precoz, pubertad precoz, pólipos uterinos, hemorragia uterina disfuncional (por ejemplo, debido a 20 señales hormonales aberrantes), y trastornos neoplásicos, tales como adenocarcinomas, queiomiosarcomas, y sarcomas. Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden ser útiles como marcadores o detectores de, así como en el diagnóstico, tratamiento y / o prevención de anomañías uterinas congénitas, tales como útero bicorne, útero septado, útero unicorne sencillo, útero unicorne con un cuerno rudimentario no cavitario, útero unicorne con un cuerno no comunicante cavitario rudimentario, útero unicorne con un cuerno cavitario 25 comunicar, útero arqueado, didelfus uterino y el útero en forma de T.
Enfermedades y / o trastornos ováricos incluyen anovulación, síndrome del ovario poliquístico (síndrome de Stein-Leventhal), quistes ováricos, hipofunción ovárica, insensibilidad ovárica a las gonadotropinas, sobreproducción de ovario de andrógenoso, el síndrome de la vena ovárica derecha, amenorrea, hirutism, y cáncer de ovario (incluyendo, entre otros, crecimiento canceroso primario y secundario, tumores de Sertoli-Leydig, carcinoma 30 endometroide de ovario, adenocarcinoma seroso papilar ovárico, adenocarcinoma mucinoso ovárico y tumores de Ovarian Krukenberg).
Enfermedades y / o trastornos cervicales incluyen cervicitis, cervicitis crónica, cervicitis mucopurulenta, displasia cervical, pólipos cervicales, quistes de Nabothian, erosión cervical, incompetencia cervical, y neoplasias cervicales (que incluyen, por ejemplo, carcinoma cervical, metaplasia escamosa, carcinoma de células escamosas, 35 adenoescamoso neoplasia de células, y neoplasia de células columnares).
Adicionalmente, las enfermedades y / o trastornos del sistema reproductor incluyen trastornos y / o enfermedades del embarazo, incluyendo aborto involuntario y muerte fetal, tales como aborto temprano, aborto tardío, aborto espontáneo, aborto inducido, aborto terapéutico, amenaza de aborto, aborto retenido, aborto incompleto , aborto completo, aborto habitual, aborto diferido, y aborto séptico; embarazo ectópico, anemia, incompatibilidad de Rh, 40 sangrado vaginal durante el embarazo, diabetes gestacional, retraso del crecimiento intrauterino, polihidramnios, el síndrome HELLP, desprendimiento prematuro de placenta, placenta previa, hiperemesis, preeclampsia, eclampsia, herpes gestacional y urticaria del embarazo. Adicionalmente, las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden usarse en el diagnóstico, tratamiento y / o prevención de enfermedades que pueden complicar el embarazo, incluyendo enfermedad cerebral, insuficiencia cardíaca, cardiopatía reumática, cardiopatía congénita, prolapso de la 45 válvula mitral, hipertensión arterial, anemia, enfermedad renal, enfermedad infecciosa (por ejemplo, rubéola, toxoplasmosis citomegalovirus, hepatitis infecciosa, clamidia, VIH, SIDA y herpes genital), diabetes mellitus, enfermedad de Graves, tiroiditis, hipotiroidismo, tiroiditis de Hashimoto, hepatitis activa crónica, cirrosis hepática, cirrosis biliar primaria, asma, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica idiopática, apendicitis, quistes ováricos, trastornos de la vesícula biliar y obstrucción intestinal. 50
Complicaciones asociadas con el esfuerzo del parto y el parto incluyen rotura prematura de las membranas, parto prematuro, embarazo prolongado, posmadurez, parto que avanza muy lentamente, sufrimiento fetal (por ejemplo, ritmo cardíaco anormal (fetal o materno), problemas de respiración, y posición fetal anormal), distocia de hombros, prolapso del cordón umbilical, embolia de líquido amniótico y sangrado uterino anormal.
Adicionalmente, enfermedades y / o trastornos del período posparto incluyen endometritis, miometritis, parametritis, 55 peritonitis, tromboflebitis pélvica, embolia pulmonar, endotoxemia, pielonefritis, tromboflebitis safena, mastitis, cistitis, hemorragia postparto, y el útero invertido.
Otros trastornos y / o enfermedades del sistema reproductor femenino que pueden diagnosticarse, tratarse y/o
prevenirse con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, por ejemplo, síndrome de Turner, seudohermafroditismo, síndrome premenstrual, enfermedad inflamatoria pélvica, congestión pélvica ( congestión vascular), frigidez, anorgasmia, dispareunia, rotura de trompa de Falopio y Mittelschmerz.
Enfermedades infecciosas
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o detectar agentes infecciosos. Por 5 ejemplo, incrementando la respuesta inmunitaria, en particular incrementando la proliferación y diferenciación de los linfocitos B y/o T, las enfermedades infecciosas se pueden tratar, detectar y/o prevenir. La respuesta inmunitaria se puede aumentar potenciando una respuesta inmunitaria existente o iniciando una respuesta inmunitaria nueva. Como alternativa, las proteínas de fusión de la invención también pueden inhibir directamente el agente infeccioso, sin provocar necesariamente una respuesta inmunitaria. 10
Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede causar enfermedad o síntomas que se pueden tratar o detectar mediante las proteínas de fusión de albúmina de la invención. Ejemplos de virus, incluyen, entre otros, los siguientes virus de ADN y ARN y familias virales. Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bonyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Dengue, VEB, VIH, Flaviviridae, Hepadnaviridae (Hepatitis), Herpesviridae (tales como, citomegalovirus, herpes simple, herpes zoster), mononegavirus (por ejemplo, 15 Paramyxoviridae , Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, la influenza A, influenza B y parainfluenza), virus del papiloma, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (como la viruela vacunal), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I , HTLV-II, Lentivirus), y Togaviridae (por ejemplo, Rubivirus). Los virus incluidos en estas familias pueden causar diversas enfermedades o síntomas, incluyendo, entre otros: artritis, bronquiollitis, virus sincitial respiratorio, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, 20 queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B , C, E, crónica activa, Delta), encefalitis B japonesa, Junín, Chikungunya, fiebre del Valle del Rift, fiebre amarilla, meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, el SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabia, resfriado común, poliomielitis, leucemia, rubéola, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la piel (por ejemplo, de Kaposi, verrugas) y viremia. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o 25 detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Las proteínas de fusión de la invención pueden usarse para tratar: meningitis, dengue, EBV y / o hepatitis (por ejemplo, hepatitis B). Las proteínas de fusión de la invención pueden usarse para tratar a los pacientes que no responden a una o más de las demás proteínas de fusión de vacunas contra la hepatitis comercialmente disponibles de la invención se pueden usar para tratar el SIDA.
De un modo similar, los agentes bacterianos y fúngicos que pueden producir enfermedades o síntomas que se 30 pueden tratar o detectar con las proteínas de fusión de albúmina de la invención incluyen, entre otros, las siguientes bacterias gramnegativsa y grampositivs, familias bacterianas y hongos: Actinomyces (p. ej., Norcardia), Acinelobacter, Cryptococcus neoformans, Aspergillus, Bacillaceae (p. ej.,Bacillus anthrasis), Bacteroides (p. ej.,Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (p. ej.,Borrelia burgdorferi), Brucella, Candidia, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium (p. ej.,Clostridium botulinum, Clostridium dificile, Clostridium perfringens, 35 Clostridium tetant), Coccidioides, Corynebacterium (p. ej.,Corynebacterium diptheriae), Cryptococcus, Dermatocycoses, E. coli (p. ej., E. coli enterotoxigénica y E. coli enterohemorrágica), Enterobacter (p. ej.,Enterobacter aerogenes), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (p. ej.,Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi), Serratia, Yersinia, Shigella), Erysipelothrix, Haemophilus (p. ej., Haemophilus influenza de tipo B), Helicobacter, Legionella (p. ej., Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria (p. ej., Listeria 40 monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (p. ej., Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (p. ej., Vibrio cholerae), Neisseriaceae (p. ej., Neisseria gonorrhea, Neisseria meningitidis), Pasteurellacea, Proteus, Pseudomonas (p. ej., Pseudomonas aeruginosa), Rickettsiaceae, Spitochetes (p. ej., Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Staphylococcus (p. ej., Staphylococcus aureus), Meningiococcus, Pneumococcus y Streptococcus (p. ej., Streptococcus pneumoniae y estreptococos de los grupos A, B, y C Streptococci), y 45 Ureaplasmas. Estas familias bacterianas, parasitarias y fúngicas pueden producir enfermedades o síntomas, incluyendo, entre otros: Infecciones resistentes a fármacos, bacteriemia, endocarditis, septicemia, infecciones oculares (p. ej., conjuntivitis), uveítis, tuberculosis, gingivitis, diarrea bacteriana, infecciones oportunistas (p. ej., infecciones relacionadas con el SIDA), paroniquia, infeccione relacionadas con prótesis, caries dental, enfermedad de Reiter, infecciones del tracto respiratorio, tales como tos ferina o empiema, sepsis, enfermedad de Lyem, 50 enfermedad por arañazo de gato, disentería, fiebre paratifoidea, intoxicación alimentaria. Enfermedad del legionario, inflamación crónica y aguda, eritema, infecciones por levaduras, tifoide, neumonía, gonorrea, meningitis (p. ej., meningitis de tipos A y B), clamidia, sífils, lepra, difteria, brucelosis, úlceras pépticas, ántrax, abortos espontáneos, defectos de nacimiento, neumonía, infecciones pulmonares, infecciones, sordera, ceguera, letargo, malestar, vómitos, diarrea crónica, enfermedad de Crohn, colitis, vaginosis, esterilidad, enfermedades inflamatorias de la 55 pelvis, candidiasis, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, fiebre escarlata, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades de la iel (p. ej., celulitis, dermatomicosis, toxemia, infecciones del tracto urinario, infecciones de heridas, infecciones nosocomiales. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Las proteínas de fusión de la invención pueden usarse para tratar: tétanos, difteria, botulismo y/o meningitis de tipo B. 60
Además, los agentes parasitarios causantes de enfermedades o síntomas que se pueden tratar, prevenir y/o diagnosticar con las proteínas de fusión de la invención incluyen, entre otros, las siguientes familias o clases:
amebiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, dourinea, ectoparásitos, giardias, helmintiasis, leishmaniasis, esquistisoma, teileriasis, toxoplasmosis. Tripanosomiasis, y tricomonas y esporozoos (p. ej., Plasmodium virax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale). Estos parásitos pueden causar diversas enfermedades o síntomas, incluyendo, entre otros: Escabiosis, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedades intestinales (p. ej, disentería, giardiasis), enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, infecciones 5 oportunistas (p. ej., relacionadas con el SIDA), malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar cualquiera de estos síntomas o enfermedades. Las proteínas de fusión de la invención se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar la malaria.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención podrían administrarse al paciente mediante una cantidad eficaz 10 de una proteína de fusión de albúmina de la invención o retirando las células del paciente y devolviendo las células modificadas al paciente (terapia ex vivo). Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar como antígeno en una vacuna para producir una respuesta inmunitaria contra la enfermedad infecciosa.
Regeneración
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para diferenciar, proliferar y atraer las células lo 15 que conduce a la regeneración de tejidos. (Véase, Science 276:59 - 87 (1997)). La regeneración de tejidos se podría usar para reparar, sustituir o proteger tejidos dañados por defectos congénitos, traumatismos (heridas, quemaduras, incisiones o úlceras), la edad, enfermedades (p. ej., osteoporosis, artrosis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirigía, incluida la cirgía plástica estética, fibrosis, lesión por reperfusión o daños por citocinas sistémicas.
Los tejidos que se pueden regenerar usandola presente invención incluyen órganos (p. ej., páncreas, hígado, 20 intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardíaco), vasculatura (incluyendo vasculares y linfáticos), tejido nervioso, hematopoyético y esquelético (huesos, cartílagos, tendones y ligamentos). Preferentemente, la regeneración se produce sin cicatrización o con una cicatrización menor. La regeneración también puede incluir angiogénesis.
Además, las proteínas de fusión de la invención pueden aumentar la regeneración de los tejidos difíciles de 25 cicatrizar. Por ejemplo, la regeneración aumentada de tendones/ligamentos aceleraría el tiempo de recuperación después del daño. Las proteínas de fusión de la invención también podrían usarse profilácticamente en un esfuerzo para evitar daños. Enfermedades específicas que podrían tratarse incluyen tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros defectos en tendones o ligamentos. Un ejemplo adicional de regeneración tisular de heridas no cicatrizantes incluye úlceras de presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas. 30
De un modo similar, el tejido nervioso y cerebral también se podría regenerar usando proteínas de fusión de la invención para prliferar y diferenciar las células nerviosas. Enfermedades que podrían tratarse usando este procedimiento incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatías o trastornos mecánicos y traumáticos (p. ej., trastornos de la médula espinal, traumatismo cerebral, enfermedad cerebrovascular e ictus). Específicamente, enfermedades asociadas con lesiones neurales periféricas, neuropatía periférica (p. ej., resultantes 35 de quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, , enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager) podrían tratarse todas usando las proteínas de fusión de albúmina de la invención.
Trastornos gastrointestinales
Las proteínas de fusión de albúmina de la pueden usarse para tratar, prevenir, diagnosticar y/o pronosticar 40 trastornos gastrointestinales, incluidas enfermedades y/o trastornos inflamatorios, infecciones, cánceres (p. ej., neoplasias intestinales (tumor carcinoide del intestino delgado, linfoma no Hodgkin del intestino delgado, , linfoma del intestino delgado)) y úlceras, tales como úlceras pépticas.
Trastonos gastorintesinales incluyen disfagioa, odinofagia, inflamación del esófago, esofagitis péptica, reflujo gástrico, fibrosis y estenosis de la submucosa, lesiones de Mallory-Weiss, leoiomiomas, lipomas, cánceres 45 epidérmicos, adenocarcinomas, trastornos de retención gástrica, gastroenteritis, atrofia gástrica, cánceres gástricos/de estómago, pólipos del estómago, trastornos autoinmunitarios tales como anemia perniciosa, estenosis pilórica, gastritis (bacteriana, viral, eosinófila, inducida por estrés, erosiva crónica, atrófica, de células plasmáticas y de Ménétrier) y enfermedades peritoneales (p. ej., quiloperitoneo, hemoperitoneo, quistes mesentéricos, lindadenitis mesentérica, oclusión vascular mesentética, paniculitis, neoplasias, peritonitis, neumoperitoneo, absceso bufrénico). 50
Los trastornos gastrointestinales también incluyen trasornos asociados con el intestino delgado, tales como síndromes de malaabsorción, distensión, síndrome del intestino irritable, intolerancia al azúcar, enfermedad celíaca, úlceras duodenales, duodenitis, esprúe tropical, enfermedad de Whipple, linfangiectasia intestinal, enfermedad de Crohn, apendicitis, obstrucciones del íleon, divertículos de Meckel, múltiples divertículos, fracaso en la rotación completa del intestino grueso y delgado, linfoma, enfermedades bacterianas y parasitarias (tales como diarrea del 55 viajero, tifoides y paratifoides, cólera, infección por nematodos (Ascariasis lumbricoides), anquilostomas (Ancylostoma duodenale), oxiuros (Enterobius vermicularis), tenias (Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Diphyllobothrium spp., y T. solium).
Enfermedades y/o trastornos hepáticos incluyen colestasis intrahepática (síndrome alagille, cirrosis hepática biliar), hígado graso (hígado graso alcohólico, síndrome de reye), trombosis de las venas hepáticas, degeneración hepatoventricular, hepatomegalia, síndrome hepatopulmonar, síndrome hepatorrenal, hipertensión portal (varices esofágicas y gástricas), absceso hepático (absceso hepático por amebas), cirrosis hepática (alcohólica, biliar y experimental), enfermedades hepáticas alcohólicas (hígado graso, hepatitis, cirrosis), parásitos (equinococcosis 5 hepática, fascioliasis, absceso hepático amébico), ictericia (hemolítica, hepatocelular y colestática), colestasis, hipertensión portal, hepatomegalia, ascitis, hepatitis (hepatitis alcohólica, hepatitis animal, hepatitis crónica (autoinmunitaria, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, inducida por fármacos), hepatitis tóxica, hepatitis viral humana (hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E), enfermedad de Wilson, hepatitis granulomatosa, cirrosis bililar secundaria, encefalopatía hepática, hipertensión portal, varices, encefalopatía hepática, cirrosis biliar primaria, 10 colangitis esclerosante primaria, adenoma hepatocelular, hemangiomas, cálculos biliares, insuficiencia hepática (encefalopatía hepática, insuficiencia hepática aguda) y neoplasias hepáticas (angiomiolipoma, metástasis hepáticas calcificadas, metástasis hepáticas quísticas, tumores epiteliales, hepatocarcinoma fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, adenoma hepática, adenoma quístico hepatobiliar, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer hepático, hemangioendotelioma hepático, hamartoma mesenquimatoso, tumores mesenquimatosos del 15 hígado, hiperplasia regenerativa nodular, tumores hepáticos benignos (quistes hepáticos [quistes simples, enfermedad hepática poliquística, adenoma quístico hepatobiliar, quistle del colédoco], tumores mesenquimatosos [hamartoma mesenquimatoso, hemangioendotelioma infantil, hemangioma, púrpura hepática , lipomas, seudotumor inflamatorio, otros], tumores epiteliales [epitelio de las vías biliares (hamartoma de las vías biliares, adenoma de las vías biliares), hepatocitos (adenoma, hiperplasia nodular focal, hiperplasia regenerativa nodular)], tumores hepáticos 20 malignos [hepatocelular, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, colangiocelular, colangiocarcinoma, adenocarcinoma quístico, tumores de los vasos sanguíneos, angiosarcoma, sarcoma de Karposi, hemangioendotelioma, otros tumores, sarcoma embrionario, fibrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinosarcoma, teratoma, carcinoide, carcinoma esscamoso, linfoma primario]), púrpura hepática, porfiria eritrohepática, profiria hepática (porfiria intermitente aguda, profiria curánea tardía), síndrome de Zellweger). 25
Enfermedades y/o trastornos pancreáticos incluyen pancreatitis aguda, pancreatitis crónica (pancreatitis necrotizante aguda, pancreatitis alcohólica), neoplasias (adenocarcinoma del páncreas, adenocarcinoma quístico, insulinoma, gastrinoma y glucagonoma, neoplasias quísticas, tumores de las células de los islotes, pancreoblastoma) y otras enfermedades pancreáticas (p. ej., fibrosis quística, quistes (seucoquiste pancreático, fístulas pancreáticas, insuficiencia)). 30
Las enfermedades de la vesícula biliar incluyen cálculos biliares (colelitiasis y coledocolitiasis), síndrome poscolecistectomía, diverticulosis de la vesícula biliar, colecistitis aguda, colecistitis crónica, tumores de las vías biliares y mucocele.
Enfermedades y/o trastornos del intetsino delgado incluyen colitis asociada con antibióticos, diverticulitis, colitis ulcerosa, megacolon adquirido, abscesos, infecciones fúngicas y bacterianas, trastornos anorrectales (p. ej., fisuras, 35 hemorroides), enfermedades colónicas (colitis, neoplasias colónicas [cáncer de colon, pólipos colónicos adenomatosos (p. ej., adenoma villoso), carcinoma de colon, cáncer colorrectal], diverticulitis colónica, diverticulosis colónica, megacolon [enfermedad de Hirschsprung, megacolon tóxico]; enfermedades del colon sigmoide [proctocolitis, neoplasias del colon sigmoide]), estreñimiento, enfermedad de Crohn, diarrea (diarrea infantil, disentería), enfermedades duodenales (neoplasias duodenales, obstrucción duodenal, úlcera duodenal, duodenitis), 40 enteritis (enterocolitis), enteropatía por VIH, enfermedades del íleon (neoplasias del íleon, ileítis), enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn), atresia intestinal, enfermedades parasitarias (anisakiasis, balantidiasis, infecciones por blastocistos, criptosporidiosis, dientamoebiasis, disentería amébica, giardiasis), fístulas intestinales (fístula rectal), neoplasias intestinales (neoplasias cecales, neoplasias colónicas, neoplasias duodenales, neoplasias del íleon, pólipos 45 intestinales, neoplasias del yeyuno, neoplasias rectales), obstrucción intestinal (síndrome del asa aferente, obstrucción duodenal, impactación de heces, seudoobstrucción intestinal, [vólvulos cecales], invaginación), perforación intestinal, pólipos intestinales (pólipos colónicos, síndrome de gardner, síndrome de peutz-jeghers), enfermedades del yeyuno (neoplasias del yeyuno), síndromes de malabsorción (síndromes del asa ciega, enfermedad celíaca, intolerancia a la lactosa, síndrome del intestino corto, esprúe tropical, enfermedad de Whipple), 50 oclusión vascular mesentérica, cistoides pneumatosis intestinal, enteropatías perdedoras de proteínas (linfagiectasia intestinal), enfermedades rectales (enfermedades del ano, incontinencia fecal, hemorroides, proctitis, fístula rectal, prolapso rectal, rectocele), úlcera péptica (úlcera duodenal, esofagitis péptica, hemorragia, perforación, úlcera de estómago, síndrome de Zollinger-Ellison), síndromes posgastrectomía (síndrome de evacuación gástrica), enfermedades del estómago (p. ej., aclorhidria, reflujo duodenogástrico (reflujo biliar), ectasia vascular del antro 55 gástrico, fístula gástrica, obstrucción de la salida gástrica, gastritis (atrófica o hipertrófica), gastroparesia, dilatación del estómago, divertículos estomacales, neoplasias estomacales (cáncer gástrico, pólipos fástricos, adenocarcinoma gástrico, pólipos gastricos hiperplásicos), rotura estomacal, úlcera de estómago, vólvulo estomacal), tuberculosis, visceroptosis, vómitos (p. ej., hematemesis, hiperemesis gravídica, náuseas y vómitos postoperatorios) y colitis hemorrágica. 60
Otras enfermedades y/o trastornos del sistema gastrointestinal incluyen enfermedades del tracto biliar, tales como gastrosquisis, fístulas (p. ej., fístulas biliares, fístulas esofágicas, fístulas gástricas, fístulas intestinales, fístuls pancreáticas), neoplasias (p. ej., neoplasias del tracto biliar, neoplasias esofágicas, tales como adenocarcinoma del
esófago, carcinoma de células ecamosas esofágicas, neoplasias gastrointestinales, neoplasias pancreáticas, tales como adenocarcinoma del páncreas, neoplasias quísticas mucinosas del páncreas, neoplasias quísticas pancreáticas, pancreatoblastoma y neoplasias peritoneales), enfermedad esofágica (p. ej., enfermedades ampollosas, candidiasis, acantosis glicogénicas, ulceración, varices esofágicas de barrett, atresia, quistes, divertículos (p. ej., divertículos de Zenker), fístulas (p. ej., fístulas traqueoesofágicas), trastornos de la motilidad (p. 5 ej., síndrome de CREST, trastornos de la deglución, acalasia, espasmos, reflujo gastroesofágico), neoplasias, perforación (p. ej., síndrome de Boerhaave, síndrome de Mallory-Weiss), estenosis, esofagitis, hernia diafragmática (p. ej., hernia de hiato); enfermedades gastrointestinales, tales como gastroenteritis (p. ej., cholera morbus, infección por el virus Norwalk), hemorragia (p. ej., hematemesis, melena, hemorragia por úlcera péptica), neoplasias estomacales (cáncer gástrico, pólipos gástricosc adenocarcinoma, cáncer de estómago)), hernia (p. ej., hernia 10 diafragmática congénita, hernia femoral, hernia inguinal, hernia de obturación, hernia umbilical, hernia ventral) y enfermedades intestinales (p. ej., enfermedades cecal (apendicitis, neoplasias cecales)).
Quimiotaxis
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden tener actividad de quimiotaxis. Una molécula quimiotáctuca atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastocitos, 15 eosinófilos, células epiteliales y / o células endoteliales) a un sitio particular en el cuerpo, tal como un sitio de inflamación, infección o de hiperproliferación . Las células movilizadas a continuación pueden combatir y / o sanar el traumatismo o anomalía concreto.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden aumentar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas quimiotácticas pueden usarse para tratar la inflamación, infección, trastorno 20 hiperproliferativo o cualquier trastorno del sistema inmune¡ológico aumentando el número de células dirigidas a una localización particular en el cuerpo. Por ejemplo, las moléculas quimiotácticas pueden usarse para tratar heridas y otros traumatismos de los tejidos atrayendo a las células inmunitarias a la localización dañada. Las moléculas quimiotácticas de la presente invención también pueden atraer a fibroblastos, que pueden usarse para tratar heridas.
También se contempla que las proteínas de fusión de la invención pueden inhibir la actividad quimiotáctica. Estas 25 moléculas también podrían usarse para tratar trastornos. Por tanto, las proteínas de fusión de la invención podrían usarse como inhibidores de la quimiotaxis.
Otras actividades
Una proteína de fusión de albúmina de la puede usarse en el tratamiento para estimular la revascularización de tejidos isquémicos debido a varias enfermedades, tales como trombosis, arteriosclerosis y otras afecciones 30 cardiovasculares. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para estimular la angiogénesis y la regeneración de extremidades, como se ha tratado anteriormente.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para tratar heridas debidas a lesiones, quemaduras, reparaciones tisulares postoperatorias y úlceras, ya que son mitógenos para varias células de diferents orígenes, tales como células de fibroblastos y células de músculos esqueléticos y, por tanto, facilitan la reparación o 35 sustitución de tejido dañado o enfermo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también se pueden usar para estimular el crecimiento neuronal y para tratar y prevenir el daño neuronal que se produce en ciertos trastornos neuronales o afecciones neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y el complejo relacionado con el SIDA. Una proteína de fusión de albúmina de la invención puede tener la capacidad para estimular el crecimiento 40 de condorcitos, por tanto se pueden usar para potenciar la regeneración ósea y periodontal, y ayudar en los transplantes de tejidos o injertos óseos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para prevenir el envejecimiento de la piel por quemaduras solares mediante estimulación del crecimiento de los queratinocitos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para mantener los órganos antes del 45 transplante o para soportar el cultivo celular de tejidos primarios. Una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse para inducir tejido de origen mesodérmico para diferenciarse en embriones tempranos.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden aumentar o disminuir la diferenciación o proliferación de las células madre embrionarias, además de, como se ha tratado anteriormente, el linaje 50 hematopoyético.
De un modo similar, una proteína de fusión de albúmina de la se pueden usar para modular el metabolismo del mamífero que afecta al catabolismo, anabolismo, procesamiento, uso y almacenamiento de energía.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se pueden usar para cambiar el estado mental o el estado físico de un mamífero influyendo sobre los biorritmos, los ritmos cardíacos, la depresión (incluidos los trastornos 55
depresivos), la tendencia a la violencia, la tolerancia del dolor, las capacidades reproductoras (preferentemente mediante actividad de activita o de tipo inhibina), los niveles hormonales o endocrinos, el apetito, la libido, la memoria, el estrés u otras cualidades de cognición.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención también pueden usarse como aditivos o conservantes alimentarios, para incrementar o disminuir las capacidades de conservación, el contenido en grasas, los lípidos, las 5 proteínas, los hidratos de carbono, las vitaminas, los minerales, los cofactores u otros componentes nutricionales.
Las aplicaciones citadas anteriormente tienen usos en una amplia variedad de huéspedes. Dichos huéspedes incluyen, entre otros, seres humanos, murinos, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos, ratones, ratas, hámsters, cerdos, cerdos enanos, pollos, cabras, vacas, ovejas, perros, gatos, primates no humanos y seres humanos. El huésped puede ser un ratón, conejo, cabra, cobaya, pollo, rata, hámster, cerdo, oveja, perro o gato. El 10 huésped puede ser un mamífero. El huésped puede ser un ser humano.
Habiendo descrito generalmente la invención, la misma se entenderá con más facilidad haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1: Generación de construcción general para la transfección en células de mamífero. 15 Generación de la construcción de fusión de albúmina compatible para la expresión en líneas celulares de mamífero
Las construcciones de fusión de albúmina se pueden generar en vectores de expresión para usar en sistemas de cultivo de células de mamífero. El ADN que codifica una proteína terapéutica se pueden clonar en el extremo N y el extremo C con HSA en un vector de expresión de mamífero mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica (p. ej., amplificación por PCR, digestión de restricción y ligación). Una vez que le vector de expresión se ha 20 construido se puede proceder a la transfección en un sistema de expresión en mamíferos. En la técnica se conocen vectores de expresión adecuados incluyendo, entre otros, por ejemplo, el vector pC4 y/o vectores disponibles en Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH).
El ADN que codifica seroalbúmina humana se ha clonado en el vector pC4 que es adecuado para los sistemas de expresión en mamíferos, creando el plásmido pC4:HSA (nº de depósito en la ATCC PTA-3277). Este vector tiene un 25 gen de la dihidrofolato reductasa "DHFR" que pemritirá la selección en presencia de metotrexato.
El vector pC4:HSA es adecuado para la expresión de proteínas de fusión de albúmina en células CHO. Para la expresión en otros sistemas de cultivo celular en mamíferos, puede ser deseable subclonar un fragmento que comprende o, como alternativa, que consiste en, ADn que codifica una proteína de fusión de albúmina en un vector de expresión alternativo. Por ejemplo, un fragmento que comprende, o, como alternativa, que consiste en, ADN que 30 codifica una proteína de fusión madura se puede subclonar en otro vector de expresión, incluidos, entre otros, cualquiera de los vectores de expresión de mamíferos descritos en el presente documento.
En una realización preferida, el ADN que codifica una construcción de fusión de albúmina se subclona en vectores proporcionados por Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) mediante procedimientos conocidos en la técnica para la expresión en células NS0. 35
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión HSA-proteína terapéutica
Usando pC4:HSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3277), se pueden generar construcciones de fusión de albúmina en las que la porción de proteína terapéutica está en el extemo C de la secuencia de albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar ADN que codifica una proteína terapéutica del fragmento o variante de la misma entre los sitios de restricción Bsu 36I y Asc I del vector. Cuando se clona en Bsu 36I y Asc I, se puede usar el mismo diseño de 40 cebador usado para clonar en el sistema de vector de levadura (SEC ID Nº 1045 y 1046) (véase el ejemplo 2).
Generación de construcciones de fusión de albúmina que comprenden productos de fusión gen-HSA
Usando pC4:HSA (Nº de depósito en la ATCC PTA-3277), se pueden generar construcciones de fusión de albúmina en las que una porción de proteína terapéutica se clona en el extemo N de la secuencia de albúmina madura. Por ejemplo, se puede clonar ADN que codifica una proteína terapéutica que tiene su secuencia original entre los sitios 45 Bam HI (o Hind III) y Cla I de pC4:HSA.. Cuando se clona en el sitio Bam HI o Hind III, es preferible incluir una secuencia Kozak (CCGCCACCATG, SEC ID Nº 1107) antes del codón de inicio de la traducción del ADN que codifica la proteína terapéutica Si una proteína terapéutica no tiene una secuenci señal, el ADN que codifica dicha proteína terapéutica se puede clonar entre los sitios Xho I y Cla I de pC4:HSA Cuando se usa el sitio Xho I, se pueden usar los siguientes ejemplos de cebadores en 5' (SEC ID Nº 1052) y 3' (SEC ID Nº 1053): 50
5'-CCGCCGCTCGAGGGGTGTGTTTCGTCGA(N)183' (SEC ID Nº 1052)
5'-AGTCCCATCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATC(N)183' (SEC ID Nº1053)
En el cebador 5’ (SEC ID Nº 10552), la secuencia subrayada es un sitio Xho I; y el sitio Xho I y el ADN tras el sitio Xho I codifica los últimos siete aminoácidos de la secuencia líder de la seroalbúmina humana natural. En la SEC ID Nº 10552 "(N)18” es AND idéntico a los primeros 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. En el cebador 3’ (SEC ID Nº 1053), la secuencia subrayada es un sitio Cla I; y el sitio Cla I y el ADN tras él son la complementaria inversa del ADn que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína HSA madura (SEC ID Nº 5 1038). En la SEC ID Nº 1053 "(NO)18” es la complementaria inversa del ADN que codifica los últimos 18 nucleótidos que codifican la proteína terapéutica de interés. Usando estos dos cebadores, se puede amplificar por PCR la proteína terapéutica de interés, purificar el producto de la PCR, digerirlo con las enzimas de restricción Xho I y Cla I y clonarlo en los sitios Xho I y Cla I en el vector pC4:HSA.
Si se desea una secuencia líder alternativa, la secuencia líder de la albúmina natica se puede sustituir con la líder de 10 la albúmina quime´rica, es decir el péptido señal HSA-kex2, o una líder alternativa mediante procedimientos estándr concoidos en la técnica (por ejemplo, un experto en la técncia podría amplificar por PCR de forma rutinaria una líder alternativa y subclonar el producto de la PCR en una construcción de fusión de albúmina en lugar de la líser de albúmina manteniendo el marco de lectura).
Ejemplo 2. Expresión general en líneas celulares de mamífero. 15
Una construcción de fusión de albúmina generada en un vector de expresión compatible con la expresión en líneas celulares de mamídero se puede transfectar en líneas celulares adecuadas mediante precipitación en fosfato cálciclo, lipofectamina, electroporación u otros procedimientos de transfección conocidos en la técnica y/o como se describe en Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición" y en Ausubel et al. 2000. Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School "Current Protocols in Molecular Biology", 20 volumes 1 -4. Las células transfectadas se seleccionan después mediante la presencia de un agente de selección determinado mediante el marcador seleccionable en el vector de expresión.
El vector de expresión pC4 (nº de acceso en la ATCC 209646) es un derivado del plásmido pSV2-DHFR (nº de acceso en la ATCC 37146). pC4 contiene repeticiones terminales largas "LTR" del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., March 1985, Molecular and Cellular Biology, 438 - 447) and a fragment of the CytoMegatoVirus 25 "CMV"-enhancer (Boshart et al. 1985, Cell 41: 521 - 530). El vector también contiene el intrón en 3’, la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la preproinsulina de rata y el gen dela DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano del SV40. Para la transfección se usan células de ovario de hámster chino “CHO” u otras líneas celulares que caecen de un gen de la DHFR activo. La transfección de una construcción de fusión de albúmina en pC4 en las células CHP mediante procedimientos conocidos en la técnica permitirá la expresión de la proteína de 30 fusión de albúmina en células CHO, seguido de la escisión de la secuencia líder y la secreción al sobrenadante. La proteína de fusión de albúmina se purifica después del sobrenadante.
El vector de expresión pEE12.1 es suministrado por Lonza Biologics, Inc. (Portsmouth, NH) y es un derivado de pEE6 (Stephens and Cockett, 1989, Nucl. Acids Res. 17: 7110). Este vector comprende un promotor, un potenciador y la regón no traducida en 5’ completa del gen temprano inmediato mayor del citomegalovirus humano "hCMV-MIE" 35 (publicación internacional nº WO89/01036), cadena arriba de una secuencia de interés y un gen de la glutamina sintasa (Murphy et al., 1991, Biochem J. 227: 277279; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169175; patente de EE.UU. 5.122.464) para los fines de selección de células transfectadas en medio selectivo que contiene metionina sulfoximina. La transfección de las construcciones de fusión de albúmina en pEE12.1 en las células NS0 (publicación internacional nº WO86/05807) mediante procedimientos conocidos en la técnica permitirá la expresión 40 de la proteína de fusión de albúmina en células NS0, seguido de la escisión de la secuencia líder y la secreción al sobrenadante. Después, la proteína de fusión de albúmina se purifica del siobrenadante usando técnicas descritas en el presente documento o, por otro lado, conocidas en la materia.
La expresión de una proteína de fusión de albúmina se puede analizar mediante, por ejemplo, SDS-PAGE y transferencia Western, análisis de HPLC de fase inversa u otros procedimientos conocidos en la técnica. 45
Las líneas celulares CHO y NS0 estables transfectadas con construcciones de fusión de albúmina generadas mediante procedimientos conocidos en la técnica (p. ej., transfección en lipofectamina) y seleccionadas con, por ejemplo, metotrexato 100 nM por vectores que tienen el gen de la dihidrofolato reductasa 'DHFR' como marcador seleccionable o mediante el crecimiento en ausencia de glutamina. Los niveles de expresión se puede encaminar mediante, por ejemplo, inmunotrasnferencia, principalmente, con un suero anti-HSA como anticuerpo primario o, en 50 segundo lugar, con suero que contiene anticuerpos dirigidos a la porción de proteína terapéutica de una proteína de fusión de albúmina como anticuerpo primario.
Los niveles de expresión se examinan mediante detección con inmunotrasnferencia con suero anti-HSA como anticuerpo primario. Ls tasas de productividad específicas se determinan mediante ELISA, en el que el anticuerpo de captura puede ser un anticuerpo monoclonal hacia la porción de proteína terapéutica de la proteína de fusión de 55 albúmina y el anticuerpo de detección puede ser el anticuerpo monoclonal anti-HS—biotinilad (o vice versa), seguido de unión de peroxidasa de rábano/estreptavidina y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Ejemplo 3. Purificación general de una proteína de fusión de albúmina de una construcción de fusión de albúmina en líneas celulares de mamífero
En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden la forma madura de HSA fusionada con el extremo N o C de la forma madura de una proteína terapéutica o porciones de la misma (p. ej., l a forma madura de una proteína terapéutica indicada en la tabla 1 o la forma madura de una proteína terapéutica mostrada en la tabla 2 como SEC ID Nº Z). En una realización de la invención, las las proteínas de fusión 5 de albúmina de la invención comprenden además una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión naciente en las vías secretoras del huésped usado para la expresión. En una realización preferida, el péptido señal codificado por una secuencia señal se elimina y la proteína de fusión de albúmina madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención comprenden, preferentemente, secuencias señal heterólogas (p. ej., la secuencia señal no natica de una proteína terapéutica´concreta), incluyendo, entre otras, MAF, 10 INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, proteína 4 de unión al factor de crecimiento de tipo insulina, variante de las secuencias líder de la HAS, incluyendo, entre otros, una secuencia líder de HSA/MAF quimérica, y otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. Especialmente preferidas como dichas secuencias señal enumeradas en la tabla 2 y/ la secuencia señal indicada en la sección "Expresión de proteínas de fusión" y/o "Procedimeintos adicionales de producción sintética y recombinante de proteínas de fusión de albúmina" de la memoria que se 15 indican anteriormente. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de la invención comprenden además un residuo de metionina en el extremo N. Los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, incluidos fragmentos y/o variantes, también entran dentro de la invención.
Las proteínas de fusión de albúmina de sobrenadantes de líneas celulares de mamífero se purifican de acuerdo con diferentes protcolos en función del sistema de expresión usado. 20
Purificación de líneas celulares CHO y 293T
La purificación de una proteínas de fusión de albúmina de sobrenadante de células CHO o de sobrenadante de células 293T transfectadas de forma transitoria puede implicar la captura inicial con una resina HQ aniónica usando un tampón de fosfato sódico y una elución por gradiente de fosfato, seguido de cromatografía de afinidad en una columna Blue Sepharose FF usando una elución de gradiente de sales. La Blue Sepharose FF elimina los 25 principales contaminantes BSA/fetuina. Otra purificación sobre la resina Poros PI 50 con un gradiente de fosfato puede eliminar y reducir la contaminación de endotoxina, así como el concentrado de la proteína de fusión de albúmina.
Pruficación de la línea celular NS0
La purificación de una proteína de fusión de albúmina del sobrenadante de células NS0 puede implicar 30 cromatografía de intercambio aniónico Q-Sepharose, seguida de purificación en SP-sepharose con una etapa de elución, seguida de purificación en Phenyl-650M con una etapa de elución y, en última instancia, diafiltración.
Después, la proteína purificada se puede formular mediante intercambio en tampón.
Ejemplo 4: Generación de la construcción ID 2053, IFNb-HAS.
La construcción ID 2053, pEE12,1:1FNb.HSA comprende AND que codifica una proteína de fusión de albúmina-35 IFNb que tiene la proteína IFNb de longitud completa, incluyendo secuencias líder de IFNb fusionadas con el extremo amino de la forma madira de HAS en el vector de expresión en NSO pEE12.1.
Clonación del ADNc de IFNb
El polinucleótido que codifica IFNb se amplificó por PCR usando los cebadores IFNb-1 y IFNb-2 descritos más adelante cortados con BamHI /ClaI y ligados en BamHI /Clacortar pC4: HSA. construcción resultante 2011.El 40 fragmentp EcoRI /EcoRI de la construcción ID nº 2011 se subclonó en el sitio EcoRI de pEE12.1 generanado una construcción ID Nº 2053 que comprende ADN que codifica una proteína de fusión de albúmina que contiene la secuencia líder y la forma madura de IFNb, seguido por la proteína HSA madura.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos adecuados para la amplificación por PCR del polinucleótido que codifica los IFNb, IFNb-1 y IFNb-2 de longitud completa. 45
El cebador DE IFNb-1 incorpora un sitio de clonación BamHI (que se muestra subrayado), un sitio de clonación Eco RI y una secuencia Kozak (mostrada en cursiva), seguidos de 80 nucleótidos que codifican los primeros 27 aminoácidos de la forma de longitud completa de IFNb. En IFNb-2, el sitio ClaI (que se muestra subrayado) y el ADN 5 que le sigue son el complementario inverso del ADN que codifica los primeros 10 aminoácidos de la proteína HSA madura (SEC ID Nº 1038) y los últimos 18 se nucleeotides son el complementario inverso del ADN que codifica el último 6 residuos de aminoácidos de IFNb (véase el Ejemplo 2). Se generó un amplímero de PCR usando estos cebadores, se purificó mediante digestión con las enzimas de restricción BamHI y ClaI y se clonó en los sitios el BamHI y Cla del vector pC4:HAS. Después de confirmar la secuencia, una fragmento EcoRI que contiene el casete 10 de expresión de la proteína fusión de albúmina IFNb se subclonó en pEE12.1 digerido con Eco RI.
Además, el análisis del extremo N de la proteína de fusión de albúmina expresada mediante secuenciación de aminoácidos puede confirmar la presencia de la secuencia esperada del IFNb (véase más adelante).
Las proteínas de fusión de la albúmina lFNb de la invención comprenden preferiblemente la forma madura de HSA, es decir, Asp-25 a Leu-609, fusionada en el extremo N o en el C de la forma madura de IFNb, es decir, Met-22 a Asn 15 187. En una realización de la invención, las proteínas de fusión de albúmina IFNb de la invención comprenden además una secuencia señal que dirige el polipéptido de fusión incipiente en la vía secretora de la huésped usado para la expresión. En una realización preferida adicional, el péptido señal codificado por una secuencia señal se elimina y la proteína de fusión de albúmina IFNb madura se secreta directamente al medio de cultivo. Las proteínas de fusión de la albúmina IFNb de la invención pueden comprender secuencias señal heterólogas incluyendo, entre 20 otras, MAF, INV, Ig, Fibulina B, Clusterina, proteína 4 de unión al factor de crecimiento de ipo insulina, secuencias líder variantes de HSA, incluyendo, entre otras, una secuencia líder HSA / MAF quimérica u otras secuencias señal heterólogas conocidas en la técnica. En una realización preferida, las proteínas de fusión de albúmina IFNb de la invención comprenden el IFNb nativo. En realizaciones preferidas, las proteínas de fusión de albúmina IFNb de la invención comprenden además un residuo de metionina en el extremo N. Los polinucleótidos que codifican estos 25 polipéptidos, incluidos fragmentos y/o variantes, también entran dentro de la invención.
Expresión y purificación de la construcción ID 2053. Expresión en líneas celulares NS0 de mieloma murino.
La construcción ID Nº 2053, pEE12.1: IFNb-HSA, se sometió a electroporación en células NS0 por procedimientos conocidos en la técnica (véase el Ejemplo 6). 30
Purficación del sobrenadante de células NS0
La purificación de la IFNb-HSA del sobrenadante de células NS0 puede seguir los procedimientos descritos en el Ejemplo 10 que implican cromatografía de intercambio aniónico Q-Sepharose a pH 7,4 usando un gradiente de NaCl de 0 a 1M en Tris-HCl 20 mM, seguido de cromatografía de intercambio aniónico Poros PI 50 a pH 6,5 con un gradiente de citrato de sodio de 5 a 40 mM, y diafiltración para 6 DV en citrato 10 mM, pH 6,5 y NaCl 140 mM. La 35 composición final del tampón La secuenciación del extremo N debe producir la secuencia MSYNLL, que es el extremo amino terminal de la forma madura de IFNb. La proteína tiene un PM aproximado de 88,5 kDa.
Para la purificación mayor escala, por ejemplo, 50 l de sobrenadante de células NSO se pueden concentrar en ~ 8 a 10 l. La muestra concentrada se puede pasar después sobre la columna de intercambio aniónico Q-Sepharose (10 x 19 cm.1,5 l) a pH 7,5 usando elución por etapas consistente en NaOAc 50 mM, pH 6,0 y NaCl 150 mM. La muestra 40 eluida se puede inactivar viralmente después con 0,75 % de Triton X-100 durante 60 min a temperatura ambiente. La cromatografía de fase inversa-SDR (10 cm x 10 cm 0,8 l) puede usarse después a pH 6,0 con 50 mM de NaOAc y NaCl 150 mM, o, como alrernativa, la muestra se puede pasar sobre una columna de SP-Sepharose a pH 4,8 usando elución por etapas de de NaOAc 50 mM, pH 6,0, y NaCl 150 mM, filtración con DV 50 deguiría después para eliminar cualquier contenido viral en la cromatografía Phenyl-650M (20 cm x 12 cm, 3,8 l) a pH 6,0 usando elución 45 por etapas consistente en 350 mM (NH4)2SO4 y NaOAc 50 mM o, alternativamente, consistente en NaOAc 50 mM pH 6.0. La diafiltración para 6 - 8 DV permitirá el intercambio de tampón en el tampón de formulación final deseada de mM Na2HPO4+ sacarosa 58 mM + NaCl 120 mM a pH 7.2 o citrato 10 mM, pH 6,5, y NaCl 140 mM o Na2HPO4, NaCl 25 mM, NaCl 100 mM a pH 7,2
La actividad de IFNb puede analizarse usando un IDRE-SEAP in vitro 50
Todas las proteínas de interferón de tipo I señaizan a través de un complejo de receptores común y una vía de señalización Jak / STAT similar que culmina en la activación del interferón "IFN", genes respondedores a través del elemento respondedor de la secuencia de interferón "ISRE". Un ensayo conveniente para la actividad de IFN de tipo
I es un sistema de ensayo de promotor-indicador que contiene múltiples copias del elemento ISRE fusionado a un gen indicador corriente abajo. Puede generarse una línea celular HEK293 estable y contiene una copia integrada de forma estable de un gen informador SEAP ISRE-que es extremadamente sensible a los IFN tipo I y muestra la linealidad de más de 5 logs de concentración.
Procedimiento de detección de clones estables en NSO de INNb-HSA 5
La construcción 2053 se sometió a electroporación en células NSO como se describe en el Ejemplo 6. Las células NSO transfectadas con la construcción ID Nº 2053 se sometieron a detección selectiva para determinar la actividad probando medios de cultivo acondicionado en el ensayo ISRE-SEAP. Las células indicadoras ISRE-SEAP / 293F se sembraron a 3 x 104 células / pocillo en placas de 96 pocillos revestidos con poli-D-lisina un día antes del tratamiento. Las células indicadoras se trataron con varias diluciones (incluyendo, entre otras, 1: 500 y 1: 5000) de 10 sobrenadante acondicionado o preparaciones purificadas de proteína de fusión de albúmina IFNb codificada por la construcción ID 2053 o rhIFNb como control. Las células indicadoras se trataron se incubaron después durante 24 horas antes de la eliminación de 40 l para uso en el ensayo de gen indicador de SEAP quimioluminiscente (Roche Nº de catálogo 1779942). El interferón beta recombinante humano "rhIFNb" (Biogen) se usó como control positivo.
Resultado 15
La preparación purificada de IFNb-HSA expresado en NSO tenía una CE50 mayor de 9,3 x 10-9g / ml de rhFNb (Biogen) que tenía una CE50 de 1,8 x 10-10g / ml (véase la Figura 2).
Inducción in vivo de OAS con un interferón Procedimiento
La enzima de la OES, 2'-5 'oligoadenilato sintetasa, se activa a nivel transcripcional por acción del interferón en 20 respuesta a la infección antiviral. El efecto de las construcciones de interferón se puede medir mediante la obtención de muestras de sangre de los monos tratados y el análisis de estas muestras para la activación transcripcional de dos ARNm de la OEA. p41 y p69. Un volumen de 0,5 ml de sangre completa se puede obtener de 4 animales por grupo a los 7 puntos de tiempo diferentes, el día 0, día 1, día 2, día 4, día 8, día 10, y el día 14 por animal. Los diversos grupos pueden incluir inyección del vehículo control, inyección intravenosa y / o subcutánea de 30 g / kg y / 25 o 300 g/kg de proteína de fusión de albúmina IFN el día 1, e inyección subcutánea de 40 g / kg de interferón alfa (Schering -Plough) como control positivo los días 1, 3 y 5. Los niveles de los transcritos de ARNm de p41 y p69 pueden determinarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman) usando sondas específicas para p41-OAS and p69-OAS. Los niveles de ARBn de la OAS se pueden cuantificar en relación con ARN ribosomal 18S control endógeno 30
Inducción in vivo de la fusión alúmina Interferón beta OAS codificada por la construcción ID 2053. Procedimiento
La actividad de la proteína de fusión HSA-IFNb codificada por la construcción 2053 se puede ensayar en el ensayo OAS in vivo previamemye descrito en la subsección "Inducción in vivo de OAS por un interferón".
Ejemplo 5: Indicaciones para las proteínas de fusión de albúmina IFNb 35
Las `proteínas de fusión de albúmina IFN beta (incluyendo, entre otras, las codificadas por la construcción 2053) se pueden usar para tratar, prevenir mejorar y / o detectar la esclerosis múltiple. Otras indicaciones incluyen, entre otras, melanoma, tumores sólidos, cáncer, infecciones bacterianas, quimioprotección, trombocitopenia, infecciones por VIH, cáncer de próstata, cáncer, neoplasias malignas hematológicas, trastornos hematológicos, preleucemia, glioma, hepatitis.B, hepatitis C, fibrosis humana virus del papiloma, fibrosis pulmonar, degeneración macular 40 relacionada con la edad, cáncer cerebral, glioblastoma multiforme, cáncer de hígado, melanoma maligno, cáncer colorrectal, enfermedad de Crohn, trastornos neurológicos, cáncer de pulmón amicrocítico, artritis reumatoide y colitis ulcerosa.
Ejemplo 6: Aislamiento de un clon de ADNc seleccionado de la muestra depositada
Muchas de las construcciones de fusión de albúmina de la invención se han depositado con la ATCC como se 45 muestra en la tabla 3. Las construcciones de fusión de albúmina pueden comprenden uno cualquiera de los siguientes vectores de expresión: el vector de expresión en la levadura S. cerevisiae pSAC35, el vector de expresión en mamíferos pC4 o el vector de expresión en mamíferos pEE12.1.
Los vectores pSAC35 (Sleep et al., 1990, Biotechnology 8:42), pC4 (nº de acceso en la ATCC 209646; Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438447 (1985); Boshart et al., Cell 41: 521530 (1985)), and pEE12.1 (Lonza 50 Biologics, Inc.; Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110 (1989); publicación internacional nº WO89/01036; Murphy et al., Biochem J. 227: 277279 (1991); Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10:169175 (1992); ; patente de EE.UU. 5.122.464; publicación internacional nº WO86/05807) comprenden un gen de resistencia a ampicilina para el crecimiento en células bacterianas. Estos vectores y/o la construcción de fusión de albúmina que los
comprende se pueden transformar en una cepa de E. coli tal como Stratagene XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037) usando técnicas descritas en la materia, tal como Hanahan, extensión en placas de agar Luria-Broth que contienen 100 µg/ml de ampicilina y crecimiento durante la noche a 37°.
El material depositado en la muestra asignada con el número de depósito en la ATCC citado en la tabla 3 para 5 cualquier construcción de fusión de albúmina dada también puede contener una o más construcciones de fusión de albúmina adicionales, codificando cada una diferentes proteínas de fusión de albúmina. Por tanto, los depósitos que comparten el mismo número de depósito en la ATCC contienen al menos una construcción de fusión de albúmina identificada en la correspondiente fila de la tabla 3.
Se pueden usar dos enfoques para aislar una construcción de fusión de albúmina concreta de la muestra depositada 10 de los ADN plasmídicos citados para dicha construcción de fusión de albúmina en la tabla 3.
Procedimiento 1: Detección selectiva
Primero, una construcción de fusión de albúmina se puede aislar directamente mediante detección selectiva de la muestra del ADN plasmídico depositado usando una sonda polinucleotídica correspondiente a la SEC ID Nº X para un ID nº de construcción individual en la tabla 1, usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se 15 puede sintetizar un pollinucleótido específico con 3040 nucleótidos usando un sintetizador de ADN de Applied Biosysteins de acuerdo con la secuencia indicada. El oligonucleótido se puede marcar con, por ejemplo, 32P-γ-ATP usando la polinucleótido quinasa de Y4 y se purifica de acuerdo con procedimientos de rutina. (p. ej., Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). La construcción de fusión de albúmina de un depósito de la ATCC dado se transforma en un huésped adecuado, como se ha indicado 20 anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) usando técnicas conocidas para el experto en la técnica, tal como las proporcionadas por el suministrador del vector o en publicaciones o patentes relacionadas citadas anteriormente. Los transformantes se siembran en placas de agar al 1,5 % (que contienen el agente de selección adecuado, por ejemplo ampicilina) hasta una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por placa. Estas placas se someten a detección selectiva usando membranas de nailon de acuerdo con procedimientos rutinarios para 25 detección selectiva de colonias bacterianas (p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edit., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 1.93 a 1.104), u otras técnicas conocidas para los expertos en la técnica.
Procedimiento 2: PCR
Como alternativa, el ADN que codifica una proteína de fusión de albúmina dada se puede amplificar de una muestra 30 de una construcción de fusión de albúmina depositada con SEC ID Nº X, por ejemplo usando dos cebadores de 1720 nucleótidos que hibridna con la construcción de fusión de albúmina depositada 5’ y 3’ con el AD que codifica una proteína de fusión de albúmina dada. La reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo en condiciones de rutina, por ejemplo en 25 µl de la mezcla de reacción con 0,5 ug del molde de ADNc anterior. Una mezcla de reacción conveniente es MgCl2 1,55 mM, 0,1 % (p/v) de gelatina, 20 µM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 35 25 pmol de cada cebador y 0,25 unidades de la Taq polimerasa. Se realizan treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto, hibridación a 55 ºC durante 1 minuto, elongación a 72 ºC durante 1 minuto) con un ciclador térmico automático Perkin-Elmer Cetus. El producto amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN con el peso molecular previsto se escinde y purifica. El producto de PCR se verifica que es la secuencia seleccionada mediante subclonación y secuenciación del producto de ADN. 40
Se dispone de varios procedimientos para la identificación de las porciones no codificantes en 5' y 3’ de un gen que puede no estar presente en el clon depositado. Estos procedimientos incluyen, enttre otros, sondaje con filtro, enriquecimiento del clon usando sondas específicas y protocolos similares o idénticos a los protocolos “RACE” en 5’ y 3’ que se conocen en la técnica. Por ejemplo, se dispone de un procedimiento similar al RACE en 5’ para generar el extreno 5' ausente de un tránscrito de longitud completa deseado (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res., 45 21(7):1683 - 1684 (1993)).
Brevemente, un oligonucleótido de ARN específico se liga a los extremos 5' de una población de ARN que posiblemente contenga los tránscritos de ARN del gen de longitud completa. Un conjunto de cebadores que contienen un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de una secuencia conocida del gen de interés se usa para amplificar por PCR la porción en 5' del gen de longitud completa deseado. 50 Este producto amplificado se puede secuenciar después y usar para generar el gen de longitud completa.
Este procedimiento anterior comienza con el ARN total aislado de la fuente deseada, aunque se puede usar poly-A+ARN. La preparación de ARN se puede tratar después con fosfatasa en caso necesario para eliminar los grupos fosfato en 5' sobre ARN degradado o dañado que pede interferir con la última etapa de ARN ligasa. La fosfatasa deberá inactivarse y el ARN tratarse con la pirofosfatasa ácida de tabaco con el fin de eliminar la estructura de 55 capuchón presente en los extremos 5’ de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato en 5’ en el extremo 5’ del ARN sin capuchón que después se puede ligar en un oligonucleótido de ARN usando la ARN ligasa de T4.
Esta preparación de ARN modificado se usa como molde para para la síntesis de la primera hebra del ADNc usando un oligonucleótido específico del gen. La preacicón de síntesis de la primera hebra se usa como molde para la amplificación por PCR del extremo 5’ deseado usando un cebador específico del oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico de la secuencia conocida del gen de interés. El producto resultante se secuencia después y analiza para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen deseado. 5
Ejemplo 7: Ensayo de captación de [3H]-2-Desoxiglucosa
Los tejidos adiposo, de músculo esquelético y hepático son tejidos sensibles a insulina. La insulina puede estimular la captación/transporte de glucosa en estos tejidos. En el caso de los tejidos adiposo y de múscuo esquelético, la insulina inicia la transducción de señal que en última instancia conduce a la translocación de la molécula 4 transportadora de glucosa, GLUT4, desde un compartimento intracelular especializado a la superficie de la célula. 10 Una vez en la superficie de la célula, GLUT4 permite la captación/transporte de glucosa.
Captación de [1H]-2-Desoxiglucosa
Se puede usar una serie de líneas celulares relacionadas con los tejidos adiposo y muscular para analizar la actividad de captación/transporte de glucosa en ausencia o presencia de una combinación de uno cualquiera de los fármacos terapéuticos indicados para el tratamiento de la diabetes mellitus. En particular, las células de fibroblastos 15 murinos 3T3-L1 y las células de músculo esquelético murino L6 se pueden diferenciar en adipocitos 3T3-L1 y en miotubos, respectivamente, para servir como modelos in vitro adecuados para el ensayo de captación de [3H]-2-Desoxiglucosa (Urso et al., J Biol Chem, 274(43): 3086473 (1999); Wang et al., J Mol Endocrinol, 19(3): 2418 (1997); Haspel et al., J Membr Biol, 169 (1): 4553 (1999); Tsakiridis et al., Endocrinology, 136(10): 4315 - 22 (1995)). Brevemente, 2 x 105 cells/100 µl de adipocitos o de células L6 diferenciadas se transfieren a placas de cultivo tisular 20 de 96 pocllos, “CT”, tratadas, es decir, revestidas, con 50 µg/ml de poli-L-lisina, placas en medio posidiferenciación y se incuban durante la noche a 37 ºC en 5 % de CO2. Las células se lavan primero una vez con medio DMEM con poca glucosa sin suero y después se mantienen con 100 µl/pocillo del mismo medio y con 100 µl/pocillo de tampón o de una combinación de una cualquiera o más de los fármacos terapéuticos enumerados para el tratamiento de la diabetes mellitus, por ejemplo concentraciones crecientes de 1 nM, 10 nM, y 100 nM de los agentes terapéuticos de 25 la invención sujeto (p. ej., fusiones específicas divulgadas como la SEC ID Nº Y y fragmentos y variantes de las mismas) durante 16 horas a 37 ºC en ausencia o presencia de insulina 1 nM. Las placas se levan tres veces con 100 µl/pocillo de solución salina tamponada HEPES. Se añade insulina a 1 nM en solución salina tamponada HEPES durante 30 min a 37° C en presencia de 10 µM [3H]-2-desoxiglucosa marcada 10 µM (Amersham, #TRK672) y 2-desoxiglucosa 10 µM sin marcar (SIGMA, D-3179). Como control se realizan las mismas condiciones a 30 excepción de en ausencia de insulina. Se añade una concentración final de citochalasina B (SIGMA, C6762) a 100 µl/pocillo en un pocillo aparte para medir la captación inespecífica. Las células se levan tres veces con solución salina tamponada HEPES. Se añaden [3H]-2-desoxiglucosa marcada 10 µM sin marcar, es decir 2-desoxiglucosa 10 µM durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se levan tres veces con solución salina tamponada con fosfato “PBS" fría. Las células se lisan tras la adición de 150 µ/pocillo de NaOH 0,2 N y la posterior incubación con 35 agitación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después, las muestras se transfieren a un vial de centelleo al que se añaden 5 ml de fluido de centelleo. Los viales se cuentan en un contador de centelleo beta. La captación en condiciones de duplicado, siendo la diferencia la ausencia o presencia de insulina, se determina con la ecuación siguiente: [(cuentas de insulina por minuto "cpm" – cpm inespecíficas)/(cpm sin insulina- cpm inespecíficas)]. Las respuestas medias entran dentro de los límites de aproximadamente por 5 y por 3 las de los controles por adipositos 40 y miotubos.
Diferenciación de células
Se deja que las células lleguen a confluencia completa en un matraz de T-75 cm2. Se retira el medio y se sustituye con 25 ml de medio de prediferenciación durante 48 horas. Las células se incuban a 37 ºC en 5 % de CO2, 85 % de humedad. Tras 48 horas, se retira el medio de prediferenciación y se sustituye con 25 ml de medio de diferenciación 45 durante 48 horas. Las células se incuban de nuevo a 37 ºC en 5 % de CO2, 85 % de humedad. Tras 48 horas, se retira el medio y se sustituye con 30 ml de medio de posdiferenciación. El medio posdiferenciación se mantiene durante 14 - 20 días o hasta que se consigue la diferenciación completa. El medio se cambia cada 2 - 3 días. Los adipocitos humanos se pueden adquirir de Zen-Bio, INC (# SA-1096).
Ejemplo 8: Ensayo in vitro de incorporación de timidina-[3H]- en línes de células de pancreáticas 50
Recientemente se ha mostrado que GLP-1 induce la diferenciación de la línea celular epitelial ductal pancreática de rata ARIP de un modo dependiente del tiempo y de la dosis, que se asocia con un incremento de la homeocaja 1 duodenal de los islotes (IDX-1) y los miveles de ARNm de insulina (Hui et at., 2001, Diabetes, 50(4): 785 - 96). El IDX-1 aumenta, a su vez, los niveles de ARNm del receptor del GLP-1.
Tipos de células analizados 55
Células RIN-M: Estas células están disponibles en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, número de línea celular CRL-2057). La línea celular RIN-M derivaba de un tumor de células de islotes de rata transplantables inducido por radiación. La línea se estableción a partir de un xenoinjerto del tumor de ratón atímico Las células
producen y secretan hormonas polipeptídicas del islote y producen L-dopa descarboxilasa (un marcadro de células que tienen captación del precursor de aminas y descarboxilación, o actividad APUD).
Células ARIP: Estas son células exocrinas pancreáticas de morfología epitelial disponibles en la Colección Americana de cultivos Tipo (ATCC, número de línea celular CRL-1674). Véanse también las referencias: Jessop, N.W. and Hay, R.J., "Characteristics of two rat pancreatic exocrine cell lines derived from transplantable tumors," In 5 Vitro 16: 212, (1990); Cockell, M. et al., "Identification of a cell-specific DNA-binding activity that interacts with a transcriptional activator of genes expressed in the acinar pancreas," Mol. Cell. Biol. 9: 24642476, (1989); Roux, E., et al. "The cell-specific transcription factor PTF1 contains two different subunits that interact with the DNA" Genes Dev. 3: 16131624, (1989); and, Hui, H., et al., "Glucagon-like peptide 1 induces differentiation of islet duodenal homeobox-1-positive pancreatic ductal cells into insulin-secreting cells," Diabetes 50: 785 - 796 (2001). 10
Preparación de las células
La línea celular RIN-M se cultiva en medio RPMI 1640 (Hyclone, #SH300027.01) con 10 % de suero bovino fetal (HyClone, #SH30088.03) y se subcultiva cada 6 a 8 días a una proporción de 1:3 a 1:6. El medio se camba cada 3 a 4 días.
La línea celular ARIP (ATCC #CRL-1674) se cultiva en medio F12K de Ham (ATCC, #302004) con L-glutamina 2 15 mM ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato sódico y 10 % de suero bovino fetal. La línea celular ARIP se subcultiva en una proporción de 1:3 a 1:6 dos veces a la semana. El medio se cambia cada 3 a 4 días.
Protocolo del ensayo
Las células se siembran a 4.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivan de 48 a 72 horas hasta una confluencia del 50 %. Las células se pasan a medio sin suero a 100 µl/pocillo. Tras incubar durante 48 - 72 horas, al 20 pocillo se añaden sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas). La incubación persiste durante 36 horas adicionales. La timidina [3H] (520 Ci/mmol) (Amersham Pharmacia, #TRK120) se diluye hasta 1 microCuries/5 microlitros. Después de una incubación de 36 horas se añaden 5 microlitros por pocillo durante otras 24 horas. La reacción se termina mediante lavado suave de las células con solución salina tamponada con fosfato “PBS" fría una vez. Las células se fijan 25 después con 100 microlitros de 10 % de TCA helado durante 15 minutos a 4 ºC. El PBS se elimina y se añaden 200 microlitros de NaOH 0,2 N. Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. La solución se transfiere a un vial de centelleo y se añaden 5 ml de fluido de centelleo compatible con soluciones acuosas y se mezclan enérgicamente. Los viales se cuentan en un contador de centelleo beta. Como control negativo solo se usa tampón. Como contro positivo se usa suero bovino fetal. 30
Ejemplo 9: Ensayo de glucosuria
La glucosuria (es decir, un exceso de azúcar en la orina) se puede determinar fácilmente para proporcionar un índice del estado de la enfermedad de diabetes mellitus. El exceso en orina en una muestra de pacientes en comparación con una muestra normal de un paciente es sintomática de DMDI y de DMNDI. La eficacia del tratamiento de dicho paciente con DMDI y DMNDI viene indicada por una disminución resultante de la cantidad de exceso de glucosa en 35 orina. En una realización preferida para el control de la DMDI y DMNDI, las muestras de orina de pacientes se analizan para determinar la presencia de glucosa usando técnicas conocidas en la materia. La glucosuria en seres humanos se define por una concentración de glucosa en orina superior a 100 mg por 100 ml. Los niveles excesivos de azúcar en los pacientes que exhiben glucosuria se pueden medir incluso con mayor precisión obteniendo muestras de sangre y analizando la glucosa en suero. 40
Ejemplo 10: Diabetes en ratones NOD.
Los ratones NOD (diabéticos no obesos) hembra se caracterizan por DMDI con una evolución similar a la hallada en seres humanos, aunque la enfermedad es más pronunciada en ratones NOD hembra que en macho. En lo sucesivo en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, la expresión “ratón NOD” hace referencia a un ratón NOD hembra. Los ratones NOD tienen una destrucción progresiva de las células beta que se debe a una 45 enfermedad autoinmunitaria crónica. Por tanto, los ratones NOD comienzan la vida con euglucemia o niveles normales de glucosa en sangre. A aproximadamente las 15 a 16 semanas de edad, los ratones NOD comienzan a estar hiperglucémicos, lo que indica destrucción de la mayoría de las células beta pancreáticas y la correspondiente incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina. Por tanto, tanto la causa como la progresión de la enfermedad son similares a las de los pacientes DMDI humanos. 50
Los ensayos de eficacia In vivo de los regímenes de inmunización se pueen evaluar en ratones NOD/LtJ hembra (disponibles comercialmente en The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.). En la literatura, se ha comunicado que e 80 % de los ratones hembra desarrolla diabetes a las 24 semanas de edad y la insulitis comienza a las 68 semanas de edad. Los ratones NOD son endogámicos y muy respondedores a diverasas estrategias inmunorreguladoras. Los ratones NOD adultos (68 semanas de edad) tienen una masa media de 20 - 25 g. 55
Estos rarones pueden estar sin tratar (control), tratados con las sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej.,
proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas), solas o en combinación con otros compuestos terapéuticos indicados anteriormente. El efecto de estos diversos tratamientos sobre la progresión de la diabetes se puede medir del siguiente modo:
A las 14 semanas de edad, los ratones NOD hembra se pueden fenotipar de acuerdo con la tolerancia a la glucosa. La tolerancia a la glucosa se puede medir con la prueba de la tolerancia a la glucosa intraperitoneal ( Brevemente, 5 se extrae sangre del plexo paraorbital a 0 minutos y a 60 minutos de la inyección intraperitoneal de glucosa (1 g/kg de peso corporal). La tolerancia normal se define como la glucosa en plasma a 0 minutos de menos de 144 mg, %, o a 60 minutos de menos de 160 mg %. Los niveles de glucosa en sangre se miden con un glucosímetro Elite.
Según este análisis fenotípico, se puede asignar a los animales a los diferentes grupos experimentales. En concreto, los animales con niveles de glucosa en sangre más elevados se pueden asignar al grupo de tolerancia a la glucosa 10 alterada. Se puede alimentar a los ratones a demanda y se les puede suministrar agua acidificda (pH 2,3).
Los ratones tolerantes e intolerantes a la glucosa se pueden subdividir además en grupos control, de proteínas de fusión de albúmina de la invención sujeto, y de combinación de proteínas de fusión de albúmina /compuestos terapéuticos. Los ratones del grupo control pueden recibir una inyección interperitoneal de vehículo al día, seis veces a la semana. Los ratones del grupo de fusión de albúmina pueden recibir una inyección interperitoneal de las 15 sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., las proteínas de fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de las mismas) en vehículo diario, seis ves a la semana. Los ratones del grupo de combinación proteínas de fusión de albúmina / compuestos terapéuticos pueden recibir proteínas de fusión de albúmina y combinaciones de compuestos terapéuticos como se ha descrito anteriormente.
EL nivel de glucosa en orina en los ratones NOD se puede determinar dos veces a la semana usando Labstix (Bayer 20 Diagnostics, Hampshire, England). El peso y la ingesta de fluidos también se puede determinar dos veces a la semana. El inicio de la diabetes se define después de la aparición de glucosuria en dos determinaciones consecutivas. Tas 10 semanas de tratameitno, se puede realizar una nueva orueba de IPGTT adicional y se puede sacrificar a los animales al día siguiente.
Durante las 10 semanas del tratamiento, los animales control de los grupos tolerantes a glucosa e intolerantes a 25 glucosa desarrollan diabetes a una velocidad del 60 % y 86 %, respectivamente (véase la patente de EE.UU. nº 5.866.546, Gross et al.). Por tanto, se producen altas tasas de diabetes incluso en ratones NOD que eran inicialmente tolerantes a la glucosa si no se realiza ninguna intervención.
Los resultados se pueden confirmar mediante la determinación de los niveles de glucosa en sangre en ratones NOD, antes y después del tratamiento. Los niveles de glucosa en sangre se miden como se ha descrito anteriormente en 30 ratones tanto tolerantes como intolerantes a la glucosa en todos los grupos descritos.
En una realización alternativa, las sustancias terapéuticas de la invención sujeto (p. ej., fusiones específicas divulgadas como la SEC ID Nº Y y fragmentos y variantes de las mismas) se pueden cuantificar usando análisis espectrométrico y cantidads adecuadas de proteínas se pueden resuspender antes de la inyección en 50 mu.l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por dosis. Se pueden administrar dos inyecciones, separadas por una 35 semana, por vía subcutánea debajo de la piel dorsal de cada ratón. La monitorización se puede realzar dos veces separadas antes de la inmunización y se puede realizar semanalmente a lo largo del tratameinto y continuar después. La orina se puede analizar para determinar la glucosa cada semana (Keto-Diastix.RTM.; Miles Inc., Kankakee, III.) y en los ratones glucosúricos se controlarán los niveles de glucosa en suero (ExacTech.RTM., MediSense, Inc., Waltham, Mass.). Se diagnostica diabetes cuando la glucemia en ayunas es superior a 2,5 g/l. 40
Ejemplo 11: Exploración histológica de ratones NOD.
La exploración histológica de las muestras de tejido de ratones NOD puede demostrar la capacidad de las composiciones de la presente invención y/o la combinación de las composiciones de la presente invención con otros agentes terapéuticos para diabetes, para incrementar la concentración relativa de las células beta en el páncreas. El procedimiento experimental es el siguiente: 45
Se puede sacrificar a los ratones del ejemplo 44 al final del periodo de tratamiento y se pueden tomar muestras de tejido del páncreas. Las muestras se pueden fijar en 10 % de formalina en solución salina al 0,9 % y se incluyen en cera. Se pueden cortar dos conjuntos de 5 secciones mu.m en serei para inmunomarcaje a un intervalo de corte de 150 .mu.m. Las secciones se pueden inmunomarcar para insuina (dilución 1:1000 de antisuerpo anti-insulina de cobaya,ICN Thames U.K.) y glucagón (dilución 1:2000 de antisuero anti-glucagón de páncreas de conejo) y se 50 detecta con antisuerpo de cobaya conjugado con peroxidasa (Dako, High Wycombe, Reino Unido.) o antisuerpo de conejo conjugado con peroxidasa (dilución a 1:50, Dako).
La composición de la presente invención puede o no tener un fuerte efecto sobre la masa visible de las células beta, como sobre las manifestaciones clínicas de la diabetes en animales tolerantes a la glucosa o intolerantes a la glucosa. 55
Ejemplo 12: Terapia de combinación de transplantes de células beta pancreáticas.
El transplante es una forma habitual de tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, especialmente cuando el propio tejido diana se ha visto dañado gravemente. Por ejemplo, y no a modo de limitación, el transplante de páncreas y el transplante de células de los islotes son opciones terapéutcas para la DMID (véase, por ejemplo, Stewart et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 86 (3): 984 - 988 (2001); Brunicardi, Transplant. Proc. 28: 2138 - 40 (1996); Kendall & Robertson, Diabetes Metab. 22: 157 - 163 (1996): Hamano et al., Kobe J. Med. Sci. 42: 93 - 104 5 (1996); Larsen & Stratta, Diabetes Metab. 22: 139 - 146 (1996); and Kinkhabwala, et al., Am. J. Surg. 171: 516 - 520 (1996)). Como ocurre con cualquier procedimiento de transplante, los tratamientos de transplantes para pacientes con enfermedades autoinmunitarias incluyen tratamientos para minimizar el riesgo de rechazo del huésped del tejido transplantado. No obstante, la enfermedad autoinmunitaria implica el riesgo independiente adicional de que la respuesta autoinmunitaria preexistente del huésped que dañó el tejido propio original ejercerá el mismo efecto 10 dañino sobre el tejido transplantado. De acuerdo con esto, la presente invención abarca procedimientos y composiciones para el tratamiento de enfermedades pancreáticas autoinmunitarias usando las proteínas de fusión de albúmina de la invención sujeto en combinación con inmunomoduladores/inmunosupresores en individuos sometidos a terapia de transplante de la enfermedad autoinmunitaria.
De acuerdo con la invención, las composiciones basadas en fusión de albúmina y las formulaciones descritas 15 anteriormente se administran para prevenir y tratar los daños en el órgano, tejido o células transplantadas resultantes de la respuesta autoinmunitaria del individuo huésped dirigida inicialmente contra el tejido propio original. La administración se puede llevar a cabo antes y después del transplante en de 2 a 4 dosis, separadas cada una por una semana.
Los siguientes inmunomoduladores/inmunosupresores, incluyendo, entre otros, AI-401, CDP-571 (anticuerpo 20 monoclonal anti-TNF), CG-1088, Diamyd (vacuna para la diabetes), ICM3 (anticuerpo monoclonal anti-ICAM-3), linomida (Roquinimex), NBI-6024 (ligando peptídico alterado), TM-27, VX-740 (HMR-3480), inhibidores de la caspasa 8 proteasa, talidomida, hOKT3gammal (Ala-ala) (anticuerpo monoclonal anti-CD3), interferón-alfa oral, lactobacillus oral y LymphoStat-B™ se pueden usar junto con las sustancias terapéuticas de fusión de albúmina de la invención sujeto en transplante de las células de los islotes o de páncreas. 25
Ejemplo 13: Modelo de ratón in vivo de DMNID
Los ratones C57BL/6J macho de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) se pueden obtener a las 3 semanas de edad y se les alimentó con pienso convencional o dietas enriquecidas con grasa (35,5 % peso/peso, Bioserv.Frenchtown, NJ) o fructosa (60 % peso/peso, Harlan Teklad, Madison, WI). El pienso regular está compuesto or 4,5 % peso/peso de grasa, 23 % peso/peso de proteína, 31,9 % peso/peso de almidón, 3,7 % peso/peso de fructosa y 5,3 % 30 peso/peso de fibra. La dieta rica en grasa (manteca) está compuesta por 35,5 % peso/peso de grasa, 20 % peso/peso de proteína, 36,4 % peso/peso de de almidón, 0,0 % peso/peso de fructosa y 0,1 % peso/peso de fibra. La dieta rica en fructosa está compuesta por 5 % peso/peso de grasa, 20 % peso/peso de proteína, 0,0 % peso/peso de almidón, 60 % peso/peso de fructosa y 9,4 % peso/peso de fibra. Los ratones se enjaularán a no más de cinco por jaula a una habitación con temperatura de 22° +/- 3° C y 50 % +/- 20 % de humedad controladas con 35 un ciclo de 12 horas de luz (de 6 de la mañana a 6 de la noche)/ oscuridad (Luo et al., 1998, Metabolism 47(6): 663 - 8. 663-8, "Nongenetic mouse models of non-insulin-dependent diabetes mellitus": Larsen et al., Diabetes 50(11): 2530 - 9 (2001). "Systemic administration of the long-acting GLP-1 derivative NN2211 induces lasting and reversible weight loss in both normal and obese rats"). Tras la exposición a las respectivas dietas durante 3 semanas, se puede inyectar a los ratones por vía intraperitoneal estreptozotocina "STZ" (Sigma, St. Louis, MO), a 100 mg/kg de peso 40 corporal o vehículo (0,05 mol/l de ácido cítrico, pH 4,5) y se mantuvieron con la misma dieta durante la siguientes 4 semanas. En condiciones sin ayuno se obtiene sangre 1, 2 y 4 semanas después de la STZ extrayéndola en la parte distal de la cola. Las muestras se usan para medir a glucosa en plasma sin ayunar y las concentraciones de insulina. El peso corporal y la ingesta de alimentos se registran semanalmente.
Para determinar directamente el efecto de la dieta rica en grasas sobre la capacidad de la insulina para estimular la 45 eliminación de la glucosa, los experimentos se puedne iniicar en tres grupos de ratones, alimentados con grasas, alimentados con pienso y a los que se inyectó vehículo y alimentados con grasa y a los que se inyectó STZ al final del periodo de 7 semanas descrito anteriormente. Los ratones se pueden dejar en ayunas durante 4 horas antes de los experimentos. En la primera serie de experimentos, se puede anestesiar a los ratones mediante inhalación de metoxiflurano (Pitman-Moor, Mundelein, IL). Se puede inyectar insulina regular (Sigma) por vía intravenosa ([IV] 0,1 50 U/kg de peso corporal) a través de la vena de la cola y se puede extraer sangre 3, 6, 9, 12 y 15 minutos después de la inyección de una vena de la cola diferente. Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar ene stas muestras y se puede calcular la semivida (t½) de la desaparición de glucosa del plasma usando WinNonlin (Scientific Consulting, Apex, NC), un programa de software de farmaocinética/farmacodinamia.
En la segunda serie de experimentos, se puede anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico intreperitoneal 55 (Sigma). Se abre la cavidad abdominal y se expone la principal vena abdominal y se introduce un catéter i.v. de calibre 24 (Johnson-Johnson Medical, Arlington, TX). El catéter se fija al tejido muscular adyacente a la vena abdominal, se corta por el fondo de la conexión de la jeringa y se engancha a un tubo de plástico PE50 prcargado, que a se vez está conectado a una jeringa con la solución de infusión. Después, se cierra la cavidad abdominal mediante suturas. Con este enfoque, no se produciría un bloqueo del retroflujo de la sangre desde la parte inferior 60 del cuerpo. Se puede perfundir continuamente glucosa en los ratones (24,1 mg/kg/min) e insulina (10 mU/kg/min) a
un volumen de infusión de 10 µl/min. Se puede extraer muestras de sangre retroorbital (70 µl cada una) a 90, 105, 120 y 135 minutos después del inicio de la infusión para medir las concentraciones de glucosa y de insulina en plasma. La media de estas cuatro muestras se usa para estimar las concentraciones en equilibrio de glucosa (SSPG) y de insulina (SSPI) en plasma para cada animal.
Por último, se pueden realizar experimentos para evaluar la capacidad de lals proteínas de fusión de albúmina, las 5 composiciones terapéuticas de la rpesente solicitud, solas o en combinación con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos indicados para el tratamiento de la diabetes mellitus, para disminuir la glucosa en plasma, en los dos grupos siguientes de modelos de ratones “DMNID" en los que se ha inyectado STZ. (1) C57BL/6J alimentados con grasas y (2) C57BL/6J alimentados con fructosa. Las concentraciones de glucosa en plasma de los ratones para estos estudios pueden variar de 255 a 555 mg/dl. Los ratones se asignal a azar a recibir tratamiento 10 con vehículo, sustancias terapéuticas de fusión de albúmina de la presente invención, solas o en combinación con uno cualquiera o más de los fármacos terapéuticos indicados para el tratameinto de la diabetes mellitus. Se puede administar un total de tres dosis. Se pueden extraer muestras de sabgre de la vena de la cola para medir la concentración de glucosa en plasma antes de la primera dosis y 3 horas después de la dosis final.
Las concentraciones de glucosa en plasma se pueden determinar usando el kit Glucose Diagnostic de Sigma (Sigma 15 No. 315), un ensayo colorimétrico enzimático. Los niveles de insulina en plasma se pueden determinar usando el kit RIA para insulina en ratas de Linco Research (#RI-13K; St. Charles, MO).
Ejemplo 14: Ensayos indicadoresH4IIe-SEAP in vitro que establecen la implicación en la acción de la insulina Los diversos indicadores H4IIe 20
H4IIe/rMEP-SEAP: El promotor de la enzima málica aislada de rata (rMEP) contiene un elemento de PPAR-gamma que está en la vía de la insulina. Esta construcción indicadora se transfecta de forma estable en la línea celular hepática H4Iie.
H4IIc/SREBP-SEAP: La proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP-1c) es un factor de transcripción que actúa sobre los promotores de una serie de genes sensibles a la insulina, por ejemplo, la sintetasa 25 de ácidos grasos (FAS), y que regula la expresión de genes clave en el metabolismo de los ácidos grasos en los fibroblastos, adipocitos, y hepatocitos. SREBP-1c, también conocido como e factor 1 de determinación y diferenciación de adipocitos (ADD-1), se considera el principal mediador de los efectos de la insulina sobre la expresión génica en las células adiposas. Su actividad está modulada por los niveles de insulina, esteroles, y glucosa. Esta construcción indicadora se transfecta de forma estable en la línea celular hepática H4Iie. 30
H4IIe/FAS-SEAP: Las construcciones indicadoras de la intetasa de ácidos grasos contienen un promotor mínimo FAS respondedor a SREBP. Esta construcción indicadora se transfecta de forma estable en la línea celular hepática H4Iie.
H4IIe/PEPCK-SEAP: El promotor de la fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK) es el sitio primario de la regulación hormonal de la transcripción del gen PEPCK qie modula la actividad de PEPCK. La PEPCK cataliza una etapa 35 comprometida y limitante de la velocidad en la gluconeogénesis hepática y, por lo tanto, debe controlarse cuidadosamente para mantener los niveles de glucosa en sangre dentro de los límites normales. Esta construcción indicadora se transfecta de forma estable en la línea celular hepática H4Iie.
Estas construcciones indicadoras también pueden transfectarse de forma estable en fibroblastos 3T3-L1 y mioblastos L6. Estas líneas celulares estables se diferenciaron después en los adipocitos 3T3-L1 y los miotubos L6 40 descritos anteriormente en el Ejemplo 41. Las líneas de células diferenciadas se pueden usar a continuación en el ensayo de SEAP se describe a continuación.
Medio de crecimiento y de ensayo
El medio de crecimiento comprende 10 %de suero bovino fetal (FBS), 10 % de suero de ternera, 1 % de NEAA, 1x de penicilina / estreptomicina y 0,75 mg / ml de G418 (para H4IIE / RFA-SEAP y H4IIE / SREBP-SEAP) o 0,50 mg / 45 ml de G418 (para H4IIE / rMEP-SEAP). Para H4IIE / PEPCK-SEAP, el medio de crecimiento se compone de 10 % de FBS, 1 % de penicilina / estreptomicina, solución salina tamponada con HEPES 15 mM y 0,50 mg / ml de G418.
El medio de ensayo consiste en medio DMEM bajo en flucisa (Life Technologies), 1 % de NEAA, 1x de penicilina / estreptomicina para la H4IIE / RFA-SEAP. Indicadores H4IIe/SREBP-SEAP, H4IIe/rMEP-SEAP. El medio de ensayo para el indicador H4IIE / PEPCK-SEAP consiste en 0,1 % de FBS, 1 % de penicilina / estreptomicina y solución 50 salina tamponada conHEPES 15 mM.
Procedimiento
Las placas de 96 pocillos se siembran a 75.000 células / pocillo en 100 µl// pocillo del medio de crecimiento hasta que las células en fase de crecimiento log se hacen adherentes. Las células se dejan sin alimento durante 48 horas,
sustituyendo el medi de crecimiento por medio de ensayo 200 µl// pocillo. .(Para las células H4IIE / PEPCK-SEAP, se añade medio de ensayo que contiene dexametasona 0,5 µM a 100 µl / pocillo y se incuban durante aproximadamente 20 horas). El medio de ensayo se sustituye después con 100 µl/l / pocillo de medio de ensayo fresco, y al pocillo se añade un alícuota de 50 µl/ del sobrenadante de las células obtenido a partir de líneas celulares transfectadas que expresan los agentes terapéuticos de la presente invención (por ejemplo, proteínas de 5 fusión de albúmina de la invención y fragmentos y variantes de la misma). Los sobrenadantes de las líneas celulares transfectadas con el vector vacío se usan como control negativo. La adición de insulina 10 nM y / o 100 nM a los pocillos se usa como control positivo. Después de 48 horas de incubación, los medios acondicionados se cosechan y la actividad SEAP se mide (protocolo Phospha-Light System, Tropix # BP2500). Brevemente, las muestras se diluyen a 1: 4 en tampón de dilución y se incuban a 65 ° C durante 30 minutos para inactivar la forma no placentaria 10 endógena de SEAP. Un alícuota de 50µl de las muestras diluidas se mezcla con 50 µl de tampón de ensayo SEAP que contiene una mezcla de inhibidores activos contra las isoenzimas SEAP no placentarias y se incuba durante otros 5 minutos. Un alícuota de 50 µl de sustrato quimioluminiscente CSPD que se diluye a 1:20 en potenciador de luminiscencia Emerald se añade a la mezcla y se incuba durante 15-20 minutos. Las placas se leyeron en un luminómetro Dynex de placas. 15
Ejemplo 15: Preparación de proteínas de fusión HA-IFN (como IFNα).
El ADNc del interferón de interés, tal como IFNα, se puede aislar mediante diversos medios, incluyendo, aunque no exclusivamente, bibliotecas de ADNc, RT-PCR y PCR usando una serie de cebadores oligonucleotídicos sintéticos solapantes, todos ellos usando procedimientos estándar. Las secuencias de nucleótidos para los interferones, tales como IFNα, se conocen y están disponibles en, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 5.326.859 y 4.588.585, el 20 documento EP 32 134 y en las bases de datos públicas, tales como GenBank. El ADNc se puede ajustar en los extremos 5’ 3’ para generar sitios de restricción, de forma que se puedan usar ligadores oligonucletídicos para clonar el ADNc en un vector que contiene el ADNc para HA. Esto Puede ser en el extremo N o C de la secuencia de HA con o sin el uso de una secuencia espaciadora. El ADNc del IFNα (u otrointerferón) se clona en un vector tal como pPPC0005 (Figura 2), pScCHSA, pScNHSA, o pC4:HSA del cual se escinde el casete de expresión completa 25 y se inserta en el plásmido pSAC35 paa permitir la expresión de la proteína de fusión de albúmina en levaduras. La proteína de fusión de albúmina secretada de la levadura se puede recoger después y purificar del medio, y se analiza su actividad biológica. Para la expresión en líneas celulares de mamífero se adopta un procedimiento similar a excepción de que el casete de expresión usado emplea un promotor de mamífero, una secuencia líder y un terminador (véase el ejemplo 1). Este casete de expresión se escinde e inserta en un plásmido adecuado para la 30 transfección en líneas celulares de mamífero.
Recuperación máxima de proteína de los viales
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención tienen un alto grado de estabilidad incluso cuando se empaquetan en concentraciones bajas. Además, a pesar de la baja concentración de proteína, se observa una buena recuperación de la proteína de fusión, incluso cuando la solución acuosa no incluye ninguna otra proteína 35 añadida para minimizar la unión a las paredes del vial. La recuperación de las soluciones de HA-IFN almacenadas en viales se comparó con una solución madre. Se introdujeron 6 o 30 µg/ml de soluciones de IFN-HA en viales y se almacenaron a 4 ° C, Después de 48 o 72 horas se retiró un volumen originalmente equivalente a 10 ng de la muestra se retira y se midió en un ELISA de tipo sándwich del IFN. Los valores estimados se compararon con los de una solución madre de alta concentración. Como se muestra, no hay esencialmente pérdida de la muestra en 40 estos viales, lo que indica que la adición de material exógeno tal como la albúmina no es necesaria para evitar la pérdida de muestra por la pared de la viales.
Ejemplo 16: Expresión de una proteína de fusión de albúmina en células de mamífero
Las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención se pueden expresar en una célula de mamífero. Un vector de expresión en mamíferos típico contiene un elemento promotor que media en la iniciación de 45 la transcripción de ARNm, una secuencia de codificación proteica y las señales requeridas para la terminación de la transcripción y la poliadenilación del tránscrito. Elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias de Kozak y secuencas intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para corte y empalme del ARN. Se consigue una transcripción muy eficaz con los promotors tardío y temprano de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo RSV, HTLVI, HIVI, y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). No obstante, 50 también se pueden usar elementos celulares (p. ej., el promotor de la actina humana).
Los vectores de expresión adecuados para usar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0. Entre las células huésped de mamífero que se pueden usar se incluyen Hela humanas, 293, H9 y células Jurkat, NIH3T3 de ratón y células C127, células Cos 1, Cos 7 y 55 CV1, células quail QC1-3, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).
Como alternativa, la proteína de fusión de albúmina se puede expresar en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de albúmina integrada en un cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable, tal como DHFR, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las
células transfeccionadas.
El polinucleótido transfectado que codifica la proteína de fusión también se puede amplificar para expresar cantidades grandes de la proteína de fusión codificada. El marcador de DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos, o incluso varios miles, de copias del gen de interés. (Véase, por ejemplo, Alt et al., J. Biol. Chem. 253:13571370 (1978); Hamlin et al., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107143 5 (1990); Page et al., Biotechnology 9: 64 - 68 (1991)). Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) Murphy et al., Biochem J. 227:277279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169 -175 (1992). Usando estos marcadores, las células de mamífero se cultivan en medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el o los genes amplificados integrados en un cromosoma. Se suelen usar células de ovario de hámster chino (CHO) y células NSO para la producción de proteínas. 10
Los derivados del plásmido pSV2-dhfr (nº de acceso en la ATCC 37146), los vectores de expresión pC4 (nº de acceso en ATCC 209646) y pC6 (nº de acceso en ATCC 209647) contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438 - 447 (March, 1995)) plus a fragment of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41:521530 (1985)). Los sitios de clonación múltiples, por ejemplo con oos sitios de escisión con enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores 15 también contienen el intrón en 3’, la señal de poliadenilación y de terminación del gen de la preproinsulina de rata y el gen dela DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano del SV40.
Específicamente, el plásmido pC6, por ejemplo, se digiere con enzimas de restricción adecuadas y después se desfosforila usando fosfatos intestinales bovinos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Después se aísla el vector desde un gel de agarosa al 1 %. 20
Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se genera usando técnicas conocidas en la materia y este polinucleótido se amplifica usando tecnología de PCR conocida en la materia. Si se usa una secuencia señal natural para producir la proteína de fusión de la presente invención, el vector no necesita un segundo péptido señal. Como alternativa, si no se usa una secuencia señal natural, el vector se puede modificar para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº 25 WO 96/34891.)
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de la invención se aísla de un gel de agarosa al 1 % usando un kit disponible comercialmente ("Geneclean," BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento se digiere después con las enzimas de restricción adecuadas y de nuevo se purifican en un gel de agarosa al 1 %.
El fragmento amplificado que codifica la proteína de fusión de albúmina de la invención se digiere después con las 30 mismas enzimas de restricción y se purifican en un gel de agarosa al 1 %. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan después con ADN ligasa de T4. Después, las células E. coli HB101 o XL-1 Blue se transforman y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC6 usando, por ejemplo, análisis con enzimas de restricción.
Para la transfección se usan células de ovario de hámster chino que carecen de un gen de la DHFR activo. Cinco µg 35 del plásmido de expresión pC6 or pC4 se cotransfecta con 0,5 µg del plásmido pSVneo usando lipofectina (Felgner et al., supra). El plásmido pSVneo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos, incluyendo G418. Las células se siembran en medio MEM menos alfa suplementado con 1 mg/ml de G418. Tras 2 días, las células se digieren con tripsina y se siembran en placas de clonación con hibridoma (Greiner, Alemania) en medio MEM menos alfa suplementado con 10, 25, or 40 50 ng/ml de metotrexato más 1 mg/ml de G418. Tras aproximadamente 1014 días, los clones se digieren con tripsina y después se siembran en placas petri de 6 pocillos o matraces de 10 ml usando concentraciones diferentes de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). A continuación, los clones que crecen a las concentraciones más altas de metotrexato se transfieren a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones todavía mayores de metotrexato (1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 mM, 20 mM). El mismo procedimiento de 45 repite hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 - 200 µM. La expresión de la proteína de fusión deseada se analiza mediante, por ejemplo, SDS-PAGE y transferencia Western o medianye análisis de HPLC de fase inversa.
Ejemplo 17: Fusiones multifusión.
Las proteínas de fusión de albúmina (por ejemplo ,. que contiene una proteína terapéutica fusionada a la albúmina 50 pueden además estar fusionados con otras proteínas para generar "proteínas multifusion". Estas proteínas multifusion se pueden usar para varias aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de las proteínas de fusión de albúmina de la invención es His-tag, HA-tag, proteína A, dominios de IgG, y la proteína de unión a maltosa facilita la purificación. Véase, por ejemplo, el documento EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84 - 86 (1988)). La señal de localización nuclear fusionada con los polipéptidos de la presente invención puede dirigir la proteína a una 55 localización subcelular específica, mientras que el heterodímero u homodímeros covalentes pueden aumentar o disminuir la actividad de una proteína de fusión de la albúmina. Adicionalmente, la fusión de secuencias de proteínas adicionales a las proteínas de fusión de albúmina de la invención puede aumentar aún más la solubilidad y / o
estabilidad de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión descritas anteriormente se pueden hacer usando o modificando de forma rutinaria técnicas conocidas en la técnica y / o modificando el siguiente protocolo, que resume la fusión de un polipéptido a una molécula de IgG.
Brevemente, la porción Fc humana de la molécula de IgG puede amplificarse por PCR, usando cebadores que abarcan los extremos 5 'y 3' de la secuencia descrita más adelante. Estos cebadores también deberían tener sitios 5 de enzimas de restricción convenientes que facilitarán la clonación en un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión de mamífero o de levadura.
Por ejemplo, si se usa pC4 (número de acceso en la ATCC 209646), la parte Fc humana puede ligarse en el sitio de clonación BamHI. Obsérvese que el sitio BamHI 3’ debe destruirse. A continuación, el vector que contiene la porción Fc humana se vuelve a digerir con la enzima de restricción BamHI, se linealiza el vector y un polinucleótido que 10 codifica una proteína de fusión de albúmina de la presente invención (generado y aislarse usando técnicas conocidas en la materia) se liga en este sitio BamHI. Tenga en cuenta que el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención se clona sin un codón de terminación, de lo contrario no se producirá una proteína de fusión que contenga Fc.
Si la secuencia señal natural se usa para producir la proteína de fusión de albúmina de la presente invención, pC4 15 no necesita un segundo péptido señal. Como alternativa, si no se usa una secuencia señal natural, el vector se puede modificar para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, la Publicación Internacional Nº WO 96/34891.)
Región Fc de IgG humana:
Ejemplo 18: Procedimiento de tratamiento usando terapia Génica ex vivo
Un procedimiento de terapia génica trasplanta fibroblastos, que son capaces de expresar una proteína de fusión de 25 albúmina de la presente invención, a un paciente. Generalmente, los fibroblastos se obtienen de un sujeto mediante biopsia de piel. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo de tejidos y se separa en pequeños trozos. Pequeños trozos del tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un matraz de cultivo de tejidos, aproximadamente diez piezas se colocan en cada matraz. El matraz se pone boca abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el matraz se 30 invierte y los trozos de tejido permanecen fijados al fondo del matraz y se añade medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10 % de FBS, penicilina y estreptomicina). A continuación se incuban los matraces a 37 grados C
durante aproximadamente una semana.
En este momento, se añade medio fresco y posteriormente se cambia cada varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, se produce una monocapa de fibroblastos. La monocapa se digiere con tripsina y se sella en matraces más grandes.
PMV-7 (. Kirschmeier, PT et al, DNA, 7: 219-25 (1988)), Flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus 5 del sarcoma murino de Moloney, se digiere con EcoRI y HindIII y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal de ternero. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, usando perlas de vidrio.
Los polinucleótidos que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención pueden generarse usando técnicas conocidas en la materia amplificado usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias en los extremos 5 'y 3' y, opcionalmente, con sitios de restricción apropiados y codones de iniciación / terminación en caso 10 necesario. Preferiblemente, el cebador 5 'contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye un sitio HindIII. Se añaden cantidades iguales de la estructura lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento EcoRI y HindIII amplificado, en presencia de ADN ligasa de T4. mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usa después para transformar bacterias HB101, que después se siembran en agar que contiene kanamicina con el propósito de confirmar que el vector tiene el gen de la 15 propiedad de interés insertado.
Las células con pA317 anfotrópico o GP + am12 se cultivan en cultivo tisular hasta una densidad confluente en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 10 % de suero de ternero (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se añade luego a los medios y las células de empaquetamiento transducidas con el vector. Las células concentradas producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células 20 concentradas se denominan ahora células productoras)
Se añade medio fresco a las células productoras transducidas, y posteriormente, los medios se cosechan de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. Los medios gastados, que contienen las partículas virales infecciosas, se filtran a través de un filtro Millipore para eliminar las células productoras desprendidas y este medio se usa luego para infectar células de fibroblastos. Se retira el medio de una placa subconfluente de fibroblastos y se 25 sustituye rápidamente con el medio de las células productoras. Este medio se elimina y se reemplaza con medio fresco. Si el título de virus es alto, entonces prácticamente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos se han infectado de manera eficiente, los fibroblastos se analizan para determinar si se produce la proteína de fusión de albúmina. 30
Los fibroblastos modificados se transplantan después al huésped, ya sea solos o después de haber sido cultivados hasta confluencia sobre perlas microportadoras Cytodex 3.
Ejemplo 19: Procedimiento de tratamiento usando terapia Génica in vivo
Otro aspecto de la presente invención es el uso de polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención en procedimientos de terapia génica in vivo para el tratamiento de trastornos, enfermedades y 35 afecciones. El procedimiento de terapia génica se refiere a la introducción de secuencoas de ácido nucleico desnudo (ADN, ARN y ADN o ARN antisentido) que codifican una proteína de fusión de albúmina de la invención en un animal. Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención pueden estar unidos operativamente (es decir asociados) a un promotor o cualquier otro elemento genético necesario para la expresión del polipéptido por el tejido diana. Dichas técnicas y procedimientos de liberación y terapia génica se 40 conocen en la materia véase, por ejemplo, WO90/11092, WO98/11779; la patente de EE.UU. Nº 5693622, 5705151, 5580859; Tabata et al., Cardiovasc.Res.35 (3): 470-479 (1997), Chao et al., Pharmacol.Res.35 (6): 517-522 (1997); Wolff, Neuromuscul.Disord.7 (5): 314-318 (1997); Schwartz et al., Gene Ther.3 (5): 405-411 (1996); Tsurumi et al, Circulation 94 (12):. 3281 a 3290 (1996 3(5):405 - 411 (1996); Tsurumi et al., Circulation 94(12):3281 - 3290 (1996).
Las construcciones de polinucleótidos pueden administrarse por cualquier procedimiento que proporciona materiales 45 inyectables a las células de un animal, tales como, inyección en el espacio intersticial de los tejidos (corazón, músculo, piel, pulmón, hígado, intestino y similares). Las construcciones de polinucleótidos pueden liberarse en un vehículo líquido o acuoso farmacéuticamente aceptable.
El término polinucleótido, ADN o ARN "desnudo" se refiere a secuencias que están libres de cualquier vehículo de liberación que actúa para ayudar, promover o facilitar la entrada en la célula, incluyendo secuencias virales, de 50 partículas vitales, formaciones de liposomas, lipofectina o agentes precipitantes y similares. Sin embargo, los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la presente invención también pueden administrarse en formulaciones de liposomas (tales como las que se enseñan en Felgner PL et al (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772:126 - 139 y Abdallah B. et al. (1995) Biol. Cell 85(1):1 - 7) que se pueden preparar por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. 55
Las construcciones del vector polinucleotídico usados en el procedimiento de terapia génica son preferiblemente construcciones que no se integrn en el genoma del huésped ni contienen secuencias que permiten la replicación.
Cualquier promotor fuerte conocido por los expertos en la técnica se puede usar para dirigir la expresión del ADN. A diferencia de otras técnicas de terapia génica, una ventaja principal de la introducción de secuencias de ácidos nucleicos desnudos en las células diana es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en las células. Los estudios han demostrado que las secuencias de ADN no replicantes pueden introducirse en las células para proporcionar la producción del polipéptido deseado durante períodos de hasta seis meses. 5
La construcción polinucleotídica puede liberarse en al espacio intersticial de los tejidos dentro de un animal, incluyendo el músculo, piel, cerebro, hígado pulmón, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándula, y tejido conjuntivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende el fluido intercelular, matriz de mucopolisacárido entre las fibras reticulares de los tejidos de órganos, fibras elásticas en las paredes de los vasos o 10 cámaras, fibras de colágeno de tejidos fibrosos o esa misma matriz dentro del tejido conjuntivo de las células musculares o en las lagunas de hueso. Es igualmente el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Se prefiere la liberación en el espacio intersticial del tejido muscular por las razones que se indican más adelante. Pueden administrarse convenientemente por inyección en los tejidos que comprenden estas células. Preferenrenebre se liberan y expresan en células persistentes que no se dividen, que se diferencian, 15 aunque la administración y expresión pueden conseguirse en células no diferenciadas o diferenciadas menos completamente, tales como, por ejemplo, las células madre de la sangre o los fibroblastos de la piel. Las células musculares in vivo son particularmente competentes en su capacidad de captar y expresar polinucleótidos.
Para la inyección polinucleótido desnudo, una cantidad de dosificación eficaz de ADN o ARN estará en el intervalo de aproximadamente 0,05 g / kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg / kg de peso corporal. 20 Preferentemente, la dosis será de aproximadamente 0,005 mg / kg a aproximadamente 20 mg / kg y más preferentemente de aproximadamente 0,05 mg / kg a aproximadamente 5 mg / kg. Por supuesto, como el experto en la materia apreciará, esta dosis variará según el sitio del tejido de la inyección. La dosificación apropiada y eficaz de la secuencia de ácido nucleico pueden determinarla fácilmente los expertos normales en la técnica y puede depender de la afección que se ba a tratar y de la vía de administración. La vía de administración preferida es 25 mediante inyección parenteral en el espacio intersticial de los tejidos. Sin embargo, también pueden usarse otras vías parenterales tales como inhalación de una formulación en aerosol especialmente para la liberación en los pulmones o tejidos bronquiales, garganta o membranas mucosas de la nariz. Además, las construcciones de polinucleótidos desnudos pueden liberarse en las arterias durante la angioplastia mediante catéter usado en el procedimiento. 30
Los efectos de dosis-respuesta del polinucleótido inyectado en el músculo in vivo se determina como sigue. El ADN molde adecuado para la producción de ARNm que codifica para el polipéptido de la presente invención se prepara de acuerdo con una metodología de ADN recombinante estándar. El ADN molde, que puede ser circular o lineal, se usa como ADN desnudo o completado con liposomas. Los músculos del cuádriceps de los ratones se inyectan con diversas cantidades del molde de ADN. 35
Ratones Balb / C hembra y macho de 5 a 6 semanas de edad se anestesian por inyección intraperitoneal con 0,3 ml de Avertin 2,5 %. Se realiza una incisión de 1,5 cm en el muslo anteror, y el músculo cuádriceps se visualiza directamente. El AND molde se inyecta en 0,1 ml de portador en una jeringa de 1 cc a través de una aguja de calibre 27 durante un minuto, aproximadamente a 0,5 cm del sitio de inserción distal del músculo dentro de la rodilla y alrededor de 0,2 cm de profundidad. Una sutura se coloca sobre el sitio de la inyección para la futura localización, y 40 la piel se cierra con pinzas de acero inoxidable.
Después de un tiempo de incubación adecuado (por ejemplo, 7 días), los extractos musculares se preparan mediante la escisión de la totalidad de los cuádriceps. Cada quinta sección transversal de los músculos cuádriceps individuales de 15 um se tiñe histoquímicamente para determinar la expresión de proteínas. Un curso de tiempo para la expresión de proteínas de fusión puede llevarse a cabo de una manera similar, excepto porque cuádriceps de 45 diferentes ratones se cosechan en diferentes momentos. La persistencia de ADN en el músculo después de la infección se puede determinar por análisis de transferencia de tipo Southern después de la preparación de ADN celular y sobrenadantes HIRT totales procedentes de ratones inyectados y control. Los resultados de la experimentación anterior en los ratones pueden usarse para extrapolar dosis adecuadas y otros parámetros de tratamiento en seres humanos y otros animales usando ADN desnudo. 50
Ejemplo 20: Animales transgénicos.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden expresarse en animales transgénicos. Los animales de cualquier especie, incluyendo, entre otros, ratones, ratas, conejos, hámsters, cobayas, cerdos, micro-cerdos, cabras, ovejas, vacas y primates no humanos, por ejemplo, babuinos, monos y chimpancés pueden ser usado para generar animales transgénicos. En una realización específica, las técnicas descritas en el presente 55 documento o conocidas de otro modo en la materia, se usan para expresar proteínas de fusión de la invención en los seres humanos, como parte de un protocolo de terapia génica.
Cualquier técnica conocida en la materia se puede usar para introducir los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención en animales para producir las líneas fundadoras de animales
transgénicos. Tales técnicas incluyen, entre otras, microinyección pronuclear (Paterson et al., Appl.Microbiol.Biotechnol.40: 691-698 (1994); . Carver et al, Biotechnology (NY) 11: 1263-1270 (1993); . Wright et al, Biotechnology (NY) 9: 830-834
(1991); y Hoppe et al., U.S. Pat. No. 4,873,191 (1989)); retrovirus mediada por la transferencia de genes en líneas germinales (Van der Putten et al., Proc.Natl.Acad.Sci., EE.UU. 82: desde 6148 hasta 6152 (1985)), Blastocistos o 5 embriones; la orientación de genes en células madre embrionarias (Thompson y otros, Cell 56:. 313-321 (1989)); electroporación de células o embriones (Lo, 1993, Mol Cell.Biol.3: 1803-1814 (1983)); introducción de los polinucleótidos de la invención usando una pistola génica (véase, por ejemplo, . Ulmer et al, Science 259: 1745 (1993); la introducción de construcciones de ácido nucleico en células madre pluripotenciales embrionarias y la transferencia de las células madre de nuevo en el blastocisto; y transferencia de genes mediada por esperma 10 (Lavitrano y otros, Cell 51:. 717-123 (1989); etcPara una revisión de tales técnicas, véase Gordon, "Animales Transgénicos". InternacionalRev.Cytol.115: 171-229 (1989).
Cualquier técnica conocida en la materia puede usarse para producir clones transgénicos que contienen polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la albúmina de la invención, por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos enucleados de los núcleos enbrión fetal cultivado o células adultas inducidas a la quiescencia (Campell et 15 al, Nature 380:. 64-66 (1996); Wilmut et al., Nature 385-810-813 (1997))
La presente invención proporciona animales transgénicos que llevan los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de la albúmina de la invención en todas sus células, así como animales que llevan estos polinucleótidos en algunas, pero no todas sus células, es decir,. animales mosaico o quiméricos. Los transgénicos pueden estar integrados con un único transgén o como múltiples copias, como en concatámeros, por ejemplo,, Tándems de 20 cabeza a cabeza o tándems de cola a cabeza. El transgén también se puede introducir selectivamente en y activado en un tipo celular particular siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Lasko et al. (Lasko et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA. 89: 6232 a 6236 (1992)). Las secuencias reguladoras requeridas para la activación específica, un tipo de célula dependerán del tipo de célula particular de Interseal y serán evidentes para los expertos en la técnica.Cuando se desea que el polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención puede integrar en el sitio 25 cromosómico del gen endógeno correspondiente a la porción de proteína terapéutica o la porción ablumin de la proteína de fusión de la invención, se prefiere la orientación de genes.Brevemente, cuando se va a usar una técnica tales, vectores que contienen algunas secuencias de nucleótidos homólogas al gen endógeno están diseñadas para el fin de integrar, a través de recombinación homóloga con secuencias cromosómicas, en e interrumpiendo la función de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno.El transgén también se puede introducir selectivamente en 30 un tipo celular particular, inactivando de este modo el gen endógeno en sólo ese tipo de célula, siguiendo, por ejemplo, la enseñanza de Gu et al. (Gu et al, Science 265: 103-106. (1994)).Las secuencias reguladoras requeridas para dicha inactivación específica de un tipo de célula dependerán del tipo de célula particular de interés, y serán evidentes para los expertos en la técnica.
Una vez que los animales transgénicos se han generado, la expresión del gen recombinante puede ensayarse 35 usando técnicas estándar.La selección inicial se puede lograr mediante técnicas de análisis de Southern blot o PCR para analizar tejidos animales para verificar que la integración del polinucleótido que codifica el protien fsuion de la invención ha tenido lugar.El nivel de expresión del ARNm del polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la invención en los tejidos de los animales transgénicos también puede evaluarse usando técnicas que incluyen, pero no se limitan a, análisis de transferencia Northern de muestras de tejido obtenidas del animal, in situ análisis de 40 hibridación, y la transcriptasa inversa-PCR (RT-PCR).Las muestras de tejido de fusión que expresa la proteína también se puede evaluar immunocytochemically o inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos para la proteína de fusión.
Una vez que se producen los animales fundadores, pueden ser criados, innato, outbred, o mestizo para producir colonias del animal particular.Ejemplos de tales estrategias de reproducción incluyen, pero no se limitan a: exogamia 45 de animales fundadores con más de un sitio de integración para establecer líneas separadas; endogamia de líneas separadas con el fin de producir transgénicos compuestos que expresan el transgén a niveles más altos debido a los efectos de aditivo expresión de cada transgén; cruce de animales transgénicos heterocigotos para producir animales homocigotos para un sitio de integración dado con el fin de aumentar tanto la expresión y eliminar la necesidad para la detección de los animales mediante análisis de ADN; cruce de líneas homocigóticas separadas para producir 50 hetorozygous compuesto o líneas homocigóticas; y cría para colocar el transgén (es decir, polinucleótido que codifica una proteína de fusión de la albúmina de la invención) en un fondo distinto que es apropiado para un modelo experimental de interés..
Los animales transgénicos de la invención tienen usos que incluyen, entre otros, sistemas de modelos animales útiles en la elaboración de la función biológica de las proteínas de fusión de la invención y la proteína terapéutica y / 55 o componente de la albúmina de la proteína de fusión de la invención, las condiciones que estudian y / o trastornos asociados con la expresión aberrante, y en el cribado de compuestos eficaces en la mejora de tales condiciones y / o trastornos.
Ejemplo 21: Ensayos de Detección de estimulación o inhibición de la proliferación y diferenciación de linfocitos B 60
La generación de respuestas inmunitarias humorales funcionales requiere tanto la señalización soluble y cognado entre las células de linaje B y sus señales microambiente puede impartir un estímulo positivo que permite que una célula de linaje B para continuar su desarrollo programado, o de un estímulo negativo que indica a la célula a detener su vía de desarrollo actual.Hasta la fecha, se han encontrado numerosas señales estimuladoras e inhibidoras de influir en la capacidad de respuesta de células B incluyendo IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IL-5 14 e IL-15 .Curiosamente, estas señales son por sí mismos efectores débiles, pero pueden, en combinación con diversas proteínas coestimuladoras, inducir la activación, proliferación, diferenciación, retorno, tolerancia y muerte entre las poblaciones de células B.
Una de las clases mejor estudiados de proteínas coestimuladoras de células B es la superfamilia de TNF-.Dentro de esta familia CD40, CD27, y CD30 junto con sus respectivos ligandos de CD154, CD70, CD153 y se ha encontrado 10 que regulan varias respuestas inmunes.Los ensayos que permiten la detección y / o observación de la proliferación y diferenciación de estas poblaciones de células B y sus precursores son herramientas valiosas en la determinación de los efectos diversas proteínas pueden tener en estas poblaciones de células B en términos de proliferación y diferenciación.A continuación se enumeran dos ensayos diseñados para permitir la detección de la diferenciación, la proliferación o inhibición de poblaciones de células B y sus precursores. 15
Ensayo in vitro, las proteínas de fusión de albúmina de la invención (incluyendo proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de proteínas terapéuticas y / o albúmina o fragmentos o variantes de la albúmina) se pueden evaluar por su capacidad para inducir activación, proliferación, diferenciación o inhibición y / o muerte en poblaciones de células B y sus precursores. La actividad de una proteína de fusión de albúmina de la invención o células B humanas purificadas de las amígdalas, medida cualitativamente con el intervalo de dosis de 0,1 a 10.000 20 ng / ml, se evalúa en un ensayo de coestimulación linfocitos B estándar en el que las células B de las amígdalas se cultivan en presencia de formalina Staphylococcus aureus Cowan I (SAC) fijado en formalina o anticuerpo IgM anti-humano inmovilizado como agente de cebado. Las segundas señales, tales como IL-2 e IL-15 sinergizan con SAC y reticulan con IgM para provocar la proliferación de células B medida mediante la incorporación de timidina tritiada. Los nuevos agentes de sinergia pueden identificarse fácilmente usando este ensayo .El ensayo consiste en aislar las 25 células B humanas de las amígdalas mediante depleción en perlas magnéticas (MACS) de las células CD3-positivas. La población celular resultante es mayor que 95 % de células B según se evalua mediante la expresión de CD45R (B220).
Varias diluciones de cada muestra se colocan en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos a los que se añaden 105 células B en suspensión en medio de cultivo (RPMI 1640 que contiene 10 % de FBS, 5 X 10-5M 2ME, 30 100 U / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina, y 10-5dilución de SAC) en un volumen total de 150ul.Proliferación o inhibición se cuantifica mediante un impulso 20h (1uCi / pocillo) con 3H-timidina (6,7 Ci / mM) a partir Además factor de 72 h después.Los controles positivos y negativos son IL2 y medio respectivamente.
Ensayo in vivo- En ratones BALB / c se inyecta (ip) dos veces al día sólo tampón, o 2 mg / kg de una proteína de fusión de la albúmina de la invención (incluyendo proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de 35 proteínas terapéuticas y / o albúmina o fragmentos o variantes de albúmina). Los ratones reciben este tratamiento durante 4 días consecutivos, tras lo cual se sacrifican y se extraen diversos tejidos y suero para sy análisis análisis. La comparación de secciones teñidas con H & E de bazo normales y bazos tratados con la proteína de fusión de albúmina de la invención identifica los resultados de la actividad de la proteína de fusión en células de bazo, tales como la difusión de la vainas linfáticas periarteriales, y / o aumentos significativos en el celularidad nucleada de las 40 regiones pulpa roja, lo que puede indicar la activación de la diferenciación y proliferación de poblaciones de células B. Los estudios de inmunohistoquímica usando un fabricante de células B, anti-CD45R (B220), se usan para determinar si los cambios fisiológicos en las células del bazo, como la desorganización del bazo, se deben al aumento de la representación de las células B dentro de las zonas de células B vagamente definidas que se infiltran establecidos regiones de células T. 45
El análisis por citometría de flujo de los bazos de rator¡nes tratados con la proteína de fusión de albúmina se usa para indicar si la proteína de fusión de albúmina aumenta específicamente la proporción de ThB +, CD45R (B220) células B apagados más de lo que se observa en los ratones control.
Asimismo, una consecuencia predicha del aumento de la representación de células B maduras in vivo es un aumento relativo en los títulos de Ig en suero. Por consiguiente, los niveles de IgM e IgA de suero se compararon 50 entre los ratones tratados con la proteína tampón y de fusión.
Ejemplo 22: Ensayo de proliferación de linfocitos T. Un ensayo de proliferación inducida por CD3 se realiza en PBMC y se mide por la captación de 3H-timidina. El ensayo se realiza como se describe a continuación. Las placas de noventa y seis pocillos se recubren con 100 l / pocillo del mAb frente CD3 (HIT3a, Pharmingen) o con el mAb de control de isotipo coincidente (B33.1) durante la 55 noche a 4 grados C (1 mg / ml en tampón de bicarbonato 0,05M, pH 9,5 ), después se lavan tres veces con PBS. Los PBMC se aíslan mediante centrifugación en gradiente F / H a partir de sangre periférica humana y se añaden a los pocillos por cuadruplicado (5 x 104 placas / pocillo) de placas recubiertas recubiertas con mAb en RPMI que contenía FCS al 10 % y P / S en presencia de concentraciones variables de una proteína de fusión de albúmina de la invención (incluyendo proteínas de fusión que contienen fragmentos o variantes de proteínas terapéuticas y / o albúmina o fragmentos o variantes de albúmina) (volumen total 200 l). El tampón proteico relevante y el medio solo son los controles. Tras 48 horas de cultivo a 37C, las placas se centrifugan 2 minutos a 1.000 rpm y se retiran 100 l de sobrenadante y se almacenan a -20 ºC para medir la IL-1 (u otras citocinas) si se observa efecto sobre la proliferación. Los pocillos se suplementan con 100 ul de medio con 0,5 uCi de timidina-3H y se cultivan a 37 ºC 5 durante 18-24 horas. Los pocillos se recogen y se usa la timidina-3H como medición de la proliferación. El anti-CD3 es el control positivo de la proliferación. La IL-2 (10 u/ml) también se usa como control que potencia la proliferación. El anticuerpo control que no induce proliferación de los linfocitos T se usa como control negativo de los efectos de las proteínas de fusión de la invención Ejemplo 23: Efecto de las proteínas de fusión de la invención sobre la expresión de MHC DE Clase II. 10 Moléculas coestimuladoras y de adhesión y la diferenciación celular de monocitos y células dendríticas humanas derivadas de monocitos. Las células dendríticas se generan mediante la expansión de la proliferación de precursores que se encuentran en la sangre periférica. Fracciones de monocitos con PBMC adherentes y elutriadas se cultivan durante 7-10 días con GM-CSF (50 ng / ml) e IL-4 (20 ng / ml). Estas células dendríticas tienen el fenotipo característico de células 15 inmaduras (expresión de CD1, CD80, CD86, CD40 y antígenos MHC de clase II). El tratamiento con factores de activación, tales como TNF-α, provoca un rápido cambio en el fenotipo de la superficie (aumento de la expresión de MHC de clase I y II, moléculas coestimuladoras y de adhesión, regulación por disminución de FCγRII, , regulación por incremento de CD83). Estos cambios se correlacionan con un aumento de la capacidad presentadora de antígeno y con la maduración funcional de las células dendríticas. 20
El análisis FACS de los antígenos de superficie se realiza como sigue. Las células se tratan 1-3 días con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención o LPS (control positivo), se lavan con PBS que contenía 1 % de BSA y azida sódica 0,02 mM, y después se incuban con una dilución 1:20 de anticuerpos monoclonales marcados adecuadamente con FITC o PE durante 30 minutos a 4 grados C. Después de un lavado adicional, las células marcadas se analizan mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton 25 Dickinson).
Efecto sobre la producción de citocinas.Las citocinas generadas por las células dendríticas, en particular, IL-12, son importantes en el inicio de las respuestas inmunitarias dependientes de células T. La IL-12 influye fuertemente en el desarrollo de la respuesta inmunitaria Th1 los linfocitos T colaboradores e induce linfocitos T citotóxicos células NK. Se usa un ELISA para medir la liberación de IL-12 como sigue. Las células dendríticas (106/ Ml) se tratan con 30 concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención durante 24 horas. Se añade LPS (100 ng / ml) al cultivo celular como control positivo. Los sobrenadantes de los cultivos de células se recogen después y se analiza en contenido en IL-12 usando el kit ELISA comercial (por ejemplo, R & D Systems (Minneapolis.MN)). Se usan los protocolos estándar proporcionados con los kits.
Efecto sobre la expresión de moléculas de MHC de clase II, coestimuladoras y de adhesión.Tres familias principales 35 de antígenos de superficie celular se pueden identificar en los monocitos: moléculas de adhesión, moléculas implicadas en la presentación de antígenos, y el receptor de Fc. La modulación de la expresión de antígenos de MHC de clase II y otras moléculas coestimuladoras, tales como B7 e ICAM-1, puede resultar en cambios en la capacidad presentadora de antígeno de los monocitos y capacidad de inducir la activación de células T.El aumento de expresión de los receptores Fc se puede correlacionar con la mejora de la actividad citotóxica de monocitos, la 40 liberación de citocinas y fagocitosis.
Análisis FACS se usa para examinar los antígenos de superficie como sigue.Los monocitos son tratados 1-5 días con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención o LPS (control positivo), se lavó con PBS que contenía 1 % de BSA y azida sódica 0,02 mM, y después se incubaron con una dilución 1:20 de FITC apropiado o PE marcado con anticuerpos monoclonales durante 30 minutos a 4 grados C. Después de un 45 lavado adicional, las células marcadas se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScan (Becton Dickinson).
Activación de monocitos y / o aumento de la supervivencia. Los ensayos para moléculas que activan (o alternativamente, inactivan) monocitos y / o aumentan la supervivencia de monocitos (o alternativamente, disminuyen la supervivencia de monocitos) se conocen en la técnica y pueden rutinariamente aplicarse para 50 determinar si una molécula de la invención funciona como inhibidor o activador de los monocitos. Las proteínas de fusión de albúmina de la invención se pueden seleccionar usando los tres ensayos descritos a continuación. Para cada uno de estos ensayos, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se purifican a partir de donantes individuales (Merican Red Cross, Baltimore, MD) mediante centrifugación a través de un gradiente Histopaque (Sigma). Los monocitos se aíslan a partir de PBMC por elutriación centrífuga a contraflujo. 55
Ensayo de supervivencia de monocitos. Los monocitos de sangre periférica humana pierden progresivamente la viabilidad cuando se cultivan en ausencia de scrum o de otros estímulos. Su muerte resulta de procesos regulados internamente (apoptosis). Además del cultivo de los factores de activación, tales como TNF-alfa mejora considerablemente la supervivencia celular y evita la fragmentación del ADN.Yoduro (PI) tinción de propidio se usa
para medir la apoptosis como sigue. Los monocitos se cultivan durante 48 horas en tubos de polipropileno en medio (control positivo) sin suero, en presencia de TNF-alfa 100 ng / ml (control negativo), y en presencia de concentraciones variables de la proteína de fusión que se va a analizar. Las células se suspenden a una concentración de 2 x 106/ ml en PBS que contiene P1 en una concentración final de 5 g / ml, y después se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos antes del análisis FACScan. La captación de PI se ha demostrado que se 5 correlaciona con la fragmentación de ADN en este paradigma experimental.
Efecto sobre la liberación de citocinas .Una función importante de los monocitos / macrófagos es su actividad reguladora sobre otras poblaciones celulares del sistema inmune a través de la liberación de citocinas después de la estimulación.Un ELISA para medir la liberación de citocinas se realiza como sigue.Monocitos humanos se incubaron a una densidad de 5x105 células / ml con concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la 10 invención y en las mismas condiciones, pero en la ausencia de la proteína de fusión.Para la producción de IL-12, las células se ceban una noche con IFN (100 U / ml) en presencia de la proteína de fusión.LPS (10 ng / ml) se añade a continuación. Los medios condicionados se recogieron después de 24 horas y se mantuvieron congeladas hasta su uso. La medición de TNF-alfa, IL-10, MCP-1 e IL-8 se lleva a cabo a continuación, usando un kit ELISA disponible en el mercado (por ejemplo, R & D Systems (Mirmeapolis, MN)) y la aplicación de los protocolos estándar 15 proporcionados con el kit.
Descarga oxidativa. Los monocitos purificados siembran en una placa de 96 pocillos a 2-1x105células / pocillo. Se añaden concentraciones crecientes de una proteína de fusión de albúmina de la invención a los pocillos en un volumen total de 0,2 ml de medio de cultivo (RPMI 1640 + 10 % de FCS, glutamina y antibióticos).Después de 3 días de incubación, las placas se centrifugaron y se retira el medio de los pocillos. Para las monocapas de macrófagos, 20 se añaden 0,2 ml por pocillo de solución de rojo fenol (NaCl 140 mM, 10 mM de tampón de fosfato de potasio pH 7,0, 5,5 mM de dextrosa, fenol 0,56 mM rojo y 19 U / ml de HRPO), junto con el estimulante ( 200 nM PMA).Las placas se incuban a 37 ° C durante 2 horas y la reacción se detiene añadiendo 20 l de NaOH 1 N por pocillo. La absorbancia se lee a 610 nm. Para calcular la cantidad de H2O2 producida por los macrófagos se efectúa una curva estándar de solución de H2O2 de molaridad conocida para cada experimento. 25
Ejemplo 24: Efectos biológicos de las proteínas de fusión de la invención. Ensayos con astrocitos y neuronas
En las proteínas de fusión de albúmina de la invención se analiza la actividad en la estimulación de la supervivencia, el sobrecrecimiento de neuritas o la diferenciación fenotípica de células neuronales corticales y para inducir la prolferación de células inmunopositivas para la proteína ácida fibrilar de glía, los astrositos. La selección de células 30 corticales para el bioensayos se basa en la expresión prevalente de FGF-1 y FGF-2 en estructuras corticales y en la potenciación notificada previamente sobre la supervivencia neuronal cortical resultante del tratamiento con FGF-2. Por ejemplo, se puede usar un ensayo de incorporación de timidina para elucidad una proteína de fusión de albúmina de la actividad de la invención con estas células.
Además, informes previos que describen los efectos biológicos de FGF-2 (FGF básico) sobre neuronas corticales o 35 del hipocampo han demostrado in vitro incrementos de la supervivencia de las neuronas y del sobrecrecimiento de las neuritas (Walicke et al., "Fibroblast growth factor promotes survival of dissociated hippocampal neurons and enhances neurite extension." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3012 - 3016. (1986), incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad). No obstante, los informes de experimentos realizados con células PC-12 sugieren que estas dos respuestas no son necesariamente sinónimas y pueden depender de no solo qué FGF se 40 está tratando sino también sobre qué receptor(es) se expresan en las células diana. Usando el paradigma del cultivo neuronal cortical primario, la capacidad de una proteína de fusión de albúmina de la invención para inducir el sobrecrecimiento de neuritas se puede comparar con la respuesta alcanzada con FGF-2 usando, por ejemplo, un ensayo de incorporación de timidina.
Ensayos en fibroblastos y células endoteliales 45
Los fibroblastos pulmonares humanos se obtienen en Clonetics (San Diego, CA) y se mantienen en medio de crecimiento de Clonetics. Las células endoteliales microvasculares dérmicas se obtienen de Cell Applications (San Diego, CA). Para los ensayos de proliferación, los fibroblastos pulmonares humanos y las células endoteliales microvasculares dérmicas se pueden cultivar a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día en medio de crecimiento. Después, las células se incuban durante un día en medio basal de BSA al 0,1 % Después de 50 sustituir el medio con medio de BSA al 0,1 % fresco, las células se incuban con la proteína de fusión de ensayo de las proteínas de invención durante 3 días. A cada pocillo se añade Alamar Blue (Alamar Biosciences, Sacramento, CA) hasta una concentración final del 10 %. Las células se incuban durante 4 horas. La viabilidad celular se mide leyendo en un lector de fluorescencia CytoFluor. Para los ensayos de PGE2, los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a 55 medio basal de BSA al 0,1 %, las células se incuban con FGF-2 o la proteína de fusión de la invención con o sin IL-1α durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogen y se analiza la PGE2 mediante el kit EIA (Cayman, Ann Arbor, MI). Para los ensayos de IL-6, los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan a 5.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos durante un día. Después de un cambio de medio a medio basal de BSA al 0,1 %, las células se
incuban con FGF-2 o con o sin una proteína de fusión de albúmina de la invención y/o IL-1α durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogen y se analiza la IL-6 mediante el kit ELISA (Endogen, Cambridge, MA).
Los fibroblastos pulmonares humanos se cultivan con FGF-2 p con proteína de fusión de albúmina de la invención durante 3 días en medio basal antes de la adición de Alamar Blue para evaluar los efectos sobre el crecimiento de fibroblastos. FGF-2 deberá mostrar una estimulación a 10 - 2500 ng/ml que. se puede usar para comparar la 5 estimulación con la proteína de fusión de la invención
Proliferación celular basada en incorporación de timidina-[3H]
El siguiente ensayo de incorporación de timidina-[3H] se puede usar para medir el efecto de una proteína terapéutica, por ejemplo proteínas factores de crecimiento, sobre la proliferación de células tales como células fibroblastos, células epiteliales o células musculares inmaduras. 10
Los cultivos subconfluentes se detienen en la fase G1 mediante una incubación de 18 horas en medio sin suero. Después se añaden proteínas terapéuticas durante 24 horas y durante las últimas 4 horas, los cultivos se marcan con timidina-[3H] a una concentración final de 0,33 µM (25 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). La timidina-[3H] incorporada se precipita con ácido tricloroacético al 10 % helado durante 24 horas. Después, las células se aclaran secuencialmente con ácido tricloroacético al 10 % helado y, después, con agua helada. Tras la lisis en 15 NaOH 0,5 M, los lisados y aclarados con PBS (500 ml) se combinan y se mide la cantidad de radioactividad.
Modelos de Parkinson
La pérdida de función motora en la enfermedad de Parkinson se atribuye a una deficiencia de dopamina del estrato resultante de la degeneración de las neuronas de proyección dopaminérgicas nigroestriatales. Un modelo animal de Parkinson que se ha caracterizado ampliamente implica la administración sistémica de 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-20 tetrahidropiridina (MPTP). En el SNC, el MPTP es captado por los astrocitos y catabolizado por la monoamino oxidasa B en 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+) y se libera. Posteriormente, el MPP+ se acumula de forma activa en las neuronas dopaminérgicas mediante el transportador para dopamina de recaptación de alta afinidad. Después, el MPP+ se concentra en las mitocondrias mediante el gradiente electroquímico e inhibe de forma selectiva la nicotinamida adenina disfosfato: ubiquinona oxidoreductasa (complejo I), de modo que interfiere con el transporte de 25 electrones y, en último término, genera radicales de oxígeno.
Se ha demostrado en paradigmas de cultivo tisular que el FGF-2 (FGF básico) tiene actividad trófica hacia las neuronas dopaminérgicas nigrales (Ferrari et al., Dev. Biol. 1989). Recientemente, el grupo del Dr. Unsicker ha demostrado que la administración de FGF-2 en implantes de espuma de gel en el estrato tiene como resultado la protección casi completa de las neuronas dopaminérgicas nígricas frente a la toxicidad asociada con la exposición a 30 MPTP (Otto and Unsicker, J. Neuroscience, 1990).
Basándose en los datos con FGF-2, una proteína de fusión de albúmina de la invención se puede evaluar para determinar si tiene una acción similar a la de FGF-2 en la potenciación de la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas in vitro y también se pueden analizar in vivo para determinar la protección de las neuronas dopaminérgicas en el estrato frente al daño asociado con el tratamiento con MPTP. El potencial efecto de una 35 proteína de fusión de albúmina de la invención se examina primero in vitro en un paradigma de cultivo celular neuronal dopaminérgico. Los cultivos se preparan diseccionando la placa del suelo del mesencéfalo del día 14 de la gestación de embriones de rata Wistar. El tejido se disocia con tripsina y se siembra a una densidad de 200.000 células/cm2 sobre cubreobjetos de cristal recubiertos con poliornitina-laminina. Las células se mantienen en medio Eagle modificado de Dulbecco y medio F12 que contiene suplementos hormonales (N1). Los cultivos se fijan con 40 paraformaldehído tras 8 días in vitro y se procesan para la tirosina hidroxilasa, un marcador específico para neuronas dopaminérgicas, tinción inmunohistoquímica. Los cultivos de células disociadas se preparan a partir de embriones de rata. El medio de cultivo se cambia cada tres días y los factores también se añaden en ese momento.
Dado que las neuronas dopaminérgicas se aíslan de animales en el día 14 de la gestación, un tiempo de desarrollo que ha pasado la etapa en la que las células precursoras dopaminérgicas están proliferando, un incremento en el 45 número de neuronas inmunopositivas para tirosina hidroxilasa representaría un incremento en el número de neuronas dopaminérgicas que sobreviven in vitro. Por tanto, si una proteína terapéutica de la invención actúa prolongando la supervivencia de neuronas dopaminérgicas, se sugeriría que la proteína de fusión puede estar implicada en la enfermedad de Parkinson.
Ejemplo 25: El efecto de las proteínas de fusión de albúmina de la invención sobre el crecimiento de las 50 células endoteliales vasculares.
El día 1, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se siembran a 2-5x104 células/35 mm a una densidad en medio M199 que contiene 4 de suero bovino fetal (FBS), 16 unidades/ml de heparina y 50 unidades/ml de suplementos de crecimiento de células endoteliales. El día 2, el medio se sustituye con M199 que contiene 10 % de FBS, 8 unidades/ml de heparina. Una proteína de fusión de albúmina de la invención y se añaden los controles 55 positivos, tales como VEGF y FGF básico (bFGF) a concentraciones variables. Los días 4 y 6, se sustituye el medio. El día 8 se determina el número de células con un contador Coulter.
Un incremento en el número de células HUVEC indica que la proteína de fusión puede proliferar las células endoteliales vasculares, mientras que una disminución del número de células HUVEC indica que la proteína de fusión inhibe las células endoteliales vasculares.
Ejemplo 26: Modelo de cicatrización de heridas en la córnea de rata.
Este modelo animal muestra el efecto de una proteína de fusión de albúmina de la invención en la 5 neovasularización. El protocolo experimental incluye:
Realizar una incisión de 1-1,5 de longitud desde el centro de la córnea hacia la capa estromal.
Insertar espátula por debajo del borde de la incisión mirando a la esquina exterior del ojo.
Realizar una bolsa (su base es de 1-1,5 mm desde el borde del ojo).
Colocar una pastilla que contiene 50ng- 5 ug de una proteína de fusión de albúmina de la invención, dentro de la 10 bolsa.
El tratamiento con un proteínas de fusión de una albúmina de la invención también se puede aplicar tópicamente a las heridas de la córnea en un intervalo de dosificación de 20 mg - 500 mg (tratamiento diario durante cinco días).
Ejemplo 27: Modelos de cicatrización de heridas alterada por glucocorticoides y ratón diabético. Modelo de ratón db+/db+ diabético 15
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención acelera el proceso de cicatrización se usa el modelo de cicatrización de heridas en ratón diabético genéticamente. El modelo de cicatrización de heridas en ratón diabético de espesor completo en ratón db+/db+ es un modelo bien caracterizado, clínicamente relevante y reproducible de la cicatrización de heridas alterada. La cicatrización de heridas en diabéticos depende de la formación de tejido de granulación y reepitelialización más que contracción (Gartner, M.H. et al., J. Surg. Res. 20 52:389 (1992); Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)).
Los animales diabéticos tienen muchos de los rasgos característicos observados en la diabetes mellitus de tipo II. Los ratones homocigotos (db+/db+) son obesos en comparación con sus hermanos de camada heterocigotos (db+/+m) normales. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) tienen una única mutación autosómica recesiva en el cromosoma 4 (db+) (Coleman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:283293 (1982)). Los animales muestran polifagia, 25 polidipsia y poliuria. Los ratones diabéticos mutantes (db+/db+) presentan niveles elevados de glucosa en sangre, niveles de insulina incrementados o normales y supresión de la inmunidad celular (Mandel et al., J. Immunol. 120:1375 (1978); Debray-Sachs, M. et al., Clin. Exp. Immunol. 51(1):17 (1983); Leiter et al., Am. J. of Pathol. 114:46 - 55 (1985)). En estos animales se ha descrito neuropatía periférica, complicaciones miocárdicas y lesiones microvasculares, espesamiento de la membrana basal y anomalías en la filtración glomerular (Norido, F. et al., Exp. 30 Neurol. 83(2):221232 (1984); Robertson et al., Diabetes 29(1):6067 (1980); Giacomelli et al., Lab Invest. 40(4):460-473 (1979); Coleman, D.L., Diabetes 31 (Suppl):16 (1982)). Estos ratones diabéticos homocigotos desarrollan hiperglucemia que es resistente a los análogos de la insulina de la diabetes de tipo II humana (Mandel et al., J. Immunol. 120:13751377 (1918)).
Las características observadas en estos animales sugieren que la cicatrización en este modelo puede ser similar a la 35 cicatrización observada en la diabetes humana (Greenhalgh, et al., Am. J. of Pathol. 136:1235 - 1246 (1990)).
En este estudio se usan ratones hembra diabéticas genéticamente C57BL/KsJ (db+/db+) y sus hermanos de camada heterocigotos no diabéticos (db+/+m) (Jackson Laboratories). Los animales se adquieren a las 8 semanas de edad y al comienzo de estudio tienen 9 semanas de edad. Los animales se enjaulan individualmente y se les ofrece agua y alimentos a demanda. Todas las manipulaciones se realizan usando técnicas asépticas. Los 40 experimentos se realizan de acuerdo con las normas y guías del Human Genome Sciences, Inc. Institutional Animal Care y el Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals.
El protocolo de formación de heridas se lleva a cabo de acuerdo con los procedimientos indicados anteriormente (Tsuboi, R. and Rifkin, D.B., J. Exp. Med. 172:245251 (1990)). Brevemente, el día de la realización de la herida, se anestesia a los animales con una inyección intraperitoneal de avertina (0,01 mg/ml), 2,2,2-tribromoetanol y 2-metil-2-45 butanol disueltos en agua desionizada. Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70 % y yodo. El área quirúrgica se seca con una gasa estéril antes de la formación de heridas. A continuación se crea una herida de 8 mm de espesor completa usando un perforador de tejido Keyes. Inmediatamente después de la formación de la herida, la piel circundante se estira suavemente para eliminar la expansión de la herida. Las heridas se dejan abiertas durante todo el experimento. La aplicación del tratamiento se 50 realiza tópicamente durante 5 días consecutivos comenzando el día de la formación de la herida. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la cirugía y después a intervalos de dos días. El cierre de la herida se determina mediante medición diaria los días 1 - 5 y el día 8. Las heridas se
miden horizontalmente y verticalmente usando un compás de Jameson calibrado. Las heridas se consideran curadas si ya no se tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se administra usando una serie de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg, por herida al día durante 8 días en vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 50 ml de la solución vehículo. 5
Se sacrifica a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). A continuación se recogen las heridas y la piel circundante para análisis histológicos e inmunohistoquímicos. Las muestras de tejido se introducen en formalina tamponada neutra al 10 % en casetes de tejido entre las esponjas de biopsia para su posterior procesamiento.
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 diabéticos y 5 controles no diabéticos). 1) Vehículo control 10 placebo, 2) grupo no tratado y 3) grupo tratado.
El cierre de heridas se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área cuadrada total de la herida. Después se estima la contracción estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y el de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente de la perforación dérmica. Los cálculos se realizan usando la fórmula siguiente: 15
a. [área abierta el día 8] – [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formalina tamponada al 1 % e incluidos en bloques de parafina se seccionan perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan usando un microtomo Reichert-Jung. Se realiza una tinción de rutina de hematoxilina-eosina (H y E) en secciones transversales de heridas diseccionadas. La exploración histológica de las heridas se usa para evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de 20 la piel reparada se alteran por el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Esta evaluación incluyó la verificación de la presencia de acumulación celular, las células inflamatorias, los capilares, los fibroblastos, la reepitelialización y la madurez epidérmica (Greenhalgh, D.G. et al., Am. J. Pathol. 136:1235 (1990)). Un observador enmascarado usa un micrómetro de lente calibrado.
Las secciones de tejido también se tiñen inmunohistoquímicamente con un anticuerpo policlonal anti-queratina 25 humana de conejo usando el sistema de detección ABC Elite. La piel humana se usa como control tisular positivo, mientras que como control negativo se usa IgG no inmunitaria. El crecimiento de queratinocitos se determina evaluando la extensión de la reepitelización de la herida usando un micrómetro de lente calibrada.
La proliferación celular con antígeno nuclear/ciclina (PCNA) en muestras de piel se demuestra usando un anticuerpo anti-PCNA (1:50) con un sistema de detección ABC Elite El cáncer de colon humano sirvió como control tisular 30 positivo y el tejido cerebral humano se usa como control negativo. Cada muestra incluyó una sección con omisión del anticuerpo primario y sustitución con IgG de ratón no inmunitaria. La clasificación de estas secciones se basa en la extensión de la proliferación en una escala de 08, el lado inferior de la escala refleja la ligera proliferación y el lado superior refleja la proliferación intensa.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor de p < 0,05 se considera 35 significativo.
Modelo de ratas con alteración por esteroides
La inhibición de la cicatrización de heridas con esteroides está bien documentada en varios sistemas vitro e in vivo (Wahl, Glucocorticoids and Wound healing. En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects. 280302 (1989); Wahlet al., J. Immunol. 115: 466 - 481 (1975); Werb et al., J. Exp. Med. 147:16841694 (1978)). Los 40 glucocorticoides retrasan la cicatrización de heridas inhibiendo la angiogénesis, disminuyendo la permeabilidad vascular (Ebert et al., An. Intern. Med. 37:701705 (1952)), la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno (Beck et al., Growth Factors. 5: 295 - 304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703797 (1978)) y produciendo una reducción transitoria de los monocitos en circulación (Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703 - 797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic 45 Press, New York, pp. 280 - 302 (1989)). La administración sistémica de esteroides para alterar la cicatrización de heridas es un fenómeno bien establecido en ratas (Beck et al., Growth Factors. 5: 295 - 304 (1991); Haynes et al., J. Clin. Invest. 61: 703 - 797 (1978); Wahl, "Glucocorticoids and wound healing", En: Antiinflammatory Steroid Action: Basic and Clinical Aspects, Academic Press, New York, pp. 280302 (1989); Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2229 - 2233 (1989)). 50
Para demostrar que una proteína de fusión de albúmina de la invención puede acelerar el proceso de cicatrización, se evalúan los efectos de múltiples aplicaciones tópicas de la proteína de fusión sobre las heridas de la piel de espesor completo producidas por escisión en ratas en las que se ha alterado la cicatrización mediante la administración sistémica de metilprednisolona.
En este ejemplo se usan ratas macho adultas Sprague-Dawley de 250 - 300 g de peso (Charles River Laboratories). 55
Los animales se adquieren a las 8 semanas de edad y al comienzo de estudio tienen 9 semanas de edad. La respuesta de cicatrización de las ratas se ve alterada por la administración sistémica de metilprednisolona (17 mg/kg/rata por vía intramuscular) en el momento de la formación de la herida. Los animales se enjaulan individualmente y se les ofrece agua y alimentos a demanda. Todas las manipulaciones se realizan usando técnicas asépticas. El estudio se realiza de acuerdo con las normas y guías del Human Genome Sciences, Inc. Institutional 5 Animal Care y el Use Committee and the Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals.
Se sigue el protocolo de formación de heridas de acuerdo con lo descrito anteriormente. El día de la formación de heridas se anestesia a los animales con una inyección intramuscular de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg). Se afeita la región dorsal del animal y se lava la piel con una solución de etanol al 70 % y yodo. El área quirúrgica se seca con una gasa estéril antes de la formación de heridas. A continuación se crea una herida de 8 mm de espesor 10 completa usando un perforador de tejido Keyes. Las heridas se dejan abiertas durante todo el experimento. La aplicación de los materiales de ensayo se administra tópicamente una vez al día durante 7 días consecutivos comenzando el día de la formación de la herida y después de la administración de metilpredinisolona. Antes del tratamiento, las heridas se limpian suavemente con solución salina estéril y esponjas de gasa.
Las heridas se examinan visualmente y se fotografían a una distancia fija el día de la formación de heridas y al final 15 del tratamiento. El cierre de la herida se determina mediante medición diaria los días 1 - 5 y el día 8. Las heridas se miden horizontalmente y verticalmente usando un compás de Jameson calibrado. Las heridas se consideran curadas si ya no se tejido de granulación y la herida está cubierta con un epitelio continuo.
La proteína de fusión de la invención se administra usando una serie de dosis diferentes, desde 4 mg a 500 mg, por herida al día durante 8 días en vehículo. Los grupos control con vehículo recibieron 50 ml de la solución vehículo. 20
Se sacrifica a los animales el día 8 con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (300 mg/kg). A continuación se recogen las heridas y la piel circundante para análisis histológicos. Las muestras de tejido se introducen en formalina tamponada neutra al 10 % en casetes de tejido entre las esponjas de biopsia para su posterior procesamiento.
Se evalúan tres grupos de 10 animales cada uno (5 con metilprednisolona y 5 son glucocorticoides). 1) Grupo son 25 tratar, 2) vehículo control placebo 3) grupos tratados.
El cierre de heridas se analiza midiendo el área en el eje vertical y horizontal y obteniendo el área total de la herida. Después se estima el cierre estableciendo las diferencias entre el área de la herida inicial (día 0) y el de después del tratamiento (día 8). El área de la herida el día 1 es de 64 mm2, el tamaño correspondiente de la perforación dérmica. Los cálculos se realizan usando la fórmula siguiente: 30
a. [área abierta el día 8] – [área abierta el día 1] / [área abierta el día 1]
Las muestras se fijan en formalina tamponada al 1 % e incluidos en bloques de parafina se seccionan perpendicularmente a la superficie de la herida (5 mm) y se cortan usando un microtomo Olympus. Se realiza una tinción de rutina de hematoxilina-eosina (H y E) en secciones transversales de heridas diseccionadas. La exploración histológica de las heridas permite evaluar si el proceso de cicatrización y el aspecto morfológico de la 35 piel reparada mejoran con el tratamiento con una proteína de fusión de albúmina de la invención. Un observador enmascarado usa un micrómetro de lente calibrado para determinar la distancia del espacio de la herida.
Los datos experimentales se analizan usando una prueba t no pareada. Un valor de p < 0,05 se considera significativo.
Ejemplo 28: Modelo animal de linfedema. 40
El propósito de este enfoque experimental es crear un modelo de linfedema apropiado y compatible para analizar los efectos terapéuticos de una proteína de fusión de albúmina de la invención en la linfangiogénesis y el reestablecimiento del sistema circulatorio linfático en la extremidad trasera de rata. La eficacia se mide mediante el volumen de hinchazón de la extremidad afectada, cuantificación de la cantidad de vasculatura linfática, proteína plasmática total en sangre, y la histopatología Se observó lLinfedema agudo durante 7-10 días. Quizás lo más 45 importante, se realiza un segumiento de la evolución crónica del edema durante hasta 3-4 semanas.
Antes de comenzar la cirugía, se extrae una muestra de sangre para el análisis de la concentración de proteínas. Las ratas macho que pesaban aproximadamente ~350g reciben pentobarbital. Posteriormente, las piernas derechas se afeitan desde la rodilla hasta la cadera. El área afeitada se limpia con una gasa empapada en EtOH al 70 %. La sangre se extrae para la prueba de proteínas totales en suero. Las mediciones de la circunferencia y volumétricas se 50 hacen antes de inyectar medio de contraste en las patas después de marcar 2 niveles de medición (0,5 cm por encima Hecl, en medio de la pata dorsal). En el dorso intradérmico de las patas derecha e izquierda se inyecta azul de 0,05 ml de 1 % Evan. Las mediciones de la circunferencia y volumétricas se realizan después de la inyección o pigmento en las patas.
Usando la articulación de la rodilla como marca, se realiza una incisión inguinal circunferencial en el medio de la 55
pata, lo que permite localizar los vasos femorales. Se usan pinzas y hemostatos para diseccionar y separar las eletas de piel. Después de localizar es los vasos femorales, se ubica el vaso linfático que corre a lo largo de lado y por debajo del vaso (s). Los principales vasos linfáticos en esta área se coagulan eléctricamente o se ligan con sutura.
Usando un microscopio, los músculos de la espalda de la pierna (cerca del semitendinoso y los aductores) se 5 diseccionan sin puntas. Después se localiza en ganglio linfático poplíteo. Los 2 vasos linfático proximales y los 2 distales y la irrigación sanguinea distal del ganglio poplíteo se ligan mediante sutura. El ganglio linfático poplíteo y cualquier tejido adiposo acompañante se retiran a continuación cortando los tejidos conjuntivos.
Hay que tener cuidado para controlar cualquier sangrado leve como consecuencia de este procedimiento.Después de los linfáticos se ocluyen, los colgajos de piel se sellan usando piel líquida (Vetbond) (AJ Buck).Los bordes 10 separados de la piel se escalan al tejido muscular subyacente mientras dejando un espacio de ~ 0,5 cm alrededor de la pierna.La piel también se puede anclar mediante sutura al músculo subyacente cuando es necesario.
Para evitar la infección, los animales se alojan individualmente con una rejilla (sin lecho). Los animales que malla que se recuperan se comprueban todos los días a través del pico edematoso óptima, que por lo general se produjo el día 5-7 .A continuación, se observa el pico edematoso meseta. Para evaluar la intensidad del linfedema, se miden 15 la circunferencia y los volúmenes de 2 lugares designados en cada pata antes de la operación y diariamente durante 7 días. Se determina el efecto de las proteínas plasmáticas sobre el linfedema y también se investiga si el análisis de proteínas es un perímetro de prueba útil. Los pesos de los miembros tanto control y edematosos se evalúan en 2 lugares. El análisis se realiza siguiendo un patrón ciego.
Mediciones de la circunferencia: Con una breve anestesia con gas para prevenir el movimiento de las extremidades, 20 se usa una cinta de tela para medir la circunferencia de la extremidad. Las mediciones se realizan en el hueso del tobillo y la pata dorsal por 2 personas diferentes y esas 2 lecturas se promedian. Las lecturas se toman para las extremidades control y las extremidades edematosas.
Medidas volumétricas: El día de la cirugía, se anestesia a los animales con pentobarbital y se analizan antes de la cirugía. Para las volumetrías diarias los animales están bajo una breve anestesia con halotano (inmovilización rápida 25 y recuperación rápida), y las dos patas se afeitan e se marcan igual usando un rotulador indeleble en las patas. Las patas se sumergen primero en agua, después se sumergen en el instrumento a cada nivel marcado y luego se mide mediante el software de edema Buxco (Chen / Victor). Los datos los registran por una sola persona, mientras que la otra coloca la extremidad por la zona marcada.
Mediciones de las proteínas de la sangre-plasma: la sangre se extrae, se centrifuga y se separa el suero antes de la 30 cirugía y después al final para la comparación entre la proteína total y el Ca2+.
Comparación del peso de las extremidades: Después de la extracción de sangre, el animal está preparado para la recogida de tejidos. Las extremidades se amputan usando una guillotina, después, las patas, tanto experimentales como control se cortan por el ligamento y se pesan. Se realiza una segunda determinación del peso cuando la articulación tibio-calcaneal es desarticulada y el pie se pesa. 35
Preparaciones histológicas: El músculo transverso situado detrás de la zona de la rodilla (poplíteo) se resecta y se coloca en un molde de metal, lleno de freezeGel, sumergido en metilbutano frío, colocado en bolsas de muestra marcadas en - 80EC hasta cortar. Después de cortarlo, se observan los vasos linfáticos del músculo con microscopio fluorescente.
Ejemplo 29: Supresión de la expresión de la molécula de adhesión inducida por TNF-alfa por una proteína 40 albúmina fusión de la invención
El reclutamiento de linfocitos en áreas de inflamación y angiogénesis implica interacciones ligando-receptor específicas entre las moléculas de adhesión a la superficie celular (CAM) sobre linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adhesión, en contextos normales y patológicos, sigue una cascada de múltiples etapas en la que participan la expresión de la molécula 1 de adhesión celular (ICAM-1), la molécula 1 de adhesión celular vascular 45 (VCAM-1) y la molécula 1 de adhesión leucocitaria endotelial (E-selectina) en células endoteliales (EC). La expresión de estas moléculas y de otras sobre el endotelio vascular determina la eficiencia con la que los leucocitos se pueden adherir a la vasculatura local y extravasar al tejido local durante el desarrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citocinas y del factor de crecimiento participa en la modulación de la expresión de estas CAM.
El factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a), una potente citocina proinflamatoria, es un estimulador de las tres CAM 50 en las células endoteliales y puede estar implicado en una amplia variedad de respuestas inflamatorias, resultando a menudo en un resultado patológico.
El potencial de una proteína de fusión de la albúmina de la invención para mediar en la supresión de la expresión de CAM inducida por TNF-a se puede analizar. Un ensayo de ELISA modificado que usa EC como absorbente de fase sólida se emplea para medir la cantidad de expresión de CAM en EC tratados con TNF-a cuando se coestimulan con 55 un miembro de la familia de proteínas de los FGF.
Para realizar el experimento, las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se obtienen a partir de cultivos de cosechas de cordón agrupados y se mantenidas en medio de crecimiento (EGM-2; Clonetics, San Diego, CA) suplementado con 10 % de FCS y 1 % de penicilina / estreptomicina en un incubador humidificado a 37 ºC y 5 % de CO2. Las HUVEC se siembran en placas de 96 pocillos a concentraciones de 1 x 104 células / pocillo en medio EGM a 37 grados C durante 18-24 horas o hasta la confluencia. Las monocapas se lavan posteriormente 3 veces 5 con una solución de medio RPMI-1640 sin suero suplementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina, y se tratan con una citocina dada y / o factor (s) de crecimiento de 24 a 37 grados C. Después de la incubación, las células se evalúan para determinar la expresión de CAM.
Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se cultivan en una placa de 96 pocillos convencional hasta confluencia. Se retira el medio de crecimiento de las células y se reemplaza con 90 ul de medio 199 (10 % 10 FBS). Las muestras para la prueba y los controles positivos o negativos se añaden a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 ul). Las placas se incuban a 37 ºC durante 5 horas (expresión de selectina y de integrina) o 24 horas (solo expresión de integrina). Las placas se aspiran para eliminar el medio y a cada pocillo se añaden 100 µl de 0,1 % de paraformaldehído – PBS (con Ca++ y Mg++). Las placas se mantienen a 4 ° C durante 30 minutos.
A continuación se retira el fijador de los pocillos y los pocillos se lavan IX con PBS (+ Ca, Mg) + BSA al 0,5 % y se 15 drena. No permita que los pocillos se sequen. Se añaden 10 µl de anticuerpo primario diluido a los pocillos de ensayo y control. Se usan Anti-ICAM-1-Biotina, Anti-VCAM-1-Biotina y Anti-E-selectina-Biotina a una concentración de 10 ug/ml (dilución 1:10 de 0,1 mg/ml de anticuerpo madre). Las células se incuban a 37 ºC durante 30 minutos en un ambiente humidificado. Los pocillos se lavan tres veces con PBS(+Ca,Mg) + +0,5 % de BSA.
A cada pocillo se añaden 20 µl de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida (dilución 1:5.000) y se incuban a 37 ºC 20 durante 30 minutos. . Los pocillos se lavan tres veces con PBS (+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA. Se disuelve un comprimido de p-nitrofenol fosfato pNPP por 5 ml de tampón de glicina (pH 10,4). A cada pocillo de ensayo se añaden 100 µl de sustrato pNPP en tampón de glicina. Los pocillos estándar por triplicado se preparan a partir de la dilución de trabajo de estreptavidina-fosfatasa alcalina en tampón de glicina: 1:5.000 (100) > 10-0,5 > 10-1 > 10-1,5. 5 µl de cada dilución se añaden a los pocillos por triplicado y el contenido en AP resultante es de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 25 ng, 0,18 ng. Después, a cada uno de los pocillos convencionales se deben añadir 100 µl del reactivo pNNP. La placa se incuba a 37 ºC durante 4 horas. A todos los pocillos se añade un volumen de 50 µl de NaOH 3M. Los resultados se cuantifican en un lector de placas a 405 nm. La opción de sustracción de fondo se usa en pocillos de blanco llenas de sólo tampón glicina. Se establece la plantilla para indicar la concentración del conjugado-AP en cada pocillo estándar [ 5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng]. Los resultados se indican como la cantidad de conjugado-30 AP unido en cada muestra.
Ejemplo 30: Construcción de la construcción indicadora GAS
Una vía de transducción de señal implicada en la diferenciación y proliferación de las células se denomina la vía Jaks-STAT. Las proteínas activadas en la vía Jaks-STAT se unen a los elementos “GAS” del sitio de activación gamma o al elemento respondedor sensible al interferón ("ISRE") localizados en el promotor de muchos genes. La 35 unión de una proteína a estos elementos altera la expresión del gen asociado.
Los elementos GAS e ISRE son reconocidos por una clase de factores de transcripción denominados transductores de señal y activadores de la transcripción o “STAT”. Existen seis miembros de la familia STAT. Stat1 y Stat3 están presentes en muchos tipos de células como Stat2 (dado que la respuesta alo IFN-alfa es amplia). Stat4 es más restringida y no está en muchos tipos de células, aunque se ha encontrado en las células T colaboradoras de clase I 40 tras el tratamiento con IL-12. Stat5 se denominó inicialmente factor de crecimiento de mamíferos, pero se ha encontrando a concentraciones más altas en otras células, incluido en células mieloides. Se puede activar en células de cultivo tisular mediante muchas citocinas.
Las STAT se activan para translocarse desde el citoplasma al núcleo tras la fosforilación de la tirosina mediante un conjunto de quinasas conocidas como la familia de Janus quinasas (“Jaks”). Las Jaks representan una familia 45 distinta de tirosina quinasas solubles e incluyen Tyk2, Jak1, Jak2 y Jak3. Estas quinasas muestran una similitud de secuencia significativa y en general están catalíticamente inactivas en las células en reposo.
Las Jaks se activan mediante una amplia gama de receptores resumidos en la Tabla siguiente. (Adaptado de la revisión de Schidler and Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:62151 (1995)).
(1995)). Una familia de receptores de citocinas capaz de activar Jaks se divide en dos grupos: a) la clase 1 incluye 50 los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF. CNTF, y trombopoyetina; y (b) Clase 2 incluye IFN-a, IFN-g e IL-10. Los receptores de la clase 1 comparten un motivo de cisteína conservado (un conjunto de cuatro cisteínas conservadas y un triptófano) y un motivo WSXWS (una región proximal a la membrana que codifica Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser (SEC ID Nº 1113)).
Por tanto, al unirse un ligando a un receptor se activan las Jaks, que, a su vez, activan las STAT, que después se 55 translocan y se unen a los elementos GAS. La totalidad de este proceso está dentro de la vía de transducción de señal Jaks-STAT. Por tanto, la activación de la vía de Jaks-STAT, que se refleja mediante la unión del elemento GAS o ISRE, se puede usar para indicar las proteínas implicadas en la proliferación y diferenciación de células. Por
ejemplo, se muestra que los factores de crecimientos y las citocinas activan la vía de Jaks-STAT (véase la Tabla 5, más adelante). Por tanto, usando los elementos GAST unidos a moléculas indicadoras se pueden identificar los activadores de la vía Jaks-STAT.
Tabla 5
JAK
ESTATS (elementos) GAST o ISRE
Ligando
tyk2 Jak1 Jak2 Jak3
Familia de IFN
IFN-a/B
+ +
-
-
1,2,3 ISRE
IFN-g
+ +
-
GAS (IRF1>Lys6>IFP)
II-10
+ ? ?
-
1,3
Familia de gp130
IL-6 (Pleiotrópica)
+ + + ? 1,3 GAS(IRF1>Lys6>IFP)
IL-11 (Pleiotrópica)
? + ? ? 1,3
OnM(Pleiotrópica)
? + + ? 1,3
LIF(Pleiotrópica)
? + + ? 1,3
CNTF(Pleiotrópica)
-
/+
+ + ? 1,3
G-CSF(Pleiotrópica)
? + ? ? 1,3
IL-12 (Pleiotrópica)
+
-
+ + 1,3
Familia de g-C
IL-2 (linfocitos)
-
+
-
+ 1,3,5 GAS
IL-4 (linfocitos/mieloides)
-
+
-
+ GAS(IRF1=IFP>>Ly6)(IgH)
IL-7 (linfocitos)
-
+
-
+ GAS
IL-9 (linfocitos)
-
+
-
+ GAS
IL-13 (linfocitos)
-
+ ? ? GAS
IL-15
? + ? + GAS
Familia de gp140
IL-3 (mieloides)
-
-
+
-
S GAS(IRF1>IFP>>Ly6)
IL-5 (mieloides)
-
-
+
-
GAS
GM-CSF (mieloide)
-
-
+
-
S GAS
Familia de la hormona del crecimiento
GH
?
-
+
-
S
PRL
? +/- +
-
1,3,5
EPO
?
-
+
-
GAS (B-CAS>IRF1=IFP>>Ly6)
Tirosina quinasas
receptoras
EGF
? + +
-
1,3 GAS (IRF1)
PDGF
? + +
-
1,3
CSF-1
? + +
-
1,3 GAS(no IRF1)
Para construir un elemento promotor que contenga GAS, que se usa en los ensayos biológicos descritos en los ejemplos 7880, se usa una estrategia basada en PCR para generar una secuencia promotora de GAS+SV40. El cebador en 5’ contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión GAS hallado en el promotor IRF1 y demostrado anteriormente que se une a las STAT tras la inducción con una serie de citocinas (Rothman et al., Immunity 5 1:457468 (1994).), aunque se pueden usar en su lugar otros elementos GAS o ISRE. El cebador en 5’ también contiene 18 pb de secuencia complementaria a la secuencia del promotor temprano de SV40 y está flanqueado por un sitio XhoI. La secuencia del cebador en 5’ es:
10
El cebador cadena abajo es complementario al promotor de SV40 y está flanqueado por un sitio Hind III: 5':GCGGCAACCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEC ID Nº 1115)
La amplificación por PCR se realiza usando el molde del promotor SV40 presente en plásmido B-gal:promotor obtenido en Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XhoI/Hind III y se subclona en BLSK2-. 15 (Stratagene.) La secuenciación con cebadores directos e indirectos confirma que el inserto contiene la secuencia siguiente:
Con este elemento promotor GAS unido al promotor de SV40, después se somete a ingeniería la construcción indicadora GAS:SEAP2. Aquí, la molécula indicadora es una fosfatasa alcalina secretada o "SEAP." No obstante, está claro que se puede usar cualquier molécula indicadora en lugar de SEAP, en este o en cualquiera de los otros ejemplos. Las moléculas indicadoras bien conocidas que se pueden usar en lugar de SEAP incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP), o 25 cualquier proteína detectable mediante un anticuerpo.
La secuencia anterior confirmó que el elemento promotor GAS-SV40 sintético se subclona en el vector pSEAP-Promotor obtenido de Clontech usando HindIII y XhoI, sustituyendo con eficacia el promotor de SV40 con el elemento promotor amplificado GAS:SV40 para crear el vector GAS-SEAP. No obstante, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina y, por tanto, no se prefiere para los sistemas de expresión en mamíferos. 30
Por tanto, con el fin de generar líneas celulares estables de mamíferos que expresan el indicador GAS-SEAP, se retira el casete GAS-SEAP del vector GAS-SEAP usando SalI y NotI, y se inserta en un vector de estructura que contiene el gen de resistencia a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), usando estos sitios de restricción en el sitio
de clonación múltiple para crear el vector GAS-SEAP/Neo. Una vez que este vector se transfecta en células de mamífero, este vector se puede usar después como molécula indicadora para la unión de GAS como se describe en los ejemplos 7880.
Se pueden realizar otras construcciones usando la descripción anterior y sustituyendo GAS con una secuencia promotora diferente. Por ejemplo, la construcción de moléculas indicadoras que contienen las secuencias 5 promotoras EGR y NF-KB se describen en los ejemplos 7882. No onstante, muchos otros promotores se pueden sustituir usando los protocolos descritos en estos ejemplos. Por ejemplo, los promotores SRE, IL-2, NFAT u osteocalcina se pueden sustituir, solos o en combinación (p. ej., GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, II-2/NFAT o NF-KB/GAS). De un modo similar, se pueden usar otras líneas celulares para analizar la actividad de la construcción indicadora, tal como HELA (epiteliales), HUVEC (endoteliales), Reh (células B), Saos-2 (osteoblastos), HUVAC 10 (aórticas) o cardiomiocitos.
Ejemplo 31: Ensayo de actividad de SEAP.
Como molécula indicadora de los ensayos descritos en los ejemplos divulgados en el presente documento, se analiza la actividad de SEAP usando el kit Tropix Phospho-light (cat. BP-400) de acuerdo con el siguiente procedimiento general. El kit Tropix Phospho-light suministra la dilución, el ensayo y los tampones de reacción que 15 se usan más adelante.
Cebar un dispensador con 2,5 x del tampón de dilución y dispensar 15 ul de 2,5x del tampón de dilución en Optiplates que contienen 35 ul de una solución que contiene una proteína de fusión de albúmina de la invención. Sellar las placas con un sellador de plástico e incubar a 65 ºC durante 30 minutos. Separar las Optiplates para evitar un calentamiento no uniforme. 20
Enfriar las muestras hasta la temperatura ambiente durante 15 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de ensayo. Aádir 50 ml de tampón de ensayo e incubar a temperatura ambiente 5 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de reacción (ver la tabla más adelante). Añadir 50 ul de tampón de reacción e incubar a temperatura ambiente duurante 20 minutos. Dado que la intensidad de la señal quimioluminiscente depende del tiempo y se requieren aproximadamente 10 minutos para leer 5 placas en un luminómetro, se deben 25 tratar 5 pacas cada vez y comenzar con el segundo grupo 10 minutos después.
Leer las unidades relativas de luz en el luminómetro. Establecer H12 como blanco e imprimir los resultados. Un incremento de la quimioluminiscencia indica actividad indicadora.
Tabla 6
Nº de placas
Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml) Nº de placas Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml)
8,25
3,25 8,5
3,5 8,75
3,75
9,25
9,5
4,5 9,75
4,75
10,25
10,5
5,5 10,75
5,75
Nº de placas
Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml) Nº de placas Diluyente tampón Rxn (ml) CSPD (ml)
11,25
6,25 11,5
6,5 11,75
6,75
12,25
7,25 12,5
7,5 12,75
7,75
Ejemplo 32: Ensayo de indentificación de la actividad neuronal.
Cuando las células se diferencian y proliferan se activa un grupo de genes mediante muchas vías de transducción de señal diferentes. Uno de estos genes, EGR1 (gen 1 de respuesta temprana de crecimiento), se induce en varios tejidos y tipos celulares tras la activación. El promotor de EGR1 es responsible de esta inducción. Usando el 5 promotor de EGR1 unido a las moléculas indicadoras se puede evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para activar células.
En concreto, se usa el protocolo siguiente para evaluar la actividad neuronal en las líneas celulares PC12. Se sabe que las células PC12 (células de feocromocitoma de rata) proliferan y/o se diferencian mediante la activación con una serie de mitógenos, tales como TPA (acetato de tetradecanoil forbol), NGF (factor de crecimiento neural) y EGF 10 (factor de crecimiento epidérmico). La expresión del gen EGR1 se activa durante este tratamiento. Por tanto, mediante a transfección estable de las células PC12 con una construcción que contiene un promotor de EGR unido a indicador SEAP se puede evaluar la activación de las células PC12 mediante una proteína de fusión de albúmina de la presente invención.
La construcción indicadora EGR/SEAP se puede ensamblar mediante el protocolo siguiente. La secuencia 15 promotora de EGR-1 (-633 a +1)(Sakamoto K et al., Oncogene 6:867871 (1991)) se puede amplificar por PCR a partir del AND genómico humano usando los cebadores siguientes:
Primer cebador: 5' GCGCTCGAGGGATGACAGCOATAGAACCCCGG-3' (SEC ID Nº 1117)
Segundo cebador: 5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3' (SEC ID Nº 1118)
Usando el vector GAS:SEAP/Neo producido en el ejemplo 75, el producyo amplificado de EGR1 se puede insertar 20 en este vector. Linealizar el vector GAS:SEAP/Neo usando las enzimas de restricción XhoI/HindIII, eliminado el GAS/SV40. Restringir el producto amplificado de EGR1 con estas mismas enzimas. Ligar el vector y el promotor de EGR1.
Para preparar placas de 96 pocillos para cultivo celular, se añaden dos ml de una solución de revestimiento (dilución 1:30 de colágeno de tpo I (Upstate Biotech Inc. Nº de Cat. 08115) en etanol al 30 % (esterilizada por filtración)) por 25 una placa de 10 cm o 50 ml por pocillo de la placa de 96 pocillos, y se deja secar al aire durante 2 horas.
Las células PC12 se cultivan de forma rutinaria en medio RPMI-1640 (Bio Whittaker) que contiene 105 de suero de caballo (JRH BIOSCIENCES, nº de Cat. 12449-78P), 5 % de suero bovino fetal (FBS) inactivado con calor suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina en una placa de cultivo tisular de 10 cm revestida previamente. Cada tres-cuatro días se realizan de una a cuatro divisiones. Se extrane las células de las 30 placas mediante raspado y se resuspenden con pipeteo arriba y abajo más de 15 veces.
Transfectar la construcción EGR/SEAP/Neo en PC12 usando técnicas concoidas en la materia. Las células estables EGR-SEAP/PC12 se obtienen cultivando las células en 300 ug/ml de G418. El medio sin G418 se usa para crecimiento de rutina pero cada de uno a dos meses las células se volverán a cultivar en 300 ug/ml de G418 un par
de pases.
Para analizar la actividad neuronal se realiza una detección de una placa de cm cn células de una cnfluencia de aproximadamente 70 a 80 % eliminando el medio antiguo. Lavar las células una vez con PBS (solución salina tamponada con fosfato). Después, dejar sin alimento a las células en medio con poco suero (RPMI-1640 que contiene 1 % de suero de caballo y 0,5 % de FBS con antibióticos) durante la noche. 5
A la mañana siguiente, retirar el medio y lavar las células con PBS. Raspar las células de la placa, suspender las células bien en 2 ml de medio con poco suero. Contar el número de células y añadir más medio con poco suero para alcanzar una densidad celular final de 5 x 105 células/ml.
Añadir a cada pocillo de la placa de 96 pocillos 200 ul de la suspensión celular (equivalente a 1x105 células/pocillo). Añadir una serie de concentraciones diferentes de una proteína de fusión de albúmina de la invención a 37 ºC 10 durante de 48 a 72 horas. Como control positivo se puede usar un factor de crecimiento que se sabe que activa las células PC12 a través del EGR, tal como 50 ng/ul del factor de crecimiento neuronal (NGF). Normalmente, en los pocillos control positico se ve una multiplicación por cincuenta de la inducción de SEAP. El ensayo de SEAP se puede realizar rutinariamente usando técnicas conocidas en la materia y/o como se describe en el ejemplo 76.
Ejemplo 33: Ensayo de la actividad de los linfocitos T. 15
El siguiente protocolo se usa para evaluar la actividad de los linfocitos T identificando factores y determinando si una proteína de fusión de albúmina de la invención prolifera y/o se diferencia en células T. La actividad de las células T se evalúa usando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el Ejemplo 75. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la vía de transducción de señal Jaks-STATS. Las células T usadas en este ensayo son células T Jurkat (nº de acceso en la ATCC TIB-152), aunque también se pueden usar las 20 células Molt-3 (nº de acceso en la ATCC CRL-1552) y las células Molt-4 (nº de acceso en la ATCC CRL-1582).
Las células T Jurkat son células colaboradoras Th1 CD4+ linfoblásticas. Con el fin de generar líneas celulares estables, aproximadamente 2 millones de células Jurkat se transfectan con el vector GAS-SEAP/neo usando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimiento de transfección descrito más adelante). Las células transfectadas se siembran hasta una densidad de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se seleccionan los transfectantes 25 resistentes a 1 mg/ml de denticina. Las colonias resistentes se expanden y después se analiza su respuesta a concentraciones crecientes de interferón gamma. Se demuestra la respuesta a la dosis de un clon seleccionado.
Específicamente, el protocolo siguiente dará suficientes células para 75 pocillos que contienen 200 ul de células. Por tanto, se escala o se realiza varias veces para generar suficientes células para múltiples placas de 96 pocillos. Las células Jurkat se mantienen en medio RPMI + 10 % de suero con 1 % de Pen-Strep. Combinar 2,5 mll de OPTI-30 MEM (Life Technologies) con 10 ug de AND plasmídico en un matraz T25. Añadir 2,5 ml de OPTI-MEM que contiene 50 ul de DMRIE-C e incubar a temperatura ambiente durante 15 - 45 minutos.
Durante el periodo de incubación, contar la concentración celular, centrifugar el número requerido de células (107 por transfección) y resuspender en OPTI-MEM hasta una concentración final de 107 células/ml. Después, añadir 1 ml de 1 x 107 células en OPTI-MEM a un matraz T25 e incubar a 37 ºC durante 6 horas. Después de la incubación, añadir 35 10 ml de RPMI + 15 % de suero.
Las líneas indicadoras estables Jurkat:GAS-SEAP se mantienen en medio RPMI + 10 % de suero, 1 mg/ml de denticina y 1 % de Pen-Strep. Estas células se tratan con concentraciones variables de una o más proteínas de fusión de la presente invención.
El día del tratamiento con la proteína de fusión, se deberán lavar las células y resuspender en RPMI + 10 % de 40 suero recién preparado hasta una densidad de 500.000 células por ml. El número exacto de células necesarias dependerá del número de proteínas de fusión y el número de concentraciones diferentes de las proteínas de fusión que se van a someter a detección selectiva. Para una placa de 96 pocillos se necesitan aproximadamente 10 millones de células (para 10 placas, 100 millones de células).
Las placas de pocillos que contienen células Jurkat tratadas con la proteína de fusión se introducen en un incubador 45 durante 48 horas (nota: este tiempo es variable entre 48 y 72 horas). Muestras de 35 ul de cada pocillo se transfieren después a una placa opaca de 96 pocillos usando una pipeta de 12 canales. Las placas opacas se cubrirán (usando cubiertas de celofán) y se almacenarán a -20 ºC hasta que se realizan los ensayos de SEAP de acuerdo con el ejemplo 76. Las placas que contienen las células tratadas restantes se introducen a 4 ºC y sirven como fuente de material para repetir el ensayo en un pocillo específico si se desea. 50
Como control positivo, se pueden usar 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activan las células Jurkat T. Normalmente, en los pocillos control positivo se ve una multiplicación por 30.
El protocolo anterior se puede usar en la generación de células transfectadas tanto de forma transitoria como estable, lo que será evidente para los expertos en la técnica.
Ejemplo 34: Ensayo de la actividad de las células T.
NF-KB (el factor nuclear KB) es un factor de transcripción activado por una amplia variedad de agentes, incluidas las ciroquinas inflamatorias IL-1 y TNF, CD30 y CD40, la linfotoxina alfa y la linfotoxina beta, mediante exposición a LPS o trombina, y mediante la expresión de ciertos productos génicos virales. Como factor de transcripción, el NF-KB regula la expresión de los genes implicados en la activación de las células inmunitarias, el control de la apoptosis 5 (NF- KB parece proteger a las células de la apoptosis), el desarrollo de células B y T, las respuestas antivirales y antimicrobianas y múltiples respuestas al estrés.
En condiciones sin estimulación, el NF- KB se retiene en el citoplasma con I-KB (Inhibidor KB). No obstante, tras la estimulación, el I- KB se fosforila y se degrada, haciendo que el NF- KB pase al núcleo y, de este modo, se activa la transcripción de los genes diana. Los genes diana activados por NF- KB incluyen los de IL-2, IL-6, GM-CSF, ICAM-1 10 y el MHC de clase 1.
Debido a su papel central y la capacidad para responder a una serie de estímulos, las construcciones indicadoras que usan el elemento promotor de NF-KB se usan para seleccionar la proteína de fusión. Los activadores o inhibidores de NF-KB serían útiles en el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, los inhibidores de NF-KB se podrían usar para tratar las enfermedades relacionadas con la activación aguda o crónica 15 de NF-KB, tal como la artritis reumatoide.
Para construir un vector que contiene el elemento promotor de NF-KB se usa una estrategia basada en PCR. El cebador cadena arriba contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión de NF-KB (GGGGACTTTCCC) (SEC ID Nº 119), 18 pb de secuencia complementaria al extremo 5’ de la secuencia del promotor temprano de SV40 está flanqueado por un sitio XhoI. 20
El cebador cadena abajo es complementario al extremo 3’ del promotor de SV40 y está flanqueado por un sitio Hind III: 25
5':GCGGCAAGCTTTTGCAAAGCCTAGGC:3' (SEC ID Nº 1115)
La amplificación por PCR se realiza usando el molde del promotor SV40 presente en pB-gal:promotor obtenido en Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XhoI y Hind III y se subclona en BLSK2-. (Stratagene) La secuenciación con cebadores directos e indirectos confirma que el inserto contiene la secuencia siguiente:
Después, sustituir el elemento del promotor mínimo de SV40 presente en el plásmido pSEAP2-promotor (Clontech) con este fragmento de NF-KB/SV40 usando XhoI y HindIII. No obstante, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina y, por tanto, no se prefiere para los sistemas de expresión en mamíferos. 35
Con el fin de generar líneas celulares de mamífero estables, se extrae el casete NF-KB/SV40/SEAP del vector NF-KB/SEAP anterior usando las enzimas de restricción SalI y NotI, y se inserta en un vector que contiene resistencia a neomicina. Particularmente, el casete NF-KB/SV40/SEAP se insertó en pGFP-1 (Clontech), sustituyendo el gen de GFP, restringiendo después el pGFP-1 con SalI y Notl.
Una vez creado el vector NF-KB/SV40/SEAP/Neo, se crean células T Jurkat estables y se mantienen de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 76. De un modo similar, el procedimiento para analizar las proteínas de fusión con estas células T Jurkat estables también se describe en el ejemplo 76. Como control positivo, a los pocillos H9, H10 y H11 se añade TNF-alfa exógeno (0,1, 1, 10 ng) y normalmente se observa una multiplicación de 510 de la activación. 5
Ejemplo 35: Ensayo de indentificación de la actividad mieloide.
El siguiente protocolo se usa para evaluar la actividad mieloide de una proteína de fusión de albúmina de la invención determinando si la proteína de fusión prolifera y/o se diferencia en células mieloides. La actividad de las células mieloides se evalúa usando la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el Ejemplo 75. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la vía de transducción de señal Jaks-10 STATS. La célula mieloide usada en este ensayo es U937, una línea celular pre-monocito, aunque se puede usar TF-1, HL60 o KG1.
Para transfectar las células U937 de forma transitoria con la construcción GAS/SEAP/Neo producida en el ejemplo 75 se usa un procedimiento DEAE-Dextrano (Kharbanda et. al., 1994, Cell Growth & Differentiation, 5:259265). Primero, recolectar 2x107 células U937 y lavar con PBS. Las células U937 normalmente se cultivan en medio RPMI 15 1640 que contiene 10 % de suero bovino fetal (FBS) inactivado con calor suplementado con 100 unidades/ml de penicilina y 10mg/ml de estreptomicina.
Después, suspender las células en 1 ml de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) qye contiene 0,5 mg/ml de DEAE-Dextrano, 8 ug de AND del plásmido GAS-SEAP2, NaCl 140 mM, KCI 5 mM, Na2HPO4.7H2O 375 uM, MgCl2 1 mM yCaCl2 675 uM. Incubar a 37 ºC durante 45 minutos. 20
Lavar las células con medio RPMI 1640 que contiene 10 % de FBS y, después, resuspender en 10 ml de medio completo e incubar a 37 ºC durante 36 horas.
Las células estables GAS-SEAP/U937 se obtienen cultivando las células en 400 ug/ml de G418. El medio sin G418 se usa para crecimiento de rutina pero cada de uno a dos meses las células se volverán a cultivar en 400 ug/ml de G418 un par de pases. 25
Estas células se analizan mediante recolección de 1x108 células (esto es bastante para un ensayo de diez placas de 9 pocillos) y lavar con PBS. Suspender las células en 200 ml del medio de crecimiento descrito anteriormente, con una densidad final de 5x105 células/ml. Sembrar en placas 200 ul de células por pocillo en la placa de 96 pocillos (o 1x105 células/pocillo).
Añadir diferentes concentraciones de la proteína de fusión. Incubar a 37 ºC durante de 48 a 72 horas. Como control 30 positivo, se pueden usar 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activan las células U937. Normalmente, en los pocillos control positivo se ve una multiplicación por 30. Se realiza el ensayo de SEAP del sobrenadante de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y/o el protocolo descrito en el ejemplo 76.
Ejemplo 36: Ensayo de identificación de cambios en la concentración de moléculas pequeñas y la permeabilidad de la membrana. 35
Se sabe que la unión de un ligando a un receptor altera los niveles intracelulares de las moléculas pequeñas, tales como calcio, potasio, sodio, y el pH, así como el potencial de membrana. Estas alteraciones se pueden medir en un ensayo para identificar las protéinas de fusión que se unen a los receptores de una célula concreta. Aunque el siguiente protocolo describe un ensayo para el calcio, este protocolo se puede modificar fácilmente para detectar los cambios en el potasio, el sodio, el pH, el potencial de membrana, o cualquier otra molécula pequeña que se pueda 40 detectar mediante una sonda fluorescente.
El ensayo siguiente usa el lector de placas Fluorometric Imaging Plate Reader ("FLIPR") para medir los cambios en las moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se unen a las moléculas pequeñas. Claramente, se puede usar cualquier molécula fluorescente que detecta una molécula pequeña en lugar de la molécula de calcio fluorescente, fluo-4 (Molecular Probes, Inc.; nº de catálogo F-14202), usada en el presente documento. 45
Para las células adherentes, sembrar las células a 10.000-20.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos negra Co-star con fondo transparente. La placa se incuba en un incubador de CO2 incubator durante 20 horas. Las células adherentes se lavan dos veces en un lavador Biotek con 200 ul de HBSS (solución salina equilibrada de Hank) que deja 100 ul de tampón después del lavado final.
Se prepara una solución madre de 1 mg/ml fluo-4 en 10 % de ácido plurónico DMSO. Para cargar las células con 50 fluo-4, a cada pocillo se añaden 50 ul def 12 ug/ml de fluo-4. La placa se incuba a 37 ºC en un incubador de CO2 durante 60 minutos. La placa se lava cuatro veces en el lavador Biotek con HBSS dejando 100 ul de tampón.
Para células ni adherentes, las células se centrifugan desde el medio de cultivo. Las células se resuspenden a 2-5x106 células/ml con HBSS en un tubo cónico de 50 ml. A cada ml de suspensión celular se añaden 4 ul de una
solución de 1 mg/ml fluo-4 en 10 % de ácido plurónico DMSO. Después, el tubo se introduce en un baño de agua a 37 ºC durante 3060 minutos. Las células se lavan dos veces con HBSS, se resuspenden hasta 1x106 células/ml y se dispensan en una microplada a 100 ul/pocillo. La placa se centrifuga a 1.000 rpm durante 5 minutos. Después, la placa se lava una vez en Denley Cell Wash con 200 ul, seguido de una etapa de aspiración hasta un volumen final de 100 ul. 5
Para un ensayo no basado en células, cada pocillo contiene una molécula fluorescente, tal como fluo-4. La proteína de fusión de la invención se añade al pocillo y se detecta un cambio en la fluorescencia.
Para medir la fluorescencia del calcio intracelular, el FLIPR se fija para los parámetros siguientes: (1) la ganancia del sistema es de 300800 mW; (2) el tiempo de exposición es de 0,4 segundos; (3) Cámara F/fin es F/2; (4) la excitación es de 488 nm; (5) la emisión es 530 nm; y (6) la adición de muestra es 50 ul. La emisión incrementada a 530 nm 10 indica un acontecimiento de señalización extraclelular causado por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de albúmina de la presente invención, que ha dado como resultado un incremento de la concentración de Ca++ intracelular.
Ejemplo 37: Ensayo de identificación de la actividad tirosina quinasa
Las proteínas tirosina quinasas (PTK) representan un grupo diverso de quinasas transmembranales y citoplásmicas. 15 Dentro del grupo de las proteínas tirosina quinasas receptoras (RPTK) están los receptores de una serie de factores de crecimiento mitogénicos y metabólicos, incluidas las subfamilias de receptores de PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF e insulina. Además existe una gran familia de RPTK para las que se desconoce el correspondiente ligando. Los ligandos de los RPTK incluyen principalmente, proteínas pequeñas secretadas, pero también proteínas unidas a la membrana y de la matriz extracelular, 20
La activación de los RPTK por los ligandos implica dimerización de receptor mediada por ligandos, que tienen como resultado la transfosforilación de las subunidades del receptor y la activación de las tirosina quinasas citoplásmicas. Las tirosina quinasas citoplásmicas incluyen tirosina quinasas asociadas a receptores de la familia src (p. ej., src, yes, lck, lyn, fyn) y proteínas tirosina quinasas no unidas a receptores y citosólicas, tales como la familia Jak, cuyos miembros participan en la transducción de señal desencadenada por la superfamilia de receptores de citocinas (p. 25 ej., las interleucinas, los interferones, GM-CSF y leptina).
Dado el amplio abanico de factores conocidos capaces de estimular la actividad de tirosina quinasa, la identificación de si una proteína de fusión de albúmina de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de la presente invención es capaz de activar las vías de transducción de la señal de la tirosina quinasa es de interés. Por tanto, el siguiente protocolo está diseñado para identificar dichas moléculas capaces de activar las vías 30 de transducción de la señal de la tirosina quinasa.
Sembrar las células diana (p. ej., queratinocitos primarios) a una densidad de aproximadamente 25.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos Loprodyne Silent Screen Plates adquirida en Nalge Nunc (Naperville, IL). Las placas se esterilizan con dos aclarados de 30 minutos con etanol al 100 %, aclaradas con agua y secadas durante la noche. Algunas placas se revisten durante 2 horas con 100 ml de cultivo celular de colágeno de tipo 1 (50 mg/ml), 35 gelatina (2 %) o polilisina (50 mg/ml), todos los cuales se pueden adquirir en Sigma Chemicals (St. Louis, MO) o 10 % de Matrigel adquirida de Becton Dickinson (Bedford,MA), o suero de ternero, r se aclaran con PBS y se almacenan a 4 ºC. El cultivo celular en estas placas se analiza sembrando 5.000 células/pocillo en medio de crecimiento y cuantificación indirecta del número de células mediante el uso de alamar Blue como ha descrito el fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) después de 48 horas. Se usan cubiertas de placa Falcon nº 40 3071 de Becton Dickinson (Bedford, MA) para cubrir las placas Loprodyne Silent Screen Plates. También se pueden usar placas de cultivo celular Falcon Microtest III en algunos experimentos de proliferación.
Para preparar extractos, se siembran células A431 sobre las membranas de nailon de placas Loprodyne (20.000/200 ml/pocillo) y se cultivan durante la noche en medio completo. Las células se inactivan mediante incubación en medio basal sin suero durante 24 horas. Tras 520 minutos, el tratamiento con EGF (60ng/ml) o concentraciones diferentes 45 de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se extrajo el medio y a cada pocillo se añaden 100 ml del tampón de extracción ((HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 1 % de Triton X-100, 0,1 % de SDS, Na3VO4 2 mM, Na4P2O7 2 mM y un cóctel de inhibidores de la proteasa (nº 1836170) obtenidos de Boeheringer Mannheim (Indianapolis, IN)) y la placa se agita en un agitador rotatorio durante 5 minutos a 4 ºC. Después, la placa se coloca en un colector de transferencia de vacío y el extracto se filtra a través de fondos de membrana de 0,45 mm de cada 50 pocillo usando vacío doméstico. Los extractos se recogen en una placa de captura/ensayo de 96 pocillos en el fondo del colector de vacío e inmediatamente se introducen en hielo. Para obtener extractos aclarados mediante centrifugación, el contenido de cada pocillo después de solubilizar con detergente durante 5 minutos, se retira y se centrífuga durante 15 minutos a 4 ºC a 160.000 x g.
Se analizan los extractos filtrados para determinar los niveles de actividad tirosina quinasa. Aunque se conocen 55 muchos procedimientos de detección de la actividad tirosina quinasa, en el presente documento se describe un procedimiento.
En general, la actividad tirosina quinasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención se evalúa
determinando su capacidad para fosforilar un residuo de tirosina sobre un sustrato específico (un péptido biotinilado). Los péptidos biotinilados que se pueden usar para este fin incluyen PSK1 (correspondiente a los aminoácidos 6 - 20 de la división celular quinasa cdc2-p34) y PSK2 (correspondiente a los aminoácidos 117 de gastrina). Ambos péptidos son sustratos de una serie de tirosina quinasas y están disponibles en Boehringer Mannheim. 5
La reacción de tirosina quinasa se establece añadiendo los siguientes componentes en orden. Primero, añadir 10 ul de péptido biotinilado 5uM, después 10 ul de ATP/Mg2+ (ATP 5mM / MgCl2 50mM), después 10ul de 5x de tampón de ensayo (imidazol clorhidrato 40mM, pH 7,3, beta-glicerofosfato 40 mM, EGTA 1mM, MgCl2 100mM, MaCl2 5 mM, 0,5 mg/ml de BSA), después 5 ul de vanadato sódico (1mM) y después 5 ul de agua. Mezclar los componentes suavemente y preincubar la mezcla de reacción a 30 ºC durante 2 minutos. Iniciar la reacción añadiendo 10 ul de la 10 enzima control o el sobrenadante filtrado.
La reacción del ensayo de tirosina quinasa se termina después añadiendo 10 ul de EDTA 120 nM e introducir las reacciones en hielo.
La actividad tirosina quinasa se determina transfiriendo un alícuota de 50 ul de la mezcla de reacción a una placa de microtitulación (MTP) e incubando a 37 ºC durante 20 minutos. Esto permite revestir con estreptavidina la placa de 15 96 pocillos para asociar con el péptido biotinilado. Lavar el módulo MTP con 300 ul/pocillo de PBS cuatro veces. Después, añadir a cada pocillo 75 ul de anticuerpo anti-fosfotirosiina conjugado con peroxidada de rábano (anti-P-Tyr-POD (0,5 u/ml)) e incubar a 37 ºC durante una hora. Lavar el pocillo como se ha indicado con anterioridad.
Después, añadir 100 ul de la solución de sustrato de peroxidada (Boehringer Mannheim) e incubar a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos (hasta 30 minutos). Meidr la absorbancia de la muestra 405 nm usando un 20 lector de ELISA. El nivel de actividad de peroxidada unida se cuantifica usando un lector de ELISA y refleja el nivel de actividad tirosina.
Ejemplo 38: Ensayo de indentificación de la actividad de fosforilación.
Como una alternativa potencial y / o complementaria del ensayo de la actividad de la proteína tirosina quinasa descrita en el Ejemplo 82 también se puede usar un ensayo que detecta la activación (fosforilación) de las 25 principales intermedios de transducción de señal intracelular. Por ejemplo, como se describe a continuación, un ensayo particular puede detectar la fosforilación de tirosina de las Erk-1 y Erk-2 quinasas. Sin embargo, la fosforilación de otras moléculas, tales como Raf, JNK, p38 MAP, MAP quinasa quinasa (MEK), MEK quinasa, Src, quinasa específica de músculo (MnSK), IRAK, Tec y Janus, así como cualquier otra molécula de fosfoserina, fosfotirosina o fosfotreonina, puede detectarse mediante la sustitución de estas moléculas para Erk-1 o Erk-2 en el 30 siguiente ensayo.
Específicamente, las placas de ensayo se hacen mediante revestimiento de una placa de ELISA de 96 pocillos con 0,1 ml de proteína G (1 ug / ml) durante 2 horas a temperatura ambiente, (RT). Las placas se enjuagaron con PBS y se bloquearon con 3 % de BSA / PBS durante 1 hora a RT. La proteína G placas se trataron entonces con 2 anticuerpos monoclonales comerciales (100 ng / pocillo) contra Erk-1 y Erk-2 (1 hora a TA) (Santa Cruz 35 Biotechnology). (Para detectar otras moléculas, esta etapa puede modificarse fácilmente mediante la sustitución de un anticuerpo monoclonal de detección de cualquiera de las moléculas descritas anteriormente.) Después de 3-5 lavados con PBS, las placas se almacenan a 4 º C hasta su uso
Se siembran células A431 a 20.000 / pocillo en una placa filtrante de 96 pocillos y se cultivan durante la noche en medio de crecimiento. Las células se mantienen sin alimento durante 48 horas en medio basal (DMEM) y después 40 se tratan con EGF (6 ng / pocillo) o concentraciones variables de la proteína de fusión de la invención durante 5-20 minutos. Después, las células se solubilizan y se filtran los extractos directamente en la placa de ensayo.
Después de la incubación con el extracto durante 1 hora a TA, los pocillos se enjuagan de nuevo. Como control positivo se usa una preparación comercial de MAP quinasa (10 ng / pocillo) en lugar de extracto de A431. Las placas se tratan después con un anticuerpo policlonal comercial (de conejo) (1 ug / ml) que reconoce específicamente el 45 epítopo fosforilado de las Erk-1 y Erk-2 quinasas (1 hora a TA). Este anticuerpo se biotinila mediante procedimientos estándar. El anticuerpo policlonal unido se cuantifica a continuación mediante incubaciones sucesivas con reactivo de mejora de europio-estreptavidina y la fluorescencia del europio en el instrumento DELFIA de Wallac (fluorescencia resuelta en el tiempo).Un aumento de la señal fluorescente sobre el fondo indica una fosforilación por la proteína de fusión de la presente invención o una molécula inducida por una proteína de fusión de albúmina de la 50 presente invención.
Ejemplo 39: Ensayo para la estimulación de la proliferación de células CD34 + en médula ósea.
Este ensayo se basa en la capacidad de los linfocitos CD34+ humanos para proliferar en presencia de factores de crecimiento hematopoyéticos y evalúa la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para estimular la proliferación de células CD34 +. 55
Se ha demostrado previamente que la mayoría de los precursores maduras responderán a una única señal. Más
precursores inmaduros requieren al menos dos señales para responder. Por lo tanto, para analizar el efecto de las proteínas de fusión de la invención sobre la actividad hematopoyética de una amplia gama de células progenitoras, el ensayo contiene una proteína de fusión dada de la invención en presencia o ausencia de factores de crecimiento hematopoyéticos. Las células aisladas se cultivan durante 5 días en presencia del factor de células madre (SCF) en combinación con la muestra analizada. El SCF solo tiene un efecto muy limitado sobre la proliferación de las células 5 de la médula ósea (MO), y actúa en condiciones únicamente como factor de "supervivencia". Sin embargo, combinado con cualquier factor que exhiba un efecto estimulante sobre estas células (por ejemplo, EL-3), el SCF causará un efecto sinérgico. Por lo tanto, si la proteína de fusión analizada tiene un efecto estimulante sobre los progenitores hematopoyéticos, tal actividad puede detectarse fácilmente. Puesto que las células normales de la MO tienen un bajo nivel de células en ciclo, es probable que cualquier efecto inhibidor de una proteína de fusión dada 10 podría no detectarse. En consecuencia, el ensayo de un efecto inhibidor sobre los progenitores se analiza, preferentemente, en células que se someten primero a estimulación in vitro con SCF + IL + 3, y después se pone en contacto con el compuesto que se está evaluando para determinar la inhibición de dicha proliferación inducida.
Brevemente, las células CD34 + se aíslan usando el procedimiento conocido de la técnica. Las células se descongelan y resuspenden en medio (medio 60 QBSF sin suero con 1 % de L-glutamina (500 ml) Quality Biological, 15 Inc., Gaithersburg, MD nº de cat. 160-204-101). Después de varias etapas de centrifugación suave a 200 xg, las células se dejan reposar durante una hora. El recuento de células se ajusta a 2,5 x 105células / ml. Durante este tiempo, se añaden 100 l de agua estéril a los pocillos periféricos de una placa de 96 pocillos. Las citocinas que se pueden analizar una proteína de fusión de albúmina de la invención en este ensayo son rhSCF (R & D Systems, Minneapolis, MN, Cat # 255-SC) a 50 ng / solas ml y en combinación con rhSCF y rhIL-3 (I + D Sistema, 20 Minneapolis, MN, Cat # 203-ML) a 30 ng / ml. Después de una hora, se añaden a los medios 10 l de citocinas preparadas, a concentraciones variables de una proteína de fusión de albúmina de la invención, y 20 l de células, que ya está presente en los pocillos para permitir un volumen total final de 100 l. Las placas se colocan después en un incubador a 37 ° C / 5 % de CO2 durante cinco días.
Dieciocho horas antes de la recolección del ensayo se añaden 0,5 % Ci / pocillo de [3H] timidina a un volumen de 10 25 l a cada pocillo para determinar la tasa de proliferación. El experimento se termina mediante la recolección de las células de cada placa de 96 pocillos a una Filtermat usando el Tomtec Harvested 96. Después de la cosecha, las almohadillas de filtros se secan, se recortan y se colocan en los montajes OMNIFILTER que consisten en una placa OmniFilter y una bandeja OmniFilter. 60  del Microscint se añaden a cada pocillo y la placa de escala con TopScal-Una película de sellado de prensa en un código de barras se fija en la primera placa para el recuento. Las placas 30 selladas se cargan después y el nivel de radiactividad se determina a través de la Packard Top Count y los datos impresos se recogieron para su análisis. El nivel de radioactividad refleja la cantidad de proliferación celular.
Los estudios descritos en este ejemplo analizan la actividad de una proteína de fusión dada para estimular la proliferación de células de médula ósea CD34 +.Un experto en la materia podría modificar fácilmente los estudios ilustrativos para analizar la actividad de las proteínas de fusión y polinucleótidos de la invención (por ejemplo, terapia 35 génica), así como agonistas y antagonistas de los mismos. La capacidad de una proteína de fusión de la albúmina de la invención para estimular la proliferación de células CD34 de médula ósea + células indica que la proteína de fusión de albúmina y / o polinucleótidos que corresponden a la proteína de fusión son útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos que afectan el sistema inmune y la hematopoyesis. Usos representativos se describen en las secciones "Inmune Actividad" y "enfermedad infecciosa" anteriormente, y en otras partes en el presente 40 documento.
Ejemplo 40: Ensayo de la respuesta potenciada de la matriz extracelular (EMECR).
El objetivo del ensayo de la respuesta celular mejorada (EMECR) de la matriz extracelular es para evaluar la capacidad de las proteínas de fusión de la invención para actuar sobre las células madre hematopoyéticas en el contexto de la señal inducida por la matriz extracelular (MEC). 45
Las células responden a los factores reguladores en el contexto de la(s) señal (es) recibidas desde el microambiente circundante, por ejemplo, los fibroblastos y las células madre endoteliales y epiteliales no pueden replicarse en ausencia de señales desde la MEC. Las células madre hematopoyéticas pueden sufrir autorenovación en la médula ósea, pero no en el cultivo en suspensión in vitro. La capacidad de las células madre para sufrir autorenovación in vitro depende de su interacción con las células del estroma y la proteína fibronectina de la MEC (fn).La adhesión de 50 las células a la fn está mediado por los receptores de integrina αs.B1 y α4.β1, expresados por las células madre hematopoyéticas humanas y de ratón. El o los factores que se integran con el entorno de la MEC y que son responsables de la estimulación de la autorenovación de las células madre todavía no se han identificado. El descubrimiento de estos factores debería ser de gran interés en las aplicaciones de terapia génica y trasplante de médula ósea. 55
Brevemente, placas de poliestireno que no son de cultivo tisular y de 96 pocillos se revisten con fragmentos de fn a una concentración de recubrimiento de 0,2 g cm2. Las células de médula ósea de ratón se cultivan en placas (1000 células / pocillo) en 0,2 ml de medio libre de suero. Las células cultivadas en presencia de IL-3 (5 ng / ml) + SCF (50 ng / ml) servirían como el control positivo, las condiciones bajo las cuales cabe esperar que se produzca poca autorenovación por una pronunciada diferenciación de las células madre. Las proteínas de fusión de la albúmina de 60
la invención se analizan con controles negativos apropiados en presencia y ausencia de SCF (5,0 ng / ml), donde el volumen de la composición administrada que contiene la proteína de fusión de albúmina de la invención representa el 10 % del volumen total del ensayo. Las células cultivadas en placas se dejan crecer incubando en un incubador de cultivo tisular con ambiente bajo en oxígeno (5 % de CO2, 7 % de O2, y 88 % de N2) durante 7 días. El número de células en proliferación dentro de los pocillos se cuantifican después midiendo la incorporación de timidina en el 5 ADN celular. La verificación de los valores positivos requerirá la caracterización fenotípica de las células, que puede realizar aumentando el sistema de cultivo y usando los reactivos de anticuerpos apropiados contra los antígenos de la superficie celular y exploración con FACS.
Si se descubre que una proteína de fusión particular de la presente invención es estimulante de los progenitores hematopoyéticos, la proteína de fusión y los polinucleótidos correspondientes a la proteína de fusión pueden ser 10 útiles, por ejemplo, en el diagnóstico y tratamiento de trastornos que afectan el sistema inmunológico y la hematopoyesis. Usos representativos se describen en las secciones "Actividad inmunitaria" y "Enfermedad infecciosa" anteriormente, y en otras partes en el presente documento. La forma de la proteína de fusión también ser útil en la expansión de las células madre y los progenitores comprometidos de diversas estirpes sanguíneas y en la diferenciación y / o proliferación de diversos tipos de células. 15
Además, las proteínas de fusión de albúmina de la invención y los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de albúmina de la invención, se pueden emplear también para inhibir la proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas y por lo tanto se pueden emplear para proteger a las células madre de la médula ósea de los agentes quimioterapéuticos durante la quimioterapia. Este efecto antiproliferativo puede permitir la administración de dosis mayores de agentes quimioterapéuticos, y el tratamiento quimioterapéutico, por lo tanto, más eficaz. 20
Además, las proteínas de fusión de la invención y los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de albúmina de la invención también pueden ser útiles para el tratamiento y diagnóstico de trastornos hematopoyéticos relacionados tales como, anemia, pancitopenia, leucopenia, trombocitopenia o leucemia, ya que las células estromales son importantes en la producción de células de linajes hematopoyéticos. Los usos incluyen cultivo ex vivo de médula ósea, trasplante de médula ósea, reconstitución de médula ósea, radioterapia o quimioterapia de la 25 neoplasia.
Ejemplo 41: Proliferación de fibroblastos dérmicos humanos y de células de músculo liso aórtico.
Una proteína de fusión de albúmina de la invención se añade a cultivos de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) y células de músculo liso aórtico humano (AoSMC) y se realizan dos co-ensayos con cada muestra. El primer ensayo examina el efecto de la proteína de fusión sobre la proliferación de fibroblastos dérmicos humanos 30 normales (NHDF) o células de músculo liso aórtico humano (AoSMC). El crecimiento aberrante de fibroblastos o de células de músculo liso es parte de varios procesos patológicos, incluyendo fibrosis y reestenosis. El segundo ensayo examina la producción de IL-6 por NHDF y SMC. La producción de IL-6 es una indicación de la activación funcional. Las células activadas tendrán un incremento de la producción de una serie de citocinas y otros factores que puede tener como resultado un desenlace proinflamatorio o inmunomodulador. Los ensayos se realizan con y 35 son estimulación con co-TNFa con el fin de comprobar la actividad coestimulatoria o inhibidora.
Brevemente, el día 1, en las placas negras de 96 pocillos se introducen 1.000 células/pocillo (NHDF) o 2.000 células/pocillo (AoSMC) en 100 µl de medio de cultivo. El medio de cultivo para NHDF contiene: Medio basal Clonetics, 1mg/ml de hFGF, 5 mg/ml de insulina, 50 mg/ml de gentamicina, 2 % de FBS, mientras que el medio de cultivo para AoSMC contiene medio basal Clonetics SM, 0,5 µg/ml de hEGF, 5 mg/ml de insulina, 1 µg/ml de hFGF, 40 50 mg/ml de gentamicina, 50 µg/ml de anfotericina B, 5 % de FBS. Después de incubar a 37 ºC durante al menos 45 horas se aspira el medio de cultivo y se reemplaza con medio para la detención del crecimiento. El medio para la detención del crecimiento para NHDF contiene medio basal para fibroblastos, 50 mg/ml de gentamicina, 2 % de FBS, mientras que el medio para la detención del crecimiento para AoSMC contiene medio basal SM, 50 mg/ml de gentamicina, 50 µg/ml de anfotericina B, 0,4 % de FBS. Incubar a 37 ºC hasta el día 2. 45
El día 2, se diseñan diluciones en serie y plantillas de una proteína de fusión de albúmina de la invención de un modo tal que siempre incluyen controles de medio y controles de proteína conocida. Para los experimentos de estimulación y de inhibición las proteínas se diluyen en medio de detención del crecimiento. Para los experimentos de inhibición se añade TNFa hasta una concentración final de 2 ng/ml (NHDF) o 5 ng/ml (AoSMC). Añadir 1/3 vol de controles que contienen medio o una proteína de fusión de albúmina de la invención e incubar a 37 ºC/5 % de CO2 50 hasta el día 5.
Transferir 60 µl de cada pocillo a otra placa de 96 pocillos marcada, cubrir con un sellador de placas y almacenar a 4 ºC hasta el día 6 (para ELISA de IL6). A los 100 ul restantes en la placa de cultivo celular, añadir en asepsia Alamar Blue en una cantidad igual al 10 % del volumen de cultivo (10 µl). Devolver las placas al incubador durante de 3 a 4 horas. Después, medir la fluorescencia con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm usando el CytoFluor. Esto da 55 los datos es estimulación/inhibición del crecimiento.
El día 5 se realiza el ELISA de IL6 revistiendo una placa de 96 pocillos con 50-100 ul/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-IL6 humano diluido en PBS a pH 7,4, se incuba a temperatura ambiente.
El día 6, vaciar las placas en la pila y se transfieren a toallitas de papel. Preparar el tampón de ensayo con PBS con 4 % de BSA. Bloquear las placas con 200 µl/pocillo de tampón de bloqueo de Pierce Super Block en PBS durante 12 h y después lavar las placas con tampón de lavador (PBS, 0,05 % de Tween-20). Transferir las placas a toallitas de papel. Después, añadir 50 µl/pocillo del anticuerpo monoclonal anti-IL6 humana marcado con biotina a 0,50 mg/ml. Realizar diluciones de la madre de IL-6 en medio (30, 10, 3, 1, 0,3, 0 ng/ml). Añadir muestras por duplicado a la fila 5 superior de la placa. Cubrir las placas e incubar durante 2 horas a TA en el agitador.
Las placas se lavan con tampón de lavado y se transfieren a toallas de papel. Diluir estreptavidina marcada con EU a 1:1000 en tampón de ensayo y añadir 100 µl/pocillo. Cubrir la placa e incubar 1 hora a TA. Las placas se lavan de nuevo con tampón de lavado y se transfieren a toallas de papel.
Añadir 100 µl/pocillo de solución de potenciación. Agitar durante 5 minutos. Leer la placa en el Wallac DELFIA 10 Fluommeter. Las lecturas de muestras por triplicado en cada ensayo se tabularon y promediaron.
Un resultado positivo en este ensayo sugiere proliferación de células AoSMC y que la proteína de fusión de albúmina puede estar implicada en la proliferación de fibroblastos dérmicos y/o en la proliferación de células de músculo liso. Un resultado positivo también sugiere muchos usos potenciales de la proteína de fusión y los polinucleótidos que codifican la proteína de fusión de albúmina. Por ejemplo, la inflamación y las respuestas 15 inmunitarias, la cicatrización de heridas y la angiogénesis tal como se detallan en la presente memoria. En particular, las proteínas de fusión se pueden usar en la cicatrización de heridas y la regeneración dérmica, así como la estimulación de la vasculogénesis, tanto de los vasos sanguíneos como de los linfáticos. El crecimiento de los vasos se puede usar en el tratamiento de por ejemplo, enfermedades cardiovasculares. Adicionalmente, las proteínas de fusión que muestran actividad antagonista en este ensayo pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, 20 trastornos y/o afecciones que implica angiogénesis actuando como agente anti-vascular (p. ej., antiangiogénesis). Estas enfermedades, trastornos y/o afecciones se conocen en la técnica y/o se describen en el presente documento, tales como, por ejemplo, neoplasias malignas, tumores sólidos, tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicas, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; placas arteroscleróticas; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, 25 rechazo de injertos corneales, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis, retinoblastoma, uveítis y Pterygia (crecimiento anormal de los vasos sanguíneos) del ojo, artritis reumatoide; psoriasis; retraso en la cicatricación de heridas; endometriosis; vasculogénesis; granulaciones; cicatrices hipertróficas (queloides); fracturas en zonas de no unión; esclerodermia; tracoma; adherencias vasculares; angiogénesis miocárdica; colaterales coronarias; colaterales cerebrales; malformaciones arteriovenosas; angiogénesis de las extremidades isquémicas; 30 síndrome de Osler-Webber; neovascularización en placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; displasia fibromuscular; granulacíón de heridas; enfermedad de Crohn; y aterosclerosis. Además, las proteínas de fusión que actúan como antagonistas en este ensayo pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades antihiperproliferaticas y/o antiinflamatorios conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento.
Ejemplo 42: Expresión de la molécula de adhesión celular (CAM) en células endoteliales 35
El reclutamiento de linfocitos en áreas de inflamación y angiogénesis implica interacciones ligando-receptor específicas entre las moléculas de adhesión a la superficie celiular (CAM) sobre linfocitos y el endotelio vascular. El proceso de adhesión, en contextos normales y patológicos, sigue una cascada de múltiples etapas en la que participan la expresión de la molécula 1 de adhesión celular (ICAM-1), la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) y la molécula 1 de adhesión leucocitaria endotelial (E-selectina) en células endoteliales (EC). La expresión 40 de estas moléculas y de otroas sobre el endotelilo vascular determina la eficiencia con la que los leucocitos s epueden adherrir a la vascularura local y extravasar al tejido local durante el desarrollo de una respuesta inflamatoria. La concentración local de citocinas y del factor de crecimiento participa en la modulación de la expresión de estas CAM.
Brevemente, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC)) se cultivan en una placa estándar de 96 45 pocillos hasta confluencia, se retira el medio de crecimiento de las células y se esustituye con 100 µl de medio 199 (10 % de suero bovino fetal (FBS)). Las muestras para análisis (que contienen una proteína de fusión de la invención) y los controles positivos o negativos se añaden a la placa por triplicado (en volúmenes de 10 µl). Después, las placas se incuban a 37 ºC durante 5 horas (expresión de selectina y de integrina) o 24 horas (solo expresión de integrina). Las placas se aspiran para eliminar el medio y a cada pocillo se añaden 100 µl de 0 - 1 % 50 de paraformaldehído –OBS (con Ca++ y Mg++). Las placas se mantienen a 4 ºC durante 30 minutos. La fijación se retira de los pocillos y los pocillos se lavan 1X con PBS(+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA y se drenan. Se añaden 10 µl de anticuerpo primario diluido a los pocillos de ensayo y control. Se usan Anti-ICAM-1-Biotina, Anti-VCAM-1-Biotina y Anti-E-selectina-Biotina a una concentración de 10 ug/ml (dilución 1:10 de 0,1 mg/ml de anticuerpo madre). Las células se incuban a 37 ºC durante 30 minutos en un ambiente humidificado. Los pocillos se lavan tres veces con 55 PBS(+Ca,Mg) + 0,5 % de BSA. A cada pocillo se añaden 20 µl de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida (dilución 1:5,00, en el presente documento denominada dilución de trabajo) y se incuban a 37 ºC durante 30 minutos. Los pocillos se lavan tes veces con PBS(+Ca,Mg) + +0,5 % de BSA. Disolver un comprimido de p-nitrofenol fosfato pNPP por 5 ml de tampón de glicina (pH 10,4). A cada pocillo de ensayo se añaden 100 µl de sustrato pNPP en tampón de glicina. Los pocillos estándar por triplicado se preparan a partir de la dilución de trabajo de 60 estreptavidina-fosfatasa alcalina en tampón de glicina: 1:5.000 (10°) > 10-0,5 > 10-1 > 10-1,5. 5 µl de cada dilución se
añaden a los pocillos por triplicado y el contenido en AP resultante es de 5,50 ng, 1,74 ng, 0,55 ng, 0,18 ng. Después, a cada uno de los pocillos convencionales se añaden 100 µl del reactivo pNNP. La placa se incuba a 37 ºC durante 4 horas. A todos los pocillos se añade un volumen de 50 µl de NaOH 3M. La placa se lee en un lector de palcas a 405 nm usando la opción de sustracción de fondo sobre pocillos blanco llenos con únicamente tampón de glicina. Adicionalmente, se establece la plantilla para indicar la concentración del conjugado-AP en cada pocillo 5 estándar [ 5,50 ng; 1,74 ng; 0,55 ng; 0,18 ng]. Los resultados se indican como la cantidad de conjugado-AP unido en cada muestra.
Ejemplo 43: Ensayo de proliferación de células endoteliales con Alamar Blue.
Este ensayo se puede usar para determinar cuantitativamente la inhibición mediada por proteínas de la proliferación inducida por bFGF de células endoteliales linfáticas bovinas (LEC), células endoteliales aórticas bovinas (BAEC) o 10 células del miometrio uterino microvasculares humanas (UTMEC). Este ensayo incorpora un indicador de crecimiento fluorométrico basado en la detección de la actividad metabólica. Se prepara un ensayo de proliferación estándar Alamar Blue en EGM-2MV con 10 ng /ml de bFGF añadido como fuente de estimulación de las células endoteliales. Este ensayo se puede usar con varias células endotelilaes con ligeros cambios en el medio de crecimiento y la concentración celular. Las diluciones de los lotes de proteínas a analizar se diluyen del modo 15 adecuado. Se usa medio sin suero (GIBCO SFM) sin bFGF como control sin estimular y se incluyen angiostatina o TSP-1 como controles inhibidores conocidos.
Brevemente, se siembran LEC, BAEC o UTMEC en medio de crecimiento a una densidad de 5.000 a 2.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos y se colocan a 37 ºC durante la noche. Después de incubar durante la noche las células, se extrae el medio de crecimiento y se sustituye con GIBCO EC-SFM. Las células se tratan con 20 las diluciones adecuadas de una proteína de fusión de albúmina de la invención o muestra(s) de proteína control (preparadas en SFM) en pocillos por triplicado con bFGF adicional hasta una concentración de 10 ng7ml. Una vez que las células se han tratado con las muestras, la o las placas se introducen de nuevo en el incubador a 37 ºC durante tres días. Después de tres días, a cada pocillo se añaden 10 ml de la reserva de alamar blue (Biosource Cat# DAL1100) y la o las placas se introducen de nuevo en el incubador a 37 ºC durante cuatro horas. Las placas se 25 leen después con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm usando el lector de fluorescencia CytoFluor. Se registra la salida directa en unidades de fluorescencia relativas.
Alamar blue es un indicador de la oxidación-reducción que brilla y cambia de color en respuesta a la reducción química del medio de crecimiento a causa del crecimiento celular. A medida que las células crecen en el cultivo, la actividad metabólica innata tiene como resultado una reducción química del entorno inmediato circundante. La 30 reducción relacionada con el crecimiento hace que el indicador cambie de forma oxidada (azul no fluorescente) a forma reducida (rojo fluorescente) (es decir, la proliferación estimulada producirá una señal más fuerte y la proliferación inhibida producirá una señal más débil y la señal total es proporcional al número total de células, así como a su actividad metabólica). El nivel de actividad de fondo se observa con medio sin nutrientes solo. Esto se compara con el resultado observado en las muestras control positivo (bFGF en medio de crecimiento) y las 35 diuciones de las proteínas.
Ejemplo 44: Detección de la inhibición de una reacción mixta de linfocitos
Este ensayo se puede usar para detectar y evaluar la inhibición de una reacción mixta de linfocitos (RML) por las proteínas de fusión de la invención. La inhibición de una RML puede deberse a un efecto directo sobre la proliferación y la viabilidad celular, la modulación de moléculas coestimuladoras sobre las células que interactúan, la 40 modulación de la adhesividad entre linfocitos y células accesorias o la modulación de la producción de citocinas por las células accesorias. Las proteínas de fusión de albúmina pueden estar dirigidas a múltiples células e inhiben la RML, ya que la fracción de células mononucleares de sangre periférica en este ensayo incluye linfocitos T, B y asesinas naturales, así como monocitos y células dendríticas.
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención que se encontró que inhibían la RML pueden encontrar 45 aplicación en enfermedades asociadas con la activación o proliferación de linfocitos y monocitos. Estas incluyen, entre otras, enfermedades tales como asma, artritis, diabetes, afecciones inflamatorias de la piel, psoriasis, eczema, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, arterioesclerosis, cirrosis, enfermedad del injerto contra el huésped, enfermedad del huésped contra el injerto, hepatitis, leucemia y linfoma. 50
Brevemente, los PBMC de donantes humanos se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad usando medio de separación de linfocitos (LSM®, Densidad de 1,0770 g / ml, Organon Teknika Corporation, West Chester, PA). Los PBMC de dos donantes se ajustan a 2 x 106 células / ml en RPMI-1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 10 % de FCS y glutamina 2 mM. Los PBMC de un tercer donante se ajustan a 2 x 105 células / ml. A los pocillos de placas de microlitros de fondo redondo y 60 pocillos se añaden cincuenta microlitros de 55 las PBMC de cada donante .Las diluciones del material de ensayo de la proteína de fusión (50 l) se añaden por triplicado a los pocillos de microlitro. Se añaden las muestras de ensayo (de la proteína de interés) para la dilución final de 1: 4; rhuIL-2 (R & D Systems, Minneapolis, MN, número de catálogo 202-IL) se añade a una concentración final de 1 g / ml; mAb anti-CD4 (R & D Systems, clon 34930.11, número de catálogo MAB379) se añade a una
concentración final de 10 g / ml. Las células se cultivan durante 7-8 días a 37 ° C en 5 % de CO2, y se añade 1 C de [3H] timidina a los pocillos durante las últimas 16 horas de cultivo. Las células se recogen y se determina la incorporación de timidina usando un Packard TopCount. Los datos se expresan como la media y la desviación estándar de las determinaciones por triplicado.
Las muestras de la proteína de fusión de interés se analizan en experimentos separados y se comparan con el 5 tratamiento de control negativo, mAb anti-CD4, que inhibe la proliferación de los linfocitos, y el tratamiento de control positivo, IL-2 (ya sea como material recombinante o sobrenadante), que mejora la proliferación de los linfocitos.
Ejemplo 45: Ensayo de la actividad proteasa.
El siguiente ensayo se puede usar para evaluar la actividad proteasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención. 10
La cimografía en gelatina y caseína se realiza esencialmente como se describe (Heusen et al., Anal. Biochem., 102:196 - 202 (1980); Wilson et al., Journal of Urology, 149:653 - 658 (1993)). Las muestras se pasan por geles de 10 % de poliacrilamida / 0,1 % de SDS que contienen 1 % o caseína gelatina, se empapan e tritón al 2,5 % a temperatura ambiente durante 1 hora y en glicina 0,1 M, a pH 8,3 a 37 ° C durante de 5 a 16 horas. Después de la tinción en amido, las áreas negras de la proteólisis aparecen como áreas claras frente al fondo negro-azul. Se usa 15 tripsina (Sigma T8642) como control positivo.
La actividad proteasa se determina también mediante el control de la escisión del éster etílico de n-a-benzoil-L-arginina (BAEE) (Sigma B-4500). .Las reacciones se establecen en MNaPO4 25 mM, EDTA 1 mM, y BAEE 1 mM), pH 7,5. Se añaden las muestras y el cambio en la absorbancia a 260 nm se controla en el espectrofotómetro Beckman DU-6 en modo de tiempo -impulso. .La tripsina se usa como control positivo. 20
Ensayos adicionales basados en la liberación de péptidos solubles en ácido a partir de caseína o hemoglobina medidos como la absorbancia a 280 nm o colorimétricamente usando el procedimiento de Folin se llevan a cabo como se describe en Bergmeyer, et al., Methods of Enzymatic Analysis, 5 (1984). Otros ensayos implican la solubilización de sustratos cromógenos (Ward, Applied Science, 251-317 (1983)).
Ejemplo 46: Identificación de la especificidad de sustrato de la serina proteasa 25
Los procedimientos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento pueden usarse para determinar la especificidad de sustrato de la proteína de fusión de albúmina de la presente invención que tiene actividad de serina proteasa. Un procedimiento preferido para determinar la especificidad de sustrato es mediante el uso de bibliotecas combinatorias de exploración posicional sintéticas como se describe en el documento GB 2 324 529 (incorporado en el presente documento en su totalidad). 30
Ejemplo 47: Ensayos de unión a ligando
El siguiente ensayo se puede usar para evaluar la actividad de unión al ligando de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
Los ensayos de unión a ligando proporcionan un procedimiento directo para determinar la farmacología del receptor y se pueden adaptar a un formato de rendimieno elevado. El ligando purificado para una proteína de fusión de 35 albúmina de la invención se marca radioactivamente hasta un actividad espe´cifica alta (50-2000 Ci/mmol) para los estudios de unión. Depsués se realiza una determinación de que el proceso de radiomarcaje no disminuye la actividad del ligando hacia la protéina de fusión. Las condiciones de ensayo para tampones, iones, pH y otros moduladores tales como nucleótidos se optimizan para establecer una proporción señal-ruido procesable para fuentes de polipéptidos de membrana y de células enteras. Para estos ensayos, la unión polipeptídica específica se 40 define como la radioactividad total asociada menos la radioactividad medida en presencia de un exceso de ligando de competición sin marcar. Cuando sea posible, se usa más de un ligando de competición para definir la unión inespecífica residual.
Ejemplo 48: Ensayo funcional en ovocitos de Xenopus
Transcritos de ARN protegidos de moldes plasmídicos linealizados que codifican una proteína de fusión de albúmina 45 de la invención se sintetizan in vitro con ARN polimerasas de acuerdo con procedimientos estándar. Los transcritos in vitro se suspenden en agua a una concentración final de 0,2 mg / ml. Se extraen lóbulos ováricos de sapos hembras adultas, se obtienen oocitos desfoliculados en estadio V y los transcritos de ARN (10 ng / oocito) se inyectan en un bolo de 50 nl usando un aparato de microinyección. Se usan pinzas de voltaje de dos electrodos para medir las corrientes de los oocitos de Xenpus individuales en respuesta a la exposición al agonista polipeptídico y a 50 la proteína de fusión. Los registros se realizan medio de Barth sin Ca2+ a temperatura ambiente. El sistema de Xenopus se puede usar para cribar ligandos conocidos y extractos de tejido / célula para la activación de ligandos.
Ejemplo 49: Ensayos microfisiométricos.
La activación de una amplia variedad de sistemas de mensajero secundario se traduce en la extrusión de pequeñas
cantidades de ácido a partir de una célula. El ácido formado es en gran medida resultado de la mayor actividad metabólica requerida para alimentar el proceso de señalización intracelular. Los cambios de pH en los medios que rodean a la célula son muy pequeños pero detectables con el microfisiómetro CYTOSENSOR (Molecular Devices Ltd., Menlo Park, Calif.). El CYTOSENSOR es, por lo tanto, capaz de detectar la capacidad de una proteína de fusión de la albúmina de la invención para activar mensajeros secundarios que se acoplan a una vía de señalización 5 intracelular que usa energía.
Ejemplo 50: Detección selectiva en sobrenadante de extracto/celular.
Existe un un gran número de receptores de mamíferos existe para os que, hasta ahora, no existe un ligando de activación afín (agonista). Por lo tanto, los ligandos activos para estos receptores pueden no estar incluidos dentro de los bancos como ligandos identificados hasta la fecha. De acuerdo con lo anterior, las proteínas de fusión de 10 albúmina de la invención también pueden someterse a detección selectiva funcional (usando calcio, AMPc, microfisiómetro, electrofisiología de oocitos, etc, cribados funcionales) contra extraxtos tisulares para identificar los ligandos naturales para la porción de proteína terapéutica y / o la porción de proteína de albúmina de una proteína de fusión de albúmina de la invención. Los extractos que producen respuestas funcionales positivas pueden subfraccionarse secuencialmente hasta aislar e identificar un ligando. 15
Ejemplo 51: Ensayo de unión a ATP.
El siguiente ensayo se puede usar para evaluar la actividad de unión a ATP de una proteína de fusión de albúmina de la invención.
La actividad de una proteína de fusión de la albúmina de la invención de unión a ATP puede detectarse usando el ensayo de unión a ATP se describe en la patente de EE.UU. 5.858.719, que se incorpora en el presente documento 20 como referencia en su totalidad. Brevemente, la unión del ATP a una proteína de fusión de albúmina de la invención se mide mediante marcaje de fotoafinidad con 8-azido-ATP en un ensayo de competición. Las mezclas de reacción que contienen 1 mg / ml de la proteína de transporte ABC se incuban con diferentes concentraciones de ATP, o el análogo de ATP no hidrolizable adenil-5’-imidodifato durante 10 minutos a 4 ° C. Se añade una mezcla de 8-azido-ATP (Sigma Chern.Corp., St. Louis, MO.) más 8-azido-ATP (32P-ATP) (5 mCi / mol, ICN, Irvine CA) a una 25 concentración final de 100 M y alícuotas de 0,5 ml se colocan en los pocillos de una placa de porcelana colocada en hielo.La placa se irradia usando una lámpara de onda corta de 254 nm UV a una distancia de 2,5 cm de la placa durante dos intervalos de un minuto con un intervalo de enfriamiento de un minuto en el medio. La reacción se para mediante la adición de ditiotreitol hasta una concentración final de 2 mM. Las incubaciones se someten a electroforesis en SDS-PAGE, se secan y se realizan las autorradiografías. Las bandas de proteína correspondientes 30 a las proteínas de fusión de albúmina de la invención se escinden y la radioactividad se cuantifica. Una disminución en la radiactividad con el aumento de ATP o adenil-5'-imidodifosfato proporciona una medida de la afinidad del ATP por la proteína de fusión.
Ejemplo 52: Ensayo de fosforilación.
Con el fin de analizar la actividad de fosforilación de una proteína de fusión de albúmina de la invención se usa un 35 ensayo de fosforilación como se describe en la patente de EE.UU. 5.958.405 (que se incorpora aquí por referencia). Brevemente, la actividad de fosforilación puede medirse mediante fosforilación de un sustrato de proteína usando 32P-ATP-gamma marcado y cuantificación de la radiactividad incorporada usando un contador gamma de radioisótopos. La proteína de dusión de la invención se incuba con el sustrato de proteína, 32P-ATP, y un tampón de quinasa. El 32P incorporado en el sustrato se separa después del 32P-ATP mediante electroforesis, y el 32P 40 incorporado se cuenta y se compara con un control negativo. Los recuentos de radiactividad por encima del control negativo son indicativos de actividad de fosforilación de la proteína de fusión.
Ejemplo 53: Detección de la actividad de fosforilación (activación) de una proteína de albúmina de fusión de la invención en presencia de ligandos polipeptídicos.
Los procedimientos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento pueden usarse para determinar la 45 la actividad de fosforilación de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención. Un procedimiento preferido de determinar la actividad de fosforilación es mediante el uso del ensayo de fosforilación de la tirosina como se describe en el documento US 5.817.471.
Ejemplo 54: Identificación de las proteínas de transducción de proteínas que interaccionan con una proteína de fusión albumia de la presente invención 50
Las proteínas de fusión de albúmina de la invención pueden servir como herramientas de investigación para la identificación, caracterización y purificación de las proteínas o proteínas receptoras de la vía de transducción de señales. Brevemente, una proteína de fusión marcada de la invención es útil como ureactivo para la purificación de moléculas con las que interacciona. En una realización de purificación por afinidad, una proteína de fusión de albúmina de la invención está acoplada covalentemente a una columna de cromatografía. El extracto sin células 55 derivado de supuestas células diana, tales como tejidos de carcinoma, se pasa por columna, y las moléculas con la afinidad adecuada se unen a la proteína de fusión de albúmina. El complejo de la proteína se recupera de la
columna, se disocia, y la molécula recuperada se somete a secuenciación de la proteína en N-terminal. Esta secuencia de aminoácidos se usa después para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados para clonar el gen relevante a partir de una biblioteca de ADNc apropiada.
Ejemplo 55: Bioensayo de IL-16.
En la técnica se conocen diversos ensayos para analizar los efectos proliferativos de una proteína de fusión de 5 albúmina de la invención Por ejemplo, uno de tales ensayos es el bioensayo de IL-6 como se describe en Marz et al. (Proc.Natl.Acad.Sci, EE.UU., 95:. 3251-56 (1998)). Después de 68 horas, a 37 ° C, el número de células viables se mide mediante la adición de la sal de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT) e incubando durante otras 4 horas, a 37 ° C. Las células B9 se lisan mediante SDS y la densidad óptica se mide a 570 nm. Se usan los controles que contienen IL-6 (positivo) y sin citocina (negativo). Brevemente, las céulas murinas B9 dependientes de IL-6 se lavan tres veces 10 en medio sin IL-6 y se siembra en placas a una concentración de 5.000 células por pocillo en 50 l y se añaden 50 l de la proteína de fusión de la invención. La proliferación potenciada en la o las muestras de ensayo (que contienen una proteína de fusión de albúmina de la invención) en relación con el control negativo es indicativa de efectos proliferativos mediados por la proteína de fusión.
Ejemplo 56: Soporte de supervivencia de neuronas de embriones de pollo. 15
Para analizar si la viabilidad celular neuronal simpática está soportada por una proteína de fusión de albúmina de la invención Se puede usar un ensayo de supervivencia de neuronas en embrión de pollo de Senaldi et al may be utilized (Proc. Natl Acad. Sci., U.S.A., 96:11458 - 63 (1998), que se incorpora por referencia en el presente documento). Brevemente, las neuronas motoras y simpáticas se aislan de embriones de pollo, se resuspenden en medio L15 (con 105 de FCS, glucosa, selenito sódico, progesterona, conalbúmina, putrescina e insulina; Life 20 Technologies, Rockville, MD.) y medio Eagle modificado de Dulbecco [con 10 % de FCS, glutamina, penicilina y Hepes 25 mM (pH 7,2); Life Technologies, Rockville, MD.], respectivamente y se incuba a 37° en 5 % de CO2 en presencia de concentraciones diferentes de la proteína de fusión purificada de la invención, así como un control negativo que carece de citocinas. Tras 3 días se determina la supervivencia de las neuronas mediante evaluación de la morfología celular y mediante el uso del ensayo colorimétrico de Mosmann (Mosmann, T., J. Immunol. Methods, 25 65:5563 (1983)). La viabilidad de las células neuronales potenciada en comparación con los controles que carecen de citocinas es indicativa de que la proteína de fusión de albúmina potencia la supervivencia de las células neuronales.
Ejemplo 57: Ensayo de LA actividad fosfatasa.
El siguiente ensayo se puede usar para evaluar la actividad serina/treonina osfatasa d(PTPasa) de una proteína de 30 fusión de albúmina de la invención.
Con el fin de analizar la actividad de serina / treonina fosfatasa (PTPasa), se pueden usar ensayos muy conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de serina / treonina fosfatasa (PSPasa) de una proteína de fusión de la albúmina de la invención puede medirse usando un kit de ensayo PSPasa de New England Biolabs, Inc. La proteína básica de mielina (MyBP), un sustrato para PSPasa, se fosforila en los residuos de serina y treonina con 35 la proteína quinasa dependiente de AMPc en presencia de [32P] ATP. La actividad de la serina/ treonina fosfatasa se determina después mediante la medición de la liberación de fosfato inorgánico a partir de la MyBP marcada con 32P.
Ejemplo 58: Interacción de las serina / treonina fosfatasas con otras proteínas
Las proteínas de fusión de la invención que tienen actividad serina / treonina fosfatasa (por ejemplo, tal como se determina en el Ejemplo 102) son útiles, por ejemplo, como herramientas de investigación para la identificación, 40 caracterización y purificación de proteínas adicionales de interaccionan o proteínas receptoras, u otras proteínas de la vía de transducción de señales. Brevemente, una proteína de fusión de la invención marcada es útil como reactivo para la purificación de moléculas con las que interacciona. En una realización de purificación por afinidad, una proteína de fusión de albúmina de la invención está acoplada covalentemente a una columna de cromatografía. El extracto sin células derivado de supuestas células diana, tales como como células neuronales o hepáticas, se hace 45 pasar por la columna, y las moléculas con la afinidad apropiada se unen a la proteína de fusión. El complejo de la proteína de fusión se recupera de la columna disociada, y la molécula recuperada se somete a secuenciación proteia por el extremo N. Esta secuencia de aminoácidos se usa después para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados para clonar el gen relevante a partir de una biblioteca de ADNc apropiada. 50
Ejemplo 59: Ensayo de actividad heparanasa.
En la técnica se conocen numerosos ensayos que s epueden usar para analizar la actividad heparanasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención. En un ejemplo, la actividad heparanasa de una proteína de fusión de albúmina de la invención, se ensaya como se describe por Vlodavsky et al., (Vlodavsky et al., Nat.Med, 5:. 793-802 (1999)), Brevemente, lisados celulares, medio acondicionado, células intactas (1 x 106células por placa de 35 mm), 55 sobrenadante de cultivo celular, o la proteína de fusión purificada se incuban durante 18 horas a 37 ° C, pH 6.2 a 6.6, con ECM marcada con 35S o con proteoglicanos I mázimos derivados de ECM soluble. El medio de incubación
se centrifuga y el sobrenadante se analiza por filtración en gel en una columna de Sepharose CL-6B (0,9 x 30 cm).Las fracciones se eluyeron con PBS y se mide su radiactividad.Degadation fragmentos de cadenas laterales de sulfato de heparán se eluyen de Sepharose 6B a 0,5 <Kav<0,8 (pico II).Cada experimento se hace al menos tres veces.Fragmentos de degradación correspondientes a "pico II", como se describe por Vlodavsky et al., Es indicativo de la actividad de una proteína de fusión de la albúmina de la invención en la escusión de heparán sulfato. 5
Ejemplo 60: Inmovilización de biomoléculas.
Este ejemplo proporciona un procedimiento para la estabilización de una proteína de fusión de albúmina de la invención en construcciones de bicapas lipídicas de células no huésped (véase, por ejemplo, Bieri et al., Nature Biotech 17:11051108 (1999), incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad) que se pueden adaptar para el estudio de las proteínas de fusión de la invención en los diversos ensayos funcionales descritos 10 anteriormente. Brevemente, se usa química específica de carbohidratos para biotinilación para confinar una marca de biotina a una proteína de fusión de albúmina de la invención, de modo que permite una orientación uniforme tras la inmovilización. Una solución 50uM de una proteína de fusión de albúmina de la invención en mebranas lavadas se incuba en NaIO4 20 mM y 1,5 mg/ml (4mM) de BACH o 2 mg/m1 (7,5mM) de biotina-hidrazida durante 1 hora a temperatura ambiente (volumen de reacción 150 ul). Después, se dializa la muestra Pierce Slidealizer Cassett, corte 15 a 10 kDa; Pierce Chemical Co., Rockford IL) a 4 ºC primero durante 5 h, intercambiando el tampón tras cada hora y, por último, durante 12 horas contra 500 ml de tampón R (NaCl 0,15 M, MgCl2 1 mM, fosfato sódico 10 mM , pH 7) Justo antes de añadir a una cubeta, la muestra se diluye a 1:5 en tampón ROG50 (tampón R suplementado con octilgucósido 50 mM).
Ejemplo 61: Ensayo de la actividad metaloproteinasa. 20
Las metaloproteinasas son hidrolasas de péptidos que usan iones metálicos, tales como Zn2 +, como mecanismo catalítico. La atividad de la metaloproteinasa de una proteína de fusión de albúmina de la presente invención se puede ensayar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Se proporcionan los siguientes procedimientos de ejemplo:
Proteólisis de la alfa-2-macroglobulina 25
Para confirmar la actividad proteasa, una proteína de fusión purificada de la invención se mezcla con el sustrato alfa-2-macroglobulina (0,2 unidades / ml; Boehringer Mannheim, Alemania) en tampón de ensayo 1x (50 mM HEPES, pH 7,5, NaCl 0,2 M, 10 mM CaCl2, 25 mM de ZnCl2y 0,05 % de Brij-35) y se incubó a 37 ° C durante 1-5 días.La tripsina se usa como control positivo.Los controles negativos sólo contienen alfa-2-macroglobulina en tampón de ensayo.Las muestras se recogen y se hirvieron en tampón de muestra de SDS-PAGE que contenía 5 % de 2-mercaptoetanol 30 durante 5 min, y luego se cargó en 8 % de gel de SDS-poliacrilamida.Después de la electroforesis, las proteínas se visualizaron por tinción con plata.La proteólisis es evidente por la aparición de bandas de peso molecular inferior en comparación con el control negativo.
Inhibición de la proteolisis alfa-2-macroglobulina por los inhibidores de las metaloproteinasas
Inhibidores de la metaloproteinasa conocidos (quelantes de metales (EDTA, EGTA, Y HgCl2), Inhibidores de la 35 metaloproteinasa de péptidos (TIMP-1 y TIMP-2), inhibidores de MMP y pequeñas moléculas comerciales) también se pueden usar para caracterizar la actividad proteolítica de una proteína de fusión de albúmina de la invención.Tres inhibidores de MMP sintéticos que se pueden usar son MMP inhibidor I, [IC50= 1,0 M contra la MMP-1 y MMP-8; IC50= 30 M contra MMP-9; IC50= 150 M contra MMP-3]; MMP-3 (estromelisina-I) inhibidor I [IC50= 5 M contra MMP-3], y MMP-3 inhibidor II [KI= 130 nM frente a MMP-3]; inhibidores disponibles a través de Calbiochem, Catalog # 40 444250, 444218, y 444225, respectivamente).Brevemente, diferentes concentraciones de los inhibidores de MMP pequeñas moléculas se mezclan con una proteína de fusión purificado de la invención (50μg / ml) en 22,9 l de tampón 1x HEPES (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M, 10 mM CaCl2, 25 mM de ZnCl2y 0,05 % Bnj-35) y se incubaron a temperatura ambiente (24 ° C) durante 2-hr, a continuación, se añade y se incuba a 37 ° C durante 20 hr-7.1 l de sustrato de alfa-2-macroglobulina (0,2 unidades / ml) .Las reacciones se detuvieron mediante la adición 45 de tampón de muestra 4x y immediatdy hervida durante 5 minutos.Después de SDS-PAGE, las bandas de proteína se visualizaron por tinción con plata.
Ensayo de escisión de sustratos peptídicos fluorogénicos sintéticos
La especificidad de sustrato para las proteínas de fusión de la invención con actividad de metaloproteinasas demostrado puede determinarse usando técnicas knonw en la técnica, tales como el uso de sustratos peptídicos 50 fluorogénicos sintéticos (de Bachem Bioscience Inc).Sustratos de prueba incluyen, M-1985, M-2225, M-2105, M-2110 y M-2255.Los cuatro primeros son sustratos de las MMP y el último es un sustrato de factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) la enzima de conversión (TACE).Estos sustratos se preparan Preferentemente en 1: 1 sulfóxido de dimetilo (DMSO) y agua.Las soluciones de reserva son 50-500 M. Ensayos fluorescentes se realizan mediante el uso de un espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS 50B equipado con un baño de agua a temperatura 55 constante.El λ de excitación es 328 nm y la emisión es λ 393 nm.Brevemente, el ensayo se lleva a cabo mediante la incubación de 176 l de tampón 1x HEPES (NaCl 0,2 M, 10 mM CaCl2, 0,05 % de Brij-35 y 50 mM HEPES, pH 7.5) con 4 l de solución de sustrato (50 mM) a 25 ° C durante 15 minutos, y después añadiendo 20 l de una proteína de
fusión purificada de la invención en el ensayo de cuvett.La concentración final de 1 mM es subestado. Velocidades de hidrólisis iniciales son monitoreados por 30 min.
<210> 322
<211> 772
<212> PRT 5
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (240) 10
<223> Xaa es igual a cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural
<220>
<221> SITE
<222> (270) 15
<223> Xaa es igual a cualquiera de los L-aminoácidos de origen natural
<400> 322
<210> 817
<211> 106
<212> ADN 5
<213> Homo sapiens
<400> 817
10
<210> 818
<211> 55
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15
<400> 818
gcgcgcatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcgtt tcggaggtaa cctgt 55
<210> 1037
<211> 1782
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1037
<210> 1038
<211> 585 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1038
<210> 1052
<211> 46 5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> primer_bind 10
<223> Cebador directo útil para insertar la proteína terapéutica en el vector pC4:HSA
<220>
<221> misc_feature
<222> (29) 15
<223> n es igual a a,t,g, o c
<220> .
<221> misc_feature
<222> (30) 20
<223> > n es igual a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
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<221> misc_feature
<222> (32) 10
<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
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<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
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<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (35) 25
<223n es igual a a,t,g, o c
<220>
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<222> (36) 30
<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
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<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
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<223> n es igual a a,t,g, o c
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<222> (39)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> n es igual a a,t,g, o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
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<222> (45)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 5
<222> (46)
<223> n es igual a a, t, g o c
<400> 1052
ccgccgctcg aggggtgtgt ttcgtcgann nnnnnnnnnn nnnnnn 46
<210> 1053
<211> 55
<212> ADN 15
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> primer_bind
<223> Cebador inverso útil para insertar la proteína terapéutica en el vector pC4:HSA 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (38) 25
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (39) 30
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (40) 35
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 5
<222> (49)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 10
<222> (50)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 15
<222> (51)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 20
<222> (52)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 25
<222> (53)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 30
<222> (54)
<223> n es igual a a, t, g o c
<220>
<221> misc_feature 35
<222> (55)
<223> n es igual a a, t, g o c
<400> 1053
agtcccatcg atgagcaacc tcactcttgt gtgcatcnnn nnnnnnnnnn nnnnn 55
<210> 1107
<211> 11
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> misc_feature
<222> (1) a (11)
<223> Secuencia Kozak
<400> 1107
ccgccaccat g 11
<210> 1108 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 1112 25
<211> 733
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1112 30
<210> 1116
<211> 271
<212> DNA 5
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Protein_Bind
<223> Promotor sintético para usar en ensayos biológicos; inclye sitios de unión a GAS hallados en el promotor de 10 IRF1 (Rothman et al., Immunity 1:457 - 468 (1994)).
<400> 1116
15
<210> 1117
<211> 32
<212> ADM
<213> Secuencia artificial 20
<220>
<221> Primer_Bind
<223> cebador sintético complementario a la secuencia promotora de EGR-1 genómica humana (sakamoto et al., oncogene 6:867 - 871 (1991)); incluye un sitio de restricción Xho I. 25
<400> 1117
gcgctcgagg gatgacagcg atagaacccc gg 32
<210> 1118
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer-Bind
<223> cebador sintético complementario a la secuencia promotora de EGR-1 genómica humana (sakamoto et al., oncogene 6:867 - 871 (1991)); incluye un sitio de restricción Xho I.
<400> 1118
gcgaagcttc gcgactcccc ggatccgcct c 31
<210> 1119 15
<211> 12
<212>ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1119 20
ggggactttc cc 12
<210> 1120
<211> 73 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Primer_Bind 30
<223> cebador sintético con 4 copias en tándem del sitio de unión a NF-KB (GGGGACTTTCCC), 18 nucleótidos complementarios al extremo 5’ de la secuencia del promotor temprano de SV40 y un sitio de restricción XhoI .
<400> 1120
<210> 1121
<211> 256
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<221> Protein_Bind
<223> Promotor sintético para usar n ensayos biológicos; incluye sitios de unión de NF-KB.
<400> 1121 10
<210> 1122
<211> 121 15
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1122
20

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un vector de expresión que codifica una proteína de fusión de albúmina IFN-beta, en donde la proteína de fusión tiene la proteína IFN-beta de longitud completa que incluye la secuencia líder de IFN-beta nativa fusionada al extremo amino de la forma madura de la seroalbúmina humana, y en donde el vector de expresión es el vector de expresión NSO pEE12. 5
  2. 2. El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido codificado por el vector de expresión comprende los aminoácidos 1 a 772 de la SEC ID Nº 322.
  3. 3. Una célula huésped de mamífero que comprende un vector de expresión de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2.
  4. 4. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de albúmina, que comprende: 10
    (a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 3 en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión de la albúmina; y
    (b) aislar la proteína de fusión de la albúmina.
  5. 5. La proteína de fusión de albúmina-interferón beta madura definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6. La proteína de fusión de albúmina-interferón de la reivindicación 5 para uso en medicina, por ejemplo para uso en 15 el tratamiento de la esclerosis múltiple; cáncer, tal como melanoma, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, un sarcoma, un linfoma, cáncer de cerebro, glioma, displasia cervical, leucemia, preleucemia, mieloma múltiple; trastornos de la médula ósea; trastornos de los huesos; tumores malignos y trastornos hematológicos; infecciones bacterianas; trombocitopenia; infecciones virales, tales como infecciones por el VIH, infecciones por hepatitis, infecciones por 20 papilomavirus humano, infecciones por el virus del herpes simple; fibrosis pulmonar; degeneración macular; enfermedad de Crohn; trastornos neurológicos; artritis; colitis ulcerosa; osteoporosis; osteopenia; fibromialgia; síndrome de Sjögren; síndrome de fatiga crónica; fiebres, como las fiebres hemorrágicas virales; diabetes, tales como diabetes insípida y diabetes mellitus; hiperglucemia; resistencia a la insulina, deficiencia de insulina; hiperlipidemia; hipercetonemia; afecciones relacionadas con la diabetes, incluyendo, entre otras, obesidad, 25 cardiopatías, hiperglucemia, infecciones, retinopatía, y/o úlceras; trastornos metabólicos; trastornos inmunitarios; obesidad; trastornos vasculares; supresión de peso corporal; supresión del apetito; Síndrome X.
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