ES2594621T3

ES2594621T3 - Preparación de irinotecán

Info

Publication number: ES2594621T3
Application number: ES05745848.1T
Authority: ES
Inventors: Keisuke Yoshino; Shigenori Nozawa; Masashi Isozaki; Seigo Sawada; Ikuo Kato; Takeshi Matsuzaki
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2025-05-31
Also published as: EA200602246A1; US7846473B2; GEP20094620B; EA011612B1; TWI362931B; AP2006003837A0; AP2255A; CR8768A; KR100889139B1; NO20066074L; ECSP067041A; CA2567857A1; WO2005117878A1; JP4885715B2; UA85099C2; EP1752150A4; EP1752150A1; JPWO2005117878A1; AR049137A1; EP1752150B1

Abstract

Una formulación de irinotecán que incluye un liposoma formado por una membrana de tipo bicapa lipídica que contiene un fosfolípido como componente de membrana principal, en la que irinotecán y/o una sal del mismo se encapsula en una concentración de al menos 0,1 mol/mol (mol de fármaco/mol de lípidos membranales totales), en la que solo la superficie externa del liposoma se modifica con un agente modificador de superficie que contiene un polímero hidrófilo.

Description

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carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantano, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol esteárico, ácido esteárico, seroalbúmina humana (SAH), manitol, sorbitol, lactosa, TFS, un polímero biodegradable, un medio libre de suero, un tensioactivo aceptable como aditivo farmacéutico, un tampón de pH fisiológico aceptable en un cuerpo vivo, o similares. Un aditivo que se va a utilizar no es limitado, pero puede seleccionarse entre los aditivos descritos anteriormente en función de su forma farmacéutica apropiada o en combinación con otro aditivo.

En la presente invención, una formulación de irinotecán que contiene tales aditivos puede proporcionarse como una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica de la presente invención puede almacenarse por un método general, por ejemplo, en un refrigerador a una temperatura de 0 a 8 ºC o a temperatura ambiente comprendida entre 1 a 30 ºC.

En la presente invención, un liposoma adopta una forma en la que CPT-11 se encapsula. Se sabe que un anillo de α-hidroxilactona en CPT-11 es conocido por hidrolizarse en un intervalo de pH superior a un estado neutro. Por lo tanto, en el liposoma de la presente invención, se requiere que la fase acuosa interna del liposoma se mantenga en un pH ácido para suprimir la hidrólisis del anillo de α-hidroxilactona independientemente de si CPT-11 se recoge en la bicapa lipídica o en la fase acuosa interna.

Un lípido es conocido generalmente por hidrolizarse en función del valor de la temperatura o pH. En particular, se conocen ésteres de carboxilato de ácidos grasos en las posiciones sn-1 y sn-2 por hidrolizarse y descomponerse fácilmente en un lisolípido y un ácido graso (Grit et al., Chem. Phys. Lipids 64, 3-18, 1993). Tales productos descompuestos alteran la composición de la membrana lipídica convencional, y se mejora la permeabilidad de la membrana lipídica, que origina daños en la estabilidad de los liposomas. Por lo tanto, cuando la fase acuosa interna se mantiene ácida, el pH en la fase acuosa externa es deseablemente de manera aproximada neutro desde el punto de vista de la estabilidad lipídica.

Una situación en la que estas dos condiciones contrarias se restringen más severamente es una etapa de introducción del fármaco. En la etapa de introducción del fármaco, se requiere que la mezcla se caliente hasta al menos la temperatura de transición de fase de la membrana lipídica, que favorece significativamente la hidrólisis lipídica. Con el fin de suprimir la hidrólisis lipídica, es deseable que el pH en la fase acuosa externa se ajuste a aproximadamente neutro. No obstante, cuando el pH en la fase acuosa externa se ajusta a aproximadamente neutro, se favorece la hidrólisis de un anillo de α-hidroxilactona en CPT-11. En vista de estas dos condiciones contrarias, el valor de pH en la fase acuosa externa en la etapa de introducción del fármaco es preferentemente 4,0 a 8,0, más preferentemente 4,0 a 7,0, más preferentemente 5,0 a 7,0.

Para completar una formulación de irinotecán altamente incorporada de la presente invención, se forma un liposoma transportador y, entonces un método referido como el método de carga remota se lleva a cabo para introducir el fármaco utilizando un gradiente iónico en el interior/fuera de la membrana liposomal. El método de carga remota puede utilizarse para un fármaco común que puede existir en un estado de carga en el caso en el que el fármaco se disuelva en un medio acuoso apropiado. Cuando un gradiente iónico se forma en el interior/fuera del liposoma, el fármaco puede encapsularse permeabilizando la membrana liposomal en función del gradiente formado.

Ejemplos de un gradiente iónico formado a través de la membrana liposomal incluyen un gradiente de concentración Na+/K+. Una técnica para la adición de un fármaco en un liposoma formado previamente por el método de carga remota para el gradiente de concentración Na+/K+ se describe en el documento US 5077056 (incorporado en el presente documento por referencia), que puede llevarse a cabo con referencia a la descripción.

En la presente invención, ejemplos preferentes del gradiente iónico incluyen un gradiente de concentración de protones, y se ejemplifica un modo de un gradiente de pH formado ajustando el valor del pH del interior de la membrana (fase acuosa interna) más bajo que el valor del pH del exterior de la membrana (fase acuosa externa). En concreto, el gradiente de pH puede estar formado en base a un gradiente de concentración de iones amonio y/o un gradiente de concentración de un compuesto orgánico que posee un grupo amino que puede protonarse.

Un ejemplo específico de un método de encapsulación de un fármaco (irinotecán o una sal del mismo) en un liposoma mediante el gradiente de concentración de ion amonio se describirá a continuación. En primer lugar, se forma previamente un liposoma en un tampón acuoso que contiene 0,1 a 0,3 M de una sal de amonio, y el medio externo se intercambia por un medio que no contiene iones amonio (por ejemplo, una solución de sacarosa), para formar así un gradiente de ion amonio en el interior/fuera de la membrana liposomal. Los iones amonio internos se equilibran con amoníaco y protones, y el amoníaco penetra la membrana lipídica y se dispersa para eliminar el amoníaco del liposoma interno. Con la eliminación de amoníaco, la porción equilibrada en el liposoma se cambia a la formación de protones. Como resultado, los protones se acumulan en el liposoma, y un gradiente de pH se forma en el interior/fuera del liposoma. Cuando se añade un fármaco a un dispersante liposomal que posee tal gradiente de pH, el fármaco se incorpora en el liposoma.

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Una sal de amonio capaz de hacer el gradiente de concentración de ion amonio incluye, pero no se limita particularmente a, sulfato de amonio, hidróxido de amonio, acetato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, citrato de amonio, succinato de amonio, lactobionato de amonio, carbonato de amonio, tartrato de amonio, y oxalato de amonio.

Tenga en cuenta que una técnica en sí para la introducción de un fármaco en un liposoma formado previamente por el método de carga remota para un gradiente de concentración de iones amonio se describe en el documento 5192549 (incorporado en el presente documento por referencia), que puede llevarse a cabo con referencia a la descripción.

De modo conveniente, el compuesto orgánico que posee un grupo amino que puede protonarse tiene un peso molecular bajo. Ejemplos específicos del mismo incluyen, entre otros, metilamina, etilamina, propilamina, dietilamina, etilendiamina, y similares.

En la presente invención, un modo adecuado es que irinotecán o una sal del mismo se incorpore por el método de carga remota mediante el gradiente de concentración de iones amonio.

Una formulación de irinotecán de la presente invención se forma mediante la incorporación de irinotecán o una sal del mismo en el transportador anteriormente descrito a una concentración superior a 0,07 mol/mol (mol de fármaco/mol de lípidos totales de la membrana), preferentemente superior a 0,1 mol/mol.

En la presente invención, el término "encerrar" significa un estado en el cual un fármaco está encapsulado en un transportador. El término también significa un estado en el cual parte o la totalidad de moléculas del fármaco se incluyen en una capa de un lípido que es un componente del transportador. Un transportador de la presente invención se purifica por un método comúnmente utilizado (tal como, filtración en gel, diálisis, separación de membrana, o centrifugación), para eliminar de este modo los fármacos no descargados en el transportador.

Se proporciona un transportador tras la etapa de eliminación de los fármacos no descargados. Por lo tanto, puede producirse un gradiente de concentración del fármaco entre el interior y el exterior del transportador a través de una bicapa lipídica. Preferentemente, el transportador de la presente invención no contiene fármacos libres fuera de la bicapa lipídica tras la preparación del transportador. Así pues, los fármacos encerrados en el transportador se liberan al área externa. El transportador de la presente invención con fármacos encerrados llega a un sitio diana, con el resultado de que administra los fármacos encerrados en el sitio diana. La administración de los fármacos al sitio diana puede lograrse recogiendo los fármacos incorporados en el transportador en el sitio diana o al ejercer el efecto de los fármacos en el sitio diana o próximo al mismo incluso si los fármacos no se recogen en el sitio diana.

En la presente invención, el término "liberación" significa que un fármaco encerrado en un transportador se dispersa hacia el exterior de una vesícula cerrada atravesando una membrana lipídica que forma el transportador o cambiando parte de la estructura de la membrana lipídica. Cuando el clorhidrato de irinotecán se metaboliza en plasma en SN-38, que es un metabolito activo y expuesto en un sitio diana a una alta concentración durante mucho tiempo, se exhibe una fuerte actividad antineoplásica, por lo que es importante para controlar la liberación. La velocidad de liberación de una formulación de irinotecán en plasma puede ser controlada ajustando la cantidad de colesterol, y se espera un efecto preferente ajustando la cantidad de colesterol. El término "velocidad de liberación" significa una velocidad de un fármaco que exuda hacia el exterior de una vesícula cerrada a partir de los componentes transportadores encapsulados del transportador y el clorhidrato de irinotecán a un fármaco incorporado en el transportador (relación en peso o relación molar). La frase "velocidad de liberación es baja" significa que la cantidad de un fármaco que exuda hacia el exterior de una vesícula cerrada por unidad de tiempo es pequeña.

En la presente invención, el término "sitio diana" significa un sitio específico en el que un fármaco encapsulado en un transportador se libera y actúa, y significa una célula, tejido, órgano o el órgano interno que se especifica en cada sitio, y un interior del mismo. El sitio diana, tal como una célula, tejido, órgano o el órgano interno, y un interior del mismo puede ser un sitio a tratar con un fármaco. Cuando un fármaco liberado se expone al sitio, se ejerce un efecto. Ejemplos del sitio diana incluyen, pero no se limitan particularmente a, un tumor.

Ejemplos de un tumor a tratar incluyen, pero no se limitan particularmente a, un tumor sólido. Ejemplos específicos de los mismos incluyen cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de intestino grueso, cáncer rectal, cáncer pancreático, cáncer de hígado, cáncer de laringe, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino, y cáncer de ovarios. El sitio diana es una célula tumoral, tejido, órgano o el órgano interno, un interior de los mismos, y similares. Por lo tanto, en la presente invención, una enfermedad significa el tumor descrito anteriormente, y se espera que un fármaco ejerza un efecto antineoplásico en él.

En la presente invención, el término "exposición" significa que un fármaco liberado en el exterior de un transportador actúa sobre el área exterior. Específicamente, cuando un fármaco liberado se aproxima y contacta con un sitio diana, el fármaco ejerce su efecto antineoplásico como su acción. Cuando el fármaco actúa sobre el sitio diana, actúa por vía tópica en una célula en un ciclo celular en el cual la síntesis de ADN se lleva a cabo en el sitio diana,

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de modo que se ejerce un efecto esperado. Para ejercer un efecto tal, debe mantenerse un equilibrio entre la velocidad de liberación de un fármaco de un transportador y la retención en sangre del transportador.

Un transportador de la presente invención libera irinotecán y/o una sal del mismo a una velocidad de liberación preferente, y el irinotecán liberado y/o una sal del mismo se metaboliza adicionalmente en SN-38, que es un metabolito activo. La presente invención se utiliza para exponer SN-38 a un sitio diana predeterminado durante un tiempo prolongado. Por lo tanto, en la presente invención, con el fin de prevenir y/o tratar una enfermedad padecida por un huésped, la administración sistémica o tópica al huésped (paciente) puede llevarse a cabo parenteralmente mediante la administración de un transportador en el cual una cantidad eficaz de irinotecán y/o una sal del mismo se encierra para liberar la cantidad eficaz de irinotecán y/o una sal del mismo en el huésped o para exponer una cantidad eficaz de SN-38 a un sitio diana a una concentración alta durante un tiempo prolongado. Ejemplos del huésped como administración diana incluyen mamíferos, preferentemente seres humanos, monos, ratones, animales de granja, y similares.

Ejemplos de una vía de administración parenteral a seleccionar incluyen inyección intravenosa (I.V), tal como goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, e inyección subcutánea, y un método de administración puede seleccionarse apropiadamente en función de la edad o síntoma de un paciente. Un transportador de la presente invención se administra a un paciente que padece una enfermedad en una cantidad suficiente para curar el síntoma de la enfermedad o aliviar, al menos, parte del síntoma. Por ejemplo, una dosis eficaz de un fármaco a encapsular en un transportador se selecciona a partir de un intervalo de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal por día. Sin embargo, la dosis del transportador de la presente invención no está limitada a ello. Para el periodo de administración, la administración puede llevarse a cabo después de la aparición de la enfermedad, o puede llevarse a cabo de forma profiláctica para aliviar el síntoma hasta la aparición en el caso en el que se prevé la aparición de la enfermedad. Además, un periodo de administración adecuado puede seleccionarse en función de la edad o síntoma de un paciente.

Ejemplos específicos del método de administración incluyen la administración de una composición farmacéutica utilizando una jeringa o goteo. Mientras tanto, se inserta un catéter en un cuerpo (por ejemplo, lumen o vaso sanguíneo) de un paciente o un huésped para guiar su borde en torno a un sitio diana, y la composición puede administrarse a través del catéter de un sitio diana predeterminado o cerca del sitio o un sitio desde el que se espera que la sangre fluya hacia el sitio diana.

Como se describe en los Ejemplos, cuando se determinó la velocidad de liberación de un fármaco encerrado en un transportador de la presente invención, se descubrió que la velocidad de liberación era baja. Para calcular la velocidad de liberación, el transportador de la presente invención se precipita por centrifugación, y se determina la cantidad de fármaco presente en el sobrenadante y en el transportador.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle a modo de ejemplos, aunque la presente invención no se limita a estos ejemplos y ejemplos de ensayo.

Se determinaron de la siguiente forma cada concentración y tamaño de partículas de un liposoma encapsulado en el fármaco preparado en cada ejemplo.

 Concentración de fosfolípido (mg/ml): una concentración de fosfolípido (FCSH) en una dispersión liposomal, que se determinó utilizando un kit para la determinación de fosfolípido (Phospholipid C-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

 Concentración de lípidos totales (mol/l): una concentración en mol total (mM) de un lípido mezclado que es un componente membranal, que se calcula a partir de la concentración del fosfolípido anterior. Los lípidos totales contienen componentes lipídicos en un agente modificador de superficie preparados como un lípido mezclado pero no contienen un lípido (en los ejemplos, PE (fosfatidiletanolamina) en PEG-PE o col (colesterol) en col-PEG) en un derivado de PEG para la introducción de PEG.

 Concentración del fármaco (mg/ml): la concentración se determinó de la siguiente manera: la formulación obtenida anteriormente se diluyó 40 veces con solución salina fisiológica, y se añadieron 2 ml de metanol a 50 µl de la mezcla, seguido de la medición de una intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 360 nm, longitud de onda de fluorescencia: 435 nm) de la mezcla utilizando un espectrofluorímetro. La concentración de clorhidrato de irinotecán encerrado se representa como "cantidad de fármaco (mg)/cantidad de formulación total (ml)".

 Cantidad de fármaco incorporada (relación molar del fármaco/lípidos totales): la concentración de clorhidrato de irinotecán encerrado en un transportador se representa como una relación molar del fármaco/lípidos totales, que se calcula a partir de una relación de la concentración del fármaco a la concentración de lípidos.

 Tamaño de partículas (nm): 20 µl de una dispersión liposomal se diluyeron en 3 ml con solución salina fisiológica, y un tamaño medio de partículas se determinó por Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments).

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Tabla 1

Ejemplo de preparación: Composición membranalinicial (relación molar) Concentración lipídica Cantidad defármaco inicial Concentración defármaco Cantidad defármaco soportado Tamaño departículas

Lípido: PEG-PE Fosfolípido(FCSH) Lípidostotales CPT-11/FCSHp/p mg/ml Mol de fármaco/molde lípido total nm

FCSH/Col: mg/ml mol/l

Ejemplo de preparación 1: 54/46 0,75 12,6 0,03 0,2 2,41 0,11712 120,9

13,73: 0,032 0,2 0,29 0,013 120,8

Ejemplo 1 de preparación comparativo

11,37: 0,027 0,1 1,32 0,073 125,2

Ejemplo de preparación 2-(1)-(2)-(3)-(4)

8,98: 0,021 0,2 1,88 0,132 124,8

7,08: 0,017 0,4 2,99 0,266 123,1

4,54: 0,011 0,8 2,96 0,41 126,5

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(Ejemplo de ensayo 1) Estabilidad acelerada de la formulación a 37 ºC

Cada formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 1 se calentó a 37 ºC durante un periodo predeterminado. Después del calentamiento, la formulación de CPT-11 se diluyó 20 veces añadiendo solución salina fisiológica, y se realizó ultracentrifugación (1 X 105 g, 2 horas, 10 ºC) para precipitar una formulación de CPT-11 (liposoma encapsulado con clorhidrato de irinotecán). Se determinó la cantidad de clorhidrato de irinotecán presente en el sobrenadante para calcular la velocidad de liberación (%) del clorhidrato de irinotecán de la formulación de CPT-11. Los resultados se muestran en la Fig. 1.

Se descubrió que la formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 1 de preparación comparativo posee la velocidad de liberación de clorhidrato de irinotecán de aproximadamente 60 % tras el calentamiento a 37 ºC durante 7 días, mientras que se descubrió que la formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo de preparación 1 por el método de carga remota libera poco clorhidrato de irinotecán incluso después del calentamiento a 37 ºC durante 7 días. Por lo tanto, se esclareció que la encapsulación de clorhidrato de irinotecán en un liposoma mediante el método de carga remota permite la preparación de una formulación de CPT-11 altamente soportada que posee una excelente estabilidad de formulación.

(Ejemplo de ensayo 2) Estabilidad de la formulación a 37 ºC

Cada formulación de CPT-11 preparada en el Ejemplo 2 se calentó a 37 ºC durante un periodo predeterminado. Después del calentamiento, para la formulación de CPT-11, se determinó la velocidad de liberación de clorhidrato de irinotecán de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1. Se descubrió que la velocidad de liberación de cada formulación de CPT-11 era 1 % o menos incluso después del calentamiento a 37 ºC durante 14 días.

Por lo tanto, se esclareció que la velocidad de liberación de la formulación de CPT-11 preparada por el método de carga remota no se ve afectada en gran medida por la cantidad de fármaco soportado (relación de fármaco/lípidos totales), e incluso una formulación de CPT-11 extremadamente muy encapsulada posee excelente estabilidad de formulación.

[Ejemplo 3]

Un liposoma que posee una composición diferente de la membrana en el Ejemplo de preparación 1 se utilizó como transportador para preparar una formulación de CPT-11. Específicamente, el procedimiento para la encapsulación de clorhidrato de irinotecán se llevó a cabo por el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1 utilizando un liposoma PEG-PE post-introducido (Ejemplo de preparación 3) o un liposoma PEG-PE pre-introducido (Ejemplo 1 de preparación referencial), incluyendo el lípido mezclado mostrado a continuación como componente membranal.

(Ejemplo de preparación 3)

(1): Preparación del lípido mezclado: se disolvieron 1,5317 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (FCSH), 0,6419 g de colesterol (Col), y 0,005 g de rodamina dihexadecanoil fosfatidiletanolamina (R-DHPE) en 50 ml de tbutanol calentado a 60 ºC, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido por liofilización, para preparar así un lípido mezclado con una relación molar de FCSH:Col:R-DHPE = 54:46:0,1.

(2): Preparación del liposoma: se llevó a cabo la adición de 10 ml de una solución de sulfato de amonio de 250 mM, al agitarse con un agitador vórtex, y filtrándose con un filtro unido a una extrusora (0,2 µm X 5 veces, 0,1 µm X 10 veces) de la misma manera que el Ejemplo de preparación 1, excepto que se utilizaron 0,37 g del lípido mezclado preparado anteriormente, a fin de obtener una dispersión liposomal. Posteriormente, la sustitución en fase acuosa externa se llevó a cabo con una solución de 10 mM de histidina/sacarosa al 10 % (pH 6,0).

(3): Introducción de PEG-PE: a la dispersión liposomal resultante se añadió una solución de polietilenglicol 2000fosfatidiletanolamina (PEG2000-PE) en agua destilada (36,74 mg/ml) (correspondiente a 2,8 % en moles de la cantidad de lípidos totales), y la mezcla se calentó a 60 ºC durante 30 minutos, para introducir de ese modo PEG2000-PE.

(4): De la misma manera que la encapsulación del fármaco en el Ejemplo de preparación 1, se añadieron 10 mg/ml de una solución de CPT-11/agua de OI a la dispersión liposomal en una cantidad requerida para CPT-11/FCSH = 0,2 (p/p) para introducir clorhidrato de irinotecán. Posteriormente, la mezcla se enfrió en hielo, y los fármacos no encapsulados se eliminaron con una solución de 10 mM de histidina/sacarosa al 10 % (pH 6,5). La formulación de CPT-11 resultante se muestra en la Tabla 2.

(Ejemplo 1 de preparación referencial)

Se repitió el procedimiento en el Ejemplo de preparación 3, excepto que PEG2000-PE a añadir en el Ejemplo de preparación 3 (3) había sido añadido previamente al lípido mezclado como componente membranal para preparar un liposoma que posee PEG-PE disperso a ambos lados de las membranas internas y externas, para preparar de ese modo una formulación de CPT-11. El procedimiento se muestra a continuación.

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(Ejemplo de preparación 4)

Se introdujo un fármaco por el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1, excepto que la sustitución en fase acuosa externa para la dispersión liposomal PEG-PE post-introducido se llevó a cabo utilizando una columna de gel que se había sometido a sustitución disolvente con una solución de 10 mM de MES/sacarosa al 10 % (pH 6,0) en el Ejemplo de preparación 1 (3), para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente soportada. Las composiciones se muestran en la Tabla 3.

(Ejemplo de preparación 5)

El procedimiento en el Ejemplo de preparación 4 se repitió excepto que el lípido mezclado a continuación preparado en (1) se utilizó como componente membranal, para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente soportada que contiene clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación.

(1) Preparación del lípido mezclado: 0,4561 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (FCSH), 0,1876 g de colesterol (Col), y 0,0563 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) se disolvieron en 25 ml de t-butanol calentado a 60 ºC, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido por liofilización, para preparar así un lípido mezclado de FCSH:Col:TRX-20 = 50:42:8 (relación molar).

El procedimiento del Ejemplo de preparación 1 (2) se repitió excepto que se utilizaron 0,700 g del lípido mezclado preparado anteriormente, para preparar de este modo una dispersión liposomal.

A la dispersión liposomal se añadieron 1,42 ml (correspondiente a 0,75 % en moles de la cantidad de lípidos totales del lípido mezclado) de una solución de PEG5000-PE en agua destilada (36,74 mg/ml) para introducir PEG5000-PE. Posteriormente, el fármaco se introdujo por el método de carga remota de la misma forma que el Ejemplo de preparación 1 (3), excepto que la sustitución en fase acuosa externa para la dispersión liposomal se llevó a cabo con una solución de 10 mM de MES/sacarosa al 10 % (pH 6,0), para preparar de ese modo una formulación de CPT-11 altamente soportada. La composición se muestra en la Tabla 3.

(Ejemplo de ensayo 4) Ensayo de estabilidad de la preservación a largo plazo a 4 ºC

Cada una de las formulaciones de CPT-11 obtenidas anteriormente se almacenó a 4 ºC durante un periodo predeterminado. Tras transcurrir el periodo de tiempo predeterminado, el tamaño de partículas de la formulación de CPT-11 y la velocidad de liberación (%) de clorhidrato de irinotecán de la formulación de CPT-11 se midieron de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

[Tabla 3]

Tabla 3

Ejemplo de preparación 4: Ejemplo de preparación 5

Composición de membrana inicial Relación molar: Lípido FCSH/Col FCSH/Col/TRX-20

54/46: 50/42/8

PEG-PE: 0,75 0,75

Concentración lipídica: Fosfolípido (FCSH) mg/ml 12,02 11,77

Lípido total mol/l: 0,028 0,03

Concentración de fármaco: mg/ml 2,67 2,41

Cantidad de fármaco soportado: mol de fármaco/mol de lípido total 0,136 0,119

Tamaño de partículas nm: Inicial 126,3 123,3

Tras 6 meses de almacenamiento: 122,2 125,4

Velocidad de liberación %: Inicial 0,63 0,12

Tras 6 meses de almacenamiento: 0,38 0,17

Para cada una de las formulaciones de CPT-11 preparadas en el Ejemplo 4 anterior, el tamaño de partículas y la velocidad de liberación no cambiaron incluso 6 meses después del almacenamiento a 4 ºC. Por lo tanto, se esclareció que cada formulación de CPT-11 preparada mediante el método de carga remota tiene una excelente

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Tabla 5

Composición de membrana inicial (relación molar): Concentración lipídica Concentración del fármaco Cantidad de fármaco soportado Tamaño de partículas

Lípido: PEG-PE Fosfolípido Lípidos totales mg/ml Mol de fármaco/mol de lípidos totales nm

FCSH:Col: TRX-20: mg/ml mol/l

Ejemplo de preparación 6: 50:42:8 0,75 18,36 0,047 3,66 0,115 134,3

(Ejemplo de preparación 7)

5 El procedimiento en el Ejemplo de preparación 4 se repitió excepto que el lípido mezclado preparado en (1) se utilizó a continuación como componente membranal, para preparar de este modo una formulación de CPT-11 altamente soportada que contiene clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina que es una sustancia cargada. El procedimiento se muestra a continuación.

10 (1) Preparación del lípido mezclado: 4,562 g de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (FCSH), 1,518 g de colesterol (Col), y 1,126 g de clorhidrato de 3,5-dipentadeciloxibenzamidina (TRX-20) se disolvieron en 50 ml de t-butanol calentado a 60 ºC, y la mezcla se enfrió en hielo, seguido por liofilización, para preparar así un lípido mezclado de FCSH:Col:TRX-20 = 50:34:16 (relación molar).

15 El procedimiento del Ejemplo de preparación 1 se repitió excepto que se utilizaron 7,207 g del lípido mezclado preparado anteriormente para preparar así un dispersante liposomal.

A la dispersión liposomal se añadió una solución de polietilenglicol 1600-colesterol (PEG1600-Col) en agua destilada (36,74 mg/ml) correspondiente a 2,0 % en moles de la cantidad de lípidos totales, y la mezcla se calentó a 60 ºC

20 durante 30 minutos para introducir PEG1600-Col. Posteriormente, el fármaco se introdujo por el método de carga remota de la misma manera que en el Ejemplo de preparación 1 (4), excepto que la sustitución en fase acuosa externa para la dispersión liposomal se llevó a cabo con una solución de 10 mM de MES/sacarosa al 10 % (pH 6,0), para preparar de ese modo una formulación de CPT-11 altamente encapsulada. La composición se muestra en la Tabla 6.

25 [Tabla 6]

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Tabla 7

Composición de membrana inicial (relaciónmolar): Concentración lipídica Concentración defármaco Cantidad defármaco soportado Tamaño departículas

Lípido: PEG-PE Fosfolípido Lípidostotales mg/ml Mol de fármaco/molde lípidos totales nm

FCSH:Col:TRX-20: mg/ml mol/l

Ejemplo de preparación 8: 50:42:8 0,75 19,04 0,049 3,22 0,098 121,6

Ejemplo de preparación 9: 54:46:0 0,75 19,66 0,045 3,28 0,107 119,9

23 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[Ejemplo 6]

Se examinó el efecto del valor del pH de una fase acuosa externa en la velocidad de encapsulación del fármaco.

(Ejemplo de preparación 10)

(1): Preparación del lípido mezclado: se pesaron 7,01 g de FCSH y 2,93 g de Col, y se añadieron 10 ml de etanol absoluto a ello. Entonces, estos se disolvieron con calentamiento a 68 ºC. Después de confirmar que se disolvieron completamente, se añadieron 90 ml de solución de sulfato de amonio (250 mM) a los mismos, y la mezcla se agitó con calentamiento a 68 ºC.

(2): Preparación del liposoma: tras la compleción de la agitación con calentamiento, la mezcla resultante se pasó a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm, cinco veces utilizando una extrusora calentada a 68 ºC. Posteriormente, el filtro se intercambió por un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm, y el filtrado se hizo pasar a través del filtro cinco veces. A partir de entonces, el filtro se intercambió de nuevo por un filtro con un tamaño de poro de 0,1 µm, y el filtrado se hizo pasar a través del filtro cinco veces. Introducción de PEG5000-DSPE: después de la extrusión, a la muestra se añadieron 20,4 ml de una solución PEG5000-DSPE (36,74 mg/ml) con el fin de determinar un contenido en PEG5000-DSPE predeterminado (% en mol), y la mezcla se agitó a 60 ºC durante 30 minutos, para introducir de este modo PEG5000-DSPE. Después de la introducción, la muestra se enfrió en hielo.

(3): Sustitución en fase acuosa externa: para cada muestra enfriada con hielo (8 ml), la sustitución en fase acuosa externa se llevó a cabo utilizando una columna de gel que se había sometido a la sustitución adecuada con cada una de las soluciones de la fase acuosa externa que posee diferentes valores de pH (pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0), concretamente, las soluciones de la fase acuosa externa que poseen pH 4,0, 5,0 (soluciones de 10 mM de ácido acético/sacarosa al 10 %), la solución de fase acuosa externa que posee pH 6,0 (solución de 10 mM de histidina/sacarosa al 10 %), las soluciones de la fase acuosa externa que poseen pH 7,0, 8,0, 9,0 (soluciones de 10 mM de Tris/sacarosa al 10 %). Después de la sustitución de fase acuosa externa, se determinó cada concentración de FCSH utilizando un kit de determinación de fosfolípidos para la dispersión liposomal. La cantidad de fosfolípidos totales (mM) se calculó a partir de la concentración de FCSH.

(4): Encapsulación del fármaco: se preparó una solución de clorhidrato de irinotecán (CPT-11)/agua de OI (agua purificada con membrana de ósmosis inversa) con una concentración de 10 mg/ml. La solución de clorhidrato de irinotecán se añadió a la dispersión liposomal en una cantidad de CPT-11/cantidad de lípidos totales = 0,16 (mol/mol) con respecto a la cantidad de lípidos totales (mM) anterior, y la mezcla se agitó a 60 ºC durante 60 minutos, para introducir de ese modo clorhidrato de irinotecán. Después de la introducción, la muestra se enfrió en hielo. Después de la encapsulación de clorhidrato de irinotecán, la dispersión liposomal se hizo pasar a través de una columna de gel que se había sometido a la sustitución con una solución de 10 mM de histidina/sacarosa al 10 % (pH 6,5) para eliminar los fármacos no encapsulados.

La concentración lipídica (FCSH), la concentración del fármaco (CPT-11) y el tamaño de partículas de cada formulación de CPT-11 obtenidas anteriormente se muestran en la Tabla 8.

(Eficiencia de encapsulación del fármaco)

Para cada formulación de CPT-11 obtenida anteriormente, la eficiencia de la encapsulación del fármaco (%) se calculó a partir de la relación de la concentración del fármaco final de CPT-11 con respecto a la concentración inicial del fármaco 0,16 (mol/mol) de acuerdo con la siguiente expresión.

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Los resultados se muestran en la Tabla 8 y en la Fig. 5. La tabla y la figura muestran lo siguiente: en el caso en que el valor de pH de la fase acuosa externa sea 8,0 o menos, la eficiencia de encapsulación de CPT-11 (%) es un valor extremadamente alto del 90 % o más, mientras que en el caso en el que el valor sea mayor a 8,0, la eficiencia de encapsulación de CPT-11 (%) disminuye.

[Tabla 8]

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Tabla 8

Fase acuosa externa pH: Concentración de FCSH (mg/ml) Concentración de CPT-11 (mg/ml) CPT-11 inicial/lípidos totales (mol/mol) CPT-11 final/lípidos totales (mol/mol) Eficiencia de encapsulación (%) Tamaño de partículas (nm)

4: 11,4 2,9 0,16 0,163 101,9 121,5

12,5: 3,2 0,159 99,4 123,8

5: 12,7 3,3 0,164 102,5 122,6

12,5: 3,1 0,157 98,1 124,0

6: 13,0 3,2 0,154 96,3 123,5

14,3: 3,4 0,151 94,4 122,9

7: 12,1 3,1 0,158 98,8 124,7

13,7: 3,2 0,148 92,5 122,4

8: 13,3 3,1 0,147 91,9 124,1

13,6: 3,2 0,148 92,5 123,8

9: 12,4 2,4 0,120 75,0 121,4

12,8: 2,3 0,115 71,9 124,1

[Ejemplo 7]

5 Se examinó el efecto del valor del pH de la fase acuosa externa en la estabilidad del fármaco.

A 1 ml de cada una de las fases acuosas externas que tienen diferentes valores de pH, concretamente, las soluciones de la fase acuosa externa que poseen pH 4,0, 5,0 (soluciones de 10 mM de ácido acético/sacarosa al 10 %), la solución de fase acuosa externa que posee pH 6,0 (solución de 10 mM de histidina/sacarosa al 10 %), las

10 soluciones de la fase acuosa externa que poseen pH 7,0, 8,0, 9,0 (soluciones de 10 mM de Tris/sacarosa al 10 %) (pH 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, o 9,0) que se utilizaron en (3) del Ejemplo de preparación 10 se añadieron 0,7 ml de una solución de clorhidrato de irinotecán (CPT-11)/agua de OI con una concentración de 10 mg/ml (agua purificada con membrana de ósmosis inversa), y la mezcla se agitó a 60 ºC durante 60 minutos.

15 La solución de CPT-11 obtenida anteriormente se diluyó 20 veces con cada solución de fase acuosa externa, y 5 µl de la muestra se sometieron a medición por cromatografía líquida de alta resolución. A partir de entonces, la relación de hidrólisis (relación existente de la forma circular abierta) (%) del anillo de α-hidroxilactona se calculó de acuerdo con la siguiente expresión.

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Áabierta: Un área del pico de la forma circular abierta de CPT-11 Ácerrada: Un área del pico de la forma circular abierta de CPT-11

Los resultados se muestran en la Fig. 5.

25 Se esclareció que, en el caso en que el valor del pH de la fase acuosa externa sea 8,0 o más, la relación existente de la forma circular abierta de CPT-11 (%) aumentó y era un valor extremadamente alto del 95 % o más. Con el fin de mantener la actividad de CPT-11, se requiere que el valor del pH sea 4,0 o menos para suprimir la hidrólisis del anillo de α-hidroxilactona. Sin embargo, desde el aspecto de la estabilidad lipídica (hidrólisis lipídica), el valor de pH

30 es deseablemente de manera aproximada 6,0 a 7,0. Teniendo en cuenta los resultados del Ejemplo 6, se descubrió que el valor de pH de la fase acuosa externa después de la introducción del fármaco era deseablemente de manera aproximada 4,0 a 7,0.

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Claims

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