ES2592268T3

ES2592268T3 - Método para análisis electroquímico rápido

Info

Publication number: ES2592268T3
Application number: ES06255055.3T
Authority: ES
Inventors: Sherry Guo; Alastair Hodges; Ron Chatelier; Bin Zhang
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2016-11-29
Anticipated expiration: 2026-09-29
Also published as: US20100270178A1; EP1770396A2; CN1975403A; US8404102B2; EP2280276A2; ES2800977T3; JP2007108171A; JP2012008151A; EP1770396A3; JP4964552B2; EP2280276A3; EP2278330A3; EP2280276B1; CN1975403B; EP1770396B1; EP2278330A2; JP4988059B2; EP2278330B1; ES2630225T3; EP3138490A1

Abstract

Un método de determinación de una concentración de analito en una muestra fisiológica, comprendiendo el método: (a) introducir la muestra fisiológica dentro de una celda electroquímica que comprende: (i) el primer y el segundo electrodos en una relación separada; y (ii) una capa de reactivo que comprende una enzima y un mediador, (b) aplicar un primer potencial eléctrico que tiene una primera polaridad a la celda de reacción y medir la corriente de la celda en función del tiempo para obtener un primer transitorio de tiempo-corriente; (c) aplicar un segundo potencial eléctrico que tiene una segunda polaridad a la celda, en el que la segunda polaridad es opuesta a la primera polaridad, y medir la corriente de la celda en función del tiempo para obtener un segundo transitorio de tiempo-corriente; y (d) calcular un primer valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un primer intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente; (e) calcular un segundo valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un segundo intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente y un tercer valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un tercer intervalo de tiempo del primer transitorio de tiempo-corriente, en el que el primer, segundo y tercer intervalos de tiempo se determinan empíricamente de forma que la concentración de analito determinada sea exacta dentro del ± 10 % de una medición de referencia, y tenga variación del 2 % en 1σ; (f) calcular una relación que comprende el segundo valor de corriente dividido entre el tercer valor de corriente; y (g) multiplicar el primer valor de corriente menos un valor de fondo por la relación para derivar la concentración de analito.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Metodo para analisis electroquimico rapido DESCRIPCION

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La deteccion de analitos en fluidos fisiologicos, por ejemplo sangre o productos derivados de la sangre, es de importancia cada vez mayor para la sociedad de hoy en dia. Los ensayos de deteccion de analitos encuentran uso en una variedad de aplicaciones, que incluyen pruebas de laboratorio clinico, pruebas en casa, etc., donde los resultados de tales pruebas desempenan una funcion importante en el diagnostico y el tratamiento en una variedad de patologias. Los analitos de interes incluyen glucosa para el tratamiento de diabetes, cetonas, colesterol (incluyendo HDL, LDL y/o trigliceridos), hemoglobina A1C y similares. En respuesta a esta importancia creciente de deteccion de analitos, se ha desarrollado una variedad de protocolos de deteccion de analitos y dispositivos para tanto uso clinico como en casa.

Un tipo de metodo que se emplea para la deteccion de analitos es un metodo electroquimico. En tales metodos, una muestra de Kquido acuoso se dispone dentro de una camara de reaccion de muestra en una tira reactiva, en este caso una celda electroquimica, que incluye dos electrodos, es decir, un primer y segundo electrodo, donde los electrodos tienen una impedancia, que los hace adecuados para la medicion amperometrica. El componente que va a analizarse se deja reaccionar directamente con un electrodo, o directa o indirectamente con un mediador para formar una sustancia oxidable (o reducible) en una cantidad correspondiente a la concentracion del componente que va a analizarse, es decir, el analito. La cantidad de sustancia oxidable (o reducible) presente se estima entonces electroquimicamente y se relaciona con la cantidad de analito presente en la muestra inicial.

Una estrategia que puede usarse para cuantificar el analito es permitir que el analito llegue a agotarse sustancialmente dentro de la celda electroquimica antes de medir electroquimicamente una sustancia oxidable (o reducible). Sin embargo, bajo ciertas condiciones, este proceso puede requerir un periodo de tiempo prolongado para alcanzar el agotamiento. Otras estrategias para cuantificar el analito se basan en un periodo de espera mas corto. Por ejemplo, puede medirse una corriente de oxidacion (o corriente de reduccion) durante un periodo de tiempo inferior al requerido para el agotamiento completo y la concentracion se calcula extrapolando los datos recogidos. Aunque procedimientos de calculo mas cortos cumplen el deseo de analisis oportunos (especialmente en el caso de la monitorizacion de glucosa), tales metodos pueden carecer de la exactitud deseada. Por tanto, se desearia desarrollar un metodo para medir rapidamente y con exactitud la concentracion de un analito en una celda electroquimica. Metodos electroquimicos y dispositivos para su uso en la determination de concentraciones de analito corregidas con hematocrito se conocen del documento WO0157510A2.

Sumario de la invention

Segun la presente invencion, se proporciona un metodo como se define por la revindication 1. Desarrollos ventajosos se definen en las reivindicaciones dependientes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las novedosas caracteristicas de la invencion se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendra un mejor entendimiento de las caracteristicas y ventajas de la presente invencion por referencia a la siguiente description detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la invencion, y los dibujos adjuntos de los que:

La FIG. 1 muestra una vista en perspectiva en despiece ordenado de una tira reactiva adecuada para su uso en la presente invencion;

la FIG. 2 es una vista en planta desde abajo de la tira reactiva; la FIG. 3 es una vista en planta desde arriba de la tira reactiva;

la FIG. 4 es una vista lateral en section transversal parcial de una portion distal de la tira reactiva;

la FIG. 5 es un esquema simplificado que muestra un medidor que se conecta electricamente con la tira

reactiva;

la FIG. 6 muestra un ejemplo de una forma de onda de tiempo-potencial que tiene un primer potencial electrico inmediatamente seguido de un segundo potencial electrico;

la FIG. 7 es un transitorio de tiempo-corriente generado por un medidor que esta probando una tira reactiva dosificada con una muestra fisiologica; y

la FIG. 8 es una grafica del sesgo que muestra la relation entre la concentracion de glucosa y el sesgo para un metodo de referencia.

DESCRIPCION DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS DE LA INVENCION

Los metodos y dispositivos objeto son aptos para su uso en la determinacion de una amplia variedad de analitos en una amplia variedad de muestras, y son particularmente aptos para su uso en la determinacion de analitos en sangre

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

completa o derivados de la misma, en la que un analito de particular interes es la glucosa. El objeto de la invencion proporciona metodos de determinacion de un valor de concentracion de analito en una muestra fisiologica de un modo rapido y con resultados precisos. En el presente documento se describen estructuras de una realizacion de tira reactiva a modo de ejemplo que pueden usarse en la medicion de un valor de concentracion de analito. Ademas, en el presente documento se describen metodos de uso de la tira reactiva en los que se mide un transitorio de tiempo- corriente y se recoge por un medidor electricamente conectado a la tira reactiva. Todavla mas, en el presente documento se describen algoritmos que se usan para procesar el transitorio de tiempo-corriente de una manera rapida y que da como resultado valores de concentracion de analito exactos.

Pueden usarse metodos objeto, en principio, con cualquier tipo de celda electroqulmica que tenga separados el primer y segundo electrodos y una capa de reactivo tal como, por ejemplo, una tira reactiva electroqulmica. En un aspecto, una tira reactiva electroqulmica incluye dos electrodos opuestos separados por una delgada capa de espaciador, en la que estos componentes definen una camara de reaccion de muestra o zona en la que se localiza una capa de reactivo.

Las FIG. 1 a 4 muestran una vista en perspectiva en despiece ordenado, una vista desde abajo, una vista desde arriba y una vista lateral en seccion transversal, respectivamente, de una tira reactiva 62 a modo de ejemplo adecuada para su uso con el metodo descrito en el presente documento. La tira reactiva 62 incluye una primera capa de electrodo 66, un espaciador 60, una segunda capa de electrodo 64, una porcion distal 80 y una porcion proximal 82. Cuando esta completamente ensamblada, la tira reactiva 62 tiene una camara de reaccion de muestra 61 para recibir una muestra. En un aspecto, la camara de reaccion de muestra 61 para recibir una muestra. En un aspecto, la camara de reaccion de muestra 61 esta formada por el area cortada 68 en espaciador 60, la segunda capa de electrodo 64 y la primera capa de electrodo 66. Puede administrarse fluido fisiologico a traves de un puerto 70, y en una realizacion, hay dos puertos 70. En un aspecto, uno de los puertos 70 puede proporcionar una entrada de muestra y el otro puede actuar de ventilacion.

En la realizacion ilustrada, la primera capa de electrodo 66 y la segunda capa de electrodo 64 estan separadas en una disposicion opuesta o de caras opuestas. Sin embargo, un experto en la materia apreciara que los electrodos pueden estar posicionados en una variedad de formas que incluyen en configuraciones coplanares y no coplanares.

Una porcion de la primera capa de electrodo 66 y la segunda capa de electrodo 64 puede proporcionar electrodos 166, 164, respectivamente. Por ejemplo, la porcion de la primera capa de electrodo 66 y la segunda capa de electrodo 64 expuestas dentro de la camara de reaccion 61 pueden definir el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164. Ademas, la primera capa de electrodo 66 puede incluir un primer contacto electrico 67 y una muesca en forma de U 65 como se ilustra en la FIG. 1. El primer contacto electrico 67, que esta electricamente conectado al primer electrodo 166 mediante una primera pista de conexion 76, se usa para establecer una conexion electrica con un medidor. La segunda capa de electrodo 64 puede incluir un segundo contacto electrico 63 que esta electricamente conectado con el segundo electrodo 164 mediante una segunda pista de conexion 78 como se ilustra en las FIG. 1 a 3. Al segundo contacto electrico puede accederse por un medidor mediante la muesca en forma de U 65 como se ilustra en la FIG. 1. Un experto en la materia apreciara que la tira reactiva 62 puede incluir una variedad de configuraciones de contacto electrico alternativas para la conexion electrica con un medidor. Por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.379.513 desvela medios de conexion de celda electroqulmica.

En una realizacion, la primera y/o segunda capas de electrodo pueden ser un material conductor formado a partir de materiales tales como oro, paladio, carbono, plata, platino, oxido de estano, iridio, indio, y combinaciones de los mismos (por ejemplo, oxido de estano dopado con indio). Ademas, los electrodos pueden formarse disponiendo un material conductor sobre una hoja aislante (no mostrada) mediante un proceso de pulverizacion, chapado sin corriente o de impresion serigrafica. En una realizacion a modo de ejemplo, la segunda capa de electrodo 64 puede ser un electrodo de oro pulverizado y la primera capa de electrodo 66 puede ser un electrodo de paladio pulverizado. Materiales adecuados que pueden emplearse como hoja aislante incluyen, por ejemplo, plasticos (por ejemplo, PET, PETG, poliimida, policarbonato, poliestireno), silicona, ceramica, vidrio, y combinaciones de los mismos.

Una capa de reactivo 72 puede disponerse dentro de la camara de reaccion 61 usando un proceso tal como recubrimiento de ranura, recubrimiento dispensando llquido desde el extremo de un tubo, chorro de tinta e impresion serigrafica. Tales procesos se describen, por ejemplo, en las siguientes patentes de EE.UU. N.° 6.749.887; 6.689.411; 6.676.995; y 6.830.934. En una realizacion, la capa de reactivo 72 se deposita sobre el primer electrodo 166 e incluye al menos un mediador y una enzima. Un mediador puede estar en cualquiera de los dos estados redox que pueden denominarse una sustancia oxidable o una sustancia reducible. Ejemplos de mediadores adecuados incluyen ferricianuro, ferroceno, derivados de ferroceno, complejos de osmio-bipiridilo y derivados de quinona. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa (GDH) basada en un co-factor de pirroloquinolina-quinona, y GDH basado en un co-factor de nicotinamida adenina dinucleotido. Una formulacion de reactivo a modo de ejemplo, que serla adecuada para hacer la capa de reactivo 72, se describe en la solicitud de EE.UU. en tramite N.° 10/242.951, titulada Method for Manufacturing a Sterilized and Calibrated Biosensor-Based Medical Device, publicada como la solicitud de patente publicada de EE.UU. N.° 2004/0120848.

En una realizacion, la camara de reaccion de muestra 61 se define por el primer electrodo 166, el segundo electrodo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

164 y el espaciador 60 como se muestra en la FIG. 1 a 4. Especlficamente, el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 definen la parte superior y la parte inferior de la camara de reaccion de muestra 61, mientras que la capa de espaciador define las paredes laterales de la camara de reaccion de muestra 61. Por ejemplo, el espaciador 60 puede incluir un area cortada 68 que define una camara de reaccion de muestra 61 para la tira reactiva 62.

La altura del espaciador 60 puede definir la distancia entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164. En un aspecto, la altura del espaciador 60 esta en el intervalo de aproximadamente 1 micrometro a 500 micrometros, preferentemente entre aproximadamente 10 y 400 micrometros, y mas preferentemente entre aproximadamente 40 micrometros y 200 micrometros.

En una realizacion, la tira reactiva 62 incluye el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 posicionados de forma que esten separados solo una corta distancia. En un escenario tal, puede producirse el ciclo de redox en el que el mediador oxidado generado en el primer electrodo 166 puede difundir al segundo electrodo 164 para reducirse y posteriormente difundir de nuevo al primer electrodo 166 para oxidarse otra vez.

Cualquiera del primer electrodo 166 o el segundo electrodo 164 puede realizar la funcion de un electrodo de trabajo que oxida o reduce una cantidad limitante de mediador dependiendo de la polaridad aplicada del medidor. Por ejemplo, si la especie limitante de la corriente es un mediador reducido, entonces puede oxidarse en el primer electrodo 166 en tanto que se aplique un potencial suficientemente positivo con respecto al segundo electrodo 164. En una situation tal, el primer electrodo 166 realiza la funcion del electrodo de trabajo y el segundo electrodo 164 realiza la funcion de un contraelectrodo/electrodo de referencia.

Similarmente, si se aplica un potencial suficientemente negativo con respecto al segundo electrodo 164, entonces el mediador reducido puede oxidarse en el segundo electrodo 164. En una situacion tal, el segundo electrodo 164 realiza la funcion del electrodo de trabajo y el primer electrodo 166 realiza la funcion del contraelectrodo/electrodo de referencia.

Una primera etapa en los metodos objeto puede incluir introducir una cantidad de la muestra fisiologica de interes en una celda electroqulmica que incluye separados el primer y el segundo electrodos y una capa de reactivo. La muestra fisiologica puede variar, pero en muchas realizaciones es generalmente sangre completa o un derivado o fraction de la misma, en la que la sangre completa es de particular interes La muestra fisiologica, por ejemplo sangre, se dosifica dentro de la camara de reaccion de muestra 61 mediante el puerto 70. En un aspecto, el puerto 70 y/o la camara de reaccion 61 estan dimensionados de forma que la action capilar haga que la muestra fisiologica llene la camara de reaccion de muestra.

La FIG. 5 proporciona un esquema simplificado que muestra un medidor 100 que conecta con el primer contacto electrico 67 y el segundo contacto electrico 63, que estan en comunicacion electrica con el primer y el segundo electrodo 166, 164, respectivamente, de la tira reactiva 62. El medidor 100 esta adaptado para conectarse electricamente con el primer electrodo 164 y el segundo electrodo 166, mediante el contacto electrico 63 y el segundo contacto electrico 67 (como se muestra en las FIG. 2 y 5). En un aspecto, el medidor 100 hace contacto con el contacto electrico 63 mediante la muesca en forma de U 65.

Como se ilustra en la FIG. 5, el contacto electrico 67 puede comprender dos dientes, 67a, 67b. En una realizacion a modo de ejemplo, el medidor 100 conecta por separado los dientes 67a, 67b, de forma que cuando el medidor 100 se conecte con la tira reactiva 62 se complete un circuito. El medidor 100 puede usar el circuito cerrado a traves de la capa de electrodo 66 como una senal de que la tira reactiva esta en su sitio. Un experto en la materia apreciara que el medidor 100 puede usar una variedad de sensores y circuitos para determinar cuando la tira reactiva 62 esta adecuadamente colocada con respecto al medidor.

En una realizacion, el primer contacto electrico 67 y el segundo contacto electrico 63 se conectan con una fuente de tension E. Cuando se realiza una prueba, a la fuente de tension E se aplica un primer potencial electrico entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 durante un primer intervalo de tiempo. El primer potencial electrico puede aplicarse inmediatamente despues de que se detecte que la muestra fisiologica esta en la camara de reaccion de muestra. En un aspecto, la muestra fisiologica puede detectarse por una tecnica automatica en la que el medidor monitoriza un cambio en la tension (por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N.° 6.193.873), corriente o capacitancia, un cambio que indica que la muestra ha sido dosificada dentro de la camara de reaccion de muestra. Alternativamente, la muestra fisiologica puede detectarse por una tecnica manual en la que el usuario observa visualmente el llenado de la camara de reaccion de muestra e inicia la prueba pulsando un boton.

Despues de que la muestra haya entrado en la celda, un primer potencial electrico, que tiene una primera polaridad, puede aplicarse a la camara de reaccion de muestra 61 y medirse una corriente resultante en funcion del tiempo. Al menos una portion de los datos (corriente en funcion del tiempo) proporciona un primer transitorio de tiempo- corriente. El primer potencial electrico puede ser suficientemente negativo con respecto al segundo electrodo 164 de forma que el segundo electrodo 164 funcione como el electrodo de trabajo en el que se mide una corriente de oxidation limitante. Despues de transcurrir el primer intervalo de tiempo, la fuente de tension E aplica un segundo potencial electrico entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 durante un segundo intervalo de tiempo.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El segundo potencial electrico produce una corriente que se mide en funcion del tiempo para producir un segundo transitorio de tiempo-corriente. En una realizacion, el segundo potencial tiene una segunda polaridad, que es opuesta a la primera polaridad. Por ejemplo, el segundo potencial puede ser suficientemente positivo con respecto al segundo electrodo 164 de forma que el primer electrodo 166 funcione como el electrodo de trabajo en el que se mide una corriente de oxidacion limitante. En un aspecto, el primer potencial electrico y el segundo potencial electrico pueden oscilar de aproximadamente -0,6 V a aproximadamente +0,6 V. El intervalo de tiempo de los transitorios de tiempo-corriente puede, en una realizacion, estar en el intervalo de aproximadamente 0,5 segundos a 10 segundos, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 segundos. En otra realizacion, una suma del primer intervalo de tiempo y el segundo intervalo de tiempo es inferior a aproximadamente 5 segundos. Debe tambien observarse que el primer intervalo de tiempo no tiene que ser el mismo que el segundo intervalo de tiempo.

En una realizacion, el segundo potencial electrico se aplica inmediatamente tras la aplicacion del primer potencial electrico. En una realizacion alternativa, un retardo o potencial de circuito abierto se introduce entre el primer potencial electrico y el segundo potencial electrico. En otra realizacion alternativa, se introduce un retardo despues de que la muestra fisiologica se detecte en la camara de reaccion de muestra, pero antes de la aplicacion del primer potencial electrico. El retardo puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,01 y 3 segundos, preferentemente entre 0,05 y 1 segundos, y lo mas preferentemente entre 0,1 y 0,5 segundos.

La FIG. 6 muestra un ejemplo de una forma de onda de tiempo-potencial que tiene un primer potencial electrico de - 0,3 V durante 3 segundos inmediatamente seguido de un segundo potencial electrico de +0,3 V durante 2 segundos. La FIG. 7 muestra la corriente medida resultante como un primer transitorio de tiempo-corriente 73 inmediatamente seguido de un segundo transitorio de tiempo-corriente 74.

En un ejemplo de la presente divulgacion no segun la invencion, la concentracion de analito se determina a partir de los datos de transitorio de tiempo-corriente medidos (FIG. 7). El metodo incluye usar el primer y segundo transitorios de tiempo-corriente, obtenidos como se ha descrito anteriormente, para determinar: (a) una variable y; y (b) una concentracion de analito preliminar Co para el analito de interes en la muestra. Debe observarse que y se define como iss

ipp

El termino ipp es la corriente promedio durante un corto periodo de tiempo cerca del fin del primer transitorio de tiempo-corriente. Por ejemplo, si el primer intervalo de tiempo dura 3 segundos, la corriente promedio puede ser la corriente promedio de 1,9 a 2,9 segundos del periodo de duracion de 3 segundos.

El termino iss es el valor de corriente en estado estacionario para el segundo transitorio de tiempo-corriente. Debido a que la altura del espaciador es aproximadamente inferior o igual a la altura de la capa de difusion, la corriente tiende hacia un valor estacionario. El termino iss puede estimarse usando la Ecuacion 2, para corrientes veces mayores que un tiempo mlnimo, en las que un tiempo mlnimo adecuado puede estimarse a partir de la Ecuacion 1.

Eq.1

-L2 In 0-01

Eq- 2

r

1 + 4 exp

imagen1

en la que, iss la corriente en estado estacionario tras la aplicacion del segundo potencial electrico; i es la corriente medida que es una funcion de tiempo; Dis el coeficiente de difusion de la molecula activa para redox, en la que este coeficiente puede determinarse a partir de la primera ley de Fick, es decir, J(x,t)=-D dC(x,t) /dx; L es el espesor del espaciador; y t es el tiempo para la aplicacion del segundo potencial electrico en el que t=0 para el comienzo del pulso.

La concentracion de analito preliminar Co para el analito de interes en la muestra se calcula usando la siguiente Ecuacion 3

Eq. 3

2FADC0

L

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

en la que F es la constante de Faraday, es decir, 9,6485 * 104 C/mol, y A es el area del primer electrodo.

La Ec. 4 muestra la ecuacion usada para convertir la corriente medida en una concentracion de analito [C] en la que CF es el factor de correction y Z es una constante que explica las corrientes de fondo.

Eq.4 [c] = CF x [Ce — Zj

El termino CF puede ser una ecuacion empirica, basada en yy C0, que hace que la concentracion de analito [C] sea mas exacta. Un ejemplo de una expresion matematica para CF se muestra en la Ec. 5 en la que b, c y d son constantes.

________1

<?xln{CJ

Por tanto, las Ecuaciones 1 a 5 pueden usarse para calcular una concentracion de analito. Sin embargo, el calculo de Co e iss es matematicamente intenso y requiere un microprocesador relativamente rapido.

Una realization proporciona un algoritmo para medir una concentracion de analito que es matematicamente mas simple y puede proporcionar una concentracion de analito exacta.

El calculo de tanto CF como Co se evita. El solicitante ha encontrado que la concentracion de analito inicial puede calcularse por integration de segundas medidas de pulsos en un pequeno intervalo de tiempo. En lugar de calcular Co, puede sustituirse un valor de corriente integrativo.

Por ejemplo, para calcular CF y Co, un primer valor de corriente integrativo h y un segundo valor de corriente integrativo l2 se calculan a partir del segundo transitorio de tiempo-corriente y un tercer valor de corriente integrativo I3 se calcula a partir del primer transitorio de tiempo-corriente. Entonces se calcula una relation que incluye el segundo valor de corriente integrativo I2 dividido entre el tercer valor de corriente integrativo I3. Esta relacion proporciona el factor de correccion mientras que el primer valor integrativo li proporciona un valor que puede sustituirse de la concentracion inicial. Un experto en la materia apreciara que los nombres "primer", "segundo" y "tercero" se eligen por comodidad y no reflejan necesariamente el orden en el que se calculan los valores de corriente integrativos.

Para mejorar la exactitud de los resultados y reducir la influencia de variation de la tira reactiva pueden usarse varios parametros emplricos. En un aspecto, 1 puede multiplicarse por una constante a y la variable Z puede restarse del producto de multiplication de a e li, para explicar corrientes de fondo. En otro aspecto, la relacion I2 / I3 puede establecerse para ser la potencia p.

La Ec. 6 ilustra las etapas de calculo.

imagen2

imagen3

Eq.6 [c] = (|)P X (a x r, - z)

La sustitucion del primer, segundo y tercer valores de corriente dentro de la Ec. 6 permite determinar concentraciones de analito exactas en un marco de tiempo relativamente corto. Se evitan el calculo que requiere tiempo y amplios recursos de ordenador de la corriente en estado estacionario y concentracion de analito inicial, produciendo analisis mas simple y tiempo de prueba del ensayo reducido. En particular, como I1 puede determinarse basandose en la integracion de valores de corriente, requiere significativamente menos potencial computacional en comparacion con un calculo de Co, que requiere un algoritmo iterativo.

El uso de valores de corriente integrados puede proporcionar el calculo rapido de la concentracion de analito. Por ejemplo, el metodo de aplicar un primer y segundo potencial electrico y calcular la concentracion de analito puede realizarse en menos de aproximadamente 10 segundos En otra realizacion, la concentracion de analito puede calcularse en menos de aproximadamente 6 segundos, y en otra realizacion mas, la concentracion de analito puede calcularse en menos de aproximadamente 5 segundos.

El primer valor de corriente integrativo I1 y el segundo valor de corriente integrativo I2 son, en un aspecto, una integral de valores de corriente con respecto a un intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente, o como un ejemplo de la presente divulgation no segun la presente invention, un sumatorio de valores de corriente con respecto a un intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente, o como un ejemplo de la presente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

divulgacion no segun la presente invencion, un valor de corriente promedio o individual del segundo transitorio de tiempo-corriente multiplicado por un intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente. Similarmente, el tercer valor de corriente I3 puede ser una integral de valores de corriente con respecto a un intervalo de tiempo del primer transitorio de tiempo-corriente, o como un ejemplo de la presente divulgacion no segun la presente invencion, un sumatorio de valores de corriente con respecto a un intervalo de tiempo del primer transitorio de tiempo-corriente, o como un ejemplo de la presente divulgacion no segun la presente invencion, un valor de corriente promedio o individual del primer transitorio de tiempo-corriente multiplicado por un intervalo de tiempo del primer transitorio de tiempo-corriente. Para el sumatorio de valores de corriente, un intervalo de mediciones de corriente consecutivas pueden sumarse juntas oscilando de solo dos valores de corriente a todos los valores de corriente .

En un aspecto, la capa de reactivo 72 esta dispuesta sobre el primer electrodo 166 y as! generalmente queda proxima al primer electrodo 166 despues de su disolucion con muestra fisiologica. Esto produce, al menos inicialmente, que una mayor proportion de sustancia oxidable este proxima al primer electrodo 166. Despues de que haya pasado un cierto periodo de tiempo, el mediador reducido, generado en la capa de reactivo 72 mediante la reaction de glucosa, difundira pasivamente del primer electrodo 166 al segundo electrodo 164. Durante la aplicacion del primer potencial electrico, el segundo electrodo 164 oxida el mediador reducido a medida que difunde del primer electrodo 166. Durante este proceso, la magnitud de la concentration de mediador entre el primer electrodo 166 y el segundo electrodo 164 forma un gradiente en el que la concentracion de mediador reducido es mayor en el primer electrodo 166 y menor en el segundo electrodo de trabajo 164. Una gran concentracion de mediador reducido en el primer electrodo 166 hara que la magnitud del gradiente llegue a ser mas inclinada. La magnitud de esta corriente de oxidation es proporcional a la magnitud de este gradiente. Por tanto, la cantidad de mediador reducido generada por la capa de reactivo 72 conduce la difusion de mediador reducido al segundo electrodo 164. La tasa de cambio de la corriente medida en los electrodos es as! indicativa de la tasa de cambio de la concentracion de mediador reducido en la capa de reactivo 72 y tambien de la reaccion cinetica de glucosa (es decir, la tasa de reaccion de glucosa que genera mediador reducido).

La reaccion cinetica de glucosa depende de varios factores que incluyen la altura del espaciador 60 (como se refiere a la maxima distancia que tiene que difundir la glucosa para llegar a la capa de reactivo 72), viscosidad de la muestra fisiologica, concentracion de hematocrito y la temperatura.

Un aumento en la viscosidad en la muestra fisiologica puede producirse con el aumento en el hematocrito, protelna, contenido de llpido, o combination de los mismos. Hematocrito se refiere a la proporcion de globulos rojos en una muestra de sangre. Normalmente, una mayor proporcion de globulos rojos hace que la sangre sea mas viscosa y haga que una mayor proporcion de la glucosa total este dentro de los globulos rojos. Con el fin de que la glucosa dentro de los globulos rojos reaccione con la capa de reactivo 72, la glucosa debe transportarse a traves de la membrana de los globulos rojos. Bajo ciertas condiciones, este transporte puede ser relativamente lento para limitar la reaccion cinetica de la glucosa. Por tanto, mayor hematocrito ralentiza la reaccion cinetica de la glucosa. La viscosidad generalmente ralentiza el proceso de difusion general dentro de la camara de reaccion de muestra 61. Una mayor temperatura generalmente aumenta la velocidad de reaccion de la glucosa con la capa de reactivo 72 dentro de la camara de reaccion de muestra 61 ya que acelera los procesos de transporte implicados.

En el metodo desvelado en el presente documento, la reaccion cinetica de la glucosa se tiene en cuenta usando transitorios de tiempo-corriente. El resultado es menos dependencia de la concentracion de hematocrito y temperatura, y exactitud y precision mejoradas en la determination de la concentracion de glucosa.

La magnitud del segundo transitorio de tiempo-corriente generalmente sera mayor que la magnitud absoluta del primer transitorio de tiempo-corriente Asl, la relation I2 / I3 generalmente sera superior a la unidad mientras que la reaccion de glucosa esta en progreso dentro de la camara de reaccion de muestra 61 y serla la unidad cuando se completara la reaccion de la glucosa. La desviacion de la relacion I2 / I3 de la unidad sera, por tanto, un factor que indica el grado de completitud de la reaccion. Valores relativamente grandes de I2 / I3 indicaran que la reaccion de glucosa esta lejos de completarse, mientras que valores de I2 / I3 proximos a la unidad indicaran que la reaccion de glucosa esta casi completa. Por tanto, la relacion I2 / I3 generalmente proporciona information sobre el progreso de la reaccion de la glucosa y puede usarse para eliminar el efecto del hematocrito, viscosidad y temperatura sobre la medicion de la concentracion de glucosa.

Para refinar adicionalmente los calculos, pueden usarse uno o mas factores de calibration. Por ejemplo, como se muestra en la Ec. 6, la relacion I2 / I3 se ajusta a p exponencial en la que p es un factor de calibracion que puede usarse para un lote particular de tiras reactivas. El uso del exponente p se encontro mediante medios emplricos para mejorar la exactitud y permitir tiempos de prueba rapidos. En una realization de la invencion, p puede oscilar de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 4 y preferentemente entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 1.

Como se muestra en la Ec. 6, puede usarse un factor de calibracion a para explicar posibles variaciones en el area cortada 68 y la altura de espaciador 60. Variaciones en el area cortada 68 pueden producir un desplazamiento sistematico en la magnitud de la corriente medida. En ciertas circunstancias, los procesos de fabrication pueden hacer que el area del electrodo varle de un lote de tiras reactivas a otro lote de tiras reactivas. Similarmente, la altura del espaciador 60 tambien puede variar entre lotes. Variaciones en la altura del espaciador 60 tienen un impacto

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

proporcional sobre la corriente medida. El calculo de un factor de calibracion a para cada lote de tira reactiva ayuda a compensar las variaciones en el area del electrodo y la altura del espaciador 60. El termino a puede calcularse durante el proceso de calibracion de un lote de tiras reactivas.

En una realizacion, como se muestra en la Ec. 6, se usa un factor de calibracion Z para explicar variaciones en el fondo. Una corriente que se genera a partir de fuentes distintas de glucosa puede contribuir a la senal de fondo. Por ejemplo, si la capa de reactivo 72 fuera a contener una pequena cantidad de sustancia oxidable como impureza antes de anadir una muestra fisiologica a la tira reactiva, entonces habrla un aumento en la corriente medida (es decir, fondo) que no podrla atribuirse a la concentracion de glucosa. Debido a que esto producirla un sesgo constante en la corriente medida global para un lote particular de tiras reactivas, este sesgo puede corregirse para usar el factor de calibracion Z. Similar a los terminos p y a, Z tambien puede calcularse durante el proceso de calibracion.

Mientras que el metodo desvelado en el presente documento se describe con el uso de factores de calibracion p, a y Z, un experto en la materia apreciara que no se requiere su uso. Por ejemplo, en una realizacion, la concentracion de glucosa podrla calcularse sin p, a y/o Z (p y/o a podrlan establecerse iguales a uno y Z podrla establecerse igual a cero).

La seleccion del intervalo de tiempo en el que Ii, I2 e I3 se calculan puede determinarse con un algoritmo de entrenamiento para un tipo de tira reactiva particular. Durante el algoritmo de entrenamiento, varias tiras reactivas se probarlan durante un intervalo de condiciones que un usuario puede encontrar durante la prueba. Tales condiciones pueden incluir un intervalo de concentracion de glucosa de 20 mg/dl a 600 mg/dl, un intervalo de hematocrito del 0 % al 70 %, un intervalo de temperatura de 5 °C a 45 °C, intervalo de humedad del 5 % de humedad relativa (% de HR) al 95 % de HR, e interferentes endogenos y exogenos. Ejemplos de interferentes endogenos y exogenos y su intervalo fisiologico de concentracion pueden encontrarse en la publicacion titulada National Committee for Clinical Laboratory Standards. Interference testing in clinical chemistry; proposed guideline EP7-P. Wayne, Pa.:NCCLS, 1986 que se incorpora por referencia en el presente documento. Usando tecnicas de minimization de errores estandar, se definio una seleccion optimizada de intervalos de tiempo para Ii, I2 e I3 de forma que la concentracion calculada de glucosa usando la Ecuacion 6 fuera exacta (por ejemplo, dentro del 10 % de medicion de referencia) y con precision (por ejemplo, variation de tira a tira de aproximadamente el 2 % a 1a). Un experto en la materia apreciara que el intervalo de tiempo elegido para el primer y el segundo valores de corriente integrativos pueden as! ser iguales o diferentes, y en una realizacion, solo dos valores de corriente integrativos se calculan. Entonces, el primer valor de corriente integrativo se usa para Ii e I2.

Despues de elegir los intervalos de tiempo para Ii, I2 e I3, puede calibrarse el lote de tiras. Metodos a modo de ejemplo de calibracion de lotes de tiras se describen en la patente de EE.UU. N.° 6.780.645. Mas particularmente, los factores de calibracion a, p y/o Z pueden calcularse para un lote particular de tiras reactivas. Normalmente, se prueban un intervalo de concentraciones de glucosa en sangre de multiples donantes usando las tiras reactivas de glucosa y tambien un instrumento de referencia que se sabe que es exacto y preciso. El error entre los resultados de las tiras reactivas de la presente invention y el metodo de referencia se minimiza por el hallazgo de la combination optima de a, p y/o Z. En una realizacion, la information de calibracion puede transmitirse a un medidor de glucosa antes de usar una tira reactiva del lote de tiras reactivas.

En otra realizacion, los factores que controlan los valores de a, p y Z pueden controlarse de forma suficientemente estrecha durante la fabrication de tal forma que sean los mismos entre lotes de tiras. Los criterios para ser capaz de emplear satisfactoriamente esta realizacion es que los multiples lotes de tiras dan una exactitud de respuesta dentro de llmites especificados con los mismos valores de a, p y Z empleados en el algoritmo. Esta realizacion obvia la necesidad de un sistema para transmitir la informacion de calibracion al medidor, ya que los valores predeterminados de a, p y Z pueden almacenarse en el medidor durante la fabricacion. Los principales parametros que necesitan ser estrictamente controlados para que esta realizacion tenga utilidad es la geometrla de la celda del sensor (las areas y separation de electrodos) y que haya un exceso suficiente de actividad de reaction de glucosa en los reactivos de forma que la velocidad de reaccion de glucosa este sustancialmente controlada por el transporte de masa en vez de controlada por la velocidad de reaccion qulmica.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de los principios y la practica de la presente invencion. Numerosas realizaciones adicionales dentro del alcance de la invencion seran evidentes para aquellos expertos en la materia.

Ejemplo 1

Se preparo un tampon que contenla citraconato 100 mM a pH 6,5, 0,1 % de antiespumante (RNA Equilibrator) y CaCl2 4 mM. A continuation, GDH que uso un cofactor de PQQ, se anadio al tampon de manera que fuera 46 mg/ml. Entonces se anadio PQQ al tampon de manera que pudiera activar la GDH. PQQ se anadio al tampon de forma que hubiera al menos 2 moles de PQQ por mol de gDh. Despues de la adicion de PQQ, la formulation se dejo incubar aproximadamente una hora. A continuacion, se anadio ferricianuro de potasio a la mezcla de forma que fuera 800 mM. La formulacion se aplico en tiras sobre el primer electrodo 166 como se muestra en la FIG. 1 por medio de un proceso de recubrimiento de ranura que se describe en las patentes de EE.UU. N.° 6749887; 6689411;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

y 6676995. Tras el recubrimiento de la formulacion y secarla de forma que formara la capa de reactivo 72, el espaciador 60 y el segundo electrodo 164 se ensamblan encima para formar la tira reactiva 62.

Ejemplo 2

Se probaron varias tiras reactivas 62 con sangre para un amplio intervalo de concentraciones de glucosa de aproximadamente 20 mg/dl a aproximadamente 600 mg/dl en sangre. Se usaron veintitres donantes de sangre diferentes para este estudio. Las tiras reactivas 62 se probaron usando un tiempo de prueba de cinco segundos. La corriente medida se convirtio en una concentracion de glucosa usando la Ec. 5. Se calculo un sesgo para cada tira reactiva contra el metodo de referencia. A baja concentracion de glucosa (<100 mg/dl) se calculo un sesgo absoluto y a glucosa alta (>100 mg/dl) se calculo un porcentaje de sesgo. La FIG. 8 muestra que el 93 % de los puntos de datos tienen un sesgo inferior o igual al 10 % o 10 mg/dl.

Se aplico un primer potencial entre los electrodos estando el electrodo recubierto de reactivo a -300 mV con respecto al otro electrodo durante 4,0 segundos, entonces se invirtio el potencial de forma que el electrodo recubierto de reactivo estuviera a +300 mV con respecto al otro electrodo durante 1 segundo. Se midieron los valores de corriente a intervalos de 50 ms y se guardaron. Para realizar este analisis, el primer valor de corriente integrativo 1 se obtuvo sumando los valores de corriente almacenados entre 4,8 y 5,0 segundos despues de invertirse el potencial. I2 se obtuvo similarmente sumando los valores de corriente entre 4,7 y 5,0 segundos despues de invertirse el potencial e I3 sumando los valores de corriente entre 1,6 y 4,0 segundos despues de aplicar el potencial original. Los valores de a, p y Z se determinaron emplricamente y fueron 1,29, 0,645 y 3,64 respectivamente.

Como se muestra en la FIG. 8, el uso del primer, segundo y tercer valores de corriente integrativos para calcular la concentracion de analito proporciono informacion de concentracion exacta de una manera rapida.

Se reconocio que las estructuras ilustradas y descritas en el presente documento pueden sustituirse con estructuras equivalentes y que la realizacion descrita de la invencion no es la unica estructura que puede emplearse para implementar la invencion reivindicada. Un ejemplo de una estructura equivalente, que puede usarse para implementar la presente invencion, se describe en la patente de EE.UU. N.° 6.413.410. Otro ejemplo de una estructura equivalente, que puede usarse para implementar la presente invencion, se describe en las patentes de EE.UU. N.° 6.612.111 y 6.284.125.

Aunque las realizaciones preferidas de la presente invencion se han mostrado y descrito en el presente documento, sera obvio para aquellos expertos en la materia que tales realizaciones se proporcionan a modo de ejemplo solo. Ahora se produciran numerosas variaciones, cambios y sustituciones por aquellos expertos en la materia sin apartarse de la invencion. Debe entenderse que las diversas alternativas a las realizaciones de la invencion descritas en el presente documento pueden emplearse en la practica de la invencion. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invencion y que as! se cubran los metodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de determination de una concentration de analito en una muestra fisiologica, comprendiendo el metodo:

(a) introducir la muestra fisiologica dentro de una celda electroquimica que comprende:

(i) el primer y el segundo electrodos en una relation separada; y

(ii) una capa de reactivo que comprende una enzima y un mediador,

(b) aplicar un primer potencial electrico que tiene una primera polaridad a la celda de reaction y medir la corriente de la celda en funcion del tiempo para obtener un primer transitorio de tiempo-corriente;

(c) aplicar un segundo potencial electrico que tiene una segunda polaridad a la celda, en el que la segunda polaridad es opuesta a la primera polaridad, y medir la corriente de la celda en funcion del tiempo para obtener un segundo transitorio de tiempo-corriente; y

(d) calcular un primer valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un primer intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente;

(e) calcular un segundo valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un segundo intervalo de tiempo del segundo transitorio de tiempo-corriente y un tercer valor de corriente basado en una integral de valores de corriente con respecto a un tercer intervalo de tiempo del primer transitorio de tiempo-corriente, en el que el primer, segundo y tercer intervalos de tiempo se determinan empiricamente de forma que la concentration de analito determinada sea exacta dentro del ± 10 % de una medicion de referencia, y tenga variation del 2 % en 1a;

(f) calcular una relation que comprende el segundo valor de corriente dividido entre el tercer valor de corriente; y

(g) multiplicar el primer valor de corriente menos un valor de fondo por la relation para derivar la concentration de analito.
2. El metodo segun la revindication 1, en el que las etapas (b) a (g) se producen en menos de 10 segundos.
3. El metodo segun la revindication 1, en el que las etapas (b) a (g) se producen en menos de 6 segundos.
4. El metodo segun la revindication 1, en el que la relation es con respecto a una potencia p.
5. El metodo segun la revindication 1, en el que la concentration de analito se calcula basandose en una ecuacion [C] = (hlhf * ((a*I1) - Z) en la que [C] es la concentration de analito, I1 es el primer valor de corriente, I2 es el segundo valor de corriente, I3 es el tercer valor de corriente, y Z, p y a son factores de calibration.
6. El metodo segun la revindication 5, en el que p esta en el intervalo de 0,2 a 4 y a esta en el intervalo de 0,2 a 4.
7. El metodo segun la revindication 6, en el que p es igual a uno y a es igual a uno.
8. El metodo segun la revindication 5, que comprende ademas la etapa de determinar empiricamente p y a.
9. El metodo segun la revindication 1, en el que el primer valor de corriente es proporcional a la concentration de analito.
10. El metodo segun la revindication 1, en el que el analito es glucosa.
11. El metodo segun la revindication 1, en el que la muestra fisiologica es un material seleccionado del grupo que consiste en sangre completa, plasma, suero, fluido intersticial y orina.
12. El metodo segun la revindication 1, en el que el primer electrodo y el segundo electrodo comprenden un material conductor seleccionado del grupo que consiste en oro, paladio, platino, plata, iridio, oxido de estano dopado y carbono.
13. El metodo segun la revindication 12, en el que el primer electrodo es paladio y el segundo electrodo es oro.
14. El metodo segun la revindication 12, en el que el material conductor se pulveriza sobre una hoja aislante.
15. El metodo segun la revindication 12, en el que el material conductor se imprime serograficamente sobre una hoja aislante.
16. El metodo segun la revindication 1, en el que la capa de reactivo esta dispuesta sobre el primer electrodo.
17. El metodo segun la revindication 16, en el que la primera polaridad es negativa con respecto al segundo

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

electrodo y la segunda polaridad es positiva con respecto al segundo electrodo.
18. El metodo segun la reivindicacion 16, en el que el primer potencial electrico oscila de 0,0 a -0,6 V con respecto al segundo electrodo y el segundo potencial electrico oscila de 0,0 a 0,6 V con respecto al segundo electrodo.
19. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el segundo potencial electrico se aplica inmediatamente tras la aplicacion del primer potencial electrico.
20. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la celda electroqulmica tiene un volumen que es inferior a 1 microlitro.
21. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la enzima es un material elegido del grupo que consiste en glucosa oxidasa, glucosa deshidrogenasa basada en un cofactor de metoxatina y glucosa deshidrogenasa basada en un cofactor de nicotinamida adenina dinucleotido.
22. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el mediador es un material elegido del grupo que consiste en ferricianuro, ferroceno, derivados de ferroceno, complejos de osmio-bipiridilo y derivados de quinona.
23. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el primer potencial electrico se aplica durante un tiempo de duracion que oscila de 1 segundo a 5 segundos.
24. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el segundo potencial electrico se aplica durante un tiempo de duracion que oscila de 1 segundo a 5 segundos.
25. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el segundo y tercer valores de corriente se calculan a diferentes intervalos de tiempo.