ES2590259T3 - Compuestos y procedimientos para el tratamiento de convulsiones y trastornos paroxísticos - Google Patents

Abstract

Una cantidad eficaz de un compuesto antiglicolítico elegido de 2-desoxiglucosa, 3-desoxi-D-glucosa, 4-desoxi-Dglucosa, 5-desoxi-D-glucosa, 2,n-desoxi-D-glucosa, donde n >= 3-5, n,m desoxi-D-glucosa, donde n >= 2-5 y m >= números enteros de 2-5 excluido el n, para su uso en el tratamiento o prevención de la epilepsia o convulsiones en un ser humano adulto o en uno joven.

Description

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antiepiléptico. Como la activación progresiva es un modelo reconocido en la técnica de la epilepsia progresiva e intratable (Cavazos y col., 1991, Journal of Neuroscience 11: 2795-2803), estos resultados también apoyan el uso de 2-DG y sus congéneres químicos relacionados como una nueva clase de fármacos anticonvulsivos y antiepilépticos que pueden trabajar donde fracasan los fármacos actuales.

La 2-DG se conoce en la técnica y ella misma y sus derivados se han utilizado en medicina, en particular como una molécula trazadora de radiomarcado en los escáneres de tomografía por emisión de positrones (TEP) de miocardio para el diagnóstico de enfermedad cardíaca isquémica y ataques cerebrales en seres humanos, así como ciertas enfermedades malignas (véase, www.fda.gov/cder/regulatorv/pet/fdgoncologyfinal.htm consultada el 23 de diciembre de 2003). La 2-DG se ha utilizado también como un agente quimioterapéutico contra el cáncer de mama (Kaplan y col., 1990. Cancer Research 50: 544-551).

Tal como se establece en el presente documento, se entenderá que las composiciones farmacéuticas que comprenden 2-DG y los procedimientos que utilizan dichas composiciones incluyen preparaciones de 2desoxiglucosa como el estereoisómero D-, así como mezclas racémicas del mismo que comprenden cualquier combinación de 2-desoxiglucosa D-y L-, siempre que el porcentaje del estereoisómero D-sea mayor que cero. La 2-DG está disponible comercialmente, y preferiblemente se produce de acuerdo con las normas y directrices de la industria farmacéutica y de conformidad con todos los requisitos reglamentarios pertinentes. La 2-DG también se puede sintetizar utilizando procedimientos bien establecidos en la técnica (véase, por ejemplo, THE MERCK INDEX, 12ª Ed., Monograph 2951, Nueva Jersey: Merck & Co., 1997; Bergmann y col., 1922, Ber. 55: 158; Snowden y col., 1947, JACS 69: 1048; Bolliger y col., 1954, Helv. Chim. Acta 34; 989; Bolliger, 1962, "2-Deoxy-D-arabino-hexose (2Deoxy-d-glucose)”, en METHODS IN CARBOHYDRATE CHEMISTRY, vol. I, (Whistler y Wolfram, eds.), New York Academic Press, pág. 186, 189).

La invención también proporciona realizaciones de dichos compuestos antiglicolíticos como composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento o la prevención de la epilepsia o de las convulsiones en un ser humano adulto o en uno joven. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera que sea conocida en sí misma, p. ej., por medio de procesos de mezclado, disolución, granulado, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización convencionales.

Las composiciones farmacéuticas de los compuestos antiglicolíticos definidos en el presente documento pueden formularse y administrarse a través de diversos medios, incluidos la administración sistémica, localizada o tópica. Las técnicas para la formulación y administración se pueden encontrar en "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA. El modo de administración puede ser seleccionado para maximizar la entrega en un sitio diana deseado en el cuerpo. Las rutas adecuadas de administración pueden, por ejemplo, incluir la administración oral, rectal, transmucosal, transcutánea o intestinal; la administración parenteral, incluidas las inyecciones intramuscular, subcutánea e intramedular, así como las inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Como alternativa, los compuestos antiglicolíticos se pueden administrar de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del compuesto directamente en un tejido específico, a menudo en una formulación de depósito o de liberación sostenida.

Específicamente, los compuestos y formulaciones antiglicolíticas se pueden administrar localmente por dispositivos y sistemas de infusión locales para lograr efectos locales en los tejidos.

Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular así de manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de compuestos antiglicolíticos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la ruta de administración elegida.

Los compuestos antiglicolíticos se pueden formular para administración parenteral por inyección, p. ej., mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los compuestos antiglicolíticos se pueden preparar como suspensiones para inyecciones oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril libre de pirógenos,

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antes de su uso. Los compuestos pueden formularse también en composiciones rectales tales como supositorios o enemas contra la retención, p. ej., que contengan bases para supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Para inyección, los compuestos antiglicolíticos se pueden formular en soluciones acuosas apropiadas, tales como tampones fisiológicamente compatibles como la solución de Hank, la solución de Ringer, la solución de Ringer lactato, o el tampón de solución salina fisiológica. Para administración transmucosal y transcutánea, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados para la barrera a impregnar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Para la administración oral, los compuestos antiglicolíticos pueden formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse con excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, añadiendo después auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa y almidón tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, celulosa microcristalina, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, pueden usarse las soluciones de azúcar concentradas, que puede contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes o mezclas de disolventes orgánicos adecuados. A los recubrimientos de comprimidos o grageas pueden añadirse colorantes o pigmentos para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.

Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas, fabricadas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos antiglicolíticos pueden estar disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administración. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración mediante compuestos antiglicolíticos de inhalación para uso según la presente invención se suministran convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol desde envases presurizados o desde un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para entregar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para uso en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos antiglicolíticos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, de forma subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos antiglicolíticos se pueden formular con materiales adecuados poliméricos o hidrófobos (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.

Un vehículo farmacéutico para las realizaciones hidrófobas de los compuestos antiglicolíticos de la invención es un sistema co-disolvente que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua, y una fase acuosa. El sistema co-disolvente puede ser el sistema co-disolvente VPD. VPD es una solución de 3 % peso/vol. de alcohol bencílico, 8 % peso/vol. de tensioactivo no polar polisorbato 80, y 65 % peso/vol. de polietilenglicol 300, enrasado con etanol absoluto. El sistema co-disolvente VPD (VPD:5W) consiste en VPD diluido

1:1 con una dextrosa al 5 % en solución acuosa. Este sistema co-disolvente disuelve bien los compuestos hidrófobos, y él mismo produce baja toxicidad tras la administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de un sistema co-disolvente pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes co-disolventes se pueden variar: por ejemplo, en lugar de polisorbato 80 pueden usarse otros tensioactivos no polares de baja toxicidad; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede variarse; otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, p. ej., polivinilpirrolidona; y otros azúcares o polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa.

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Como alternativa, se pueden emplear otros sistemas de entrega. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro o portadores para fármacos hidrófobos. También pueden emplearse ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque normalmente a costa de una mayor toxicidad. Además, los compuestos antiglicolíticos pueden ser entregados utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Diversos materiales de liberación sostenida se han establecido y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar los compuestos antiglicolíticos desde unas pocas semanas hasta más de 100 días.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes adecuados en fase sólida o gel. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir su finalidad prevista. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad eficaz para impedir el desarrollo de o para aliviar los síntomas existentes del sujeto a tratar. La determinación de las cantidades eficaces está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada en el presente documento.

La invención también proporciona formulaciones de los compuestos antiglicolíticos como productos alimenticios, complementos alimenticios o como un componente de un alimento para un animal, preferiblemente un ser humano, más preferiblemente un ser humano con epilepsia y lo más preferiblemente seres humanos adultos o en jóvenes con epilepsia médicamente refractaria o resistente a los medicamentos.

Para cualquiera de los compuestos antiglicolíticos utilizados en la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro, como se ha descrito en el presente documento, o utilizando sistemas de modelos animales reconocidos en la técnica o una combinación de los mismos. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante que incluye la EC50 (dosis eficaz para un aumento del 50 %) como se determina in vitro, es decir, la concentración del compuesto de ensayo que alcanza la mitad de la cantidad máxima de frecuencia de los ataques. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis específica para cualquier paciente particular dependerá de diversos factores que incluyen la actividad de los compuestos antiglicolíticos empleados, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración, y la tasa de excreción, combinación de fármacos, la gravedad y la extensión del trastorno convulsivo particular, en la terapia que experimenta el paciente y el criterio del médico que prescribe y, en particular, la edad del paciente, que puede ser un adulto, un joven, un niño o un bebé.

Los compuestos antiglicolíticos preferidos proporcionados por la invención tendrán ciertas propiedades farmacológicas. Tales propiedades incluyen, pero no se limitan a la biodisponibilidad oral, baja toxicidad, baja unión a proteínas séricas y deseables semivida in vitro e in vivo. Los ensayos pueden ser usados para predecir estas propiedades farmacológicas deseables. Los ensayos usados para predecir la biodisponibilidad incluyen el transporte a través de monocapas de células intestinales humanas, que incluyen monocapas de células Caco-2. La unión a proteínas séricas puede predecirse a partir de ensayos de unión de albúmina. Tales ensayos se describen en una revisión de Oravcová y col., (1996, J. Chromat B 677: 1-27). Las semividas in vitro de compuestos antiglicolíticos pueden predecirse a partir de ensayos de semivida microsómica como se describe por Kuhnz y Gieschen (1998, Drug Metabolism and Disposition, 26: 1120-1127).

La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos antiglicolíticos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, p. ej., para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación entre LD50 y ED50. Se prefieren los compuestos antiglicolíticos que muestran altos índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos antiglicolíticos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser escogidas por el médico personal a la vista del estado del paciente (véase, p. ej., Fingl y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1, pág. 1).

Por ejemplo, la cantidad de la dosificación y el intervalo de administración de la 2-DG se pueden ajustar individualmente para reducir la frecuencia de los ataques, duración o la intensidad de la dosis desde 250 mg/kg o menos hasta la más alta tolerada para reducir la frecuencia de los ataques y minimizar la toxicidad. Dosis de 650 mg/kg fueron bien toleradas en ratas. Los efectos anticonvulsivos de 2-DG administrada a 250 mg/kg dos veces al

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día durante 3 meses duraron aproximadamente 8 semanas después de suspender la 2-DG mientras se continúa la estimulación dos veces al día, lo que indica que los efectos de la 2-DG se prolongan bastante. Un médico experto en la técnica puede ajustar la dosis en el intervalo hasta 500 a 600 mg/kg y el calendario de administración que produce efectos anticonvulsivos y antiepilépticos prolongados. Las cantidades de dosificación eficaces se pueden ajustar a aproximadamente 14 mg/kg de 2-DG en niños y 40 mg/kg de 2-DG en adultos, utilizando las medidas de eficacia terapéutica (p. ej., disminución en la frecuencia o gravedad de los ataques) como un criterio para establecer niveles de dosificación eficaces.

Para las realizaciones alternativas, los compuestos antiglicolíticos de este tipo inhiben reversiblemente la glicólisis, la cantidad de dosificación y el calendario de administración de dichos compuestos se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles de plasma de los compuestos antiglicolíticos que sean suficientes para reducir la frecuencia, la duración o la intensidad de los ataques.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar antes, durante o después de la ocurrencia de un evento paroxístico tal como un ataque, especialmente un ataque epiléptico, y la vía de administración y dosis administrada elegida en consecuencia. Por ejemplo, la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención durante un ataque será preferiblemente una dosificación rápidamente biodisponible que utilice una vía de administración segura y eficaz (entre otras, que pueden no incluir formulaciones orales en estas realizaciones).

Los usos de la invención reducen la frecuencia, la duración o la intensidad de los ataques en un animal, preferiblemente un ser humano adulto o en uno joven. La invención es eficaz para reducir la frecuencia, duración o intensidad de los ataques en al menos el 50 %, más preferiblemente el 60 %, más preferiblemente el 70 %, más preferiblemente el 80 %, más preferiblemente el 90 %, más preferiblemente el 95 %, más preferiblemente el 98 %, y más preferiblemente el 99 % de los pacientes tratados. En realizaciones preferidas, la invención se pone en práctica utilizando las composiciones farmacéuticas de la invención como se describe en el presente documento.

Los Ejemplos que siguen son ilustrativos de realizaciones específicas de la invención, y de varios usos de las mismas. Se exponen únicamente con fines explicativos, y no deben ser tomados como limitantes de la invención.

Ejemplo 1

Acciones anticonvulsivas y antiepilépticas de 2-DG contra ataques de activación progresiva

Los efectos anticonvulsivos y antiepilépticos de 2-desoxiglucosa (2-DG) se evaluaron en el modelo de activación progresiva de la epilepsia del lóbulo temporal.

En el modelo de la activación progresiva, la activación repetida de rutas neuronales in vivo induce ataques electrográficos y conductuales progresivos, aumentos permanentes de la susceptibilidad a ataques adicionales, y finalmente ataques espontáneos (Goddard y col., 1969, Experimental Neurology. 25: 295-330; Pinel, 1978, Experimental Neurology 58: 190-202; Wada y col., 1975, Canadian Journal of Neurological Sciences 2: 477-492; Sayin y col., 2003, Journal of Neuroscience. 23: 2759-2768). La activación progresiva se ha convertido en el modelo experimental de la epilepsia más ampliamente estudiado (McNamara, 1999, Nature 399: A15-22). En un protocolo típico de activación progresiva, la estimulación periódica suministrada una vez o dos veces al día provoca poco a poco una creciente posdescarga (PD) eléctrica sincronizada o ataque electrográfico acompañado de un ataque conductual. Una vez que los ataques de activación progresiva se han inducido repetidamente, la susceptibilidad a ataques repetidos es para toda la vida y por ello puede considerarse permanente. La activación progresiva puede ser inducida por la activación eléctrica o química de diversas rutas neuronales en una variedad de especies que incluyen anfibios, mamíferos y primates (Morrell y Tsuru, 1976, Electroencephalografy and Clinical Neurophysiology

40: 1-11); Wada y Mizoguchi, 1984; Epilepsia 25: 278-287). Debido a que la activación progresiva induce alteraciones permanentes en el cerebro y puede ser provocada en una variedad de especies por diversos estímulos, se ha considerado como un fenómeno de plasticidad cerebral a largo plazo, así como un modelo de epilepsia del lóbulo temporal. Las características conductuales de ataques repetidos de activación progresiva breve provocados por la estimulación límbica se asemejan a los ataques parciales complejos humanos con generalización secundaria. En las primeras etapas de activación progresiva límbica en roedores, cada estimulación provoca una PD acompañada de un ataque parcial breve, que progresa hasta ataques generalizados secundarios provocados por estímulos. Esta característica es un ejemplo de las alteraciones funcionales progresivas inducidas por activación progresiva que son epileptógenas.

Experimentos in vivo para demostrar los efectos anticonvulsivos y antiepilépticos de 2-DG se realizaron de la forma siguiente. Ratas macho adultas Sprague-Dawley (con un peso entre 250-350 g, obtenidas de Harlan, Madison, WI) fueron anestesiadas con ketamina (80 mg/kg por vía intramuscular) y xilacina (10 mg/kg por vía intramuscular), y fueron implantadas estereotácticamente con un electrodo bipolar de acero inoxidable aislado para la estimulación y registro. El electrodo fue implantado en el bulbo olfatorio (9,0 mm anterior, 1,2 mm lateral, 1,8 mm ventral con respecto al bregma) o la ruta perforante (8,1 mm posterior, 4,4 mm lateral, 3,5 mm ventral con respecto al bregma), y se fijó al cráneo con acrílico. Después de un período de recuperación de dos semanas después de la colocación del electrodo, las ratas implantadas, sin restricciones, despiertas, recibieron estimulación de activación progresiva dos

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Tabla 1

PD para Clase 3

PD para Clase 4 PD para Clase 5

2-DG

16,7  3,1 20,9  4,0 27,7  6,0

Solución salina

6,6  1,3 9,3  0,9 12,9  1,3

El efecto de la 2-DG en el umbral de PD también se ilustra en la Figura 3 para una rata de activación progresiva que experimenta ataques provocados repetidos. Los ataques provocados repetidos eran acompañados de una disminución gradual del umbral de PD, que era inicialmente 1.500 A a 200 A. La administración intraperitoneal (IP) de 2-DG a una dosis de 250 mg/kg inducía gradualmente un incremento en el umbral de PD hacia 1.500 A durante un período de aproximadamente 2-3 semanas de estimulación dos veces al día, lo que sugería que el efecto anticonvulsivo de 2-DG puede continuar desarrollándose gradualmente durante la administración repetida. El efecto anticonvulsivo gradualmente creciente sobre el umbral de PD era también bastante prolongado, ya que el umbral de PD se mantenía elevado durante hasta 6 semanas después de suspender el tratamiento de 2-DG dos veces al día.

Ejemplo 2

Efecto de 2-DG en estallido sincronizado en laminillas de hipocampo

Para confirmar aún más los efectos anticonvulsivos de 2-DG observados en ratas con activación progresiva, se evaluó el efecto de la 2-DG en el estallido sincronizado inducido por elevación de la [K+]o, en laminillas de hipocampo de rata ex corpora.

En estos experimentos, el día 14 posnatal, 35 ratas macho Sprague-Dawley fueron anestesiadas y decapitadas. Se extrajeron los cerebros y se transfirieron a líquido cefalorraquídeo frío artificial (ACSF), que comprendía NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgSO4 1,5 mM y NaHCO3 26 mM, complementado con glucosa 10 mM), que se burbujeó de forma continua con 95 % de O2 y 5 % de CO2. Las laminillas de hipocampo transversales (400 micrómetros) se prepararon en un micrótomo de cuchilla vibratoria Leica VT1000 S (Wetzlar Alemania). Se dejó que las laminillas se recuperaran durante 1 hora a temperatura ambiente y después se transfirieron a una cámara de registro de la interfaz a 34 ºC en ACSF con [K+]o de 7,5 mM. Se hicieron registros extracelulares de la región CA3 con un Axioclamp 2B (Axon Instruments, Forest City, CA) utilizando un microelectrodo de vidrio relleno de NaCl 150 mM. Los datos se registraron y analizaron utilizando PClamp8 (Axon Instruments).

El estallido sincronizado se indujo por incubación de laminillas de hipocampo en ACSF complementado con una concentración final de [K+]o de 7,5 mM. Los registros de la línea de base se obtuvieron después de exposición a [K+]o elevada durante 1 hora y la frecuencia de ráfaga se había estabilizado. A continuación, el estallido se registró en ACSF que contenía 2-DG 1 mM. Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 4A a 4C. La frecuencia de ráfaga disminuyó progresivamente después de la adición de 2-DG como se muestra en los registros de la Figura 4B y 4C y en los gráficos de barras en las Figuras 5A y 5B.

Como se muestra en la Figura 5B, los efectos anticonvulsivos de 2-DG persistieron hasta 60 minutos después del retorno de la laminilla de hipocampo al ACSF que contenía [K+]o de 7,5 mM, pero sin 2-DG. Este hallazgo era congruente con estudios previos que demuestran que la 2-DG queda atrapada en las células después de la absorción por el transportador de glucosa, y la 2-DG, probablemente, no es arrastrada fuera del tejido.

Para determinar además si los efectos anticonvulsivos de 2-DG se debieron al suministro disminuido de energía a las neuronas y células cerebrales como resultado de la inhibición de la glicólisis, se evaluaron los efectos de la 2-DG en el estallido cuando se suministraba lactato como una fuente de energía alternativa. Como se demostraba en la Figura 5C, la adición de 2-DG 1 mM disminuía el estallido en presencia de lactato 20 mM, lo que indica que los efectos anticonvulsivos de 2-DG no se pueden atribuir a la disminución del suministro de energía por la inhibición de la glicólisis mediante 2-DG.

Ejemplo 3

Disminución de estallido sincronizado mediante yodoacetato

Para confirmar que los resultados expuestos anteriormente se debieron a efectos antiglicolíticos, los experimentos expuestos en el Ejemplo 2 se repitieron utilizando ACSF complementado con glucosa 10 mM o lactato 10 mM en presencia de yodoacetato 200 M, un inhibidor de la enzima glicolítica, la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa

(E.C. 1.2.1.12). Los resultados de estos experimentos se muestran en las Figuras 6 y 7. La Figura 6 muestra la tasa del estallido sincronizado de la línea de base de una laminilla de hipocampo en ACSF con [K+]o 10 mM, glucosa 10 mM y lactato 20 mM. La disminución en la frecuencia de ráfaga se muestra en forma gráfica en la Figura 7. El yodoacetato disminuyó el estallido sincronizado, lo que demuestra que la inhibición de la glicólisis por la inhibición de la gliceraldehido fosfato deshidrogenasa es también un medio eficaz para la disminución de la sincronización

neuronal, el evento celular asociado con diversos trastornos convulsivos.

Ejemplo 4

Efecto de la fuente de energía sobre el estallido sincronizado inducido en laminillas de hipocampo

Para investigar más a fondo las acciones anticonvulsivas de 2-DG, se evaluaron también los efectos de la falta de 5 glucosa sobre las descargas de ráfagas epilépticas.

Los efectos de la falta de glucosa sobre las descargas de ráfagas sincronizadas se examinaron en laminillas de hipocampo de rata ex corpora utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 2. Las ráfagas sincronizadas espontáneas se registraron en CA3 en ACSF que contenía glucosa 10 mM complementada con [K+]o 7,5 mM durante ~1 h, y después en ACSF exento de glucosa complementado con lactato 10 mM o piruvato 10 mM. Los 10 resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 8. Se encontró que la frecuencia media de las ráfagas en la línea de base en glucosa 10 mM era regular con un intervalo entre ráfagas de 3,8 segundos. El intervalo entre ráfagas aumentó a 24 segundos cuando la laminilla se expuso a ACSF exento de glucosa complementado con lactato 10 mM, lo que indica un efecto anticonvulsivo de falta de glucosa. Este efecto era rápidamente inducido y era reversible, con el efecto de la desaceleración observada dentro de 5-10 minutos, y la recuperación de los valores de

15 la línea de base dentro de los 10 minutos después de la retorno a ACSF que contenía glucosa 10 mM. Resultados similares se encontraron cuando la glucosa se sustituyó por piruvato 10 mM. Estos resultados demostraron que la eliminación de la glucosa y la sustitución por fuentes de energía alternativas tales como lactato o piruvato suprimen las ráfagas sincronizadas en CA3 y tienen efectos anticonvulsivos.

Claims (1)

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