ES2586837T3 - Método para la expansión in vivo de linfocitos T reguladores - Google Patents

Abstract

Un agonista de TNFR25 para su uso en un método para retrasar el rechazo agudo de un órgano o tejido trasplantado en un sujeto, en el que el agonista de TNFR25 es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a TNFR25, o en el que el agonista de TNFR25 es una fusión del ligando 1A análogo al factor de necrosis tisular -Ig (fusión TL1A-Ig).

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la expansion in vivo de linfocitos T reguladores Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con n.° de serie 61/273.299, presentada el 3 de agosto de 2009.

Campo de la invencion

Las realizaciones de la divulgacion se refieren a composiciones y metodos para regular los linfocitos T in vivo. En particular, las composiciones y metodos regulan los linfocitos CD4+FoxP3+ humanos.

Antecedentes

La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF) consiste en al menos 19 ligandos y 30 receptores (TNFRSF) que se expresan diferencial y temporalmente en celulas linfoides y no linfoides. En los linfocitos TCD3+, la senalizacion de TNFSF funciona de manera espedfica y no espedfica del antfgeno para soportar varias fases de la respuesta inmunitaria, incluyendo la polarizacion, la expansion, la funcion efectora, la contraccion, la memoria y la muerte. TNFSF15 (TL1A) es el ligando para TNFRSF25 (DR3, denominado a partir de ahora en el presente documento TNFR25). El ligando 1A analogo a TNF (TL1A) se describe en Meylan et al. 2008. Immunity 29: 79-89, Migone et al. 2002. Immunity 16: 479-492, Prehn et al. 2004. Clinical Immunology 112: 66-77, Takedatsu et al. 2008. Gastroenterology 135: 552-567 y Bamias et al. 2006. PNAS 103: 22: 8441-8446. TL1A puede modular los linfocitos T y NKT que expresan TNFR25 tanto positiva como negativamente, estimulando las cascadas de senalizacion de TRADD o FADd mediante la cola citoplasmica que contiene el dominio muerte de TNFR25. La senalizacion de TNFR25 es un importante contribuyente a la patologfa observada en una gama de dolencias autoinflamatorias, incluyendo asma, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) y artritis reumatoide (AR). El bloqueo de anticuerpos de TL1A puede evitar el asma aguda en ratones y la inactivacion genetica de TNFR25 debilita significativamente los acontecimientos patologicos en modelos experimentales de EAE o AR. TL1A contribuye al desarrollo de esta enfermedad potenciando la polarizacion, la diferenciacion y la funcion efectora de los linfocitos NKT, Th2 y Th17.

El documento WO 2007/027751 describe agonistas de TNFR25 que tienen una actividad antiinflamatoria y un efecto de cicatrizacion y en particular que representan modificadores de la respuesta biologica que alteran la interaccion entre las defensas inmunitarias celulares del cuerpo y las celulas cancerosas para reforzar, dirigir, o restaurar la capacidad del cuerpo de combatir el cancer cuando se administra con vacunas tumorales.

Sanchez-Fueyo et al. 2004. Inmunologia 23: 2: 231-238 describen que los linfocitos TReg CD4+CD25+ juegan un papel central en la induccion de tolerancia al aloinjerto periferico y que la transferencia de linfocitos TReg CD4+CD25+ en un modelo de transferencia adoptivo de aloinjerto de piel puede evitar el rechazo al aloinjerto.

Sumario

Se muestran aspectos de la presente invencion en las reivindicaciones independientes. Se muestran las caractensticas preferidas de estos aspectos en las reivindicaciones dependientes. El siguiente Sumario se proporciona para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la invencion. Se afirma con el entendimiento de que este no se usara para interpretar o limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.

La senalizacion a traves del miembro 25 de la superfamilia del receptor TNF (TNFRSF25, DR3) en linfocitos T CD4+, cuando se expresa constitutivamente, potencia la produccion de las citoquinas Th2 y Th17 y contribuye a la inflamacion patologica en modelos de enfermedad del asma, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple (MS), encefalitis autoinmunitaria experimental y artritis reumatoide.

En las realizaciones preferidas, los agentes que modulan la senalizacion de TNFRSF25, modulan la respuesta celular inmunitaria. Estos agentes proporcionan novedosos tratamientos para sus enfermedades y dolencias. Por ejemplo, un agonista de TNFRSF25 conduce a la rapida y extensa expansion in vivo de los linfocitos CD4+FoxP3+ al 30-35 % de todos los linfocitos CD4+ en cuatro dfas de administracion. La sensibilizacion de los linfocitos CD4+FoxP3+ era debida a la proliferacion aumentada de los linfocitos CD4+FoxP3+CD25+ que expresan elevados niveles de GITR y CD 103. El agonista de TNFRSF25 expandio los linfocitos CD4+FoxP3+ de la actividad supresora dependiente de TGF-p retenida ex vivo, que sin embargo era susceptible a la abrogacion mediante la senalizacion continuada de TNFRSF25. La senalizacion de TNFRSF25, ademas de modular las respuestas de las celulas efectoras, juega un importante papel en la induccion y la resolucion de respuestas inflamatorias mediante el control de la expansion y actividad de los linfocitos T reguladores.

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Breve descripcion de los dibujos

Las Figuras 1A-1C: muestran que TNFR25 estimula la rapida proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+ in vivo. Figura 1A: Expresion diferencial de TNFR25, GITR, OX40 y 4-1BB sobre linfocitos T convencionales y reguladores. Se determino la expresion de TNFRSF mediante citometna de flujo sobre linfocitos (Tconv) CD4+FoxP3" muy purificados y linfocitos Treg CD4+FoxP3+ procedentes de esplenocitos recogidos de ratones FIR no tratados. Figura 1B: Cinetica y la expansion dependiente de la dosis de los linfocitos Treg CD4+FoxP3+ en sangre periferica tras la inyeccion de 4C12. Se inyectaron ratones (FIR) con el iniciador FoxP3-RFP por via intraperitoneal (i.p.) con la cantidad de 4C12 indicada. Los ratones se sangraron diariamente y se analizo la expresion de FoxP3-RFP en celulas de sangre periferica mediante citometna de flujo. Figura 1C: Se comparo la expansion de los linfocitos Treg tras el tratamiento con otros anticuerpos agomsticos de TNFR. Se inyectaron los ratones por via i.p. con los anticuerpos indicados (100 |jg) en el dfa 0. Los ratones se sangraron diariamente como en la Figura 1B durante 6 dfas, se muestra el porcentaje de linfocitos Treg de sangre periferica de los linfocitos T CD4+ totales en el dfa 4. Estos datos se han reproducido en 8 experimentos independientes. Las barras de errores indican promedio ± SEM. Se determino la significancia mediante el test de la t de student (Figura 1B) o mediante un ANOVA monolateral con la prueba posterior de Tukey (Figura 1C). * indica p<0,05, ** indica p<0,01, *** indica p<0,001.

Las Figuras 2A-2F muestran que TNFR25 indujo que la expansion de los linfocitos Treg requiere la senalizacion de TCR e IL-2. Los linfocitos CD4+ estaban muy purificados mediante la tecnica de clasificacion de FACS a partir de ratones FIR y se transfirio adoptivamente en ratones MHCII"7" o CD4-/". Tras la transferencia adoptiva, se trataron los ratones receptores tanto con 4C12 como con un anticuerpo control isotipo y se analizo el porcentaje (Figura 2A) y el numero absoluto de celulas positivas (Figura 2B) de Foxp3-RFP 4 dfas despues del tratamiento con anticuerpos. Se trataron ratones FIR con ciclosporina-A (Figura 2C) o FK506 (Figura 2D) o un vetuculo control desde el dfa 1 al dfa 4 mediante inyeccion i.p. como se describe en los metodos. Se trataron los ratones tanto con anticuerpo 4C12 como con anticuerpo IgG control y se analizo la proporcion de celulas positivas para FoxP3-RFP con respecto a los linfocitos CD4+ totales en la sangre periferica en el dfa 4. Se analizaron ratones deficientes en el receptor p de IL-2 (Figura 2E) o ratones CD80/86'r(Figura 2F) para la proporcion de linfocitos CD4+FoxP3+ de los esplenocitos CD4+ totales 4 dfas despues del tratamiento tanto con 4C12 como isotipo del anticuerpo control, en comparacion con los ratones C57BL/6 del control. Estos datos se representan como el promedio ± S.E.M. de al menos 2 experimentos independientes con ±3 ratones por grupo por experimento. **indica p<0,01, ***indica p<0,001.

Las Figuras 3A-3E muestran que TNFR25 expandio los linfocitos Treg son hipersensibles a IL-2 y requieren la activacion de Akt. Figura 3A: Se purificaron linfocitos CD4+FoxP3+ procedentes de ratones FIR en el dfa 4 despues del tratamiento IgG del control o anticuerpos 4C12 y se incubaron con las cantidades indicadas de IL-2 in vitro. Se midio la proliferacion de los linfocitos CD4+FoxP3+ en el dfa 3 del cultivo mediante la incorporacion de timidina tritiada. Figura 3B: Se purificaron los linfocitos CD4+FoxP3+ como en la (Figura 3A) y se determino la expresion superficial de IL-2Ry (CD 132) o IL-2Rp (CD 122) mediante citometna de flujo. Figura 3C: Linfocitos CD4+FoxP3+ purificados a partir de ratones FIR 4 dfas despues del tratamiento con IgG o anticuerpo 4C12 se analizaron para la expresion de pSTAT5 15 minutos despues del tratamiento con 10 ng/ml de IL-2 in vitro. Se trataron los ratones FIR una vez al dfa con rapamicina (Figura 3D) o dos veces al dfa con inhibidor V de Akt (Figura 3E) o un vetuculo control desde el dfa 1 al dfa 4 mediante inyeccion i.p. como se describe en los metodos. Se trataron los ratones tanto con anticuerpo 4C12 como con anticuerpo IgG control en el dfa 0 y se analizo la proporcion de celulas positivas para FoxP3-RFP con respecto a los linfocitos CD4+ totales en la sangre periferica en el dfa 4. Estos datos se representan como el promedio ± S.E.M. de al menos 2 experimentos independientes con ± 2 ratones por grupo por experimento. ns indica no significativo, *** indica p<0,001.

Las Figuras 4A-4E muestran que la expansion de los linfocitos Treg in vivo mediante TNFR25 inhibe la inflamacion en el asma alergica. Se indujo asma alergica mediante inmunizacion con ova/alum seguida por estfmulo con aerosol con ova/PBS como se describe en materiales y metodos. Figura 4A: Se recogio sangre periferica y se analizo para la fraccion de linfocitos CD4+FoxP3+ de los linfocitos T CD4+ totales de los ratones inmunizados con ova/alum en comparacion con los ratones no inmunizados tras el tratamiento tanto con 4C12 como el isotipo del anticuerpo control. Los datos representan el promedio ± SEM. Figura 4B: Se recogieron celulas pulmonares totales y se analizaron mediante citometna de flujo. Se muestras las cantidades totales de cada poblacion celular indicada. Los datos indican el promedio ± SEM. Figura 4C: el porcentaje de linfocitos Treg CD4+FoxP3+ del total de linfocitos T CD4+ T. Figura 4D: Se recogio el fluido de lavado bronquioalveolar (BALF) 3 dfas despues de la aerosolizacion con ova/PBS como se ha descrito. Se muestra el numero total de eosinofilos. Los datos representan el promedio ± SEM. Figura 4E: Se extrajo el ARN total de las celulas pulmonares totales y se uso para la RT-PCR en tiempo real. Se muestran los niveles de expresion de IL-4, IL-5 e IL-13 en 4C12 o los ratones tratados con el isotipo del control con respecto a las celulas pulmonares del control aerosolizadas con solucion salina. Figura 4F: Se recogieron los pulmones y se seccionaron para las secciones histologicas. Se obtuvieron las secciones tenidas con H&E (paneles de la izquierda) asf como las secciones tenidas con PAS (paneles de la derecha) de cada grupo de tratamiento. Se muestran las imagenes representativas. Se han repetido estos datos en cuatro experimentos independientes con al menos 3 ratones/grupo/experimento. Figura 4G: Se cuantificaron las secciones tenidas con PAS utilizando el software Image J como se describe en los metodos. Se cuantificaron dos imagenes representativas de cada uno de ± 5 ratones procedentes de 2 experimentos separados. Se determino la significancia estadfstica mediante ANOVA

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monolateral con la prueba posterior de Tukey. * indica p<0,05, ** indica p<0,01, *** indica p<0,001 tanto de 4C12 como de IAC en comparacion con el grupo IgG o el grupo control con solucion salina, como se ha indicado.

Las Figuras 5A-5F muestran que la estimulacion de TNFR25 conduce a la expansion de los linfocitos Treg in vivo induciendo la proliferacion de los linfocitos CD4+FoxP3+ CD25int existentes. Figura 5A: Se trataron ratones FIR con IgG o 4C12 en el dfa 0 y se recogieron esplenocitos 4 dfas despues y se analizaron mediante citometna de flujo. Graficos de citometna de flujo representativos procedentes de globulos rojos recogidos de ratones 4 dfas despues del tratamiento indicado. Figura 5B: La relacion promedio de los linfocitos Treg CD25hi frente a los linfocitos Treg CD25int en esplenocitos 4 dfas despues del tratamiento indicado. Figura 5C: Se muestran graficos de puntos representativo que se preclasificaron con linfocitos CD4+, FoxP3+. Los porcentajes indican la contribucion de cada fenotipo hacia la fraccion total de linfocitos CD4+FoxP3+. Figura 5D: Se muestra la proporcion promedio de linfocitos Treg Ki67+ o Ki67" entre CD25hi y CD25int tras el tratamiento indicado como se describe en la Figura 5A. Los datos son el promedio ± SEM. Figura 5E: Linfocitos CD4+FoxP3"y Figura 5F: Se clasificaron los linfocitos CD4+FoxP3+ procedentes de ratones FIR CD45.2+ hasta >99 % de pureza y se transfirieron adoptivamente 2 x 106 celulas de cada subconjunto en ratones B6-SJL CD45.1 congenicos. 24 h despues, se inyectaron los ratones por via i.p. con 20 mg de 4C12 o IgG, respectivamente. Figuras 5E, 12G: Transferencia de linfocitos CD4+FoxP3"y linfocitos CD4+FoxP3+ (Figuras 5F, 5H) en ratones CD45.1 B6-SJL congenicos. Figuras 5E, 5F: Histograma que muestra el porcentaje de CD45.2+ y linfocitos RFP+ (FoxP3+) entre los linfocitos CD4+ en el dfa 5 tras la transferencia adoptiva. Figuras 5G, 5H: Cinetica de contraccion de las celulas transferidas tras el tratamiento con 4C12 o IgG de hamster. Se muestran los porcentajes de linfocitos transferidos (CD45.2+CD4"+) de los linfocitos hospedadores CD45.1+CD4+FoxP3" (Figura 5E) o de los linfocitos CD45.2+CD4+FoxP3+ de los linfocitos hospedadores CD45.1+ CD4+ (Figura 5F). Las barras de errores indican el porcentaje promedio ± SEM de 3 ratones por grupo por cada dos experimentos independientes. ** indica p<0,05, y *** indica p<0,01.

Las Figuras 6A-6F muestran la actividad supresora de los linfocitos Treg expandidos in vivo. Se clasificaron los linfocitos Treg CD4+FoxP3+ procedentes de ratones inyectados con 4C12 y el isotopo del control IgG en el dfa 4 y se sometieron a un ensayo de supresion normalizado in vitro utilizando linfocitos CD4+FoxP3"CD25" como linfocitos Tconv a-CD3 solubles (2 pg/ml) durante 72 h (96 pocillos, placa con el fondo redondeado). El ensayo se llevo a cabo en ausencia (Figuras 6A ,6C) o presencia (Figura 6B, 6D) de 1:1 de celulas presentadoras de antfgenos (APC) utilizando diferentes relaciones de linfocitos Treg: linfocitos Tconv (Figuras 6A, 6B). En las Figuras 6C y 6D, IgG, 4C12 o DTA1 (10 g/ml) se anadieron anticuerpos al ensayo de supresion. La relacion linfocitos Treg : linfocitos Teff se mantuvo constante en una relacion 1:2. Figura 6E: Se utilizaron linfocitos Teff procedentes de ratones dominantes negativos (DN) TNFR25 y de linfocitos Treg procedentes de ratones silvestres. Se anadieron anticuerpos IgG o 4C12 (10 pg/ml) al ensayo de supresion. La relacion linfocitos Treg : Teff es 1:2. Figura 6F: Se utilizaron linfocitos Treg CD4+CD25hi y CD4+CD25int procedentes de ratones a los que se habfa inyectado IgG o 4C12. Se anadio 3H- timidina durante las ultimas 6 h antes de que el ensayo se analizara en un contador por centelleo. Se calculo el porcentaje de proliferacion utilizando los recuentos obtenidos para la condicion indicada como porcentaje de los recuentos totales en pocillos que conteman linfocitos Teff en ausencia de linfocitos Treg. Los datos se expresan como promedio ±SEM con ± 4 muestras para cada condicion en cada uno de dos experimentos independientes con > 6 ratones por grupo por experimento.

Las Figuras 7A, 7B muestran la comparacion de los linfocitos Treg expandidos mediante tratamiento con 4C12 o complejo de IL-2 recombinante/anticuerpo dirigido contra IL-2 (IAC). Figura 7A: Se trataron ratones FIR con 4C12 (10 pg) en el dfa 0 o con una serie de tres inyecciones con IAC en los dfas 0-2. Se midio la proporcion de linfocitos FoxP3+ en la poblacion de linfocitos T CD4+ en la sangre periferica diariamente mediante citometna de flujo. Figura 7B: Se aislaron esplenocitos procedentes de 4 ratones FIR en el dfa 4 despues del tratamiento con IAC, 4C12 o la IgG de control de isotipo. Se muestran la proporcion de linfocitos CD4+FoxP3+ que expresan CD25 y el marcador de proliferacion Ki67.

Las Figuras 8A-8D muestras que el tratamiento con 4C12 induce la expansion de los linfocitos Treg en todos los tejidos analizados. Figura 8A: Un ejemplo de un grafico de puntos de citometna de flujo tfpico para la tincion de linfocitos CD4 y FoxP3 (RFP). Los linfocitos CD4+FoxP3+ procedentes del cuadrante Q2-1 se clasificaron para el posterior analisis de linfocitos CD25hi y CD25int como se muestra en las Figuras 8B-8D. Figura 8B: La relacion de GITR y la Figura 8C: Expresion de CD103 entre linfocitos Treg CD25hi frente a linfocitos Treg CD25int en esplenocitos 4 dfas despues del tratamiento indicado. Figura 8D: Los datos se representan como el promedio ± S.E.M. de al menos 8 experimentos independientes con al menos ±3 ratones por grupo por experimento. Se llevaron a cabo analisis emparejados utilizando el test de la T de students. ** indica p<0,01, y *** indica p<0,001.

Las Figuras 9A-9B muestran un ejemplo de estrategia de clasificacion y los resultados obtenidos. Figura 9A: Se recogieron esplenocitos de ratones FIR, enriquecidos para linfocitos T CD4+ y se clasificaron sobre la base de los linfocitos CD4+ y FoxP3+ (RFP). El panel izquierdo ilustra una poblacion tfpica de esplenocitos enriquecidos en linfocitos CD4. Los paneles intermedio y derecho ilustran el analisis de la clasificacion posterior representativa para las poblaciones de linfocitos CD4+FoxP3-(clasificados P3) y linfocitos CD4+FoxP3+ (clasificados P4). Figura 9B: Para algunos experimentos, los linfocitos CD4+FoxP3+ (clasificados P3) se clasificaron basandose en la expresion de CD25. Se muestran los graficos representativos demostrando la estrategia de clasificacion de los linfocitos CD25hi y los linfocitos CD25int.

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Las Figuras 10A-10E demuestran que los agonistas de TNFRSF25 pueden proteger de la colitis inducida por sulfato de sodio-dextrano, un modelo de raton de la enfermedad de Crohn. Se proporcionaron ratones C57BL/6 o TL1A inactivados geneticamente con sulfato de sodio dextrano al 3 % (DSS) disuelto en agua corriente ad libitum durante 7 dfas. En algunos experimentos, los ratones se trataron en el dfa 0 del experimento con el IgG de control de isotipo o con el anticuerpo agonista de TNFRSF25, el clon 4C12. Se controlo el peso diariamente comenzando 4 dfas antes de la provision de DSS (dfa -4 del experimento). En el dfa -4, un grupo de ratones se trato con el anticuerpo agonista de TNFRSF25, el clon 4C12, mediante inyeccion intraperitoneal (20 pg/raton), y los otros se trataron con IgG de control de isotipo de hamster. Se midio la mortalidad cuando los animales perdieron ± 20 % del peso corporal de partida (Figura 10A). En algunos experimentos, los animales se sacrificaron en el dfa 5 del experimento y se preparo el ARN total utilizando el kit RNeasy miniprep (Qiagen) procedente de tejido colonico lavado con PBS y congelado de forma ultrarrapida. Se posteriormente transcribio de forma inversa el ARN (Quantitect RT, Qiagen) y se amplifico el ADNc mediante la PCR en tiempo real utilizando las sondas Taqman (Applied Biosystems) para los transcritos indicados (Figura 10B). Se muestran los datos como el cambio de veces en la expresion de ratones TL1A inactivados geneticamente en comparacion con ratones C57BL/6 del control. Se controlo el porcentaje de perdida de peso corporal y se represento graficamente durante el curso del estudio en cada grupo experimental (Figura 10C). En los experimentos donde se sacrificaron animales en el dfa 5 del experimento para el aislamiento del ARN se aislaron ganglios linfaticos mesentericos para el analisis, mediante citometna de flujo de la proporcion de linfocitos CD4+ que expresaban el factor de transcripcion FoxP3, indicativo de la reserva de linfocitos T reguladores (Figura 10D). Finalmente, se llevo a cabo la transcripcion inversa utilizando ARN aislado procedente de los grupos de tratamiento indicados como se describe para la Figura 10B y se sometio a la RT-PCR de los transcritos indicados Las barras de errores indican el promedio ± S.E.M. para ± 3 ratones por experimento y un mmimo de 2 experimentos por panel.

La Figura 11 demuestra que los agonistas de TNFRSF25 retrasan el rechazo agudo de los corazones alogenicos en un modelo heterotopico de trasplante en ratones. Para estudiar la induccion de la tolerancia por linfocitos Treg naturales expandidos mediante 4C12, se utilizo un modelo de trasplante de corazon que se describe bien para estudios de tolerancia. Se trasplantaron corazones de ratones CBA/J (H2d) en el abdomen de ratones C57BL/6 (H2b) en el dfa 0. En el dfa -4, un grupo de ratones se trato con el anticuerpo agomstico TNFRSF25, el clon 4C12, mediante inyeccion intraperitoneal (20 pg/raton), con los otros tratados con anticuerpo IgG de control de isotipo de hamster. En el momento del trasplante, se confirmo la expansion de los linfocitos Treg en la sangre en el grupo tratado con 4C12. Se controlo la supervivencia del aloinjerto palpando el corazon manualmente y se califico el pulso en una escala de 0 a 4 (0 = sin pulso; 1 = muy leve; 2 = leve; 3 = moderado; 4 = fuerte). Se define el rechazo como el cese del latido cardfaco palpable. En el momento del rechazo (= cuando el latido cardfaco se detuvo), se retiro el injerto, se fijo la formalina y se sometio a examen patologico. La perdida de funcion del injerto a las 48 h del trasplante se considera un fallo tecnico (<5 %) y se omitio del analisis adicional.

La Figura 12 demuestra que los agonistas TNFRSF25 expanden selectivamente de forma natural, pero no inducida, los linfocitos T reguladores. Se aislaron linfocitos CD4+FoxP3'T de ratones que expresaban un gen indicador FoxP3- RFP y se cultivaron in vitro durante 5 dfas en presencia de IL-2, TGF-p, anticuerpo dirigido contra CD3 y acido retinoico de acuerdo con los protocolos normalizados. A la conclusion del periodo de cultivo, las celulas viables contenidas en la poblacion de linfocitos CD4+ conteman 70-85 % de linfocitos T reguladores inducidos por linfocitos CD4+FoxP3- RFP+ (iTreg). Estas celulas se purificaron mediante clasificacion celular de alta velocidad. De forma simultanea, los linfocitos CD4+ totales se purificaron a partir de ratones que expresaban un gen indicador FoxP3- GFP (estas celulas contienen por tanto una mezcla de iTreg y de linfocitos T reguladores naturales, rtmicamente derivados, asf denominados (nTreg)). iTreg (se mezclaron 6x105linfocitos iTreg con linfocitos CD4+ totales aislados de ratones FoxP3-GFP que conteman 8x105linfocitos Treg) y se transfirieron adoptivamente (mediante inyeccion intravenosa) en ratones receptores CD44'/'. Despues de 2 dfas, los ratones CD4'/_ receptores que conteman una mezcla de linfocitos iTreg positivos para RFP y linfocitos nTreg positivos para GFP se trataron tanto con anticuerpos 4C12 como con el isotipo de los anticuerpos IgG del control (20 pg/raton, mediante inyeccion intraperitoneal). Cinco dfas despues, se determino la proporcion de linfocitos iTreg positivos para RFP y de linfocitos Treg totales positivos para GFP (que contienen la unica fuente de nTreg) mediante citometna de flujo de los esplenocitos aislados (Figura 12).

Descripcion detallada

Las realizaciones descritas en el presente documento, incluyendo aquella de la presente invencion, se describen con referencia a las figuras adjuntas, en las que se utilizan numeros de referencia similares a lo largo de las figuras para designar elementos similares o equivalentes. Las figuras no estan hechas a escala y se proporcionan meramente para ilustrar la presente invencion. A continuacion, se describen algunos aspectos de la invencion con referencia a las aplicaciones a modo de ejemplo para la ilustracion. Debe entenderse que se muestran numerosos detalles, relaciones, y metodos espedficos para proporcionar una comprension completa de la invencion. Una persona normalmente experta en la tecnica relevante, reconocera, sin embargo, facilmente que se puede practicar la invencion sin uno o mas de los detalles espedficos o con otros metodos. La presente invencion no esta limitada por la ordenacion ilustrada de los hechos o acontecimiento, ya que alguno hechos pueden producirse en diferentes ordenes y/o simultaneamente con otros hechos o acontecimientos. Ademas, no se requieren todos los hechos o acontecimientos ilustrados para implementar una metodologfa de acuerdo con la presente invencion.

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Se pretende que todos los genes, nombres de genes, y productos genicos divulgados en el presente documento correspondan a homologos de cualquier especie para la cual son aplicables las composiciones y metodos divulgados. De esta manera, los terminos incluyen, pero no de forma limitativa, los genes y productos genicos de seres humanos y ratones. Debe entenderse que cuando se divulga un gen o producto genico de una especie concreta, se pretende que esta divulgacion sea solo ilustrativa y no se vaya a interpretar como una limitacion a no ser que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De esta manera, por ejemplo, para las moleculas divulgadas en el presente documento, por ejemplo, 4C2 no esta limitada a ratones, pero se prefiere el anticuerpo humano, que en algunas realizaciones se refiera a secuencias de acido nucleico y secuencias de aminoacidos de mairnfero que se pretende que abarquen genes homologos y/u ortologos y productos genicos procedentes de otros animales, incluyendo, pero no de forma limitativa, otros mamnferos, peces, anfibios, reptiles, y pajaros. En las realizaciones preferidas, los genes o secuencias de acidos nucleico son de seres humanos.

Salvo que se defina otra cosa, todos los terminos (incluidos los terminos tecnicos y cientificos) utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente una persona normalmente experta en la tecnica a la cual pertenece la presente invencion. Se entendera ademas que los terminos, tales como los definidos en los diccionarios usados comunmente, deben interpretarse como teniendo un significado que es consistente con su significado en el contexto de la tecnica relevante y no se interpretara en un sentido idealizado o excesivamente formal salvo que se defina expresamente de esta forma en el presente documento.

Definiciones

Ademas, en la extension que los terminos "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o sus variantes se usan tanto en la descripcion detallada como/o en las reivindicaciones, se pretende que dichos terminos sean inclusivos de una manera similar al termino "que comprende".

El termino "alrededor" o "aproximadamente" significa comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor concreto como ha determinado una persona normalmente experta en la materia, que dependera en parte sobre como se mide o determina el valor, es dedr, las limitaciones del sistema medido. Por ejemplo; "alrededor" puede significar comprendido en una desviacion estandar de 1 o mas de 1, para la practica en la materia. Alternativamente, "alrededor" puede significar un intervalo de hasta 20%, preferentemente hasta 10%, mas preferentemente hasta 5 % y aun mas preferentemente hasta un 1 % de un valor dado. De forma alternativa, particularmente con respecto a sistemas o procesos biologicos, el termino puede significar comprendido en un orden de magnitud, preferentemente, en 5 veces, y mas preferentemente en 2 veces, de un valor. Donde los valores concretos se describen en la aplicacion y en las reivindicaciones, salvo que se indique de otra forma, el termino "alrededor" significa comprendido en un intervalo de error aceptable para que deba asumirse el valor concreto.

Un "linfocito T regulador" o "linfocito Treg" o "linfocito Tr" se refiere a una celula que puede modular la respuesta de un linfocito T. Los linfocitos Treg expresan el factor de transcripcion Foxp3, que no esta regulado en exceso tras la activacion de los linfocitos T y discrimina los linfocitos Treg de las celulas efectoras activadas. Los linfocitos Treg se identifican por los marcadores superficiales celulares CD25, CTLA4, y GITR. Se han identificado algunos subconjuntos de linfocitos Treg que tienen la capacidad de inhibir respuestas inflamatorias autoinmunitarias y cronicas y de mantener la tolerancia inmunitaria en hospedadores que soportan tumores. Estos subconjuntos incluyen linfocitos T reguladores de tipo 1 (Tr1) que secretan interleuquina 10- (IL-10-), linfocitos T auxiliares de tipo 3 (Th3) que secretan factor-p de crecimiento transformante (TGF-p-), y linfocitos Treg CD4+/CD25+ "naturales" (Trn) (Fehervari y Sakaguchi. J. Clin. Invest. 2004, 114:1209-1217; Chen y col. Science. 1994, 265: 1237-1240; Groux et al. Nature. 1997, 389: 737-742).

"Agonista de TNFR25", "agente TNFR25" "composicion de TNFR25" se usan de manera indistinta en el presente documento y se refieren a una sustancia que se une al receptor TNFR25 y que estimula una respuesta en la celula sobre la cual se expresa el receptor TNFR25 se expresa de forma similar a una respuesta que se observana exponiendo a un ligando de TNFR25, por ejemplo, TL1a. Un agonista es lo opuesto a un antagonista en el sentido de que aunque un antagonista puede tambien unirse al receptor, este fracasa en activar el receptor y bloquea completa o parcialmente de forma real este de la activacion por los agonistas endogenos o exogenos. Un agonista parcial activa un receptor, pero no produce tanto cambio fisiologico como un agonista completo. De forma alternativa, otro ejemplo de un agonista de TNFR25 es un anticuerpo que es capaz de unirse y activar TNFR25. Un ejemplo de un anticuerpo dirigido contra TNFR es 4C12 (agonista). (Depositado bajo la normativa del Tratado de Budapest en representacion de: la Universidad de Miami; Fecha de recepcion de semillas/cepa(s) por la ATCC®: 5 de mayo de 2009; ATCC ®Designacion del Deposito de Patente: PTA10000. Referencia de Identificacion por el Depositante: Lmea de celulas de hibridoma; 4C12; Se ensayo este deposito el 4 de junio de 2009 y en esta fecha, las semillas/cepa(s) fueron viables. Organismo Depositario Internacional: American Type Culture Collection (ATCC®), Manassas, VA, EE.UU.).

"Antagonista de TNFR25" se denomina en el presente documento una sustancia que inhibe la funcion fisiologica normal de un receptor TNFR25. Dichos agentes trabajan interfiriendo en la union del receptor endogeno a los agonistas/ligandos como TL1A, con el receptor TNFR25.

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Los antagonistas o agonistas de TNFR25 pueden estar en la forma de aptameros. Los "aptameros" son moleculas de ADN o ARN que se han seleccionado entre combinaciones aleatorias basandose en su capacidad para unirse con otras moleculas. Los aptameros se unen espedficamente a una molecula diana en la que la molecula del acido nucleico tiene una secuencia que comprende una secuencia reconocida por la molecula diana en su escenario natural. De forma alternativa, un aptamero puede ser una molecula de acido nucleico que se une a una molecula diana en la que la molecula diana no se une naturalmente a un acido nucleico. La molecula diana puede ser cualquier molecula de interes. Por ejemplo, el aptamero se puede usar para unirse a un dominio de union a ligando de una protema, evitando por lo tanto la interaccion del ligando que se produce naturalmente con la protema. Este es un ejemplo no limitante, y los expertos en la tecnica reconoceran que se pueden generar facilmente otras realizaciones utilizando tecnicas generalmente conocidas en la materia (vease, por ejemplo, Gold et al., Annu. Rev. Biochem. 64763 1995; Brody y Gold, J. Biotechnol. 74:5, 2000; Sun, Cur. Opin. Mol. Ther. 2:100, 2000; Kusser, J. Biotechnol. 74:27, 2000; Hermann y Patel, Science 287:820, 2000; y Jayasena, Clinical Chem. 45:1628, 1999).

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" es inclusivo de todas las especies, incluyendo anticuerpos humanos y humanizados y la diana antigenica, por ejemplo, TNFR25, puede ser de cualquier especie. De esta manera, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra TNFR25 puede ser un anticuerpo de raton dirigido contra TNFR25 humano, un anticuerpo de cabra dirigido contra TNFR25 humano; anticuerpo de cabra dirigido contra TNFR25 de raton; anticuerpo de rata dirigido TNFR25; anticuerpo de raton dirigido contra TNFR25 de rata y similares. Las combinaciones de anticuerpos generados en una determinada especie contra una diana antigenica, por ejemplo, TNFR25, de otras especies, o en algunos casos, de la misma especie (por ejemplo, en respuestas autoinmunitarias o inflamatorias) no tienen lfmites y todas las especies estan abarcadas en la presente invencion. El termino anticuerpo se usa, en el sentido mas amplio e incluye anticuerpos completamente ensamblados, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos humanos, humanizados o quimericos),anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos), y fragmentos de anticuerpos que se pueden unir a un antfgeno (por ejemplo, Fab', F'(ab)2, Fv, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos), que comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las anteriores siempre que presente la actividad biologica deseada.

"Molecula diana" incluye cualquier macromolecula, incluyendo protemas, hidratos de carbono, enzimas, polisacaridos, glucoprotemas, receptores, antfgenos, anticuerpos, factores de crecimiento; o puede ser cualquier molecula organica pequena incluyendo una hormona, sustrato, metabolito, cofactor, inhibidor, farmaco, colorante, nutriente, pesticida, peptido; o puede ser una molecula inorganica incluyendo un metal, ion metalico, oxido metalico, y un complejo metalico; puede ser tambien un organismo completo incluyendo una bacteria, virus, y un eucariota monocelular tal como un protozoo.

"Tratar" o "tratamiento" de un estado, trastorno o dolencia incluye: (1) Evitar o retrasar la aparicion de smtomas clfnicos o subclfnicos del estado, trastorno o dolencia que se desarrolla en un mairnfero que puede padecer o estar predispuesto al estado, trastorno o dolencia pero que no experimenta todavfa o expresa los smtomas clfnicos o subclfnicos del estado, trastorno o dolencia; o (2) inhibir el estado, trastorno o dolencia, es deferir, detener, reducir o retrasar el desarrollo de la enfermedad o una recafda de la misma (en el caso de un tratamiento de mantenimiento) o al menos uno de sus smtomas clfnicos o subclfnicos; o (3) Aliviar la enfermedad, es decir, producir la regresion del estado, trastorno o dolencia o al menos uno de sus smtomas clfnicos o subclfnicos. El beneficio a un sujeto que se va a tratar es tanto estadfsticamente significativo como al menos perceptible para el paciente o para el medico.

"Paciente" o "sujeto" se refiere a marnfferos e incluye sujetos humanos y veterinarios.

Una "cantidad profilacticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profilactico deseado. Normalmente, debido a que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz sera menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.

Modulacion de la respuesta inmunitaria

Caracteristicas de los subconjuntos de linfocitos T CD4: Los linfocitos T CD4 tras la activacion y expansion se desarrollan en diferentes subconjuntos de linfocitos T auxiliares (Th) con diferentes perfiles de citoquinas y distintas funciones efectoras. La diferenciacion adecuada de linfocitos Th en subconjuntos efectores mas adecuados para la defensa del hospedador frente a un patogeno invasor es de importancia cntica para el sistema inmunitario. Los linfocitos T CD4 se diferencian en al menos cuatro subconjuntos conocidos, tres subconjuntos efectores (Th1, Th2 y Th17) y un subconjunto de linfocitos T reguladores (linfocitos Treg). Basandose en las citoquinas que producen, los linfocitos T se dividieron historicamente en linfocitos Th1 y Th2, y esto ha proporcionado un marco para comprender como los medios espedficos de citoquinas producidos por las celulas del sistema inmunitario innato dirigen el desarrollo de la inmunidad adaptativa. Los linfocitos Th1 que son inducidos de forma potente por las celulas dendriticas (CD) que secretan IL-12, se caracterizan por la expresion del factor T-bet de transcripcion espedfico del linaje (T box 21) y la produccion de IFN-y. Los linfocitos TH2, dependeran de IL-4 durante la diferenciacion y la ausencia de IL-12, produce IL-4, IL-5, IL-9, e IL-13 y se caracterizan por la expresion del factor de transcripcion GATA-3. De forma importante, en los cinco ultimos anos, se ha descubierto y caracterizado un tercer subconjunto de

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linfocitos T auxiliares efectores productores de IL-17, denominados linfocitos Th17, y se especifica por la expresion del factor de transcripcion RORyt.

Los linfocitos Th17 producen IL-17, IL-17F, e IL-22. Secretando estas citoquinas efectoras, los linfocitos Th17 inducen una reaccion masiva del tejido debido a la amplia distribucion de los receptores IL-17 e IL-22. Los linfocitos Th17 secretan tambien IL-21 para comunicarse con las celulas del sistema inmunitario. La sinergia entre la isoforma 1 del factor p de crecimiento transformante de las citoquinas (TGFp) y la interleuquina (IL)-6 induce el desarrollo de linfocitos Th17 en ratones y seres humanos, mientras que IL-23 soporta la expansion de estas celulas. Los factores de diferenciacion (TGF-p mas IL-6 o IL-21), el crecimiento y el factor de estabilizacion (IL-23), y los factores de transcripcion (STAT3, ROR-yt (ROR-c), y ROR-a) implicados en el desarrollo de los linfocitos Th17 se han identificado solo recientemente. La participacion de TGF-p en la diferenciacion de linfocitos Th17 coloca el linaje Th17 en estrecha relacion con los linfocitos T reguladores CD4+CD25+Foxp3+ (Treg) debido a que TGF-p induce tambien la diferenciacion de linfocitos T no expuestos anteriormente a tratamiento en linfocitos Treg Foxp3+ en el compartimento inmunitario periferico. Los linfocitos Treg son una subpoblacion especializada de linfocitos T que actua para suprimir la activacion del sistema inmunitario y que mantiene por lo tanto la homeostasis del sistema inmunitario y la tolerancia de los autoantigenos. El desarrollo de los linfocitos Treg, que son capaces de suprimir la enfermedad autoinmunitaria, esta redprocamente relacionado con los linfocitos Th17, que pueden impulsar respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas autoinmunitarias. Se pueden identificar linfocitos Treg mediante su expresion unica del factor de transcripcion forkhead box P3 (Foxp3). De forma importante, en la medida que se sabe, existen dos poblaciones fenotfpicamente identicas de linfocitos Treg CD4+CD25+ - naturales y adaptativos. Los linfocitos Treg CD4+CD25+ surgen en el timo en condiciones homeostaticas para salvaguardarlo contra la autoinmunidad. Los linfocitos T CD4+CD25+ surgen durante los procesos inflamatorios tales como infecciones y canceres y suprimen a inmunidad a traves de mecanismos heterogeneos que incluyen el contacto directo o la produccion de factores solubles tales como IL-10 y TGF-p.

Receptor 25 del Factor de Necrosis Tumoral (TNFR25): Denominado indistintamente en el presente documento como receptor 3 de muerte (DR3), es un regulador de la funcion de los linfocitos T. El receptor 3 de muerte (DR3) (Chinnaiyan et al., Science 274:990, 1996) es un miembro de la familia de receptores TNF. Se conoce tambien como TrAMP (Bodmer et al., Immunity 6:79, 1997), wsl-1 (Kitson et al., Nature 384:372, 1996), Apo-3 (Marsters et al., Curr Biol 6:1669, 1996), y LARD (Screaton et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:4615, 1997) y contiene un dominio de muerte tfpico. La transfeccion de celulas 293 con DR3 humano (hDR3) indujo la apoptosis y activo NF-KB. Se han observado formas cortadas y empalmadas multiples de ARNm DR3, indicando la regulacion en el nivel posterior a la transcripcion (Screaton et al., Proc Natl Acad Sci USA 94:4615, 1997).

Los linfocitos T CD4+FoxP3+ reguladores (Treg) pueden suprimir la actividad de los linfocitos T efectores autorreactivos que escapan a la seleccion negativa en el timo. Los linfocitos Treg son suficientes para evitar o retrasar la patologfa autoinmunitaria en modelos experimentales de IBD, asma y EAE. Los linfocitos Treg bloquean la senalizacion de TNFR25 de la inhibicion de los linfocitos CD4+CD25- pero no de los linfocitos CD8+ espedficos de antfgenos in vitro. De forma interesante, ratones transgenicos que expresaban TNFR25 de longitud completa bajo el promotor CD2 expresan elevados niveles de citoquinas Th2 y Th17 y tienen una celularidad disminuida en tejidos linfoides secundarios. La coincidencia de la actividad reguladora disminuida de los linfocitos T, la celularidad disminuida, y la produccion de citoquinas aumentada en ratones TNFR25 transgenicos sugiere que la senalizacion de TNFR25 puede ser proinflamatoria y antiinflamatoria dependiendo del contexto en el que se reciben las senales de TNFR25.

En resumen, los experimentos llevados a cabo en el presente documento, mostraron el hallazgo inesperado de que la estimulacion de TNFR25 in vivo conduce a la expansion rapida y sistemica de la reserva de linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+. El anticuerpo (4C12) indujo que la expansion de Treg se produjera de forma independiente al antfgeno exogeno y dio como resultado un aumento de 3-4 veces en el porcentaje de linfocitos Treg de los linfocitos CD4+ comprendido en el lapso de 4 dfas de la administracion. Esta expansion de linfocitos Treg que resulto predominantemente de la proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+CD25int , es duradera, y no disminuye hasta los niveles sin estimular durante dos semanas. 4C12 expandio los linfocitos Treg que retienen las funciones supresoras de los linfocitos T efectores mediados por TGFp ex vivo; sin embargo, la senalizacion continuada de TNFR25 abroga la actividad supresora de los linfocitos Treg expandidos mediante 4C12. Sin pretender quedar vinculados por teona alguna, estos hallazgos indican la senalizacion de los linfocitos TNFR25 en los linfocitos Treg tiene la doble funcion de aumentar la proliferacion de los linfocitos Treg y la inhibicion de la actividad supresora de los linfocitos Treg. La inhibicion de la supresion de linfocitos Treg por la senalizacion de TNFR25 es muy plastica y se puede restaurar o mantener tras la eliminacion o continuacion de la senalizacion de TNFR25 en los linfocitos Treg, respectivamente. La adicion de esta informacion al papel de TNFR25 como un coestimulador de respuestas Th2 y Th17 indica que el papel de TNFR25 en la senalizacion inmunitaria es para potenciar simultaneamente la funcion celular efectora durante la induccion de una respuesta inflamatoria y acelera la resolucion de la inflamacion mediante una reserva expandida regionalmente de los linfocitos Treg que recuperan la actividad supresora tras la eliminacion del estfmulo inflamatorio. Tomados en su conjunto, estos hallazgos evidencian que los tratamientos dirigidos contra TNFR25 pueden ser valioso tanto para potenciar como para inhibir la activacion inmunitaria,

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dependiendo del contexto inflamatorio en el que se administran; con amplias implicaciones en los campos de la enfermedad autoinmunitaria, la infeccion cronica, el trasplante y el cancer.

En una realizacion preferida, un metodo para regular una respuesta inmunitaria in vivo comprende administrar a un paciente que lo necesita, al menos un agente que modula la funcion del receptor 25 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFRSF25; TNFR25; DR3). La funcion preferida es la senalizacion mediada por TNFRSF25 que da como resultado la induccion de los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg). La estimulacion de la molecula de TNFRSF25 induce los linfocitos Treg que suprimen una respuesta inmunitaria. Sin embargo, la estimulacion continuada de la molecula de TNFRSF25 abroga la actividad supresora de los linfocitos Treg, regulando de esta manera una respuesta inmunitaria.

La senalizacion a traves del miembro 25 de la superfamilia del receptor TNF (TNFRSF25, DR3) en linfocitos T CD4+, cuando se expresa constitutivamente, potencia la produccion de las citoquinas Th2 y Th17 y contribuye a la inflamacion patologica en modelos de enfermedad del asma, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis multiple (MS), y artritis reumatoide.

En realizaciones preferidas que regulan la respuesta inmunitaria in vivo tratan las enfermedades o trastornos asociados con una respuesta inmunitaria. Dichas enfermedades o trastornos comprenden, por ejemplo: reacciones de rechazo mediante el trasplante de organos o tejidos tales como corazon, rinon, tffgado, medula osea, piel, cornea, pulmon, pancreas, intestino delgado, miembro, musculo, nervio, disco intervertebral, traquea, mioblasto, carfflago, etc.; reacciones de injerto frente a hospedador tras el trasplante de medula osea; enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide, lupus sistemico eritematoso, tiroiditis de Hashimoto, esclerosis multiple, miastenia grave, diabetes de tipo I, etc.; infecciones producidas por microorganismos patogenos (por ejemplo, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum, Trichophyton asteroides, etc.); enfermedades de la piel inflamatorias o hiperproliferativas o manifestaciones cutaneas o enfermedades inmunologicamente mediadas (por ejemplo, psoriasis, dermatitis atopica, dermatitis de contacto, dermatitis eczematoide, dermatitis seborreica, ffquen plano, penfigo, penfigoide bulloso, epidermolisis bullosa, urticaria, angioedema, vasculitis, eritema, eosinofilia dermica, lupus eritematoso, acne, y alopecia areata); enfermedades autoinmunitarias del ojo (por ejemplo. queratoconjuntivitis, conjuntivitis vernal, uveitis asociada con enfermedad de Behcet, queratitis, queratitis herpetica, queratitis conica, distrofia epitelial de la cornea, queratoleucoma, penfigo ocular, ulcera de Mooren, escleritis, oftalmopaffa de Grave , smdrome de Vogt-Koyanagi-Narada, queratoconjuntivitis sicca (ojo seco), flictenula, iridociclitis, sarcoidosis, oftalmopaffa endocrina, etc.); enfermedades de las vfas aereas obstructivas reversibles (por ejemplo, asma bronquial, asma alergica, asma intrmseca, asma extrmseca, y asma debida a polvo, asma particularmente cronica o inveterada (por ejemplo, asma taroffa e hipersensibilidad de las vfas aereas), bronquitis, etc.; inflamaciones mucosales o vasculares (por ejemplo, ulcera gastrica, lesion vascular isquemica o trombotica, enfermedades isquemicas del intestino, enteritis, enterocolitis necrotizante, danos intestinales asociados con quemaduras termicas, enfermedades mediadas por leucotrieno B4); inflamaciones/alergias intestinales (por ejemplo, enfermedades ceffacas, proctitis, gastroenteritis eosinofflica, mastocitosis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); enfermedades alergicas relacionadas con los alimentos con manifestacion sintomatica remota procedente del tracto gastrointestinal (por ejemplo, migrana, rinitis y eczema); enfermedades renales (por ejemplo, nefritis intersticial, smdrome de Goodpasture, smdrome uremico hemofftico, y nefropaffa diabetica); enfermedades nerviosas (por ejemplo, miositis multiple, smdrome de Guillain-Barre, enfermedad de Meniere, neuritis solitaria, infarto cerebral, enfermedades de Alzheimer, enfermedades de Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica(ELA) y radiculopaffa); enfermedad isquemica cerebral (por ejemplo, lesion de cabeza, hemorragia cerebral (por ejemplo, hemorragia subaracnoide, hemorragia intracerebral), trombosis cerebral, embolismo cerebral, ataque al corazon, ictus, ataque isquemico transitorio (TIA), encefalopaffa hipertensiva, infarto cerebral); enfermedades endocrinas (por ejemplo, hipertiroidismo, y enfermedad de Basedow); enfermedades hematicas (por ejemplo, aplasia de globulos rojos, anemia aplasica, anemia hipoplastica, purpura trombocitopenico idiopatico, anemia hemofftica autoinmunitaria, agranulocitosis, anemia perniciosa, anemia megaloblastica y aneritroplasia); enfermedades oseas (por ejemplo, osteoporosis); enfermedades respiratorias (por ejemplo, sarcoidosis, fibrosis pulmonar, y pneumonia intersticial idiopatica); enfermedades de la piel (por ejemplo, dermatomiositis, leucoderma vulgar, ictiosis vulgar, fotosensibilidad, y linfoma cutaneo de linfocitos T); enfermedades circulatorias (por ejemplo, arterioesclerosis, ateroesclerosis, smdrome de aortitis, poliarteritis nodosa, y miocardosis); enfermedades relacionadas con el colageno (por ejemplo, escleroderma, granuloma de Wegener, y smdrome de Sjogren); adiposis; fascitis eosinofflica; enfermedades periodontales (por ejemplo, dano a la encfa, periodoncio, hueso alveolar o sustancia osea del diente); smdrome nefrotico (por ejemplo, glomerulonefritis); alopecia de patron masculino, alopecia senil; distrofia muscular; pioderma y smdrome de Sezary; enfermedades asociadas a anomaffas cromosomicas (por ejemplo, smdrome de Down); enfermedad de Addison; enfermedades mediadas por oxfgeno activo [por ejemplo, lesion organica (por ejemplo, trastornos en la circulacion isquemica de organos (por ejemplo, corazon, tffgado, rinon, tracto digestivo, etc.) asociadas con preservacion, trasplante, o enfermedades isquemicas (por ejemplo, trombosis, infarto de miocardio, etc.)); enfermedades intestinales (por ejemplo, choque de endotoxinas, colitis pseudomembranosa, y colitis inducida por farmacos o radiacion); enfermedades renales (por ejemplo, insuficiencia renal aguda isquemica, insuficiencia renal cronica); enfermedades pulmonares (por ejemplo, toxicosis producida por oxfgeno pulmonar o farmacos (por ejemplo, paracort, bleomicina, etc.), cancer de pulmon y enfisema pulmonar); enfermedades oculares (por ejemplo, cataratas, enfermedad por almacenamiento de hierro (siderosis bulbi), retinitis pigmentosa, placas seniles, cicatrizacion vffrea, quemadura alcalina de la cornea); dermatitis (por ejemplo, eritema multiforme, dermatitis

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bullosa debida a inmunoglobulina A lineal, dermatitis por contacto con cemento); y otras enfermedades (por ejemplo, gingivitis, periodontitis, septicemia, pancreatitis, y enfermedades producidas por contaminacion ambiental (por ejemplo, contaminacion del aire), envejecimiento, carcinogenos, metastasis de carcinoma, e hipobaropatia)]; las enfermedades producidas por histaminas liberan o liberan leucotrieno C4; restenosis de la arteria coronaria tras angioplastia y prevencion de adhesiones posteriores a cirug^a; enfermedades autoinmunitarias y dolencias inflamatorias (por ejemplo, edema mucosal primario, gastritis atrofica autoinmunitaria, menopausia prematura, esterilizad masculina, diabetes mellitus juvenil, penfigo vulgar, penfigoide, oftalmitis simpatetica, uveitis inducida por lente, leucopenia idiopatica, hepatitis cronica activa, cirrosis idiopatica, lupus discoide eritematoso, orquitis autoinmunitaria, artritis (por ejemplo, artritis deformante), o policondritis); infeccion por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), SIDA; conjuntivitis alergica; cicatriz hipertrofica y queloide debido a trauma, quemadura, o cirugfa.

En una realizacion preferida, el agente se administra en una monodosis o se extiende durante un periodo de tiempo a fin de mantener los efectos supresores de los linfocitos Treg. Por ejemplo, tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

En otra realizacion preferida, el agente se administra en dosis multiples o en una pluralidad de dosis de tal manera que se abrogan los efectos supresores de los linfocitos Treg. Por ejemplo, en el tratamiento del cancer, enfermedades vmcas u otras enfermedades que requieren una compensacion inmunomediada de celulas anomalas.

En otra realizacion preferida, el agente se administra en una formulacion de liberacion extendida con el fin de proporcionar una estimulacion constante de TNFRSF25 a fin de abrogar la supresion del sistema inmunitario por los linfocitos Treg.

En otra realizacion preferida, al menos un agente estimula la senalizacion de TNFRSF25 e induce la proliferacion de linfocitos CD4+Foxp3+CD25int en un paciente. Se pueden controlar los efectos supresores de los linfocitos Treg y se pueden ajustar las dosis del agente para mantener los efectos supresores en enfermedades o dolencias en las que se desea una respuesta inmunitaria disminuida, por ejemplo, autoinmunidad, rechazo al trasplante y similares.

En otra realizacion preferida, al menos un agente estimula la senalizacion de TNFRSF25 e induce la proliferacion de linfocitos Treg inducidos timicamente, pero no inducidos perifericamente. Se pueden controlar los efectos supresores de los linfocitos Treg y se pueden ajustar las dosis del agente para mantener los efectos supresores en enfermedades o dolencias en las que se desea una respuesta inmunitaria disminuida, por ejemplo, autoinmunidad, rechazo al trasplante y similares.

En otra realizacion preferida, al menos un agente estimula la senalizacion de TNFRSF25 e induce la proliferacion de linfocitos Treg inducidos timica y perifericamente, donde se sabe que esta presente el antfgeno homologo reconocido por los linfocitos Treg inducidos perifericamente. Se pueden controlar los efectos supresores de los linfocitos Treg y se pueden ajustar las dosis del agente para mantener los efectos supresores en enfermedades o dolencias en las que se desea una respuesta inmunitaria disminuida, por ejemplo, autoinmunidad, rechazo al trasplante y similares.

En otra realizacion preferida, se puede administrar uno o una combinacion de agentes a un paciente para modular su respuesta inmunitaria. Por ejemplo, un paciente puede recibir uno o mas agentes en una dosis terapeuticamente eficaz como se ha determinado por la proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+ en un paciente, o cualquier otro ensayo que mida la respuesta deseada. Por ejemplo, inmunoensayos, deteccion de biomarcadores, FACS, inmunotransferencias, hibridacion, PCR etc. Los linfocitos Treg se pueden identificar como, por ejemplo, linfocitos CD4+FoxP3+. En algunos aspectos, existe la expresion simultanea de CD103. La expresion de CD103 por los linfocitos Treg contribuye a la retencion de tejidos comprendidos en tejidos. Los agentes conocidos no interfieren con la proliferacion de linfocitos Treg mediada por TNFRSF25 que incluye rapamicina.

En otra realizacion preferida, el agente que modula la senalizacion de TNFRSF25 comprende al menos uno de: un anticuerpo, un aptamero, un ligando, molecula pequena, peptido, protema, oligonucleotido, polinucleotido, molecula organica o inorganica.

En una realizacion preferida, el agente es un agonista de TNFRSF25.

En otra realizacion preferida, un metodo para suprimir una respuesta inmunitaria in vivo comprende administrar a un paciente que lo necesita, al menos un agente que modula la funcion de senalizacion mediada por el receptor 25 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFRSF25; TNFR25; DR3); e, induciendo la expansion de los linfocitos T reguladores supresores (Treg).

En otra realizacion preferida, el agente modula la senalizacion del receptor 25 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral e inhibe la actividad supresora de los linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+.

En otra realizacion preferida, una composicion para modular una respuesta inmunitaria que comprende un agente que modula la senalizacion de TNFRSF25. En una realizacion, el agente se administra a un paciente de tal manera

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que los linfocitos Treg supresores suprimen una respuesta inmunitaria. En otra realizacion preferida, el agente se administra a un paciente en una dosis o en condiciones que abrogan la senal que conduce a una inhibicion de los linfocitos Treg supresores, de tal manera que se monta una respuesta inmunitaria.

En otra realizacion preferida, un metodo para tratar el cancer in vivo que comprende administrar a un paciente que lo necesita, al menos un agente que modula la funcion de senalizacion del receptor 25 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFRSF25; TNFR25; DR3) a dosis y condiciones que proporcionan una estimulacion continua del TNFRSF25 que abroga los efectos supresores de la respuesta inmunitaria que pueden inducir los linfocitos Treg a un cancer.

En otra realizacion preferida, la modulacion de las celulas inmunitarias y las respuestas posteriores comprende un metodo para tratar a un paciente con una enfermedad tal como por ejemplo, cancer, enfermedad vmca, o enfermedad producida por cualquier organismo infeccioso en la que una composicion anti-TNFR25, se administra a un paciente, y modula las funciones de las celulas inmunitarias, por ejemplo, la proliferacion de un linfocito en la que el linfocito se ha suprimido o atenuado previamente, o en casos donde la respuesta inmunitaria es normal pero el aumento de la potencia de la respuesta inmunitaria da como resultado un tratamiento mas eficaz y rapido de un paciente. Una ruta reguladora negativa, y no la carencia de una inmunogenicidad tumoral inherente (es decir, la capacidad de los tumores no manipulados de estimular la inmunidad protectora), juegan un importante papel en la prevencion del control inmunomediado de la progresion tumoral. La implicacion terapeutica es que el recuento de los circuitos reguladores inmunoatenuantes/inmunosupresores contribuye a un control inmunitario satisfactorio del cancer y es tan, si no mas, importante que desarrollar potentes protocolos de vacunacion.

Vacunas tumorales: Como tales, los agonistas de TNFR25 son eficaces modificadores de la respuesta biologica, en, por ejemplo, vacunas para tumores debido a que refuerzan la activacion de los linfocitos T y la respuesta inmunitaria celular a un antfgeno espedfico de tumor, mientras que los antagonistas de TNFR25 bloquean o inhiben la activacion de los linfocitos T. Por tanto, se describen tambien metodos y agentes terapeuticos que aumentan la eficacia de una vacuna tumoral.

Las vacunas tumorales intentan usar los elementos del sistema inmunitario natural del cuerpo para combatir el cancer. Las vacunas tumorales contienen uno o mas antfgenos espedficos de tumor y pueden contener un adyuvante y modificadores de la respuesta biologica. Un antfgeno espedfico de tumor es un polipeptido que esta limitado sustancialmente a la expresion en o sobre celulas tumorales y que puede utilizarse para estimular una respuesta inmunitaria prevista para hacer diana en aquellas celulas tumorales. Se usan diferentes tipos de vacunas para tratar diferentes tipos de cancer. Para que una composicion antigenica sea util como una vacuna, una composicion antigenica debe inducir una respuesta inmunitaria al antfgeno en una celula o tejido. Como se usa en el presente documento, una "composicion antigenica" puede comprender un antfgeno (por ejemplo, un peptido o polipeptido), un acido nucleico que codifica un antfgeno (por ejemplo, un vector de expresion de antfgeno), o una celula que expresa o presenta un antfgeno.

El aumento de la respuesta inmunitaria a una vacuna u otro estimulante antigenico puede medirse mediante cualquier metodo convencional, tal como por ejemplo, ensayos de proliferacion, secrecion de citoquinas, tipos de citoquinas secretadas, ensayos de linfocitos T citotoxicos, ensayos ELISA, RIA y similares. El aumento de la respuesta inmunitaria puede detectarse tambien vigilando el tratamiento. Por ejemplo, en el caso de tratar el cancer, se vigilana tambien una respuesta inmunitaria aumentada observado uno o mas de los siguientes efectos: (1) inhibicion, en alguna extension, del crecimiento tumoral, incluyendo (i) ralentizar (ii) inhibir la angiogenesis y (ii) completar la detencion del crecimiento; (2) reduccion del numero de celulas tumorales; (3) mantener el tamano del tumor; (4) reduccion en el tamano del tumor; (5) inhibicion, incluyendo (i) reduccion (ii) ralentizacion o (iii) prevencion completa, de la infiltracion celular en los organos perifericos; (6) inhibicion, incluyendo (i) reduccion (ii) ralentizacion o (iii) prevencion completa, de la metastasis; (7) aumento de la respuesta inmunitaria antitumoral, que puede dar como resultado (i) el mantenimiento del tamano del tumor, (ii) reducir el tamano del tumor, (iii) ralentizar el crecimiento de un tumor, (8) reducir, retrasar o evitar a invasion y/u (alivio, en alguna extension, de la gravedad o del numero de uno o mas smtomas asociados con el trastorno.

En otra realizacion preferida, el anticuerpo dirigido contra TNFR25 se puede administrar como una construccion vectorial que expresa anticuerpos dirigidos contra TNFR25. Ademas, la construccion vectorial puede contener secuencias de nucleotidos que codifican citoquinas, tales como el factor estimulador de colonias de granulocitos macrofagos (GM-CSF), interleuquina-12 (IL-12) y moleculas coestimuladoras tales como 87-1, 87-2, CD40. Se pueden usar las citoquinas en diversas combinaciones para afinar la respuesta del sistema inmunitario del sujeto, incluyendo respuesta de anticuerpos y linfocitos T citotoxicos para llevar a cabo el nivel espedfico de respuesta necesario para controlar o eliminar la infeccion o el estado de enfermedad. El polinucleotido puede codificar tambien un producto de fusion que contiene un polipeptido antigenico, por ejemplo, un antfgeno antitumoral, antfgeno antivmco y similar, y una molecula coestimuladora, tal como CTLA-4. Los ejemplos de vectores adecuados comprenden vectores vmcos que incluyen el virus de la polio, los virus de la viruela, tales como vaccinia, el virus de la viruela del canario, y la viruela aviar, los virus del herpes, incluyendo el virus del herpes bagre, vectores asociados a adenovirus, y retrovirus. Los vectores bacterianos ilustrativos incluyen las formas atenuadas de Salmonella, Shigella, Edwardsiella ictaluri, Yersinia ruckerii, y Listeria monocytogenes. L. monocytogenes puede ser tambien

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valiosa como una herramienta de investigacion utilizada para estimular la expansion de linfocitos Treg en animales de tal manera que pueden recogerse en un punto temporal posterior con un rendimiento aumentado de linfocitos Treg por animal.

Terapias combinadas

En una realizacion preferida, el aumento o regulacion en exceso de una respuesta inmunitaria se puede combinar con una o mas terapias. El anticuerpo dirigido contra TNFR25, por ejemplo, se puede administrar antes de, simultaneamente con, o despues de un curso de tratamiento con uno o mas agentes o metodos de tratamiento.

En otra realizacion, las composiciones de TNFR25 se pueden administrar a celulas autologas, lo que permite a las celulas expandirse y a continuacion reinfundir las celulas en el paciente.

Los agentes estimuladores de TNFR25 pueden administrarse en una composicion farmaceutica, como un polinucleotido en un vector, liposomas, peptidos de acidos nucleicos, y similares.

En otra realizacion preferida, se pueden administrar los agentes estimuladores de TNFR25 con uno o mas agentes farmacologicamente activos adicionales. Como se usa en el presente documento, el termino " agente farmacologicamente activo" se refiere a cualquier agente , tal como un farmaco, capaz de tener un efecto fisiologico (por ejemplo, un efecto terapeutico o profilactico) sobre celulas procariotas o eucariotas, in vivo o in vitro, incluyendo, pero sin limitacion, agentes quimioterapeuticos, toxinas, agentes radioterapeutico, agentes radiosensibilizantes, vectores de terapia genica, construcciones de acidos nucleicos de sentido contrario o ARN interferente pequeno, agentes de formacion de imagenes, agentes diagnosticos, agentes conocidos por actuar con una protema intracelular, polipeptidos, y polinucleotidos.

El agente adicional farmacologicamente activo se puede seleccionar entre una variedad de tipos conocidos de farmacos, incluyendo, por ejemplo, analgesicos, anestesicos, agentes antiinflamatorios, antihelmmticos, agentes antiarntmicos, agentes antiasma, antibioticos (incluyendo penicilinas), agentes anticancerosos (incluyendo Taxol), anticoagulantes, antidepresivos, agentes antidiabeticos, antiepilepticos, antihistaminas, antitusivos, agentes antihipertensivos, agentes antimuscarmicos, agentes antimicobacterianos, agentes antineoplasicos, agentes antioxidantes, antipireticos, inmunosupresores, inmunoestimulantes, agentes antitiroideos, agentes antivmcos, sedantes anxioltticos (hipnoticos y neurolepticos), astringentes, agentes bacteriostaticos, agentes bloqueantes beta- adrenoceptores, productos sangumeos y sustitutos, broncodilatadores, agentes tamponantes, agentes ionotropicos cardfacos, agentes quimioterapeuticos, medios de contraste, corticoesteroides, supresores de la tos (expectorantes y mucoltticos), agentes diagnosticos, agentes de diagnostico por imagenes, diureticos, dopaminergicos (agentes antiparkinsoniananos), agentes secuestrantes de radicales libres, factores de crecimiento, hemostaticos, agentes inmunologicos, agentes reguladores de lfpidos, relajantes musculares, protemas, peptidos y polipeptidos, parasimpaticomimeticos, calcitonina paratiroidea y bifosfonatos, prostaglandinas, radiofarmaceutico, hormonas, hormonas sexuales (incluyendo esteroides), aglutinantes de liberacion temporal, agentes antialergicos, estimulantes y anoreticos, esteroides, simpaticomimeticos, agentes tiroideos, vasodilatadores, y xantinas.

El agente adicional farmacologicamente activo no necesita ser un agente terapeutico. Por ejemplo, el agente puede ser citotoxico para las celulas locales a las cuales se administra, pero tiene un efecto beneficioso global sobre el sujeto. Ademas, el agente puede ser un agente diagnostico sin actividad terapeutica directa per se, tal como un agente de contraste para la formacion de imagenes biologicas.

Quimioterapia: Las composiciones TNFR25 se pueden administrar con quimioterapia. La administracion de, por ejemplo, anticuerpo dirigido contra TNFR25 dana como resultado probablemente la necesidad disminuida de quimioterapia, o si se requiere o recomienda todavfa quimioterapia, las dosis senan menores, aliviando por tanto algo de los efectos secundarios adversos de estos agentes quimioterapeuticos. Los tratamientos contra el cancer incluyen una variedad de terapias de combinacion con tratamiento basados tanto en sustancias qmmicas como en radiacion. Las quimioterapias combinadas incluyen, por ejemplo, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, busulfan, nitrosourea, dactinomicina, daunurubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoiposido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de union al receptor de estrogenos, taxol, gemcitabina, navelbinainhibidores de la farnesil-protem transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, o cualquier analogo o variante derivada del anterior.

Radioterapia: Las composiciones se pueden combinar con radioterapia. Otros factores que producen el dano del ADN y que se han usado extensamente incluyen los que se conocen comunmente como rayos gamma, rayos X, y/o, la administracion dirigida de radioisotopos a las celulas tumorales. Tambien se contemplan otras formas de factores que ocasionan danos en el ADN, tales como la radiacion de microondas y la irradiacion de haces de protones (Patente de Estados Unidos. N.° 5.760.395 y patente de los Estados Unidos N.° 4.870.287) e irradiacion de UV. Es mas probable que todos estos factores realicen una amplia gama de danos en el ADN, sobre los precursores del ADN, sobre la replicacion y reparacion del ADN, y sobre el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosis para los rayos X estan comprendidos en dosis diarias de 50 a 200 roentgen para periodos de

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tiempo prolongados (3 a 4 semanas), a dosis unicas de 2000 a 6000 roentgen. Los intervalos de dosificacion de los radioisotopos vanan ampliamente, y dependen de la semivida del isotopo, la fuerza y tipo de la radiacion emitida, y de su captacion por las celulas neoplasicas.

Inmunoterapia: Los agentes anti-TNFR25 se pueden combinar con otras formas de inmunoterapia. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento del cancer, los compuestos inmunoterapeuticos, de una forma general, se basan en el uso de celulas y moleculas efectoras (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) para dirigirse y destruir las celulas cancerosas. Trastuzumab (HERCEPTIN™) o bevacizumab (AVASTIN™) son un ejemplo de este tipo. El efector inmune puede ser, por ejemplo, un anticuerpo espedfico de algun marcador situado en la superficie de una celula tumoral. El anticuerpo en solitario puede servir como efector de tratamiento o puede reclutar otras celulas para efectuar realmente la destruccion de la celula. El anticuerpo tambien puede estar conjugado a un farmaco o toxina (compuesto quimioterapeutico, radionucleido, cadena de ricina A, toxina colerica, toxina de la tosferina, etc.) y servir simplemente como agente de direccionamiento. Alternativamente, el efector puede ser un linfocito que tiene en su superficie moleculas que interactuan, tanto directa como indirectamente, con una celula tumoral diana. Varias celulas efectoras incluyen linfocitos T citotoxicos y celulas destructoras naturales (NK). La combinacion de modalidades terapeuticas, es decir, actividad citotoxica directa y potenciacion de dicha respuesta efectora inmune mediante, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra TNFR25, proporcionana un beneficio terapeutico en el tratamiento del cancer.

La respuesta inmune espedfica de antfgeno se dirigina a uno o mas antfgenos tumorales y la administracion de las composiciones de TNFR25 potenciana la respuesta inmunitaria dirigida hacia estos antfgenos tumorales. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para el direccionamiento en el contexto de la presente invencion. Los marcadores tumorales habituales incluyen el antfgeno carcinoembrionico, antfgeno espedfico de prostata, antfgeno asociado a tumor urinario, antfgeno fetal, tirosinasa (p97), gp68, TAG-72, HMFG, antfgeno de sialil-Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de estrogenos, receptor de laminina, erb B y p 155. Un aspecto alternativo de la inmunoterapia es combinar efectos contra el cancer con efectos estimulantes del sistema inmunitario. Tambien existen moleculas estimulantes del sistema inmunitario, entre las que se incluyen: citoquinas tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gamma-IFN, quimioquinas tales como MIP-1, McP-1, IL-8 y factores del crecimiento tales como el ligando FLT3. La combinacion de moleculas estimulantes del sistema inmunitario, tanto como protemas o usando un suministro de genes junto con un supresor tumoral tal como MDA-7 potencia los efectos antitumorales.

Existen numerosos enfoques diferentes para la inmunoterapia pasiva del cancer. Se pueden clasificar ampliamente en lo siguiente: inyeccion de anticuerpos solos; inyeccion de anticuerpos acoplados a toxinas o agentes quimioterapeuticos; inyeccion de anticuerpos acoplados a isotopos radioactivos; inyeccion de anticuerpos anti- idiotipo; y, finalmente, eliminacion de las celulas tumorales de la medula osea. Preferentemente, los anticuerpos monoclonales humanos se utilizan en la inmunoterapia pasiva, ya que producen pocos o ningun efecto secundario en el paciente.

En la inmunoterapia activa, se administra un peptido antigenico, polipeptido o protema, o una composicion de celula tumoral autologa o alogenica o "vacuna", de forma general, con un auxiliar bacteriano diferenciado. En la inmunoterapia del melanoma, aquellos pacientes que suscitan una respuesta de IgM elevada frecuentemente sobrevivir mejor que aquellos que no suscitan anticuerpos IgM, o lo hacen en cantidad baja. Los anticuerpos IgM son frecuentemente anticuerpos transitorios y, como excepcion a la regla, parecen ser anticuerpos contra gangliosidos o contra hidratos de carbono.

En la inmunoterapia adoptiva, los linfocitos en circulacion del paciente, o linfocitos infiltrados en tumores, se afslan in vitro, se activan mediante linfoquinas tales como IL-2 o se transducen con genes de necrosis tumoral. Las composiciones de TNFR25, por ejemplo, el anticuerpo contra TNFR25, se administran o se cultivan con las celulas que posteriormente se van a reinfundir. Para conseguirlo, se administrana a un animal, o paciente humano, una cantidad inmunitariamente eficaz de linfocitos activados junto con anticuerpos contra TNFR25 y, opcionalmente, con una composicion de peptido antigenico incorporada a un coadyuvante. Los linfocitos activados seran, lo mas preferiblemente, las propias celulas del paciente aisladas previamente de la sangre o una muestra de tumor y activados (o "expandidos") in vitro. Esta forma de inmunoterapia ha producido varios casos de regresion de melanoma y de carcinoma renal, pero el porcentaje de pacientes que responden fue bajo en comparacion con los que no lo hicieron. El anticuerpo contra TNFR25 se puede administrar a un paciente, tras reinfusion a las celulas con un regimen que se puede determinar por el medico a cargo del paciente o enfermera especialista.

Inmunosupresores: La administracion de uno o mas agentes TNFRSF25 se puede realizar con uno o mas inmunosupresores cuando se desea mantener una respuesta inmunitaria suprimida (por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias). Los ejemplos de inmunosupresores incluyen, sin limitacion, acido micofenolico, azatliioprina, ciclosporina A, FK506, FK520, Elidel; tacrolimus y siroliinus; minociclina; leflunomida; o metotrexato.

Cirug^a: Aproximadamente el 60 % de personas con cancer se someten a algun tipo de cirugfa, que incluye cirugfa preventiva, de diagnostico o estadificacion, curativa y paliativa. La cirugfa curativa es un tratamiento del cancer que se puede usar junto con otros tratamientos, tales como los descritos en el presente documento, quimioterapia,

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radioterapia, terapia hormonal, terapia genica, inmunoterapia, y/o terapias alternativas.

La cirugfa curativa incluye la reseccion, en la que todo o parte del tejido canceroso se retira ffsicamente, extirpa y/o destruye. La reseccion tumoral se refiere a la eliminacion ffsica de al menos parte de un tumor. Ademas de la reseccion de tumores, el tratamiento mediante cirugfa incluye la cirugfa con laser, criocio^a, y cirugfa controlada microscopicamente (cirug^a de Mohs). Se contempla adicionalmente que las realizaciones descritas en el presente documento se puedan utilizar junto con la retirada de canceres superficiales, precanceres, o cantidades incidentales de tejido normal.

Tras la extirpacion de todo o parte de las celulas, tejido o tumor canceroso, se puede formar una cavidad en el cuerpo. El tratamiento se puede realizar mediante perfusion, inyeccion directa o aplicacion local a la zona de un tratamiento contra el cancer adicional. Dicho tratamiento se puede repetir, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7 dfas o cada 1, 2, 3, 4, y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses. Estos tratamientos tambien pueden ser de dosis variables.

Otros agentes: Se contempla que se puedan utilizar otros agentes combinados con las realizaciones descritas en el presente documento para mejorar la eficacia terapeutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes inmunomoduladores que afectan a la regulacion en exceso de los receptores de la superficie celular y uniones de GAP, agentes citostaticos y de diferenciacion, la inhibicion de la adhesion celular, y el aumento en la sensibilidad de las celulas hiperproliferativas respecto a los inductores apoptoticos u otros agentes. Los agentes inmunomoduladores incluyen el factor de necrosis tumoral; interferon alfa, p, y gamma; IL-2 y otras citoquinas; F42K y otros analogos de citoquina; o MIP-1, MIP-Ip, MCP-1, RANTES, y otras quimioquinas. Se contempla ademas que la regulacion en exceso de los ligandos de la superficie celular o sus ligandos tales como ligando Fas/Fas, DR4 o DR5/TRAIL (ligando Apo-2) potencie las capacidades de estimulacion de la presente invencion. El aumento de la senalizacion intercelular mediante el aumento del numero de uniones de GAP aumentana los efectos proliferativos de las poblaciones celulares deseadas.

El ligando Apo2 (Apo2L, tambien denominado TRAIL) es un miembro de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF). TRAIL activa la apoptosis rapida en muchos tipos de celulas cancerosas, aunque no es toxico para las celulas normales. El ARNm de TRAIL se encuentra en una amplia variedad de tejidos. La mayona de celulas normales parecen ser resistentes a la accion citotoxica de TRAIL, lo que sugiere la existencia de mecanismos que las protegen de la induccion de apoptosis mediante TRAIL. El primer receptor descrito para TRAIL, denominado receptor de muerte 4 (DR4), incluye un "dominio de muerte" citoplasmico; DR4 transmite la senal de apoptosis transportada por TRAIL. Se han identificado receptores adicionales que se unen a TRAIL. Un receptor, denominado DR5, incluye un dominio de muerte citoplasmaticos, y senala la apoptosis de forma muy similar a DR4. Los ARNm de DR4 y dR5 se expresan en muchos tejidos normales y lmeas celulares tumorales. Se han identificado receptores senuelo tales como DcR1 y DcR2 que evitan que TRAIL induzca la apoptosis mediante DR4 y DR5. Estos receptores senuelo representan, por tanto, un mecanismo novedoso para regular la sensibilidad a una citoquina proapoptotica directamente en la superficie celular. La expresion preferida de estos receptores inhibidores en tejidos normales sugiere que TRAIL podna ser util como agente anticanceroso que induce la apoptosis en celulas cancerosas, preservando las celulas sanas al mismo tiempo.

Se han realizado muchos avances en la terapia contra el cancer desde la introduccion de los farmacos citotoxicos quimioterapeuticos. Sin embargo, una de las consecuencias de la quimioterapia es el desarrollo/adquisicion de fenotipos resistentes a farmacos y el desarrollo de resistencia multifarmaco. El desarrollo de resistencia multifarmaco sigue siendo un obstaculo importante para el tratamiento de dichos tumores y, por tanto, una mejora de la respuesta inmunitaria proporciona un enfoque alternativo.

Otra forma de terapia incluye la hipertermia, que es un procedimiento en el que un tejido del paciente se expone a alta temperatura (hasta 106 °F, 41 °C). En la aplicacion de la hipertermia local, regional o de cuerpo completo pueden estar implicados dispositivos de calentamiento externos o internos. La hipertermia local implica la aplicacion de calor a una zona pequena, como un tumor. El calor se suele aplicar externamente con ondas de alta frecuencia dirigidas al tumor desde un dispositivo externo al cuerpo. El calor interno puede implicar una sonda esteril, incluyendo alambres finos calentados o tubos huecos llenos de agua caliente, una antena de microondas implantada, o electrodos de radiofrecuencia.

El organo o extremidad del paciente se calienta en la terapia regional, que se realiza mediante dispositivos que producen alta energfa, como imanes: Alternativamente, parte de la sangre del paciente se puede extraer y calentar antes de perfundirse en la zona que se ha calentado internamente. Tambien se puede implementar el calentamiento del cuerpo completo en los casos en que el cancer se ha diseminado por todo el cuerpo. Con este fin, se pueden emplear sabanas de agua caliente, cera caliente, bobinas inductoras y camaras termicas.

La terapia hormonal tambien se puede utilizar junto con las realizaciones descritas en el presente documento o junto con cualquier otra terapia contra el cancer anteriormente descrita. El uso de hormonas se puede utilizar en el tratamiento de determinados canceres como el cancer de mama, prostata, ovario o cuello de utero, para disminuir el nivel o bloquear los efectos de determinadas hormonas tales como testosterona o estrogeno. Este tratamiento se

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utiliza frecuentemente junto con al menos otra terapia contra el cancer como opcion de tratamiento o para reducir el riesgo de metastasis.

Administracion de composiciones

Las formulaciones farmaceuticas y vacunas pueden ser para administracion por via oral (solido o lfquido), parenteral (inyeccion intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutanea), transdermica (tanto pasiva o usando ionoforesis o electroporacion), transmucosal (nasal, vaginal, rectal, o sublingual), o de inhalacion, o usando inserciones bioerosionables, y se puede formular en formas farmaceuticas adecuadas para cada ruta de administracion.

Para dirigirse a una celula tumoral in situ, las composiciones descritas anteriormente se pueden administrar a animales incluyendo seres humanos en cualquier formulacion adecuada. Por ejemplo, se pueden formular las composiciones dirigidas a una celula tumoral en trasportadores o diluyentes farmaceuticamente aceptables tales como suero salino fisiologico o una solucion salina tamponada. Los transportadores y diluyentes adecuados se pueden seleccionar segun el modo y ruta de administracion y la practica farmaceutica convencional. Una descripcion de transportadores y diluyentes farmaceuticamente aceptables ilustrativos, asf como de formulaciones farmaceuticas, se puede encontrar en el Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto estandar en este campo, y en USP/NF. Se pueden anadir otras sustancias a las composiciones para estabilizar y/o conservar las composiciones.

Las composiciones se pueden administrar a los animales mediante cualquier tecnica convencional. Las composiciones pueden administrarse directamente a un sitio diana mediante, por ejemplo, administracion quirurgica a un sitio diana interno o externo, o mediante un cateter dirigido a un sitio accesible mediante un vaso sangumeo. Se conocen en la tecnica otros metodos de administracion, por ejemplo, la administracion mediante liposomas o la difusion desde un dispositivo medico impregnado con la composicion. Las composiciones pueden administrarse en un unico bolo, multiples inyecciones, o mediante infusion continua (por ejemplo, por via intravenosa). Para administracion parenteral, las composiciones se formulan preferentemente en una forma esterilizada exenta de pirogenos.

En algunas realizaciones, las composiciones o vacunas se administran mediante administracion pulmonar. La composicion o vacuna se administra a los pulmones de un mairnfero durante la inhalacion y atraviesa el revestimiento epitelial pulmonar hasta el torrente sangumeo [vease, por ejemplo, Adjei, et al. Pharmaceutical Research 1990; 7:565 569; Adjei, et al. Int. J. Pharmaceutics 1990; 63:135 144 (acetato de leuprolido); Braquet, et al. J Cardiovascular Pharmacology 1989; 13(sup5):143 146 (endotelina1); Hubbard, et al. (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206 212 (a1 -antitripsina); Smith, et al. J. Clin. Invest. 1989;84:1145-1146 (a1-proteinasa); Oswein, et al. "Aerosolization of Proteins", 1990; Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (hormona del crecimiento humana recombinante); Debs, et al. J. Immunol. 1988; 140:3482 3488 (interferon y y factor de necrosis tumoral a); y la patente de Estados Unidos n.° 5.284.656 de Platz, et al. (factor estimulador de las colonias de granulocitos). Se describe un metodo y una composicion para la administracion pulmonar de farmacos para efectos sistemicos en la patente de Estados Unidos n.° 5.451.569 de Wong, et al. Vease tambien la patente de Estados Unidos 6.651.655 de Licalsi et al.

Se contemplan para su uso en la practica de las realizaciones descritas en el presente documento una amplia variedad de dispositivos mecanicos disenados para la administracion pulmonar de productos terapeuticos, incluyendo, pero sin limitacion, nebulizadores, inhaladores de dosis medida, e inhaladores de polvo, todos ellos conocidos de la persona experta en la materia. Algunos ejemplos espedficos de dispositivos comercialmente disponibles adecuados para la practica de la presente invencion son el nebulizador Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); el nebulizador Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, CO); el inhalador de dosis medida Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); y el inhalador para polvo Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, MA). Todos estos dispositivos requieren el uso de formulaciones adecuadas para la dispensacion del agente terapeutico. Normalmente, cada formulacion es espedfica del tipo de dispositivo utilizado, y puede implicar el uso de un material propulsor adecuado, ademas de los diluyentes, adyuvantes, tensioactivos y/o transportadores normalmente usados en terapia. Analogamente, tambien se contempla el uso de liposomas, microcapsulas o microesferas, complejos de inclusion, u otros tipos de transportadores.

Las formulaciones a utilizar en un dispositivo inhalador de dosis medida comprenderan general mente un polvo fmamente dividido que incluye el agente terapeutico suspendido en un propulsor con ayuda de un tensioactivo. El propulsor puede ser cualmente material normalmente empleado a tal fin, tal como un clorofluorocarbono, un hidroclorofluorocarbono, un hidrofluoorocarbono, o un hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometana, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol, y 1,1,1,2 tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitan y lecitina de soja. El acido oleico tambien se puede utilizar como tensioactivo.

Las formulaciones a dispensar desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderan un polvo seco fmamente dividido que contiene el agente terapeutico, y tambien puede incluir un agente de carga tal como lactosa, sorbitol,

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sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersion de polvo desde el dispositivo, por ejemplo, 50 a 90 % en peso de la formulacion. El agente terapeutico debena prepararse de forma mas ventajosa en forma particulada con un tamano promedio de partfcula inferior a 10 mm (o micrometros), lo mas preferiblemente de 0,5 a 5 mm, para la administracion mas eficaz al pulmon distal.

Tambien se contempla la administracion nasal o a otra mucosa del agente terapeutico. La administracion nasal permite el paso al torrente sangumeo directamente despues de la administracion de la composicion a la nariz, sin necesidad de depositar el producto en el pulmon. Las formulaciones para la administracion nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano y saponina como un adyuvante.

La composicion o vacuna se puede administrar junto con uno o mas principios activos, composiciones farmaceuticas o vacunas adicionales. Los agentes terapeuticos se pueden administrar a un animal, preferentemente un mairnfero, lo mas preferiblemente a un ser humano.

Sistemas de liberacion prolongada: Un primer sistema de liberacion prolongada incluye sistemas de matriz, en el que el agente se incluye o dispersa en una matriz u otro material que sirve para retrasar la liberacion del agente a un entorno acuoso (es decir, el fluido luminal del tracto GI). Cuando el agente se dispersa en una matriz de este tipo, la liberacion del farmaco se produce principalmente desde la superficie de la matriz. Asf, el farmaco se libera desde la superficie de un dispositivo, que incorpora la matriz una vez que se difunde por la matriz o cuando la superficie del dispositivo se erosiona, exponiendo el farmaco. En algunas realizaciones, ambos mecanismos pueden actuar simultaneamente. Los sistemas de matriz pueden ser grandes, por ejemplo, del tamano de un comprimido (aproximadamente 1 cm) o mas pequenos (< 0,3 cm). El sistema puede ser unitario (por ejemplo, un bolo), puede estar dividido para componerse de varias subunidades (por ejemplo, varias capsulas constituyen una dosis unitaria) que se administran practicamente simultaneamente, o pueden comprender una pluralidad de partfculas, tambien denominado material multiparticulado. Un material multiparticulado puede tener numerosas aplicaciones en formulacion. Por ejemplo, se puede utilizar un material multiparticulado como un polvo para rellenar la envoltura de una capsula, o usarse tal cual para mezclar con alimento para facilitar la ingesta.

En una realizacion espedfica, una matriz multiparticulada comprende una pluralidad de partfculas que contienen el principio, comprendiendo cada partfcula el principio y/o un analogo del mismo, por ejemplo, en forma de una solucion/dispersion solida con uno o mas excipientes seleccionados para formar una matriz capaz de controlar la velocidad de disolucion del principio en un medio acuoso. Los materiales de matriz utiles en esta realizacion son generalmente hidrofobos tales como ceras, algunos derivados de celulosa, u otros polfmeros hidrofobos. Si es necesario, los materiales de matriz se pueden formular opcionalmente con materiales hidrofobos, que se pueden utilizar como aglutinantes o potenciadores. Los materiales de matriz utiles para la fabricacion de estas formas farmaceuticas son: etilcelulosa, ceras tales como parafina, aceites vegetales modificados, cera de carnauba, aceite de ricino hidrogenado, cera de abeja, y similares, asf como poliestireno sinteticos tales como poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo) copolfmeros de acetato de vinilo y etileno, poliestireno, y similares. Los aglutinantes o agentes modificadores de la liberacion solubles en agua o hidrofilos que opcionalmente se pueden formular en la matriz incluyen polfmeros hidrofilos tales como hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropil metil celulosa (HPMC), metilcelulosa, poli(N-vinil-2-pirrolidinona) (PVP), poli(oxido de etileno) (PEO), poli(alcohol vimlico) (PVA), goma xantana, carragenato, y otros materiales naturales y sinteticos de este tipo. Ademas, los materiales que actuan como agentes modificadores de la liberacion incluyen materiales solubles en agua tales como azucares o sales. Los materiales solubles en agua preferidos incluyen lactosa, sacarosa, glucosa y manitol, asf como polfmeros hidrofilos tales como, por ejemplo, HPC, HPMC, y PVP.

En una realizacion espedfica, un producto multiparticulado se define como aquel que se procesa mediante aglomeracion controlada. En este caso, el agente se disuelve o se disuelve parcialmente en un transportador fusible adecuado, y se pulveriza sobre las partfculas transportadoras que comprenden la sustancia de matriz.

Dosis: Una dosis eficaz de una composicion de la materia sujeto divulgada en el presente documento se administra a un sujeto que lo necesita. Una "cantidad eficaz para tratamiento" o una "cantidad terapeutica" es una cantidad de una composicion terapeutica suficiente para producir una respuesta mensurable (por ejemplo, una respuesta biologicamente o clmicamente relevante en un sujeto que se esta tratando). Los niveles de dosificacion reales de los principios activos en las composiciones de la materia sujeto divulgada en el presente documento se pueden variar con el fin de administrar una cantidad del(de los) compuesto(s) activo(s) que es eficaz para conseguir la respuesta terapeutica deseada en un sujeto concreto. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de la actividad de la composicion terapeutica, la via de administracion, la combinacion con otros farmacos o tratamientos, la gravedad de la dolencia que se va a tratar, y del estado y antecedentes medicos del sujeto que se esta tratando. Sin embargo, esta comprendido en los conocimientos del experto en la materia comenzar las dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapeutico deseado, e incrementar la dosificacion gradualmente hasta que se consiga el efecto deseado. La potencia de la composicion puede variar y, por tanto, una "cantidad eficaz para tratamiento" puede variar. Sin embargo, utilizando los metodos de ensayo descritos en el presente documento, el experto en la materia puede evaluar rapidamente la potencia y eficacia de un compuesto candidato de la materia sujeto divulgada en el presente documento y ajustar el regimen terapeutico de acuerdo con ello.

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Tras revisar la divulgacion de la materia sujeto divulgada en el presente documento, una persona normalmente experta en la materia puede adaptar las dosificaciones a un sujeto individual, teniendo en cuenta la formulacion concreta, el metodo de administracion a utilizar con la composicion, y la enfermedad concreta tratada. Otros calculos de la dosis pueden tener en cuenta la altura y el peso del sujeto, la gravedad y estadio de los smtomas, y la presencia de condiciones ffsicas perjudiciales adicionales. Dichos ajustes o variaciones, asf como la evaluacion de cuando y como realizar dichos ajustes o variaciones, son bien conocidos por los expertos en la tecnica medica.

Por la cita de las diferentes referencias del presente documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia concreta sea "tecnica anterior" respecto a su invencion. Las realizaciones de las composiciones y metodos de la invencion se ilustran en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas descritas en el presente documento, incluyendo las de la invencion. Se apreciara que seran evidentes para el experto en la materia las variaciones en las proporciones y alternativas en los elementos de los componentes mostrados.

Ejemplo 1: La expansion terapeutica de Treg in vivo mediante TNFRSF25 evita la inflamacion pulmonar por alergia

La superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF) consiste en al menos 19 ligandos y 30 receptores (TNFRSF) que se expresan diferencial en celulas linfoides y no linfoides. En los linfocitos TCD3+, la senalizacion de TNFSF funciona normalmente de forma espedfica de TCR para soportar varias fases de la respuesta inmunitaria, incluyendo la polarizacion, la expansion, la funcion efectora, la contraccion, la memoria y la muerte. TNFRSF25 (DR3, denominado a partir de ahora en el presente documento como TNFR25) es uno de los miembros de TNFSF descubiertos mas recientemente y se expresa principalmente en linfocitos T CD4+ y CD8+y en linfocitos T citoltticos naturales (NKT) (Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., y Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205:1037-1048). TNFSF15 (TL1A), el ligando de TNFR25, se expresa en algunas celulas endoteliales y se induce rapidamente en celulas dendnticas y en macrofagos/monocitos tras la senalizacion de TLR4 o FcyR (Meylan, F., et al. 2008. Immunity 29:79-89; Prehn, J.L., et al. 2007. J Immunol 178:4033-4038). Los estudios in vitro demuestran que la senalizacion de TNFR25 en linfocitos T CD4+, CD8+ o citoltticos naturales aumenta la produccion de IL-2, IL-4 e IFNy posterior a la activacion de TCR o a la estimulacion simultanea mediante IL-12 e IL-18 (Papadakis, K.A., et al. 2005. J Immunol 174:4985-4990). La senalizacion de TNFR25 tambien disminuye el umbral de los linfocitos T CD4+ T a la proliferacion inducida por TCR en ausencia de coestimulacion de CD28 mediante un mecanismo dependiente de IL- 2 (Meylan et al. 2008; Migone, T.S., et al. 2002. Immunity 16:479-492).

La activacion de TNFR25 mediante TL1A agrava la patologfa de la enfermedad en asma experimental, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), artritis reumatoide (AR) y encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (Pappu, B.P., et al. 2008. J Exp Med 205:1049-1062). En cada uno de estos estudios, la estimulacion dependiente de TNFR25 de Th1, Th2 o Th17 polariza y los linfocitos T efectores activados por TCR potencian la produccion de las citoquinas efectoras relevantes de cada subconjunto T auxiliar. Las senales de TNFR25 no son necesarias para la diferenciacion de linfocitos T CD4+ T no expuestos anteriormente frente a los linajes Th1, Th2 o Th17. En algunos de estos informes, se han estudiado los modelos de raton con ablacion genetica de TNFR25 o TL1A (Pappu, B.P. et al., 2008; Takedatsu, H., et al. Gastroenterology 135:552-567. Bull, M.J., et al. 2008. J Exp Med 205:2457-2464), modelos de raton transgenico que expresan un TNFR25 dominante negativo o bloqueo sistemico de A. No se observaron anomalfas inmunitarias o susceptibilidades a enfermedades en los modelos de raton deficiente en TL1A o TNFR25 o en modelos de enfermedad autoagresiva donde se ha inhibido la senalizacion normal de TL1A a TNFR25. Ademas, en cada uno de estos informes, la expresion de TNFR25 o TL1A produce un fenotipo proinflamatorio que parece mas peligroso para el animal que en ausencia de TNFR25 o TL1A. Hasta el momento no existen informes que analicen el papel de TNFR25 sobre los linfocitos T CD4+FoxP3+ reguladores (Treg), aunque Treg puede expresar TNFR25 (Pappu, B.P., et al. 2008. J Exp Med 205:1049-1062). Dada la importancia de Treg en la prevencion de la autoinmunidad letal), la expresion de TNFR25 mediante Treg y la funcion de TNFR25 en la patogenesis de multiples modelos de enfermedad autoagresiva, los autores decidieron estudiar el papel de TNFR25 sobre la funcion de Treg. Esta investigacion revelo que los Treg expresan intensamente TNFR25, pero no lo hacen los linfocitos T FoxP3CD4+ convencionales (Tconv). La estimulacion in vivo de TNFR25 en ausencia de antfgeno exogeno usando un anticuerpo agonista, el clon 4C12, conduce a la proliferacion rapida y selectiva de los Treg naturales, pero no de los Tconv, hasta un 30-35 % de todos los linfocitos T CD4+ en un plazo de cuatro dfas desde el tratamiento con 4C12 y es independiente de la implicacion de TCR en la senalizacion de MHC II e IL-2. La expansion de Treg mediante TNFR25 protege contra la inflamacion pulmonar tras estfmulo con antfgeno de las vfas respiratorias superiores de ratones sensibilizados. Estos datos demuestran un nuevo papel para TNFR25 como regulador de Treg. Este papel puede proteger de la patogenesis de la enfermedad en el asma alergica. Ademas, la expansion in vivo de Treg natural con agonistas de TNFR25 proporcionana un metodo traducible, como alternativa a enfoques basados en IL-2 o ex vivo, para facilitar el uso clmico de la terapia con Treg en seres humanos.

Materiales y metodos:

Ratones: Los ratones C57BL/6 de tipo natural se adquirieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA).

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Ratones indicadores Foxp3-RFP en un fondo B6 (Wan, Y.Y., y Flavell, R.A. 2005. Proc Natl Acad Sci U S A 102:5126-5131)), FoxP3-GFP (Fontenot, J.D., et al. 2005. Immunity 22:329-341; Fontenot, J.D., Gavin, M.A., y Rudensky, A.Y. 2003. Nat Immunol 4:330-336) y CD45.1 SJ-L, MHC N'/_, IL-2 receptor p mutante, los ratones CD80/86'/_ y CD4'/_ se reprodujeron en el animalario de los inventores. Los ratones TL1A'/_ se adquirieron de Lexicon Genetics Inc. (The Woodlands, TX) y se retrocruzaron en un fondo C57BL/6 por Speed Congenics. Los ratones se utilizaron a las 6-12 semanas de edad, y se mantuvieron en condiciones exentas de patogenos en el animalario de la UM. Todos los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el comite institucional para el cuidado y el uso animal de Miami.

Anticuerpos y reactivos. Los anticuerpos comerciales a utilizar en la campana de flujo se adquirieron de BD Pharmingen o eBioscience. El Armenian Hamster IgG control de isotipo se compro a eBioscience. DTA-1 (a-GITR) se obtuvo de BioXCell, LG.3A10 (a-IL-27) de BioLegend y 158321 (a-4-1BB) de R&D Systems. El raton recombinante IL2 y el anticuerpo monoclonal anti-IL-2, clon JES6-1A12, se adquirieron de eBioscience. Los ratones recombinantes para el complejo IL2/anti-IL-2 (IAC) se generaron mediante incubacion de 10.000 unidades de IL-2rm con 5 |jg de JES6-1A12 durante 15 minutos a 25°C. Los hibridomas de hamster armenio productores de anticuerpos contra el TNFR25 de raton (4C12, agonista) se generaron como se ha descrito anteriormente (Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., y Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205:1037-1048). 4C12 (a-TNFR25) y OX-86 (a-OX40) se produjeron en biorreactores de fibra hueca (Fibercell Systems, Frederick, MD) y se purificaron de los sobrenadantes exentos de suero en una columna de protema G (GE Healthcare, UK). Se uso rapamicina (Rapamune, Wyeth) a 75 jg/kgMa como se ha descrito anteriormente (Araki, K., et al. 2009. Nature 460:108-112.). La ciclosporina-A (25 mg/kgMa) FK506 (3 mg/kg/dfa) e inhibidor Akt V (Tricirbina, 1,5 mg/kg/dfa, o dos veces al dfa, segun se indica) se adquirieron de Calbiochem/EMD y se administraron mediante inyeccion intraperitoneal.

Citometna de flujo y clasificacion celular: Se prepararon suspensiones de una sola celula a partir de bazo y ganglios linfaticos. 106 celulas se prebloquearon con anticuerpo con anti-CD16/CD32 de raton y se tineron con diferentes combinaciones de anticuerpos. La tincion intracelular se realizo de acuerdo con los procedimientos normalizados. El analisis mediante citometna de flujo se realizo en un instrumento Becton Dickinson FACS LSR II y el programa informatico DIVA o FlowJo. La clasificacion celular se realizo con un clasificador celular FACSAria (BD) tras enriquecimiento de los esplenocitos en linfocitos T CD4+ usando el kit EasySep Mouse CD4+ T cell Pre-Enrichment de Stem Cell Technologies.

RT-PCR en tiempo real: El ARN total se extrajo de cortes de tejido colonico o pulmonar congelado instantaneamente, y se transcribio de forma inversa con el kit RNeasy Mini Kit y el kit QuantiTect Reverse Transcription Kit de QIAGEN, respectivamente. La PCR en tiempo real se realizo por duplicado en un equipo ABI 7300 Light Cycler con sondas TaqMan de Applied Biosystems. Las muestras se normalizaron para la accion p.

Transferencia adoptiva: Para los estudios de las Figuras 2A y 2B, los linfocitos CD4+ totales se clasificaron mediante FACS de ratones FIR y se determino el porcentaje de linfocitos FoxP3+RFP+ tras la clasificacion. Los linfocitos CD4+ totales que conteman 106linfocitos FoxP3+ se transfirieron de forma adoptiva (i.v.) en ratones MHC II'/'o CD4'/'el dfa -2. El dfa 0, los ratones se trataron con anticuerpo 4C12 o el control de isotipo. Para los estudios de las Figuras 11A- 11E, 2 x 106linfocitos CD4+FoxP3- o CD4+FoxP3+ de ratones CD45.2+ FIR clasificados mediante FACS se transfirieron de forma adoptiva mediante inyeccion intravenosa en ratones CD45.1 SJL congenicos. Un dfa despues, se administraron 10 jg de 4C12 mediante inyeccion intraperitoneal. La expansion de las celulas transferidas se siguio diariamente mediante FACS (a partir de 3 dfas) en celulas de sangre periferica.

Ensayos de supresion in vitro: 1 x 105linfocitos CD4+CD25 se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se activaron con 2 jg de anticuerpo anti-CD3 (2C11) soluble en presencia o ausencia de los APC (relacion 1:1) y linfocitos CD4+FIR+ reguladores en diferentes proporciones. El IgG control, los anticuerpos 4C12, DTA1, se anadieron donde se indica a una concentracion de 10 jg/ml. Los cultivos se incubaron durante 72 horas y pulsaron con 3H-timidina (1 jCi/pocillo; Perkin Elmer, Waltham, MA) durante las ultimas 6 h. Los isotopos incorporados se midieron mediante recuento por centelleo en medio lfquido (contador Micro Beta TriLux, Perkin Elmer).

Induccion de asma alergica: Los ratones se sensibilizaron mediante inyeccion i.p. de 66 jg ovoalbuminca (albumina de huevo de gallina cristalizado, calidad V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) adsorbida con 6,6 mg de alum (sulfato de potasio y aluminio; Sigma-Aldrich) en 200 jl de PBS el dfa 0, con un refuerzo i.p. el dfa 5. El dfa 12, los ratones recibieron i.p. bien 20 jg de anticuerpo agonista contra TNFRSF25 (4C12) o 20 jg de anticuerpo de cabra dirigido contra la IgH control de isotipo de hamster (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Westgrove, PA) en 200 jl de PBS. El dfa 16, los ratones recibieron un estfmulo mediante aerosol con ovoalbumina al 0,5 % (Sigma-Aldrich) en PBS durante 1 hora utilizando un nebulizador BANG (CH Technologies, Westwood, NJ) en un sistema de exposicion por inhalacion de flujo dirigido solamente a la nariz Jaeger-NYU (CH Technologies). El dfa 19, los ratones se sacrificaron, los pulmones se perfundieron con PBS, y se obtuvo el lavado broncoalveolar. Los lobulos pulmonares se procesaron para determinar el ARN o para obtener suspensiones de celula unica preparadas a partir del pulmon homogeneizado para analisis mediante citometna de flujo, o para histologfa pulmonar. El drenado de los ganglios linfaticos bronquiales tambien proporciono el ARN para analisis posterior, asf como analisis mediante citometna de flujo. La cuantificacion de cortes pulmonares tenidos con acido-Schiff (PAS) se realizo mediante el programa informatico MacBiophotonics Image J por desconvolucion del color (con el vector H PAS) seguido por asignacion de

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umbral a las imagenes (color [2], configurado a 100) y se contaron con el contador de nucleos (Smites configurados entre 100-1000).

Analisis estad^stico: Todos los analisis graficos y estadfsticos se realizaron con el programa ABI Prism. Se llevaron a cabo analisis emparejados utilizando el test de la T de Student. El analisis multivariante se realizo usando el ANOVA monolateral y la prueba posterior de Tukey. La significancia se indica como * (p<0,05), ** (p<0,01) y *** (p<0,001).

Resultados

TNFR25 se expresa intensamente por los linfocitos T reguladores: Antes de este estudio, no habfa informes que demostraran una funcion de TNFR25 sobre los linfocitos T CD4+FoxP3+ reguladores (Treg). para confirmar si existfa expresion de TNFR25 por Treg, FoxP3 CD4+ (Tconv) y Treg se clasificaron por celula unica desde ratones indicadores FoxP3 hasta mas de un 99 % de pureza y posteriormente se analizo mediante citometna de flujo para determinar la expresion de TNFR25 asf como de GITR (TNFRSF18), Ox40 (TNFRSF4, CD134) y 4-1BB (TNFRSF9, CD137). La clasificacion de Treg vivos fue posible mediante el uso de ratones indicadores FoxP3 (ratones FIR) que expresan una protema fluorescente roja de un transgen desactivado procedente de una construccion bicistronica segun el promotor FoxP3. Este analisis revelo que, aunque TNFR25, Ox40, GITR y 4-1BB se expresan tanto por Treg como por Tconv, la mayor diferencia relativa en los niveles de expresion se observo mediante una expresion muy elevada de TNFR25 en Treg en comparacion con la expresion baja mediante Tconv (Figure 1A). Sin desear quedar vinculado por teona alguna, la expresion diferencial de TNFR25 entre Treg y Tconv indica que TNFR25 puede tener un papel importante en el funcionamiento de Treg.

La estimulacion de TNFR25 expande rapidamente los linfocitos Treg in vivo: La generacion de un anticuerpo agonista de TNFR25, el clon 4C12, se ha descrito anteriormente (Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., and Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205:1037-1048). Mediante el uso de ratones FIR, se realizo un seguimiento continuo de la frecuencia y fenotipo de la poblacion de linfocitos Treg en sangre periferica despues del tratamiento con el anticuerpo agonista de TNFR25, 4C12. La inyeccion intraperitoneal (i.p) de 4C12 indujo una expansion rapida y muy reproducible de los linfocitos Treg CD4+FoxP3+ in vivo (Figura 1B). Esta expansion fue maxima en los dfas 4 y 5 despues de la inyeccion de 4C12, con Treg FoxP3+ que comprendfan un 30-35 % de los linfocitos T CD4+ totales en la sangre periferica durante el maximo de la respuesta. Los linfocitos Treg expandidos mediante 4C12 persistieron en la sangre periferica y en todos los sitios tisulares examinados durante dos semanas, y disminuyendo lentamente hasta los niveles sin estimular. El sitio de inyeccion no tiene ningun papel en esta expansion, como demuestra una expansion de linfocitos Treg equivalente tras la inyeccion de 4C12, por via tanto intraperitoneal, subcutanea o intravenosa. La expansion de linfocitos Treg tras la inyeccion de 4C12 fue dependiente de la dosis, con una respuesta maxima observada a una dosis de solamente 10 |jg, correspondiente a aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal (Figura 1B). Se descubrio que el tratamiento de los ratones FIR con la protema de fusion TL1AIg purificada de raton (100 jg) induce la expansion de linfocitos Treg con una magnitud y cinetica analoga al tratamiento con el anticuerpo 4C12. La deteccion de la expresion de RFP en ratones FIR notifico fehacientemente la presencia de los transcriptos de FoxP3; sin embargo, su posible existencia puede que no garantice la expresion de la protema FoxP3 porque FoxP3 y RFP se traducen independientemente desde el transcrito de FoxP3-RFP. Por tanto, la expansion de linfocitos CD4+FoxP3+ tras la administracion de 4C12 se confirmo en ratones no genomanipulados mediante la tincion con anticuerpos FoxP3 y en ratones indicadores geneticamente inactivados para FoxP3-GFP que expresan una protema de fusion FoxP3-GFP.

Entre los miembros de TNFR que expresan linfocitos Treg, TNFR25 es el unico que produce la expansion de linfocitos Treg: Los miembros de TNFRSF GITR yd Ox40 se expresan mediante linfocitos Treg (Figura 1A) y realizan la actividad y proliferacion de los linfocitos Treg. Se cree que la estimulacion de los linfocitos Treg mediante 4-1BB puede modular tanto la actividad como la proliferacion de estas celulas. Ademas, se cree que la estimulacion de los linfocitos CD4+FoxP3- mediante el miembro de TNFRSF CD27 induce la expresion de FoxP3. Dado el solapamiento entre bien la supresion funcional o la induccion de los linfocitos Treg entre TNFR25 y estos otros miembros de TNFSF, la expansion de los linfocitos Treg se comparo in vivo tras la estimulacion de TNFR25, Ox40, 4-1BB, GITR o CD27. En todos los casos, se utilizaron anticuerpos monoclonales agonistas bien caracterizados del correspondiente receptor para disparar la senalizacion espedfica. Estos estudios demostraron que TNFR25 es unico entre los miembros de TNFRSF analizados por su capacidad de inducir selectivamente la expansion de los linfocitos Treg (Figura 1C). Se ha informado recientemente que la expansion de los linfocitos Treg inducida por Ox40 requiere el agotamiento de IL-4, IL-6 e IFNy (Ruby, C.E., et al. 2009. J Immunol 183:4853-4857). Por el contrario, TNFR25 induce la expansion de los linfocitos Treg in vivo sin necesitar manipulaciones adicionales.

Las senales de TMHC ll e lL-2 son necesarias para la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25: ln vitro, la proliferacion de los linfocitos Treg se puede inducir mediante varias combinaciones de anticuerpos estimuladores de TCR, celulas presentadoras de antfgenos y senales de IL-2. La induccion de la proliferacion de linfocitos Treg in vitro se intento en estos estudios usando muchas combinaciones diferentes de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, IL- 2 recombinante, TGF-p y acido retinoico con o sin anticuerpo agonista de TNFR25, y en todos los casos, la estimulacion con TNFR25 no consiguio potenciar la proliferacion de linfocitos Treg in vitro, indicando que se necesitaban senales adicionales (Tabla 1).

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Tabla 1: Condiciones estudiadas in vitro usando varias poblaciones de linfocitos (indicadas) para analizar los _______________requisitos de la proliferacion de linfocitos Treg inducidos con TNFR25. _____________

Condicion

Esplenocitos CD4+ LN

1. Sin estimular

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2. Sin estimular+4C12

X X X

3. Sin estimular + 4C12 ret.

X

4. a-CD3

X X X

5. a-CD3 + 4C12

X X X

6. a-CD3 + 4C12 ret.

X

7. a-CD3 + TGF-p

X X X

8. a-CD3 + TGF-p + 4C12

X X X

9. a-CD3+RA

X

10. a-CD3 + RA + 4C12

X

11. a-CD3 + RA + 4C12 ret.

X

12. a-CD3 + a-CD28

X X X

13. a-CD3 + a-CD28 + 4C12

X X X

14. a-CD3 + IL-2

X X X

15. a-CD3 + IL-2 + 4C12

X X X

16. a-CD3 + a-CD28 + IL-2

X

17. a-CD3 + a-CD28 + IL-2 + 4C12

X

18. a-CD3 + a-CD28 + TGF-p

X

19. a-CD3 + a-CD28 + TGF-p + 4C12

X

20. a-CD3 + IL-2 + TGF-p

X

21. a-CD3 + IL-2 + TGF-p + 4C12

X

22. a-CD3 + a-CD28 + IL-2 + TGF-p

X

23. a-CD3 + a-CD28 + IL-2 + TGF-p + 4C12

X

24. Un dfa in vivo + 4 dfas in vitro: IL-2 + escalado de 4C12

X

Como TNFR25 puede afectar la sensibilidad de los linfocitos T CD4+ T a las senales de TCR, los siguientes experimented se realizaron para determinar si la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 era dependiente de la senalizacion de TCR in vivo. Ratones MHC II-/-o CD4-/-se transfirieron de forma adoptiva linfocitos cD4+ totales que conteman 106linfocitos CD4+FoxP3+ purificados de ratones FIR. Como los ratones MHC II-/-son deficientes en linfocitos T CD4+, se decidio utilizar ratones CD4-/-como poblacion de control para cualquier expansion homeostatica que pudiera aparecer trans la transferencia adoptiva en un entorno con los linfocitos T CD4+ agotados. Los ratones se trataron con 4C12 o con el anticuerpo control de isotipo 2 dfas despues de la transferencia adoptiva, y el porcentaje y la cantidad absoluta de linfocitos Treg se determinaron en los dfas 4 y 6 despues de la inyeccion de anticuerpo (Figuras 2A, 28). Estos datos demuestran que, aunque los linfocitos Treg se expanden en grado similar en los ratones CD4-/-y silvestres, las moleculas de MHC II son necesarias para la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 in vivo. Se observo que el porcentaje de linfocitos Treg transferidos de forma adoptiva en ratones MHC II-/- era inferior que en ratones CD4-/- porque los ratones MHC II-/- tienen mas linfocitos CD4+ al principio que los ratones CD4-/- (Figura 2A). Una comparacion entre las cifras absolutas de linfocitos Treg transferidos de forma adoptiva (Figura 28) indica que se recuperaron cifras absolutas equivalentes de linfocitos Treg en ambos grupos. Estos estudios demuestran una necesidad de senales MHC II en la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25, que implica indirectamente la necesidad de la senalizacion de TCR para que los linfocitos Treg se vuelvan sensibles a la senalizacion de TNFR25, analogamente a la senalizacion de TNFR25 en linfocitos Tconv. Para proporcionar evidencia adicional de que las senales de TCR son necesarias para la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25, los ratones se pretrataron con ciclosporina A o FK506 y se analizaron las cifras de linfocitos Treg despues del tratamiento con 4C12 o los anticuerpos control de isotipo (Figuras 2C, 2D). Estos estudios demuestran que, analogamente a lo observado en ausencia de senales MHC II; el estfmulo de TNFR25 en presencia de ciclosporina A o FK506 no induce la proliferacion de linfocitos Treg. El requisito de autoantfgenos homologos en el MHC II esta aun en investigacion, pero un regimen de ese tipo proporcionana una explicacion adicional para la selectividad de los linfocitos Treg para TNFR25 (ademas de la expresion selectiva de TNFR25 sobre los linfocitos Treg, Figuras 8A-8C) en ausencia de antfgeno exogeno.

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Se cree que la senalizacion de TNFR25 aumenta la sensibilidad de los linfocitos Tconv a las senales de IL-2 posteriores a las senales de TCR en ausencia de coestimulacion con CD28. Dado el requisito de la activacion tanto de MHCII como de NFAT para la activacion de la expansion de los linfocitos Treg inducida por TNFR25 (Figuras 2A- 2D) se determino si las senales de IL-2 o CD80186 eran necesarias adicionalmente. La expansion de linfocitos Treg en ratones que expresan una cadena p no funcional del receptor de IL-2 (Figura 2E) y en ratones CD80186-/- (Figura 2F) se determino 4 dfas despues de la inyeccion de 4C12. Estos datos demuestran que la senalizacion del receptor de TCR e IL-2, pero no la coestimulacion con CD80 o CD86, es necesaria para la expansion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 in vivo. Sin desear quedar vinculado por teona alguna, la senalizacion de CD28 y CTLA-4 en los linfocitos Treg puede que no sea un requisito para la proliferacion inducida por TNFR25. Ademas, puesto que la combinacion entre TNFR25, estimulacion con TCR y senalizacion de IL-2 no consigue inducir la proliferacion de linfocitos Treg in vitro, se requieren senales necesarias que tambien estan en investigacion.

Los linfocitos Treg estimulados con TNFR25 son hipersensibles a la proliferacion inducida por IL-2 ex vivo: Aunque los requisitos de la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 in vitro necesita mas estudio, se observo que los linfocitos Treg purificados de ratones tratados con anticuerpos agonistas de TNFR25 eran hipersensibles a la proliferacion inducida por IL-2 ex vivo (Figura 3A). Estos datos corroboran la importancia de las senales de IL-2 en la expansion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 (Figura 2E), e indican que la estimulacion de TNFR25 induce la expansion de los linfocitos Treg afectando la sensibilidad de los linfocitos Treg a las senales de IL-2. Se preven varios mecanismos posibles, que podnan explicar esta observacion: 1) TNFR25 podna aumentar la expresion de las subunidades del receptor de IL-2 sobre los linfocitos Treg, 2) TNFR25 podna potenciar la activacion de STAT5 en linfocitos Treg, 3) TNFR25 podna potenciar la activacion de mTOR en linfocitos Treg y 4) TNFR25 podna potenciar la activacion de PI3-quinasa/Akt en linfocitos Treg. Para determinar la expresion de las cadenas alfa, beta y gamma del receptor de IL-2 se realizo una citometna de flujo con linfocitos Treg que experimentaron expansion in vivo posterior al tratamiento con el anticuerpo 4C12 comparado con los linfocitos Treg aislados de ratones tratados con los anticuerpos de IgG de control (Figura 3B). Estos datos demuestran que, aunque la expresion de la cadena alfa del receptor de IL-2 (CD25) disminuye realmente tras la exposicion a 4C12 (Figura 7A), la expresion de las cadenas beta y gamma (CD 122 y CD 132, respectivamente) permanece inalterada en los linfocitos Treg aislados de ratones tratados con 4C12 y los anticuerpos control de isotipo (Figura 3B), eliminando eficazmente la opcion (1) como posibilidad. Para determinar si la fosforilacion de STAT5 quedaba potenciada en los ratones tratados con 4C12, se asilaron linfocitos Treg de ratones tratados 4 dfas antes con 4C12 o anticuerpo control de isotipo y se expusieron a IL-2 ex vivo (10 ng/ml, 15 min). La tincion posterior de estos linfocitos Treg con anticuerpos fosfoespedficos demostro que ni STAT5 ni la fosforlizacion de S6 se potencio en los linfocitos Treg aislados de ratones tratados con 4C12 en comparacion con los ratones de control, eliminando eficazmente la segunda posibilidad (Figura 3C). Posteriormente, la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 in vivo se encontro inalterada en presencia del inhibidor de mTOR, rapamicina, eliminando la tercera posibilidad (Figura 3D). Finalmente, para determinar si la senalizacion de Akt era necesaria para la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25, los ratones se trataron con anticuerpos agonistas de TNFR25 o con anticuerpo de control en presencia o ausencia del inhibidor selectivo de Akt1/2/3, tricibina (inhibidor de Akt V, AktiV). Estos estudios demuestran que la inhibicion selectiva de la activacion de Akt fue suficiente para inhibir la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 de 33,69 ± 1,253 % en controles tratados con vehfculo a 22,43 ± 1,352 % (N=6) cuando se trataron una vez al dfa con AktiV (no se muestran los datos, p<0,001) y a 18,20 ± 2,117 % (N=3) cuando se trataron dos veces al dfa con AktiV (Figura 3E, p=0,0003).

Comparacion de la expansion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 o el complejo del anticuerpo IL-2 en ratones no expuestos a antigeno: El unico otro agente que expande selectivamente los linfocitos Treg in vivo se notifico por Boyman et al (Science 311:1924-1927, 2006) mediante el uso de un complejo de IL-2 recombinante y anticuerpo espedfico de IL-2 (IAC), el clon JES6-1A12. Asf, la expansion de los linfocitos Treg in vivo se comparo directamente despues del tratamiento con cualquiera de 4C12 o iAc (Figura 7A). Este analisis demuestra que la magnitud y la cinetica de la expansion de los linfocitos Treg fueron similares despues del tratamiento con 4C12 o IAC in vivo. Sin embargo, se observo que la contraccion de los linfocitos Treg expandidos era prolongada despues del tratamiento con 4C12 en comparacion con el tratamiento con IAC. A diferencia de los linfocitos Treg expandidos con TNFR25, que expresan niveles intermedios de CD25, los linfocitos Treg expandidos con IAC expresaban elevados niveles de Cd25 (Figura 7B). No se encontraron otras diferencias en la expresion de CD11a, CD28, CD45RA, CD62L, CD127, CTLA-4 intra o extracelular, OX40, PD-1, IL-17A o IFNy por comparacion de los linfocitos Treg expandidos mediante 4C12 con los linfocitos Treg expandidos mediante IAC.

La expansion de linfocitos Treg in vivo mediante TNFR25 reduce la inflamacion pulmonar alergica: Para determinar si los linfocitos Treg expandidos mediante 4C12 evitan la inflamacion en un modelo de enfermedad, se sometio a ensayo si este tratamiento podna reducir la inflamacion en un modelo bien caracterizado de inflamacion pulmonar alergica inducida en ratones estimulados con ovoalbumina/alum en un estimulo de las vfas respiratorias con ovoalbumina. Los ratones se estimularon con ovoalbumina/alum el dfa 0 y 5 y posteriormente se trataron con 4C12 IgG de hamster el dfa 12. Cuatro dfas despues, en el momento de maxima expansion de linfocitos Treg, las vfas respiratorias se sensibilizaron con ovoalbumina aerosolizada en PBS o un control salino en PBS. La expansion maxima de los linfocitos Treg se confirmo por seguimiento de los linfocitos Treg en sangre periferica durante este periodo (Figura 4A). La expansion de linfocitos Treg inducida por 4C12 tras la sensibilizacion con ovoalbumina/alum se retraso ligeramente los dos primeros dfas, en comparacion con la expansion en ratones no sensibilizados, pero

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despues los linfocitos Treg rapidamente se expandieron en una proporcion mayor (50-55 %) de linfocitos T CD4+ totales en el dfa 4 (Figuras 4B, 4C). Los ratones se sacrificaron tres dfas despues de la aerosolizacion, y se analizaron el fluido de lavado bronquioalveolar (BALF), ganglios linfaticos bronquiales (bLN) y tejido pulmonar.

El numero total de celulas aisladas de los pulmones quedo inalterado entre los animales de control y los tratados con 4C12. Coherente con esta observacion, el numero de linfocitos T CD4+ y CD8+ T dentro de los pulmones fue similar entre los animales de control y los tratados con 4C12; sin embargo, en los ratones tratados con 4C12, el numero de linfocitos Treg fue significativamente mayor (Figura 4B). El analisis de la composicion de los linfocitos Treg del tejido pulmonar revelo que siete dfas despues de la administracion de 4C12 (y 3 dfas despues de la aerosolizacion), la frecuencia de linfocitos Treg en los pulmones permanecio al 55 % de todos los linfocitos T CD4+, en comparacion con un 22 % en los ratones tratados con IgG de hamster (Figura 4C). Se ha notificado que el equilibrio entre linfocitos Tconv y Treg es un mejor predictor de la patogenesis de la enfermedad que simplemente el numero total de linfocitos Treg (Tang, Q., et al. 2008. Immunity 28:687-697; Monteiro, J.P., et al. 2008. J Immunol 181:58955903); la relacion de CD4+FoxP3- (linfocitos Tconv) y linfocitos Treg se determino en tejido pulmonar (Tabla 2). Para confirmar que el fenotipo de linfocitos Treg infiltrantes en el pulmon era consistente con el fenotipo de linfocitos T expandidos con TNFR25 en ratones sin enfermedad, se analizaron los linfocitos Treg infiltrantes en el pulmon y se descubrio que no se podfan distinguir de los linfocitos Treg infiltrantes en el pulmon asilados de ratones tratados con IgG por su expresion de GITR, OX40, PD-1, CD44, CD62L y CD69. Tabla 2: Se muestra el numero total de linfocitos CD4+FoxP3- (Tconv), CD4+FoxP3+ (Treg) y la relacion de linfocitos Tconv a Treg del total de celulas pulmonares recogidas, tal como se describe para las Figuras 10A-10E. El numero de linfocitos se calculo multiplicando el numero de celulas obtenidas en una suspension de celula unica del pulmon izquierdo por el porcentaje de celulas linfoides controladas analizadas mediante citometna de flujo x el porcentaje de linfocitos Tconv o Treg dentro de la poblacion linfoide controlada.

4C12 disminuye el numero absoluto de linfocitos Tconv y la relacion de linfocitos Tconv:Trea

IgG 4C12

n.° de linfocitos Tconv/pulmon

78.200 23.340

n.° de linfocitos Trea/pulmon

10.700 44.400

Relacion Tcom/Treg

7:1 1:2

Coherente con el analisis de las celulas del tejido pulmonar, el numero de celulas aisladas del BALF aumento significativamente despues del estfmulo con aerosol que contema ovoalbumina, pero no el control salino aerosolizado, en todas las condiciones, pero se redujo intensamente mediante el tratamiento con 4C12. El numero total de eosinofilos en el BALF se asemeja al numero total de celulas en el BALF, y se observo que el pretratamiento con 4C12 reduce significativamente la gravedad de la eosinofiliza de las vfas respiratorias (Figura 4D).

Las citoquinas proinflamatorias IL-4, IL-5 y IL-13 se han implicado intensamente en la patogenesis de la inflamacion pulmonar alergica. Para determinar si la expresion de estas citoquinas se redujo mediante el pretratamiento con 4C12, el ARN total se extrajo de pulmones congelados rapidamente tres dfas despues de la aerosolizacion y se analizaron mediante RT-PCR. Este analisis demostro que la expresion de IL-4, IL-5 e IL-13 entre los linfocitos CD4+ infiltrantes en el pulmon se redujo significativamente despues del tratamiento con 4C12, pero sigue elevada despues del tratamiento con el anticuerpo control de isotipo, en comparacion con los controles con solucion salina aerosolizada (Figura 4E). Como control adicional, el nivel de expresion del ARN de FoxP3 se analizo y replico las mismas proporciones relativas de los linfocitos CD4+ que expresaban FoxP3 observada en la citometna de flujo (comparar la Figura 4C a 4E). La histologfa del tejido pulmonar confirmo estos hallazgos, demostrando una infiltracion de linfocitos y produccion de moco en las vfas respiratorias reducidos despues del tratamiento con 4C12 en comparacion con los controles de solucion salina aerosolizada (Figura 4F y cuantificado en la Figura 4G).

TNFR25 expande los linfocitos Treg sin activar o expandir los linfocitos Tconv: Para determinar el fenotipo de los linfocitos Treg expandidos por 4C12, los autores analizaron los linfocitos CD4+FoxP3+ aislados de ganglios linfaticos perifericos, ganglios linfaticos mesentericos, y bazos de ratones que habfan recibido 4C12 o IgG de control de isotipo. Los linfocitos Treg expandidos con 4C12 eran predominantemente linfocitos CD4+FoxP3+CD25 intermedios (int) y se descubrio que se habfan expandido en todos los organos linfoides secundarios analizados (Figuras 5A, 5B y Figuras 8A, 8D). El tratamiento con 4C12 no altero la expresion de CD11a, CD28, CD45RA, CD62L, CD127, CTLA-4 intra o extracelular, OX40, PD-1, IL-17A o IFNy mediante linfocitos Treg. Aunque todos los linfocitos CD4+FoxP3+ siguen siendo positivos para GITR despues del tratamiento con 4C12, la proporcion de linfocitos CD4+FoxP3+ que expresan GITR se desplazo en favor del subconjunto CD25 int despues del tratamiento con 4C12 (Figura 8B). La integrina aEp7 se expresa por un subconjunto muy supresor de CD4+FoxP3+ que puede ser tanto positivo como negativo para CD25. El analisis de la expresion de CD103 revelo un aumento en la expresion de CD103 mediante los linfocitos Treg expandidos por 4C12, pero no los linfocitos Treg control (Figura. 8C). De forma importante, el analisis de los linfocitos CD4+FoxP3'y de los linfocitos CD8+ despues del tratamiento con 4C12 revelo que la senalizacion de TNFR25 no aumenta la cifra absoluta o la proporcion de estas poblaciones celulares. Para determinar si el tratamiento con 4C12 estimula la proliferacion de linfocitos no Treg, los linfocitos T CD4+ Tconv los linfocitos T CD8+ se tineron con el marcador de proliferacion, Ki67. Este analisis ilustro que el tratamiento con 4C12 en ausencia de antfgeno exogeno no aumento la proliferacion de linfocitos Tconv o linfocitos T CD8+. Ademas, la

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tincion de linfocitos CD8+ y linfocitos FoxP3- CD4+ para CD44, CD62L y CD69 no revelo diferencias entre ratones tratados con 4C12 e IgG. Asf, la senalizacion de TNFR25 expande selectivamente los linfocitos Treg sin inducir la expansion o la activacion de los linfocitos efectores CD4+ o cD8+ en ausencia de antigeno exogeno.

La estimulacion de TNFR25 induce la proliferacion de linfocitos Treg naturales in vivo: El aumento de linfocitos Treg despues del tratamiento con 4C12 podna resultar bien de una expresion de FoxP3 de novo o de la proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+. Para diferenciar entre estas dos posibilidades, se determino la expresion del marcador de proliferacion, Ki67, sobre linfocitos CD4+FoxP3+ (Figuras 5C, 5D). Como los datos muestran que el aumento en la relacion de linfocitos CD4+FoxP3+CD25int con respecto a los linfocitos CD4+FoxP3+CD25tu la mayona de linfocitos Ki67+ era CD4+FoxP3+CD25int en los ratones tratados con 4C12. Una proporcion menor (~27 %) de linfocitos CD4+FoxP3+ no se tino con Ki67 (Figuras 5C, 5D), y la mayona de estos linfocitos eran CD25hi. No quedo claro si la proliferacion observada de linfocitos CD25int despues del tratamiento con 4C12 era resultado de la estimulacion selectiva de linfocitos CD25int o si los linfocitos Treg se estimulaban para proliferar independientemente de la expresion de CD25, que se redujo durante la proliferacion.

La mayor proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+CD25 int no descarta conclusivamente la posibilidad de que la senalizacion de TNFR25 pueda estimular la expresion de FoxP3 de novo por los linfocitos CD4+FoxP3- . Para analizar esta posibilidad, se llevaron a cabo experimentos de transferencia adoptiva infundiendo linfocitos CD4+FoxP3- o CD4+FoxP3+ muy purificados (>99 % pureza) de ratones CD45.2+ FIR en ratones B6/SJL congenicos para CD45.1. Estos estudios permitieron rastrear los linfocitos CD45.2+ de transferencia adoptiva despues del tratamiento con 4C12 en hospedadores CD45.1+ y realizar un seguimiento de la persistencia, induccion del silenciamiento de FoxP3-RFP mediante linfocitos CD45.2+CD4+ de transferencia adoptiva (Figuras 5E-5H). Se eligio deliberadamente realizar estos experimentos en ratones completamente inmunocompetentes para evitar cualquier complicacion que pudiera surgir de la expansion homeostatica de linfocitos Treg tras la transferencia adoptiva en cepas inmunodeficientes genetica o experimentalmente. La transferencia de 2X106 celulas clasificadas (Figura 9A) a receptores CD45.1+ inmunocompetentes fue suficiente para detectar una poblacion rara, pero facilmente distinguible, de linfocitos CD45.2+CD4+ en la sangre periferica durante al menos dos semanas despues de la transferencia adoptiva (Figuras 5G, 5H). La estimulacion con TNFR25 de ratones receptores mediante 4C12 despues de la transferencia adoptiva no estimulo de novo la expresion de FoxP3 mediante linfocitos CD4+FoxP3- (Figura 5E) que permanecio con una frecuencia del 0,5% y de FoxP3-RFP independientemente de del tratamiento con 4Cl2 o anticuerpo de control. La frecuencia de los linfocitos FoxP3+RFP+ despues de la transferencia adoptiva de 2 X 106linfocitos fue del 0,04 % para linfocitos CD4 en la sangre periferica de ratones tratados con anticuerpo de control y aumento a un 0,11 % en ratones tratados con 4C12 (Figura 5F), un aumento de tres veces la frecuencia de linfocitos FoxP3+RFP+CD45.2+. Esto resultado es coherente con la medida de expansion de los linfocitos Treg FoxP3+ mediante el anticuerpo agonista TNFR25 en ratones no transferido (Figura 1B). Los datos indican que el tratamiento con 4C12 estimula selectivamente la proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+, que mantienen la expresion de FoxP3 tras la expansion (Figura 5F). Los datos muestran que la senalizacion de TNFR25 estimula principalmente la proliferacion aumentada de linfocitos CD4+FoxP3+CD25int dando como resultado un aumento sistemico de los linfocitos Treg. Estos estudios tambien demuestran que, aunque los linfocitos CD4+FoxP3- de transferencia adoptiva no se expanden en ningun momento despues del tratamiento con 4C12 (Figura 5G), la expansion de los linfocitos CD4+FoxP3+ de transferencia adoptiva sigue una cinetica similar a la expansion y contraccion de los linfocitos Treg endogenos en ratones FIR (comparar la Figura 5H con la Figura 1B). De manera importante, los linfocitos CD4+FoxP3+ de transferencia adoptiva mantienen la expresion de FoxP3 tanto durante como despues de la expansion, lo que sugiriere que la contraccion observada de la combinacion de linfocitos Treg expandidos es resultado de la muerte celular en lugar de la perdida de expansion de FoxP3 (Figuras 5F, 5H). Si la combinacion expandida de linfocitos CD45.2+CD4+FoxP3+ de transferencia adoptiva perdieran la expresion de FoxP3 en cualquier momento durante el experimento, la fraccion de linfocitos CD4+FoxP3- de los linfocitos CD45.2+CD4+ aumentana; sin embargo, esto no sucede. Se observo que una pequena proporcion de los linfocitos CD4+FoxP3- de transferencia adoptiva (<5 %) mostraban la expresion de FoxP3 (Figura 5E) y una pequena proporcion de linfocitos CD4+FoxP3+ transferidos (<5 %) perdio la expresion de FoxP3 (Figura 5F) durante el experimento. Dichas inestabilidades poco importantes en la expresion de FoxP3 probablemente explican estas observaciones.

Los linfocitos Treg expandidos mediante TNFR25 son muy supresores ex vivo: Para determinar si los linfocitos Treg expandidos mediante 4C12 retienen la actividad supresora, se purificaron linfocitos Treg a partir de ratones FIR durante 4 dfas tras el tratamiento tanto con 4C12 como con anticuerpo IgG de control de isotipo (Figura BA). Estos subconjuntos de linfocitos Treg se usaron a continuacion en un ensayo de proliferacion tradicional. Los linfocitos Treg purificados a partir de ratones tratados con 4C12 suprimieron la proliferacion de linfocitos CD4+CD25- en un grado mayor que los ratones tratados con el anticuerpo control de isotipo (Figuras 6A-6D). Se observo la supresion de la proliferacion de linfocitos Tconv mediante los linfocitos Treg expandidos con 4C12 en presencia y ausencia de celulas presentadoras de antfgenos (APC) en el ensayo de supresion in vitro (Figura 6A vs. 6B). Para determinar si la adicion de 4C12 durante el ensayo de supresion modulaba la actividad supresora de Treg, se llevaron a cabo ensayos identicos de los linfocitos como se describe (Figuras 6A, 6B) en presencia de 4C12 o un anticuerpo agonista de GITR conocido por liberar la supresion mediada por Treg a partir de Tconv (clon DTA-1) o el isotipo del anticuerpo de control (Figuras 6C, 6D). La presencia de anticuerpos agonistas de TNFR25 o GITR restauro parcialmente la proliferacion de linfocitos Tconv, produciendo ambos anticuerpos un efecto similar en ausencia de APC independientemente de si los linfocitos Treg se obtuvieron de 4C12 o de los ratones tratados con el isotipo de

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IgG del control (Figura 6c). De forma interesante, en presencia de APC, DTA-1 indujo la proliferacion de Tconv en presencia de linfocitos Treg procedentes de ratones tratados con el isotipo de IgG del control en una mayor extension que con los linfocitos Treg procedentes de ratones tratados con 4Cl2 (Figura 6D). La presencia de APC no altera significativamente la restauracion parcial de la proliferacion de linfocitos Tconv en presencia de 4C12. Los controles demostraron tambien que el efecto estimulador de 4C12 solo sobre los linfocitos Tconv fue mmimo, y significativamente menor que el efecto estimulador de GITR sobre los linfocitos Tconv (Figuras 6c, 6D). Para demostrar adicionalmente que la inhibicion de la actividad supresora de linfocitos Treg mediante 4C12 era espedfica para el efecto de TNFR25 expresado por los linfocitos Treg y no por los linfocitos Tconv, se llevaron a cabo ensayos de supresion utilizando linfocitos Tconv transgenicos que expresaban TNFR25 negativo dominante (Figura 6e). Estos datos demuestran que la inhibicion de la actividad supresora de los linfocitos Treg por la senalizacion de TNFR25 se produce en condiciones donde solo Treg expresa un TNFR25 funcional indicando que este efecto es debido a la senalizacion por TNFR25 sobre los linfocitos Treg y no sobre los linfocitos Tconv. De forma notable, los linfocitos Treg se expandieron in vivo con 4C12 y a continuacion se sometieron a los ensayos de supresion in vitro (Figuras 6A-6B) que son muy supresores en condiciones donde el anticuerpo 4C12 ya no esta presente. Es solo cuando el anticuerpo 4C12 se mantiene en el curso del ensayo de supresion que se observa la inhibicion parcial de la actividad supresora de los linfocitos Treg. Como 4C12 indujo la proliferacion de los linfocitos Treg CD25int, y en algunos estudios, el nivel de expresion de CD25 es predictivo de la actividad supresora de los linfocitos Treg, la actividad supresora de los linfocitos Treg CD25hi y CD25int clasificados a partir de ratones tras el tratamiento con 4C12 o con el anticuerpo control de isotipo cuando se compararon (Figura 9B y Figura 6F). La actividad supresora no depende del nivel de expresion de CD25 debido a que los linfocitos Treg CD25hi y CD25int fueron ambos muy supresores en el ensayo de proliferacion (Figura 6F). De forma interesante, los linfocitos Treg CD25int expandidos con 4C12 tuvieron ligeramente mas actividad supresora que los linfocitos Treg CD25int procedentes de los ratones tratados con IgG (Figuras 6F, bares 3-4). Este hallazgo indica que la actividad supresora aumentada de los linfocitos Treg expandidos con 4C12 en comparacion con los linfocitos Treg tratados con IgG (Figuras 6A-6D) es al menos parcialmente atribuible a la actividad de los linfocitos CD25int.

Discusion:

Se han reconocido miembros de la familia del receptor TNF como importantes coestimuladores de respuestas celulares inmunoefectoras y como inductores de la apoptosis. Aqrn, se identifico TNFR25 como una novedosa funcion no redundante como regulador de los linfocitos T reguladores. TNFR25 media la solida expansion de los linfocitos Treg in vivo en ratones inmunocompetentes mientras que al mismo tiempo restringe parcialmente su actividad supresora. No se han notificado otras senales fisiologicas, incluyendo las de otros miembros de la familia TNFR para ejercer actividad similar sobre los linfocitos Treg. Ademas, la observacion de que la senalizacion de TNFR25 induce la expansion de los linfocitos Treg con similar magnitud y cinetica al unico reactivo notificado diferente para expandir selectivamente los linfocitos Treg (complejo IL2(/anticuerpo dirigido contra IL-2 (Boyman, O., et al. 2006. Science 311:1924-1927), indica que los agonistas de TNFR25 pueden proporcionar una alternativa traducible a IL-2 basandose en los tratamientos para uso terapeutico en seres humanos.

Sin pretender quedar ligado por teona alguna, la pareja del ligando: receptor de TNFR25 y de TL1A esta implicada en la generacion de la inflamacion patogena en diversos modelos de enfermedad. Hasta el momento, no existe un informe individual que identifique un papel para TNFR25 o TL1A en el mantenimiento de la salud o la prevencion de la enfermedad que indique que dicho papel no se pueda descubrir. La disponibilidad del anticuerpo agonista de TNFR25, 4C12 permitio en el primer momento el estudio de TNFR25 en diversos subconjuntos de linfocitos T en un escenario donde la disponibilidad temporal de la senalizacion de TNFR25, las senales inflamatorias y el antfgeno exogeno se controlanan independientemente. La identificacion de un papel protector para los linfocitos Treg expandidos con TNFR25 en la inflamacion pulmonar alergica no contradice los estudios previos implicando TL1A en la exacerbacion de la inflamacion pulmonar alergica debido a que en los actuales estudios, la senalizacion de TNFR25 precede a la exposicion del antfgeno mientras que en estudios anteriores, la senalizacion de TNFR25 sigue al estimuio del antfgeno. Mas bien, la expresion diferencial de TNFR25 por los linfocitos Treg (expresion elevada) en comparacion con los linfocitos Tconv (expresion baja) indica que la secuencia de exposicion de los linfocitos T al antfgeno, las senales coestimuladoras o TL1A pueden gobernar si una respuesta inflamatoria concreta es suprimida por los linfocitos Treg o inducirse por los linfocitos Tconv. En los estudios actuales, el tratamiento con los agonistas de TNFR25 antes del estimulo antigenico de las vfas aereas indujo la acumulacion preferente de linfocitos Treg, pero no de Tconv, en las vfas aereas y se asocio con una reduccion en la produccion de IL-4, Il-5, e IL-13, asf como una eosinofila y produccion de moco reducidas en el espacio bronquioalveolar.

Fueron necesarias las senalizaciones de MHC II e IL-2 pero no la coestimulacion de CD80/86 para la proliferacion de los linfocitos Treg inducidos por TNFR25. Aunque se requieren las senalizaciones de MHCII e IL-2 para la proliferacion de Treg inducida por TNFR25, la provision de senalizaciones de TCR e IL-2 no son suficientes para inducir la proliferacion de Treg in vitro, indicando que puede requerirse una senalizacion adicional que esta en investigacion adicional. Aunque el requerimiento de MHCII implica fuertemente la proliferacion de linfocitos Treg inducidos por TNFR25 en TCR expresados mediante linfocitos Treg, estos datos son indirectos. Como evidencia adicional de un papel de TCR en este proceso, se ha observado que la estimulacion de TNFR25 no inducina la proliferacion de linfocitos Treg en presencia de los inhibidores de NFAT, ciclosporina A o FK506; proporcionando evidencias de que los acontecimientos de senalizacion son posteriores a la proliferacion de linfocitos Treg debido a

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la influencia de TCR. Estos datos indican que Treg y Tconv pueden llegar a ser permisivos para la senalizacion de TNFr25 posterior a la ligadura de TCR, y que la selectividad de los linfocitos Treg de los anticuerpos agonistas de TNFR25 puede ser al menos parcialmente debida a la disponibilidad del autoantigeno en condiciones no inflamatorias. Si la estimulacion de TCR es persistente o no con el autoantigeno contribuye tambien a la expresion aumentada de TNFR25 en los linfocitos Treg en comparacion con Tconv, o no se sabe tambien si la diferencia se mantiene mediante las rutas de senalizacion no relacionadas.

Dado que se requieren al menos dos rutas receptoras adicionales (receptor IL-2 y TCR) para la proliferacion de linfocitos Treg estimulados por TNFR25, la confluencia de las rutas de senalizacion posteriormente a estos receptores conduce a que la proliferacion de los linfocitos Treg pueda ser compleja. Se proporciono una pista de como pueden interactuar estas rutas mediante la observacion de que ex vivo, los linfocitos estimulados con TNFR25 eran hipersensibles a la senalizacion de IL-2. Se determino posteriormente que la inhibicion de la ruta de P13- quinasa/Akt proporciono un enlace posteriormente del receptor de IL-2 es importante para la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25. Estos datos indican que la inhibicion mediada por PTEN de la ruta P13- quinasa/Akt restringe la proliferacion de linfocitos Treg posteriormente a la senalizacion de IL-2. La identificacion de MHCII, IL-2R, NFAT y Akt proporciona un punto de partida tangible para elucidar los acontecimientos de senalizacion posteriormente a la estimulacion de TNFR25 que culmina en la proliferacion de linfocitos Treg, pero se van a llevar a cabo estudios adicionales para elucidar los mecanismos moleculares de las interferencias entre estas diversas rutas.

La expansion de los linfocitos Treg inducida por TNFR25 se produce con una cinetica y magnitud similares a la expansion de linfocitos Treg inducida por IAC, pero da como resultado un aumento en la proporcion de linfocitos cD25int mas bien que linfocitos CD25hi. La importancia de esta observacion es desconocida; sin embargo, el aumento de la expresion de CD25 por los linfocitos Treg tras la exposicion a IAC sugiere un bucle de retroalimentacion positiva impulsado por la disponibilidad aumentada de IL-2. En el caso de que TNFR25 induzca la expansion de los linfocitos Treg, la concentracion de IL-2 no esta manipulada, de tal manera que la disminucion resultante en la expresion de CD25 mediante la proliferacion de los linfocitos Treg puede dar como resultado una competicion aumentada para la IL-2 endogena procedente de una poblacion de linfocitos Treg en expansion. La interrogacion de los diferentes marcadores superficiales expresados por los linfocitos Treg revelo pocas diferencias entre los linfocitos Treg expandidos con TNFR25 e IAC, aunque algunos, incluyendo GITR, fluctuaron entre las poblaciones de CD25int y CD25hi. El unico marcador analizado que aumento consistentemente tras el tratamiento con 4C12 era CD103, que contribuye a la retencion de los linfocitos Treg en los tejidos.

Los datos complementan datos recientes que notifican papeles para la estimulacion de TNFR25 en la induccion de respuestas inflamatorias con la inhibicion de la actividad supresora de los linfocitos Treg en una teona unificada del papel de las interacciones de TL1A:TNFR25 en la induccion y la resolucion de la inflamacion del tejido. El mecanismo preciso por el cual la estimulacion de TNFR25 induce la proliferacion de los linfocitos Treg e inhibe su actividad supresora sigue estando poco claro, debido en parte a que no se entienden bien las rutas de senalizacion activadas por las senales de TNFR25, y son objeto de investigacion adicional. Ademas, se desconoce si la expansion inducida por TNFR25 de los linfocitos Treg n vivo es dependiente del reconocimiento del autoantfgeno y, de forma similar a iAc, las condiciones necesarias para la expansion de los linfocitos Treg inducida por TNFR25 in vitro permanece poco clara y esta en investigacion adicional. Sin pretender quedar ligado a teona alguna, se ha teorizado que la identificacion de un requerimiento in vivo para MHC II permite que la proliferacion de linfocitos Treg inducida por TNFR25 indique la implicacion de TCR es un requisito general para que la coestimulacion de linfocitos T inducida por TNFR25 en ausencia de antfgeno exogeno se mantenga mediante la expresion preferente de TNFR25 por los linfocitos Treg y la disponibilidad del autoantfgeno presentada por MHC II. La sensibilidad aumentada de los linfocitos Treg a la estimulacion de TNFR25 a partir de ratones inmunizados frente a no inmunizados es tambien intrigante, y puede indicar funciones distintas para TNFR25 en respuestas inmunitarias primarias frente a secundarias.

Independientemente del mecanismo, debido a la importancia de la senalizacion de TNFR25 en la patogenesis de numerosos crecimientos de enfermedades inflamatorias (asma, IBD, EAE, AR) es importante comprender el papel espacio-temporal que la senalizacion de TNFR25 ejerce sobre diversos subconjuntos de linfocitos CD4+ T. Es muy probable que, de forma similar a OX40, el contexto temporal de la senalizacion de TNFR25 dirija diferencialmente la inmunidad inflamatoria y reguladora. La capacidad unica de senalizacion de TNFR25 se expande rapida y que inhibe transitoriamente los linfocitos T reguladores naturales CD4+FoxP3+ puede tener importantes consecuencias para el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria, la infeccion cronica, el trasplante y el cancer.

Ejemplo 2: La expansion terapeutica de linfocitos Treg in vivo mediante TNFRSF25 retrasa el rechazo agudo de los corazones alogenicos en un modelo de trasplante de corazon heterotopico.

Para estudiar la induccion de la tolerancia por linfocitos Treg naturales expandidos mediante 4C12, se selecciono un modelo de trasplante de corazon que se describe bien para estudios de tolerancia. Se trasplantaron corazones de ratones CBA/J (H2d) en el abdomen de ratones C57BL/6 (H2b) en el dfa 0. En el dfa -4, un grupo de ratones se trato con el anticuerpo agonista de TNFRSF25, el clon 4C12, mediante inyeccion intraperitoneal (20 pg/raton), y los otros se trataron con IgG de control de isotipo de hamster. En el momento del trasplante, se confirmo la expansion de los

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linfocitos Treg en la sangre en el grupo tratado con 4C12. Se controlo la supervivencia del aloinjerto palpando el corazon manualmente y se califico el pulso en una escala de 0 a 4 (0 = sin pulso; 1 = muy leve; 2 = leve; 3 = moderado; 4 = fuerte). Se define el rechazo como el cese del latido ca^aco palpable. En el momento del rechazo (= cuando el latido cardfaco se detuvo), se retiro el injerto, se fijo la formalina y se sometio a examen patologico. La perdida de funcion del injerto a las 48 h del trasplante se considera un fallo tecnico (<5 %) y se omitio del analisis adicional.

Ejemplo 3: La expansion terapeutica de linfocitos Treg in vivo mediante agonistas de TNFRSF25 protege de colitis inducida por dextrano-sulfato de sodio, un modelo de raton de la enfermedad de Crohn.

Se proporcionaron ratones C57BL/6 o TL1A inactivados geneticamente con sulfato de sodio dextrano al 3 % (DSS) disuelto en agua corriente ad libitum durante 7 dfas. Se controlo el peso diariamente comenzando 4 dfas antes de la provision de DSS (dfa -4 del experimento). En el dfa -4, un grupo de ratones se trato con el anticuerpo agonista de TNFRSF25, el clon 4C12, mediante inyeccion intraperitoneal (20 pg/raton), y los otros se trataron con IgG de control de isotipo de hamster. Se midio la mortalidad cuando los animales perdieron ± 20 % del peso corporal de partida (Figura 10A). En algunos experimentos, los animales se sacrificaron en el dfa 5 del experimento y se preparo el ARN total utilizando el kit RNeasy miniprep (Qiagen) procedente de tejido colonico, lavado con PBS congelado de forma ultrarrapida. Se transcribio de forma inversa el ARN posteriormente (Quantitect RT, Qiagen) y se amplifico el ADNc mediante la PCR en tiempo real utilizando las sondas Taqman (Applied Biosystems) para los transcritos indicados (Figura 10B). Se muestran los datos como el cambio de veces en la expresion de ratones TL1A inactivados geneticamente en comparacion con ratones C57BL/6 del control. Se controlo el porcentaje de perdida de peso corporal y se represento graficamente durante el curso del estudio en cada grupo experimental (Figura 10C). En los experimentos donde se sacrificaron animales en el dfa 5 del experimento para el aislamiento del ARN se aislaron ganglios linfaticos mesentericos para el analisis, mediante citometna de flujo de la proporcion de linfocitos CD4+ que expresaban el factor de transcripcion FoxP3, indicativo de la reserva de linfocitos T reguladores (Figura 10D). Finalmente, se llevo a cabo la transcripcion inversa utilizando ARN aislado procedente de los grupos de tratamiento indicados como se describe para la Figura 10B y se sometio a la RT-PCR de los transcritos indicados. Las barras de errores indican el promedio ± S.E.M. para ± 3 ratones por experimento y un mmimo de 2 experimentos por panel.

Estos datos demuestran que el pretratamiento con un anticuerpo agonista de TNFRSF25 conduce a la expansion de linfocitos reguladores FoxP3+ dentro del intestino, evita la perdida de peso y la inflamacion letal del colon, y evita la expresion de citoquinas inflamatorias entre las que se incluyen IL-1 p e IL-6 del tejido colonico. En su conjunto, estos datos proporcionan evidencia de que la estimulacion de TNFRSF25 puede evitar la inflamacion letal del intestino en un modelo de raton habitualmente utilizado para imitar las caractensticas inflamatorias de la enfermedad de Crohn en seres humanos.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un agonista de TNFR25 para su uso en un metodo para retrasar el rechazo agudo de un organo o tejido

   trasplantado en un sujeto, en el que el agonista de TNFR25 es un anticuerpo monoclonal que se une

   5 espedficamente a TNFR25, o en el que el agonista de TNFR25 es una fusion del ligando 1A analogo al factor de

   necrosis tisular -Ig (fusion TL1A-Ig).
2. 2. El agonista de TNFR25 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo monoclonal es del isotipo IgG.

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3. 3. El agonista de TNFR25 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el agonista de TNFR25 induce la proliferacion de linfocitos CD4+FoxP3+ en el sujeto.
4. 4. Uso de un agonista de TNFR25 en la fabricacion de un medicamento para retrasar el rechazo agudo de un organo 15 o tejido trasplantado en un sujeto, en el que el agonista de TNFR25 es un anticuerpo monoclonal que se une

   espedficamente a TNFR25, o en el que el agonista de TNFR25 es una fusion TL1A-Ig.
5. 5. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el anticuerpo monoclonal es del isotipo IgG.

   20 6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el agonista de TNFR25 induce la proliferacion de linfocitos

   CD4+FoxP3+ en el sujeto.