ES2586579T3

ES2586579T3 - Nuevas inmunoadhesinas de CTLA4-IG

Info

Publication number: ES2586579T3
Application number: ES11727563.6T
Authority: ES
Inventors: Gregory A. Lazar; Matthew J. Bernett
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2011-02-22
Publication date: 2016-10-17
Anticipated expiration: 2031-02-22
Also published as: US20160264643A1; US11352412B2; US9371397B2; US8329867B2; EP2536745B1; US20220348634A1; AU2016202816A1; CY1124024T1; ES2826894T3; PL2536745T3; DK2536745T3; AU2011217770A1; CN106432473A; US10155800B2; SI2536745T1; CN106432473B; US20210230250A1; EP3053932B1; WO2011103584A3; SMT201600289B

Abstract

Una inmunoadhesina que comprende un primer dominio que comprende una variante CTLA4 en comparación con SEQ ID NO: 6 y un segundo dominio que comprende una región Fc de IgG, en donde dicha variante comprende al menos una modificación de aminoácidos en un CTL4 natural, en la que dicha modificación es una sustitución de la posición de CTLA4 T51, en la que dicha variante ofrece una mejor unión a B7-1, B7-2, o a ambos B7-1 y B7-2.

Description

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la SEQ ID NO: 6. Las posiciones de la región constante del anticuerpo y de la región Fc descritas en este documento están enumeradas de acuerdo con el índice de UE o el esquema de numeración de UE (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, por la presente incorporada por referencia en su totalidad). El índice de UE o el índice de UE como en Kabat o el esquema de numeración de UE se refiere a la numeración del anticuerpo de UE (Edelman et al, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85, por la presente incorporada por referencia en su totalidad).

El objetivo de las variantes en el presente documento es proporcionar una o más propiedades optimizadas, por lo general mediante la alteración de la afinidad para un ligando diana o receptor de Fc. La afinidad puede potenciarse o reducirse en relación con una proteína de matriz. Por "mayor afinidad" o "mejor afinidad" o "afinidad mejorada" o "mejorada afinidad" de un polipéptido matriz, tal como se utiliza en este documento, se entiende que una variante se une a un ligando o receptor con una constante de equilibrio de asociación (KA o Ka) significativamente mayor o menor constante de equilibrio de disociación (KD o Kd) que el polipéptido matriz hecho en las mismas condiciones, por ejemplo, cuando las cantidades del polipéptido variante y original en el ensayo de unión son esencialmente las mismas.

Por ejemplo, una variante de CTLA4 con la mejora de la afinidad de unión de B7-2 puede mostrar de aproximadamente 1,2, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 veces o más, la mejora en la afinidad de unión de B7-2 comparado con el polipéptido CTLA4 matriz, donde se determina la afinidad de unión de B7-2, por ejemplo, por los métodos de unión descritos en este documento, incluyendo pero no limitados a Biacore™, por un experto en la técnica.

En consecuencia, por "afinidad reducida" en comparación con un polipéptido matriz como se usa en el presente documento se entiende que una variante se une a un ligando o receptor con KA significativamente más bajo o KD más alto que el polipéptido matriz. También puede definirse una mayor o menor afinidad en relación con un nivel absoluto de afinidad.

Las inmunoadhesinas comprenden en el presente documento preferiblemente una variante de CTLA4. Las variantes de CTLA4 pueden mejorar la unión a B7-1, B7-2, o ambos B7-1 y B7-2. Las variantes de CTLA4 pueden mejorar la unión selectivamente a B7-2 en relación con B7-1. Es decir, las variantes pueden mejorar la afinidad de CTLA4 para B7-2, aunque o bien pueden reducir la afinidad por B7-1, no afectar a la afinidad de B7-1, o mejorar la afinidad por B7-1 menos que la mejora de la afinidad a B7-2. Alternativamente, las variantes pueden mejorar la unión selectivamente a B7-1 en relación con B7-2.

Las inmunoadhesinas comprenden en el presente documento preferiblemente una variante de Fc. Las variantes de Fc descritas en el presente documento pueden optimizarse para mejorar o reducir la unión a receptores de Fc o ligandos de Fc. Por "receptor de Fc" o "ligando de Fc", como se usa en el presente documento, se entiende una molécula, preferiblemente un polipéptido, de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo de Fc-ligando. Los ligandos Fc incluyen, pero no se limitan a, FcγRs, FcγRs, FcγRs, FcRn, C1q, C3, lectina de unión a la manosa, receptor de manosa, la proteína A estafilocócica, proteína G estreptocócica, y FcγR viral. Los ligandos Fc también incluyen homólogos de los receptores de Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc que son homólogos a las FcγRs. Los ligandos Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc.

En realizaciones preferidas, las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento incorporan variantes de Fc que mejoran la unión de FcRn. Tales variantes pueden mejorar las propiedades farmacocinéticas in vivo de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig. Las variantes preferidas que aumentan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero no se limitan, a las sustituciones en las posiciones 259, 308, 428 y 434, incluyendo pero no limitado a, por ejemplo, 259I, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M (USSN12/341.769, presentada el 22 de diciembre de 2008, titulada "Fc Variants with Altered Binding to FcRn", totalmente incorporada por referencia). Otras variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen, pero no están limitados, a: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al, 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176: 346-356), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 307Q, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al., Journal of Biological Chemistry, 2001, 276 (9): 6591-6604), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al., Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281: 23514-23524). Otras modificaciones para modular la unión de FcRn se describen en Yeung et al, 2010, J. Immunol., 182: 7663-7671.

Otras modificaciones Fc para uso en la presente invención incluyen variantes que reducen o eliminan la unión a FcγRs y/o proteínas del complemento, reduciendo o eliminando así las funciones efectoras mediadas por Fc, tales como ADCC, ADCP y CDC. Dichas variantes también se denominan en este documento "variantes knockout" o "variantes KO". Las variantes que reducen la unión a FcγRs y el complemento son útiles para reducir las interacciones no deseadas mediadas por la región Fc y para el ajuste de la selectividad de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig. Las variantes knockout preferidas se describen en el documento US 2008-0242845 A1, publicado el 2 de octubre de 2008 y titulado "Fc Variants with Optimized Properties". Las modificaciones preferidas incluyen, pero no están limitadas, a sustituciones, inserciones y deleciones en las posiciones 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 y 328,

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en el que la numeración es según el índice de UE. Las sustituciones preferidas incluyen, pero no se limitan a 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L y 328R, en el que la numeración es según el índice de UE. Una variante preferida comprende 236R/328R. Las variantes pueden ser utilizadas en el contexto de cualquier isotipo IgG o la región Fc del isotipo de IgG, incluyendo, pero no limitados, a IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humanas. Las regiones Fc de IgG preferidas para reducir FcγR y complementar la unión y la reducción de las funciones efectoras mediadas por Fc son regiones Fc de IgG2 e IgG4. También pueden ser útiles isotipos híbridos, por ejemplo, isotipos IgG1/IgG2 híbridos como se describe en USSN11/256.060. Otras modificaciones que reducen las interacciones de FcγR y el complemento incluyen, pero no se limitan, a sustituciones 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 330S, 331S, 220S, 226S, 229S, 238S, 233P y 234V, así como la eliminación de la glicosilación en la posición 297 por medio de mutaciones o medios enzimáticos o mediante la producción en organismos tales como bacterias que no glicosilan las proteínas. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl, 2009, Current Opinion in Biotechnology

20: 685-691.

Las modificaciones Fc que mejoran la unión a FcγRs y/o al complemento también pueden encontrar el uso en las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig de este documento. Tales variantes de Fc pueden mejorar las funciones efectoras mediadas por Fc tales como ADCC, ADCP y/o CDC. Modificaciones preferidas para mejorar y complementar la unión de FcγR se describen en el documento US 2006-0024298 A1, publicado el 2 de febrero de 2006, y el documento US 2.006-0235208 A1, publicado el 19 de octubre de 2006. Las modificaciones preferidas comprenden una sustitución en una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en 236, 239, 268, 324 y 332, en el que la numeración es de acuerdo con el índice de UE. Las sustituciones preferidas incluyen, pero no se limitan, a 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D y 332E. Las variantes preferidas incluyen, pero no se limitan, a 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T y 267E/268F/324T. Otras modificaciones para mejorar las interacciones de FcγR y el complemento incluyen, pero no se limitan, a sustituciones 298A, 333A, 334A, 326A, 2471, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305I y 396L. Estas y otras modificaciones se revisan en Strohl, 2009, ibid.

En una realización, las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento pueden incorporar variantes de Fc que aumentan la afinidad por un receptor inhibidor FcγRIIb. Tales variantes pueden proporcionar las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig en el presente documento con actividades inmunomoduladoras relacionadas con células FcγRIIb+, incluyendo, por ejemplo, células B y monocitos. En una realización, las variantes de Fc proporcionan una mayor afinidad selectiva respecto a FcγRIlb relativa a uno o más receptores activadores. Las modificaciones para alterar la unión a FcγRIIb se describen en el documento USSN 12/156183, presentado el 30 de mayo de 2008, titulado "Methods and Compositions for Inhibiting CD32b Expressing Cells", incorporado expresamente por referencia. En particular, las variantes de Fc que mejoran la unión a FcγRIIb pueden incluir una o más modificaciones en una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el índice de UE. Sustituciones preferibles para mejorar la afinidad de FcγRIIb incluyen, pero no se limitan, a 234D, 234E, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, y 332E. Más preferiblemente, las sustituciones incluyen, pero no se limitan, a 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W y 328Y. Variantes Fc preferidas para mejorar la unión a FcγRIIb incluyen, pero no se limitan, a 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E y 267E/328F.

Las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento pueden incorporar modificaciones Fc en el contexto de cualquier isotipo IgG o región Fc del isotipo de IgG, incluyendo, pero no limitado, a IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4 humana. EL isotipo IgG puede seleccionarse tal como para alterar la función o funciones efectoras mediadas por FcγR y/o complemento. También pueden ser útiles isotipos de IgG híbridos. Por ejemplo, el documento USSN 11/256060 describe una serie de regiones constantes de IgG1/IgG2 híbridas que pueden encontrar uso en la invención en particular. En algunas realizaciones de la invención, las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig pueden comprender medios para modificaciones isotípicas, es decir, las modificaciones en una IgG matriz para el tipo de aminoácidos en una IgG alternativa. Por ejemplo, una variante híbrida de IgG1/IgG3 puede ser construida por un medio de sustitución sustituyendo las posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 con los aminoácidos de IgG3 en las posiciones donde los dos isotipos difieren. Así, un anticuerpo de IgG variante híbrido puede ser construido de manera que comprenda uno o más medios de sustitución, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras realizaciones de la invención, una variante híbrida de IgG1/IgG2 puede ser construida por un medio de sustitución para la sustitución de las posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG1 en las posiciones donde los dos isotipos difieren. Así, un anticuerpo de IgG variante híbrido puede ser construido de manera que comprenda uno o más medios sustitutivos, por ejemplo, uno o más de las siguientes subestaciones de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (en referencia a una inserción de una glicina en la posición 236), y 327A.

Como se apreciará por los expertos en la técnica, la descripción de las variantes individuales y de combinación en la región Fc puede ser independiente y opcionalmente combinado con cualquiera de las variantes de CTLA4 descritas en este documento. Es decir, como se describe en el presente documento, las variantes de CTLA4 se seleccionan individualmente y, opcionalmente, y/o son combinadas dentro del conjunto de las variantes descritas, en cualquier combinación. Del mismo modo, las listas anteriores de las variantes del dominio Fc adecuadas pueden ser individualmente y, opcionalmente, combinadas de cualquier manera, no sólo dentro de la región Fc, sino con las variantes de CTLA4. Es decir, una variante de CTLA4 puede ser seleccionada para que comprenda un número de

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Las modificaciones pueden incluir aquellas que mejoran la expresión y/o la purificación de los rendimientos a partir de células huéspedes o huéspedes comúnmente utilizados para la producción de sustancias biológicas. Estos incluyen, pero no se limitan a diversas líneas de células de mamíferos (por ejemplo, CHO), líneas de células de levadura, líneas celulares de las bacterias y plantas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro entre cadenas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro intra-cadena.

Las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoácidos no naturales incorporados usando, incluyendo pero no limitado, a los métodos descritos en Liu y Schultz, 2010, Annu Rev Biochem 79: 413-444, incorporada en este documento expresamente por referencia. En algunas realizaciones, estas modificaciones permiten la manipulación de varias propiedades, discutidas anteriormente, inmunológicas, funcionales, biofísicas o de fabricación. En realizaciones adicionales, estas modificaciones permiten otras modificaciones químicas para otros fines.

Otras modificaciones se contemplan en el presente documento. Por ejemplo, la inmunoadhesina CTLA4-Ig puede estar unida a una de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Otras modificaciones de aminoácidos adicionales se pueden incluir para permitir la modificación post-traduccional química específica o no específica de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan, a la PEGilación y la glicosilación. Sustituciones específicas que pueden ser utilizadas que permiten la PEGilación incluyen, pero no se limitan, a la introducción de nuevos residuos de cisteína o aminoácidos no naturales, tal que se pueden utilizar químicas de acoplamiento eficaces y específicas para conectar un PEG u otro resto polimérico. La introducción de sitios de glicosilación específicos se puede conseguir mediante la introducción de nuevas secuencias N-X-T/S en las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento.

Las modificaciones para reducir la inmunogenicidad pueden incluir modificaciones que reducen la unión de péptidos procesados derivados de la secuencia matriz a las proteínas del MHC. Por ejemplo, se pueden diseñar modificaciones de aminoácidos de tal manera que no haya o haya un número mínimo de epítopos inmunes que se predice que se unan, con alta afinidad, a cualquier alelo MHC prevalente. Varios métodos de identificación de los epítopos de unión de MHC en las secuencias de proteínas son conocidos en la técnica y pueden ser usados para marcar epítopos en un anticuerpo descrito en este documento.

Las modificaciones covalentes se incluyen dentro del alcance de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento, y son generalmente, pero no siempre, hechas después de la traducción. Por ejemplo, se pueden introducir varios tipos de modificaciones covalentes en la molécula haciendo reaccionar los residuos de aminoácidos específicos con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas

: o con los residuos N-o C-terminal. En algunas realizaciones, la modificación covalente de las inmunoglobulinas descritas en este documento comprende la adición de uno o más marcadores. La expresión "grupo marcador" significa cualquier marcador detectable. En algunas realizaciones, el grupo marcador se acopla a la inmunoadhesina CTLA4-Ig a través de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. Varios métodos para las proteínas marcadoras son conocidos en la técnica y pueden ser utilizados en la generación de inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento.

En una realización, las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento son "proteínas de fusión", a veces denominadas en esta memoria "conjugados". La pareja de fusión o pareja de conjugado puede ser proteínica

: o no proteínica; esta última generalmente se genera usando grupos funcionales en la inmunoadhesina CTLA4-Ig y en la pareja del conjugado. Las parejas del conjugado y de fusión pueden ser cualquier molécula, incluyendo compuestos químicos de moléculas pequeñas y polipéptidos. Por ejemplo, una variedad de conjugados y métodos se describen en Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 584-588, que se incorpora en su totalidad por referencia. Posibles parejas conjugadas incluyen, pero no se limitan, a citoquinas, agentes citotóxicos, toxinas, radioisótopos, agentes quimioterapéuticos, agentes anti-angiogénicos, a inhibidores de tirosina quinasa, y otros agentes terapéuticamente activos. En algunas realizaciones, las parejas conjugadas pueden considerarse más como cargas útiles, es decir que el objetivo de un conjugado está dirigido a la entrega de la pareja conjugada a una célula diana, por ejemplo una célula cancerosa o célula inmune, por la inmunoadhesina CTLA4-Ig. Así, por ejemplo, la conjugación de una toxina a una inmunoadhesina CTLA4-Ig se dirige a la entrega de dicha toxina a células que expresan el antígeno diana. Como se apreciará por un experto en la técnica, en realidad, los conceptos y las definiciones de fusión y conjugado se solapan. La designación de una fusión o conjugado no está destinada a limitar a cualquier realización particular descrita en el presente documento. Más bien, estos términos se utilizan libremente para transmitir el concepto amplio de que cualquier inmunoadhesina CTLA4-Ig según la invención puede estar relacionada genéticamente, químicamente, o de otra manera, con uno o más polipéptidos o moléculas que proporcionen alguna propiedad deseable.

Producción de inmunoadhesinas CTLA4-Ig

También se describen en este documento métodos para producir y probar experimentalmente inmunoadhesinas de CTLA4-Ig. Los métodos descritos no están destinados a limitar las realizaciones para cualquier aplicación o teoría de

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Los vectores de expresión comprenden típicamente una proteína unida operativamente con secuencias de control o reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier pareja de fusión, y/o elementos adicionales. Por "unido operativamente" en el presente documento se quiere decir que el ácido nucleico se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácidos nucleicos reguladores de la transcripción y de la traducción unidos operativamente al ácido nucleico que codifica la inmunoadhesina CTLA4-Ig, y son típicamente apropiados para la célula huésped utilizada que expresa la proteína. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden incluir secuencias promotoras, sitios de unión ribosómicos, secuencias de inicio y de parada de la traducción, y secuencias transcripcionales de inicio y de parada, y secuencias potenciadoras o activadoras. Como también se conoce en la técnica, los vectores de expresión contienen típicamente un gen de selección o marcador para permitir la selección de células huésped transformadas que contienen el vector de expresión. Los genes de selección son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped usada.

Las inmunoadhesinas CTLA4-Ig pueden ser unidas operativamente a una pareja de fusión para permitir la orientación de la proteína expresada, purificación, detección, expresión y similares. Las parejas de fusión pueden estar unidos a la secuencia de inmunoadhesina CTLA4-Ig a través de una secuencia de unión. La secuencia de enlazador comprenderá generalmente un pequeño número de aminoácidos, típicamente de menos de diez, aunque también pueden usarse enlazadores más largos. Típicamente, las secuencias de enlazador son seleccionadas para ser flexibles y resistentes a la degradación. Como se apreciará por los expertos en la técnica, cualquiera de una amplia variedad de secuencias puede utilizarse como enlazadores. Por ejemplo, una secuencia de enlazador común comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS [SEQ ID NO: 40]. Una pareja de fusión puede ser una secuencia de reconocimiento o señal que reconoce la inmunoadhesina CTLA4-Ig y cualesquiera parejas de fusión asociadas a una localización celular deseada o al medio extracelular. Como se sabe en la técnica, ciertas secuencias de señalización se pueden orientar a una proteína para ser secretada ya sea en el medio de crecimiento, o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula. Una pareja de fusión también puede ser una secuencia que codifica un péptido o una proteína que permite la purificación y/o la detección. Tales parejas de fusión incluyen, pero no se limitan a los marcadores de polihistidina (His-marcadores) (por ejemplo, H6 y H10 u otras marcadores para su uso con sistemas de cromatografía de afinidad metálicos inmovilizados (IMAC) (por ejemplo, columnas de afinidad de Ni+2)), fusiones GST, fusiones MBP, Strep-marcador, la secuencia diana de biotinilación de BSP de la enzima bacteriana BirA, y marcadores de epítopo, que son el objetivo de los anticuerpos (por ejemplo, marcadores c-myc, flag-marcadores, y similares). Como se apreciará por los expertos en la técnica, tales marcadores pueden ser útiles para la purificación, para la detección, o ambas cosas. Por ejemplo, una inmunoadhesina CTLA4-Ig se puede purificarse utilizando un His-marcador inmovilizando a una columna de afinidad de Ni+2, y a continuación, después de la purificación de la misma His-marcador puede ser usado para inmovilizar el anticuerpo a una placa recubierta con Ni+2 para llevar a cabo un ensayo de unión ELISA u otro (tal como se describe a continuación). Una pareja de fusión puede permitir el uso de un método de selección para seleccionar las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig (véase abajo). Las parejas de fusión que permiten una variedad de métodos de selección son bien conocidas en la técnica.

En una realización, las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig se purifican o aíslan después de la expresión. Las proteínas pueden aislarse o purificarse en una variedad de formas conocidas por los expertos en la técnica. La purificación puede ser particularmente útil en la invención para la separación de especies de la cadena pesada heterodiméricas a partir de especies de cadena pesada homodiméricas, tal como se describe en el presente documento. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas cromatográficas, incluyendo intercambio iónico, interacción hidrofóbica, afinidad, de tamaño o de filtración en gel, y de fase inversa, llevado a cabo a presión atmosférica o a presión elevada usando sistemas tales como FPLC y HPLC. Los métodos de purificación incluyen también técnicas electroforéticas, de enfoque isoeléctrico, inmunológicas, de precipitación, de diálisis y de cromatoenfoque. Las técnicas de ultrafiltración y diafiltración, conjuntamente con la concentración de proteínas, también son útiles. Como es bien conocido en la técnica, una variedad de proteínas naturales se unen Fc y anticuerpos, y estas proteínas pueden encontrar uso para la purificación de inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento. Por ejemplo, las proteínas bacterianas A y G se unen a la región Fc. Del mismo modo, la proteína bacteriana L se une a la región Fab de algunos anticuerpos, como, por supuesto, lo hace el antígeno diana del anticuerpo. La purificación menudo puede ser activada por una pareja de fusión particular. Por ejemplo, las inmunoadhesinas CTLA4-Ig pueden purificarse utilizando resina de glutatión si se emplea una fusión GST, cromatografía de afinidad de Ni+2 si se emplea un His-marcador, o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se utiliza un flag-marcador. Para una guía general en las técnicas de purificación adecuadas, véase, por ejemplo incorporadas por referencia en su totalidad Protein Purification: Principles and Practice, 3ª Ed, Scopes, Springer-Verlag, Nueva York, 1994, incorporado por referencia en su totalidad. El grado de purificación necesario variará dependiendo de la selección o el uso de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig. En algunos casos no es necesaria la purificación. Por ejemplo, en una realización, si se secretan las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig, la detección puede tener lugar directamente desde los medios. Como es bien conocido en la técnica, algunos de los métodos de selección no implican la purificación de proteínas.

Experimentación in vitro

Pueden ser probadas experimentalmente inmunoadhesinas CTLA4-Ig usando una variedad de métodos in vitro, incluyendo, pero no limitado a, los que utilizan ensayos de unión, ensayos basados en células y las tecnologías de selección. Pueden utilizarse tecnologías de automatización y cribado de alto rendimiento en los procedimientos de

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típicamente añadidas exógenamente tal que las células se exponen a las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento. Estos ensayos tienen típicamente, pero no siempre, base en la biología de la capacidad de la inmunoadhesina CTLA4-Ig de unirse al antígeno diana y median algún acontecimiento bioquímico, por ejemplo, funciones efectoras, tal como la lisis celular, la fagocitosis, inhibición de la unión del ligando/receptor, la inhibición del crecimiento y/o proliferación, la inhibición de la liberación de calcio y/o de señalización, la apoptosis y similares. Tales ensayos a menudo incluyen el seguimiento de la respuesta de las células frente a la inmunoadhesina CTLA4-Ig, por ejemplo, la supervivencia celular, la muerte celular, la fagocitosis celular, la lisis celular, el cambio en la morfología celular, o la activación transcripcional, tal como la expresión celular de un gen natural o gen reportero. Por ejemplo, tales ensayos pueden medir la capacidad de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig que provocan la muerte celular, por ejemplo ADCC, ADCP y CDC. Los ensayos que miden la muerte celular que está mediada por la interacción conjunta de antígenos son particularmente relevantes para la invención. Para algunos ensayos de células o componentes adicionales, es decir, además de las células diana, puede ser necesario añadir, por ejemplo, el complemento en suero o células efectoras, tales como monocitos de sangre periférica (PBMCs), células NK, macrófagos, células T y similares. Dichas células adicionales pueden ser de cualquier organismo, por ejemplo, seres humanos, ratones, rata, conejo y mono. Los anticuerpos reticulados o monómeros pueden provocar la apoptosis de ciertas líneas celulares, que expresan el antígeno diana del anticuerpo, o pueden mediar el ataque en células diana por células inmunes que se han añadido al ensayo. Los métodos para controlar la muerte celular o la viabilidad son conocidos en la técnica e incluyen el uso de reactivos colorantes, fluoróforos, inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de caspasa o anexina-fluoroconjugados pueden permitir la apoptosis que se desea medir, y la absorción o liberación de sustratos radioactivos (por ejemplo, ensayos de liberación de cromo-51)

o la reducción metabólica de colorantes fluorescentes, tales como el azul alamar pueden permitir el crecimiento celular, la proliferación o la activación a monitorizar. En una realización, se utiliza el ensayo de citotoxicidad basado en DELFIA EuTDA (Perkin Elmer, Mass.). Alternativamente, las células diana muertas o dañadas pueden ser controladas mediante la medición de la liberación de una o más proteínas intracelulares naturales, por ejemplo de lactato deshidrogenasa. La activación transcripcional también puede servir como un método para ensayar la función en los ensayos basados en células. En este caso, la respuesta puede monitorizarse mediante el ensayo de genes naturales o proteínas que pueden ser sobre-reguladas o reguladas; por ejemplo, se puede medir la liberación de ciertas interleuquinas, o, alternativamente, puede la lectura puede ser a través de una luciferasa o del constructo indicador GFP. Los ensayos basados en células también pueden incluir la medida de cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de una inmunoadhesina CTLA4-Ig. Los tipos de células para tales ensayos pueden ser procariotas o eucariotas, y se puede emplear una variedad de líneas celulares que son conocidos en la técnica. Alternativamente, las selecciones basadas en células se llevan a cabo utilizando células que han sido transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig.

Experimentación in vivo

Las propiedades biológicas de las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento pueden ser caracterizadas en células, tejidos y en experimentos de organismos enteros.

Como se muestra en el presente documento, en general, la prueba de la unión y las afinidades asociados de los dominios de la variante de CTLA4 de las inmunoadhesinas de la invención se realiza mediante los ensayos de unión que se indican en los ejemplos. Como se describió anteriormente, la afinidad puede ser descrita como mejor cuando la KA de un polipéptido variante con respecto al polipéptido matriz es significativamente más alta o cuando la KD de un polipéptido variante es significativamente menor con relación a un polipéptido matriz. Cuando se expresa en términos de una relación, por ejemplo, KA (polipéptido variante)/KA (polipéptido matriz) o KD (polipéptido matriz)/KD (variante de polipéptido), un aumento significativo en la afinidad es testigo, por ejemplo, cuando una y/o ambas de estas relaciones es de aproximadamente 1,2, 1,5, 2,0, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 250, 500, 1.000 o más.

Como se sabe en la técnica, los medicamentos se prueban a menudo en animales, incluyendo pero no limitados a ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, a fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento frente a una enfermedad o un modelo de la enfermedad, o para medir la farmacocinética de un fármaco, toxicidad y otras propiedades. Dichos animales pueden ser referidos como modelos de enfermedad. Con respecto a las inmunoadhesinas de CTLA4-Ig descritas en este documento, un desafío particular surge cuando el uso de modelos animales evalúan el potencial para la eficacia en seres humanos de polipéptidos candidatos; esto es debido, al menos en parte, al hecho de que los dominios Fc de la inmunoadhesinas de CTLA4-Ig que tienen un efecto específico sobre la afinidad para un receptor de Fc humano no pueden tener un efecto de afinidad similar con el receptor de animales ortólogos. Estos problemas pueden agravarse aún más por las inevitables ambigüedades asociadas con la asignación correcta de los verdaderos ortólogos (Mechetina et al, 2002, Immunogenetics 54: 463468, que se incorpora por referencia en su totalidad), y el hecho de que algunos ortólogos simplemente no existen en el animal.

Las terapias se prueban a menudo en ratones, incluyendo pero no limitadas, a ratones desnudos, ratones Ragdeficientes, ratones SCID, ratones de xenoinjerto y ratones transgénicos (incluyendo knockins y knockouts). Las inmunoadhesinas CTLA4-Ig terapéuticas en el presente documento pueden ser probadas en cepas de ratón NZB, NOD, BXSB, MRL/lpr, K/BxN y transgénicas (incluyendo knockins y knockouts). Tales ratones pueden desarrollar varias condiciones autoinmunes que asemejan patologías de enfermedades específicas de órganos humanos,

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están disponibles de los complejos entre CTLA4 humana y B7-1 humana (Stamper et al, 2001, Nature 410: 608-611) y B7-2 (Schwartz et al, 2001, Nature 410: 604-608). La biblioteca de variantes diseñadas se proporciona de la siguiente manera: A29K, A29N, A29E, A29W, A29F, A29Y, A29H, A29Q, A29R, T30D, T30V, T30A, T3ON, T30E, T30H, T30R, E31i, E31M, E31T, E31V, E31D, R33F, R33T, R33M, R33W, R331, R33Y, R33L, R33E, R33Q, T35E, T35V, T35M, T35D, T35F, T35Y, A49T, A49F, A49Y, A49W, A49D, A49E, T51V, T51L, T51N, T51H, T51Q, T51E, T51S, T51R, T51D, M53E, M53Q, M53Y, M53W, M53F, M53H, T59V, T59L, T59N, T59Y, T59H, T59Q, T591, L61D, L61E, L61I, L61F, L61G, L61H, L61K, L61M, L61N, L61P, L61Q, L61R, L61S, L61T, L61V, L61W, L61Y, D63E, S64K, S64R, S64Y, K93D, K93E, K93F, K93H, K93Q, K93R, K93T, K93V, K93W, K93Y, K93N, K93S, E95D, E95Q, E95Y, E95H, E95L, M97F, M97D, M97N, M97I, M97V, Y98F, Y98W, Y102F, Y102W, Y103F, Y103W, Y103H, Y103D, Y103E, Y103N, Y103Q, L104D, L104E, L104V, L104M, L104Y, L104W, L104F, L104H, G105D, G105E, I106E y I106Y.

Los genes que codifican la proteína CTLA4 se sintetizaron comercialmente (Blue Heron Biotechnologies, Bothell, WA), y se subclonaron en el vector de expresión pTT5 de mamífero (Durocher Y, et al, 2002, Nucleic Acids Res 30 [2]: E9), que contiene la región constante humana IgG. Las modificaciones de aminoácidos se construyeron en la parte superior del constructo de abatacept CTLA4-Ig(ab) usando mutagénesis dirigida al sitio que utiliza los métodos de la mutagénesis dirigida al sitio de QuikChange® (Stratagene, La Jolla Calif.). Belatacept CTLA4 (A29Y/L104E)-Ig (ab) también se construyó como control. Todos los ADN se secuenciaron para confirmar la fidelidad de las secuencias. Los plásmidos que contienen los genes CTLA4-Ig se transfectaron en células 293E (Durocher Y, et al, 2002, Nucleic Acids Res 30 [2]: E9; Instituto de Investigación de Biotecnología del Consejo de Investigación Nacional de Canadá) usando lipofectamina™ (Invitrogen, Carlsbad, California) a escala pequeña (3 ml) en formato de placa de 6 pocillos y se cultivaron en medios FreeStyle™ 293 (Invitrogen, Carlsbad, California). Después de 5 días de crecimiento, las proteínas variantes fueron seleccionadas para la unión de la diana directamente a partir de los sobrenadantes. Después de 5 días de crecimiento, las proteínas se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo por la proteína A de afinidad utilizando la resina MabSelect™ (GE Healthcare).

Se seleccionaron proteínas de fusión de la variante CTLA4-Ig Fc según la unión a B7-1 y B7-2 usando resonancia de plasmón de superficie. Las mediciones de la unión se realizaron utilizando un instrumento Biacore™ 3000 (Biacore). Los chips sensores se derivatizaron con mAb anti-His-marcador seguido de la captura de B7-1-Ig o B7-2-Ig (ambos de R & D Systems) a 100 nM y 200 nM, respectivamente durante 1,5 minutos. Se inyectaron proteínas de la variante CTLA4-Ig y el control en tampón HBS-EP (Biacore) durante 1 min seguido de una disociación de 2 min. Los datos fueron procesados poniendo a cero el tiempo y la respuesta antes de la inyección del receptor restando las señales no específicas apropiadas (respuesta del canal de referencia e inyección del tampón de desarrollo). Los sensogramas de disociación se ajustaron usando el software BlAevaluation para obtener las constantes de velocidad de disociación (desunión o kd o Koff). Los resultados de tres experimentos de unión separados se proporcionan en la Tabla 1, junto con la mejora del plegado o la reducción de la velocidad de disociación para la unión a ambos antígenos.

Tabla 1. Constantes de disociación (koff) para la unión de las variantes CTLA4-Ig a B7-1 y B7-2

Variante: B7-1 (Koff) B7-2 (Koff) Nivel de cambio de B7-1 Nivel de cambio de B7-2

Experimento 1

Abatacept (WT): 9,32E-04 5,53E-03 1,00 1,00

Belatacept: 2,92E-04 1,30E-03 3,19 4,25

A29K: 6,35E-04 1,77E-03 1,47 3,12

T30D: 1,03E-03 5,79E-03 0,90 0,96

E31i: 2,26E-03 4,27E-03 0,41 1,30

R33F: No obs. No obs. 0,00 0,00

T35E: No obs. No obs. 0,00 0,00

A49T: 4,18E-03 1,60E-02 0,22 0,35

T51V: 9,52E-04 6,40E-03 0,98 0,86

M53E: 1,00E-03 6,20E-03 0,93 0,89

T59V: 1,04E-03 5,77E-03 0,90 0,96

L61D: 1,02E-03 2,48E-03 0,91 2,23

D63E: 1,05E-03 6,51E-03 0,89 0,85

S64K: 7,51E-04 6,94E-03 1,24 0,80

K93D: No obs. No obs. 0,00 0,00

E95D: No obs. No obs. 0,00 0,00

M97F: 3,33E-03 No obs. 0,28 0,00

Y98F: 1,11E-03 No obs. 0,84 0,00

Y102F: 3,67E-03 No obs. 0,25 0,00

Y103F: 1,47E-03 4,35E-03 0,63 1,27

L104D: 3,16E-04 4,62E-03 2,95 1,20

G105D: No obs. No obs. 0,00 0,00

Experimento 2

Abatacept (WT): 1,01E-03 5,19E-03 1,00 1,00

Belatacept: 3,46E-04 1,32E-03 3,19 4,25

A29K: 8,87E-04 2,07E-03 1,14 2,51

A29N: 1,71E-03 5,16E-03 0,59 1,01

A29E: 9,53E-04 6,04E-03 1,06 0,86

A29W: 8,37E-04 2,38E-03 1,21 2,18

A29F: 1,16E-03 0,0107 0,87 0,49

A29Y: 7,56E-04 3,11E-03 1,34 1,67

A29H: 6,63E-04 1,92E-03 1,52 2,70

T30V: 1,26E-03 5,80E-03 0,80 0,89

T30A: 1,60E-03 5,39E-03 0,63 0,96

T30N: 1,10E-03 4,10E-03 0,92 1,27

T30E: 1,01e-03 3,83E-03 1,00 1,36

T30H: 1,18E-03 4,17E-03 0,86 1,24

T30R: 1,34E-03 4,12E-03 0,75 1,26

E31M: 7,65E-04 No obs. 1,32 0,00

E31T: 9,65E-04 No obs. 1,05 0,00

E31V: 1,49E-03 No obs. 0,68 0,00

E31D: 5,61E-03 0,0243 0,18 0,21

R33T: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33M: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33W: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33I: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33Y: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33L: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33E: No obs. No obs. 0,00 0,00

R33Q: 9,34E-03 No obs. 0,11 0,00

T35V: No obs. No obs. 0,00 0,00

T35M: No obs. No obs. 0,00 0,00

T35D: No obs. No obs. 0,00 0,00

T35F: No obs. No obs. 0,00 0,00

T35Y: No obs. No obs. 0,00 0,00

A49F: 2,49E-03 0,031 0,41 0,17

A49Y: 1,98E-03 0,0379 0,51 0,14

A49W: 3,86E-03 6,38E-03 0,26 0,81

A49D: 3,10E-03 0,0337 0,33 0,15

A49E: 4,06E-03 No obs. 0,25 No obs.

T51L: 1,47E-03 No obs. 0,69 No obs.

T51N: 1,85E-03 2,42E-03 0,55 2,14

T51H: 2,81E-03 0,0475 0,36 0,11

M53Q: 1,49E-03 4,71E-03 0,68 1,10

M53Y: 7,01E-04 4,66E-03 1,44 1,11

T59L: 9,54E-04 5,14E-03 1,06 1,01

T59N: 1,11E-03 5,18E-03 0,91 1,00

T59Y: 1,05E-03 5,29E-03 0,96 0,98

T59H: 1,15E-03 5,51E-03 0,88 0,94

T59Q: 1,20E-03 5,18E-03 0,84 1,00

T59I: 1,14E-03 5,50E-03 0,89 0,94

L61E: 1,03E-03 3,48E-03 0,98 1,49

L61I: 1,18E-03 6,30E-03 0,86 0,82

L61A: 8,66E-04 3,79E-03 1,17 1,37

L61F: 1,04E-03 5,86E-03 0,97 0,89

Experimento 3

Abatacept (WT): 1,16E-03 5,45E-03 1,00 1,00

Belatacept: 3,98E-04 1,41E-03 2,91 3,87

L61G: 9,66E-04 2,11E-03 1,20 2,58

L61H: 8,67E-04 4,39E-03 1,34 1,24

L61K: 1,29E-03 2,63E-03 0,90 2,07

L61M: 1,07E-03 5,01E-03 1,08 1,09

L61N: 1,33E-03 2,68E-03 0,87 2,03

L61P: 8,55E-04 2,79E-03 1,36 1,95

L61Q: 1,87E-04 6,98E-03 6,20 0,78

L61R: 1,06E-03 3,10E-03 1,09 1,76

L61S: 9,81E-04 3,18E-03 1,18 1,71

L61T: 1,29E-03 3,20E-03 0,90 1,70

L61V: 1,33E-03 6,09E-03 0,87 0,89

L61W: 9,37E-04 3,74E-03 1,24 1,46

L61Y: 8,76E-04 4,79E-03 1,32 1,14

S64R: 1,08E-03 7,22E-03 1,07 0,75

S64Y: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93E: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93F: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93H: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93Q: 4,72E-04 3,68E-03 2,46 1,48

K93R: 3,06E-04 6,06E-03 3,79 0,90

K93T: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93V: 1,67E-04 4,77E-03 6,95 1,14

K93W: No obs. No obs. 0,00 0,00

K93Y: No obs. No obs. 0,00 0,00

E95Q: No obs. No obs. 0,00 0,00

E95Y: No obs. No obs. 0,00 0,00

E95H: No obs. No obs. 0,00 0,00

E95L: No obs. No obs. 0,00 0,00

M97D: No obs. No obs. 0,00 0,00

M97N: 5,32E-03 No obs. 0,22 0,00

M97I: 5,60E-03 No obs. 0,21 0,00

M97V: 0,0527 No obs. 0,02 0,00

Y98W: 3,25E-03 No obs. 0,36 0,00

Y102W: No obs. No obs. 0,00 0,00

Y103W: 2,21E-03 0,0499 0,52 0,11

Y103H: 2,51E-03 4,19E-03 0,46 1,30

Y103D: 5,88E-04 2,46E-03 1,97 2,22

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L61D: 3,26E+06 2,04E-03 6,26E-10 1,10

L61E: 2,63E+06 1,65E-03 6,25E-10 1,11

L61G: 2,76E+06 1,52E-03 5,49E-10 1,26

L61K: 2,24E+06 1,85E-03 8,27E-10 0,84

L61N: 2,60E+06 2,03E-03 7,82E-10 0,88

K93Q: 2,57E+06 8,75E-04 3,40e-10 2,03

K93R: 1,16E+06 1,47E-03 1,26E-09 0,55

K93V: 1,15E+06 7,54E-04 6,55E-10 1,05

Y103D: 2,01E+06 0,0105 5,24E-09 0,13

Y103E: 2,45E+06 0,0143 5,85E-09 0,12

Y103N: 2,14e+06 0,0188 8,77E-09 0,08

Y103Q: 1,83E+06 8,17E-03 4,48E-09 0,15

L104D: 5,57E+05 2,11E-03 3,79E-09 0,18

L104E: 2,47E+06 8,90E-04 3,60E-10 1,92

L104V: 2,54E+06 1,54E-03 6,05E-10 1,14

kon = asociación; Koff = disociación; KD = constante de disociación en el equilibrio; KD nivel de cambio = KD (abatacept)/KD(variante)

Tabla 3. Afinidades de unión de B7-2 y constantes cinéticas de las variantes de CTLA4-Ig

Variante: kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M) KD del nivel de cambio

Abatacept: 3,64E+06 1,66E-02 4,55E-09 1,00

Belatacept: 3,35E+06 2,18E-03 6,52E-10 6,98

A29K: 1,55E+06 3,96E-03 2,55E-09 1,78

A29W: 3,28E+06 4,74E-03 1,44E-09 3,16

A29Y: 4,45E+06 6,29E-03 1,41E-09 3,23

A29H: 3,35E+06 3,42E-03 1,02E-09 4,46

T51N: 2,86E+06 5,07E-03 1,77E-09 2,57

M53Y: 3,90E+06 1,17E-02 3,01E-09 1,51

L61D: 4,51E+06 1,55E-02 3,44E-09 1,32

L61E: 4,18E+06 1,30E-02 3,11E-09 1,46

L61G: 3,54E+06 2,05E-02 5,79E-09 0,79

L61K: 2,63E+06 2,76E-02 1,05E-08 0,43

L61N: 3,45E+06 2,01E-02 5,81E-09 0,78

K93Q: 3,80E+06 8,43E-03 2,22E-09 2,05

K93R: 1,79E+06 1,71E-02 9,55E-09 0,48

K93V: 1,68E+06 1,22E-02 7,30E-09 0,62

Y103D: 1,11E+06 9,28E-03 8,38E-09 0,54

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T51R 7,08E+06 0,0181 2,56E-09 0,02 T51D 9,86E+06 0,0359 3,64E-09 0,02 M53W 1,28E+07 2,21E-03 1,72E-10 0,34 M53F 1,12E+07 1,08E-03 9,57E-11 0,61 M53H 1,51E+07 1,48E-03 9,80E-11 0,60 K93N No obs. K93S 1,16E+04 3,42E-04 2,96E-08 0,00 A29Q 4,33E+06 2,12E-03 4,91E-10 0,12 A29R 1,04E+06 2,22E-03 2,13e-09 0,03

kon = asociación; Koff = disociación; KD = constante de disociación en el equilibrio; KD nivel de cambio = KD (abatacept)/KD (variante); No obs. = ninguna unión detectada. Tabla 5. Afinidades de unión de B7-2 y las constantes cinéticas de las variantes de CTLA4-Ig

Variante: kon (1/Ms) Koff (1/s) KD (M) KD nivel de cambio abatacept

Abatacept: 3,10E+07 0,0135 4,37E-10 1,00

Belatacept (A29Y/L104E): 3,21E+07 2,18E-03 6,79E-11 6,44

A29H/T51N/M53Y/L61E/K93Q: 3,59E+07 1,20E-03 3,35E-11 13,04

A29H/T51N/M53Y/K93Q: 3,55E+07 1,31E-03 3,70E-11 11,81

A29H/T51N/M53Y/L61E: 5,11E+07 2,50E-03 4,89E-11 8,94

A29H/T51N/L61E/K93Q: 4,68E+07 1,07E-03 2,28E-11 19,17

A29H/M53Y/L61E/K93Q: 4,86E+07 1,43E-03 2,94E-11 14,86

T51N/M53Y/L61E/K93Q: 4,75E+07 2,39E-03 5,05E-11 8,65

A29H/M53Y/K93Q: 3,86E+07 1,34E-03 3,48E-11 12,56

A29H/L61E/K93Q: 4,86E+07 1,53E-03 3,14E-11 13,92

A29H/T51N/L61E: 3,77E+07 2,32E-03 6,14E-11 7,12

A29H/M53Y/L61E: 3,40e+07 2,47E-03 7,27E-11 6,01

T51N/M53Y/L61E: 4,31E+07 4,64E-03 1,08E-10 4,05

M53Y/L61E/K93Q: 5,38E+07 5,11E-03 9,50E-11 4,60

T51N/L61E/K93Q: 5,68E+07 2,29E-03 4,04E-11 10,82

A29H/T51N: 3,33ey+07 2,56E-03 7,69E-11 5,68

A29H/M53Y: 3,27E+07 2,41E-03 7,36E-11 5,94

A29H/K93Q: 3,06E+07 1,73E-03 5,65E-11 7,73

T51N/M53Y: 3,37E+07 5,54E-03 1,64E-10 2,66

T51N/K93Q: 3,50E+07 2,20E-03 6,29E-11 6,95

T51Q: 1,29E+07 0,15 1,16E-08 0,04

T51E: No obs. No obs. 0,00

T51S: 1,41E+07 4,59E-03 3,26E-10 1,34

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Claims

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