ES2586410T3 - Procedimientos y composiciones de detección de un mutante de EGFR resistente a fármacos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para la detección de una resistencia adquirida a los efectos terapéuticos de gefitinib o erlotinib en un sujeto que padece, o se sospecha que tiene, cáncer de pulmón, en el que el procedimiento comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra que se ha obtenido del sujeto, y b) sondar la muestra con un medio para detectar de forma selectiva una secuencia de nucleótidos que comprende una T mutante en la posición que corresponde a la base 2369 del ADNc del EGFR (SEQ ID No: 1); c) identificar que la base en dicha posición es T; en el que encontrar que la forma mutante está presente indica que el cáncer está desarrollando resistencia adquirida a los efectos terapéuticos de gefitinib o erlotinib, en el que el paciente ha sido tratado con gefitinib o erlotinib antes de que la muestra se haya obtenido del paciente, y el paciente era sensible a gefitinib o erlotinib cuando se administró por primera vez.

Description

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Tabla 1. ADNc DEL EGFR MUTANTE DE 2369 C→T

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ribonucleótidos, puede incluir restos de origen natural tales como las bases de origen natural y anillos de ribosa o desoxirribosa, o pueden estar compuestos de restos sintéticos o modificados tales como los descritos a continuación. Un polinucleótido empleado en el presente documento puede ser monocatenario o puede ser una estructura bicatenaria con emparejamiento de bases, o incluso una estructura tricatenaria con emparejamiento de bases.

Los ácidos nucleicos y polinucleótidos pueden ser de 20 o más nucleótidos de longitud, o de 30 o más nucleótidos de longitud, o de 50 o más nucleótidos de longitud, o de 100 o más, o de 1000 o más, o de decenas de miles o más,

o de cientos de miles o más, de longitud. Como se utiliza en el presente documento, “oligonucleótidos” y términos similares basados en este se refieren a polímeros cortos compuestos de nucleótidos de origen natural, así como a polímeros compuestos de nucleótidos sintéticos o modificados, como se describe en el párrafo inmediatamente anterior. Los oligonucleótidos pueden ser de 10 o más nucleótidos de longitud, o de 20 o más nucleótidos de longitud, o de 30 o más nucleótidos de longitud, o de 40 o más, hasta aproximadamente 50, nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden sintetizarse de forma química y pueden utilizarse como cebadores de PCR, o sondas, entre otros usos.

Se comprende que, debido al solapamiento en los intervalos de tamaño proporcionados en el párrafo precedente, los términos “polinucleótido” y “oligonucleótido” se pueden utilizar como sinónimos en el presente documento para referirse a un cebador o una sonda de la invención.

Como se usa en el presente documento, “secuencia de nucleótidos”, “secuencia de oligonucleótido” o “secuencia de polinucleótido”, y expresiones similares, se refieren indistintamente a la secuencia de bases que tiene un oligonucleótido o polinucleótido, así como a la estructura del oligonucleótido o polinucleótido que posee la secuencia. Una secuencia de nucleótidos o una secuencia de polinucleótido se refiere adicionalmente a cualquier polinucleótido u oligonucleótido natural o sintético en el que la secuencia de bases se define mediante descripción o mención de una secuencia particular de letras que designan bases como se emplean de forma convencional en este campo.

Los trabajadores con habilidad en campos tales como la bioquímica, la biología molecular, la genómica y campos similares relacionados con el campo de la invención entienden de forma convencional que un “nucleósido” comprende un monosacárido unido por enlace glucosídico a una base purínica o pirimidínica; y un “nucleótido” comprende un nucleósido con por lo menos un grupo fosfato agregado, normalmente en una posición 3’ o una 5’ (en el caso de las pentosas) del sacárido, pero puede estar en otras posiciones del sacárido. Los restos de nucleótidos ocupan posiciones secuenciales en un oligonucleótido o un polinucleótido. Una modificación o derivado de un nucleótido puede aparecer en cualquier posición secuencial en un oligonucleótido o un polinucleótido. Las modificaciones o derivados pueden aparecer en el grupo fosfato, el monosacárido o la base.

Como ejemplos no limitantes, las siguientes descripciones proporcionan determinados nucleótidos modificados o derivatizados, todos los cuales están dentro del ámbito de los polinucleótidos descritos en el presente documento. El monosacárido puede modificarse para ser, por ejemplo, una pentosa o una hexosa que sea una ribosa o desoxirribosa. El monosacárido también puede modificarse sustituyendo grupos hidroxilo con grupos hidro o amino, alquilando o esterificando grupos hidroxilo adicionales, etc. Los sustituyentes en la posición 2’, tales como el grupo 2’-O-metilo, 2’-O-etilo, 2’-O-propilo, 2’-O-alilo, 2’-O-aminoalquilo o 2’-desoxi-2’-fluoro proporcionan a un oligonucleótido propiedades de hibridación potenciadas.

Las bases en los oligonucleótidos y polinucleótidos pueden ser bases “no modificadas” o “naturales” que incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Además, pueden ser bases con modificaciones o sustituciones. Los ejemplos no limitantes de bases modificadas incluyen otras bases sintéticas y naturales tales como hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5carboximetil-aminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina, 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 5-propil-uracilo, 5-propinilcitosina y otros derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azo-uracilo, 6-azo-citosina, 6-azo-timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil-, 8-hidroxil-y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo en particular 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citocinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7metiladenina, 2-fluoro-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Las bases modificadas adicionales incluyen pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (IH-pirimido[5,4-b][I,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (Ipirimido[5,4-b][I,4] benzotiazin-2(3H)-ona), abrazaderas de guanina tales como una fenoxazina citidina sustituida (por ejemplo, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-b][I54]benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido[4,5b]indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido[3’,2’:4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las bases modificadas también

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col., (1985) “Formation of internucleotidic bonds via phosphonate intermediates”, Chem. Scripta 25, 280-282; y Froehler, B. C, y col., (1986a) “Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates”, Nucleic Acid Res., 14, 5399-5407, entre otros) y la síntesis sobre un soporte (Beaucage, y col. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1862) así como técnicas de fosforamidato (Caruthers, M. H., y col., “Methods in Enzymology”, Vol. 154, pág. 287-314 (1988), Patentes de Estados Unidos 5.153.319, 5.132.418, 4.500.707, 4.458.066, 4.973.679, 4.668.777 y 4.415.732, y otros descritos en “Synthesis and Applications of DNA and RNA”, S. A. Narang, editor, Academic Press, Nueva York, 1987, y las referencias contenidas en ellos, y técnicas distintas a la técnica de la fosforamidita. La síntesis en fase sólida ayuda a aislar el oligonucleótido de impurezas y de los excesos de reactivos. Una vez escindido del soporte sólido, el oligonucleótido se puede aislar adicionalmente mediante técnicas conocidas.

Cualquier muestra de ensayo de ácido nucleico, en forma purificada o sin purificar, puede utilizarse como ácido nucleico (o ácidos nucleicos) de partida, a condición de que contenga, o se sospeche que contiene, la secuencia de ácido nucleico específica que contiene el locus polimórfico. Por lo tanto, el procedimiento puede amplificar, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo ARN mensajero, en el que el ADN o ARN puede ser monocatenario o bicatenario. En caso de que se vaya a utilizar ARN como molde, se utilizarían enzimas y/o condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde a ADNc. Además, puede utilizarse un híbrido ADN-ARN que contenga una cadena de cada uno. También se puede emplear una mezcla de ácidos nucleicos o los ácidos nucleicos se pueden producir en una reacción de amplificación previa en el presente documento, de este modo pueden utilizarse los mismos cebadores o cebadores distintos. La secuencia de ácido nucleico específica a amplificar, es decir, el locus polimórfico, puede ser una fracción de una molécula más grande o puede estar presente de forma inicial como una molécula discreta, de forma que la secuencia específica constituye el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia a amplificar esté presente de forma inicial en una forma pura. Puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, tal como contenida en ADN humano completo.

El ADN utilizado en el presente documento se puede extraer a partir de una muestra corporal, material tisular y similar por una diversidad de técnicas tales como las descritas en Maniatis, y col. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y., p 280-281, 1982). Si la muestra extraída está impura, puede tratarse antes de la amplificación con una cantidad de un reactivo eficaz para abrir las células, o las membranas celulares animales de la muestra, y para exponer y/o separar la cadena (o cadenas) del ácido nucleico (o ácidos nucleicos). Esta etapa de lisis y desnaturalización del ácido nucleico para exponer y separar las cadenas permitirá que se produzca la amplificación mucho más fácilmente.

El agente para la polimerización del ADN puede ser cualquier compuesto o sistema que funcione para llevar a cabo la síntesis de los productos de extensión del cebador, incluyendo enzimas. Las enzimas adecuadas para este fin incluyen, por ejemplo, muteínas de polimerasa, transcriptasa inversa, otras enzimas que incluyen enzimas termoestables (es decir, las enzimas que realizan la extensión del cebador después de someterse a temperaturas suficientemente elevadas para provocar la desnaturalización), tales como la polimerasa Taq. La enzima adecuada facilitará la combinación de los nucleótidos de la manera apropiada para formar los productos de extensión del cebador que son complementarios a cada cadena de ácido nucleico del locus polimórfico. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3’ de cada cebador y procederá en la dirección 5’ a lo largo de la cadena molde, hasta que se interrumpa la síntesis, produciendo moléculas de distintas longitudes.

Los productos de amplificación pueden detectarse mediante su análisis en transferencias de Southern sin utilizar sondas radiactivas. En tal procedimiento, por ejemplo, se amplifica una pequeña muestra de ADN que contiene un nivel muy bajo de la secuencia de ácido nucleico del locus polimórfico y se analiza mediante una técnica de transferencia de Southern o, de forma similar, utilizando análisis por transferencia puntual. El uso de marcadores o sondas no radiactivas se facilita por el alto nivel de la señal amplificada. Como alternativa, las sondas utilizadas para detectar los productos amplificados se pueden marcar directa o indirectamente de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Los expertos en la materia conocerán otros marcadores adecuados para unir a la sonda, o serán capaces de determinarlos, utilizando experimentación de rutina. En la realización preferente, los productos de amplificación se pueden determinar separando la mezcla en un gel de agarosa que contiene bromuro de etidio que hace que el ADN sea fluorescente.

Las secuencias amplificadas mediante los procedimientos de la invención adicionalmente se pueden evaluar, detectar, clonar, secuenciar y similares, ya sea en solución o después de la unión a un soporte sólido, mediante cualquier procedimiento habitualmente aplicado a la detección de una secuencia de ADN específica tal como PCR, restricción de oligómero (Sa[upsilon][alpha], y col., Bio/Technology, 3: 1008-1012, (1985)), análisis por sonda de oligonucleótido específico de alelo (ASO) (Conner, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 278, (1983)), ensayos de ligamiento de oligonucleótido (OLA) (Landgren, y col., Science, 241: 1007, (1988)), y similares. Se han revisado las técnicas moleculares para el análisis del ADN (Landgren, y col., Science, 242: 229-237, (1988)).

Preferentemente, el procedimiento de amplificación es mediante PCR, como se describe en el presente documento y como se usa comúnmente por los expertos en la materia. Se han descrito procedimientos alternativos de amplificación y pueden emplearse también siempre que el locus de EGFR amplificado por PCR utilizando los cebadores de la divulgación se amplifique de forma similar por los medios alternativos. Tales sistemas de amplificación alternativos incluyen, pero sin limitación, la replicación de secuencia autosostenida, que comienza con

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una secuencia de ARN corta de interés y un promotor de T7. La enzima transcriptasa inversa copia el ARN en forma de ADNc seguido de la degradación del ARN transcrito. Otra técnica de amplificación de ácidos nucleicos es la amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) que utiliza la transcripción inversa y la ARN polimerasa T7 e incorpora dos cebadores para dirigir su esquema de ciclado. NASBA puede comenzar con ADN o ARN y finalizar con cualquiera, y amplifica hasta 108 copias al cabo de 60 a 90 minutos. Como alternativa, el ácido nucleico se puede amplificar mediante transcripción activada por ligamiento (LAT). LAT trabaja a partir de un molde monocatenario con un único cebador que es parcialmente monocatenario y parcialmente bicatenario. La amplificación se inicia ligando un ADNc al oligonucleótido promotor y al cabo de unas pocas horas, la amplificación es de 108 a 109 veces. El sistema de replicasa QB se puede utilizar uniendo una secuencia de ARN denominada MDV-I a un ARN complementario para una secuencia de ADN de interés. Después de mezclarlo con la mezcla, el ARN híbrido encuentra su complemento entre los ANRm de la muestra de ensayo y se une, activando la replicasa para copiar la secuencia acoplada de interés. Otra técnica de amplificación de ácidos nucleicos, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), trabaja utilizando dos mitades de una secuencia de interés marcadas de forma distinta que están enlazadas covalentemente mediante la ligasa en presencia de la secuencia contigua en una muestra, formando una nueva diana. La técnica de amplificación de ácidos nucleicos de reacción en cadena de reparación (RCR) utiliza dos pares de sondas de oligonucleótido complementarias y específicas para la diana, polimerasa termoestable y ligasa, y nucleótidos de ADN que amplifican de forma geométrica las secuencias deseadas. Un hueco de 2 bases separa los pares de sondas de oligonucleótido, y la RCR rellena y empalma el hueco, imitando la reparación de ADN normal. La amplificación de ácidos nucleicos mediante activación por desplazamiento de cadena (SDA) utiliza un cebador corto que contiene un sitio de reconocimiento para Hinc II con una protuberancia corta en el extremo 5’ que se une al ADN diana. Una ADN polimerasa rellena en la parte del cebador opuesta a la protuberancia con análogos de adenina que contienen azufre. Se añade Hinc II, pero solo corta la cadena de ADN no modificada. Una ADN polimerasa que carece de actividad 5’ exonucleasa entra en el sitio del corte y comienza a polimerizar, desplazando la cadena de cebador inicial cadena abajo y fabricando una nueva que sirve como más cebador. La SDA produce una amplificación de más de 107 veces en 2 horas a 37 grados C. A diferencia de la PCR y la LCR, la SDA no necesita el ciclado de temperatura instrumentado. Otro sistema de amplificación útil en el procedimiento de la invención es el sistema de replicasa QB. Aunque la PCR es el procedimiento preferente de amplificación de la invención, también pueden utilizarse estos otros procedimientos para amplificar el locus como se describe en el procedimiento de la invención.

Se pueden utilizar una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica para la detección de variaciones de secuencia predeterminadas mediante hibridación específica de alelo. Preferentemente, el gen de prueba se sondea con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO); y cada ASO contiene la secuencia de una mutación conocida. El análisis por ASO detecta variaciones de secuencia específicas en un fragmento polinucleótido diana mediante el análisis de la capacidad de una sonda de oligonucleótido específica para hibridar con el fragmento de polinucleótido diana. Preferentemente, el oligonucleótido contiene la secuencia mutante (o su complemento). La presencia de una variación de secuencia en la secuencia diana se indica mediante hibridación entre la sonda de oligonucleótido y el fragmento diana en condiciones en las que una sonda de oligonucleótido que contiene una secuencia normal no hibrida con el fragmento diana. Una falta de hibridación entre la sonda de oligonucleótido de la variante de secuencia (por ejemplo, mutante) y el fragmento de polinucleótido diana indica la ausencia de la variación de secuencia específica (por ejemplo, mutación) en el fragmento diana. En una realización preferente, las muestras de prueba se sondean en un formato puntual convencional. Cada región dentro del gen de prueba que contiene la secuencia correspondiente al ASO se aplica de forma individual a una superficie sólida, por ejemplo, como un punto individual sobre una membrana. Cada región individual puede producirse, por ejemplo, como un producto de amplificación de PCR distinto utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la realización experimental expuesta en Mullis, K. B., 1987, Patente de Estados Unidos n.º 4.683.202).

Los formatos basados en membrana que pueden utilizarse como alternativas al formato de transferencia puntual para realizar los análisis de ASO incluyen, pero sin limitación, transferencia puntual inversa, (ensayo de amplificación múltiplex), y ensayo de diagnóstico específico de alelo múltiplex (MASDA).

En un formato de transferencia puntual inversa, las sodas de oligonucleótido o polinucleótido que tienen la secuencia conocida se inmovilizan sobre la superficie sólida y posteriormente se hibridan con la muestra de polinucleótido de prueba marcada. En esta situación, los cebadores se pueden marcar o los NTP pueden marcarse antes de la amplificación para preparar una muestra de polinucleótido de prueba marcada. Como alternativa, la muestra de polinucleótidos de prueba se puede marcar después del aislamiento y/o síntesis. En un formato múltiplex, las muestras individuales contienen múltiples secuencias diana dentro del gen de prueba, en lugar de solo una única secuencia diana. Por ejemplo, en el mismo punto de muestra se aplican múltiples productos de PCR conteniendo cada uno por lo menos una de las secuencias diana de ASO. Se pueden producir múltiples productos de PCR de forma simultánea en una única reacción de amplificación utilizando los procedimientos de Caskey y col., Patente de Estados Unidos n.º 5.582.989. Por lo tanto, se puede sondar la misma transferencia mediante cada ASO, cuya secuencia correspondiente está representada en los puntos de muestra.

Un formato MASDA expande el nivel de complejidad del formato múltiplex utilizando múltiples ASO para sondar cada transferencia (que contiene puntos con múltiples secuencias diana). Este procedimiento se describe en detalle en la Patente de Estados Unidos n.º 5.589.330 de A. P. Shuber, y en Michalowsky y col., American Journal of Human Genetics, 59 (4): A272, póster 1573 (octubre de 1996), cada uno de los cuales se incorpora en el presente

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la resistencia a fármaco, incluso antes de que se comunicara la asociación de las mutaciones de los exones 19 y 21 de EGFR con la respuesta a fármacos en el CPCNP. La transición de C a T que reemplaza la Thr-766 con la mutación de metionina (ACG a ATG) se mostró in vitro en el contexto del EGFR de tipo silvestre, que confiere resistencia a gefitinib [21] y un inhibidor de quinazolina relacionado, PD153035 [22].

Se conocen una diversidad de ensayos para evaluar la presencia de mutaciones en los ácidos nucleicos. Estos incluyen, a modo de ejemplos no limitativos, la detección mediante polimorfismo de conformaciones monocatenarias en electroforesis en gel [29], detección de alelos mediante bioluminiscencia en un dispositivo de microfluidos [30] y la detección de alelos en un soporte sólido o micromatriz mediante extensión de cebador específica de alelo [31, 32].

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Obtención de tejidos

Las muestras de ensayo tumorales, que incluían bloques de parafina, biopsias con aguja fina y derrames pleurales, se obtuvieron a través de protocolos aprobados por el Institutional Review Board of Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (protocolo 92-055 [7] y protocolo 04-103 [Protocolo S1]). Todos los pacientes proporcionaron el consentimiento con total conocimiento de causa.

Análisis mutacionales del EGFR y KRAS en tumores de pulmón

Se extrajo ADN genómico procedente de muestras de ensayo tumorales, y los cebadores para los análisis del EGFR (exones 18-24) y KRAS2 (exón 2) eran como está publicado [3,7]. Todas las reacciones de secuenciación se realizaron en las direcciones directa e inversa, y todas las mutaciones se confirmaron por lo menos dos veces a partir de aislados de PCR independientes.

La mutación del exón 20 (T790M) también se detectó mediante análisis de longitud de productos de PCR marcados de forma fluorescente (FAM) en un dispositivo de electroforesis capilar (ABI 3100 Avant, Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos), basándose en un sitio de restricción para NlaIII nuevo creado por la mutación T790M (2369 C→T). Se utilizaron los siguientes cebadores.

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ADN procedente de líneas celulares de CPCNP (H1975, positiva para L858R y T790M; H-2030, EGFR de tipo silvestre) para la calibración, este ensayo detecta la presencia de la mutación T790M cuando el ADN de H1975 constituye el 3 % o más del ADN total analizado, en comparación con una sensibilidad del 6 % para la secuenciación directa (dato no mostrado), con la advertencia de que el alelo que contiene la mutación T790M se amplifica aproximadamente dos veces en las células H1975.

RT-PCR

Se utilizaron los siguientes cebadores para generar fragmentos del ADNc de EGFR que se extienden a lo largo del exón 20:

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Las secuencias que son diana de EGFR 2095F y EGFR 2943R se muestran subrayadas en la Tabla 1. Los productos de PCR se ligaron en plásmidos utilizando el kit TOPO TA-cloning (Invitrogen, Carlsbad, California, Estados Unidos), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron preparaciones a pequeña escala de ADN de clones individuales utilizando el sitio de cebado T7 del vector de clonación.

Análisis funcionales de los EGFR mutantes

Se introdujeron mutaciones en los ADNc de EGFR de tipo silvestre de longitud completa y mutante utilizando el Kit de Mutagénesis Dirigida QuikChange (Stratagene, La Jolla, California, Estados Unidos) y se clonaron en los vectores de expresión como se describe [3]. Para generar la deleción (del) L747-E749; mutante A750P, se utilizaron los siguientes cebadores:

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Para introducir la mutación T790M se utilizaron los siguientes cebadores: 5

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El ADNc del mutante L858R se generó previamente [3]. Todos los clones mutantes volvieron a secuenciarse completamente de forma bidireccional para asegurarse de que no se habían introducido mutaciones adicionales. Se expresaron de forma transitoria diversos EGFR en células de riñón embrionario de ser humano 293T como está publicado [3]. Las células se trataron con distintas concentraciones de gefitinib o erlotinib.

Inmunotransferencia

Para los detalles sobre lisis celular, inmunotransferencia y reactivos de anticuerpo, véanse los procedimientos y los procedimientos complementarios en [3]. Se realizaron por lo menos tres experimentos independientes para todos los análisis.

Cultivo celular

Las líneas celulares de CPCNP H1650, H1975, H2030, H2347, H2444, H358 y H1734 se adquirieron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Virginia, Estados Unidos). H3255 fue un obsequio de B. Johnson y P. Janne. Las células se cultivaron en medio de cultivo completo (RPMI-1640; Colección Americana de Cultivos Tipo n.º de catálogo 30-2001) complementado con suero fetal bovino al 10 %, 10 unidades/ml de penicilina y 10 [μ]g/ml de estreptomicina) a 37 ºC y CO2 al 5 %. Para los estudios de viabilidad, las células se sembraron en medio de cultivo completo en placas ViewPlates de 96 pocillos negras con fondo transparente (PerkinElmer, Wellesley, Massachusetts, Estados Unidos) a una densidad de 5.000 (H1975 y H2030) o de 7.500 (H3255) células por pocillo. Después de la incubación durante una noche, las células se cultivaron durante 24 h en el medio RPMI-1640 complementado con suero al 0,1 %. Las células (en medio RPMI-1640 complementado que contenía suero al 0,1 %) se incubaron después durante 48 h con la presencia continua de gefitinib o erlotinib.

Ensayo de viabilidad

La viabilidad celular se ensayó utilizando calceína AM (éster de acetoximetilo de Calceína, Molecular Probes, Eugene, Oregón, Estados Unidos). Después de la incubación con gefitinib o erlotinib, se lavaron dos veces las monocapas con PBS (que contenía calcio y magnesio) y se incubaron con Calceína AM 7,5 [μ]mol en RPMI-1640 complementado (sin suero) durante 30 min. El medio de marcaje se retiró, y las células se lavaron tres veces con PBS. La fluoresceína de la calceína (Ex, 485 nm; Em 535 nm) se detectó de forma inmediata utilizando un lector de placa de multi-marcador Victor V (PerkinElmer); se realizaron tres experimentos independientes para cada línea celular; cada experimento incluyó de cuatro a ocho repeticiones por condición.

Producción de anticuerpos monoclonales y policlonales anti-EGFR mutante

Se inyectó un grupo de tres ratones hembra Balb/c (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, Mass.) con 5 ug/dosis de proteína EGFR truncada purificada o un fragmento de la misma que contenía la mutación T790M en 100 ul de adyuvante Detox (RIBI ImmunoChem Res Inc, Hamilton, Mo.) mediante inyección intraperitoneal en los días 0, 3, 7, 10 y 14. El día 17 los animales se sacrificaron, se retiraron sus bazos y los linfocitos se fusionaron con la línea de mieloma de ratón 653 utilizando polietilenglicol 4000 al 50 % mediante un procedimiento establecido (véanse las Patentes de Estados Unidos n.º 5.939.269 y 5.658.791, incorporadas como referencia en el presente documento). Las células fusionadas se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos a una densidad de 2x105 células/pocillo seguido de selección por HAT en el día 1 después de la fusión. Después se hicieron reaccionar los sobrenadantes de cultivo de hibridoma inmovilizados con el mutante T790M del EGFR biotinilado. Los pocillos positivos para los anticuerpos anti-EGFR se expandieron para estudios adicionales. Estos cultivos permanecen estables cuando se expanden y las líneas celulares se conservan mediante congelación. Se determinó el isotipo de los cultivos parentales y después se ensayó su capacidad para capturar y para reconocer de forma específica el mutante T790M del EGFR.

Como alternativa, se generó un antisuero policlonal en conejo frente a péptidos de la proteína mutante purificados. Los anticuerpos policlonales frente al mutante T790M del EGFR se obtuvieron acoplando tales péptidos a hemocianina de lapa californiana con glutaraldehído al 0,05 %, se emulsionaron con adyuvante completo de Freund y se inyectaron por vía intradérmica en varios sitios. Los animales se reinmunizaron cuatro y siete semanas más tarde con el péptido acoplado emulsionado en adyuvante incompleto de Freund y se les extrajo sangre diez días después de la última inyección.

Los anticuerpos preparados de acuerdo con los procedimientos anteriores se usaron después para la identificación y/o el diagnóstico de células tumorales (es decir, en secciones ultrafinas de tejidos cancerosos) por la expresión de la mutación T790M del EGFR y/o para los enfoques terapéuticos de acuerdo con los procedimientos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos n.º 5.601.989, 5.563.247, 5.610.276 y

5.405.941. Estos mismos anticuerpos se utilizaron para controlar la expresión del mutante T790M del EGFR.

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Ejemplo 4. Comunicaciones de casos

Los presentes inventores identificaron mutaciones del EGFR secundarias en tres de los seis individuos cuya enfermedad evolucionó con gefitinib o erlotinib (Tabla 5). A continuación, se presentan los historiales médicos abreviados de estos tres pacientes.

Paciente 1.

Esta mujer de 63 años que “nunca fumó” (fumó menos de 100 cigarrillos en toda su vida) inicialmente presentaba opacidades difusas bilaterales en el tórax y derrame pleural en el lado derecho. La biopsia transbronquial reveló adenocarcinoma. La enfermedad evolucionó en dos ciclos de quimioterapia sistémica, después de lo cual se inició gefitinib, 250 mg diarios. La comparación de las radiografías de tórax obtenidas antes del inicio de gefitinib (Figura 4A, panel izquierdo) y 2 semanas más tarde (Figura 4A, panel intermedio) mostró una mejora drástica. Nueve meses más tarde, una radiografía de tórax reveló evolución de la enfermedad (Figura 4A, panel derecho). Posteriormente, el paciente se sometió a una biopsia guiada por tomografía computarizada (TC) de un área en la base del pulmón derecho (Figura 5A, panel izquierdo). A pesar del tratamiento continuo con gefitinib, ya sea con quimioterapia o 500 mg diarios, el derrame pleural reapareció 12 meses después del inicio del tratamiento con gefitinib (Figura 5A, panel derecho). Se obtuvo líquido pleural para estudios moleculares. En total, para el análisis se disponía de tres muestras de ensayo tumorales de esta paciente: la biopsia del tumor de pulmón original, una biopsia de la lesión de pulmón en aumento y líquido pleural. Sin embargo, la revisión de la biopsia transbronquial original mostró que tenía escasas células tumorales (Tabla 5).

Paciente 2.

Esta mujer de 55 años con un historial de tabaquismo de nueve paquetes por año se sometió a dos resecciones quirúrgicas en 2 años (lobectomías superior derecha y superior izquierda) para carcinoma bronquioloalveolar con invasión focal. Dos años más tarde, su enfermedad reapareció con nódulos pulmonares bilaterales y adicionalmente evolucionó con quimioterapia sistémica. Después de eso, la paciente comenzó el tratamiento con erlotinib, 150 mg diarios. Un barrido de TC inicial del tórax demostró innumerables nódulos bilaterales (Figura 4B, panel izquierdo), que se redujeron claramente en número y tamaño 4 meses después del tratamiento (Figura 4B, panel intermedio). Después de 14 meses de terapia, la dosis del paciente de erlotinib se disminuyó hasta 100 mg diarios debido a la fatiga. A los 23 meses de tratamiento con erlotinib, un barrido de TC demostró una lesión esclerótica en aumento en la columna torácica. La paciente se sometió a biopsia guiada por TC de esta lesión (Figura 5B, panel izquierdo), y la dosis de erlotinib se aumentó hasta 150 mg diarios. Después de 25 meses de tratamiento, la enfermedad evolucionó en el pulmón (Figura 4B, panel derecho). El tratamiento con erlotinib se interrumpió y se realizó una biopsia con aguja gruesa guiada de forma fluoroscópica en un sitio de enfermedad evolutiva en el pulmón (Figura 5B, panel derecho). En total, para el análisis se disponía de tres muestras de ensayo tumorales de esta paciente: el tumor de pulmón reseccionado original, la biopsia de la lesión en aumento de la columna y la biopsia de la lesión de pulmón en evolución (Tabla 5).

Paciente 3.

Esta mujer de 55 años que “nunca fue fumadora” se trató durante casi 4,5 años con paclitaxel y trastuzumab de forma semanal [17] por un adenocarcinoma con características de carcinoma bronquioloalveolar que implicaba el lóbulo inferior izquierdo, la pleura y los ganglios linfáticos del mediastino. El tratamiento se interrumpió debido a la fatiga. Posteriormente, se sometió a la paciente a resección quirúrgica. Debido a la implicación metastásica de múltiples nódulos linfáticos del mediastino y las características clínicas conocidas en ese momento como predictivas de respuesta al gefitinib (mujer, nunca fumadora, histología variante bronquioloalveolar), se le puso 1 mes más tarde gefitinib “adyuvante” (Figura 4C, panel izquierdo). Este fármaco se interrumpió después de tres meses cuando la paciente desarrolló un nuevo derrame pleural maligno del lado derecho (Figura 4C, panel intermedio). A pesar del drenaje y de la quimioterapia sistémica, el derrame pleural reapareció 4 meses más tarde (Figura 4C, panel derecho), momento en el que se recogió líquido pleural para el análisis. En total, para el análisis se disponía de dos muestras de ensayo clínicas de esta paciente: tumor procedente de la resección quirúrgica y líquido pleural (Tabla 5).

Tabla 5. Muestras de ensayo analizadas en el presente estudio para mutaciones en el dominio tirosina quinasa del EFGF (Exones 18 a 24) y KRAS (Exón 2)

Paciente

Muestra de ensayo de Patología Analizada Fecha de Obtención Porcentaje de Células Tumorales EGFR KRAS

1

Biopsia transbronquial Día 0 Escasas Tipo silvestre Tipo silvestre

Lesión de pulmón en evolución

12 meses >85 % L858R + T790M Tipo silvestre

Derrame pleural

14 meses >85 % L858R + T790M Tipo silvestre

5

10

15

20

25

30

35

40

(continuación)

Paciente

Muestra de ensayo de Patología Analizada Fecha de Obtención Porcentaje de Células Tumorales EGFR KRAS

2

Lesión de pulmón original Día 0 >85 % Del L747-E749; A750P Tipo silvestre

Lesión de la columna en evolución

75 meses >85 % Del L747-E749; A750P + T790M Tipo silvestre

Lesión de pulmón en evolución

77 meses >85 % Del L747-E749; A750P + T790M Tipo silvestre

3

Biopsia pleural original Día 0 n/a Del E746-A750 Tipo silvestre

Derrame pleural

76 meses >50 % Del E746-A750 + T790M Tipo silvestre

La biopsia transbronquial en la paciente 1 tuvo escasas células tumorales; el análisis de secuenciación reveló solo secuencia de tipo silvestre (véase el texto). En otros tres casos, no se identificaron ninguna de las mutaciones de EGFR ni de KRAS adicionales (datos no mostrados). Porcentaje de células tumorales: definido mediante evaluación de los portaobjetos histopatológicas correspondientes, del: deleción, n/a -no aplicable.

Ejemplo 5. Los tumores de las pacientes contienen mutaciones del dominio tirosina quinasa del EGFR asociadas con la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR

Los presentes inventores exploraron todas las muestras tumorales disponibles procedentes de las tres pacientes descritas en el Ejemplo 4 para las mutaciones del EGFR sensibles a fármaco descritas anteriormente, mediante secuenciación directa del ADN de los exones 19 y 21 [3]. Las muestras tumorales de la paciente 1 mostraron un cambio T→G en el nucleótido 2573, que dio como resultado la sustitución de aminoácido L858R del exón 21 observada comúnmente en los tumores sensibles a fármaco. Esta mutación estaba presente en el material de biopsia de la lesión de pulmón en evolución (Figura 6A, paneles superiores; Tabla 5) y en células procedentes del derrame pleural (Figura 6A, paneles inferiores; Tabla 5), los cuales en el examen citopatológico consistían en una mayoría de células tumorales (Tabla 5). Cabe destacar que las comparaciones de los rastreos sugieren que puede haberse producido un aumento del número de copias del alelo mutante. En concreto, aunque la proporción de los picos de tipo silvestre (nucleótido T) con respecto al mutante (nucleótido G) en la posición 2573 fue de aproximadamente 1:1 o 1:2 en la muestra de ensayo de biopsia de pulmón (Figura 6A, paneles superiores), las células del líquido pleural demostraron un pico de G mutante dominante (Figura 6A, paneles inferiores). De forma concordante con esto, un polimorfismo mononucleotídico (PMN) observado en el nucleótido 2361 (A o G) demostró un cambio correspondiente en las proporciones de A:G, con una proporción de 1:1 en la biopsia transbronquial y una proporción casi de 5:1 en el líquido pleural (Figura 7A). Notablemente, los presentes inventores no detectaron la mutación T→G en 2573 en la muestra de ensayo de biopsia transbronquial original (Tabla 5; datos no mostrados). Como se indicó anteriormente, esta última muestra de ensayo contenía escasas células tumorales, muy probablemente menos que las necesarias para la detección de una mutación del EGFR mediante secuenciación directa (véase [7]).

Las tres muestras de ensayo de la paciente 2, que incluían el tumor de pulmón original y las dos muestras metastásicas de hueso y de pulmón, mostraron una deleción del exón 19 que implicaba la eliminación de 11 nucleótidos (2238-2248) y la inserción de dos nucleótidos, G y C (Figura 6B, todos los paneles; Tabla 5). Estos cambios de nucleótidos suprimen los aminoácidos L747-E749 y cambian el aminoácido 750 de alanina a prolina (A750P). Previamente se había comunicado una mutación del L747-E749; A750P con distintos cambios de nucleótidos [2]. En todas las muestras de la paciente 2, la secuencia de tipo silvestre predominó en una proporción de aproximadamente 3:1 por encima de la secuencia mutante.

Las dos muestras tumorales disponibles de la paciente 3 contenían una deleción de 15 nucleótidos (2236-2250) en el exón 19 (Tabla 5; datos no mostrados), que dio como resultado la eliminación de cinco aminoácidos (del E746-A750). Esta deleción específica se había comunicado anteriormente [3]. La proporción de los picos de mutante con respecto al tipo silvestre fue de aproximadamente 1:1 en ambas muestras de ensayo (datos no mostrados).

En conjunto, estos resultados demuestran que los tumores procedentes de las tres pacientes contienen mutaciones del EGFR asociadas con la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa gefitinib y erlotinib. Además, estos datos muestran que, en pacientes individuales, las lesiones metastásicas o recurrentes de la columna vertebral, pulmones y líquido pleural contienen las mismas mutaciones. Estas últimas observaciones respaldan la idea de que las células tumorales recidivantes y metastásicas en los individuos derivan de clones progenitores originales.

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