ES2586457T3 - Reacción en cadena de la polimerasa múltiple de rescate de amplicón para amplificación de dianas múltiples - Google Patents

Abstract

Un método de PCR múltiple que comprende: amplificar múltiples ácidos nucleicos diana usando pares de cebadores anidados específicos de diana que comprenden cebadores directo externo, directo interno, inverso interno e inverso externo para cada diana en una primera reacción de amplificación, en el que la concentración de cebadores anidados es de 100-1000 nM, y en el que al menos uno de dichos cebadores internos comprende nucleótidos adicionales para proporcionar una secuencia adicional que no es específica para los ácidos nucleicos diana, de modo que la amplificación del ácido nucleico diana con dicho cebador también incorporará en el amplicón resultante un sitio de unión para un cebador común que, a diferencia de un cebador específico de diana, puede usarse para amplificar adicionalmente amplicones de ácido nucleico diana no relacionados, produciendo de este modo al menos un amplicón de ácido nucleico que contiene al menos un sitio de unión a cebador común; separar el al menos un amplicón de ácido nucleico de al menos una parte de los cebadores de la primera amplificación; y amplificar el al menos un amplicón de ácido nucleico en una segunda reacción de amplificación usando al menos un cebador común que se une con el al menos un sitio de unión a cebador común.

Description

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Ejemplo 1 Se diseñó una reacción de arm-PCR para amplificar y detectar patógenos responsables de enfermedades portadas por alimentos. El gen diana usado para cada patógeno se enumera en la Tabla 1 a continuación. Tabla 1

Organismo diana

Gen diana

Escherichia coli (E. coli)

rfbE

E. coli

eac

Salmonella

invA

Campylobacter jejuni (1) y coli (2)

ceuE

Shigella

ipaH

Yersinia enterocolitica

yst

Vibrio cholerae

OMPW

Toxina termolábil de E coli (ETEC)

LT

Toxina shiga de E. coli (STEC)

Stx

Toxina del cólera de Vibrio cholerae

Ctx

Toxina termoestable de E. coli (ETEC)

ST

Vibrio parahaemolyticus

tlh

Se enumeran cebadores generados para cada diana en la Tabla 2. SupF y SupR indican secuencias de cebadores comunes. Las secuencias de cebadores comunes que forman el marcador para cebadores específicos de diana se

10 muestran en negrita. Fo, Fi, Ri y Ro indican los cebadores anidados para cada diana de amplificación, mientras que el oligo D indica la sonda de detección que hibrida con una secuencia específica dentro del amplicón. La sonda se une covalentemente con una perla codificada por colores para la detección con el instrumento Luminex xMAP®.

Tabla 2

Nombre del cebador Secuencia del cebador SEQ ID NO:

Sup F TTCTTAGCGTATTGGAGTCC 1

Sup R /5Biosg/AATGTACAGTATTGCGTTTTG 2

ceuE Fo CAACAAGTTGATTTTGAAGC 3 ceuE Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCATTAATGCTTTAAAACCTGATC 4 ceuE Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGTTAAAAAATTTGCATTATCAAG 5 ceue Ro ACCATAAAGTTTTGCAACGC 6 ceuE D1 /5AmMC12/CTC CAA CTT TAT TTG TAG 7

ceuE2 Fo CAACAAGTTGATTTTGAAGC 8 ceuE2 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCATTAATGCTTTAAAACCTGATC 9 ceuE2 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGTTAAAAAATTTGCATTATCAAG 10 ceuE2 Ro ACCATAAAGTTTTGCAACGC 11 ceuE D2 /5AmMC12/CTC CAA CTA TGT TTG TAG 12

rfbE2 Fo AGGATTAGCTGTACATAGGC 13 rfbE2 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCGGCATGACGTTATAGGCTAC 14 rfbE2 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGTGTTCTAACTGGGCTAATCC 15 rfbE2 Ro CGTGATATAAAATCATCAGC 16 rfbE2 D /5AmMC12/GACAAATATCTGCGCTGCTAT 17

eac1 Fo CGATTACGCGAAAGATACCG 18

eac1 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCCCAGGCTTCGTCACAGTTGC 19

7

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5

10

15

20

Nombre del cebador Secuencia del cebador SEQ ID NO:

stx2 Fo ACAACGGTTTCCATGACAAC 63 stx2 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCGGACAGCAGTTATACCACTC 64 stx2 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGGAAACCAGTGAGTGACGACT 65 stx2 Ro CCATTAACGCCAGATATGAT 66 stx2 D /5AmMC12/ACGTTCCGGAATGCAAAT 67

ctx1 Fo CAGATTCTAGACCTCCTGATG 68 ctx1 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCAGCAGTCAGGTGGTCTTATG 69 ctx1 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGCATTTGAGTACCTCGGTCAA 70 ctx1 Ro CTTGCATGATCATAAAGGTTG 71 ctx1 D /5AmMC12/AGAGGACAGAGTGAGTAC 72

ctx2 Fo GGGCTACAGAGATAGATATTAC 73 ctx2 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCAGATATTGCTCCAGCAGCAG 74 ctx2 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGCATGATGAATCCACGGCTCT 75 ctx2 Ro CGATGATCTTGGAGCATTCC 76 ctx2 D /5AmMC12/TATGGATTGGCAGGTTTC 77

ST Fo CTTTTTCACCTTTCGCTCAG 78 ST Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCGATGCTAAACCAGCAGGGTC 79 ST Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGCAATTCACAGCAGTAATTGC 80 ST Ro CCGGTACAAGCAGGATTACA 81 ST D /5AmMC12/AGTAGTCCTGAAAGCATG 82

tlh1 Fo GATTCGTTTGACGGACGCAG 83 tlh1 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCCATGTTGATGACACTGCCAG 84 tlh1 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGCGATCTCTTCTTGTGTTGAG 85 tlh1 Ro CAAGCACTTTCGCACGAATT 86 tlh1 D /5AmMC12/AAAGCGCCTCAGTTTAAG 87

tlh2 Fo AAGAGCACGGTTTCGTGAAC 88 tlh2 Fi TTCTTAGCGTATTGGAGTCCGACATCAACCGCTCATCGTC 89 tlh2 Ri AATGTACAGTATTGCGTTTTGCAGAACACAAACTTCTCAGC 90 tlh2 Ro CGGTGAGTTGCTGTTGTTGG 91 tlh2 D /5AmMC12/ATGTACACCCACGCATTG 92

Una mezcla de cebadores que contiene 10 pmol de cada uno de los cebadores Fo, Fi, Ri y Ro en la Tabla 2. Para esta amplificación, solamente se incluyó un molde diana, Campylobacter jejuni. El molde se diluyó a 10 pg/μl, 1 pg/μl, 0,1 pg/μl, 0,01 pg/μl y 0,001 pg/μl. Se usó un kit de PCR Qiagen Multiplex para preparar una muestra que contenía 44 μl de mezcla Multiplex, 5 μl de mezcla de cebadores y 1 μl de molde. Las condiciones de ciclación fueron las siguientes:

95 °C durante 15 minutos 94 °C durante 15 segundos 55 °C durante 15 segundos 72 °C durante 15 segundos Estos tres ciclos se repitieron, 2-20 veces (15 veces en total para este ejemplo) 94 °C durante 15 segundos 70 °C durante 15 segundos Estos dos ciclos se repitieron, 6 veces en total para este ejemplo. 72 °C durante 3 minutos Mantenimiento a 4 °C

Tras completar la primera amplificación como se ha descrito anteriormente, se añadieron muestras a columnas de Millipore con un punto de corte de peso molecular de 50 kd y se centrifugaron durante 11 minutos a 13 k RPM para retirar una parte sustancial de los cebadores (peso molecular generalmente por debajo de 30 kd), rescatando

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Claims (1)

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