ES2585584T3 - Utilización de chaperonas farmacológicas para mejorar la fabricación y la purificación de ß-glucosidasa ácida - Google Patents

Abstract

Un método para mejorar la producción de una proteína de ß-glucosidasa ácida recombinante, método que comprende poner en contacto una célula hospedadora in vitro con isofagomina, en donde la célula hospedadora expresa la proteína recombinante; y purificar la ß-glucosidasa ácida del medio de cultivo celular después de la secreción por la célula huésped, en donde la isofagomina estabiliza la proteína de ß-glucosidasa ácida durante la purificación.

Description

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DESCRIPCION

Utilizacion de chaperonas farmacologicas para mejorar la fabricacion y la purificacion de 13-glucosidasa acida

La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/181.255, presentada el 26 de mayo de 2009.

1. Campo de la invencion

La presente invencion proporciona metodos para mejorar la produccion de protemas recombinantes a traves del uso de chaperonas farmacologicas para las protemas recombinantes. La union de una chaperona farmacologica a una protema recombinante expresada por una celula puede estabilizar la protema e incrementar la exportacion de la protema fuera del retmulo endoplasmico de la celula, e incrementar la secrecion de la protema por la celula.

2. Antecedentes

Diversas protemas humanas recombinantes se producen usando sistemas de cultivo de celulas de mairnfero que sobreexpresan y secretan estos productos biologicos en el medio, que a continuacion se purifican mediante procedimientos cromatograficos. Protemas recombinantes producidas satisfactoriamente incluyen protemas secretoras (p. ej., factores de coagulacion sangumea, inmunoglobulinas, eritropoyetina y otras hormonas, inhibidores de elastasa, etc.) y enzimas lisosomicas (p. ej., p-glucocerebrosidasa, a-galactosidasa A, a-glucosidasa acida, etc.). Varios factores cnticos afectan a la eficacia y el rendimiento en tal procedimiento de fabricacion: el nivel de expresion para la lmea celular; si la protema recombinante secretada mantiene su actividad biologica en el medio de cultivo celular antes de la purificacion; y el esquema de purificacion de la protema para la recuperacion del producto biologico.

Los ejemplos anteriores son protemas que comparten todas una ruta biosintetica comun en el retmulo endoplasmico (ER, por sus siglas en ingles) (Blobel y cols., 1979). Estas protemas (que incluyen todas las protemas membranarias, protemas secretoras, protemas peroxisomicas y lisosomicas) tambien comparten una ruta de exportacion comun del ER que conduce las protemas recientemente sintetizadas al aparato de Golgi para codificaciones postraduccionales adicionales para clasificar diferentes clases de protemas de modo que alcancen sus destinos celulares y extracelulares pretendidos (Kornfeld, 1987). Para que estas protemas alcancen sus destinos finales, en primer lugar se deben plegar como estructuras estables que pasen suficientemente el sistema de control de calidad (QC, por sus siglas en ingles) del ER antes de salir de este compartimento (Ellgaard & Helenius, 2003). Las protemas mutantes a menudo no se pliegan establemente y son reconocidas y retenidas por el sistema QC del ER (Ellgaard & Helenius, 2003). Si estas protemas mutantes no alcanzan una conformacion estable despues de multiples intentos, finalmente son eliminadas por los sistemas de degradacion asociada al ER (ERAD, por sus siglas en ingles). Se ha observado que una retencion aberrante en el ER de protemas mutantes menos estables y una ERAD excesiva son la principal causa de numerosas enfermedades incluyendo fibrosis qrnstica, diabetes tipo 2 y diversas enfermedades de almacenamiento lisosomico (Schmitz y cols., 2005; Fan y cols., 1999; Tropak y cols., 2004).

Tambien se observa la degradacion prematura de protemas normales de modo que una fraccion apreciable de protemas silvestres no alcance conformaciones estables dentro del espacio de tiempo asignado y finalmente sea eliminada por ERAD. El ejemplo mas citado es la eliminacion de 50-70% del canal de iones cloruro regulador de la conductancia transmembranaria de la fibrosis qrnstica (CFTR, por sus siglas en ingles) silvestre. Se cree que las protemas complejas grandes (p. ej., CFTR, receptores, factores de coagulacion, etc.) tienden a plegarse menos eficazmente que los homologos mas simples y mas pequenos y por lo tanto son propensas a una degradacion prematura. Por otra parte, Randall Kaufman y colaboradores describieron la acumulacion de Factor VIII humano recombinante y el hinchamiento inusual del ER, la activacion aguda de ciertas cinasas y diversas rutas celulares durante la produccion de este producto biologico. Estos efectos celulares profundos se conocen ahora como estres del ER asociado con la expresion de protemas complejas y otras protemas problematicas (p. ej., Factor VIII y antitripsina a-1 en forma Z). Tambien se cree que la acumulacion de protema, la degradacion excesiva y el estres del ER afectan adversamente a la produccion de protemas recombinantes y conducen a bajos rendimientos de protemas. Asf, existe una necesidad de mejorar los procedimientos de fabricacion de protemas recombinantes.

El documento WO2004074450 se refiere a un metodo para mejorar la eficacia de la terapia genica para deficiencias de protemas mediante la administracion de una chaperona, p. ej. isofagomina, potenciando de ese modo la expresion, la eficacia y la estabilidad in vivo de p-glucosidasa acida.

El documento WO2008054947 divulga metodos para identificar una chaperona para p-glucosidasa acida, p. ej. isofagomina, y describe la expresion de una p-glucosidasa acida mutada en fibroblastos de un paciente con enfermedad de Gaucher en presencia o ausencia de isofagomina.

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El documento WO2004069190 divulga un metodo para incrementar la produccion de una protema recombinante, p. ej. B-glucosidasa acida, en celulas hospedadoras no mai^eras al poner en contacto la celula hospedadora en un medio que comprende una chaperona, p. ej. isofagomina.

3. Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona un metodo para mejorar la produccion de p-glucosidasa acida recombinante a traves del uso de la chaperona farmacologica isofagomina (tambien conocida como chaperonas sitioespedficas activas; ASSC, por sus siglas en ingles). La produccion de una protema recombinante (p. ej., a-glucosidasa acida, a- galactosidasa A acida o p-glucosidasa acida) se puede mejorar, por ejemplo, mediante la union de una chaperona farmacologica (p. ej., 1-desoxinorjirimicina, 1-desoxigalactonorjirimicina o isofagomina) a una p-glucosidasa acida recombinante expresada en una celula hospedadora.

En una realizacion no limitativa, la p-glucosidasa acida recombinante es expresada por una lmea celular in vitro. En otra realizacion no limitativa, la celula hospedadora es una celula de mairnfero. En otra realizacion no limitativa, la celula hospedadora puede ser una celula CHO, una celula HeLa, una celula HEK-293, una celula 293T, una celula COS, una celula COS-7, un mioblasto primario de raton o una celula NIH 3T3.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante incrementa la exportacion de la protema fuera del retmulo endoplasmico de la celula.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida

recombinante incrementa la secrecion de la protema desde la celula.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida

recombinante estabiliza la protema fuera de la celula despues de la secrecion de la protema por la celula.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida

recombinante reduce el estres del retmulo endoplasmico asociado con la expresion de la protema recombinante.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante incrementa la estabilidad de la protema a un pH mayor de 5,0.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante estabiliza la protema recombinante durante la purificacion de la protema desde el medio de cultivo celular despues de la secrecion por la celula. En una realizacion no limitativa adicional, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante durante la purificacion de la protema desde el medio de cultivo celular despues de la secrecion por la celula incrementa el rendimiento de la protema purificada.

En otra realizacion no limitativa, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante puede estabilizar la protema durante el almacenamiento. En una realizacion no limitativa adicional, la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la p-glucosidasa acida recombinante reduce la digestion proteolftica y/o el dano qmmico a la protema durante el almacenamiento.

4. Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa la estabilidad de GAA humana recombinante (Myozyme®, Genzyme Corp.) a pH neutro (7,4) o pH acido (5,2) en presencia o ausencia de 100 pM de hidrocloruro de 1-desoxinorjirimicina (1-DNJ-HCl) segun se determina en un ensayo de estabilidad termica. El ensayo de estabilidad termica utiliza calor para inducir la desnaturalizacion de protemas, que se verifica usando un colorante SYPRO Orange que emite fluorescencia al unirse a aminoacidos hidrofobos (que no estan expuestos en una protema plegada). Una estructura protemica que requiera mas calor para desnaturalizarse es por definicion mas estable. Myozyme es normalmente mucho mas estable a pH lisosomico (5,2) que a pH neutro (7,4). Sin embargo, la estabilidad de la enzima a pH 7,4 se incrementa significativamente al anadir 100 pM de desoxinorjirimicina, en comparacion con Myozyme sola.

La Figura 2A representa los efectos de 1-DNJ-HCl sobre la actividad de GAA humana recombinante (rhGAA; Myozyme®, Genzyme Corp.) a pH neutro (7,4) o pH lisosomico (5,2) a 37°C. La actividad de GAA se evaluo para determinar la capacidad de una ASSC para prolongar la actividad de rhGAA a lo largo del tiempo. Se incubo Myozyme (45 nM) en tampon de pH 7,4 o pH 5,2 con o sin 1-DNJ 50 pM a 37°C a lo largo de 24 horas. Se ensayo la actividad de la enzima gAa de las muestras usando 4-MU-a-glucosa a las 0, 3,6 y 24 horas y la actividad residual de GAA se expreso como % de la actividad inicial. Estos resultados indican que la 1-DNJ mejora la perdida de actividad de la enzima GAA a pH neutro (7,4).

La Figura 2B representa un experimento de estabilidad termica de SYPRO Orange en paralelo para determinar si la perdida de actividad enzimatica mostrada en la Figura 2A, particularmente la perdida de actividad de Myozyme a pH neutro (7,4), se correlaciona con el despliegue y la desnaturalizacion de la protema. Se incubo Myozyme (0,9 pM) en

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tampon de pH 7,4 o pH 5,2 con o sin 1-DNJ-HCl 10 pM a 37°C y el plegamiento de la protema se verifico cada hora a lo largo de 24 horas. Las Figuras 2A y 2B muestran que la desnaturalizacion de GAA se correlaciona con la perdida de actividad enzimatica. De forma mas importante, estos resultados indican que la 1-DNJ puede prevenir la desnaturalizacion de GAA y la perdida de actividad enzimatica a pH neutro.

La Figura 3 representa los resultados de un ensayo de estabilidad termica que utiliza calor para inducir la desnaturalizacion de protema, que se verifica usando un colorante SYPRO Orange que emite fluorescencia al unirse a aminoacidos hidrofobos (que no estan expuestos en una protema plegada). 1-DNJ-HCl incrementa la termoestabilidad de GAA como es evidente por incrementos en la temperatura de fusion de GAA de un modo dependiente de la dosis. El experimento se efectuo a pH 7,4.

La Figura 4 representa los resultados de un ensayo de estabilidad termica que utiliza calor para inducir la desnaturalizacion de protema, que se verifica usando un colorante SYPRO Orange que emite fluorescencia al unirse a aminoacidos hidrofobos (que no estan expuestos en una protema plegada). La isofagomina incrementa la termoestabilidad de p-glucosidasa acida como es evidente por incrementos en la temperatura de fusion de un modo dependiente de la dosis. El experimento se efectuo a pH 7,4.

La Figura 5 representa un experimento de estabilidad termica de SYPRO Orange para verificar el despliegue de p- glucosidasa acida (GCasa; Cerezyme®). Se incubo GCasa (2 pM) en tampon de pH 7,4 o pH 5,2 con o sin IFG 10 pM a 37°C y el despliegue de la protema se verifico cada hora a lo largo de 24 horas. Estos resultados indican que la IFG puede prevenir la desnaturalizacion de GCasa a pH neutro.

La Figura 6 representa los resultados de un ensayo de estabilidad termica que utiliza calor para inducir la desnaturalizacion de protema, que se verifica usando un colorante SYPRO Orange que emite fluorescencia al unirse a aminoacidos hidrofobos (que no estan expuestos en una protema plegada). La 1-desoxigalactonojirimicina incrementa la estabilidad de a-Gal A (Fabrazyme®) de un modo dependiente de la dosis como es evidente por incrementos en la temperatura de fusion de a-Gal A. El experimento se efectuo a pH 7,4.

La Figura 7 representa el incremento en p-glucosidasa acida, o las actividades de a-Gal A desde medios acondicionados de celulas COS-7 durante la expresion transitoria y la incubacion con IGF o DGJ 100 pM, respectivamente. Estos resultados demuestran que la incubacion con una chaperona farmacologica conocida que se une a y estabiliza una protema diana provoca incrementos en la actividad enzimatica. Los incrementos en los niveles de actividad enzimatica son un resultado de un incremento en la secrecion de protema de las protemas diana y/o las prevencion de la degradacion y la inactivacion de las protemas secretadas desde los medios acondicionados. El incremento en la actividad de p-glucosidasa acida es espedfico para su chaperona farmacologica (IFG) ya que una chaperona farmacologica estructuralmente similar (DNJ) no provocaba cambio en la actividad de p-glucosidasa acida en comparacion con una transfeccion transitoria de control con vector vado (EV, por sus siglas en ingles).

5. Descripcion detallada

La presente invencion proporciona metodos para mejorar la produccion de 13-glucosidasa acida recombinante a traves del uso de la chaperona farmacologica isofagomina para la protema recombinante. La presente invencion se basa en parte en el descubrimiento de que la chaperona farmacologica isofagomina puede estabilizar la enzima lisosomica p-glucosidasa acida en una conformacion que no se degrade en el retmulo endoplasmico de una celula que expresa la enzima lisosomica. La invencion tambien se basa en parte en el descubrimiento de que la union de la chaperona farmacologica isofagomina a la enzima lisosomica isofagomina incrementa la estabilidad de la enzima contra el estres por temperatura y pH.

Por claridad y no a modo de limitacion, esta descripcion detallada se divide en las siguientes subporciones:

(i) Definiciones;

(ii) Trastornos de deficiencia de protemas;

(iii) Produccion de protemas recombinantes; y

(iv) Estabilidad in vitro.

5.1 Definiciones

Los terminos usados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados normales en la tecnica, dentro del contexto de esta invencion y en el contexto espedfico en el que se usa cada termino. Ciertos terminos se

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analizan posteriormente, o en cualquier parte de la memoria descriptiva, para proporcionar directrices adicionales al profesional al describir las composiciones y los metodos de la invencion y como elaborarlos y usarlos.

El termino "enzimoterapia restitutiva" o "ERT" (por sus siglas en ingles) se refiere a la introduccion de una enzima purificada no natural en un individuo que tiene una deficiencia en tal enzima. La enzima administrada se puede obtener de fuentes naturales o mediante expresion recombinante. El termino tambien se refiere a la introduccion de una enzima purificada en un individuo que requiere o se beneficia de otro modo de la administracion de una enzima purificada, p. ej., que sufre insuficiencia protemica. La enzima introducida puede ser una enzima recombinante purificada producida in vitro, o una enzima purificada de tejido o fluido aislado, tal como, p. ej., placenta o leche de animal, o de plantas.

El termino "estabilizar una conformacion apropiada" se refiere a la capacidad de un compuesto o peptido u otra molecula para asociarse con una protema silvestre, o a una protema mutante que puede realizar su funcion silvestre in vitro e in vivo, de tal modo que la estructura de la protema silvestre o mutante se pueda mantener como su forma natural o apropiada. Este efecto se puede manifestar practicamente a traves de uno o mas de (i) un incremento del penodo de conservacion de la protema; (ii) una actividad superior por unidad/cantidad de protema; o (iii) mayor eficacia in vivo. Se puede observar experimentalmente a traves de un incremento de rendimiento desde el ER durante la expresion; mayor resistencia al despliegue debido a incrementos de temperatura (p. ej. segun se determina en ensayos de estabilidad termica), o la presencia de agentes caotropicos, y por medios similares.

Segun se usa en la presente, el termino "centro activo" se refiere a la region de una protema que tiene alguna actividad biologica espedfica. Por ejemplo, puede ser un centro que se une a un sustrato u otro socio de union y contribuye a los residuos de aminoacido que participan directamente en la formacion y la ruptura de enlaces qmmicos. Los centros activos de esta invencion pueden abarcar centros cataltticos de enzimas, centros de union a antfgeno de anticuerpos, dominios de union a ligando de receptores, dominios de union de reguladores o dominios de union a receptor de protemas secretadas. Los centros activos tambien pueden abarcar dominios de transactivacion, interaccion protema-protema o union a ADN de factores de transcripcion y reguladores.

Segun se usa en la presente, los terminos "chaperona farmacologica" o "chaperona sitioespedfica activa" se refieren a cualquier molecula, incluyendo una protema, un peptido, un acido nucleico, un carbohidrato, etc., que interactue espedficamente de forma reversible con un centro activo de una protema y mejore la formacion de una conformacion molecular estable. Segun se usa en la presente, "chaperona sitioespedfica activa" no incluyen chaperonas generales endogenas presentes en el ER de celulas tales como Bip, calnexina o calreticulina, o chaperonas qdmicas inespedficas generales tales como agua deuterada, DMSO o TMAO.

En una realizacion no limitativa, la chaperona sitioespedfica activa puede ser un "inhibidor competitivo" de una protema o enzima, en donde un inhibidor competitivo se puede referir a un compuesto que se asemeja estructuralmente a la estructura qmmica y la geometna molecular del sustrato enzimatico al que se une la enzima en aproximadamente la misma localizacion que el sustrato. Asf, el inhibidor compite por el mismo centro activo que la molecula del sustrato, incrementando asf la Km. La inhibicion competitiva habitualmente es reversible si estan disponibles suficientes moleculas de sustrato para desplazar el inhibidor, es decir, los inhibidores competitivos se pueden unir reversiblemente. Por lo tanto, la cantidad de inhibicion enzimatica depende de la concentracion del inhibidor, la concentracion del sustrato y las afinidades relativas del inhibidor y el sustrato por el centro activo.

El termino "celulas hospedadora" significa cualquier celula de cualquier organismo que se seleccione, se modifique, se transforme, se desarrolle o se use o se manipule de cualquier modo, para la produccion de una sustancia por la celula, por ejemplo, la expresion por la celula de un gen, una secuencia de ADN o ARN, una protema o una enzima. En una realizacion, una celula hospedadora se transfecta con un vector que codifica una protema que se puede usar para proteinoterapia restitutiva.

En otra realizacion no limitativa, la celula hospedadora puede ser una celula CHO, una celula HeLa, una celula HEK- 293, una celula 293T, una celula COS, una celula COS-7, un mioblasto primario de raton o una celula NIH 3T3.

El termino "purificado", segun se usa en la presente, se refiere a un material que se ha aislado bajo condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluyendo materiales naturales a partir de los que se obtiene el material. Por ejemplo, una protema purificada preferiblemente esta sustancialmente libre de otras protemas o acidos nucleicos con los que esta asociada en una celula; una molecula de acido nucleico purificada preferiblemente esta sustancialmente libre de protemas u otras moleculas de acido nucleico no relacionadas con las que se puede encontrar dentro de una celula. Segun se usa en la presente, el termino "sustancialmente libre" se usa funcionalmente, en el contexto de una prueba analttica del material. Preferiblemente, un material purificado sustancialmente libre de contaminantes es al menos 95% puro; mas preferiblemente, al menos 97% puro, y aun mas preferiblemente al menos 99% puro. La pureza se puede evaluar mediante cromatograffa, electroforesis en gel, inmunoensayo, analisis de la composicion, ensayo biologico y otros metodos conocidos en la tecnica. En una realizacion espedfica, purificado significa que el nivel de contaminantes esta por debajo de un nivel aceptable para las autoridades reguladoras para la administracion segura a un ser humano o un animal no humano.

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Segun se usa en la presente, los terminos "mutante" y "mutacion" significan cualquier cambio detectable en el material genetico, p. ej., ADN, o cualquier proceso, mecanismo o resultado de tal cambio. Esto incluye mutaciones genicas, en las que la estructura (p. ej., secuencia de ADN) de un gen se altera, cualquier gen o ADN que surja de cualquier proceso de mutacion y cualquier producto de expresion (p. ej., ARN, protema o enzima) es expresado por un gen o una secuencia de ADN modificados.

Segun se usa en la presente, el termino "protema mutante" se refiere a protemas traducidas de genes que contienen mutaciones geneticas que dan como resultado secuencias protemicas alteradas. En una realizacion espedfica, tales mutaciones dan como resultado la incapacidad de la protema para alcanzar su conformacion natural bajo las condiciones normalmente presentes en el ER. El fallo para conseguir esta conformacion da como resultado que estas protemas se degraden, en lugar de ser transportadas a traves de su ruta normal en el sistema de transporte protemico hasta su localizacion apropiada dentro de la celula. Otras mutaciones pueden dar como resultado una disminucion de la actividad o una renovacion mas rapida.

Segun se usa en la presente, el termino "gen silvestre" se refiere a secuencias de acido nucleico que codifican una protema capaz de tener una actividad funcional biologica normal in vivo. La secuencia de acido nucleico silvestre puede contener cambios de nucleotidos que difieren de la secuencia publicada conocida, con tal de que los cambios den como resultado sustituciones de aminoacidos que tengan poco o ningun efecto sobre la actividad biologica. El termino silvestre tambien puede incluir secuencias de acido nucleico manipuladas para codificar una protema capaz de incrementar o mejorar la actividad con relacion a la protema endogena o natural.

Segun se usa en la presente, el termino "protema silvestre" se refiere a cualquier protema codificada por un gen silvestre que sea capaz de tener actividad biologica funcional cuando se exprese o se introduzca in vivo. El termino "actividad silvestre normal" se refiere a la funcion fisiologica normal de una protema en una celula. Tal funcionalidad se puede probar mediante cualquier medio conocido para establecer la funcionalidad de una protema.

El termino "geneticamente modificado" se refiere a celulas que expresan un producto genico particular despues de la introduccion de un acido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica el producto genico, junto con elementos reguladores que controlan la expresion de la secuencia codificante. La introduccion del acido nucleico se puede efectuar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica incluyendo direccion genica y recombinacion homologa. Segun se usa en la presente, el termino tambien incluye celulas que se han manipulado para expresar o sobreexpresar un gen o producto genico endogeno normalmente no expresado por tal celula, p. ej., mediante tecnologfa de activacion genica.

La expresion "farmaceuticamente aceptable", siempre que se use en relacion con las composiciones farmaceuticas de la invencion, se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y tfpicamente no producen reacciones adversas cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, segun se usa en la presente, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o uno estatal o listado en la Farmacopea de EE. UU. u otra farmacopea reconocida generalmente para el uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. El termino "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehmulo con el que se administra el compuesto. Tales portadores farmaceuticos pueden ser lfquidos esteriles, tales como agua y aceites. Se emplean preferiblemente como portadores agua o soluciones salinas en solucion acuosa y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Portadores farmaceuticos se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin, 18a Edicion.

Los terminos "dosis terapeuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a la cantidad de un compuesto que es suficiente para dar como resultado una respuesta terapeutica. En realizaciones en las que se administran en un complejo una ASSC y una enzima, los terminos "dosis terapeuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se pueden referir a la cantidad del complejo que es suficiente para dar como resultado una respuesta terapeutica. Una respuesta terapeutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (p. ej., un profesional clmico) reconocera como una respuesta eficaz a la terapia. Asf, una respuesta terapeutica sera generalmente una mejora de uno o mas smtomas o signos de una enfermedad o un trastorno.

Los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" significaran generalmente un grado de error aceptable para la cantidad medida dada la naturaleza o la precision de las medidas. Grados de error ejemplares tfpicos estan dentro de 20 por ciento (%), preferiblemente dentro de 10%, y mas preferiblemente dentro de 5% de un valor o intervalo de valores dado. Alternativamente, y particularmente en sistemas biologicos, los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que estan dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 10 o 5 veces, y mas preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor dado. Las cantidades numericas dadas en la presente son aproximadas a menos que se indique otra cosa, lo que significa que el termino "alrededor de" o "aproximadamente" se puede inferir cuando no se indique expresamente.

Se debe apuntar que una concentracion de la ASSC que es inhibidora durante la produccion in vitro, el transporte o el almacenamiento de la protema terapeutica purificada puede constituir una "cantidad eficaz" para los propositos de esta invencion debido a la dilucion (y el desplazamiento consiguiente en la union debido al cambio en el equilibrio), la biodisponibilidad y el metabolismo de la ASSC durante la administracion in vivo.

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5.2 Trastornos de deficiencia de protemas

Trastornos caracterizados por deficiencia de protemas o enzimas, o perdida de funcion en tejidos espedficos, pueden ser tratados en teona mediante proteinoterapia restitutiva. En tales trastornos, ciertas celulas o todas las celulas de un individuo carecen de una protema funcional suficiente, contienen una forma inactiva de la protema o contienen niveles insuficientes para la funcion biologica.

Los trastornos de deficiencia de protemas o enzimas pueden estar provocados, por ejemplo, por una mutacion en el gen que codifica la protema o la enzima que da como resultado la expresion de una protema o enzima que no es funcional, o tiene una funcion reducida o alterada. La deficiencia tambien puede estar provocada por una mutacion en el gen de la protema o la enzima que de como resultado de poca a ninguna expresion de la protema o la enzima (p. ej. una mutacion completa).

Por otra parte, la deficiencia de enzima o protema se puede deber a un trastorno de conformacion, provocado por mutaciones que alteran el plegamiento de la protema y el retardo de la protema mutante en el ER, dando como resultado deficiencia de protema. Tales enfermedades incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, fibrosis qmstica, deficiencia de a1-antitripsina, hipercolesterolemia familiar, enfermedad de Fabry, enfermedad de Alzheimer (Selkoe, Annu. Rev. Neurosci. 1994; 17:489-517), osteogenesis imperfecta (Chessler y cols., J. Biol. Chem. 1993; 268:1822618233), smdrome de glicoprotemas con deficiencia de carbohidratos (Marquardt y cols., Eur. J. Cell. Biol. 1995; 66: 268-273), smdrome de Maroteaux-Lamy (Bradford y cols., Biochem. J. 1999; 341:193-201), ceguera hereditaria (Kaushal y cols., Biochemistry 1994; 33:6121-8), trombastenia de Glanzmann (Kato y cols., Blood 1992; 79:3212-8), deficiencia de factor VII hereditaria (Arbini y cols., Blood 1996; 87:5085-94), albinismo oculocutaneo (Halaban y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000; 97:5889-94) y deficiencia de protema C (Katsumi, y cols., Blood 1996; 87:4164-75). Recientemente, una mutacion en la enfermedad ligada al cromosoma X adrenoleucodistrofia (ALD) dio como resultado un plegamiento incorrecto del transportador de peroxisomas defectuoso que podna ser rescatado por cultivo a baja temperatura de celulas afectadas (Walter y cols., Am J Hum Genet 2001; 69:35-48). Generalmente, se acepta que las mutaciones tienen lugar uniformemente a lo largo de toda la secuencia de un gen. Por lo tanto, es predecible que el fenotipo resultante del plegamiento incorrecto de la protema deficiente exista en muchos otros trastornos geneticos.

Muchos de los trastornos de deficiencia de protema hereditarios son deficiencias enzimaticas. Una gran clase de trastornos enzimaticos hereditarios implica mutaciones en enzimas lisosomicas y se denominan trastornos de almacenamiento lisosomico (LSD, por sus siglas en ingles). Los trastornos de almacenamiento lisosomico son un grupo de enfermedades provocadas por la acumulacion de glucoesfingolfpidos, glucogeno y mucopolisacaridos. Ejemplos de trastornos lisosomicos incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Gaucher (Beutler y cols., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8a ed. 2001 Scriver y cols., ed. pp. 3635-3668, McGraw-Hill, Nueva York), gangliosidosis GM1 (id. en pp 3775-3810), fucosidosis (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 1995. Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. y Valle, D., ed pp. 2529-2561, McGraw-Hill, Nueva York), mucopolisacaridosis (id. en pp 3421-3452), enfermedad de Pompe (id. en pp. 3389-3420), enfermedad de Hurler-Scheie (Weismann y cols., Science 1970; 169, 72-74), enfermedades de Niemann-Pick A y B, (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 8a ed. 2001. Scriver y cols. ed., pp 3589-3610, McGraw-Hill, Nueva York), y enfermedad de Fabry (id. en pp. 3733-3774).

Enfermedad de Fabry

El termino "enfermedad de Fabry" se refiere a un error innato ligado al cromosoma X del catabolismo de los glucoesfingolfpidos debido a una actividad de a-galactosidasa A (a-Gal A) liposomica deficiente. Este defecto provoca la acumulacion de globotriaosilceramida (trihexosido de ceramida) y glucoesfingolfpidos relacionados en lisosomas endoteliales vasculares del corazon, los rinones, la piel y otros tejidos.

a-Galactosidasa A se refiere al gen Gla humano que comprende una secuencia de acido nucleico descrita en el N° de Registro del GenBank NM_000169. Alternativamente, la a-galactosidasa A puede ser codificada por cualquier molecula de aminoacido que exhiba al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y hasta 100% de homologfa con el gen de a-galactosidasa A (segun se determina mediante un software estandar, p. ej. BLAST o FASTA), y cualesquiera secuencias que se hibriden bajo condiciones estandar a estas secuencias.

a-Galactosidasa A (a-GAL A) humana se refiere a una enzima codificada por el gen Gla humano, o cualquier otra secuencia de aminoacidos al menos 90% homologa con la misma. La enzima a-GAL humana consiste en 429 aminoacidos y esta en los N° de Registro del GenBank U78027 y NP_000160.

El termino "enfermedad de Fabry atipica" se refiere a pacientes con manifestaciones principalmente cardfacas de la deficiencia de a-GAL, a saber acumulacion progresiva de globotriaosilceramida (GL-3) en celulas del miocardio que conduce a una dilatacion significativa del corazon, particularmente el ventnculo izquierdo.

Una "portadora" es una mujer que tiene un cromosoma X con un gen de a-GAL defectuoso y un cromosoma X con un gen normal y en la que esta presente inactivacion del cromosoma X del alelo normal en uno o mas tipos de celula. Una portadora a menudo esta diagnosticada de enfermedad de Fabry.

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Una chaperona farmacologica para a-galactosidasa A puede ser 1-desoxigalactonorjirimicina (DGJ), en donde la DGJ es un compuesto que tiene las siguientes estructuras:

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Este termino incluye tanto la base libre como cualesquiera formas salinas, y cualesquiera profarmacos de las mismas.

Otras chaperonas farmacologicas adicionales para a-GAL A se describen en las Patentes de EE. UU. N° 6.274.597, 6.774.135 y 6.599.919 de Fan y cols., e incluyen a-alo-homonojirimicina, p-1-C-butil-desoxigalactonojirimicina y a- galacto-homonojirimicina, calistegina A3, calistegina B2, calistegina B3, N-metil-calistegina A3, N-metil-calistegina B2 y N-metil-calistegina B3.

Enfermedad de Pompe

La enfermedad de Pompe es una LSD recesiva autosomica caracterizada por actividad de a-glucosidasa acida (GAA; a-glucosidasa) deficiente que deteriora el metabolismo de glucogeno lisosomico. La deficiencia enzimatica conduce a acumulacion de glucogeno lisosomico y da como resultado debilidad progresiva de los musculos esqueleticos, reduction de la funcion ca^aca, insuficiencia respiratoria y/o deterioro del SNC en fases tardias de la enfermedad. Las mutaciones geneticas en el gen de GAA dan como resultado bien reducir la expresion o bien producir formas mutantes de la enzima con estabilidad alterada y/o una actividad biologica que conduce finalmente a la enfermedad. (vease generalmente Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid a-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver y cols., eds., McGraw- Hill, New York, 7a ed., paginas 2443-2464). Las tres formas clmicas reconocidas de la enfermedad de Pompe (infantil, juvenil y adulta) se correlacionan con el nivel de actividad de a-glucosidasa residual (Reuser A J y cols., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). Las ASSC (tambien denominadas en cualquier parte "chaperonas farmacologicas") representan un nuevo enfoque terapeutico prometedor para el tratamiento de enfermedades geneticas, tales como trastornos del almacenamiento lisosomico (p. ej., enfermedad de Pompe).

a-Glucosidasa acida (GAA) se refiere a un gen de glucosidasa humana, a, acida (GAA) que comprende una secuencia de acido nucleico descrita en los N° de Registro del GenBank NM_000152, NM_001079803 o NM_001079804. Alternativamente, la a-glucosidasa acida puede ser codificada por cualquier molecula de acido nucleico que exhiba al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y hasta 100% de homologia con el gen de a-glucosidasa acida (segun se determina mediante un software estandar, p. ej. BLAST o FASTA), y cualesquiera secuencias que se hibriden bajo condiciones estandar a estas secuencias.

a-Glucosidasa acida humana se refiere a una enzima que hidroliza polimeros de D-glucosa con enlaces a-1,4 y a- 1,6 presentes en glucogeno, maltosa e isomaltosa. Nombres alternativos son como sigue: glucoamilasa; 1,4-a-D- glucano glucohidrolasa; amiloglucosidasa; Y-amilasa; y exo-1,4-a-glucosidasa. El gen de GAA humana se ha cartografiado al cromosoma 17q25.2-25.3 y tiene una secuencia de aminoacidos descrita en los N° de Registro del GenBank Y00839, NP_000143, NP_001073271 o NP_001073272, o cualquier otra secuencia de aminoacidos al menos 90% homologa con la misma.

La enfermedad de Pompe infantil (tipo I o A) es la mas comun y la mas grave, caracterizada por retraso en el desarrollo, hipotonia generalizada, hipertrofia cardiaca e insuficiencia cardiorrespiratoria dentro del segundo ano de vida. La enfermedad de Pompe juvenil (tipo II o B) es intermedia en gravedad y se caracteriza por una preponderancia de smtomas musculares sin cardiomegalia. Los individuos con enfermedad de Pompe juvenil habitualmente mueren antes de alcanzar 20 anos de edad debido a insuficiencia respiratoria. La enfermedad de Pompe adulta (tipo III o C) a menudo se presenta como una miopatia lentamente progresiva en la adolescencia o tan tarde como en la decada de los sesenta (Felice K J y cols., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135).

En la enfermedad de Pompe, se ha observado que la a-glucosidasa se modifica mucho postraduccionalmente mediante glicosilacion, fosforilacion y procesamiento proteolitico. La conversion del precursor de 110 kilodaltons (kDa) en formas maduras de 76 y 70 kDa mediante proteolisis en el lisosoma se requiere para la catalisis optima de glucogeno.

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Segun se usa en la presente, el termino "enfermedad de Pompe" se refiere a todos los tipos de enfermedad de Pompe. Las formulaciones y los reg^enes de dosificacion divulgados en esta solicitud se pueden usar para tratar, por ejemplo, enfermedad de Pompe Tipo I, Tipo II o Tipo III.

Una chaperona farmacologica para a-glucosidasa acida puede ser 1-desoxinorjirimicina (1-DNJ), que se representa mediante la siguiente formula:

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o una sal farmaceuticamente aceptable, un ester o un profarmaco de la misma. En una realizacion, la sal es sal de hidrocloruro (es decir 1-desoxinojirimicina-HCl).

Otras chaperonas farmacologicas adicionales para a-glucosidasa acida se describen en la Patente de EE. UU. N° 6.599.919 de Fan y cols., y la Publicacion de Solicitud de Patente de EE. UU. N° 2006/0264467 de Mugrage y cols., e incluyen a-homonojirimicina y castanospermina.

Enfermedad de Gaucher

Segun se usa en la presente, el termino "enfermedad de Gaucher" se refiere a una deficiencia de la enzima lisosomica glucocerebrosidasa que descompone glucocerebrosidos grasos. A continuacion, la grasa se acumula, principalmente en el hngado, el bazo y la medula osea. La enfermedad de Gaucher puede dar como resultado dolor, fatiga, ictericia, dano oseo, anemia e incluso la muerte. Hay tres fenotipos clmicos de la enfermedad de Gaucher. Los pacientes con Tipo 1 manifiestan, bien tempranamente en la vida o en la primera adultez, facilmente moretones y experimentan fatiga debido a anemia, bajos niveles de plaquetas, dilatacion del hngado y el bazo, debilitamiento del esqueleto, y en algunos casos tienen insuficiencia pulmonar y renal. No hay signos de implicacion cerebral. En el Tipo II, de comienzo temprano, la dilatacion del hngado y el bazo se produce a los 3 meses de edad y hay una implicacion cerebral intensiva. Hay una alta tasa de mortalidad a los 2 anos. El Tipo III se caracteriza por dilatacion del hngado y el bazo y ataques cerebrales. El gen de p-glucocerebrosidasa esta situado en el cromosoma 1q21 humano. Su precursor protemico contiene 536 aminoacidos y su protema madura tiene una longitud de 497 aminoacidos.

En una realizacion no limitativa, glucocerebrosidasa se refiere al gen de glucosidasa de Homo sapiens, U (Gba) que comprende una secuencia de acido nucleico descrita en los N° de Registro del GenBank NM_001005741, NM_001005741, NM_001005749, NM_001005750 o NM_000157. Alternativamente, la glucocerebrosidasa puede ser codificada por cualquier molecula de acido nucleico que exhiba al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y hasta 100% de homologfa con el gen de glucocerebrosidasa (segun se determina mediante un software estandar, p. ej. BLAST o FASTA), y cualesquiera secuencias que se hibriden bajo condiciones estandar a estas secuencias.

En otra realizacion no limitativa, glucocerebrosidasa se refiere a una enzima codificada por el gen de glucosidasa humana U (Gba) (N° de Registro del GenBank NP_001005741, NP_001005742, NP_001005749, NP_001005750 o NP_000148), o cualquier otra secuencia de aminoacidos al menos 90% homologa con el mismo.

En una realizacion no limitativa, una chaperona farmacologica para glucocerebrosidasa puede ser isofagomina (IFG; (3R,4R,SR)-5-(hidroximetil)-3,4-piperidindiol), que tiene la siguiente estructura:

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El tartrato de isofagomina se ha descrito recientemente en la Patente de EE. UU. N° 7.501.439 de propietario comun, de Mugrage y cols., y se le ha asignado un numero de CAS 919364-56-0. La isofagomina tambien se puede preparar en la forma de otras sales por adicion de acidos elaboradas con una variedad de acidos organicos e inorganicos. Tales sales incluyen las formadas con cloruro de hidrogeno, bromuro de hidrogeno, acido metanosulfonico, acido sulfurico, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido oxalico, acido maleico, acido bencenosulfonico, acido toluenosulfonico y varios otros (p. ej., nitrato, fosfato, boratos, citratos, benzoatos, ascorbatos, salicilatos y similares). Tales sales se pueden formar como es conocido por los expertos en la tecnica.

Otras chaperonas farmacologicas adicionales para glucocerebrosidasa se describen en las Patentes de EE. UU. N° 6.599.919 de Fan y cols., 6.046.214 de Kristiansen y cols., 5.844.102 de Sierks y cols., y la Publicacion de Solicitud

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de Patente de EE. UU. N° 2008/0009516 de Wustman, e incluyen C-bencilisofagomina y derivados, N-alquil(C9-12)- DNJ, glucoimidazol (y derivados), C-alquil-IFG (y derivados), N-alquil-p-valeinaminas, flufenozina, N-dodecil-DNJ y calisteginas A3, B1, B2yCi.

Ademas de los trastornos hereditarios, otras deficiencias enzimaticas surgen del dano a un tejido o un organo resultante de trastornos primarios o secundarios. Por ejemplo, el tejido pancratico danado, o pancreatitis, que esta provocado por alcoholismo da como resultado una deficiencia en enzimas pancreaticas necesarias para la digestion. La pancreatitis se esta tratando actualmente usando enzimoterapia restitutiva.

Los trastornos de deficiencia de protemas se pueden tratar mediante la administracion de protemas restitutivas para mejorar o estimular procesos biologicos. Por ejemplo, a los individuos con anemia se les administra eritropoyetina recombinante (EPOGEN®, PROCRIT®, EPOIETlN®) para estimular la produccion de globulos rojos e incrementar el transporte de oxfgeno a los tejidos. Ademas, interferones recombinantes tales como interferon a 2b (INTRON A®, PEG-INTRON® o REBETOL®) e interferon R 1a (AVONEX®, BETASERON®) se administran para tratar la hepatitis B y la esclerosis multiple, respectivamente. Otras protemas adicionales administradas son desoxirribonucleasa humana recombinante I (rhDNase-PULMOZYME®), una enzima que escinde selectivamente ADN usada para mejorar la funcion pulmonar en pacientes con fibrosis qmstica; hormona estimulante de tiroides recombinante (THYROGEN®) desarrollada para el uso en pacientes con cancer de tiroides que se han sometido a tiroidectoirna casi total o total, y que por lo tanto deben tomar hormonas tiroideas; G-CSF recombinante (NEUPOGEN®) para tratar la neutropenia procedente de quimioterapia, y enzimas digestivas en individuos con pancreatitis. Otra area significativa de la terapia protemica es en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cancer con anticuerpos, que tienen un centro activo muy definido altamente espedfico. Productos terapeuticos de anticuerpo incluyen RESPIRGRAM® para el virus respiratorio sincicial, HERCEPTIN®, para el cancer de mama; REMICAID® y HUMIRA®, para artritis y enfermedades inflamatorias, y otros. Las ASSC para anticuerpos son muy conocidas, y se pueden emplear bien el antfgeno diana o bien un analogo estructuralmente relacionado (p. ej., una forma modificada de la diana activa o un mimetico).

Un "paciente" se refiere a un sujeto que ha sido diagnosticado de o se sospecha que tiene una enfermedad particular. El paciente puede ser un ser humano o un animal. Por ejemplo, un "pacientes con enfermedad de Fabry" se refiere a un individuo que ha sido diagnosticado de o se sospecha que tiene enfermedad de Fabry y tiene un a- GAL mutada. Marcadores caractensticos de la enfermedad de Fabry se pueden presentar en hemicigotos macho y portadores hembra con la misma frecuencia, aunque las hembras tfpicamente estan menos gravemente afectadas.

5.3 Produccion de protemas recombinantes

Las protemas restitutivas utiles para tratar pacientes con una deficiencia de protema, por ejemplo, a traves de enzimoterapia restitutiva, se pueden aislar y purificar usando tecnicas normales de biologfa molecular, microbiologfa y ADN recombinante dentro de la experiencia de la especialidad. Por ejemplo, acidos nucleicos que codifican la protema restitutiva se pueden aislar usando expresion de ADN recombinante segun se describe en la bibliograffa. Vease, p. ej., Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (en la presente "Sambrook y cols., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); B. E Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel y cols. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994). El acido nucleico que codifica la protema puede ser de longitud completa o estar truncado, con tal de que el gen codifique una protema biologicamente activa. Por ejemplo, una forma truncada biologicamente activa de a-Gal A, la enzima deficiente asociada con la enfermedad de Fabry, se ha descrito en la Pat. EE. UU. N° 6.210.666 de Miyamura y cols.

El gen identificado y aislado que codifica la protema diana se puede insertar a continuacion en un vector de clonacion apropiado. Se puede usar un gran numero de sistemas vector-hospedador conocidos en la especialidad. Posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plasmidos o virus modificados, pero el sistema vectorial debe ser compatible con la celula hospedadora usada. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, E. coli, bacteriofagos tales como derivados de A, o plasmidos tales como derivados de pBR322 o derivados del plasmido pUC, p. ej., vectores pGEX, pmal-c, pFLAG, etc. La insercion en un vector de clonacion se puede efectuar, por ejemplo, al ligar el fragmento de ADN en un vector de clonacion que tiene terminos cohesivos complementarios. Sin embargo, si los centros de restriccion complementarios usados para fragmentar el ADN no estan presentes en el vector de clonacion, los extremos de las moleculas de ADN se pueden modificar enzimaticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado al ligar secuencias de nucleotidos (conectores) a los terminos del ADN; estos conectores ligados pueden comprender oligonucleotidos qmmicamente sintetizados espedficos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restriccion. La produccion de la protema recombinante se puede maximizar mediante manipulaciones geneticas tales como incluir un peptido de senal en el termino N para facilitar la secrecion o una secuencia no traducida 3' que contienen un centro de poliadenilacion.

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Las construcciones usadas para transducir celulas hospedadoras son vectores derivados de virus, incluyen, pero no se limitan a, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, virus de las paperas, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis y virus variolovacunal.

Las moleculas recombinantes se pueden introducir en las celulas hospedadoras a traves de transformacion, transfeccion, infeccion, electroporacion, etc., de modo que se generan muchas copias de la secuencia genica. Preferiblemente, el gen clonado esta contenido en un plasmido vectorial lanzadera, que proporciona expansion en una celula en clonacion, p. ej., E. coli, y una purificacion facil para la insercion posterior en una lmea celular de expresion apropiada, si esto se desea.

Sistemas hospedador-vector potenciales incluyen, pero no se limitan a, sistemas de celulares de mairnfero infectados con virus (p. ej., virus variolovacunal, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insecto infectados con virus (p. ej., baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriofagos, ADN, ADN de plasmido o ADN de cosmido. Los elementos de expresion de vectores vanan en sus intensidades y especificidades. Dependiendo del sistema hospedador-vector utilizado, se puede usar uno cualquiera de un numero de elementos de transcripcion y traduccion adecuados. Las diferentes celulas hospedadoras tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento y la modificacion traduccional y postraduccional (p. ej., glicosilacion, escision [p. ej., de la secuencia de senal]) de protemas. Lmeas celulares o sistemas hospedadores apropiados se pueden elegir para asegurar la modificacion y el procesamiento deseados de la protema extrana expresada, tal como glicosilacion, sialiacion y fosforilacion. Por ejemplo, se puede usar la expresion en un sistema bacteriano para producir un producto de protema de nucleo no glicosilado. Sin embargo, una protema expresada en bacterias no se puede plegar apropiadamente. La expresion en levadura puede producir un producto glicosilado. La expresion en celulas eucarioticas puede incrementar la probabilidad de glicosilacion y plegamiento "naturales" de una protema heterologa. Por otra parte, la expresion en celulas de marnffero puede proporcionar una herramienta para reconstituir, o constituir, una protema.

La purificacion de una protema expresada recombinantemente se puede alcanzar usando metodos conocidos en la especialidad tales como precipitacion con sulfato amonico, cromatograffa en columna que contiene resinas de interaccion hidrofoba, resinas de intercambio de cationes, resinas de intercambio de aniones y resinas de cromatoenfoque. Alternativamente, se puede usar cromatograffa de inmunoafinidad para purificar la protema recombinante usando un anticuerpo policlonal o monoclonal apropiado que se une espedficamente a la protema, o a un marcador que esta fusionado a la protema recombinante. En una realizacion preferida, la pureza de la protema recombinante usada para el metodo de la presente invencion sera al menos 95%, preferiblemente al menos 97% y lo mas preferiblemente, mayor de 98%.

Las protemas restitutivas utiles para tratar pacientes con una deficiencia de protema, por ejemplo, a traves de enzimoterapia restitutiva, se pueden purificar de un sistema de expresion celular recombinante (p. ej., celulas de mamffero o celulas de insecto -veanse, generalmente, la Pat. EE. UU. N° 5,580.757 de Desnick y cols.; las Pat. EE. UU. N° 6.395.884 y 6.458.574 de Selden y cols.; la Pat. EE. UU. N° 6.461.609 de Calhoun y cols.; la Pat. EE. UU. N° 6.210.666 de Miyamura y cols.; la Pat. EE. UU. N° 6.083.725 de Selden y cols.; la Pat. EE. UU. N° 6.451.600 de Rasmussen y cols.; la Pat. EE. UU. N° 5.236.838 de Rasmussen y cols.; y la Pat. EE. UU. N° 5.879.680 de Ginns y cols.), placenta humana o leche de animal (vease la Pat. EE. UU. N° 6.188.045 de Reuser y cols.).

Otras tecnicas de smtesis para obtener la protema restitutiva adecuada para uso farmaceutico se pueden encontrar, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. N° 7.423.135, 6.534.300 y 6.537.785; la Solicitud Publicada Internacional N° 2005/077093 y las Solicitudes Publicadas de EE. UU. N° 2007/0280925 y 2004/0029779. Estas referencias se incorporan en la presente mediante referencia en su totalidad para todos los propositos.

Por otra parte, diferentes sistemas de expresion de vector/hospedador pueden afectar a reacciones de procesamiento, tales como escisiones proteolfticas, en un grado diferente. La eficacia de la expresion se puede incrementar mediante el uso de una chaperona espedfica, segun se describe en la Pat. EE. UU. N° 6.274.597, y miembros de la familia relacionados.

Segun se apunta anteriormente, un aspecto de la presente invencion proporciona un metodo para mejorar la produccion de una protema recombinante, metodo que comprende poner en contacto una celula hospedadora que expresa la protema recombinante p-glucosidasa acida con la chaperona farmacologica isofagomina espedfica para la protema recombinante.

En una realizacion no limitativa, la chaperona farmacologica puede estabilizar una protema recombinante diana en el ER de una celula que expresa la protema, y evitar la ERAD y la degradacion prematura de la protema. Al hacer esto, la chaperona farmacologica puede reducir el estres del ER asociado con la expresion de la protema recombinante, lo que a su vez puede permitir que la lmea celular de produccion mantenga una alta viabilidad y expresion de la protema.

En otras realizaciones no limitativas, la chaperona farmacologica puede estabilizar una protema recombinante expresada por una celula, e incrementar la exportacion de la protema fuera del ER de la celula e incrementar la secrecion de la protema fuera de la celula.

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En otras realizaciones no limitativas, la chaperona farmacologica puede estabilizar una protema recombinante diana fuera de una celula que expresa la protema (es decir, despues de que la protema se haya secretado al medio de cultivo celular). Al estabilizar la protema recombinante, la chaperona farmacologica puede conferir un beneficio a protemas que normalmente se deben almacenar a un pH inferior para conservar la estabilidad, y habitualmente no son estables en la mayona de los medios de cultivo celular que tfpicamente se formulan a pH neutro. Pueden resultar perdidas significativas en la actividad enzimatica mientras estas protema permanecen en el medio de cultivo celular antes de la recogida y la purificacion. Las chaperonas farmacologicas pueden estabilizar estas protemas y evitar la desnaturalizacion y la inactivacion irreversibles de la actividad de la protema en medios con un pH mayor de 5,0, por ejemplo, a un pH neutro.

En otras realizaciones no limitativas, la chaperona farmacologica puede proteger a una protema recombinante diana durante la purificacion de la protema del medio de cultivo. Si una protema recombinante no es estable en el medio, se puede desnaturalizar y ser sensible a proteolisis por proteasas contaminantes en las mezclas de purificacion. Las chaperonas farmacologicas pueden evitar esta proteolisis al estabilizar la protema y evitar que los centros proteoltticos se revelen. Por lo tanto, la chaperona farmacologica puede mejorar la integridad de la protema y/o la actividad de la enzima durante el procedimiento de purificacion.

En otras realizaciones no limitativas, la chaperona farmacologica puede proteger a una protema recombinante durante el almacenamiento y/o la preparacion de una formulacion farmaceutica. Por ejemplo, una chaperona farmacologica puede unirse a e inhibir la actividad enzimatica de factores de coagulacion (p. ej. proteasas) para asegurar que tales protemas sean digeridas proteolfticamente durante el almacenamiento y la formulacion. Las chaperonas farmacologicas tambien pueden evitar otros tipos de dano qrnmico irreversible (p. ej., oxidacion, hidrolisis o desamidacion), o inestabilidad ffsica, tal como agregacion, precipitacion y adsorcion a superficies, durante la formulacion. Ademas, la chaperona farmacologica puede estabilizar y proteger a la protema de estreses tales como pH, temperatura, estres por cizalladura, estres por congelacion/descongelacion y combinaciones de estos estreses, que de otro modo pueden contribuir a la degradacion de la protema.

La protema restitutiva puede ser una a-glucosidasa acida (GAA) recombinante, codificada por el mas predominante de nueve haplotipos observados de este gen y se produce mediante tecnologfa de ADN recombinante en una lmea celular de ovario de hamster chino. La GAA recombinante puede ser, por ejemplo, una GAA recombinante como la descrita en Kakkis y cols., 2008, "An improved a-glucosidase enzyme for Pompe disease," Abstract, 58th Annual Meeting of the ASHG; Kishnani y cols., 2007, Neurology. 68(2):99-109; las Patentes de EE. UU. N° 6.118.045 de Reuser y cols., 7.056.712 de Chen y 7.351.410 de van Bree, cada una de las cuales se incorpora mediante referencia en su totalidad para todos los propositos.

La ASSC puede ser 1-desoxinorjirimicina (1-DNJ) y la GAA puede ser GAA recombinante. Alternativamente, la ASSC puede ser a-homonojirimicina y la GAA puede ser GAA recombinante.

La ASSC puede ser castanospermina y la GAA puede ser una GAA recombinante. La ASSC (p. ej. 1- desoxinorjirimicina, a-homonojirimicina y castanospermina) se puede obtener a partir de bibliotecas sinteticas (vease, p. ej., Needels y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10700-4; Ohlmeyer y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10922-10926; Lam y cols., Publicacion PCT N°WO 92/00252; Kocis y cols., Publicacion PCT N°WO 94/28028) que proporcionan una fuente de ASSC potenciales segun la presente invencion. Bibliotecas de compuestos sinteticos estan disponibles comercialmente de Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, N.J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.) y Microsource (New Milford, Conn.). Una biblioteca qrnmica excepcional esta disponible de Aldrich (Milwaukee, Wis.). Alternativamente, bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos bacterianos, fungicos, vegetales y animales estan disponibles de, p. ej., Pan Laboratories (Bothell, Wash.) o MycoSearch (NC), o son facilmente producibles. Adicionalmente, bibliotecas y compuestos naturales y producidos sinteticamente se modifican facilmente a traves de Res. 1986; 155:119-29.

5.4 Estabilidad in vitro

Asegurar la estabilidad de una formulacion de protema restitutiva durante su penodo de conservacion es un reto importante. Por ejemplo, los viales de enzima recombinante a menudo son para un solo uso y el producto no utilizado se debe descartar. Adicionalmente, la enzima recombinante a menudo debe ser reconstituida, diluida y administrada por un profesional sanitario, y esa administracion debe efectuarse sin retraso. A menudo, las enzimas recombinantes se deben almacenar a bajas temperaturas, por ejemplo, de 2 a 8°C, y el producto solo es estable durante una cantidad de tiempo limitada, por ejemplo, hasta 24 horas.

Cuando la ASSC y la protema restitutiva estan presentes en la misma composicion, las composiciones formuladas de la invencion proporcionan composiciones mas estables. Ademas de estabilizar la protema administrada in vivo, la ASSC se une a y estabiliza reversiblemente la conformacion de la protema restitutiva in vitro, evitando de ese modo la agregacion y la degradacion, y prolongando el penodo de conservacion de la formulacion. El analisis de la interaccion ASSC/protema restitutiva se puede evaluar usando tecnicas muy conocidas en la especialidad, tales como, por ejemplo, calorimetna de barrido diferencial o dicrofsmo circular.

Por ejemplo, cuando una formulacion acuosa inyectable de la composicion se suministra en un vial con tapon para la retirada del contenido usando una aguja y una jeringa, la presencia de una ASSC inhibe la agregacion de la protema restitutiva. El vial podna ser bien para un solo uso o bien para multiples usos. La formulacion tambien se puede suministrar como una jeringa precargada. En otra realizacion, la formulacion esta en un estado seco o liofilizado, que 5 requerina la reconstitucion con un patron o un diluyente fisiologico suministrado hasta un estado Kquido. En este

caso, la presencia de una ASSC estabilizana la protema restitutiva durante y despues de la reconstitucion para evitar la agregacion. Cuando la formulacion es un lfquido para la administracion intravenosa, tal como en una bolsa esteril para la conexion a un conducto o cateter para administracion intravenosa, la presencia de una ASSC conferina el mismo beneficio.

10 Ademas de estabilizar la protema restitutiva que se va a administrar, la presencia de una ASSC puede permitir que la formulacion de protema restitutiva se almacene a un pH neutro de alrededor de 7,0-7,5. Esto conferira un beneficio a protemas que normalmente se deben almacenar a un pH inferior para conservar la estabilidad. Por ejemplo, las enzimas lisosomicas, tales como GAA, tfpicamente retienen una conformacion estable a un pH bajo (p. ej., 5,0 o inferior). Sin embargo, el almacenamiento prolongado de la enzima restitutiva a un pH bajo puede acelerar 15 la degradacion de la enzima y/o la formulacion.

6. Ejemplos

La presente invencion se describe adicionalmente por medio de los ejemplos, presentados posteriormente.

Ejemplo 1: Estabilidad de a-glucosidasa acida con ataque termico

La estabilidad de GAA humana recombinante (Myozyme®, Genzyme Corp.) con y sin 100 |jM de la ASSC 20 hidrocloruro de 1-desoxinorjirimicina (DNJ) se determino a traves de un ensayo de estabilidad termica que utiliza calor para inducir la desnaturalizacion de protemas. La desnaturalizacion se verifica usando un colorante SYPRO Orange que emite fluorescencia al unirse a aminoacidos hidrofobos (que no estan expuestos en una protema plegada).

La estabilidad termica se interpreto a pH 7,4 para dos formulaciones, que corresponden al pH del ER. Segun se 25 muestra en la Figura 1, la formulacion que contiene 100 jM de DNJ a pH 7,4 requena significativamente mas calor para la desnaturalizacion, y asf es mas estable, en comparacion con la formulacion sin la ASSC a pH 7,4.

Ejemplo 2: La 1-desoxinojirimicina (DNJ) evita la perdida de actividad de a-glucosidasa acida durante la incubacion prolongada a 37°C

La actividad de GAA residual se determino para cuatro formulaciones:

30 (1) Myzozyme sola a pH 7,4;

(2) Myzozyme mas DNJ 50 jM a pH 7,4;

(3) Myzozyme sola a pH 5,2;

(4) Myzozyme mas DNJ 50 jM a pH 5,2.

La actividad se midio, basandose en el % de actividad inicial (t=0) a lo largo de 24 horas. Se ensayo la actividad de 35 la enzima GAA de las muestras basandose en la hidrolisis del sustrato fluorogenico 4-MU-a-glucosa a las 0, 3, 6 y 24 horas. La actividad de GAA se expreso como % de la actividad inicial, es decir actividad residual.

Segun se muestra en la Figura 2A, la formulacion (1) anterior (sin la ASSC) perdfa actividad a lo largo del tiempo, teniendo solamente alrededor de 20% de su actividad inicial 24 horas despues de la administracion. En contraste, la formulacion (2) mantema la mayona, si no la totalidad, de su actividad inicial a lo largo de 24 horas. Ambas 40 formulaciones a pH 5,2 (formulaciones (3) y (4) anteriores) manteman la mayona de su actividad inicial a lo largo de 24 horas.

A fin de determinar si la perdida de actividad enzimatica inicial se correlaciona con un fallo para mantener una conformacion apropiada, se realizo un experimento de estabilidad termica de SYPRO Orange sobre las muestras anteriores segun se describe generalmente en el Ejemplo 1. En este experimento de estabilidad termica, la 45 concentracion de DNJ se disminuyo hasta 10 jM en las formulaciones (2) y (4). Basandose en este experimento, se estimo el % de GAA plegada y se represento en la Figura 2B. La disminucion en la cantidad de GAA plegada a lo largo de 24 horas en la Figura 2B para la formulacion (1) se correlaciona con la perdida de actividad mostrada en la Figura 2A para esta misma formulacion general.

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 3: La DNJ incrementa la estabilidad de GAA durante el ataque termico

Un experimento de estabilidad termica como el descrito generalmente en el Ejemplo 1 se realizo sobre cuatro composiciones:

(1) Composicion solamente de Myozyme;

(2) Myozyme mas 1 pM de 1-DNJ-HCl;

(3) Myozyme mas 10 pM de 1-DNJ-HCl;

(4) Myozyme mas 100 pM de 1-DNJ-HCl;

Segun se muestra en la Figura 3, el DNJ-HCl incrementa la termoestabilidad de GAA como es evidente por los incrementos en la temperatura de fusion de GAA, de un modo dependiente de la dosis.

Ejemplo 4: La isofagomina (IFG) incrementa la estabilidad de p-glucosidasa acida durante el ataque termico

Un experimento de estabilidad termica como el descrito generalmente en el Ejemplo 1 se realizo sobre tres composiciones de GCasa (Cerezyme®):

(1) Composicion solamente de GCasa; pH 7,4

(2) GCasa mas 10 pM de IFG; pH 7,4

(3) GCasa mas 100 pM de IFG; pH 7,4

Segun se muestra en la Figura 4, la IFG incrementa la estabilidad termica de GCasa de un modo dependiente de la dosis, como es evidente por los incrementos en la temperatura de fusion de la protema.

Ejemplo 5: Estabilidad termica de GCasa en presencia de IFG El porcentaje de GCasa desplegada se determino para tres formulaciones:

(1) GCasa sola a pH 5,2

(2) GCasa sola a pH 7,4;

(3) GCasa con IFG 10 pM; pH 7,4

Para determinar si la IFG evitaba el despliegue de GCasa a 37°C y pH neutro, se realizo un experimento de estabilidad de SYPRO Orange sobre las muestras anteriores segun se describe generalmente en el Ejemplo 1. En este experimento de estabilidad termica, la concentracion de IFG era 10 pM en la formulacion (3). Basandose en los resultados de la Figura 5, la IFG evitaba el despliegue de GCasa bajo las condiciones especificadas.

Ejemplo 6: La 1-desoxigalactonorjirimicina (DGJ) incrementa la estabilidad de a-Gal A durante el ataque termico

Un experimento de estabilidad termica como el descrito generalmente en el Ejemplo 1 se realizo sobre tres composiciones de a-Gal A (Fabrazyme®):

(1) Composicion solamente de a-Gal A; pH 7,4

(2) a-Gal A mas 10 pM de DGJ; pH 7,4

(3) a-Gal A mas 100 pM de DGJ; pH 7,4

Segun se muestra en la Figura 6, la DNJ incrementa la estabilidad termica de a-Gal A de un modo dependiente de la dosis como es evidente por los incrementos en la temperatura de fusion de la protema.

Ejemplo 7: Las chaperonas farmacologicas incrementan los niveles de actividad de protema recombinante a partir de celulas COS-7 transfectadas transitoriamente

Celulas COS-7 se transfectaron transitoriamente con vector vado, un plasmido que codifica para el gen de GBA o un plasmido que codifica para el gen de GLA. Las diversas transfecciones transitorias se incubaron con 100 pM de 5 las chaperonas farmacologicas indicadas (IFG, DGJ o DNJ). Despues de 48 horas de expresion de protema, se recogio el medio acondicionado de cada transfeccion y se determino el nivel de actividades de p-glucosidasa acida o a-Gal A despues de la captura de protemas secretadas con cuentas de concanavalina A-agarosa. Esta etapa de captura en concanavalina A era necesaria para eliminar la inhibicion potencial de actividades enzimaticas por las chaperonas farmacologicas durante el curso de la determinacion de la actividad usando los sustratos fluorogenicos 10 apropiados (4-MU-p-glucosa para GCasa; 4-MU-p-galactosa para a-Gal A).

Segun se muestra en la Figura 7, la incubacion con IFG o DGJ incrementaba las actividades de p-glucosidasa acida o a-Gal A, respectivamente. Cuando la DNJ se incubaba en la expresion transitoria de p-glucosidasa acida, no se observaba incremento en la actividad de la enzima. Esta observacion indica que los incrementos en la actividad de la enzima se deben a interacciones espedficas con una chaperona farmacologica y/o un inhibidor de la protema 15 conocidos.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para mejorar la produccion de una protema de p-glucosidasa acida recombinante, metodo que comprende

   poner en contacto una celula hospedadora in vitro con isofagomina, en donde la celula hospedadora expresa la protema recombinante; y

   purificar la p-glucosidasa acida del medio de cultivo celular despues de la secrecion por la celula huesped, en donde la isofagomina estabiliza la protema de p-glucosidasa acida durante la purificacion.
2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la celula hospedadora es una celula de mairnfero.
3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la celula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en celulas CHO, celulas HeLa, celulas HEK-293, celulas 293T, celulas COS, celulas COS-7, mioblastos primarios de raton y celulas NIH 3T3.
4. 4. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contacto de una celula hospedadora con la isofagomina estabiliza la protema en una conformacion silvestre apropiada que no se degrada en el retmulo endoplasmico de la celula.
5. 5. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contacto de una celula hospedadora con la isofagomina reduce el estres del retmulo endoplasmico asociado con la sobreexpresion de la protema recombinante.
6. 6. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contacto de una celula hospedadora con la isofagomina incrementa la exportacion de la protema fuera del retmulo endoplasmico de la celula.
7. 7. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contacto de una celula hospedadora con la isofagomina incrementa la secrecion de la protema fuera de la celula.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el contacto de una celula hospedadora con la isofagomina incrementa la estabilidad de la protema a un pH mayor de 5,0.
9. 9. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas almacenar la p-glucosidasa acida recombinante purificada en un medio que tiene un pH mayor de 5,0; en donde el medio contiene isofagomina para estabilizar la p- glucosidasa acida y prevenir la desnaturalizacion y la inactivacion irreversibles de la actividad de la protema.
10. 10. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la p-glucosidasa acida recombinante se purifica para que sea al menos 95% pura.
11. 11. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la purificacion de la p-glucosidasa acida recombinante comprende precipitacion con sulfato amonico, cromatograffa en columna que contiene una resina de interaccion hidrofoba, poner en contacto la 13-glucosidasa acida silvestre humana recombinante con una resina de intercambio de cationes, poner en contacto la 13-glucosidasa acida silvestre humana recombinante con una resina de intercambio de aniones o poner en contacto la 13-glucosidasa acida silvestre humana recombinante con una resina de cromatoenfoque.
12. 12. Un metodo segun la reivindicacion 1, metodo que comprende poner en contacto una celula hospedadora CHO que expresa la p-glucosidasa recombinante con isofagomina o una sal de la misma; y

    purificar la p-glucosidasa acida del medio de cultivo celular despues de la secrecion por la celula hospedadora, en donde la isofagomina o la sal de la misma estabiliza la p-glucosidasa acida durante la purificacion.