ES2581480T3

ES2581480T3 - Compuestos inhibidores de crecimiento tumoral y métodos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2581480T3
Application number: ES12198310.0T
Authority: ES
Inventors: Åsa KARLSSON; Oliver Von Stein; Arezou Zargari; Nikolai Kouznetsov
Original assignee: Index Pharmaceuticals AB
Current assignee: Index Pharmaceuticals AB
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2016-09-06
Anticipated expiration: 2028-04-30
Also published as: JP5844779B2; EP2573176B1; WO2008136748A1; EP2160465A4; EP2573176A1; JP5346923B2; DK2573176T3; US20100196356A1; JP2013255508A; EP2160465A1; EP2160465B1; US8309529B2; WO2008136748A8; JP2010525811A

Abstract

Oligonucleótido aislado que consiste en una secuencia según SEQ ID NO 4.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos inhibidores de crecimiento tumoral y metodos de uso de los mismos Campo tecnico

La presente solicitud se refiere al campo de la medicina, y en particular a compuestos novedosos y a metodos para su uso en el tratamiento de cancer o bien solos o bien en combinacion con terapias existentes y futuras.

Tecnica anterior

El tratamiento de cancer esta entrando en una era de enfoques de seleccion de diana. Un enfoque de este tipo es el uso del sistema inmunitario para reconocer y eliminar celulas malignas. Los oligonucleotidos CpG sinteticos (ADN CpG) son una clase relativamente nueva de agentes que tienen la capacidad de estimular una respuesta inmunitaria potente, organizada, especifica de tumor (KRIEG, A M. Lymphocyte activation by CpG dinucleotide motifs in prokaryotic DNA. Trends Microbiol. 1996, vol .4, n.° 2, pags. 73-6; y KRIEG, A M, et al. Mechanisms and therapeutic applications of immune stimulatory ADN CpG. Pharmacol Ther. 1999, vol .84, n.° 2, pags. 113-20. ).

Estudios recientes demuestran que existen al menos tres clases de secuencias de ADN CpG, cada una con diferentes caracteristicas fisicas y efectos biologicos. Estudios preliminares en varios modelos animales de cancer sugieren que el ADN CpG puede tener muchos usos en inmunoterapia contra el cancer. Los ADN CpG tienen la capacidad de inducir regresion tumoral activando la inmunidad innata, potenciando la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y sirviendo como adyuvantes de vacunas potentes que provocan una respuesta inmunitaria especifica, protectora. Ensayos clinicos anteriores indican que el ADN CpG puede administrarse de manera segura a seres humanos y hay estudios en curso para entender como pueden desempenar un papel estos agentes en la inmunoterapia contra el cancer (WOOLDRIDGE, J E , et al. CpG DNA and cancer immunotherapy: orchestrating the antitumour immune antitumour. Curr Opin Oncol. Nov de 2003, vol. 15, n.° 6, pags. 440-5. )

Una patente anterior (documento US 6.498.147 B, THE SCRIPPS INSTITUTE, 2002-12-24) presento oligonucleotidos antisentido y dio a conocer inhibicion antisentido de celulas tumorales in vitro, asi como un experimento con animales que muestra inhibicion antisentido de crecimiento tumoral in vivo en ratones C57B1/6 singenicos. Se trato a los ratones con inyecciones intraperitoneales de 40 mg/g de oligodesoxinucleotidos sentido y antisentido. El analisis histologico mostro necrosis tumoral focal seguida por necrosis segmentaria extendida.

La leucemia linfocitica cronica de celulas B (LLC-B) es la leucemia mas comun en el mundo occidental. La LLC-B es un cancer de los globulos blancos y la medula osea, caracterizada por proliferacion descontrolada y/o muerte celular (apoptosis) reducida de celulas sanguineas, especificamente de los linfocitos B, y es la forma mas extendida de leucemia en adultos. Su incidencia se aproxima al 50 por 100.000 tras los setenta anos de edad. La leucemia tiene habitualmente un transcurso natural prolongado de anos e incluso decadas, pero en ultima instancia acelera a medida que las celulas adquieren defectos geneticos secuenciales. La LLC-B difiere de muchos otros tumores malignos en que las celulas monoclonales de la LLC-B se acumulan de manera continuada, debido a una vida prolongada de manera anomala, lo que probablemente es una consecuencia de interacciones alteradas entre celulas defectuosas de LLC-B y su entorno. Las citocinas son factores esenciales en la homeostasis celular y el dialogo celula-celula, y se propone que son criticas en este medio (CALIGARIS-CAPPIO eta/., 1999, ROZMaN et al., 1995).

No se ha encontrado ningun acontecimiento de transformacion inicial para la LLC-B. Las translocaciones cromosomicas, aunque se producen principalmente durante el proceso de transposicion genica y son comunes en otros tumores malignos linfoides, son poco frecuentes en la LLC-B. Las anomalias tienden a aumentar en frecuencia y en numero durante el transcurso de la enfermedad. Cuando se encuentran translocaciones, tienden a dar como resultado perdida genetica mas que la formacion de un gen de fusion o sobreexpresion de un oncogen. Las anomalias geneticas mas comunes en la LLC-B son deleciones 13q (50% de los casos), deleciones 13q4 (asociadas con transcurso inactivo), trisomia 12 (12q13-15, con sobreexpresion de la oncoproteina MDMQ que suprime p53) y deleciones 1lq22-q23 (20% de los casos) (GAIDAN et al., 1991 et al, DOHNER et al., 1999).

Las celulas LLC-B expresan moleculas de superficie tales como CD23 (receptor de baja afinidad para IgE), CD25 (cadena a de IL-2R) y CD27 (molecula coestimuladora), que en otros entornos indican un estado de activacion. La expresion y asociacion de varias proteinas regulan estrechamente el proceso de apoptosis. El equilibrio relativo de estas proteinas controla la vida celular. Los genes responsables de este sistema incluyen la familia BCL-2, el factor de necrosis tumoral y genes tales como Myc y p53 (OSORIO et al., 1999). Todas las rutas de muerte promovidas por estos genes parecen tener una cascada de “demolicion” comun, representada por la familia de proteasas de las caspasas. Las celulas de la LLC-B expresan de manera sistematica altos niveles de productos de los miembros anti- apoptoticos de la familia BCL-2 (bad-2, bcl-n, bax), mientras que el inhibidor de la funcion de Bcl-2, Bcl- 6, esta marcadamente reducido. El mecanismo implicado en la sobreexpresion de Bcl-2 no esta claro actualmente. Las celulas leucemicas de LLC-B son negativas o debilmente positivas para Fas. Generalmente permanecen resistentes a la muerte mediada por el anticuerpo anti-Fas incluso tras la expresion de Fas inducida por estimulacion. En casos

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sensibles poco frecuentes, se produce muerte celular independientemente de la expresion de Bcl-2 por un mecanismo todavia no caracterizado. Pareceria que la sobreexpresion de Bcl-2 y la ruta de Fas son mecanismos implicados en la patofisiologia de LLC-B pero no necesariamente acontecimientos causantes criticos. Es probable que mediadores que incluyen citocinas unan el factor etiologico inicial con las rutas terminales de la apoptosis.

La mayoria de las celulas de LLC-B estan en la fase G0 del ciclo celular y pueden no inducirse para entrar en fase proliferativa mediante metodos convencionales tales como concanavalina-A, esteres de forbol o reticulacion de receptor, que inducen la proliferacion de linfocitos normales. Solo un pequeno subconjunto de celulas parece ampliar la poblacion clonal en respuesta a una senal promotora desconocida. Las citocinas que promueven la proliferacion pueden proporcionar este estimulo in vivo (DANCESCU et al., 1992).

Las celulas de LLC-B se acumulan a expensas de la reserva de celulas B normales. Por otra parte, las celulas T totales habitualmente estan aumentadas. Los linfocitos T de medula osea son predominantemente celulas CD4+ tal como se observa en trastornos autoinmunitarios tales como artritis reumatoide y sarcoidosis. Frecuentemente hay un fenotipo de citocina predominante de Th2 en sangre periferica. Tambien se han notificado anomalias en el repertorio de TCR. Los informes indican que los linfocitos T y las celulas estromales pueden desempenar un papel clave en soportar un entorno capaz de perpetuar la vida de las celulas de LLC-B. Tanto las celulas malignas como su celula sequito de celulas T expresan una variedad de moleculas de superticie y sus receptores: CD5 y su ligando CD72, CD27 y CD70. Estos hallazgos abren diversas posibilidades de interaccion mutua que podrian dar como resultado directa o indirectamente (citocinas) la auto-conservacion celular. Una supervivencia dilatada de este tipo podria aumentar a su vez las posibilidades de acumulacion de mutaciones genicas e inestabilidad genetica, lo que favorece la progresion de la enfermedad a traves de regulacion incorrecta de puntos de comprobacion del ciclo celular, y resistencia a terapia citotoxica (KLEIN et al., 2000).

La interaccion simbiotica entre las celulas de LLC-B y su entorno esta ciertamente casi medida por la secrecion de citocinas y modulada por moleculas de adhesion. La investigacion de la implicacion de citocinas en LLC-B ha generado un volumen de datos sustancial que apoyan o refutan diversas citocinas como mediadores de la proliferacion y la vida prolongada en esta leucemia. Las investigaciones sobre produccion de citocinas han demostrado senales de reaccion en cadena de la polimerasa con transcripcion inversa para IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL7, TNF-p y TNF-a (PISTOIA et al., 1997). Estos hallazgos se han contradicho por otros estudios que mostraron resultados negativos para IL4, IL3 y IL6 (TANGYE et al., 1999). En contraposicion, se ha demostrado la secrecion de TGF-p, asi como de IL10, en linfocitos B normales. No se ha notificado otra produccion de citocinas como constitutiva para estas celulas.

La inmunoterapia del cancer se ha explorado a lo largo de un siglo, pero ha sido solo en la ultima decada que se han introducido diversos productos basados en anticuerpos en el tratamiento de pacientes con diversas formas de cancer. En la actualidad, es una de las areas mas activas de investigacion clinica, con ocho productos terapeuticos ya aprobados en oncologia. Loa anticuerpos contra marcadores asociados a tumores han formado parte de la practica medica en inmunohistologia y en inmunoensayos in vitro durante varias decadas, y ahora estan reconociendose cada vez mas como agentes biologicos importantes para la deteccion y el tratamiento de cancer (STROME et al., 2007). La ingenieria molecular ha mejorado las expectativas para tales agentes terapeuticos basados en anticuerpos, dando como resultado constructos diferentes y anticuerpos humanizados o humanos que pueden administrarse frecuentemente.

CD20 se expresa de manera variable sobre la superticie de las celulas B en pacientes con LLC, expresando algunas celulas B de pacientes bajos niveles del antigeno CD20. CD20 (antigeno de diferenciacion restringido a linfocitos B humanos) es una proteina transmembrana hidrofoba con un peso molecular de aproximadamente 35 kD ubicada en linfocitos pre-B y B maduros. El antigeno tambien se expresa en mas del 90% de las celulas B en linfomas no Hodgkin (LNH), pero no se encuentra en celulas madre hematopoyeticas, celulas pro B, celulas plasmaticas normales u otros tejidos normales. CD20 regula una etapa(s) temprana en el proceso de activacion para el inicio y la diferenciacion del ciclo celular, y posiblemente funciona como canal de iones calcio. CD20 no se libera de la superficie celular y no se internaliza tras la union del anticuerpo. El antigeno CD20 libre no se encuentra en la circulacion (PEScOvITZ, 2006).

El anticuerpo anti-CD20, rituximab, que es un anticuerpo monoclonal quimerico murino/humano obtenido por ingenieria genetica dirigido contra CD20 humano (Rituxan® o MabThera®, de Genentech, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.) se usa para el tratamiento de pacientes con LLC-B y linfoma no Hodgkin de celulas B, positivo para CD20, folicular o de bajo grado con recidiva o que no responde al tratamiento. Rituximab funciona reclutando las defensas naturales del organismo para atacar y destruir las celulas B a las que se une a traves del antigeno CD20. Estudios del mecanismo de accion in vitro han demostrado que rituximab se une al complemento humano y lisa lineas linfoides de celulas B a traves de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) (REFF et al., 1994). Adicionalmente, tiene actividad significativa en ensayos para citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Estudios preclinicos in vivo han demostrado que rituximab reduce celulas B de la sangre periferica, los ganglios linfaticos y la medula osea de monos cinomolgos, presumiblemente a traves de procesos mediados por celulas y el complemento (REFF et al., 1994). Aunque rituximab se ha usado con cierto exito en pacientes con LLC, en analisis de los pacientes con LLC muestra que la densidad de CD20 sobre la superficie de las

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celulas de LLC-B es bastante variable con algunas celulas B de pacientes que expresan niveles muy bajos del antigeno CD20. El tratamiento tipico para tumores malignos de celulas B, ademas de rituximab, es la administracion de radioterapia y agentes quimioterapicos. En el caso del LLC, se usara radioterapia externa convencional para destruir celulas malignas. Sin embargo, los efectos secundarios son un factor limitante en este tratamiento. Otro tratamiento ampliamente usado para los tumores malignos hematologicos es la quimioterapia. La quimioterapia de combinacion tiene cierto exito en alcanzar remisiones parciales o completas. Desgraciadamente, estas remisiones obtenidas a traves de quimioterapia a menudo no son duraderas.

A la inversa, se ha encontrado que la expresion de CD23 esta presente de manera sistematica a niveles superiores en LLC-B. El antigeno de diferenciacion de leucocitos CD23 es una glucoproteina transmembrana de tipo II de 45 kD expresada en varias lineas de linaje hematopoyetico, que funciona como un receptor de baja afinidad para IgE (FcyRII) (PATHAN et a/., 2008). Es un miembro de la familia de lectina de tipo C y contiene un tallo de superhelice a- helicoidal entre el dominio de union de lectina extracelular y la region transmembrana. Se cree que la estructura del tallo contribuye a la oligomerizacion de CD23 unido a membrana para dar un trimero durante la union a su ligando (por ejemplo, IgE). Tras la proteolisis, el CD23 unido a membrana da lugar a varias especies de peso molecular de CD23 soluble (sCD23) (37 kD, 29 kD y 16 kD). Ademas de estar implicado en regular la produccion de IgE, tambien se ha especulado que CD23 promueve la supervivencia de celulas B del centro germinal. La expresion de CD23 esta altamente regulada por incremento en celulas B foliculares activadas normales y en las celulas de LLC-B.

Lumiliximab es un anticuerpo monoclonal quimerico anti-CD23 (de Biogen Idec, ensayos clinicos actualmente en curso) que alberga regiones variables de macaco y regiones constantes humanas (IgG1, k) y se desarrollo originalmente para inhibir la produccion de IgE mediante celulas B de sangre humana activadas. Ahora esta en un ensayo de Fase II para su uso en pacientes con LLC-B. Estudios in vitro han demostrado que lumiliximab induce apoptosis dependiente de caspasa en celulas de LLC-B a traves de la ruta de muerte mitocondrial (PATHAN et a/., 2008). Por tanto, parece inducir apoptosis de celulas tumorales a traves de un mecanismo diferente de rituximab.

Recientemente se han aprobado otros diversos anticuerpos para el tratamiento de cancer. Alemtuzumab (Campath® o MabCampath®, un anticuerpo anti-CD52 de Ilex Pharmaceuticals) (KEATING et a/., 2002) se aprobo en 2001 para el tratamiento de la LLC. Bevacizumab (Avastin®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA) es un AcM IgG1 humanizado dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) usado en el tratamiento del cancer colorrectal, cancer de pulmon de celulas pequenas y cancer de mama. Trastuzumab (Herceptin® de Roche) es un AcM IgG1 humanizado que es eficaz contra tumores de cancer de mama metastasico que sobreexpresan la diana HER-2 (STROME et a/., 2007).

Con el fin de hacer que los farmacos de anticuerpos sean mas eficaces, seria util una regulacion por incremento de las dianas antigenicas especificas sobre la superficie de las celulas tumorales. Una forma de obtener tal efecto podria ser estimular las celulas con oligonucleotidos inmunomoduladores. Pueden obtenerse efectos inmunoestimuladores a traves del uso de oligodesoxinucleotidos (ODN) basados en ADN sinteticos que contienen motivos Cpg no metilados. Tales ODN CpG tienen efectos altamente inmunoestimuladores sobre leucocitos humanos y murinos, induciendo proliferacion de celulas B; secrecion de citocinas e inmunoglobulinas; actividad litica de linfocitos citoliticos naturales (NK) y secrecion de IFN-gamma; y activacion de celulas dendriticas (DC) y otras celulas presentadoras de antigenos para expresar moleculas coestimuladoras y secretar citocinas, especialmente las citocinas de tipo Th1 que son importantes en promover el desarrollo de respuestas de celulas T de tipo Th1 (KRIEG et al, 1995). El aumento en la densidad de receptores por ODN CpG podria estar mediado a traves de un efecto directo de los oligonucleotidos sobre las celulas, o a traves de la induccion de citocinas. Un aumento en la densidad de antigenos o un aumento en la poblacion de celulas que expresan los receptores diana permitiria que los anticuerpos destruyesen las celulas tumorales mas eficazmente, o bien a traves de promover la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o bien la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).

El documento WO 95/35032 se refiere a oligonucleotidos (antisentido) que se hibridan con ARNm de NF-kB y a metodos de usar los mismos para suprimir procesos que dependen de la activacion de NF-KB. Tales procesos estan asociados normalmente con trastornos tales como los mediados por respuestas inmunitarias o de citocinas (por ejemplo, choque septico o no septico), asi como aquellos trastornos inducidos por agentes infecciosos tales como retrovirus, mas especificamente, HIV y VLTH.

Hay indicios de que el motivo CpG solo no es responsable de la eficacia de los oligonucleotidos. Hay incluso indicios de que este motivo no es necesario para la funcion deseada.

Independientemente de los esfuerzos considerables invertidos en desarrollar enfoques terapeuticos para el cancer basados en oligonucleotidos, y el exito ocasional notificado hasta ahora, todavia sigue existiendo la necesidad de nuevos compuestos y modos de administracion, que muestren eficacia mejorada y efectos secundarios minimos o ninguno.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que secuencias de oligonucleotido especificas cuando

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se administran por via subcutanea o en particular cuando se administran por via topica sobre una membrana mucosa, por ejemplo por via oral, via pulmonar, via intranasal, via rectal o via intravaginal, tienen un profundo efecto sobre diversas formas de cancer humano tal como se confirma in vivo, en estudios con animales, e in vitro, usando PBMC de pacientes con LLC y sujetos sanos.

Ademas, se han desarrollado y sometido a prueba secuencias novedosas que muestran efectos terapeuticos pronunciados o bien solas o bien en combinacion con otros tratamientos. Los oligonucleotidos se usan para inducir apoptosis, para activar celulas NK, para inhibir la migracion de neutrofilos y en particular para aumentar la expresion de receptores de la superficie celular. Los oligonucleotidos dados a conocer pueden usarse en combinacion con enfoques inmunologicos para tratar el cancer, por ejemplo anticuerpos monoclonales dirigidos a receptores especificos. Las realizaciones de la invencion se definen en las reivindicaciones adjuntas, incorporadas en el presente documento como referencia.

Breve descripcion de los dibujos

La invencion se describira en detalle mas minucioso en la siguiente descripcion, los ejemplos no limitativos y las reivindicaciones, con referencia a los dibujos adjuntos en los que

La figura 1 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a lo largo del tiempo para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 150 pg de la sustancia de SEQ ID NO. 6, en comparacion con control (PBS);

la figura 2 es un grafico como la figura 1, que muestra en este caso una comparacion entre la sustancia de SEQ ID NO. 6, administrada por via subcutanea (bolo de 50 pg) y por via intranasal (50 pg), en comparacion con control (PBS);

la figura 3 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 50 pg SEQ ID NO. 7, en comparacion con control (PBS);

la figura 4 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 50 pg SEQ ID NO. 1, en comparacion con control (PBS);

la figura 5 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 50 pg SEQ ID NO. 2, en comparacion con control (PBS);

la figura 6 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 50 pg SEQ ID NO. 3, en comparacion con control (PBS);

la figura 7 es un grafico que muestra crecimiento tumoral medido como volumen tumoral (mm3) a para ratones con linfoma RMA subcutaneo inducido, tras la administracion subcutanea de 50 pg SEQ ID NO. 4, en comparacion con control (PBS);

la figura 8 es un diagrama de barras que muestra el efecto reductor del crecimiento sobre una linea de celulas de cancer de colon humanas HCT116 in vitro, tras la administracion de los compuestos segun SEQ ID NO. 1 - 7, en la que “+” y “-” indican un control positivo y negativo, respectivamente.

La figura 9 es un diagrama de barras que muestra induccion de apoptosis en una linea de celulas de cancer de colon humanas HCT116 in vitro, tras la administracion de los compuestos segun SEQ ID NO. 1 - 7, en la que “+” y “-” indican un control positivo y negativo, respectivamente.

La figura 10 consiste en tres diagramas de barras (10 a, b y c) que muestran el efecto sobre la expresion de los marcadores de proliferacion de celulas B, CD20, CD40 y CD54 en un modelo de linfoma de celulas B humanas in vitro, tras la administracion de los compuestos segun SEQ ID NO. 1 - 7;

la figura 11 consiste en dos diagramas de barras (11 a y b) que muestran el efecto sobre la expresion de los marcadores de activacion de celulas B, CD69, CD80 y CD86 respectivamente en un modelo de linfoma de celulas B humanas in vitro, tras la administracion de los compuestos segun SEQ ID NO. 1 - 7; y

la figura 12 es un diagrama de barras que muestra el efecto sobre la expresion del marcador de apoptosis CD95 en un modelo de linfoma de celulas B humanas in vitro, tras la administracion de los compuestos segun SEQ ID NO. 1 - 7.

lo largo del tiempo de la sustancia de

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La figura 13 es un grafico que muestra como inducen los compuestos experimentales la regulacion por incremento de CD20n sobre celulas B de pacientes con LLC. A la concentracion sometida a prueba, 10 pM, los compuestos IDXs0022, 0038 y 0071 muestran todos ellos un efecto significativo. Estos compuestos corresponden a SEQ ID NO 3, 8 y 9 en la tabla 1.

La figura 14 muestra de manera similar la regulacion por incremento de CD80 sobre celulas B de pacientes con LLC. Tambien en este caso, los compuestos representados por SEQ ID NO 3, 8 y 9 muestran efecto en comparacion con el control no tratado.

La figura 15 muestra como inducen los compuestos experimentales la activacion de celulas NK en PBMC de pacientes con LLC. De nuevo, los compuestos representados por SEQ ID NO 3, 8 y 9 muestran efecto en comparacion con el control no tratado.

La figura 16 muestra que los compuestos experimentales inducen apoptosis de celulas T en PBMC de pacientes con LLC. Los compuestos sometidos a prueba muestran efecto y el compuesto IDXs0022, correspondiente a SEQ ID NO 3 es lo mas potente a la concentracion sometida a prueba, 10 pM.

La figura 17 muestra que los compuestos experimentales tambien inducen apoptosis de celulas B en PBMC de pacientes con LLC. Todos los compuestos sometidos a prueba muestran efecto, y el compuesto IDXs0022, correspondiente a SEQ ID NO 3 es de nuevo lo mas potente a la concentracion sometida a prueba, 10 pM.

La figura 18 muestra la regulacion por incremento de la citocina IL-6 en PBMC de un control sano para SEQ ID NO 3 a la concentracion de 25 pM, y tras 30 min, 2 h y 6 h de exposicion, en comparacion con pacientes no tratados.

La figura 19 muestra la regulacion por incremento de la citocina IL-10 en PBMC de un control sano para SEQ ID NO 3 a la concentracion de 25 pM, y tras 30 min, 2 h y 6 h de exposicion, en comparacion con pacientes no tratados.

La figura 20 muestra la regulacion por incremento de la citocina IP-10 en PBMC de un control sano para SEQ ID NO 3 a la concentracion de 25 pM, y tras 30 min, 2 h y 6 h de exposicion, en comparacion con pacientes no tratados.

La figura 21 muestra la regulacion por incremento de la expresion de CD20 en PBMC de controles sanos para SEQ ID NO 3 a las concentraciones 0,1, 1, 10 y 25 pM, y tras 30 min, 2 h y 6 h de exposicion, en comparacion con pacientes no tratados y 72 h de exposicion.

La figura 22 muestra la activacion de celulas NK en PBMC de controles sanos a diferentes concentraciones, y tras 30 min, 2 h y 6 h de exposicion, en comparacion con pacientes no tratados y 72 h de exposicion, usando SEQ ID NO 3.

La figura 23 muestra la expresion de CD20 medida en PBMC de tres controles sanos, lograda mediante la administracion de SEQ ID nO 3 a 10 pM.

La figura 24 muestra la induccion de activacion de celulas NK (CD69) lograda por SEQ ID NO 3 a 10 pM, en comparacion con pacientes no tratados y control positivo, SEQ ID NO 6.

Descripcion

Antes de describir la invencion en detalle, ha de entenderse que esta invencion no se limita a las piezas componentes particulares de los dispositivos descritos ni a las etapas de procedimiento de los metodos descritos, ya que tales dispositivos y metodos pueden variar. Tambien ha de entenderse que la terminologia usada en el presente documento es unicamente para fines de describir las realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitativa. Debe observarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un,” “uno/una” y “el/la” tambien incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una secuencia” incluye mas de tal secuencia, y similares.

Ademas, el termino “aproximadamente” se usa para indicar una deviacion de +/- el 2% del valor dado, preferiblemente +/- el 5% y lo mas preferiblemente +/- el 10% de los valores numericos, cuando sea aplicable.

El termino “cancer” pretende significar cualquier enfermedad neoplasica maligna, es decir cualquier tumor o crecimiento maligno producido por division celular anomala y descontrolada. El termino “cancer” pretende incluir en particular tanto tumores solidos, localizados, tal como se ejemplifica en los experimentos con animales incluidos en la presente descripcion, como formas de cancer no solidas, tales como pero sin limitarse a leucemia linfocitica cronica (LLC) y linfoma folicular (LF), dos formas de leucemia investigadas en los ejemplos.

Los presentes inventores han identificado secuencias de oligonucleotido novedosas que pueden realizar al menos una de las siguientes funciones: induccion de apoptosis, activacion de celulas NK, inhibicion de neutrofilos y

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regulacion por incremento de la expresion de marcadores especificos de superficie celular. Los inventores tambien han hecho disponibles metodos de terapia novedosos y sorprendentemente han encontrado que una reduccion en la dosis (desde 150 pg hasta 50 pg) mejoraba significativamente la respuesta en la administracion subcutanea, y que la aplicacion sobre una membrana mucosa, sometida a prueba aqui en forma de administracion nasal, proporciono un modo de administracion igualmente eficaz.

Sin querer restringirse a ninguna teoria, los presentes inventores contemplan que las secuencias de oligonucleotido presentadas en el presente documento pueden inhibir la migracion de celulas, en particular de neutrofilos, hasta el sitio del tumor, inhibiendo por tanto el crecimiento del tumor. Ademas, los experimentos en lineas celulares humanas in vitro indican que los oligonucleotidos segun la invencion pueden tanto reducir el crecimiento como inducir la apoptosis.

En contraposicion a la teoria de que la deficiencia de la migracion de neutrofilos es un efecto del cancer, que hace que el individuo sea susceptible a infecciones, los presentes inventores contemplan que los tumores se aprovechan en cierta medida de, o pueden usar el sistema de defensa del organismo, es decir, las reacciones inflamatorias, en su beneficio. Los compuestos definidos por SEQ ID NO 1 - 5 y 8 - 9 presentados en la tabla 1 ofrecen la posibilidad de inhibir tales mecanismos.

Los inventores tambien muestran sorprendentemente que un oligonucleotido aislado que consiste en una secuencia segun SEQ ID NO 4 puede provocar o aumentar la expresion de marcadores de superficie celular, ilustrados en el presente documento mediante CD20, CD23, CD25, CD40, CD54, CD69, CD80 y CD86.

Los inventores por tanto ponen a disposicion compuestos y metodos para el tratamiento de cancer, en los que un oligonucleotido aislado que consiste en una secuencia segun SEQ ID NO 4 se usa o bien solo; para aumentar la apoptosis, para activar celulas NK, para regular por incremento la expresion de uno o mas de los marcadores de superficie celular CD20, CD23, CD25, CD40, CD54, CD69, CD80 y CD86; o bien en combinacion con una terapia antitumoral elegida entre extirpacion quirurgica del tumor, tratamiento con radiacion, tratamiento hormonal, intervencion quirurgica, quimioterapia, terapias inmunologicas, terapia fotodinamica, terapia con laser, hipertermia, crioterapia, inhibicion de angiogenesis, o una combinacion de cualquiera de ellas. Lo mas preferiblemente, dicho tratamiento antitumoral es un tratamiento inmunologico y comprende la administracion de un anticuerpo al paciente.

Los ejemplos de anticuerpos disponibles actualmente incluyen, pero no se limitan a, rituximab (Rituxan®, MabThera®), lumiliximab, alentuzumab (Campath®, MabCampath®, bevacizumab (Avastin®) y trastuzumab (Herceptin®).

Cuando se administra en combinacion con terapia antitumoral, un oligonucleotido aislado que consiste en una secuencia segun SEQ ID NO 4 se administra preferiblemente antes de la terapia antitumoral, preferiblemente 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas o 12 horas antes de la terapia. Cuando se administra en combinacion con una terapia inmunologica, y en particular una terapia que implica la administracion de un anticuerpo, el oligonucleotido se administra preferiblemente antes de la administracion del anticuerpo al paciente, y de la manera mas preferible suficientemente antes con el fin de permitir la regulacion por incremento de una molecula de la superficie celular o un marcador de la superficie celular hacia el que se dirige el anticuerpo especifico.

La tabla 1 presenta diversos oligonucleotidos, incluyendo un oligonucleotido aislado que consiste en una secuencia segun SEQ ID NO 4.

Tabla 1. Informacion de secuencias

Tabla 1

SEQ ID No.: Secuencia (5’-3’) IDX-No

1: C*C*G*GGGTCGCAGCTGAGCCCA*C*G*G 0011

2: A*T*C*GT CT GCCAT GGTGAA*G*A*T 0013

3: T*C*G*TCGTTCTGCCATCGTC*G*T*T s0022

4: G*G*G*GTCGTCTG*C*G*G s0052

5: G*A*T*CGTCCGTCGG*G*G*G s0058

6: G*G*A*ACAGTTCGTCCAT*G*G*C 0150

7: G*G*G*GAACAGTTCGTCCAT*G*G*C 0955

8: T*C*G*TCGTTCGGCCGATCG*T*C*C 9038

9: T*C*G*TTCGTCTGCTTGTTC*G*T*C 9071

Nota: * indica fosfotiolacion

Los inventores han sintetizado las secuencias anteriores SEQ ID NO 1 - 5 y 8 - 9. SEQ ID NO 2 corresponde a una secuencia publicada en el documento WO 95/35032. SEQ ID NO 6 se publico por primera vez en el documento US 6.498.147, y SEQ ID NO 7 se ha publicado entre otros por SOKOLOSKI , J A, et al. Antisense oligonucleotides to the

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p65 subunit of NF-kB block CD11 b expression and alter adhesion properties of diferentiated HL-60 granulocytes. Blood. 15 de julio de 1993, vol. 82, n.° 2, pags. 625-632.

La secuencia de oligonucleotido segun SEQ ID NO 4 puede comprender al menos un nucleotido que tiene una modificacion de la estructura principal de fosfato. Dicha modificacion de la estructura principal de fosfato es preferiblemente una modificacion de fosforotioato o fosforoditioato.

La presente invencion tambien comprende el uso de una secuencia de oligonucleotido aislado segun SEQ ID NO 4 para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de cancer, en particular para el tratamiento de cancer a traves de la inhibicion de crecimiento tumoral, por ejemplo a traves de la inhibicion de la migracion de neutrofilos al sitio del tumor.

Segun una realizacion preferida, el medicamento se administra por via nasal en una dosis eficaz para lograr al menos una de regulacion por incremento de un marcador de la superficie celular, induccion de apoptosis, activacion de celulas NK e inhibicion de la migracion de neutrofilos en el tratamiento de cancer. Dicha dosis esta preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 pg para el tratamiento de cancer.

De manera correspondiente, la invencion tambien comprende el uso de una secuencia de oligonucleotido aislado segun SEQ ID NO 4 para la fabricacion de un medicamento para la administracion subcutanea en una dosis eficaz para lograr al menos una de regulacion por incremento de un marcador de la superficie celular, induccion de apoptosis, activacion de celulas NK e inhibicion de la migracion de neutrofilos en el tratamiento de cancer. Dicha dosis esta preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 pg para el tratamiento de cancer.

Una realizacion de la invencion comprende el uso tal como se definio anteriormente, en el que se administra un tratamiento antitumoral antes de, despues de o esencialmente simultaneamente con la administracion de dicho oligonucleotido. Este tratamiento antitumoral se elige entre tratamiento con radiacion, tratamiento hormonal, intervencion quirurgica, quimioterapia, terapia inmunologica, terapia fotodinamica, terapia con laser, hipertermia, crioterapia, inhibicion de angiogenesis, o una combinacion de cualquiera de ellas.

El tratamiento antitumoral es preferiblemente una terapia inmunologica que implica la administracion de un anticuerpo al paciente.

Segun una realizacion del metodo de tratamiento segun la invencion, dicho oligonucleotido se administra por via mucosa, es decir por via topica a un

En una cualquiera de las realizaciones anteriores de la invencion, dicho oligonucleotido se administra en una dosis eficaz para provocar o aumentar o regular por incremento la expresion de al menos una molecula de la superficie celular o marcador de la superficie celular, en particular un marcador de la superficie celular elegido entre CD20, CD23, CD25, CD40, CD54, CD69, CD80 y CD86.

Un experto es consciente del hecho de que hay numerosos enfoques para el tratamiento de cancer. Es caracteristico para la batalla contra el cancer que se usen varias terapias, dependiendo del tipo de cancer, su localizacion y estado de progresion y el estado del paciente. De modo que frecuentemente se usan varias terapias de manera subsiguiente o en combinacion. Aunque algunas terapias tales como la intervencion quirurgica, la radioterapia y la quimioterapia se han puesto en practica durante muchas decadas, otras se han concebido recientemente y muchas estan todavia en uso experimental. Naturalmente, estan desarrollandose constantemente nuevos enfoques y se concibe que los oligonucleotidos, su uso y metodos de tratamiento, encuentren utilidad tambien en combinacion con tratamientos futuros. Los inventores creen actualmente que los oligonucleotidos dados a conocer, su uso y metodos de tratamiento serian utiles en combinacion con los siguientes tratamientos antitumorales, sin embargo sin desear limitarse a los mismos; tratamiento con radiacion, tratamiento hormonal, intervencion quirurgica, quimioterapia, terapia inmunologica, terapia fotodinamica, terapia con laser, hipertermia, crioterapia, inhibicion de angiogenesis, o una combinacion de cualquiera de ellas.

El oligonucleotido se administra en una dosis terapeuticamente eficaz. La definicion de una “dosis terapeuticamente eficaz” depende de la enfermedad y del entorno de tratamiento, siendo una “dosis terapeuticamente eficaz” una dosis que sola o en combinacion con otros tratamientos da como resultado una mejora medible del estado del paciente.

Las cantidades eficaces de oligonucleotidos para tratar cancer oscilarian ampliamente entre aproximadamente 0,01 pg y aproximadamente 100 pg por kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 pg y aproximadamente 10 pg, y lo mas preferiblemente entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 5 pg por kg de peso corporal de un mamifero receptor. El oligonucleotido puede administrarse en una unica dosis o en dosis

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repetidas. La realizacion mas preferida en la actualidad supone una unica dosis del nucleotido segun la invencion, administrada a una membrana mucosa, por ejemplo administrada por vfa intranasal, vfa oral, vfa rectal o vfa intravaginal en una cantidad de 50 pg.

Los nucleotidos pueden administrarse por v^a subcutanea o por v^a topica sobre una membrana mucosa. El termino “por vfa topica sobre una membrana mucosa” incluye administracion oral, pulmonar, rectal, vaginal y nasal. Los nucleotidos pueden administrarse por vfa intranasal. Se conoce bien que la accesibilidad y la estructura vascular de la nariz hacen de la administracion nasal de farmacos un metodo atractivo para administrar tanto farmacos como productos biologicos de moleculas pequenas, de manera sistemica as^ como a traves de la barrera hematoencefalica al SNC. Los nucleotidos pueden administrarse en cualquier formulacion adecuada, tal como tampones acuosos adecuados, por ejemplo pero sin limitarse a solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se contempla que los nucleotidos se administren en una formulacion adecuada, disenada para aumentar la adhesion a la membrana mucosa, tal como polfmeros de formacion de gel adecuados, por ejemplo, quitosano, etc.; una formulacion que potencia la captacion celular de los nucleotidos, tal como un vehfculo de administracion lipofilo, liposomas o micelas; o ambos.

Hay varios metodos y dispositivos disponibles para la administracion nasal; dosificacion individual o multiple de formulaciones tanto lfquidas como en polvo, con accion o bien topica o bien sistemica. Usando tecnicas de administracion o dispositivos apropiados, es posible seleccionar como diana la region del bulbo olfativo para administrar al SNC. La presente divulgacion no se limita a metodos o dispositivos particulares para administrar los nucleotidos a la membrana mucosa nasal. Los estudios con animales iniciales han mostrado que la simple instilacion mediante pipeta funciona satisfactoriamente, aunque para el uso en seres humanos, se preferinan dispositivos para la administracion fiable de dosis individuales o multiples.

Los oligonucleotidos pueden administrarse a la membrana mucosa del colon a traves de instilacion rectal, por ejemplo en forma de un enema acuoso que comprende los oligonucleotidos suspendidos en un tampon adecuado.

Los oligonucleotidos pueden administrarse a la membrana mucosa de los pulmones o a las vfas respiratorias a traves de inhalacion de un aerosol, que comprende los oligonucleotidos suspendidos en un tampon adecuado, o realizando un lavado, comprendiendo tambien los oligonucleotidos suspendidos en un tampon adecuado.

Los oligonucleotidos pueden administrarse a la membrana mucosa del tracto urogenital, tal como la uretra, la vagina etc., a traves de la aplicacion de una disolucion, un tampon, un gel, unguento, pasta o similar, que comprende los oligonucleotidos suspendidos en un vehfculo adecuado.

Aunque se ha demostrado que el efecto de la aplicacion a la mucosa nasal es sistemico, se contempla que la aplicacion a otras ubicaciones, tales como las membranas mucosas del tracto urogenital, las vfas respiratorias o los intestinos, es mas adecuada para el tratamiento de tumores ubicados en estos organos o en las proximidades de los mismos.

La invencion encuentra utilidad en el tratamiento de cancer, tal como se respalda por los datos in vivo e in vitro presentados en la seccion experimental e ilustrados en las figuras adjuntas.

Las realizaciones de la invencion tienen muchas ventajas. Hasta ahora, la administracion de un oligonucleotido en las dosis definidas por los inventores no ha provocado ningun efecto secundario evidente. Ademas, la administracion mucosa es facil, rapida e indolora, y sorprendentemente da como resultado un efecto sistemico. Se cree que la influencia sobre las condiciones en el sitio del tumor, por ejemplo a traves de inhibicion de la migracion de neutrofilos al sitio del tumor es uno, pero no el unico, factor responsable para la reduccion del crecimiento y la induccion de apoptosis observada en los experimentos. Se sostiene que este efecto, o bien solo, o bien en combinacion con tratamientos anticancerosos existentes y futuros, ofrece un enfoque prometedor para luchar contra el cancer.

Ejemplos

1. Experimentos con animales

Se investigo el efecto del crecimiento subcutaneo de celulas de linfoma RMA in vivo, en ratones C57BL/6 (B6) singenicos tras la administracion de oligonucleotidos. El objetivo del estudio fue investigar el efecto inhibidor del crecimiento tumoral de diferentes oligonucleotidos en un modelo murino experimental de crecimiento tumoral subcutaneo. Se conoce que los tumores subcutaneos experimentales pueden inducirse por la inoculacion de ratones B6 receptores con celulas tumorales RMA mantenidas in vivo.

El estudio implico 10 grupos de ocho ratones C57BL/6 (B6) cada uno, un total de 80 ratones.

1.1 Sistemas de prueba

Tipo de celulas tumorales e induccion

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La induccion de un tumor subcutaneo en ratones se logra mediante la inoculacion de una suspension celular (103) de celulas de linfoma inducido por el virus de Raucher crecido in vivo (RMA) en el costado derecho del animal.

Formulacion y preparacion del articulo de prueba

Los oligonucleotidos que iban a investigarse se suministraron y se administraron por Index Pharmaceuticals AB, Estocolmo, Suecia, a temperatura ambiente en concentraciones “listas para usar” (2,5-1,25 pg/pl) y se mantuvieron a -20°C hasta el dia de la instilacion.

1.2 Material animal y condiciones Especies, variedad y proveedor

Los ratones usados son ratones C57BL/6/By consanguineos obtenidos a traves de cria realizada en las instalaciones de MTC, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suecia.

Especificaciones

El peso de los ratones fue de aproximadamente 20 gramos. En los experimentos se usaron 80 ratones divididos en 10 grupos experimentales. Los ratones se manejaron segun las rutinas habituales para animales inmunocompetentes en las instalaciones para animales de MTC, que incluian alojamiento en jaulas abiertas, manejo con guantes en bancos abiertos.

Entorno

Se mantuvieron los ratones en jaulas abiertas convencionales de tipo M3 (anchura:longitud:altura = 25:40:16 cm). Se alojaron las jaulas en estanterias abiertas con flujo de aire continuo tras cortinas de plastico. Se adquirieron lechos convencionales de Scanbur - BK, Sollentuna, Suecia. Se cambiaron los lechos una vez a la semana. La temperatura en la sala para animales se mantuvo en el intervalo de 18°C - 22°C y se controlo a traves del sistema de ventilacion ambiental en el laboratorio. El ciclo de luz fue de 12 horas de oscuridad y 12 horas de luz (luces encendidas a las 06:00).

Comida y agua

Se facilito a los ratones una dieta para ratones normal adquirida de Scanbur - BK, Sollentuna, Suecia. Se rellenaron las botellas de agua cuando fue necesario durante la aclimatacion y experimentacion. La comida y el agua estuvieron disponibles a voluntad.

1.3 Procedimientos pre-experimentales Aclimatacion y procedimientos sanitarios

Se importaron los ratones al laboratorio al menos 5 dias antes del comienzo del procedimiento experimental con el fin de conseguir una aclimatacion apropiada.

Asignacion aleatoria a grupos de tratamiento

Tras la inspeccion y la autorizacion sanitaria, se cogieron aleatoriamente los ratones de las jaulas, se marcaron individualmente mediante marcas en la oreja y se asignaron a los grupos experimentales.

1.4. Procedimientos experimentales /diseno experimental

Configuracion

Los procedimientos experimentales se iniciaron al menos 5 dias tras la llegada de los ratones a la unidad de investigacion. Los grupos se asignaron aleatoriamente y se trataron segun el protocolo experimental.

Procedimientos experimentales

En resumen, el experimento comprendio las siguientes acciones: se hicieron crecer celulas tumorales RMA como un tumor ascitico en ratones B6 para proporcionar una fuente de celulas tumorales adaptadas a crecimiento in vivo. Tras la recuperacion, se inoculo una dosis baja de celulas tumorales RMA en el costado derecho en ratones B6/By receptores. Para este experimento se uso una dosis de celulas tumorales de 103 celulas.

Tras la inoculacion de las celulas tumorales, se monitorizo a todos los ratones dos veces por semana mediante palpacion en el sitio de inyeccion. A los primeros signos de crecimiento tumoral en cualquier raton, se subdividieron

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los ratones en grupos y se les administraron 3 dosis (100 pi) a una dosis de las sustancias de prueba cada tres dias. Las sustancias de prueba se administraron por via subcutanea en el costado izquierdo de los animales. En un grupo de ratones, la sustancia de prueba tambien se administro por via intranasal. Para este grupo, se administraron 50 pg (40 pl) de la sustancia.

Los animales de control recibieron un total de 3 dosis, divididas en una dosis cada tres dias del vehiculo unicamente (PBS). El numero de ratones receptores fue de ocho por grupo experimental, para un total de 10 grupos, es decir un total de 80 ratones. Se monitorizo continuamente a los ratones y se midieron los crecimientos de los tumores subcutaneos y se expresaron como volumenes en masa de cancer.

Tratamiento de tumores RMA subcutaneos

Los animales recibieron en total tres inyecciones subcutaneas (100 pL) de los oligonucleotidos en el costado izquierdo, una inyeccion cada tres dias comenzando en el punto del tiempo de los primeros signos de crecimiento tumoral medible. Se midio el tamano del tumor usando un calibre y se expreso como volumen en masa de cancer (mm3).

Evaluacion de la tasa de crecimiento tumoral

Cada raton se siguio mediante palpacion manual. En cuanto aparecio un tumor, se midio su tamano usando un calibre cada dia.

Procedimientos terminales

Se sacrifico a los animales portadores de tumores cuando el tamano de su tumor en crecimiento alcanzo 1500 mm3. Cualquier animal que no desarrollo un tumor se monitorizo durante un maximo de dos meses, punto en el cual se sacrifico el raton.

Recogida de muestras de tumor de los ratones

Se extirpo el tumor usando guantes, bisturi y pinzas esteriles una vez realizadas todas las mediciones. Una parte de la masa tumoral, aproximadamente 400-500 mg, se extrajo, se corto con un bisturi esteril y se transfirio a disolucion de almacenamiento en un tubo Eppendorf etiquetado preparado. Se cerro el tubo hermeticamente y se mezclo el contenido mediante inversion 5-6 veces. Se almacenaron las muestras recogidas a 4°C hasta que se analizaron.

1.5 Resultados

Cada compuesto sometido a prueba mostro un efecto sobre el crecimiento tumoral durante el periodo de observacion de un maximo de 10 dias. Para SEQ ID NO 7, se observo sorprendentemente que una dosis inferior (50 pg frente a 150 pg) daba como resultado una reduccion pronunciada del crecimiento tumoral. Resulto altamente sorprendente que la misma dosis (50 pg) cuando se administro por via nasal dio como resultado una reduccion del crecimiento igual de grande (veanse las figuras 1 y 2).

Entre las SEQ ID NO 1,2, 3, 4 y 7 (figuras 3 - 7) el efecto fue los mas pronunciado para SEQ ID NO 1 y 7, al menos en este entorno experimental.

2. Experimentos in vitro con lineas celulares humanas

Se usaron dos modelos reconocidos de lineas celulares para cancer humano. El objetivo del estudio fue investigar la capacidad de diferentes oligonucleotidos para inhibir el crecimiento de celulas tumorales y para inducir apoptosis en celulas tumorales. Otro objetivo fue correlacionar los datos obtenidos en estudios con animales con otras configuraciones, predictivos para el efecto sobre el cancer en seres humanos. Se uso un control positivo (un oligonucleotido inmunoestimulador disponible comercialmente), asi como un control negativo (una secuencia artificial que contenia un sitio CpG invertido).

2.1 Linea de celulas de linfoma humana

Se estimulo la linea de celulas de linfoma de Burkitt humana Daudi con uno cada de los nucleotidos inventivos, SEQ ID NO 1 - 6 en medio de cultivo tisular durante 48 y 72 h. Se analizo la expresion de diversos marcadores de expresion en superficie mediante FACS tal como se describe en la bibliografia (vease por ejemplo GURSEL, et al. Diferential and competitive activation of human immune cells by distinct classes of CpG oligodeoxinucleotide. J Leuk Biol. 2002, vol. 71, pags. 813-820.; JAHRSDORFER, et al. ADN CpG increases primary malignant B cell expression of costimulatory molecules and target antigens. J Leuk Biol. 2001, vol. 69, pags. 81-88.; JAHRSDORFER, et al. B- cell lymhomas differ en their responsiveness to CpG oligodeoxinucleotides. Clin Can Res. 2005, vol. 11, pags. 14901499.; y JAHRSDORFER, et al. Immunostimulatory oligodeoxinucleotides induce apoptosis of B cell chronic

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lymphocytic leukemia cells. J Leuk Biol. 2005, vol. 77, pags. 378-387) usando el instrumento FACSarray (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).

2.2 Linea de celulas de cancer de colon humana

Se estimulo la linea de celulas de cancer de colon humana HCT116 con cada uno de los nucleotidos inventivos, SEQ ID NO 1 - 5 y 7 en medio de cultivo tisular durante 72 h. Se analizaron la proliferacion celular y la muerte celular mediante analisis de FACS usando Ki-67 y 7-amino-actinomicina (7-AAD), respectivamente, tinendo segun procedimientos conocidos por un experto. Ki- 67 se expresa por las celulas en proliferacion, y usando 7-AAD, pudieron identificarse celulas apoptoticas.

2.4 Resultados

Tal como se observa en la figura 8, todos los compuestos segun SEQ ID NO 1 - 7 pudieron reducir el crecimiento tumoral en cierta medida. Sin embargo, en particular SEQ ID NO 2 - 5 y 7 lograron reduccion marcada de crecimiento tumoral en comparacion con las celulas no tratadas (control positivo).

La figura 9 muestra la capacidad de los mismos compuestos para inducir apoptosis, y en este caso los compuestos, en particular SEQ ID NO 1,5 y 7 indujeron una alta tasa de apoptosis en comparacion con las celulas no tratadas.

Tal como se muestra en la figura 10, todas las secuencias, excepto SEQ ID NO 7, estimularon la expresion de los marcadores de proliferacion de celulas B, CD20, CD40 y CD54.

La figura 11, por otra parte, muestra la regulacion por incremento de los marcadores de activacion de celulas B, CD69, CD80 y CD86, tras el tratamiento con todas las secuencias, siendo SEQ ID NO 7 el agente inductor mas debil de la activacion de celulas B.

La figura 12 muestra que el tratamiento con todas las secuencias, excepto SEQ ID No 7, dio como resultado un marcado aumento del receptor apoptotico CD95 (tambien conocido como receptor de FAS).

Experimentos realizados durante el ano de prioridad

3. Expresion de receptor en PBMC aisladas de sujetos sanos

3.1 Materiales y metodos

Se obtuvo sangre periferica heparinizada de sujetos sanos (n= 3). Se aislo la fraccion de celulas mononucleares mediante centrifugacion en gradiente con Ficoll-Hipaque (Seromed, Berlin, Alemania). Se incubaron las celulas inmediatamente a 37°C en un volumen de 500 pl de medio RPMI completo (que contenia FCS al 10%, penicilina- estreptomicina al 1%, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM y piruvato de sodio 1 mM) en placas de 48 pocillos a una concentracion de 2x106 celulas/ml y se trataron con 1, 10 y 25 pM de cada uno de 10 compuestos de oligonucleotido diferentes. Se tino una fraccion de las celulas con dos mezclas de 4 anticuerpos cada una (CD19, CD20, CD23, CD80 y CD3, CD25, CD56, CD69) para el analisis directo de la expresion de antigenos de superficie mediante FACS.

Tras 48 horas, se centrifugaron 200 pl de las celulas en placas de 96 pocillos, se resuspendieron en 100 pl de FCS al 2% (en PBS) y se incubaron con dos conjuntos de mezclas de anticuerpos (igual que anteriormente) durante 30 min a 4°C. Entonces se lavaron las celulas dos veces en PBS pura y posteriormente se analizaron mediante FACS usando un bioanalizador FACSArray para el analisis de la expresion de antigenos de superficie. Tras 4 dias desde el dia 0, se recogio el resto de las celulas para el analisis de la apoptosis. Se centrifugaron las celulas en placas de 96 pocillos, se resuspendieron en FCS al 2% igual que anteriormente y se incubaron con una mezcla de anticuerpos de CD19 y CD3 (BD Pharmingen) durante 30 min a 4°C. Se lavaron las celulas dos veces con PBS y se tineron posteriormente con anexina V y 7-AAD durante 10 min a TA para el analisis de la apoptosis temprana y tardia, respectivamente. Se analizaron las celulas mediante citometria de flujo igual que anteriormente.

3.2 Resultados

Los resultados indican que la expresion de CD20 y CD23 se regulo por incremento mediante la administracion de SEQ ID NO 3 a 10 pM (figura 23 y datos no mostrados) y que se logro la induccion de activacion de celulas NK (CD69) mediante SEQ ID NO 3 a 10 pM, en comparacion con pacientes no tratados y control positivo, SEQ ID NO 6 (figura 24). Tras una incubacion de 4 d con compuestos de oligonucleotido, la apoptosis de celulas T y B no resulto alterada (datos no mostrados).

4. Expresion de receptor en PBMC aisladas de pacientes con LLC y LF

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4.1 Materiales y metodos

Se obtuvo sangre periferica heparinizada tras el consentimiento informado de pacientes (n=5) con leucemia linfocitica cronica de celulas B (LLC-B) y linfoma folicular (LF) con enfermedad circulante significativa. Se diagnostico a todos los pacientes mediante criterios inmunofenotipicos, morfologicos y clinicos de rutina.

Se aislo la fraccion de celulas mononucleares mediante centrifugacion en gradiente con Ficoll-Hipaque (Seromed, Berlin, Alemania). Se incubaron inmediatamente las celulas a 37°C en un volumen de 500 pl de medio RPMI completo (que contenia FCS al 10%, penicilina-estreptomicina al 1%, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM y piruvato de sodio 1 mM) en placas de 48 pocillos a una concentracion de 2x106 celulas/ml y se trataron con 1, 10 y 25 pM de cada uno de 10 compuestos de oligonucleotido diferentes. Se tino una fraccion de las celulas con dos mezclas de 4 anticuerpos cada una (CD19, CD20, CD23, CD80 y CD3, CD25, CD56 CD69) para el analisis directo de la expresion de antigenos de superficie mediante FACS.

Tras 48 horas, se centrifugaron 200 pl de las celulas en placas de 96 pocillos, se resuspendieron en 100 pl de FCS al 2% (en PBS) y se incubaron con dos conjuntos de mezclas de anticuerpos (igual que anteriormente) durante 30 min a 4°C. Entonces se lavaron las celulas dos veces en PBS pura y posteriormente se analizaron mediante FACS usando un bioanalizador FACSArray para el analisis de la expresion de antigenos de superficie. Tras 4 dias desde el dia 0, se recogio el resto de las celulas para el analisis de la apoptosis. Se centrifugaron las celulas en placas de 96 pocillos, se resuspendieron en FCS al 2% igual que anteriormente y se incubaron con una mezcla de anticuerpos de CD19 y CD3 (BD Pharmingen) durante 30 min a 4°C. Se lavaron las celulas dos veces con PBS y se tineron posteriormente con anexina V y 7-AAD durante 10 min a TA para el analisis de la apoptosis temprana y tardia, respectivamente. Se analizaron las celulas mediante citometria de flujo igual que anteriormente

4.2 Resultados

Los resultados muestran que las SEQ ID NO 3, 8, y 9 inducen regulacion por incremento de CD20 sobre celulas B de pacientes con LLC (figura 13), asi como la regulacion por incremento de CD80 sobre celulas B de pacientes con LLC (figura 14). La expresion de CD23 y CD25 tambien se regulo por incremento (datos no mostrados).

Tambien se mostro que las SEQ ID NO 3, 8 y 9 inducen activacion de celulas NK tal como se mide mediante la tincion de CD69 (figura 15).

Los resultados tambien indican que las SEQ ID NO 3, 8 y 9 inducen apoptosis de celulas T y celulas B en PBMC de pacientes con LLC (figuras 16 y 17).

5. Experimento de pulsos

5.1 Configuracion experimental

Se determino el perfil de citocinas y la expresion de marcadores de superficie en un experimento denominado de pulsos usando PBMC de un control sano. Se determino el perfil de citocinas tras el cultivo de 48 h in vitro y se realizo la tincion de marcadores de superficie (FACS) tras 72 h.

Se prepararon las PBMC y se cultivaron tal como se describe en los ejemplos 3 y 4. Entonces se sometieron las PBMC a los compuestos experimentales durante un periodo predeterminado, seguido por lavado. El lavado se realizo tal como sigue: En primer lugar, se centrifugaron las placas a 1500 rpm durante 5 min. Entonces se desecho el sobrenadante y se anadio medio nuevo. Se repitio la centrifugacion y se desecho el segundo sobrenadante y se anadio medio recien preparado. Tras esto, se cultivaron las PBMC adicionalmente hasta los puntos de tiempo deseados de 48 h (perfil de citocinas) o 72 h (tincion de marcadores de superficie).

Se determino el perfil de citocinas tras 48 h de cultivo in vitro. En el primer lote, las PBMC se cultivaron solo 48 h sin haberse sometido al compuesto experimental. En un segundo lote, se sometieron las PBMC a un pulso de 30 min con SEQ ID NO 3 (IDXs0022), o en otras palabras, se expusieron a SEQ ID NO 3 durante 30 min, se lavaron tal como se describio anteriormente y luego se cultivaron durante 48 h. En un tercer lote, se sometieron las PBMC a un pulso de 2 h, y en un cuarto lote, se sometieron a SEQ ID NO 3 durante 6 h. Se analizaron las siguientes citocinas: II-6, II-10 y IP-10. La concentracion de citocina se facilita como pg/ml.

Se realizo tincion de marcadores de superficie 72 h tras el cultivo in vitro. En el primer lote, las PBMC se cultivaron solo 72 h sin haberse sometido al compuesto experimental. En un segundo lote, se sometieron las PBMC a un pulso de 30 min con SEQ ID NO 3 (IDXs0022), o en otras palabras, se expusieron a SEQ ID NO 3 durante 30 min, se lavaron tal como se describio anteriormente y luego se cultivaron durante 72 h. En un tercer lote, se sometieron las PBMC a un pulso de 2, y en un cuarto lote, se sometieron a SEQ ID NO 3 durante 6 h. Se realizo analisis de marcadores de superficie mediante analisis directo de la expresion de antigenos de superficie de CD19, CD20, CD56 y CD69 mediante FACS.

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10

15

20

25

30

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65

3.2. Resultados

Los resultados muestran que tambien hay un efecto a largo plazo pronunciado cuando el oligonucleotido se ha retirado lavando tras solo 30 min, lo que respalda la viabilidad de la administracion nasal, o administracion a otras membranas mucosas donde no se espera que el oligonucleotido resida durante mas de aproximadamente 30 min.

Los resultados tambien muestran un efecto pronunciado cuando el oligonucleotido se retiro mediante lavado tras 2 h e incluso tras 6 h, lo que corresponde por ejemplo a administracion rectal, donde se espera un tiempo de residencia mayor. Los resultados se muestran en las figuras 18, 19 y 20 para el analisis de citocinas y en las figuras 21 y 22 para la tincion de marcadores de superficies.

Tambien debe indicarse que este experimento se realizo usando PBMC humanas lo que hace que los resultados sean transferibles a un entorno in vivo con mejor precision que experimentos realizados con lineas de celulas humanas inmortalizadas, otro entorno experimental habitual. De manera notable, las PBMC obtenidas a partir de un paciente enfermo contendran por ejemplo las celulas B y el efecto de los compuestos experimentales se observa directamente sobre dianas relevantes para la terapia.

Referencias

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PATHAN, N.I., Chu P., Hariharan K., Cheney C., Molina A., Byrd J. Mediation of apoptosis by and antitumour

Claims

1.

5 2.
3.

10
4.

15
5.

20
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25
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30
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35
9.
10.

40

REIVINDICACIONES

Oligonucleotido aislado que consiste en una secuencia segun SEQ ID NO 4.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer en el que dicho tratamiento es una terapia inmunologica y comprende la administracion de un anticuerpo al paciente, y en el que dicho oligonucleotido se administra antes de la administracion de un anticuerpo.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el oligonucleotido se administra 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 6 horas o 12 horas antes de la administracion del anticuerpo.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el oligonucleotido se administra por via topica a una membrana mucosa o por via subcutanea en una dosis eficaz para inducir apoptosis en el tratamiento de cancer y en el que dicha dosis esta en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 ^g por kg de peso corporal.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el oligonucleotido se administra por via topica a una membrana mucosa o por via subcutanea en una dosis eficaz para regular por incremento la expresion de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD20, cD23, CD25, CD40, CD54, CD69, CD80 y CD86 y en el que dicha dosis esta en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 ^g por kg de peso corporal.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el oligonucleotido se administra por via topica a una membrana mucosa o por via subcutanea en una dosis eficaz para activar celulas NK y en el que dicha dosis esta en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 ^g por kg de peso corporal.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el tratamiento de cancer implica la regulacion por incremento de la expresion de al menos uno de los marcadores de superficie celular CD20 y CD23 antes de la administracion de un anticuerpo al paciente.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el tratamiento de cancer implica la activacion de celulas NK.

Oligonucleotido segun la reivindicacion 1 para su uso en el tratamiento de cancer segun la reivindicacion 2, en el que el tratamiento de cancer implica la induccion de apoptosis.

Secuencia de oligonucleotido aislado segun la reivindicacion 1, en el que al menos un nucleotido tiene una modificacion de estructura principal de fosfato.