ES2581318T3

ES2581318T3 - Selección y evolución simultáneas e integradas de rendimiento y expresión de anticuerpos/proteínas en huéspedes de producción

Info

Publication number: ES2581318T3
Application number: ES15156820.1T
Authority: ES
Inventors: Jay Milton Short
Original assignee: Bioatla Inc
Current assignee: Bioatla Inc
Priority date: 2009-07-17
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2016-09-05
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: EP3636759B1; AU2010273974B2; EP3042957B1; AU2021203220B2; US20180371452A1; EP2454376B1; DK3636759T3; MX392642B; EP2454376A4; DK2907873T3; AU2010273974A8; EP2907873A1; KR20220002712A; MX347654B; AU2017203243B2; JP6681131B2; EP3156485A1; KR20120069664A; IN2012DN00737A; US20240263354A1

Abstract

Método de evolución y expresión de un anticuerpo en un huésped de producción celular eucariota; comprendiendo el método: a. seleccionar un anticuerpo molde; b. hacer evolucionar el anticuerpo molde para permitir la producción de un conjunto de anticuerpos mutantes en un huésped de producción celular eucariota; c. examinar los anticuerpos mutantes para determinar al menos una propiedad, característica o actividad predeterminada; d. seleccionar un anticuerpo mutante superior del conjunto de anticuerpos mutantes basándose en la optimización de la al menos una propiedad, característica o actividad predeterminada en comparación con la misma propiedad, característica o actividad del anticuerpo molde; y e. expresar el anticuerpo mutante superior en el mismo huésped de producción celular eucariota que en la etapa (b) para cualquier escala comercial.

Description

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DESCRIPCION

Seleccion y evolucion simultaneas e integradas de rendimiento y expresion de anticuerpos/protelnas en huespedes de produccion.

Campo de la invencion

En un aspecto particular, la presente invencion es relevante para anticuerpos y para su optimizacion mediante evolucion de anticuerpos. Se descubren anticuerpos terapeuticos, se hacen evolucionar y se fabrican en el mismo huesped usando los mismos sistemas geneticos.

Antecedentes de la invencion

Se han disenado, desarrollado e implementado una variedad de sistemas de anticuerpos y otras protelnas que generan moleculas terapeuticas proteicas. Mas recientemente, se han desarrollado muchos sistemas de evolucion para potenciar la funcion de las protelnas. Por separado, se han desarrollado sistemas de expresion en mamlfero para la produccion de alto rendimiento de anticuerpos y otras protelnas para aplicaciones terapeuticas. Hasta la fecha, ningun grupo ha desarrollado un sistema para permitir la generacion, evolucion de un anticuerpo o protelna, y produccion/fabricacion de protelnas en un sistema de expresion en mamlfero eficaz individual.

El documento WO 2002092780 se refiere a metodos para generar conjuntos, o bibliotecas, de acidos nucleicos que codifican para sitios de union a antlgeno, tales como anticuerpos, dominios de anticuerpo u otros fragmentos. El metodo es para generar sitios de union a antlgeno variantes alterando acidos nucleicos molde incluyendo mutagenesis por saturacion, reensamblaje de ligamiento sintetico, o una combinacion de los mismos.

Rajpal et al., “A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries”, Proc Natl Acad Sci U S A., vol. 102, paginas 8466-8471, (2005) dan a conocer un metodo para mejorar la afinidad de anticuerpos usando la denominada mutagenesis revisada que evalua y optimiza simultaneamente mutaciones combinatorias de aminoacidos seleccionados en el anticuerpo. El procedimiento se centra en una distribucion precisa dentro de uno o mas dominios de region determinante de la complementariedad y explora la contribucion sinergica de la qulmica de cadenas laterales de aminoacidos.

Iba et al., “Expression vectors for the introduction of highly diverged sequences into the six complementaritydetermining regions of an antibody”, Gene, vol. 194, paginas 35-46, (1997) dan a conocer tres clases de vectores fagemidos que permiten la introduction simultanea de secuencias con alta divergencia en seis regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo mediante la reaccion en cadena de la polimerasa con cebadores de oligodesoxinucleotidos degenerados. Los fagos expresaron o bien la forma de Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) o bien Fab de un Ac fusionado con la media molecula de cplll en la superficie del fago M13.

El documento WO 2005/003345 da a conocer un metodo de mutagenesis mediante el que se introduce un aminoacido predeterminado en todas y cada una de las posiciones de un conjunto seleccionado de posiciones en una region preseleccionada (o varias regiones diferentes) de un polipeptido para producir una biblioteca de analogos de polipeptido. Las bibliotecas producidas pueden usarse para estudiar el papel de aminoacidos especlficos en la estructura y funcion del polipeptido y para desarrollar polipeptidos nuevos o mejorados tales como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, enzimas y ligandos.

El documento WO 2003/023032 da a conocer un procedimiento para la evolucion dirigida de alto rendimiento de peptidos y protelnas, particularmente aquellos que actuan en entornos biologicos complejos. Las protelnas y los peptidos incluyen, pero no se limitan a, protelnas intracelulares, protelnas de mensajeros/senalizacion/hormonas y protelnas virales.

Se desarrollan muchos anticuerpos usando sistemas de presentation en fago de bacterias en bacterias, mientras que la expresion de anticuerpos de longitud completa se lleva a cabo principalmente en celulas de mamlfero. Esta falta de similitud hace que sea imposible la evolucion o seleccion de clones para expresion. Otras barreras incluyen el requisito tradicional de que se examinen grandes numeros de variantes usando tecnologlas tradicionales y se han optimizado sistemas de expresion en mamlfero de alto nivel para la expresion, no la donation de grandes numeros de variantes. No se ha disenado previamente un sistema integrado de seleccion de anticuerpos/protelnas, evolucion y expresion en mamlfero. El uso de celulas eucariotas para manejar grandes numeros, combinado con evolucion no estocastica del anticuerpo en el interior de una celula huesped eucariota optimizada, aumenta la probabilidad de exito y acelera en gran medida el procedimiento para generar un anticuerpo optimizado que se expresara a niveles suficientemente altos en celulas eucariotas que se desea fabricar.

Sumario de la invencion

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La presente divulgacion proporciona metodos de integracion de generacion y/o selection de anticuerpos terapeuticos, evolution y expresion en un huesped eucariota, tal como un huesped de celula de mamufero o un huesped de celula de levadura, para la fabrication en un sistema individual. Se generan, se optimizan y se fabrican anticuerpos terapeuticos en el mismo sistema de huesped eucariota. El sistema dado a conocer de Optimization de anticuerpos integrada completa (CIAO!™) permite la evolucion simultanea de la optimizacion de la expresion y el rendimiento de anticuerpos.

En una realization, la divulgacion proporciona un metodo de seleccion, evolucion y expresion de un anticuerpo en un huesped de production celular eucariota; comprendiendo el metodo las etapas de: seleccionar un anticuerpo molde; hacer evolucionar el anticuerpo molde para producir un conjunto de anticuerpos mutantes en el huesped de produccion celular eucariota; examinar los anticuerpos mutantes para determinar la al menos una propiedad, caracteristica o actividad predeterminada; seleccionar un anticuerpo mutante superior del conjunto de anticuerpos mutantes basandose en la optimizacion de la al menos una propiedad, caracteristica o actividad predeterminada en comparacion con la misma propiedad, caracteristica o actividad del anticuerpo molde; y expresar el anticuerpo mutante superior en el mismo huesped de produccion celular eucariota que se usa en la etapa de hacer evolucionar para cualquier escala comercial. En un aspecto, la etapa de seleccion comprende generar una biblioteca de anticuerpos anti-antigeno en un huesped de produccion celular eucariota con presentation en la superficie celular de anticuerpos; examinar la biblioteca para determinar al menos una propiedad, caracteristica o actividad predeterminada; y seleccionar un anticuerpo molde de la biblioteca. En otro aspecto, la biblioteca de anticuerpos anti-antigeno es una biblioteca de anticuerpos anti-antigeno humanizados.

En un aspecto, el huesped de produccion celular eucariota se selecciona de celulas de fibroblasto de raton 3T3; celulas de fibroblasto de hamster sirio BHK21; celulas epiteliales de perro, MDCK; celulas epiteliales humanas Hela; celulas epiteliales de rata canguro PtK1; celulas plasmaticas de raton SP2/0; y celulas plasmaticas de raton NS0; celulas de rinon embrionario humano HEK 293; celulas de rinon de mono COS; celulas de ovario de hamster chino CHO, CHO-S; celulas embrionarias de raton R1; celulas embrionarias de raton E14.1; celulas embrionarias humanas H1; celulas embrionarias humanas H9; celulas embrionarias humanas PER C.6; celulas de levadura S. cerevisiae; o celulas de levadura Picchia. En un aspecto particular, el sistema eucariota es CHO-S o HEK293. En un aspecto, las etapas de examen utilizan clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS).

En otro aspecto, la etapa de hacer evolucionar comprende producir un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir del anticuerpo molde que tiene m regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en el que m es un numero entero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5 o 6, comprendiendo cada una de dichas CDR n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo generar m x n conjuntos independientes de anticuerpos, comprendiendo cada conjunto anticuerpos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una position individual predeterminada de la CDR; en el que cada conjunto de anticuerpos difiere en la position individual predeterminada; y el numero de anticuerpos miembros diferentes generados es equivalente a m x n x X. En un aspecto particular, m es 6.

En un aspecto, la etapa de hacer evolucionar comprende generar n-1 conjuntos independientes de polipeptidos mutantes a partir del anticuerpo molde, comprendiendo cada conjunto polipeptidos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada del polipeptido; en el que cada conjunto de polipeptidos difiere en la posicion individual predeterminada; y el numero de polipeptidos miembros diferentes generados es equivalente a [n-1] x X. En un aspecto, X es 19.

En otro aspecto, la etapa de examen comprende someter a ensayo cada polipeptido miembro para determinar al menos una propiedad, caracteristica o actividad predeterminada; identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracteristica o actividad del polipeptido miembro en relation con el polipeptido molde; crear un mapa funcional en el que el mapa funcional se usa para identificar posiciones y mutaciones en el polipeptido mutante que dan como resultado un mutante superior y/o una mutation silenciosa en comparacion con el polipeptido molde.

En otro aspecto, el fragmento de anticuerpo se selecciona de una cadena pesada, cadena ligera, dominio variable, dominio constante, region hipervariable, region determinante de la complementariedad 1 (CDR1), region determinante de la complementariedad 2 (CDR2), y region determinante de la complementariedad 3 (CDR3).

En otro aspecto, la etapa de generacion comprende someter un polinucleotido que contiene codones que codifica para dicho polipeptido molde a amplification basada en polimerasa usando un oligonucleotido degenerado 64 veces para cada codon que va a mutagenizarse, en el que cada uno de dichos oligonucleotidos degenerados 64 veces se compone de una primera secuencia homologa y una secuencia de triplete N,N,N degenerada, de modo que se genera un conjunto de polinucleotidos de progenie; y someter dicho conjunto de polinucleotidos de progenie a amplificacion clonal de manera que se expresan polipeptidos codificados por los polinucleotidos de progenie.

Tambien forma parte de la invention el metodo segun la revindication 1 en el que la propiedad, caracteristica o actividad predeterminada se selecciona de reduction de la agregacion anticuerpo-proteina, potenciacion de la estabilidad de anticuerpo, aumento de la solubilidad de anticuerpo, introduction de sitios de glicosilacion,

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introduccion de sitios de conjugacion, reduccion de la inmunogenicidad, potenciacion de anticuerpo expresion, aumento de la afinidad antigenica, disminucion de la afinidad antigenica, cambio en la afinidad de union, cambio en la inmunogenicidad o potenciacion de la especificidad.

En otro aspecto, la etapa de hacer evolucionar comprende una tecnica de evolucion seleccionada de una de evolucion de posicion completa (CPE); evolucion de insercion de posicion completa (CPI); evolucion de delecion de posicion completa (CPD); evolucion de posicion completa (CPE) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS); evolucion de delecion de posicion completa (CPD) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS); o evolucion de delecion de posicion completa (CPD) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS).

El anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

En otro aspecto, la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada en la etapa de examen (e) comprende uno o mas de (1) examinar para una mutacion silenciosa y (2) examinar para una mutacion de cambio de sentido; en comparacion con el anticuerpo molde.

En otro aspecto, una o mas partes del anticuerpo seleccionadas de Fc y Fv; region de entramado; y una o mas CDR se modifican en el anticuerpo humano mutante superior en comparacion con el anticuerpo humano molde que va a hacerse evolucionar.

En otro aspecto, la etapa de examen comprende examinar el conjunto de anticuerpos humanos mutantes para determinar la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y examinar para determinar simultaneamente la expresion modificada.

En otro aspecto, el huesped de produccion celular es un huesped de produccion eucariota y la etapa de hacer evolucionar comprende hacer evolucionar el anticuerpo humano molde para producir un conjunto de anticuerpos humanos mutantes en el huesped de produccion celular eucariota con presentacion en la superficie celular.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona un metodo de evolucion para la expresion y fabrication potenciadas de un anticuerpo humano en un huesped de produccion celular eucariota; comprendiendo el metodo seleccionar un anticuerpo humano molde para evolucion; hacer evolucionar el anticuerpo humano molde que comprende la generation de codones mutantes que codifican para el anticuerpo humano molde para producir un conjunto de anticuerpos humanos mutantes en el huesped de produccion; examinar el conjunto de anticuerpos humanos mutantes para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y examinar para determinar la expresion potenciada en comparacion con el anticuerpo humano molde; seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos humanos mutantes basandose en (1) retention u optimization de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y (2) expresion potenciada en comparacion con el anticuerpo humano molde; y fabricar el anticuerpo humano mutante superior que comprende expresar el anticuerpo humano mutante superior en el mismo huesped de produccion que en la etapa de hacer evolucionar.

En un aspecto, los codones mutantes del anticuerpo humano mutante superior dan como resultado al menos una mutacion silenciosa y/o mutacion de cambio de sentido. En otro aspecto, los codones mutantes del anticuerpo humano mutante superior dan como resultado al menos una mutacion silenciosa.

En un aspecto adicional, el anticuerpo humano molde es un farmaco terapeutico de anticuerpo aprobado por un comite etico, y el anticuerpo humano mutante superior es un farmaco biosimilar.

En otro aspecto, la etapa de selection comprende seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos humanos mutantes basandose en (1) optimizacion de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y (2) expresion potenciada en comparacion con el anticuerpo humano molde.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona un metodo de identification y produccion de un anticuerpo humano diana, comprendiendo el metodo generar una biblioteca de anticuerpos humanos en un huesped de produccion celular eucariota con presentacion en la superficie celular de anticuerpos; examinar la biblioteca para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; identificar un anticuerpo humano diana de la biblioteca basandose en la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y expresar el anticuerpo humano diana en el mismo huesped de produccion celular eucariota que en la etapa de generacion para producir un anticuerpo humano diana. En un aspecto, el anticuerpo humano diana es un anticuerpo de longitud completa.

En otra realizacion, la divulgacion proporciona un metodo de evolucion de un anticuerpo humano en un huesped de fabricacion, comprendiendo el metodo mutar un anticuerpo humano molde para producir un conjunto de anticuerpos humanos mutantes en un huesped de fabricacion; y examinar el conjunto de anticuerpos de progenie mutantes para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada. En un aspecto, el metodo comprende

ademas seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos humanos mutantes basandose en la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada. En otro aspecto, el metodo comprende ademas fabricar el anticuerpo humano mutante superior que comprende expresar el anticuerpo humano mutante superior en el mismo huesped de produccion que en la etapa de mutacion. En otro aspecto, la etapa de 5 seleccion comprende ademas seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos humanos mutantes basandose en (1) optimization de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada en comparacion con el anticuerpo humano molde, y (2) expresion modificada en comparacion con el anticuerpo humano molde. En un aspecto, la expresion modificada es expresion potenciada.

En otra realization, la divulgation proporciona un metodo de evolution y fabrication de un anticuerpo humano en un 10 huesped de fabricacion celular; comprendiendo el metodo mutar un anticuerpo humano molde para producir un conjunto de anticuerpos humanos mutantes en un huesped de fabricacion; examinar el conjunto de anticuerpos humanos mutantes para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y examinar para expresion modificada; seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos humanos mutantes basandose en (1) optimizacion de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad 15 predeterminada, y (2) expresion modificada en comparacion con el anticuerpo humano molde; y fabricar el anticuerpo humano que comprende expresar el anticuerpo humano mutante superior en el mismo huesped de fabricacion que en la etapa de mutacion.

En una realizacion adicional, la divulgacion proporciona un metodo de evolucion para la expresion y fabricacion potenciadas de un anticuerpo humano en un huesped de produccion celular eucariota; comprendiendo el metodo 20 mutar un anticuerpo humano molde que comprende generation de codones mutantes que codifican para el anticuerpo humano molde para producir un conjunto de anticuerpos humanos mutantes en un huesped de fabricacion; examinar el conjunto de anticuerpos humanos mutantes para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y examinar para determinar la expresion potenciada en comparacion con el anticuerpo humano molde; seleccionar un anticuerpo humano mutante superior del conjunto de anticuerpos 25 humanos mutantes basandose en (1) retention u optimizacion de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y (2) expresion potenciada en comparacion con el anticuerpo humano molde; y fabricar el anticuerpo humano mutante superior en el mismo huesped de fabricacion que en la etapa de mutacion.

En un aspecto, la etapa de examen comprende examinar el conjunto de anticuerpos humanos mutantes para determinar la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada y examinar para determinar la 30 expresion potenciada simultaneamente.

Breve description de los dibujos

La figura 1 proporciona un esquema del metodo CIAO™ de integration de generacion y/o seleccion de anticuerpos terapeuticos, evolucion y expresion en un huesped eucariota, tal como un huesped de celula de mamlfero o un huesped de celula de levadura, para la fabricacion en un sistema individual.

35 La figura 2 ilustra como se usa la evolucion de position completa (CPE™) para generar una base de datos especlfica de moleculas (EvoMap™).

La figura 3 muestra un esquema de la slntesis de posicion completa (CPS™) que puede usarse para combinar mutantes superiores de CPE™.

La figura 4 muestra un esquema de la evolucion de insertion de posicion completa (CPI™).

40 La figura 5 ilustra una combination de metodos de evolucion: un acido nucleico prolongado a partir de evolucion CPI™ se somete a evolucion de posicion completa (CPE™) y se usa para generar una base de datos especlfica de moleculas (EvoMap™).

La figura 6 muestra un esquema de evolucion de deletion de posicion completa (CPD™).

La figura 7 ilustra otra combinacion de metodos de evolucion: un acido nucleico acortado a partir de evolucion 45 CPD™ se somete a evolucion de posicion completa (CPE™) y se usa para generar una base de datos especlfica de moleculas (EvoMap™).

Definition de terminos

Para facilitar la comprension de los ejemplos proporcionados en el presente documento, se describiran determinados metodos y/o terminos que aparecen frecuentemente.

50 El termino “agente” se usa en el presente documento para indicar un polipeptido, una mezcla de polipeptidos, un

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alineamiento de compuestos localizados espacialmente (por ejemplo, un alineamiento de peptido VLSIPS, alineamiento de polinucleotido y/o un alineamiento de molecula pequena combinatoria), macromolecula biologica, una biblioteca de presentacion de peptidos en bacteriofago, un anticuerpo de bacteriofago (por ejemplo, scFv) biblioteca de presentacion, una biblioteca de presentacion de peptidos polisomicos, o un extracto producido a partir de materiales biologicos tales como bacterias, plantas, hongos o celulas o tejidos de animales (en particular de mamlferos). Se evaluan los agentes para determinar su posible actividad como antineoplasicos, antiinflamatorios o moduladores de la apoptosis mediante su inclusion en ensayos de examen descritos a continuacion en el presente documento. Se evaluan los agentes para determinar su posible actividad como inhibidores especlficos de la interaction de protelnas (es decir, un agente que inhibe selectivamente una interaction de union entre dos polipeptidos predeterminados pero que no interfiere sustancialmente en la viabilidad celular) mediante su inclusion en ensayos de examen descritos a continuacion en el presente documento.

El termino “aminoacido” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier compuesto organico que contiene un grupo amino (--NH2) y un grupo carboxilo (--COOH); preferiblemente o bien como grupos libres o bien alternativamente tras condensation como parte de enlaces peptldicos. Los “veinte alfa-aminoacidos que forman polipeptidos codificados de manera natural” se entienden en la tecnica y se refieren a: alanina (ala o A), arginina (arg o R), asparagina (asn o N), acido aspartico (asp o D), cistelna (cys o C), acido glutamico (glu o E), glutamina (gln o Q), glicina (gly o G), histidina (his o H), isoleucina (ile o I), leucina (leu o L), lisina (lys o K), metionina (met o M), fenilalanina (phe o F), prolina (pro o P), serina (ser o S), treonina (thr o T), triptofano (trp o W), tirosina (tyr o Y), y valina (val o V).

El termino “amplification” significa que aumenta el numero de copias de un polinucleotido.

El termino “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a moleculas de inmunoglobulina intactas, as! como a fragmentos de moleculas de inmunoglobulina, tales como fragmentos Fab, Fab', (Fab')2, Fv, y SCA, que pueden unirse a un epltopo de un antlgeno. Estos fragmentos de anticuerpo, que retienen cierta capacidad para unirse selectivamente a un antlgeno (por ejemplo, un antlgeno de polipeptido) del anticuerpo del que se derivan, pueden producirse usando metodos bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, citado anteriormente), y se describen adicionalmente, tal como sigue. Los anticuerpos pueden usarse para aislar cantidades preparativas del antlgeno mediante cromatografla de inmunoafinidad. Otros usos diversos de tales anticuerpos son diagnosticar y/o estadificar la enfermedad (por ejemplo, neoplasia) y para aplicacion terapeutica para tratar una enfermedad, tal como por ejemplo: neoplasia, enfermedad autoinmunitaria, SIDA, enfermedad cardiovascular, infecciones, y similares. Los anticuerpos quimericos, similares a humanos, humanizados o totalmente humanos son particularmente utiles para la administration a pacientes humanos.

Un fragmento Fab consiste en un fragmento de union a antlgeno monovalente de una molecula de anticuerpo, y puede producirse mediante digestion de una molecula de anticuerpo completo con la enzima papalna, para proporcionar un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada.

Un fragmento Fab' de una molecula de anticuerpo puede obtenerse tratando una molecula de anticuerpo completo con pepsina, seguido por reduction, para proporcionar una molecula que consiste en una cadena ligera intacta y una parte de una cadena pesada. Se obtienen dos fragmentos Fab' por molecula de anticuerpo tratada de esta manera.

Un fragmento (Fab')2 de un anticuerpo puede obtenerse tratando una molecula de anticuerpo completo con la enzima pepsina, sin reduccion posterior. Un fragmento (Fab')2 es un dlmero de dos fragmentos Fab', mantenidos juntos mediante dos enlaces disulfuro.

Un fragmento Fv se define como un fragmento modificado mediante ingenierla genetica que contiene la region variable de una cadena ligera y la region variable de una cadena pesada expresadas como dos cadenas.

Un anticuerpo de cadena sencilla (“SCA”) es una molecula de cadena sencilla modificada mediante ingenierla genetica que contiene la region variable de una cadena ligera y la region variable de una cadena pesada, unidas mediante un ligador polipeptldico flexible adecuado.

El termino “farmaco biosimilar”, tambien denominado “farmaco biologico de continuacion”, se refiere a nuevas versiones aprobadas de manera oficial de productos biofarmaceuticos innovadores, tras el vencimiento de una patente o exclusividad.

El termino “huesped de production celular”, o “huesped de fabrication”, se refiere a una llnea celular usada para la production o fabricacion de anticuerpos. Celulas eucariotas tales como celulas de mamlfero, incluyendo, pero sin limitarse a llneas celulares humanas, de raton, hamster, rata, mono as! como llneas celulares de levaduras, insectos y plantas. Pueden utilizarse celulas procariotas. En un aspecto, un huesped de produccion celular de mamlfero se selecciona de un miembro del grupo que consiste en celulas de fibroblasto de raton 3T3; celulas de fibroblasto de hamster sirio BHK21; celulas epiteliales de perro, MDCK; celulas epiteliales humanas Hela; celulas epiteliales de

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rata canguro PtK1; celulas plasmaticas de raton SP2/0; y celulas plasmaticas de raton NS0; celulas de rinon embrionario humano HEK 293; celulas de rinon de mono COS; celulas de ovario de hamster chino CHO, CHO-S; celulas embrionarias de raton R1; celulas embrionarias de raton E14.1; celulas embrionarias humanas H1; celulas embrionarias humanas H9; celulas embrionarias humanas PER C.6. En otro aspecto, el huesped de produccion celular es a GS-NS0 o GS-CHOK1 llnea celular. En otro aspecto, el huesped de produccion celular se selecciona de celulas de levadura S. cerevisiae; y celulas de levadura Picchia.

Una molecula que tiene una “propiedad quimerica” es una molecula que es: 1) en parte homologa y en parte heterologa a una primera molecula de referencia; mientras que 2) al mismo tiempo es en parte homologa y en parte heterologa a una segunda molecula de referencia; sin 3) excluir la posibilidad de ser al mismo tiempo en parte homologa y en parte heterologa a todavla una o mas moleculas de referencia adicionales. En una realizacion no limitativa, una molecula quimerica puede prepararse ensamblando una reordenacion de secuencias moleculares parciales. En un aspecto no limitativo, puede prepararse una molecula de polinucleotido quimerico sintetizando el polinucleotido quimerico usando una pluralidad de moldes moleculares, de manera que el polinucleotido quimerico resultante tenga las propiedades de una pluralidad de moldes.

El termino “relacionado” tal como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia genica que esta relacionada evolutiva y funcionalmente entre especies. Por ejemplo, pero sin limitacion, en el genoma humano el gen de CD4 humano es el gen relacionado con el gen de 3d4 de raton, puesto que las secuencias y estructuras de estos dos genes indican que son altamente homologos y ambos genes codifican para una protelna que funciona en la senalizacion de la activacion de celulas T a traves de reconocimiento de antlgeno restringido a CMH de clase II.

El termino “escala comercial” significa la produccion de un anticuerpo a una escala apropiada para la reventa.

Una “ventana de comparacion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleotido contiguas en el que una secuencia de polinucleotido puede compararse con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleotidos contiguos y en el que la parte de la secuencia de polinucleotido en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) del 20 por ciento o menos en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. La alineacion optima de secuencias para alinear una ventana de comparacion puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 mediante el algoritmo de alineacion de homologla de Needlemen y Wuncsch J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics version 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o mediante inspection, y se selecciona la mejor alineacion (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homologla a lo largo de la ventana de comparacion) generada mediante los diversos metodos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “region determinante de la complementariedad” y “CDR” se refieren al termino reconocido en la tecnica tal como se ejemplifica mediante Kabat y Chothia. Las definiciones de CDR tambien se conocen generalmente como regiones supervariables o bucles hipervariables (Chothia y Leks, 1987; Clothia et al., 1989; Kabat et al., 1987; y Tramontano et al., 1990). Los dominios de region variable comprenden normalmente los aproximadamente 105-115 aminoacidos amino-terminales de una cadena de inmunoglobulina que se produce de manera natural (por ejemplo, aminoacidos 1-110), aunque tambien son adecuados dominios variables algo mas cortos o mas largos para formar anticuerpos de cadena sencilla. Las CDR forman parte de inmunoglobulinas que determinan la especificidad de dichas moleculas y entran en contacto con un ligando especlfico. Las CDR son la parte mas variable de la molecula y contribuyen a la diversidad de estas moleculas. Hay tres regiones CDR, cDR1, CDR2 y CDR3, en cada dominio V. CDR-H representa una region CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se refiere a una region CDR de una cadena ligera variable. H significa la cadena pesada variable y L significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una region derivada de Ig pueden determinarse tal como se describe en Kabat (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edic., publication de NIH n.° 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

El termino “completa” se usa en el presente documento para referirse a una tecnica de evolution en la que se realizan todos los cambios posibles en cada position de un polinucleotido molde o polipeptido molde y se somete a prueba el polinucleotido o polipeptido para confirmar que se han realizado los cambios pretendidos.

“Sustituciones de aminoacidos conservativas” se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifaticas es serina y treonina; un grupo de aminoacidos que tienen amida que contienen cadenas laterales es asparagina y glutamina; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales aromaticas es fenilalanina, tirosina y triptofano; un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoacidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cistelna y metionina. Grupos de sustituciones de aminoacidos

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conservatives preferidas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina- glutamina.

El termino “corresponde a” se usa en el presente documento para significar que una secuencia de polinucleotido es homologa (es decir, es identica, no relacionada evolutivamente de manera estricta) a la totalidad o una parte de una secuencia de polinucleotido de referencia, o que una secuencia de polipeptido es identica a una secuencia de polipeptido de referencia. En contraposition, el termino “complementaria a” se usa en el presente documento para significar que la secuencia complementaria es homologa a la totalidad o una parte de una secuencia de polinucleotido de referencia. Para ilustracion, la secuencia de nucleotidos “TATAC” corresponde a una secuencia “TATAC” de referencia y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “region de entramado de secuencia definida” se refiere a un conjunto de secuencias definidas que se seleccionan con una base no aleatoria, generalmente basandose en datos experimentales o datos estructurales; por ejemplo, una region de entramado de secuencia definida puede comprender un conjunto de secuencias de aminoacidos que se predice que forman una estructura de lamina b o puede comprender un motivo de repetition de heptada de cremallera de leucina, un dominio de dedo de zinc, entre otras variaciones. Un “nucleo de secuencias definidas” es un conjunto de secuencias que engloban un alcance limitado de variabilidad. Mientras que (1) una secuencia decamerica completamente aleatoria de los 20 aminoacidos convencionales puede ser cualquiera de (20)10 secuencias, y (2) una secuencia decamerica pseudoaleatoria de los 20 aminoacidos convencionales puede ser cualquiera de (20)10 secuencias pero presentara un sesgo hacia determinados residuos en determinadas posiciones y/o en general, (3) un nucleo de secuencias definidas es un subconjunto de secuencias si se permitiese que cada position de residuo fuese cualquiera de los 20 aminoacidos convencionales admisibles (y/o amino/iminoacidos no convencionales admisibles). Un nucleo de secuencias definidas comprende generalmente posiciones de residuo variantes e invariantes y/o comprende posiciones de residuo variantes que pueden comprender un residuo seleccionado de un subconjunto definido de residuos de aminoacido), y similares, o bien de manera segmentada o bien por toda la longitud de la secuencia de miembro de biblioteca seleccionada individual. Los nucleos de secuencias definidas pueden referirse o bien a secuencias de aminoacidos o bien a secuencias de polinucleotido. Como ilustracion y sin limitation, las secuencias (NNK)10 y (NNM)10, en las que N representa A, T, G, o C; K representa G o T; y M representa A o C, son nucleos de secuencias definidas.

El termino “desinmunizacion” tal como se usa en el presente documento se refiere a la production de una variante de la molecula de union molde, que esta modificada en comparacion con una molecula de tipo natural original volviendo dicha variante no inmunogenica o menos inmunogenica en seres humanos. Las moleculas desinmunizadas segun la invention se refieren a anticuerpos o partes de los mismos (como regiones de entramado y/o CDR) de origen no humano. Ejemplos correspondientes son anticuerpos o fragmentos de los mismos tal como se describen en el documento US 4.361.549. El termino “desinmunizado” tambien se refiere a moleculas, que muestran una propension reducida a generar epltopos de celulas T. Segun esta invencion, el termino “propension reducida a generar epltopos de celulas T” se refiere a la elimination de epltopos de celulas T que conduce a la activation de celulas T especlficas.

Ademas, propension reducida a generar epltopos de celulas T significa sustitucion de aminoacidos que contribuyen a la formation de epltopos de celulas T, es decir sustitucion de aminoacidos, que son esenciales para la formation de un epltopo de celulas T. En otras palabras, propension reducida a generar epltopos de celulas T se refiere a inmunogenicidad reducida o capacidad reducida para inducir proliferation de celulas T independiente de antlgeno. Ademas, propension reducida a generar epltopos de celulas T se refiere a desinmunizacion, que significa perdida o reduction de posibles epltopos de celulas T de secuencias de aminoacidos que inducen proliferacion de celulas T independiente de antlgeno.

El termino “epltopo de celulas T” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias peptldicas cortas que pueden liberarse durante la degradation de peptidos, polipeptido o protelnas dentro de celulas y posteriormente presentarse por moleculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) para desencadenar la activacion de celulas T; vease, entre otros, el documento WO 02/066514. Para peptidos presentados por CMH de clase II, tal activacion de celulas T puede inducir entonces una respuesta de anticuerpos mediante la estimulacion directa de celulas B para producir dichos anticuerpos.

“Digestion” de ADN se refiere a la escision catalltica del ADN con una enzima de restriction que actua solo en determinadas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restriccion usadas en el presente documento estan disponibles comercialmente y sus condiciones de reaction, cofactores y otros requisitos se usaron tal como conocera el experto habitual en la tecnica. Para fines anallticos, normalmente se usa 1 mg de plasmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 ml de disolucion tampon. Con el fin de aislar fragmentos de ADN para la construction de plasmidos, normalmente se digieren de 5 a 50 mg de ADN con de 20 a 250 unidades de enzima en un mayor volumen. El fabricante especifica tampones y cantidades de sustrato apropiados para enzimas de restriccion particulares. Habitualmente se usan tiempos de incubation de aproximadamente 1 hora a 37°C, pero pueden variar segun las instrucciones del proveedor. Despues de la digestion,

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se somete la reaccion a electroforesis directamente sobre un gel para aislar el fragmento deseado.

El termino “intercambio de ADN” se usa en el presente documento para indicar la recombinacion entre secuencias sustancialmente homologas pero no identicas, en algunas realizaciones intercambio de ADN puede implicar cruzamiento a traves de recombinacion no homologa, tal como a traves de sistemas de cer/lox y/o flp/frt y similares. El intercambio de ADN puede ser aleatorio o no aleatorio.

Tal como se usa en esta invencion, el termino “epltopo” se refiere a un determinante antigenico en un antlgeno, tal como un polipeptido de fitasa, al que se une el paratopo de un anticuerpo, tal como un anticuerpo especlfico de fitasa. Los determinantes antigenicos consisten habitualmente en agrupamientos de superficie qulmicamente activos de moleculas, tales como aminoacidos o cadenas laterales de azucar, y pueden tener caracterlsticas estructurales tridimensionales especlficas, as! como caracterlsticas de cara especlficas. Tal como se usa en el presente documento “epltopo” se refiere a aquella parte de un antlgeno u otra macromolecula que puede formar una interaccion de union que interacciona con el cuerpo de union de region variable de un anticuerpo. Normalmente, tal interaction de union se manifiesta como un contacto intermolecular con uno o mas residuos de aminoacido de una CDR.

El termino “evolution” se refiere a un cambio en al menos una propiedad, caracterlstica o actividad de un anticuerpo modificado genetica o sinteticamente en comparacion con un anticuerpo molde.

Los terminos “fragmento”, “derivado” y “analogo” cuando hacen referencia a un polipeptido comprenden un polipeptido que retiene al menos una funcion o actividad biologica que es al menos esencialmente igual que la del polipeptido de referencia. Ademas, los terminos “fragmento”, “derivado” o “analogo” se ejemplifican mediante una molecula de “pro-forma”, tal como una pro-protelna de baja actividad que puede modificarse mediante escision para producir una forma madura con actividad significativamente mayor.

Se proporciona un metodo en el presente documento para producir a partir de un polipeptido molde un conjunto de polipeptidos de progenie en los que una “gama completa de sustituciones de aminoacidos individuales” esta representada en cada position de aminoacido. Tal como se usa en el presente documento, “gama completa de sustituciones de aminoacidos individuales” hace referencia a los 20 alfa-aminoacidos codificados de manera natural que forman polipeptidos codificados de manera natural, tal como se describe en el presente documento.

El termino “gen” significa el segmento de ADN implicado en la production de una cadena de polipeptido; incluye regiones que preceden y que siguen a la region codificante (secuencias llder y remolque) as! como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificantes individuales (exones).

“Inestabilidad genetica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la tendencia natural de secuencias altamente repetitivas a perderse a traves de un procedimiento de acontecimientos reductores que implican generalmente simplification de secuencia a traves de la perdida de secuencias repetidas. Las deleciones tienden a implicar la perdida de una copia de una repetition y todo lo que haya entre las repeticiones.

El termino “heterologa” significa que una secuencia de acido nucleico monocatenario no puede hibridar con otra secuencia de acido nucleico monocatenario o su complemento. Por tanto, zonas de heterologla significa que zonas de polinucleotidos o polinucleotidos tienen zonas o regiones dentro de su secuencia que no pueden hibridar con otro acido nucleico o polinucleotido. Tales regiones o zonas son por ejemplo zonas de mutaciones.

El termino “homologa” o “homeologa” significa que una secuencia de acido nucleico de acido nucleico monocatenario puede hibridar con una secuencia de acido nucleico monocatenario complementaria. El grado de hibridacion puede depender de varios factores incluyendo la cantidad de identidad entre las secuencias y las condiciones de hibridacion tales como temperatura y concentraciones de sal tal como se comentara mas adelante. Preferiblemente, la region de identidad es mayor de 5 pb, mas preferiblemente la region de identidad es mayor de 10 pb.

El termino “humanizado” se usa para describir anticuerpos en los que se combinan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un animal mamlfero, por ejemplo, un raton, con una region de entramado humana. A menudo, se injertaran polinucleotidos que codifican para las CDR aisladas en polinucleotidos que codifican para una region de entramado de region variable adecuada (y opcionalmente regiones constantes) para formar polinucleotidos que codifican para anticuerpos completos (por ejemplo, humanizados o totalmente humanos), fragmentos de anticuerpo, y similares. En otro aspecto, ademas de anticuerpos de raton, pueden humanizarse otras especies, tales como, por ejemplo, otros roedores, camello, conejo, gato, perro, cerdo, caballo, vaca, pez, llama y tiburon. En un aspecto amplio, puede utilizarse cualquier especie que produzca anticuerpos en la produccion de anticuerpos humanizados. Adicionalmente, los anticuerpos de la invencion pueden ser quimericos, similares a humanos, humanizados o totalmente humanos, para reducir su posible antigenicidad, sin reducir su afinidad por su diana. Los anticuerpos quimericos, similares a humanos y humanizados se han descrito generalmente en la tecnica.

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Incorporando la menor cantidad posible de secuencia foranea en el anticuerpo hlbrido, se reduce la antigenicidad. La preparacion de estos anticuerpos hlbridos puede llevarse a cabo mediante metodos bien conocidos en la tecnica.

En un aspecto alternativo, se adaptan anticuerpos humanos o de raton a una especie receptora diferente, tal como una especie amenazada, para proporcionar agentes terapeuticos para la especie receptora al tiempo que se protege frente a una respuesta inmunitaria negativa. En este aspecto, se utilizan las regiones de entramado de una especie receptora en combinacion con las CDR de anticuerpos de una especie conocida o segunda especie.

Una region variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consiste en una region “de entramado” interrumpida por tres regiones hipervariables, tambien denominadas CDR. La extension de la region de entramado y las CDR se ha definido de manera precisa (vease, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat et al., 1987). Las secuencias de las regiones de entramado de diferentes cadenas ligeras o pesadas estan relativamente conservadas dentro de una especie. Tal como se usa en el presente documento, una “region de entramado humana” es una region de entramado que es sustancialmente identica (85 o mas, habitualmente 90-95 o mas) a la region de entramado de una inmunoglobulina humana que se produce de manera natural. La region de entramado de un anticuerpo, es decir las regiones de entramado combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para posicionar y alinear las CDR. Las CDR son principalmente responsables de la union a un epltopo de un antlgeno. Segun esta invencion, una region de entramado se refiere a una region en el dominio V (dominio VH o VL) de inmunoglobulinas que proporciona un armazon proteico para las regiones determinantes de la complementariedad hipervariables (CDR) que entran en contacto con el antlgeno. En cada dominio V, hay cuatro regiones de entramado designadas como FR1, FR2, FR3 y FR4. La region de entramado 1 engloba la region desde el extremo N-terminal del dominio V hasta el comienzo de CDR1, la region de entramado 2 se refiere a la region entre CDR1 y CDR2, la region de entramado 3 engloba la region entre CDR2 y CDR3 y la region de entramado 4 significa la region desde el final de CDR3 hasta el extremo C-terminal del dominio V; vease, entre otros, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5a ed. Por tanto, las regiones de entramado engloban todas las regiones fuera de las regiones CDR en los dominios VH o VL.

El experto en la tecnica se encuentra facilmente en condiciones de deducir a partir de una secuencia dada las regiones de entramado y las CDR; veanse Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edic., publicacion de NIH n.° 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., Chothia (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883.

Los beneficios de esta invencion se extienden a “aplicaciones industriales” (o procesos industriales), termino que se usa para incluir aplicaciones en la industria comercial propiamente dicha (o simplemente industria) as! como aplicaciones industriales no comerciales (por ejemplo, investigacion biomedica en una institucion sin animo de lucro). Las aplicaciones relevantes incluyen aquellas en las areas del diagnostico, la medicina, agricultura, fabricacion y ensenanza.

El termino “identicas” o “identidad” significa que dos secuencias de acido nucleico tienen la misma secuencia o una secuencia complementaria. Por tanto, “zonas de identidad” significa que regiones o zonas de un polinucleotido o el polinucleotido global son identicas o complementarias a zonas de otro polinucleotido o el polinucleotido.

El termino “aislado” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, una enzima o un polinucleotido que se produce de manera natural o presente en un animal vivo no esta aislado, pero el mismo polinucleotido o enzima, separado de parte o de la totalidad de los materiales coexistente en el sistema natural, esta aislado. Tales polinucleotidos podrlan formar parte de un vector y/o tales polinucleotidos o enzimas podrlan formar parte de una composicion, y todavla estar aislados porque tal vector o composicion no forma parte de su entorno natural.

Por “acido nucleico aislado” quiere decirse un acido nucleico, por ejemplo, una molecula de ADN o ARN, que no es inmediatamente contiguo a las secuencias flanqueantes en 5' y 3' a las que normalmente es inmediatamente contiguo cuando esta presente en el genoma que se produce de manera natural del organismo del que se deriva. El termino describe por tanto, por ejemplo, un acido nucleico que se incorpora en un vector, tal como un plasmido o vector viral; un acido nucleico que se incorpora en el genoma de una celula heterologa (o el genoma de una celula homologa, pero en un sitio diferente del que se produce de manera natural); y un acido nucleico que existe como una molecula independiente, por ejemplo, un fragmento de ADN producido mediante amplificacion por PCR o digestion con enzimas de restriccion, o una molecula de ARN producida mediante transcripcion in vitro. El termino tambien describe un acido nucleico recombinante que forma parte de un gen hlbrido que codifica para secuencias de polipeptido adicionales que pueden usarse, por ejemplo, en la produccion de un polipeptido de fusion.

“Ligamiento” se refiere al procedimiento de formacion de enlaces fosfodiester entre dos fragmentos de acido nucleico bicatenarios (Maniatis et al., 1982, pag. 146). A menos que se proporcione de otro modo, puede lograrse el ligamiento usando condiciones y tampones conocidos con 10 unidades de ADN ligasa de T4 (“ligasa”) por 0,5 mg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que van a ligarse.

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Tal como se usa en el presente documento, “ligador” o “espaciador” se refiere a una molecula o grupo de moleculas que conecta dos moleculas, tales como una proteina de union a ADN y un peptido aleatorio, y sirve para colocar las dos moleculas en una configuracion preferida, por ejemplo, de modo que el peptido aleatorio puede unirse a un receptor con impedimento esterico minimo de la proteina de union a ADN.

El termino “presentacion en la superficie de una celula de mamifero” se refiere a una tecnica mediante la cual un anticuerpo, o una parte de un anticuerpo, se expresa y se presenta en la superficie de una celula huesped de mamifero con fines de examen; por ejemplo, mediante examen para determinar la union especifica a antigeno mediante una combinacion de perlas magneticas y clasificacion de celulas activada por fluorescencia. En un aspecto, se usan vectores de expresion de mamifero para la expresion simultanea de inmunoglobulinas tanto como una forma secretada como una forma unida a la superficie celular como en DuBridge et al., documento US 2009/0136950. En otro aspecto, se emplean las tecnicas de Gao et al. para un vector viral que codifica para una biblioteca de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se presentan en las membranas celulares cuando se expresan en una celula como en Gao et al., documento US 2007/0111260. Se conoce la presentacion en superficie de IgG completa en celulas de mamifero. Por ejemplo, Akamatsuu et al. desarrollaron un vector de presentacion en la superficie de una celula de mamifero, adecuado para aislar directamente moleculas de IgG basandose en su afinidad de union a antigeno y actividad biologica. Usando un vector episomico derivado de virus de Epstein-Barr, se presentaron bibliotecas de anticuerpos como moleculas de IgG completas en la superficie celular y se examinaron para determinar la union especifica a antigeno mediante una combinacion de perlas magneticas y clasificacion de celulas activada por fluorescencia. Se recuperaron los plasmidos que codificaban para anticuerpos con caracteristicas de union deseadas a partir de las celulas clasificadas y se convirtieron en la forma para la produccion de IgG soluble. Akamatsuu et al. J. Immunol. Methods 2007 327(1-2):40-52. Ho et al. usaron celulas de rinon embrionario humano 293T que se usan ampliamente para la expresion transitoria de proteinas para la presentacion en la superficie celular de anticuerpos de cadena sencilla Fv para maduracion de afinidad. Se enriquecieron las celulas que expresaban un anticuerpo mutante poco comun con mayor afinidad, 240 veces mediante una clasificacion celular de un solo pase a partir de un gran exceso de celulas que expresan anticuerpo WT con una afinidad ligeramente menor. Ademas, se obtuvo un mutante altamente enriquecido con aumento de la afinidad de union por CD22 despues de una seleccion individual de una biblioteca combinatoria aleatorizando un punto caliente de anticuerpo intrinseco. Ho et al. Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells, Proc Natl Acad Sci U S A 20 de junio de 2006; 103(25): 9637-9642.

Beerli et al. usaron celulas B especificas para un antigeno de interes que se aislaron directamente de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de donantes humanos. Se generan bibliotecas de Fv de cadena sencilla (scFv) recombinantes, especificos de antigeno a partir de esta combinacion de celulas B y se examinan mediante presentacion en la superficie de una celula de mamifero usando un sistema de expresion de virus Sindbis. Este metodo permite aislar anticuerpos especificos de antigeno mediante una tanda individual de FACS. Las regiones variables (VR) de las cadenas pesadas (HC) y cadenas ligeras (LC) se aislaron de clones positivos y anticuerpos totalmente humanos recombinantes producidos como fragmentos Fab o IgG completas. De esta manera, se aislaron varios anticuerpos de alta afinidad hipermutados que se unen a la particula pseudoviral (VLP) Qb, un antigeno viral modelo, asi como anticuerpos especificos para nicotina. Todos los anticuerpos mostraron altos niveles de expresion en cultivo celular. Los Acm especificos de nicotina humanos se validaron de manera preclinica en un modelo de raton. Beerli et al., Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display, Proc Natl Acad Sci USA. 23 de septiembre de 2008; 105(38): 14336-14341.

Tambien se conoce la presentacion en la superficie celular de levaduras, por ejemplo, veanse Kondo y Ueda 2004, Yeast cell-surface display-applications of molecular display, Appl. Microbiol. Biotechnol., 64(1): 28-40, que describe por ejemplo, un sistema de modificacion mediante ingenieria de la superficie celular usando la levadura Saccharomyces cerevisiae. Varios sistemas de presentacion representativos para la expresion en la levadura S. cerevisiae se describen en Lee et al, 2003, Microbial cell-surface display, TRENDS in Bitechnol. 21(1): 45-52. Tambien Boder y Wittrup 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nature Biotechnol., 15(6): 553.

El termino “fabricacion” se refiere a la produccion de un anticuerpo en una cantidad suficiente como para permitir al menos pruebas clinicas de fase I de un anticuerpo terapeutico, o una cantidad suficiente para la aprobacion reguladora de un anticuerpo de diagnostico.

El termino “mutacion de cambio de sentido” se refiere a una mutacion puntual en la que se cambia un nucleotido individual, lo que da como resultado un codon que codifica para un aminoacido diferente. Las mutaciones que cambian un aminoacido a un codon de terminacion se denominan mutaciones sin sentido.

Tal como se usa en el presente documento, una “propiedad molecular que va a hacerse evolucionar” incluye la referencia a moleculas que se componen de una secuencia de polinucleotido, moleculas que se componen de una secuencia de polipeptido, y moleculas que se componen en parte de una secuencia de polinucleotido y en parte de una secuencia de polipeptido. Ejemplos particularmente relevantes, pero no limitativos en modo alguno, de propiedades moleculares que van a hacerse evolucionar incluyen actividades enzimaticas en condiciones

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especificadas, tales como relacionadas con la temperatura; salinidad; presion; pH; y concentracion de glicerol, DMSO, detergente, y/o cualquier otra especie molecular con la que entra en contacto en un entorno de reaccion. Ejemplos particularmente relevantes adicionales, pero no limitativos en modo alguno, de propiedades moleculares que van a hacerse evolucionar incluyen estabilidades, por ejemplo, la cantidad de una propiedad molecular residual que esta presente despues de un tiempo de exposicion especificado a un entorno especificado, tal como puede encontrarse durante el almacenamiento.

El termino “mutar” se refiere a crear una mutacion en una secuencia de acido nucleico; en el caso en el que la mutacion se produce dentro de la region codificante de un gen, lo que conducira a un cambio de codon que puede conducir o no a un cambio de aminoacido.

El termino “mutaciones” significa cambios en la secuencia de una secuencia de acido nucleico de tipo natural o cambios en la secuencia de un peptido o polipeptidos. Tales mutaciones pueden ser mutaciones puntuales tales como transiciones o transversiones. Las mutaciones pueden ser deleciones, inserciones o duplicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, la secuencia de nucleotidos “N,N,G/T” degenerada representa 32 posibles tripletes, donde “N” puede ser A, C, G o T.

Tal como se usa en el presente documento, la secuencia de nucleotidos “N,N,N” degenerada representa 64 posibles tripletes, donde “N” puede ser A, C, G o T.

El termino “que se produce de manera natural” tal como se usa en el presente documento aplicado al objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un polipeptido o secuencia de polinucleotido que esta presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado de manera intencionada por el hombre en el laboratorio, se produce de manera natural. Generalmente, el termino se produce de manera natural se refiere a un objeto presente en un individuo no patologico (no enfermo), tal como serla tlpico para la especie.

Tal como se usa en el presente documento, una “molecula de acido nucleico” se compone de al menos una base o un par de bases, dependiendo de si es monocatenaria o bicatenaria, respectivamente. Ademas, una molecula de acido nucleico puede pertenecer exclusivamente o de manera quimerica a cualquier grupo de moleculas que contienen nucleotidos, tal como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, los siguientes grupos de moleculas de acido nucleico: ARN, ADN, acidos nucleicos genomicos, acidos nucleicos no genomicos, acidos nucleicos que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural, y acidos nucleicos sinteticos. Esto incluye, a modo de ejemplo no limitativo, acidos nucleicos asociados con cualquier organulo, tal como la mitocondria, ARN ribosomico, y moleculas de acido nucleico que se componen de manera quimerica de uno o mas componentes que no se producen de manera natural junto con componentes que se producen de manera natural.

Adicionalmente, una “molecula de acido nucleico” puede contener en parte uno o mas componentes no basados en nucleotidos tal como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, aminoacidos y azucares. Por tanto, a modo de ejemplo, pero no de limitacion, una ribozima que se basa en parte en nucleotidos y se basa en parte en protelna se considera una “molecula de acido nucleico”.

Ademas, a modo de ejemplo, pero no de limitacion, una molecula de acido nucleico que se marca con un resto detectable, tal como un marcador radiactivo o alternativamente un marcador no radiactivo, se considera asimismo una “molecula de acido nucleico”.

Los terminos “secuencia de acido nucleico que codifica para” o una “secuencia codificante de ADN de” o una “secuencia de nucleotidos que codifica para” un anticuerpo particular, as! como otros terminos sinonimos, se refieren a una secuencia de ADN que se transcribe y se traduce para dar un anticuerpo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Una “secuencia promotora” es una region reguladora de ADN que puede unirse a ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante posterior (en el sentido de 3'). El promotor forma parte de la secuencia de ADN. Esta region de secuencia tiene un codon de iniciacion en su extremo 3'. La secuencia promotora incluye el numero mlnimo de bases cuando hay los elementos necesarios para iniciar la transcripcion a niveles detectables por encima del fondo. Sin embargo, despues de unirse la ARN polimerasa a la secuencia e iniciarse la transcripcion en el codon de iniciacion (extremo 3' con un promotor), avanza la transcripcion de manera posterior en el sentido de 3'. Dentro de la secuencia promotora se encontrara un sitio de inicio de la transcripcion (definido de manera conveniente mediante mapeo con la nucleasa SI) as! como dominios de union a protelna (secuencias consenso) responsables de la union de la ARN polimerasa.

Los terminos “acido nucleico que codifica para un anticuerpo” o “ADN que codifica para un anticuerpo” o “polinucleotido que codifica para un anticuerpo” y otros terminos sinonimos engloban un polinucleotido que incluye solo la secuencia codificante para el anticuerpo as! como un polinucleotido que incluye secuencia codificante y/o no codificante adicional.

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En una realizacion preferida, una “especie de molecula de acido nucleico especlfica” se define mediante su estructura qulmica, tal como se ejemplifica mediante, pero sin limitarse a, su secuencia primaria. En otra realizacion preferida, una “especie de molecula de acido nucleico” especlfica se define mediante una funcion de la especie de acido nucleico o por una funcion de un producto derivado de la especie de acido nucleico. Por tanto, a modo de ejemplo no limitativo, una “especie de molecula de acido nucleico especlfica” pueden definirse mediante una o mas actividades o propiedades atribuibles a la misma, incluyendo actividades o propiedades atribuibles a su producto expresado.

La presente definicion de “ensamblar una muestra de acido nucleico de trabajo en una biblioteca de acidos nucleicos” incluye el procedimiento de incorporar una muestra de acido nucleico en una coleccion basada en vector, tal como mediante ligamiento en un vector y transformacion de un huesped. A continuacion en el presente documento se proporciona una descripcion de vectores, huespedes y otros reactivos relevantes as! como ejemplos no limitativos especlficos de los mismos. La presente definicion de “ensamblar una muestra de acido nucleico de trabajo en una biblioteca de acidos nucleicos” tambien incluye el procedimiento de incorporar una muestra de acido nucleico en una coleccion no basada en vector, tal como mediante ligamiento a adaptadores. Preferiblemente, los adaptadores pueden aparearse con cebadores de PCR para facilitar la amplificacion por PCR.

Por consiguiente, en una realizacion no limitativa, una “biblioteca de acidos nucleicos” se compone de una coleccion basada en vector de una o mas moleculas de acido nucleico. En otra realizacion preferida, una “biblioteca de acidos nucleicos” se compone de una coleccion no basada en vector de moleculas de acido nucleico. En aun otra realizacion preferida, una “biblioteca de acidos nucleicos” se compone de una coleccion combinada de moleculas de acido nucleico que se basa en parte en vector y no se basa en parte en vector. Preferiblemente, la coleccion de moleculas que comprenden una biblioteca puede someterse a busqueda y separacion segun la especie de molecula de acido nucleico individual.

La presente invencion proporciona un “constructo de acido nucleico” o alternativamente a “constructo de nucleotidos” o alternativamente un “constructo de ADN”. El termino “constructo” se usa en el presente documento para describir una molecula, tal como un polinucleotido (por ejemplo, un polinucleotido de fitasa) que puede opcionalmente unirse qulmicamente a uno o mas restos moleculares adicionales, tales como un vector, o partes de un vector. En un aspecto especlfico, pero no limitativo en modo alguno, un constructo de nucleotidos se ejemplifica mediante un constructo de expresion de ADN adecuado para la transformacion de una celula huesped.

Un “oligonucleotido” (o de manera sinonima un “oligo”) se refiere o bien a un polidesoxinucleotido monocatenario o bien a dos hebras de polidesoxinucleotido complementarias que pueden sintetizarse qulmicamente. Tales oligonucleotidos sinteticos pueden tener o no un 5'-fosfato. Los que no lo tienen no se ligaran con otro oligonucleotido sin anadir un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleotidosintetico se ligara con un fragmento que no se ha desfosforilado. Para lograr la amplificacion basada en polimerasa (tal como con PCR), se mencionan un “oligonucleotido degenerado 32 veces que se compone de, en serie, al menos una primera secuencia homologa, una secuencia N,N,G/T degenerada, y una segunda secuencia homologa”. Tal como se usa en este contexto, “homologa” hace referencia a homologla entre el oligo y el polinucleotido parental que se somete a la amplificacion basada en polimerasa.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “operativamente unido” se refiere a un ligamiento de elementos de polinucleotido en una relacion funcional. Un acido nucleico esta “operativamente unido” cuando se coloca en una placed relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia codificante. Operativamente unido significa que las secuencias de ADN que se unen son normalmente contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de protelna, contiguas y en el marco de lectura.

Una secuencia codificante esta “operativamente unida a” otra secuencia codificante cuando la ARN polimerasa transcribira las dos secuencias codificantes en un ARNm individual, que entonces se transcribe para dar un polipeptido individual que tiene aminoacidos derivados de ambas secuencias codificantes. No es necesario que las secuencias codificantes sean contiguas entre si siempre que las secuencias expresadas se procesen en ultima instancia para producir el anticuerpo deseado.

Tal como se usa en el presente documento el termino “condiciones fisiologicas” se refieren a temperatura, pH, fuerza ionica, viscosidad, y parametros bioqulmicos similares que son compatibles con un organismo viable, y/o que normalmente existen de manera intracelular en una celula de mamlfero o celula de levadura cultivada viable. Por ejemplo, las condiciones intracelulares en una celula de levadura hecha crecer en condiciones de cultivo de laboratorio tlpicas son condiciones fisiologicas. Condiciones de reaccion in vitro adecuadas para cocteles de transcripcion in vitro son generalmente condiciones fisiologicas. En general, las condiciones fisiologicas in vitro comprenden NaCl o KCl 50-200 mM, pH 6,5-8,5, 20-45°C y cation divalente (por ejemplo, Mg++, Ca++) 0,00110 mM; preferiblemente NaCl o KCl 150 mM, pH 7,2-7,6, cation divalente 5 mM, y a menudo incluyen el 0,01-1,0 por ciento de protelna no especlfica (por ejemplo, BSA). A menudo puede estar presente un detergente no ionico (Tween, NP-40, Triton X-100), habitualmente a del 0,001 al 2%, normalmente al 0,05-0,2% (v/v). Pueden

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seleccionarse condiciones acuosas particulares por el profesional segun metodos convencionales. Para una orientacion general, pueden aplicarse las siguientes condiciones acuosas tamponadas: NaCl 10-250 mM, Tris HCl 550 mM, pH 5-8, con adicion opcional de cation/cationes divalente(s) y/o quelantes metalicos y/o detergentes no ionicos y/o fracciones de membrana y/o agentes antiespumantes y/o centelleadores.

El termino “poblacion” tal como se usa en el presente documento significa una coleccion de componentes tales como polinucleotidos, partes de polinucleotidos o anticuerpos. Una “poblacion mixta” significa una coleccion de componentes que pertenecen a la misma familia de acidos nucleicos o anticuerpos (es decir, estan relacionados) pero que difieren en su secuencia (es decir, no son identicos) y as! en su actividad biologica.

Una molecula que tiene una “pro-forma” se refiere a una molecula que experimenta cualquier combinacion de una o mas modificaciones qulmicas covalentes y no covalentes (por ejemplo, glicosilacion, escision proteolltica, dimerizacion u oligomerizacion, cambio conformacional inducido por temperatura o pH, asociacion con un cofactor, etc.) como via para lograr una forma molecular mas madura que tiene una diferencia de propiedad (por ejemplo un aumento de la actividad) en comparacion con la molecula de pro-forma de referencia. Cuando pueden distinguirse dos o mas modificaciones qulmicas (por ejemplo dos escisiones proteollticas, o una escision proteolltica y una desglicosilacion) como via para la produccion de una molecula madura, la molecula precursora de referencia puede denominarse molecula de “pre-pro-forma”.

Una “propiedad” puede describir cualquier caracterlstica, incluyendo una propiedad caracterlstica flsica, qulmica o de actividad de un anticuerpo que va a optimizarse. Por ejemplo, en determinados aspectos, la propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada que va a optimizarse puede seleccionarse de reduccion de la agregacion anticuerpo-protelna, potenciacion de la estabilidad de anticuerpo, aumento de la solubilidad de anticuerpo, aumento de la estabilidad al pH de anticuerpo, aumento de la estabilidad a la temperatura de anticuerpo, aumento de la estabilidad al disolvente de anticuerpo, aumento de la selectividad, disminucion de la selectividad, introduction de sitios de glicosilacion, introduccion de sitios de conjugation, reduccion de la inmunogenicidad, potenciacion de la expresion de protelnas, aumento de la afinidad antigenica, disminucion de la afinidad antigenica, cambio en la afinidad de union, cambio en la inmunogenicidad, cambio en la actividad catalltica, optimization del pH o potenciacion de la especificidad. Una propiedad “optimizada” se refiere a un cambio deseable en una propiedad particular en un anticuerpo mutante en comparacion con un anticuerpo molde.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “pseudoaleatorio” se refiere a un conjunto de secuencias que tienen variabilidad limitada, de manera que, por ejemplo, el grado de variabilidad de residuos en otra position, excepto cualquier posicion pseudoaleatoria, se permite cierto grado de variation de residuos, sin embargo circunscrito.

“Unidades casi de repetition”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a las repeticiones que van a reordenarse y son por definition no identicas. En efecto, el metodo se propone no solo para unidades codificantes practicamente identicas producidas mediante mutagenesis de la secuencia de partida identica, sino tambien la reordenacion de secuencias similares o relacionadas que pueden divergir significativamente en algunas regiones. No obstante, si las secuencias contienen suficientes homologlas como para reordenarse mediante este enfoque, pueden denominarse unidades “casi de repeticion”.

Tal como se usa en el presente documento “biblioteca de peptidos aleatorios” se refiere a un conjunto de secuencias de polinucleotido que codifican para un conjunto de peptidos aleatorios, y al conjunto de peptidos aleatorios codificados por esas secuencias de polinucleotido, as! como a las protelnas de fusion que contienen esos peptidos aleatorios.

Tal como se usa en el presente documento, “secuencia peptldica aleatoria” se refiere a una secuencia de aminoacidos que se compone de dos o mas monomeros de aminoacidos y se construye mediante un procedimiento estocastico o aleatorio. Un peptido aleatorio puede incluir motivos de armazon o region de entramado, que pueden comprender secuencias invariantes.

Tal como se usa en el presente documento, “receptor” se refiere a una molecula que tiene una afinidad por un ligando dado. Los receptores pueden ser moleculas que se producen de manera natural o sinteticos. Los receptores pueden emplearse en un estado inalterado o como agregados con otras especies. Los receptores pueden unirse, de manera covalente o no covalente, a un miembro de union, o bien directamente o bien a traves de una sustancia de union especlfica. Los ejemplos de receptores incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y antisueros reactivos con determinates antigenicos especlficos (tales como en virus, celulas, u otros materiales).

Anticuerpos “recombinantes” se refieren a anticuerpos producidos mediante tecnicas de ADN recombinantes, es decir, producidos a partir de celulas transformadas mediante un constructo de ADN exogeno que codifica para el anticuerpo deseado. Anticuerpos “sinteticos” son los preparados mediante slntesis qulmica.

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El termino “polinucleotidos relacionados” significa que regiones o zonas de los polinucleotidos son identicas y regiones o zonas de los polinucleotidos son heterologas.

“Reordenacion reductora”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al aumento de la diversidad molecular que se acumula a traves de acontecimientos de delecion (y/o insercion) que estan mediados por secuencias repetidas.

Los siguientes terminos se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o mas polinucleotidos: “secuencia de referenda”, “ventana de comparacion”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia” e “identidad sustancial”.

Una “secuencia de referenda” es una secuencia definida usada como base para una comparacion de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mas grande, por ejemplo, como un segmento de un ADNc de longitud completa o secuencia genica dada en una lista de secuencias, o puede comprender una secuencia genica o de ADNc completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleotidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleotidos de longitud, y a menudo al menos 50 nucleotidos de longitud. Puesto que dos polinucleotidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleotido completa) que es similar entre los dos polinucleotidos y (2) pueden comprender ademas una secuencia que es divergente entre los dos polinucleotidos, normalmente se realizan comparaciones de secuencias entre dos (o mas) polinucleotidos comparando las secuencias de los dos polinucleotidos a lo largo de una “ventana de comparacion” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia.

“El Indice de repeticion (RI)”, tal como se usa en el presente documento, es el numero promedio de copias de las unidades casi de repeticion contenidas en el vector de clonacion.

El termino “saturacion” se refiere a una tecnica de evolucion en la que se realiza cada cambio posible en cada posicion de un polinucleotido molde o polipeptido molde; sin embargo el cambio en cada posicion no se confirma mediante pruebas, sino que meramente se asume estadlsticamente cuando se estima que se produce la mayorla de los posibles cambios o casi cada cambio posible en cada posicion de un molde.

El termino “identidad de secuencia” significa que dos secuencias de polinucleotido son identicas (es decir, nucleotido por nucleotido) a lo largo de la ventana de comparacion. El termino “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera optima a lo largo de la ventana de comparacion, determinando el numero de posiciones en las que aparece la base de acido nucleico identica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para proporcionar el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion (es decir, el tamano de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Esta “identidad sustancial”, tal como se usa en el presente documento, indica una caracterlstica de una secuencia de polinucleotido, en la que el polinucleotido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de al menos el 85 por ciento, a menudo una identidad de secuencia del 90 al 95 por ciento, y de la manera mas comun una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento en comparacion con una secuencia de referencia de una ventana de comparacion de al menos 25-50 nucleotidos, en la que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleotido que puede incluir deleciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparacion.

El termino “mutacion silenciosa” se refiere a un cambio de codon que no da como resultado un cambio de aminoacido en un polipeptido expresado y se basan en la redundancia de uso de codones para la insercion de aminoacidos.

Tal como se conoce en la tecnica, la “similitud” entre dos enzimas se determina comparando la secuencia de aminoacidos y sus sustitutos de aminoacido conservados de una protelna con la secuencia de una segunda protelna. Puede determinarse la similitud mediante procedimientos que se conocen bien en la tecnica, por ejemplo, un programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (herramienta de busqueda de alineaciones locales basicas) en el Centro Nacional de Informacion Biologica).

Tal como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo de cadena sencilla” se refiere a un polipeptido que comprende un dominio VH y un dominio VL en ligamiento de polipeptidos, generalmente ligados a traves de un peptido espaciador (por ejemplo, [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x), y que puede comprender secuencias de aminoacidos adicionales en los extremos amino y/o carboxilo terminales. Por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla puede comprender un segmento de anclaje para la union al polinucleotido codificante. Como ejemplo, un scFv es un anticuerpo de cadena sencilla. Los anticuerpos de cadena sencilla son generalmente protelnas que consisten en uno o mas segmentos de polipeptido de al menos 10 aminoacidos contiguos codificados sustancialmente por genes de la

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superfamilia de inmunoglobulinas (por ejemplo, vease Williams y Barclay, 1989, pags. 361-368), codificados lo mas frecuentemente por una secuencia genica de cadena pesada o cadena ligera de roedor, primate no humano, de ave de corral, porcina, bovina, ovina, de cabra o humana. Un anticuerpo de cadena sencilla funcional contiene generalmente una parte suficiente de un producto genico de la superfamilia de inmunoglobulinas de modo que se retenga la propiedad de union a una molecula diana especlfica, normalmente un receptor o antlgeno (epltopo).

Se dice que los miembros de un par de moleculas (por ejemplo, un par anticuerpo-antlgeno o un par de acidos nucleicos) se “unen especlficamente” entre si si se unen entre si con mayor afinidad que a otras moleculas no especlficas. Por ejemplo, un anticuerpo producido contra un antlgeno al que se une mas eficazmente que a una protelna no especlfica puede describirse como que se une especlficamente al antlgeno.

“Hibridacion especlfica” se define en el presente documento como la formacion de hlbridos entre un primer polinucleotido y un segundo polinucleotido (por ejemplo, un polinucleotido que tiene una secuencia distinta pero sustancialmente identica al primer polinucleotido), en la que secuencias de polinucleotido sustancialmente no relacionadas no forman hlbridos en la mezcla.

El termino “polinucleotido especlfico” significa un polinucleotido que tiene determinados puntos finales y que tiene una determinada secuencia de acido nucleico. Dos polinucleotidos en los que un polinucleotido tiene la secuencia identica como parte del segundo polinucleotido pero diferentes extremos comprende dos polinucleotidos especlficos diferentes.

“Condiciones de hibridacion rigurosas” significa que se producira hibridacion solo si hay una identidad de al menos el 90%, preferiblemente una identidad de al menos el 95% y lo mas preferiblemente una identidad de al menos el 97% entre las secuencias. Vease Sambrook et al., 1989.

Tambien se incluyen en la invencion polipeptidos que tienen secuencias que son “sustancialmente identicas” a la secuencia de un polipeptido, tal como una de cualquier SEQ ID NO dada a conocer en el presente documento. Una secuencia de aminoacidos “sustancialmente identica” es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia solo en sustituciones de aminoacidos conservativas, por ejemplo, sustituciones de un aminoacido por otro de la misma clase (por ejemplo, sustitucion de un aminoacido hidrofobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina, por otro, o sustitucion de un aminoacido polar por otro, tal como sustitucion de arginina por lisina, acido glutamico por acido aspartico, o glutamina por asparagina).

Adicionalmente una secuencia de aminoacidos “sustancialmente identica” es una secuencia que difiere de una secuencia de referencia en una o mas sustituciones, deleciones o inserciones no conservativas, particularmente cuando se produce una sustitucion de este tipo en un sitio que no es el sitio activo de la molecula, y siempre que el polipeptido conserve esencialmente sus propiedades de comportamiento. Por ejemplo, pueden delecionarse uno o mas aminoacidos de un polipeptido de fitasa, lo que da como resultado la modificacion de la estructura del polipeptido, sin alterar significativamente su actividad biologica. Por ejemplo, pueden eliminarse aminoacidos amino o carboxilo terminales que no se requieren para la actividad biologica de fitasa. Tales modificaciones pueden dar como resultado el desarrollo de polipeptidos de fitasa activos mas pequenos.

Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es mas abundante que cualquier otra especie macromolecular individual en la composicion), y de manera preferible, fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que la especie objeto comprende al menos el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composicion sustancialmente pura comprendera mas del 80 al 90 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion. Lo mas preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composicion mediante metodos de detection convencionales) en la que la composicion consiste esencialmente en una especie macromolecular individual. Las especies de disolvente, moleculas pequenas (<500 Dalton) y especies ionicas elementales no se consideran especies macromoleculares.

Tal como se usa en el presente documento, “oligopeptido molde” significa un anticuerpo molde para el que se desea una biblioteca secundaria de variantes. Tal como apreciaran los expertos en la tecnica, cualquier numero de moldes encuentra uso en la presente invencion. Se incluyen especlficamente dentro de la definition de “anticuerpos” u “oligopeptidos” fragmentos y dominios de anticuerpos conocidos, incluyendo dominios funcionales tales como dominios de union, etc., y fragmentos mas pequenos, tales como giros, bucles, etc. Es decir, tambien pueden usarse partes de un anticuerpo. Ademas, pueden usarse variantes de anticuerpo, es decir, estructuras analogas a anticuerpos que no se producen de manera natural.

Estructuras principales adecuadas de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, todas los que se encuentran en la base de datos recopilada y mantenida por la Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB, anteriormente el Laboratorio Nacional de Brookhaven).

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Tal como se usa en el presente documento, el termino “segmento variable” se refiere a una parte de un peptido naciente que comprende una secuencia aleatoria, pseudoaleatoria o de nucleo definido. Un “segmento variable” se refiere a una parte de un peptido naciente que comprende una secuencia aleatoria, pseudoaleatoria o de nucleo definido. Un segmento variable puede comprender posiciones de residuo tanto variantes como invariantes, y el grado de variation de residuos en una position de residuo variante pueden limitarse: se seleccionan ambas opciones a criterio del profesional. Normalmente, los segmentos variables tienen de 5 a 20 residuos de aminoacido de longitud (por ejemplo, de 8 a 10), aunque los segmentos variables pueden ser mas largos y pueden comprender partes de anticuerpo, tales como un fragmento de anticuerpo.

El termino “salvaje” o “de tipo natural”, significa que el polinucleotido no comprende ninguna mutation. Un anticuerpo “de tipo natural” significa que el anticuerpo sera activo a un nivel de actividad que se encuentra en la naturaleza y comprendera la secuencia de aminoacidos que se encuentra en la naturaleza.

Description detallada de la invention

La divulgation proporciona un metodo de integration de generation y/o selection, evolution y expresion de anticuerpos terapeuticos en un huesped mamlfero para la fabrication en un sistema individual. En una realization del metodo CIAO, se generan, se optimizan y se fabrican anticuerpos terapeuticos en el mismo sistema de huesped mamlfero. En otra realizacion, se descubren y se fabrican agentes terapeuticos proteicos en el mismo huesped. Esto optimiza la fabricacion desde el mismo comienzo, ahorrando costes (tiempo y recursos).

De manera historica, el descubrimiento de anticuerpos se ha realizado en huespedes eucariotas (euc) y procariotas (proc). Normalmente, en bacterias (E. coli), se descubren anticuerpos de longitud parcial; por ejemplo, en tecnologlas de presentation en fago, se recuperan Fab y a veces se convierten en de longitud completa de manera posterior. Existen varias posibles desventajas en estos enfoques.

En un ejemplo, existen algunas pruebas de que regiones de Fc y Fv se comunican para afectar a las propiedades de anticuerpo, tales como union y expresion. Por tanto, cuando un fragmento de anticuerpo se optimiza para una propiedad tal como expresion, la mejora no siempre se traduce en una expresion mejorada en el anticuerpo ensamblado de longitud completa. Por ejemplo, se creo una biblioteca de Fc como intentos de hallar un Fc “santo grial” que pudiera unirse a cualquier Fv para mejorar la expresion en cualquier huesped.

En un aspecto, se realizo mutagenesis de codones en la region constante para la optimization de la expresion en celulas de mamlfero. Especlficamente, se crearon 326 mutantes en la region constante y se expresaron en celulas HEK 293 y CHO-S. Se realizo examen mediante ELISA. Varios Fc cumpllan con los criterios de expresion mejorada, e incluso se identificaron determinados Fc optimizados que transferlan efectos positivos a traves de multiples llneas celulares; sin embargo, cuando se unio un Fv diferente al Fc, la mejora no se tradujo en la expresion. Esto demuestra que los que Fc y Fv se comunican.

Para evitar resultados inesperados tras la recombinacion de fragmentos de anticuerpo, en un aspecto preferido, se usa el metodo CIAO para descubrir moleculas de anticuerpo de longitud completa. En otro aspecto preferido, el metodo CIAO utiliza huespedes euc.

En una realizacion, el sistema eucariota es un sistema de mamlfero que se selecciona de uno del grupo que consiste en las llneas celulares CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK- MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MM1, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT- 474, Caco-2, HCC 1954, MDAMB-468, LnCAP, NRK-49F y SP2/0; y esplenocitos de raton y PBMC de conejo. En un aspecto, el sistema de mamlfero se selecciona de una llnea celular CHO o HEK293. En un aspecto especlfico, el sistema de mamlfero es una llnea celular CHO-S. En otro aspecto especlfico, el sistema de mamlfero es una llnea celular HEK293. En otra realizacion, el sistema eucariota es un sistema de celulas de levadura. En un aspecto, el sistema eucariota se selecciona de celulas de levadura S. cerevisiae o celulas de levadura Picchia.

En otra realizacion, la creation de llneas celulares de mamlfero puede realizarse comercialmente por una organization de investigation por contrato o de fabricacion personalizada. Por ejemplo, para anticuerpos recombinantes u otras protelnas, Lonza (Lonza Group Ltd, Basilea, Suiza) puede crear vectores para expresar producto usando la tecnologla del GS Gene Expression System™ con las llneas celulares huesped o bien CHOK1SV o bien NSO.

En otra realizacion, puede realizarse evolucion en huespedes proc (tales como E. coli) y pueden realizarse examenes en huespedes euc (por ejemplo, CHO), siempre que se produzca el examen en el mismo huesped que el huesped de fabricacion.

Seleccion de anticuerpo(s) candidato(s) llder

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Pueden usarse una variedad de metodos para descubrir, generar y/o seleccionar uno o mas candidatos a anticuerpo terapeutico que van a hacerse evolucionar. Las moleculas seleccionadas pueden ser anticuerpos recombinantes existentes, o pueden proceder de colecciones de anticuerpos recombinantes. Pueden descubrirse anticuerpos recombinantes usando cualquier numero de plataformas de generacion y examen disponibles. Los anticuerpos pueden estar en cualquier forma, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, totalmente humanos, Fab, Fv, Fc, bifuncionales, quimericos, humanizados o totalmente humanos o fragmentos de los mismos. En un aspecto preferido, se usa el metodo CIAO para descubrir moleculas de anticuerpo de longitud completa. Pueden generarse y examinarse bibliotecas de anticuerpos recombinantes usando sistemas de selection o examen en huespedes mamlferos optimizados o no optimizados para proporcionar candidatos para la evolution. Varios sistemas de expresion eucariotas estan publicados, por ejemplo, sistemas de celulas de mamlfero o levadura.

En el metodo de la presente invention, tales sistemas de expresion en mamlfero, en particular sistemas que usan presentation en la superficie celular de moleculas para examen y seleccion, se emplean para identificar y seleccionar candidatos para fabrication, o evolucion seguida por fabrication. Preferiblemente, tales huespedes mamlferos son celulas de fibroblastos (3T3, raton; BHK21, hamster sirio), celulas epiteliales (MDCK, perro; Hela, ser humano; PtK1, rata, canguro), celulas plasmaticas ((SP2/0 y NS0, raton), celulas de rinon (293, ser humano; COS, mono), celulas de ovario (CHO, hamster chino), celulas embrionarias (R1 y E14,1, raton; H1 y H9, ser humano; PER C.6, ser humano). Se emplea la tecnologla de presentacion en la superficie celular para presentar anticuerpos en la superficie de las celulas de mamlfero para su examen. Se clonan protelnas como fusiones con moleculas de membrana que cuando se expresan presentan las protelnas en la superficie de las celulas para un examen de alto rendimiento, rapido, por ejemplo.

En determinadas realizaciones, la divulgation proporciona un metodo de provision de un anticuerpo optimizado. En una realization, se selecciona un antlgeno y se genera una biblioteca de anticuerpos humanos y se expresa en un sistema de mamlfero, por ejemplo, celulas CHO-S. Se examina la biblioteca para identificar coincidencias de anticuerpo totalmente humano, por ejemplo, mediante clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS). Las coincidencias de anticuerpo totalmente humano se examinan/caracterizan entonces adicionalmente mediante cualquier ensayo relevante para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada. En un aspecto, se examinan moleculas evolucionadas para determinar multiples caracterlsticas simultaneamente, por ejemplo, funcion y expresion mejoradas. El ensayo relevante puede comprender por ejemplo, ELISA, o una tecnologla de alineamiento. Se selecciona un anticuerpo molde de las coincidencias de anticuerpo humano. Cualquier metodo de evolucion se realiza con el anticuerpo molde, o un polipeptido fragmento del mismo, para preparar un conjunto de anticuerpos mutantes. En un aspecto, la evolucion se realiza mediante un metodo de modification mediante ingenierla de protelna completa para producir el conjunto de anticuerpos mutantes. El metodo de modificacion mediante ingenierla de protelna completa puede seleccionarse, por ejemplo, de uno o una combination de evolucion de position completa (CPE™), slntesis de protelna completa (CPS™), evolucion flexible, evolucion sinergica, evolucion de insertion de posicion completa (CPI™) o evolucion de deletion de posicion completa (CPD™). En otro aspecto, los anticuerpos mutantes se expresan en el mismo sistema de mamlfero usado para generar la biblioteca de anticuerpos humanos.

El conjunto de anticuerpos mutantes se caracterizan/examina para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada. En un aspecto, el conjunto de anticuerpos mutantes se examina simultaneamente, por ejemplo, para determinar la funcion y expresion mejoradas. En un aspecto, se usa una base de datos especlfica de moleculas en forma de un mapa de posicion funcional (un EvoMap™) para optimization adicional mediante una o mas tecnicas de evolucion de protelnas conocidas en la tecnica; seguida por identification y caracterizacion de mutantes superiores. Se selecciona un anticuerpo optimizado mediante comparacion con el anticuerpo molde con respecto a la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada.

En un aspecto, se realiza la expresion a escala de gramos del anticuerpo optimizado seleccionado; seguida por toxicologla distinta de GLP. Se realiza la transfection de llnea celular estable, el desarrollo del procedimiento y la generacion de un banco de celulas maestro. Se realiza la fabricacion con BPF en el mismo sistema de mamlfero usado para generar la biblioteca de anticuerpos humanos, por ejemplo, celulas CHO-S, para dar como resultado Acm recombinantes terapeuticos optimizados.

En otra realizacion, el metodo CIAO parte de la seleccion de un hibridoma molde o anticuerpo recombinante; la evolucion del anticuerpo para proporcionar un conjunto de anticuerpos mutantes que se examinan mediante el uso de presentacion en la superficie celular de anticuerpos en un sistema de celulas de mamlfero; y se realiza la fabricacion en el mismo sistema de celulas de mamlfero usado para el examen.

En otra realizacion, el hibridoma molde/anticuerpo recombinante seleccionado se humaniza y se examina en el huesped de fabricacion, seguido por la production en el huesped de fabricacion, en el que la etapa de optimizacion (evolucion) se omite completamente.

En otros aspectos de la presente invencion, se realiza la optimizacion de la expresion posterior en huespedes de fabricacion haciendo evolucionar la region Fc del anticuerpo, codones silenciosos en el anticuerpo, y/o el vector y/o

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genes del huesped usados en la expresion de protelnas. En un aspecto, se genera una biblioteca de Fc mediante cualquier tecnica evolutiva. En un aspecto especlfico de optimizacion de la expresion, se realiza CPE con un dominio Fc de un anticuerpo para crear una biblioteca de mutantes de Fc que pueden usarse para seleccionar una pareja optima para cualquier Fv. La optimizacion se disena para una rapida union de todas las variantes de CPE de Fc a cada nueva region Fv. Alternativamente, puede usarse un subconjunto de estos Fc para unirse a diferentes Fv. Cada una de estas combinaciones de variante de CPE de Fc/Fv se examina como un anticuerpo de longitud completa expresado en celulas de mamlfero (por ejemplo CHO, medios rentables) para una expresion optima. Ademas, puede realizarse CPS para examinar todas las permutaciones teoricas de hasta 12 o mas de estas coincidencias de CPE en celulas de mamlfero para determinar la mejora de la expresion. Tambien pueden seleccionarse cambios de codon deseables especlficos para identificar clones con aumento de la expresion. Se identifican codones silenciosos y se realiza cPe en estas posiciones. Esta biblioteca de CPE se examina para identificar coincidencias de expresion optimas. Ademas, pueden usarse todas las permutaciones teoricas de hasta 12 o mas coincidencias de CPE en el procedimiento de CPS para generar una nueva biblioteca que puede examinarse en celulas de mamlfero para determinar una mejora de la expresion. Se usan las coincidencias de mutacion silenciosa de CPS superiores para personalizar la protelna para una expresion optima en una llnea celular y medios especlficos. Esto proporciona la oportunidad de control de la estructura fina de farmacos biosimilares.

Otras zonas para la potenciacion de la expresion incluyen: optimizacion del vector, incluyendo promotor, sitios de corte y empalme, extremos terminales 5' y 3', secuencias flanqueantes, reduction de la deletion y la transposition genica, mejora de actividades genicas de celulas huesped, optimizacion de enzimas de glicosilacion de huesped, y mutagenesis y selection de celulas huesped de ancho cromosomico. Se ha demostrado que secuencias de aminoacidos en 5' son importantes para la potenciacion de la expresion.

Evolution de candidatos llder

Cualquier metodo de evolucion de protelnas puede emplearse para la evolucion simultanea de la optimizacion del rendimiento y la expresion de anticuerpos. La optimizacion del rendimiento de anticuerpos puede incluir la mejora de diversas caracterlsticas tales como afinidad, caracterlsticas farmacocineticas, direccionamiento a tejido, agregacion anticuerpo-protelna, direction de la alta variabilidad de ensayo y modification de otras caracterlsticas in vivo.

Los metodos para hacer evolucionar moleculas, incluyendo candidatos seleccionados de la presente invention, incluyen metodos estocasticos y no estocasticos. Los metodos publicados incluyen enfoques de mutagenesis aleatoria y no aleatoria. Cualquiera de estos enfoques puede emplearse para hacer evolucionar propiedades de los anticuerpos terapeuticos de la presente invencion hacia una caracterlstica deseada, tal como mejor estabilidad a diferentes entornos de pH o temperatura, o mejor expresion en una celula huesped. Otras propiedades potencialmente deseables, tales como actividad catalltica mejorada, estabilidad de protelna mejorada en diversas condiciones, selectividad y/o solubilidad mejoradas, y resultados de expresion mejorados mediante la mejora de caracterlsticas tales como agregacion reducida pueden seleccionarse para experimentos de evolucion.

Se realiza la evolucion directamente en un huesped eucariota, tal como un huesped de celula de mamlfero o un huesped de celula de levadura, que se usara para la production posterior del anticuerpo terapeutico. Pueden hacerse evolucionar candidatos para una expresion optima en el mismo huesped usado para examinar y/o hacer evolucionar y para la fabricacion. Puede lograrse la optimizacion de la expresion mediante la optimizacion de vectores usados (componentes de vector, tales como promotores, sitios de corte y empalme, extremos terminales 5' y 3' y secuencias flanqueantes), modificacion genica de celulas huesped para reducir deleciones y transposiciones genicas, evolucion de actividades genicas de celulas huesped mediante metodos in vivo o in vitro de hacer evolucionar genes relevantes, optimizacion de enzimas de glicosilacion de huesped mediante la evolucion de genes relevantes, y/o mediante estrategias de mutagenesis y seleccion de celulas huesped de ancho cromosomico para seleccionar para celulas con capacidades de expresion potenciadas. Las celulas huesped se describen adicionalmente en el presente documento.

La tecnologla de examen y expresion con presentation en la superficie celular (por ejemplo, tal como se definio anteriormente) puede emplearse para examinar bibliotecas de anticuerpos evolucionados para determinar candidatos que van a fabricarse.

Los metodos actuales de amplio uso para crear mutantes a partir de una molecula de partida son tecnologlas de mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, reacciones en cadena de la polimerasa propensas a errores y mutagenesis por casete, en las que la region especlfica que va a optimizarse se reemplaza por un oligonucleotido mutagenizado de manera sintetica. En estos casos, se generan varios sitios mutantes alrededor de determinados sitios en la secuencia original.

En mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, se reemplaza una secuencia corta por un oligonucleotido mutagenizado de manera sintetica. La PCR propensa a errores usa condiciones de polimerizacion de baja fidelidad para introducir un bajo nivel de mutaciones puntuales de manera aleatoria a lo largo de una secuencia larga. En una mezcla de fragmentos de secuencia desconocida, puede usarse PCR propensa a errores para mutagenizar la

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mezcla. En mutagenesis por casete, un bloque de secuencias de un molde individual se reemplaza normalmente por una secuencia (parcialmente) aleatorizada.

Se han producido genes quimericos uniendo 2 fragmentos de polinucleotido usando extremos cohesivos compatibles generados por enzima(s) de restriccion, en los que cada fragmento se deriva de una molecula progenitora (o parental) independiente. Otro ejemplo es la mutagenesis de una posicion de codon individual (es decir para lograr una sustitucion, adicion o delecion de codon) en un polinucleotido parental para generar un polinucleotido de progenie individual que codifica para un polipeptido mutagenizado en el sitio individual.

Ademas, se han utilizado, sistemas de recombinacion especlficos del sitio in vivo para generar hlbridos de genes, as! como metodos aleatorios de recombinacion in vivo, y recombinacion entre genes homologos pero truncados en un plasmido. Tambien se ha notificado mutagenesis mediante extension solapante y PCR.

Se han usado metodos no aleatorios para lograr mayores numeros de mutaciones puntuales y/o quimerizaciones, por ejemplo se han usado enfoques completos o exhaustivos para generar todas las especies moleculares dentro de una agrupacion particular de mutaciones, para atribuir funcionalidad a grupos estructurales especlficos en un anticuerpo molde (por ejemplo una posicion de aminoacido individual especlfica o una secuencia que se compone de dos o mas posiciones de aminoacidos), y para clasificar y comparar agrupaciones especlficas de mutaciones. La patente estadounidense numero 7033781 titulada “Whole cell engineering by mutagenizing a sustantial portion of a starting genome, combining mutations, and optionally repeating” describe un metodo de hacer evolucionar un organismo hacia caracterlsticas deseadas. La patente estadounidense numero 6764835 titulada “Saturation mutagenesis in directed evolution” y la patente estadounidense numero 6562594 titulada “Synthetic linkage reassembly in directed evolution” describe metodos de hacer evolucionar de manera exhaustiva y examinar para determinar caracterlsticas deseadas de moleculas. Cualquiera de tales metodos puede usarse en el metodo de la presente invencion.

Existe una diferencia entre los metodos conocidos previamente de “mutagenesis por saturacion” y las tecnicas de evolucion “completa” preferidas en el presente documento. Mutagenesis por saturacion se refiere a una tecnica de evolucion en la que se realiza cada cambio posible en cada posicion de un polinucleotido molde o polipeptido molde; sin embargo el cambio en cada posicion no se confirma mediante pruebas, sino que meramente se supone estadlsticamente. Evolucion completa se refiere a una tecnica de evolucion en la que se realiza cada cambio posible en cada posicion de un polinucleotido molde o polipeptido molde y se somete a prueba el polinucleotido o polipeptido para confirmar que se ha realizado el cambio pretendido.

Los metodos de saturacion son metodos inherentemente estadlsticos, no completos y tampoco fueron nunca verdaderamente completos a traves de todas las etapas (por ejemplo, a traves de generacion de mutantes, identificacion de mutantes, expresion de protelnas mutantes, examen de protelnas mutantes y generacion, identificacion, expresion y examen de mutantes superiores recombinados). En tecnicas completas de evolucion, cada molecula se examina y confirma tanto en la primera etapa de mutagenesis, como ademas en una segunda etapa de recombinacion de los mutantes superiores o coincidencias.

A menos que se confirme la mutagenesis por saturacion mediante secuenciacion o algun otro metodo, la tecnica no puede considerarse que sea completa por varios posibles motivos. Por ejemplo, 1) los sistemas de clonacion no son eficaces al 100% debido a errores de clonacion o de slntesis, o es diflcil clonar las moleculas o 2) algunas protelnas son toxicas cuando se expresan y por tanto no pueden expresarse eficazmente. Por tanto, es importante confirmar mediante secuenciacion, o alguna otra tecnica, en cada etapa. Es util puntuar cada etapa para examinar la expresion, de modo que los clones sin expresion no se designen como “negativos” como en el trabajo anterior, solo se puntuen como no expresables. Por tanto, se considera que las tecnicas completas son un sistema no estocastico mas puro que las tecnicas de saturacion, tal como se confirma mediante la etapa de “confirmacion”.

Evolucion de posicion completa

Haciendo referencia a la figura 1, usando un peptido lineal como ejemplo sencillo, en una primera etapa, se genera un conjunto de variantes de aminoacido que se producen de manera natural (o un subconjunto de las mismas, o derivados de aminoacido) para cada codon desde la posicion 1 hasta la n (correspondiendo n al numero de residuos en la cadena de polipeptido) mediante un procedimiento denominado en el presente documento evolucion de posicion completa (CPE™). Este procedimiento se repite para cada cadena de polipeptido de la molecula diana. Un conjunto mlnimo de mutaciones de aminoacido contiene solo un codon para cada uno de los 19 aminoacidos naturales. Sin embargo, se reconoce que cada sistema de expresion puede experimentar sesgo de codones, en el que combinaciones insuficientes de ARNt pueden conducir a detencion de la traduccion, terminacion prematura de la traduccion, desplazamiento de marco de la traduccion e incorporacion incorrecta de aminoacidos. Por tanto, para la optimization de la expresion, cada conjunto contiene hasta 63 codones diferentes, incluyendo codones de terminacion. En la siguiente etapa, se confirman las mutaciones mediante secuenciacion de cada nueva molecula. Tambien pueden emplearse otros metodos de confirmacion.

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Cada conjunto de aminoacidos se examina entonces para determinar al menos uno de:

- Funcion mejorada

- Mutaciones neutras

- Mutaciones inhibidoras

- Expresion

- Compatibilidad del clon con el sistema huesped.

Preferiblemente, se examinan multiples caracterlsticas simultaneamente tales como, por ejemplo, funcion y expresion mejoradas.

Se combinan los datos para cada conjunto para toda(s) la(s) cadena(s) de polipeptido y se genera un mapa funcional detallado (denominado en el presente documento EvoMap™) de la molecula diana. Este mapa contiene informacion detallada sobre como afecta cada mutacion al rendimiento/expresion y/o capacidad de clonacion de la molecula diana. Permite la identificacion de todos los sitios en los que no pueden realizarse cambios sin una perdida de funcion de la protelna (por ejemplo, union antlgeno/receptor en caso de anticuerpos). Tambien muestra donde pueden realizarse cambios sin afectar a la funcion. Identifica ademas cambios que dan como resultado moleculas que no se expresan en el sistema huesped, y por tanto no evalua el efecto de la mutacion.

En la figura 1, se muestra un esquema de un EvoMap™ hipotetico. Cada posicion en el molde se identifica como un sitio restringido (no mutable), un sitio totalmente mutable, un sitio parcialmente mutable o un mutante superior para una sustitucion de aminoacido especlfica. Cada sitio parcialmente mutable pueden designarse ademas como adecuado para sustitucion, por ejemplo, por un residuo cargado, o una sustitucion de residuo apolar, y un clon sin expresion y/o molecula que no puede clonarse en el sistema huesped.

Es posible utilizar el EvoMap™ para reconocer y recombinar sustituciones de aminoacidos individuales beneficiosas, y examinar para optimizar adicionalmente las caracterlsticas deseadas en la molecula diana. Sin embargo, la evolucion de determinadas caracterlsticas puede requerir dos o mas mutaciones simultaneas para poderse observar. El EvoMap™ puede aprovecharse para producir eficazmente, y de manera rentable, un conjunto de polipeptidos mutantes multi-sitio de modo no aleatorio. El conjunto de polipeptidos mutantes multi-sitio puede examinarse entonces para determinar mutantes superiores multi-sitio.

La CPE permite el mapa de mutaciones de anticuerpo confirmadas in vivo completo. La identificacion de todo el conjunto de mutantes superiores permite etapa(s) de evolucion combinatoria adicional(es). Puede utilizarse CPE para reducir el riesgo de inmunogenicidad de anticuerpos evolucionados mediante la seleccion de mutaciones no en superficie; elimination de epltopos de celulas T; y imitation de mutaciones somaticas.

En un aspecto, puede usarse CPE para generar una biblioteca de hasta 5, 10 o 15 aminoacidos, o hasta la totalidad de los 19 aminoacidos. Se realizan cambios en cada posicion en el anticuerpo y se examina para determinar una caracterlstica deseable, tal como la afinidad de union o expresion, y se crea el Evomap™. Pueden usarse tandas posteriores de mutacion y examen para generar los datos para los 19 aminoacidos. A partir del mapa, se identifican sitios totalmente mutables. Estos sitios son utiles para identificar posiciones que pueden modificarse para crear una nueva coleccion de moleculas que pueden producirse y someterse a prueba para determinar caracterlsticas. Por ejemplo, puede emplearse informatica para identificar haplotipos de HLA en la secuencia, y pueden realizarse cambios deseados para evitar estos haplotipos realizando cambios dirigidos especlficos en sitios “neutros” (“totalmente mutables”) identificados a partir del mapa, en los que la caracterlstica neutra no se vera afectada. Esto podrla reducir potencialmente el riesgo de inmunogenicidad (podrlan seleccionarse mutaciones no en superficie, eliminar epltopos de celulas T, imitar mutaciones hipersomaticas). Ademas, el mapa puede mostrar sitios para modificaciones especlficas de sitio (glicosilacion y conjugation qulmica) para mejorar diversas caracterlsticas. Ademas, la optimization de mutaciones silenciosas puede mejorar la expresion de anticuerpos en una variedad de huespedes.

Evolucion sinergica

En una realization de la presente invention, se genera un EvoMap™ y se utiliza para evolucion sinergica, tal como se muestra en la figura 2. En la evolucion sinergica, puede combinarse la mutacion simultanea en 2-20 sitios seleccionados para producir un efecto combinatorio. Se usa el EvoMap™ del polipeptido molde para seleccionar mutaciones puntuales de aminoacido especlficas individuales para el ensamblaje en mutaciones de polipeptido multi-sitio.

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En la evolucion sinergica, se seleccionan mutaciones puntuales de aminoacido no desactivantes de dentro de sitios parcialmente mutables que estan cerca de sitios no mutables en el EvoMap™. En un aspecto, las mutaciones puntuales no desactivantes seleccionadas son adyacentes a sitios no mutables. En la evolucion sinergica, se realiza mutacion simultanea de aminoacidos en de dos a 20 de los sitios seleccionados para efectos combinatorios. En un aspecto, se usa recombinacion de dos a 20 mutaciones seleccionadas para producir una biblioteca de variantes de codon que codifica para una poblacion de polipeptidos mutantes multi-sitio. Despues de la clonacion y expresion, entonces se examinan los polipeptidos mutantes multi-sitio producidos para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada en comparacion con el polipeptido molde. De esta manera, pueden identificarse polipeptidos mutantes superiores multi-sitio. En un aspecto, se producen polipeptidos mutantes multi- sitio mediante slntesis combinatoria de protelnas. Una ventaja de la evolucion sinergica es que no requiere una estructura cristalina de rayos X del anticuerpo para dirigir la evolucion del polipeptido molde. Esta tecnica es util particularmente para anticuerpos con alta variation de ensayo y otros efectos multi-sitio.

Segun la presente invention, las aplicaciones de la evolucion sinergica incluyen, pero no se limitan a evolucion de cambios mecanlsticos moleculares complejos, evolucion de anticuerpos con alta variacion de ensayo, evolucion de la especificidad de anticuerpo, mejora de la expresion en diversos huespedes de expresion, estabilidad y optimization del pH. La evolucion sinergica es aplicable a anticuerpos terapeuticos.

En un aspecto de la presente invencion, puede usarse evolucion sinergica para optimizar uno o mas aspectos de un polipeptido que forma parte de una molecula de anticuerpo. La molecula de anticuerpo puede ensamblarse ligando uno o mas acidos nucleicos mutantes que codifican para polipeptidos con cero, uno o mas acidos nucleicos que codifican para polipeptidos de region de entramado para crear un anticuerpo variante mediante tecnicas de clonacion, traduction y expresion conocidas en la tecnica. En un aspecto, un polipeptido de region de entramado se deriva de una molecula de anticuerpo de tipo natural. En este aspecto, puede usarse la evolucion sinergica junto con tecnicas de humanization de anticuerpos. Por ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal de raton para evolucion y humanizacion. Se clonan y se secuencian las regiones CDR del anticuerpo y pueden sintetizarse regiones CDR individuales (CDR1, CDR2, CDR3) y ligarse a otros nucleotidos que codifican para polipeptidos de region de entramado de anticuerpo humano, seguido por la production de una biblioteca de IgG variante humana. Se examina entonces la biblioteca de IgG variante humana para determinar al menos una propiedad, por ejemplo dos o mas propiedades incluyendo funcion y expresion mejoradas, en comparacion con el Acm de raton. En otro aspecto, un polipeptido de region de entramado es un polipeptido de armazon artificial. En la section de ejemplos, se presentan tecnicas especlficas de preparation de fragmentos de ADN bc, ligamiento y ensamblaje de acidos nucleicos, clonacion, transfection, expresion, slntesis en fase solida de bibliotecas, slntesis en fase de disolucion de bibliotecas, evolucion de position completa, slntesis combinatoria de protelnas, cuantificacion de la expresion mediante cuantificacion por ELISA y ensayo de b-galactosidasa y ELISA funcional.

En otra realization de la invencion, puede usarse la evolucion sinergica para potenciar la afinidad de union de un anticuerpo. En esta realizacion, puede realizarse la optimizacion de la region variable del anticuerpo. Por ejemplo, para la produccion de mutantes de anticuerpo, se realiza CPE para regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo seleccionado y se genera un EvoMap™. Se seleccionan mutantes para reensamblaje; por ejemplo, se seleccionan variantes de la cadena ligera y se seleccionan variantes de la cadena pesada para el ensamblaje. Se seleccionan mutaciones puntuales de aminoacido no desactivantes de dentro de sitios parcialmente mutables que estan cerca de sitios no mutables. Puede usarse la tecnologla de reemsamblaje que utiliza CPS para crear una biblioteca de cadenas pesadas. Pueden combinarse las variantes de cadena ligera con las variantes de cadena pesada, clonarse, expresarse y se examinan las variantes como IgG completas de sobrenadantes de llneas celulares eucariotas. Se evalua la afinidad de union para determinadas variantes mediante, por ejemplo, el uso de ensayos de instrumentation ELISA, BIAcore y/o Sapidyne, u otras tecnicas conocidas por un experto en la tecnica.

Evolucion flexible

En otra realizacion, puede usarse CPE/EvoMap para identificar y aprovechar sitios totalmente mutables. En un aspecto, el aprovechamiento de multiples sitios totalmente mutables se denomina evolucion flexible y se usa para realizar cambios dirigidos tales como introduction de sitios para glicosilacion (por ejemplo codones para aminoacidos para glicosilacion unida a N u O; Asn dentro de la secuencia consenso Asn-Aa-Ser-Thr o Ser/Thr) y conjugation qulmica. Tambien puede usarse evolucion flexible en el diseno de sitios de escision con proteasa, introduccion de etiquetas para purification y/o detection, marcaje especlfico del sitio, y similares. Ademas, puede utilizarse la optimizacion de codones de mutaciones silenciosas para la mejora de la expresion de anticuerpos. En esta realizacion, denominada evolucion flexible, tras la expresion de anticuerpos, las bibliotecas de polipeptidos mutantes producidas se vuelven a examinar para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada en comparacion con el polipeptido molde. En un aspecto, la propiedad predeterminada incluye reduction de la agregacion anticuerpo-protelna, potenciacion de la estabilidad de anticuerpo, o aumento de la solubilidad de anticuerpo. En un aspecto, las bibliotecas de polipeptidos mutantes se examinan para determinar dos o mas propiedades simultaneamente. En otro aspecto, puede usarse cualquier sistema de expresion eucariota que glicosila para la introduccion de sitios de glicosilacion, tal como, por ejemplo, llneas celulares de mamlferos, plantas, levaduras e insectos.

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En la evolucion flexible, la evaluacion de la bioinformatica y estructuras cristalinas de rayos X de anticuerpo de anticuerpos relacionados, o el anticuerpo o polipeptido molde, es util para la optimizacion de moldes. En un aspecto, sitios seleccionados no son residuos en contacto. En otro aspecto, la selection de mutaciones de anticuerpo no en superficie permite un riesgo reducido de inmunogenicidad.

Las aplicaciones de la evolucion flexible incluyen, pero no se limitan a, reduction de la agregacion anticuerpo- protelna, mejora de la solubilidad de anticuerpos, optimizacion de la farmacocinetica a traves de bibliotecas de glicosilacion, optimizacion de la estructura secundaria y terciaria de anticuerpos y desinmunizacion de sitios antigenicos directamente a traves de o bien conjuntos de mutation o bien indirectamente a traves de enmascaramiento de glicosilacion.

En un aspecto de la evolucion flexible, se utiliza un EvoMap™ para identificar sitios totalmente mutables, se realiza generation de CPS con insertion de residuos de glicosilacion en sitios totalmente mutables (o mutaciones silenciosas para efectos de traduction), y se realiza el examen de la biblioteca glicosilada combinatoria mediante analisis analltico (por ejemplo analisis mediante espectrometrla de masas, dispersion dinamica de la luz), reduccion de la inmunogenicidad (mediante bioinformatica o ensayo) y/o analisis farmacocinetico (por ejemplo en ratones Foxnlnu).

En un aspecto, puede usarse evolucion flexible para desinmunizacion para eliminar la inmunogenicidad mientras que se mantiene la funcion. Puede realizarse desinmunizacion mediante evolucion flexible enmascarando la inmunogenicidad con glicosilacion, identification de sustituciones de aminoacidos de espectros de mutaciones hipersomaticas humanas que pueden eliminar la inmunogenicidad mientras que se mantiene la funcion, reduccion de la dosis para eludir una posible inmunogenicidad, y minimization de cambios de residuo de aminoacido no en superficie. Ademas, pueden usarse bases de datos de inmunogenicidad y algoritmos para identificar y reemplazar posibles epltopos de union a CMH. En un aspecto, se acopla la prediction de modification in silico con datos de CPE/CPS para generar variantes.

Pueden medirse la propension reducida a generar epltopos de celulas T y/o la desinmunizacion mediante tecnicas conocidas en la tecnica. Preferiblemente, puede someterse a prueba in vitro la desinmunizacion de protelnas mediante un ensayo de proliferation de celulas T. En este ensayo, se examinan PBMC de donantes que representan > 80% de alelos de HLA-DR en el mundo, para determinar la proliferacion en respuesta a polipeptidos o bien de tipo natural o bien desinmunizados. De manera ideal, solo se detecta proliferacion celular tras la carga de las celulas presentadoras de antlgeno con peptidos de tipo natural. Los ensayos adicionales para determinar la desinmunizacion incluyen ensayos de reestimulacion in vitro de PBMC humanos (por ejemplo ELISA para interferon- gamma (TH1) o IL4 (TH2)). Alternativamente, puede someterse a prueba la desinmunizacion mediante la expresion de tetrameros de HLA-DR que representan todos los haplotipos. Para someter a prueba si se presentan peptidos desinmunizados en haplotipos de HLA-DR, puede medirse la union de, por ejemplo, peptidos marcados con fluorescencia en PBMC. La medicion de ratones transgenicos para HLA de clase I y clase II para determinar las respuestas al antlgeno diana (por ejemplo interferon-gamma o IL4). Alternativamente, el examen de biblioteca de epltopos con celulas T educadas (CMHI nonamerico; CMHII icosamerico) de ensayos de PBMC y/o raton transgenico. Ademas, puede probarse la desinmunizacion determinando si se han generado anticuerpos contra las moleculas desinmunizadas despues de la administration en pacientes.

En otra realization, las tecnicas flexibles de evolucion de la presente invention pueden utilizarse para la optimizacion de la expresion. En un aspecto, la presente invencion da a conocer la utilizacion de metodos de modificacion mediante ingenierla de protelnas para desarrollar variantes de Fc con codones optimizados con mutacion silenciosa con expresion mejorada en celulas eucariotas. Una mutacion silenciosa es una en la que una variation de la secuencia de ADN no da como resultado un cambio en la secuencia de aminoacidos del anticuerpo. En un aspecto, se realiza mutagenesis de codones en la region constante para la optimizacion de la expresion en celulas eucariotas. Una variante de Fc con codones optimizados con propiedades de expresion mejorada al tiempo que conserva la capacidad para mediar en funciones efectoras mejora la production de anticuerpos terapeuticos. En este aspecto, por ejemplo, puede hacerse evolucionar una region constante de una molecula de anticuerpo para examinar en diferentes huespedes de expresion, por ejemplo, examen de la expresion de llneas celulares de mamlfero utilizando CHO, HEK293 y COS-7. En la figura 3, se muestra un ejemplo de optimizacion de la expresion mediante mutagenesis de codones en la region constante para la expresion en celulas de mamlfero y se describe en el ejemplo 19. Los niveles de expresion mostrados son cada uno un promedio de 4 puntos de datos, y se confirmaron a lo largo de multiples experimentos. Se demostro la capacidad de multiples llneas celulares para el primer mutante sometido a prueba en sistemas de expresion de llnea celular HEK293 y CHO.

Ademas, puede usarse el EvoMap™ para generar modelos moleculares tridimensionales computacionales del oligopeptido, o regiones especlficas del mismo, para explorar los mecanismos estructurales implicados en, por ejemplo, estabilidad y especificidad anticuerpo-epltopo. Se muestra un EvoMap™ tridimensional hipotetico en la figura 13.

Tambien puede combinarse la information en EvoMap con information estructural (si esta disponible) para

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seleccionar por ejemplo, solo residuos de superficie para mutaciones para aumentar la solubilidad/disminuir la agregacion.

Evolucion de insercion de posicion completa

En una realizacion, la divulgacion proporciona metodos de identification de y mapeo de polipeptidos mutantes formados a partir de, o basados en, un polipeptido molde. Haciendo referencia a la figura 8, usando un peptido lineal como ejemplo sencillo, en una primera etapa, se genera un conjunto de variantes de aminoacido que se producen de manera natural (o un subconjunto de las mismas, o derivados de aminoacido) para cada codon desde la posicion 2 hasta la n (correspondiendo n al numero de residuos en la cadena de polipeptido) mediante un procedimiento denominado en el presente documento as evolucion de insercion de posicion completa (CPI™).

En la CPI™, se inserta un aminoacido despues de cada aminoacido en la totalidad de un polipeptido molde uno cada vez para generar un conjunto de polipeptidos alargados. Puede usarse CPI para insertar 1, 2, 3, 4, o hasta 5 nuevos sitios cada vez. Cada uno de los 20 aminoacidos se anade en cada nueva posicion, uno cada vez, creando un conjunto de 20 moleculas diferentes en cada nueva posicion anadida en el molde. En este caso, se salta la posicion 1, que es metionina e invariante. Este procedimiento se repite para cada cadena de polipeptido de la molecula diana. Un conjunto mlnimo de mutaciones de aminoacido contiene solo un codon para cada uno de los 20 aminoacidos naturales.

La presente invention se refiere a metodos de identificacion de y mapeo de polipeptidos mutantes formados a parti r de, o basados en, un polipeptido molde. Normalmente, el polipeptido comprendera n residuos de aminoacido, en el que el metodo comprende (a) generar n+[20 x (n-1)] polipeptidos independientes, en los que cada polipeptido difiere del polipeptido molde en que se ha insertado despues de cada posicion en el molde cada uno de los 20 aminoacidos uno cada vez (tal como se ilustra en la figura 1); someter a ensayo cada polipeptido para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y (b) para cada miembro identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracterlstica o actividad en relation con el polipeptido molde.

En una realizacion, se seleccionan una o mas regiones para mutagenesis para anadir una posicion cada vez tal como se describio anteriormente. En tal caso, n representa un subconjunto o region del polipeptido molde. Por ejemplo, cuando el polipeptido es un anticuerpo, todo el anticuerpo o una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo se someten a mutagenesis para anadir una posicion cada vez en el polipeptido molde despues de cada posicion.

La invencion incluye por tanto metodos de mapeo de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde que tiene al menos una, y preferiblemente seis, regiones determinantes de la complementariedad (CDR), comprendiendo las CDR en conjunto n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo (a) generar n+[20 x (n-1)] anticuerpos independientes, en el que cada anticuerpo difiere del anticuerpo molde en que se ha insertado una posicion predeterminada individual, una cada vez, despues de cada posicion en la secuencia molde; (b) someter a ensayo cada conjunto para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y (c) para cada miembro identificar cualquier cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde. Para anticuerpos, la propiedad, caracterlstica o propiedad predeterminada pueden ser la afinidad de union y/o la inmunogenicidad, por ejemplo.

Ademas, se proporcionan metodos de production de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde que tiene al menos una region determinante de la complementariedad (CDR), comprendiendo la CDR n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo: (a) generar n+[20 x (n-1)] anticuerpos independientes, en los que cada anticuerpo difiere del anticuerpo molde en que tiene un aminoacido extra anadido en una posicion individual predeterminada de la CDR. En otra realizacion, el anticuerpo comprende seis CDR, y en conjunto las CDR comprenden n residuos de aminoacido.

En otra realizacion, los nuevos polipeptidos alargados descritos anteriormente se mutan adicionalmente y se mapean despues del examen para identificar un cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido acortado. Normalmente, el polipeptido alargado comprendera n residuos de aminoacido, en el que el metodo comprende (a) generar n (n-1 en el caso en el que el residuo inicial sea metionina) conjuntos independientes de polipeptidos, comprendiendo cada conjunto polipeptidos miembro que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada del polipeptido; en el que cada conjunto de polipeptidos difiere en la posicion individual predeterminada; someter a ensayo cada conjunto para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; (b) para cada miembro identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde; y opcionalmente (c) crear un mapa funcional que refleje tales cambios. Preferiblemente, el numero de polipeptidos miembros diferentes generados es equivalente a n x X (o [n-1] x X, segun sea el caso).

Como alternativa, el metodo comprende generar una poblacion individual que comprende los conjuntos de

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polipeptidos mutados de los polipeptidos alargados. En esta realizacion, se examina toda la nueva poblacion, se identifican los miembros individuales y se genera el mapa funcional.

Normalmente, cuando se usa cada aminoacido que se produce de manera natural, X sera 19 (representando los 20 residuos de aminoacido que se producen de manera natural y excluyendo el residuo particular presente en una posicion dada del polipeptido molde). Sin embargo, puede usarse en la totalidad cualquier subconjunto de aminoacidos, y cada conjunto de polipeptidos pueden sustituirse por la totalidad o un subconjunto del X total usado para toda la poblacion.

Sin embargo, se reconoce que cada sistema de expresion puede experimentar sesgo de codones, en el que combinaciones insuficientes de ARNt pueden conducir a detencion de la traduccion, terminacion prematura de la traduccion, desplazamiento de marco de la traduccion e incorporacion incorrecta de aminoacidos. Por tanto, para la optimization de la expresion, cada conjunto contiene hasta 63 codones diferentes.

Cada conjunto de aminoacidos se examina entonces para determinar al menos una, y preferiblemente dos o mas, caracterlstica deseables tales como funcion mejorada; mutaciones neutras, mutaciones inhibidoras y expresion.

En un aspecto, los polipeptidos alargados pueden mapearse para identificar un cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad que da como resultado los polipeptidos acortados en relation el “tipo natural”. Se combinan los datos para cada conjunto para todo el polipeptido, o “molecula diana”. Pueden usarse entonces las coincidencias del examen de los polipeptidos alargados (moleculas diana) para la mutagenesis completa adicional de cadena(s) y el examen tal como se describe en el presente documento. Los datos de mutagenesis proporcionan que se genere un mapa funcional detallado (denominado en el presente documento EvoMap™) de la molecula diana. Este mapa contiene information detallada sobre como afecta cada mutation al rendimiento/expresion de la molecula diana. Permite la identification de todos los sitios en los que no pueden realizarse cambios sin una perdida de la funcion del anticuerpo (o union a antlgeno/receptor de anticuerpos). Tambien muestra donde pueden realizarse cambios sin afectar a la funcion.

En otro aspecto, puede usarse CPE para generar una biblioteca de 5, 10, hasta 15, o hasta los 19 aminoacidos en cada posicion de interes.

Evolution de deletion de posicion completa

La evolucion de delecion de posicion completa (CPD™) se refiere a metodos de identificacion de y mapeo de polipeptidos mutantes formados a partir de, o basados en, un polipeptido molde. La evolucion de CPD deleciona cada aminoacido a traves del anticuerpo una posicion cada vez. Normalmente, el polipeptido comprendera n residuos de aminoacido, en el que el metodo comprende (a) generar n-1 (n-2 en el caso en el que el residuo inicial es metionina) polipeptidos independientes, en el que cada polipeptido difiere del polipeptido molde en que carece de una posicion predeterminada individual; someter a ensayo cada polipeptido para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y (b) para cada miembro identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde.

En una realizacion de evolucion de CPD, se seleccionan una o mas regiones para mutagenesis para eliminar una posicion cada vez. En tal caso, n representa un subconjunto o region del polipeptido molde. Por ejemplo, cuando el polipeptido es un anticuerpo, todo el anticuerpo o una o mas regiones determinates de la complementariedad (CDR) del anticuerpo se someten a mutagenesis para eliminar una posicion cada vez en el polipeptido molde.

En una realizacion, CPD incluye por tanto metodos de mapeo de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde que tiene al menos una, y preferiblemente seis, regiones determinantes de la complementariedad (CDR), comprendiendo las CDR en conjunto n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo (a) generar (n-1) anticuerpos independientes, en el que cada anticuerpo difiere del anticuerpo molde en que carece de una posicion predeterminada individual; (b) someter a ensayo cada conjunto para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y (c) para cada miembro identificar cualquier cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde. Para anticuerpos, la propiedad, caracterlstica o propiedad predeterminada puede ser la afinidad de union y/o la inmunogenicidad, por ejemplo.

Un aspecto de la evolucion de CPD incluye metodos de production de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde que tiene al menos una region determinante de la complementariedad (CDR), comprendiendo la CDR n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo: (a) generar n-1 anticuerpos independientes, en el que cada anticuerpo difiere del anticuerpo molde en que carece de una posicion predeterminada individual de la CDR. En otra realizacion, el anticuerpo comprende seis CDR, y en conjunto las CDR comprenden n residuos de aminoacido.

En otra realizacion de la evolucion de CPD, los nuevos polipeptidos acortados descritos anteriormente se mutan y se

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mapean adicionalmente tras el examen para identificar un cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido acortado. Normalmente, el polipeptido acortado comprendera n residuos de aminoacido, en el que el metodo comprende (a) generar n (n-1 en el caso en el que el residuo inicial es metionina) conjuntos independientes de polipeptidos, comprendiendo cada conjunto polipeptidos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada del polipeptido; en el que cada conjunto de polipeptidos difiere en la posicion individual predeterminada; someter a ensayo cada conjunto para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; (b) para cada miembro identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde; y (c) crear un mapa funcional que refleje tales cambios. Preferiblemente, el numero de polipeptidos miembros diferentes generados es equivalente a n x X (o [n-1] x X, tal como puede ser el caso).

Como alternativa, el metodo de CPD comprende generar una poblacion individual que comprende los conjuntos de polipeptidos mutados a partir de los polipeptidos acortados. En esta realization, se examina toda la nueva poblacion, se identifican los miembros individuales y se genera el mapa funcional. Normalmente, cuando se usa cada aminoacido que se produce de manera natural, X sera 19 (representando los 20 residuos de aminoacido que se producen de manera natural y excluyendo el residuo particular presente en una posicion dada del polipeptido molde). Sin embargo, puede usarse en la totalidad cualquier subconjunto de aminoacidos, y cada conjunto de polipeptidos puede sustituirse por la totalidad o un subconjunto del X total usado para toda la poblacion.

Puede usarse cualquier medio de mutation o sintetico para generar el conjunto de mutantes en la evolution de CPD. En una realizacion, la generation de polipeptidos comprende (i) someter un polinucleotido que contiene codones que codifica para el polipeptido molde a amplification basada en polimerasa usando un oligonucleotido degenerado 64 veces para cada codon que va a mutagenizarse, en el que cada uno de los oligonucleotidos degenerados 64 veces se compone de una primera secuencia homologa y una secuencia de triplete N,N,N degenerada, de modo que se genera un conjunto de polinucleotidos de progenie; y (ii) someter el conjunto de polinucleotidos de progenie a amplificacion clonal de manera que se expresan polipeptidos codificados por los polinucleotidos de progenie.

En una realizacion de evolucion de CPD, todo el polipeptido acortado se somete a mutagenesis por saturation. En otra realizacion, se seleccionan una o mas regiones para mutagenesis por saturacion. En tal caso, n representa un subconjunto o region del polipeptido molde. Por ejemplo, cuando el polipeptido es un anticuerpo, todo el anticuerpo o una o mas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo se someten a mutagenesis por saturacion.

La divulgation de la evolucion de CPD incluye por tanto metodos de mapeo de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde acortado que tiene al menos una, y preferiblemente seis, regiones determinantes de la complementariedad (CDR), comprendiendo las CDR en conjunto n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo (a) generar n conjuntos independientes de anticuerpos, comprendiendo cada conjunto anticuerpos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada de la CDR; en el que cada conjunto de anticuerpos difiere en la posicion individual predeterminada; y el numero de anticuerpos miembros diferentes generados es equivalente a n x X; (b) someter a ensayo cada conjunto para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; (c) para cada miembro identificar cualquier cambio en una propiedad, caracterlstica o actividad en relacion con el polipeptido molde; y (d) crear un mapa de posicion estructural de tales cambios. Para anticuerpos, la propiedad, caracterlstica o propiedad predeterminada puede ser la afinidad de union y/o la inmunogenicidad. Tal como se expuso anteriormente, como alternativa puede generarse una poblacion individual que comprende todos los conjuntos de anticuerpos mutados.

Ademas, se proporcionan metodos de production de un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir de un anticuerpo molde acortado que tiene al menos una region determinante de la complementariedad (CDR), comprendiendo la CDR n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo: (a) generar n conjuntos independientes de anticuerpos, comprendiendo cada conjunto anticuerpos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada de la CDR; en el que cada conjunto de anticuerpos difiere en la posicion individual predeterminada; y el numero de anticuerpos miembros diferentes generados es equivalente a n x X. En otra realizacion, el anticuerpo comprende seis CDR, y en conjunto las CDR comprenden n residuos de aminoacido.

El metodo de evolucion de CPD™ incluye un mapa de posicion funcional (EvoMap™) producido mediante los metodos descritos en el presente documento. En una realizacion adicional, determinados residuos particularmente sensibles al cambio pueden indicarse as! en el EvoMap™. Puede implementarse una optimization adicional realizando cambios de mutacion por adicion en posiciones fuera de estas posiciones sensibles. Tambien es posible utilizar el EvoMap™ para reconocer y recombinar sustituciones de aminoacidos individuales beneficiosas, y examinar para optimizar adicionalmente las caracterlsticas deseadas en la molecula diana, en un procedimiento denominado slntesis combinatoria de protelnas (CPS™).

Slntesis combinatoria de protelnas

La slntesis combinatoria de protelnas (CPS™) implica combinar coincidencias individuales de CPE, CPI, CPD, o cualquier otra tecnica de evolucion para combinar dos o mas mutaciones. Se usa CPS para sintetizar anticuerpos con mutaciones combinadas que luego se examinan para determinar caracterlsticas de genes y anticuerpos optimizados. En la figura 3 se muestra un esquema de CPS™. En un aspecto, se combinan en la cPs dos o mas 5 mutaciones puntuales que dan como resultado mutantes superiores o mutaciones neutras.

En una realizacion, se combina CPE con CPS para crear mutantes, que se examinan para detectar la propiedad deseada. En un aspecto, pueden ahorrarse tiempo y recursos en el procedimiento de CPE cambiando 2 aa o 3 aa o 4 aa cada vez frente a uno cada vez; de modo que si el numero de aa en el anticuerpo es N, el numero total generado y examinado para 2 aa cada vez serla (2o2) x^N; 3 cada vez serla (203) x1/3N, etc. Por ejemplo, en un 10 aspecto especlfico, (en el ejemplo de 2 aa): se combina el 1° aa en la 1a posicion de aa con los 20 en la 2a posicion de aa y los demas aa permanecen igual, luego se combina el 2° aa en la 1a posicion de aa con los 20 en la 2a posicion de aa y los demas aa permanecen iguales. Se examina toda la poblacion para detectar mutantes superiores y luego se realiza mutacion en el segundo conjunto de los siguientes dos aa mas adelante. En un aspecto similar, esto puede realizarse para 3 aa cada vez o 4 aa cada vez. En otro aspecto, se sigue opcionalmente el procedimiento 15 de CPE con CPS de mutantes superiores (incluyendo cualquier subconjunto de los mismos).

En un aspecto, pueden incorporarse aminoacidos no naturales en el procedimiento (de modo que los otros 19 aminoacidos, o un subconjunto de los mismos, mas aminoacidos no naturales) usando tecnologlas novedosas tales como el codon cuadruplete descrito en los artlculos adjuntos y relacionados. Neumann et al. Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome Nature 464, 441-444 (14 de febrero de 2010). 20 En este aspecto se realiza CPE/CPS para la incorporacion de aminoacidos no naturales.

En un aspecto adicional, toda la biblioteca de CPE se crea de manera sintetica (sintetizando todas las moleculas en maquinas disponibles comercialmente). En el caso que de la maquina de slntesis no pueda crear hebras suficientemente grandes, se sintetizan fragmentos y luego se ligan para generar moleculas de longitud completa. Esta biblioteca se examina y se sigue con CPS para combinar mutaciones deseadas. Este es un procedimiento en 25 dos etapas en el que la CPE va seguida por CPS, no una etapa de solo CPE.

En otro aspecto, se genera una biblioteca de CPE y se examina, seguido luego por combinar mediante CPS mutantes superiores tal como sigue: si hay 10 mutantes superiores, se somete a prueba una molecula individual con los 10 cambios, luego se someten a prueba todas las versiones de 9 mutaciones, luego 8, 7, 6, 5 etc. hasta que uno de los grupos no encuentra una molecula mejorada con respecto a cualquiera en el grupo anterior. Una vez que se 30 identifica una molecula mejorada, puede terminarse el procedimiento.

En un aspecto adicional, se realiza CPE para identificar mutantes superiores y mutaciones neutras para determinar la afinidad y expresion, luego se realiza CPS con combinaciones de mutantes superiores y mutaciones neutras, y vuelve a examinarse la biblioteca para detectar mejoradas adicionales en caracterlsticas tales como funcion, afinidad y/o expresion.

35 En un aspecto adicional, se realiza CPE en codones del Fc u otro dominio para detectar cambios de glicosilacion.

En otro aspecto, puede realizarse CPE o CPE combinada con CPS de microARN o intrones.

En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinada con CPS de CDR de anticuerpos de roedor, luego se examinan para detectar mutantes superiores, seguido por humanizacion.

En un aspecto, se realiza CPE o CPE combinada con CPS para producir nucleotidos intermedios alternativos que 40 conducen a la mutacion deseada en la reaccion final, por ejemplo, una citosina metilada que se convierte en un uracilo.

En un aspecto, se utiliza CPE o CPE combinada con CPS mas informatica para convertir CDR de raton en CDR humanas y viceversa.

En un aspecto, se utiliza CPE o CPE combinada con CPS con 2 y 3 mutaciones separadas por todo el anticuerpo.

45 En otro aspecto, se usa CPE o CPE combinada con CPS en un vector de cadena doble para evaluacion de examen para detectar un aumento de sensibilidad.

En un aspecto adicional, se utiliza CPE o CPE combinada con CPS para seleccionar cambios alostericos.

Puede usarse cualquiera de varias tecnicas de examen para evaluar mutantes de CPE/CPS. En un aspecto pueden secretarse mutantes de CPE o CPE combinada con CPS y presentarse en huespedes eucariotas. Alternativamente, 50 pueden producirse mutantes de CPE o CPE combinada con CPS en E. coli y examinarse en huespedes eucariotas.

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En otro aspecto, se realiza CPE partiendo de 15 aa o 10 aa y seguida por CPS; luego seguida por el resto de los 19 aa restantes. En otro aspecto, se utiliza CPE o CPE combinada con CPS para hacer evolucionar anticuerpos especlficamente con cambios de aminoacidos que no estan en la superficie. En un aspecto, puede utilizarse CPE para mapeo epitopico multidimensional. En otro aspecto, puede realizarse examen mediante cPe o CPE combinada con CPS de manera transitoria en celulas eucariotas. En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinada con CPS, luego se realiza la secuenciacion y el alineamiento de todos los clones, por ejemplo, en un formato basado en chip o basado en pocillo para la expresion y el examen. En otro aspecto, se utiliza CPE o CPE combinada con CPS para hacer evolucionar la coordinacion de iones de metal seleccionando concentraciones de iones variables. En un aspecto adicional, se realiza CPE o CPE combinada con CPS, y se expresan y examinan anticuerpos en condiciones libres de celulas y en organismos vivos no humanos. En un aspecto, se realiza el examen mediante CPE o CPE combinada con CPS de celulas madre para determinar efectos variables sobre la diferenciacion y la expresion de anticuerpos y ARN y ARNm. En un aspecto adicional, se realiza el examen multiplex mediante CPE o CPE combinada con CPS para detectar multiples caracterlsticas de anticuerpos como expresion y union. En otro aspecto, se realiza CPE o CPE combinada con CPS en moleculas molde que participan en el transporte cerebral y el cruce de membranas; y se examinan mutantes para detectar caracterlsticas mejoradas. En un aspecto, se examinan mutantes de CPE o CPE combinada con CPS para detectar caracterlsticas higroscopicas de anticuerpos. En otro aspecto, se someten a ensayo mutantes de CPE o CPE combinada con CPS para seleccionar anticuerpos dinamicos. En un aspecto, se realiza el examen mediante CPE o CPE combinada con CPS fuera de la condicion objetivo para identificar mutantes dentro de la condicion objetivo y viceversa.

En una realizacion, se utiliza cualquiera de los aspectos anteriores de CPE o CPE combinada con CPS en combinacion con un metodo seleccionado de CPT, CPD, y combinacion de CPD con CPI.

En otra realizacion, se utiliza cualquiera de los aspectos anteriores de CPE o CPE combinada con CPS en combinacion con un metodo seleccionado de evolucion flexible y evolucion sinergica realizadas a partir de un molde.

El termino “molde” puede referirse a un polipeptido base o a un polinucleotido que codifica para tal polipeptido. Tal como apreciarla un experto en la tecnica, puede usarse cualquier molde en los metodos y las composiciones de la presente invencion. Pueden usarse moldes que pueden mutarse y de ese modo hacerse evolucionar para guiar la slntesis de otro polipeptido o biblioteca de polipeptidos tal como se describe en la presente invencion. Tal como se describe en mas detalle en el presente documento, el molde que puede hacerse evolucionar codifica para la slntesis de un polipeptido y puede usarse posteriormente para descodificar la historia de slntesis del polipeptido, para amplificar indirectamente el polipeptido, y/o para hacer evolucionar (es decir, diversificar, seleccionar y amplificar) el polipeptido. El molde que puede hacerse evolucionar es, en determinadas realizaciones, un acido nucleico. En determinada realizacion de la presente invencion, el molde se basa en un acido nucleico. En otras realizaciones, el molde es un polipeptido.

Los moldes de acido nucleico usados en la presente invencion estan compuestos por ADN, ARN, un hlbrido de ADN y ARN, o un derivado de ADN y ARN, y pueden ser mono o bicatenarios. La secuencia del molde se usa para codificar para la slntesis de un polipeptido, preferiblemente un compuesto que no es, o no se parece a, un acido nucleico o analogo de acido nucleico (por ejemplo, un pollmero no natural o una molecula pequena). En el caso de determinados pollmeros no naturales, el molde de acido nucleico se usa para alinear las unidades de monomero en la secuencia en la que aparecen en el pollmero y ponerlos en proximidad estrecha a unidades de monomero adyacentes a lo largo del molde de modo que reaccionaran y se uniran mediante un enlace covalente. En otras determinadas realizaciones, el molde puede utilizarse para generar pollmeros no naturales mediante amplification por PCR de una biblioteca de molde de ADN que consiste en una region aleatoria de nucleotidos.

Se apreciara que el molde puede variar enormemente en el numero de bases. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el molde puede ser de 10 a 10.000 bases de longitud, preferiblemente entre 10 y 1.000 bases de longitud. La longitud del molde dependera por supuesto de la longitud de los codones, la complejidad de la biblioteca, la longitud del pollmero no natural que va a sintetizarse, la complejidad de la molecula pequena que va a sintetizarse, el uso de secuencias espaciadoras, etc. La secuencia de acido nucleico puede prepararse usando cualquier metodo conocido en la tecnica para preparar secuencias de acido nucleico. Estos metodos incluyen metodos tanto in vivo como in vitro incluyendo pCr, preparation de plasmidos, digestion con endonucleasas, slntesis en fase solida, transcription in vitro, separation de hebras, etc. En determinadas realizaciones, el molde de acido nucleico se sintetiza usando un sintetizador de ADN automatizado.

Tal como se comento anteriormente, en determinadas realizaciones de la invencion, el metodo se usa para sintetizar polipeptidos que no son, o no se parecen a, acidos nucleicos o analogos de acido nucleico. Por tanto, en determinadas realizaciones de la presente invencion, el molde de acido nucleico comprende secuencias de bases que codifican para la slntesis de un pollmero no natural o molecula pequena. El mensaje codificado en el molde de acido nucleico comienza preferiblemente con un codon especlfico que lleva a su lugar un sitio qulmicamente reactivo a partir del cual puede tener lugar la polimerizacion, o en el caso de sintetizar una molecula pequena el codon de “initiation” puede codificar para un anti-codon asociado con un armazon de molecula pequena o un primer reactante. El codon de “iniciacion” de la presente invencion es analogo al codon de “iniciacion”, ATG, que codifica

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para el aminoacido metionina.

En aun otras realizaciones de la invencion, el propio molde de acido nucleico puede modificarse para que incluya un sitio de iniciacion para la slntesis de pollmeros (por ejemplo, un nucleofilo) o un armazon de molecula pequena. En determinadas realizaciones, el molde de acido nucleico incluye un bucle en horquilla en uno de sus extremos que termina en un grupo reactivo usado para iniciar la polimerizacion de las unidades de monomero. Por ejemplo, un molde de ADN puede comprender un bucle en horquilla que termina en un grupo amino en 5', que puede estar protegido o no. A partir del grupo amino puede comenzar la polimerizacion del pollmero no natural. El grupo amino reactivo tambien puede usarse para unir un armazon de molecula pequena sobre el molde de acido nucleico con el fin de sintetizar una biblioteca de moleculas pequenas.

Para terminar la slntesis del pollmero no natural, debe incluirse un codon de “terminacion” en el molde de acido nucleico preferiblemente en el extremo de la secuencia codificante. El codon de “terminacion” de la presente invencion es analogo a los codones de “terminacion” (es decir, TAA, TAG, TGA) que se encuentran en transcritos de ARNm. Estos codones conducen a la terminacion de la slntesis de anticuerpos. En determinadas realizaciones, se elige un codon de “terminacion” que es compatible con el codigo genetico artificial usado para codificar para el pollmero no natural. Por ejemplo, el codon de “terminacion” no debe entrar en conflicto con ningun otro codon usado para codificar para la slntesis, y debe ser del mismo formato general que los otros codones usados en el molde. El codon de “terminacion” puede codificar para una unidad de monomero que termina la polimerizacion al no proporcionar un grupo reactivo para la union adicional. Por ejemplo, una unidad de monomero de terminacion puede contener un grupo reactivo bloqueado tal como una acetamida en vez de una amina primaria. En aun otras realizaciones, la unidad de monomero de terminacion comprende un extremo terminal biotinilado que proporciona un modo conveniente de terminacion de la etapa de polimerizacion y purificacion del pollmero resultante.

En una realizacion, se usan productos de ADN mutagenizado directamente como molde para la slntesis in vitro de los correspondientes anticuerpos mutantes. Debido a la alta eficacia con la que pueden generarse sustituciones de los 19 aminoacidos en un residuo individual, es posible realizar mutagenesis por saturacion en numerosos residuos de interes, o bien independientemente o bien en combination con otras mutaciones dentro del anticuerpo. Tal como se usa en el presente documento, mutagenesis “por saturacion completa” se define como sustituir un aminoacido dado dentro de un anticuerpo por los otros 19 aminoacidos que se producen de manera natural. Por ejemplo, la mutagenesis por saturacion de sitio genico, que explora de manera sistematica mlnimamente todas las posibles sustituciones de aminoacidos individuales a lo largo de una secuencia de anticuerpo, se da a conocer en Kretz et al., Methods in Enzymology, 2004, 388:3-11; Short, patente estadounidense n.° 6.171.820; y Short, patente estadounidense n.° 6.562.594.

En un aspecto, esta invencion preve el uso de cebadores de codon (que contienen una secuencia N,N,G/T degenerada) para introducir mutaciones puntuales en un polinucleotido, de modo que se genera un conjunto de polipeptidos de progenie en los que una gama completa de sustituciones de aminoacidos individuales esta representada en cada position de aminoacido (vease la patente estadounidense n.° 6.171.820; vease tambien la patente estadounidense n.° 5.677.149). Los oligos usados se componen de manera contigua de una primera secuencia homologa, una secuencia N,N,G/T degenerada, y preferiblemente pero no necesariamente una segunda secuencia homologa. Los productos de traduction de la progenie posterior a partir del uso de tales oligos incluyen todos los posibles cambios de aminoacido en cada sitio de aminoacido a lo largo del polipeptido, debido a que la degeneration de la secuencia N,N,G/T incluye codones para los 20 aminoacidos.

El uso de codones es uno de los factores importantes en la expresion genica eucariota. Las frecuencias con las que se usan diferentes codones varlan significativamente entre diferentes huespedes, y entre anticuerpos expresados a altos o bajos niveles dentro del mismo organismo. El motivo mas probable de esta variation es que codones preferidos se correlacionan con la abundancia de ARNt relacionados disponibles dentro de la celula. Es posible que el uso de codones y las concentraciones de aceptores de ARNt hayan evolucionado conjuntamente, y que la presion de selection para esta coevolucion sea mas pronunciada para genes altamente expresados que para genes expresados a bajos niveles.

En un aspecto, se usa un oligo degenerado de este tipo (que se compone de un casete de N,N,G/T degenerado) para someter cada codon original en un molde de polinucleotido parental a una gama completa de sustituciones de codones. En otro aspecto, se usan al menos dos casetes de N,N,G/T degenerados, o bien en el mismo oligo o bien no, para someter al menos dos codones originales en un molde de polinucleotido parental a una gama completa de sustituciones de codones. Por tanto, mas de una secuencia N,N,G/T puede estar contenida en un oligo para introducir mutaciones de aminoacidos en mas de un sitio. Esta pluralidad de secuencias N,N,G/T puede ser directamente contigua, o estar separada por una o mas secuencia(s) de nucleotidos adicional(es). En otro aspecto, pueden usarse oligos utilizables para introducir adiciones y deleciones o bien solos o bien en combinacion con los codones que contiene una secuencia N,N,G/T, para introducir cualquier combinacion o permutation de adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoacidos.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona el uso de casetes degenerados que tienen menos degeneracion

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que la secuencia N,N,G/T. Por ejemplo, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete degenerada que se compone de solo un N, en el que dicho N puede estar en la primera, segunda o tercera posicion del triplete. Cualquier otra base incluyendo cualquier combinacion y permutacion de las mismas puede usarse en las dos posiciones restantes del triplete. Alternativamente, puede ser deseable en algunos casos usar (por ejemplo, en un oligo) una secuencia de triplete N,N,N degenerada.

Sin embargo, se aprecia que el uso de un triplete N,N,G/T degenerado tal como se da a conocer en el presente documento es ventajoso por varios motivos. En un aspecto, esta invencion proporciona un medio para generar de manera sistematica y bastante facil la sustitucion de la gama completa de posibles aminoacidos (para un total de 20 aminoacidos) en todas y cada una de las posiciones de aminoacido en un polipeptido. Por tanto, para un polipeptido de 100 aminoacidos, la presente invencion proporciona un modo para generar de manera sistematica y bastante facil 2000 especies distintas (es decir, 20 posibles aminoacidos por posicion X 100 posiciones de aminoacido). Se aprecia que se proporciona, a traves del uso de un oligo que contiene un triplete N,N,G/T degenerado, 32 secuencias individuales que codifican para 20 posibles aminoacidos. Por tanto, en un recipiente de reaccion en el que se somete una secuencia de polinucleotido parental a mutagenesis por saturacion usando un oligo de este tipo, se generan 32 polinucleotidos de progenie distintos que codifican para 20 polipeptidos distintos. En cambio, el uso de un oligo no degenerado en mutagenesis dirigida al sitio conduce a solo un producto de polipeptido de progenie por recipiente de reaccion.

Por tanto, en una realizacion preferida, cada recipiente de reaccion de mutagenesis por saturacion contiene polinucleotidos que codifican para al menos 20 moleculas de polipeptidos de progenie de manera que los 20 aminoacidos estan representados en una posicion de aminoacido especlfica correspondiente a la posicion de codon mutagenizada en el polinucleotido parental. Los polipeptidos de progenie degenerados 32 veces generados a partir de cada recipiente de reaccion de mutagenesis por saturacion puede someterse a amplification clonal (por ejemplo, clonarse en un huesped de E. coli adecuado usando un vector de expresion) y someterse a examen de expresion. Cuando se identifica mediante examen un polipeptido de progenie individual que presenta un cambio en una propiedad (en comparacion con el polipeptido molde), puede secuenciarse para identificar la sustitucion de aminoacido responsable de tal cambio contenido en el mismo.

Puede usarse cualquier metodo mutagenico recombinante o de slntesis qulmica para generar la poblacion de polipeptidos mutantes. La practica de la presente invencion puede emplear, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de biologla celular, cultivo celular, biologla molecular, biologla transgenica, microbiologla, ADN recombinante e inmunologla, que estan dentro del conocimiento de la tecnica. Tales tecnicas se explican con mas detalle en la bibliografla. Vease, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); ADN Cloning, volumenes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., patente estadounidense n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, volumenes 154 y 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walquer, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volumenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embiyo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

En una realizacion, el polipeptido molde es un anticuerpo. El anticuerpo se somete a los metodos descritos en el presente documento para, por ejemplo, mapear y entender que posiciones dentro de la CDR efectuan la afinidad de union. Las tecnicas para preparar y usar diversos constructos basados en anticuerpos y fragmentos de los mismos se conocen bien en la tecnica. Un aspecto importante de la presente invencion es la identification de residuos que desempenan, o es probable que desempenen, un papel en la interaction de interes (por ejemplo, interaction antlgeno-anticuerpo, quelacion de metales, union a receptor, union a sustrato, etc.). Puede usarse cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun la presente invencion.

En una realizacion, puede usarse cualquiera de las plataformas de evolution CPE, CPI, CPD y CPS para generar anticuerpos agonistas, es decir anticuerpos activantes. Estas tecnologlas de evolucion permiten la generation de anticuerpos agonistas mas alla de la activation del tipo de reticulation de protelnas mas sencilla y en particular permiten la activacion de receptores tales como GPL-1 o 2 que se activan tradicionalmente por peptidos.

En un aspecto, se seleccionan anticuerpos mediante FACS o microscopla o equivalente para detectar anticuerpos debilmente activantes usando celulas con senales fluorescentes que fluorescen cuando se activa el receptor de superficie celular. Posteriormente, se usan las herramientas de evolucion para potenciar esta activacion. Entonces se utiliza la tecnologla de CPS para combinar mutantes superiores.

En otro aspecto, se selecciona un anticuerpo que se une al sitio de activacion del receptor tal como se determina mediante mapeo de epltopos. Se usan tecnicas de CPE, CPI y/o CPD para seleccionar mutantes que provocan la

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estimulacion del receptor tal como se determina mediante una lectura intracelular tal como fluorescencia en respuesta a la liberacion de iones de calcio u otros ensayos que se conocen bien en la tecnica. Entonces se utiliza la tecnologla de CPS para combinar mutantes superiores.

En un aspecto particular, algunas de las ventajas clave de CPI con inserciones de aminoacidos individuales, dobles o triples son que estos aminoacidos insertados pueden extenderse en la cavidad de union del receptor para activar el receptor. En otro aspecto particular, la CPD puede remodelar y/o reposicionar aminoacidos que interaccionan con el receptor para mejorar o efectuar la activacion y finalmente la CPE puede realizar cambios relativamente mas pequenos para efectuar la activacion del receptor.

La especificidad de un anticuerpo esta determinada por las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) dentro de las regiones variables de cadena ligera (VL) y regiones variables de cadena pesada (VH). El fragmento Fab de un anticuerpo, que tiene aproximadamente un tercio del tamano de un anticuerpo completo contiene las regiones variables de cadena pesada y ligera, la region constante de cadena ligera completa y una parte de la region constante de cadena pesada. Las moleculas Fab son estables y se asocian bien debido a la contribution de las secuencias de region constante. Sin embargo, el rendimiento de Fab funcional expresado en sistemas bacterianos es menor que el del fragmento Fv mas pequeno que contiene solo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. El fragmento Fv es la parte mas pequena de un anticuerpo que todavla retiene un sitio de union a antlgeno funcional. El fragmento Fv tiene las mismas propiedades de union que el Fab, sin embargo, sin la estabilidad conferida por las regiones contantes, las dos cadenas del Fv pueden disociarse de manera relativamente facil en condiciones diluidas.

En un aspecto, pueden fusionarse regiones VH y VL por medio de un ligador polipeptldico (Huston et al., 1991) para estabilizar el sitio de union a antlgeno. Este fragmento Fv de polipeptido individual se conoce como anticuerpo de cadena sencilla (scFv). Las VH y VL pueden disponerse con cualquier dominio en primer lugar. El ligador une el extremo carboxilo-terminal de la primera cadena con el extremo amino-terminal de la segunda cadena.

Un experto en la tecnica reconocera que los fragmentos Fv de cadena sencilla, Fv de cadena pesada o ligera o Fab pueden usarse con este sistema. Una cadena pesada o ligera puede mutagenizarse seguido por la adicion de la cadena complementaria a la disolucion. Entonces se permite que las dos cadenas se combinen y formen un fragmento de anticuerpo funcional. La adicion de secuencias de cadena pesada o ligera no especlficas aleatorias permite la production de un sistema combinatorio para generar una biblioteca de diversos miembros.

Generalmente, se genera un polinucleotido de expresion de cadena sencilla. Este polinucleotido de expresion contiene: (1) un casete de anticuerpo de cadena sencilla que consiste en un dominio Vh, un peptido espaciador y un dominio Vl operativamente unidos para codificar para un anticuerpo de cadena sencilla, (2) un promotor adecuado para la transcription in vitro (por ejemplo, promotor de T7, promotor SP6, y similares) operativamente unido para garantizar la transcripcion in vitro del casete de anticuerpo de cadena sencilla que forma un ARNm que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla, y (3) una secuencia de termination de la transcripcion adecuada para funcionar en una reaction de transcripcion in vitro. Opcionalmente, el polinucleotido de expresion puede comprender tambien un origen de replication y/o un marcador seleccionable. Un ejemplo de un polinucleotido de expresion adecuado es pLM166.

Las secuencias de Vh y Vl pueden obtenerse convenientemente de una biblioteca de secuencias de Vh y Vl producidas mediante amplification por PCR usando cebadores especlficos de la familia del gen de V o cebadores especlficos del gen de V (Nicholls et al., J. Immunol. Met., 1993, 165: 81; documento WO93/12227) o se disenan segun metodos convencionales conocidos en la tecnica basandose en la information de secuencia disponible. Normalmente, se alslan secuencias de VH y VL de raton o ser humano. Entonces se ligan las secuencias de VH y VL, habitualmente con una secuencia espaciadora intermedia (por ejemplo, que codifica para un espaciador peptldico flexible en marco), formando un casete que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla. Normalmente, se usa una biblioteca que comprende una pluralidad de secuencias de Vh y Vl (algunas veces tambien con una pluralidad de especies de peptido espaciador representadas), en el que la biblioteca se construye con una o mas de las secuencias de Vh y Vl mutadas para aumentar la diversidad de secuencia particularmente en residuos de CDR, algunas veces en residuos de region de entramado. Las secuencias de region V pueden clonarse convencionalmente como ADNc o productos de amplificacion por PCR para celulas que expresan inmunoglobulinas. Por ejemplo, pueden usarse celulas de hibridoma humano, o linfoma, u otra llnea celular que sintetiza inmunglobulina o bien secretada o bien de superficie celular para el aislamiento de ARN de poliA+. El ARN se usa entonces para la slntesis de ADNc cebado con oligo dT usando la enzima transcriptasa inversa (para metodos generales veanse Goodspeed et al., Gene 1989, 76: 1; Dunn et al., J. Biol. Chem., 1989, 264: 13057). Una vez aislado el producto de pCr o ADNc de region V, se clona en un vector para formar un casete de anticuerpo de cadena sencilla.

Para lograr la construction de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, se alslan los genes codificantes y se identifican. Los genes pueden modificarse para permitir la donation en un vector de expresion o una transcripcion/traduccion in vitro. Aunque pueden usarse metodos tales como estudiar con sonda el ADN para VH y

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VL a partir de ADNc de hibridoma (Maniatis et al., 1982) o construir un gen sintetico para VH y VL (Barbas et al., 1992), un modo conveniente es usar metodos dirigidos por molde para amplificar las secuencias de anticuerpo. Puede amplificarse una poblacion diversa de genes de anticuerpo a partir de una muestra de molde disenando cebadores para las secuencias conservadas en los extremos 3' y 5' de la region variable conocida como region de entramado o para las regiones constantes del anticuerpo (Iverson et al., 1989). Dentro de los cebadores, pueden colocarse sitios de restriction para facilitar la donation en un vector de expresion. Dirigiendo los cebadores a estas regiones conservadas, se mantiene la diversidad de la poblacion de anticuerpos para permitir la construction de bibliotecas diversas. La especie y clase especlficas de anticuerpo pueden definirse mediante la selection de las secuencias de cebador tal como se ilustra por el gran numero de secuencias para todos los tipos de anticuerpos facilitados en Kabat et al., 1987.

Puede usarse ARN mensajero aislado del bazo o la sangre periferica de un animal como molde para la amplification de una biblioteca de anticuerpos. En determinadas circunstancias, cuando es deseable presentar una poblacion homogenea de fragmentos de anticuerpo sobre la superficie celular, puede aislarse ARNm de una poblacion de anticuerpos monoclonales. Puede prepararse ARN mensajero a partir de cualquier fuente mediante metodos convencionales y usarse directamente o para la preparation de un molde de ADNc. La generation de ARNm para fines de clonacion de anticuerpos se logra facilmente siguiendo los procedimientos bien conocidos para la preparacion y caracterizacion de anticuerpos (vease, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988).

La generacion de anticuerpos monoclonales (Acm) sigue generalmente los mismos procedimientos que aquellos para preparar anticuerpos policlonales. En resumen, se prepara un anticuerpo policlonal inmunizando un animal con una composition inmunogenica acorde y recogiendo antisueros de ese animal inmunizado. Puede usarse una amplia gama de especies animales para la production de antisueros. Normalmente el animal usado para la production de antisueros es un conejo, un raton, una rata, un hamster, una cobaya o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande de los conejos, se prefieren habitualmente conejos para la produccion de anticuerpos policlonales.

Las composiciones inmunogenicas a menudo varlan en la inmunogenicidad. A menudo es necesario por tanto reforzar el sistema inmunitario del huesped, tal como puede lograrse acoplando un inmunogeno peptldico o polipeptldico a un portador. Portadores a modo de ejemplo y preferidos son hemocianina de lapa californiana (KLH) y albumina serica bovina (BSA). Otras albuminas tales como ovoalbumina, albumina serica de rata o albumina serica de conejo tambien pueden usarse como portadores. Se conocen bien medios reconocidos para conjugar un polipeptido a una protelna transportadora e incluyen glutaraldehldo, ester de m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida, carbodiimidas y bencidina bis-diazotada.

La inmunogenicidad de una composicion de inmunogeno particular puede potenciarse mediante el uso de estimuladores no especlficos de la respuesta inmunitaria, conocidos como adyuvantes. Los adyuvantes a modo de ejemplo y preferidos incluyen adyuvante completo de Freund (un estimulador no especlfico de la respuesta inmunitaria que contiene Mycobacterium tuberculosis inactivada), adyuvante incompleto de Freund y adyuvante de hidroxido de aluminio.

La cantidad de composicion de inmunogeno usada en la produccion de anticuerpos policlonales varla con la naturaleza del inmunogeno as! como el animal usado para la inmunizacion. Puede usarse una variedad de vlas para administrar el inmunogeno (subcutanea, intramuscular, intradermica, intravenosa e intraperitoneal). La produccion de anticuerpos policlonales puede monitorizarse extrayendo muestras de sangre del animal inmunizado en diversos puntos de tiempo tras la inmunizacion. Tambien puede administrarse una segunda inyeccion, de refuerzo. El procedimiento de refuerzo y titulacion se repite hasta que se logra un tltulo adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, puede extraerse sangre del animal inmunizado y aislarse el suero, almacenarse y recogerse el bazo para el aislamiento de ARNm a partir de la respuesta policlonal o puede usarse el animal para generar Acm para el aislamiento de ARNm a partir de una poblacion homogenea de anticuerpos.

Pueden prepararse Acm facilmente a traves del uso de tecnicas bien conocidas, tales como las ejemplificadas en la patente estadounidense n.° 4.196.265. Normalmente, esta tecnica implica inmunizar un animal adecuado con una composicion de inmunogeno seleccionado, por ejemplo un hapteno de molecula pequena conjugado con un portador, una protelna, un polipeptido o peptido purificado o parcialmente purificado. La composicion de inmunizacion se administra de una manera eficaz para estimular las celulas productoras de anticuerpos. Roedores tales como ratones y ratas son animales usados frecuentemente; sin embargo, tambien es posible el uso de celulas de conejo, oveja, rana. El uso de ratas puede proporcionar determinadas ventajas (Goding, pags. 60-61, 1986), pero se prefieren ratones, particularmente el raton BALB/c ya que este es el mas usado de manera rutinaria y generalmente proporciona un mayor porcentaje de fusiones estables.

Tras la inmunizacion, se seleccionan celulas somaticas con el potencial de producir anticuerpos, especlficamente linfocitos B (celulas B), para su uso en el protocolo de generacion de Acm. Estas celulas pueden obtenerse a partir de bazos, amlgdalas o ganglios linfaticos que se han sometido a biopsia, o a partir de muestras de sangre. Son preferibles celulas de bazo y celulas sangulneas, las primeras debido a que son una fuente rica de celulas

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productoras de anticuerpos que estan en la fase de plasmablasto en division, y las ultimas porque puede accederse facilmente a la sangre. A menudo, se habra inmunizado un panel de animales y se extraera el bazo del animal con el tltulo de anticuerpos mas alto y se obtendran los linfocitos del bazo homogeneizando el bazo con una jeringa. Normalmente, un bazo de un raton inmunizado contiene de aproximadamente 5X107 a 2X108 linfocitos.

Los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado se fusionan entonces con celulas de una celula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizo. Llneas celulares de mieloma adecuadas para su uso en procedimientos de fusion de produccion de hibridomas preferiblemente no son productoras de anticuerpos, tienen alta eficacia de fusion y deficiencias enzimaticas que las hacen incapaces de crecer en determinados medios selectivos que soportan el crecimiento solo de las celulas fusionadas deseadas (hibridomas).

Puede usarse una cualquiera de varias celulas de mieloma, tal como conocen los expertos en la tecnica (Goding, pags. 65-66, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un raton, puede usarse P3- X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, puede usarse R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 son todas utiles en relacion con fusiones de celulas humanas.

Una celula de mieloma murina preferida es la llnea celular de mieloma NS-1 (tambien denominada P3-NS-1-Ag4-1), que esta facilmente disponible del NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository solicitando el numero de deposito de llnea celular GM3573. Otra llnea celular de mieloma de raton que puede usarse es la llnea celular no productora SP2/0 de mieloma murino de raton resistente a 8-azaguanina.

Los metodos para generar hlbridos de celulas de mieloma y celulas de ganglios linfaticos o bazo productoras de anticuerpos comprenden habitualmente mezclar celulas somaticas con celulas de mieloma en una proportion 2:1, aunque la proporcion puede variar entre 20:1 y 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o agentes (qulmicos o electricos) que promueven la fusion de membranas celulares. Se han descrito metodos de fusion usando virus Sendai por Kohler & Milstein (1975; 1976), y los que usan polietilenglicol (PEG), tal como PEG al 37% (v/v), por Gefter et al., 1977). El uso de metodos de fusion inducida electricamente tambien es apropiado (Goding pags. 71-74, 1986).

Los procedimientos de fusion producen habitualmente hlbridos viables a bajas frecuencias, de 1X10-6 a 1X10-8. Sin embargo, esto no supone un problema, ya que los hlbridos viables, fusionados se diferencian de las celulas parentales, no fusionadas (particularmente las celulas de mieloma no fusionadas que normalmente seguirlan dividiendose indefinidamente) mediante cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es generalmente uno que contiene un agente que bloquea la slntesis de novo de nucleotidos en los medios de cultivo tisular. Agentes a modo de ejemplo y preferidos son aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la slntesis de novo tanto de purinas como de pirimidinas, mientras que la azaserina bloquea solo la slntesis de purinas. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio se complementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleotidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio se complementa con hipoxantina.

El medio de selection preferido es HAT. Solo celulas que pueden llevar a cabo rutas de salvamento de nucleotidos pueden sobrevivir en medio HAT. Las celulas de mieloma son defectuosas en enzimas clave de la ruta de salvamento, por ejemplo, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), y no pueden sobrevivir. Las celulas B pueden llevar a cabo esta ruta, pero tienen una vida limitada en cultivo y generalmente mueren en el plazo de aproximadamente dos semanas. Por tanto, las unicas celulas que pueden sobrevivir en los medios selectivos son los hlbridos formados a partir de celulas B y de mieloma.

Este cultivo proporciona una poblacion de hibridomas a partir de los cuales se seleccionan hibridomas especlficos. Normalmente, la seleccion de hibridomas se realiza cultivando las celulas mediante dilution de clones individuales en placas de microtitulacion, seguido por someter a prueba los sobrenadantes clonales individuales (despues de aproximadamente de dos a tres semanas) para detectar la reactividad deseada. Los ensayos simples y rapidos incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimaticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos en placa, ensayos de union inmunologica puntual, y similares.

Los hibridomas seleccionados se diluyen en serie y se clonan para dar llneas celulares productoras de anticuerpos individuales a partir de las cuales pueden propagarse entonces clones indefinidamente para proporcionar Acm. Las llneas celulares pueden aprovecharse para la produccion de Acm en dos modos basicos. Puede inyectarse una muestra del hibridoma (a menudo en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se uso para proporcionar las celulas de mieloma y somaticas para la fusion original. El animal inyectado desarrolla tumores que secretan el anticuerpo monoclonal especlfico producido por el hlbrido celular fusionado. Los llquidos corporales del animal, tales como suero o llquido ascltico, pueden extraerse entonces para proporcionar Acm a alta concentration. Las llneas celulares individuales tambien podrlan cultivarse in vitro, en donde los Acm se secretan de manera natural al medio de cultivo a partir del cual pueden obtenerse facilmente en altas concentraciones. Los Acm producidos por cualquier medio pueden purificarse adicionalmente, si se desea, usando filtracion, centrifugacion y

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diversos metodos cromatograficos tales como HPLC o cromatografla de afinidad.

Tras el aislamiento y la caracterizacion del anticuerpo monoclonal deseado, el ARNm puede aislarse usando tecnicas bien conocidas en la tecnica y usarse como molde para la amplificacion de la secuencia diana.

Estan disponibles varios procedimientos dependientes de molde para amplificar las secuencias diana antes y despues de la mutagenesis. Uno de los metodos de amplificacion mejor conocidos es la reaccion en cadena de la polimerasa (denominada PCR) que se describe en detalle en las patentes estadounidense n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159, y en Innis et al., 1990. En resumen, en la PCR, se preparan dos secuencias de cebador que son complementarias a regiones en hebras complementarias opuestas de la secuencia diana. Se anade un exceso de desoxinucleosidos trifosfato a una mezcla de reaccion junto con una ADN polimerasa, por ejemplo, Taq polimerasa. Si la secuencia diana esta presente en una muestra, los cebadores se uniran a la diana y la polimerasa provocara que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia diana anadiendo nucleotidos. Elevando y disminuyendo la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos se disociaran de la diana para formar productos de reaccion, los cebadores en exceso se uniran a la diana y a los productos de reaccion y se repite el procedimiento. Preferiblemente puede realizarse un procedimiento de amplificacion por PCR con transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de diana amplificada. Se conocen bien en la tecnica metodologlas de reaccion en cadena de la polimerasa. Usando tecnicas de amplificacion enzimaticas tales como PCR, pueden disenarse elementos de control deseados en el cebador y, por tanto, se incorporaran en el producto de ADN.

Otro metodo para la amplificacion es la reaccion en cadena de la ligasa (“LCR”), dada a conocer en el documento EPA n.° 320 308. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de la secuencia diana, cada par se unira a hebras complementarias opuestas de la diana de manera que quedan contiguas. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se uniran para formar una unidad individual. Mediante ciclos de temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas unidas se disocian de la diana y entonces sirven como “secuencias diana” para el ligamiento de pares de sondas en exceso. La patente estadounidense n.° 4.883.750 describe un metodo similar a LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.

Tambien puede usarse Qbeta replicasa, descrita en la solicitud PCT n.° PCT/US87/00880, como metodo de amplificacion. En este metodo, se anade una secuencia de replicacion de ARN que tiene una region complementaria a la de una diana a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiara la secuencia de replicacion que entonces puede detectarse.

Un metodo de amplificacion isotermica, en el que se usan endonucleasas de restriccion y ligasas para lograr la amplificacion de moleculas diana que contienen 5'-[alfa-tio]-trifosfatos de nucleotido en una hebra de un sitio de restriccion tambien puede ser util en la amplificacion de acidos nucleicos (Walquer et al., 1992).

La amplificacion por desplazamiento de hebra (SDA) es otro metodo de llevar a cabo la amplificacion isotermica de acidos nucleicos que implica multiples tandas de desplazamiento de hebra y slntesis, es decir, traduccion de mellas. Un metodo similar, denominado reaccion en cadena de reparacion (RCR) implica aparear varias sondas a lo largo de toda una region seleccionada como diana para la amplificacion, seguido por una reaccion de reparacion en la que solo dos de las cuatro bases estan presentes. Las otras dos bases pueden anadirse como derivados biotinilados para lograr una facil deteccion. Se usa un enfoque similar en sDa. Tambien pueden detectarse secuencias especlficas de diana usando una reaccion de sonda clclica (CPR). En CPR, una sonda que tiene secuencias en 3' y 5' de ADN no especlfico y secuencia media de ARN especlfico se hibrida con ADN que esta presente en una muestra. Tras la hibridacion, se trata la reaccion con ARNasaH, y se identifican los productos de la sonda como productos distintivos que se liberan tras digestion. El molde original se aparea con otra sonda de ciclado y se repite la reaccion.

Se describen otros metodos de amplificacion en la solicitud de GB n.° 2 202 328, y en la solicitud PCT n.° PCT/US89/01025, pueden usarse segun la presente invencion. En la primera solicitud, se usan cebadores “modificados” en una slntesis dependiente de molde y enzima, similar a pCr. Los cebadores pueden modificarse mediante marcaje con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, enzima). En la ultima solicitud, se anade un exceso de sondas marcadas a una muestra. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y se escinde catallticamente. Tras la escision, se libera la secuencia diana intacta a la que va a unirse la sonda en exceso. La escision de la sonda marcada senaliza la presencia de la secuencia diana.

Otros procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos incluyen sistemas de amplificacion basados en transcripcion (TAS), incluyendo amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989). En NASBA, los acidos nucleicos pueden prepararse para la amplificacion mediante extraccion con fenol/cloroformo convencional, desnaturalizacion termica de una muestra cllnica, tratamiento con tampon de lisis y columnas de minicentrifugacion para el aislamiento de ADN y ARN o extraccion de ARN con cloruro de guanidinio. Estas tecnicas de amplificacion implican aparear un cebador que tiene secuencias especlficas de diana. Tras la polimerizacion, se digieren los hlbridos de ADN/ARN con RNasa H mientras que se desnaturalizan termicamente de nuevo moleculas de ADN bicatenarias. En cualquier caso, el ADN monocatenario se hace completamente

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bicatenario mediante la adicion de un segundo cebador especifico de diana, seguida por polimerizacion. Las moleculas de ADN bicatenario se transcriben entonces de manera multiple mediante una polimerasa tal como T7 o SP6. En una reaccion clclica isotermica, los ARN se transcriben de manera inversa para dar ADN bicatenario, y se transcriben de nuevo con una polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya esten truncados o completos, indican secuencias especlficas de diana.

Davey et al., documento EPA n.° 329 822 dan a conocer un procedimiento de amplificacion de acido nucleico que implica sintetizar de manera clclica ARN monocatenario (“ARNmc”), ADNmc, y ADN bicatenario (ADNbc), que pueden usarse segun la presente invencion. El ARNmc es un primer molde para un primer oligonucleotido cebador, que se alarga mediante la transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). El ARN se elimina entonces del duplex de ADN:ARN resultante mediante la accion de ribonucleasa H (RNasa H, una ARNasa especlfica de ARN en duplex con o bien ADN o bien ARN). El ADNmc resultante es un segundo molde para un segundo cebador, que tambien incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificada por ARN polimerasa de T7) en 5' con respecto a su homologla al molde. Este cebador se extiende entonces mediante ADN polimerasa (ejemplificada por el fragmento “Klenow” grande de ADN polimerasa I de E. coli), dando como resultado una molecula de ADN bicatenario (“ADNbc”), que tiene una secuencia identica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor puede usarse por la ARN polimerasa apropiada para realizar muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden reintroducirse entonces en el ciclo conduciendo a una amplificacion muy rapida. Con la eleccion apropiada de enzimas, esta amplificacion puede hacerse de manera isotermica sin adicion de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza clclica de este procedimiento, puede elegirse que la secuencia de partida este en forma de o bien ADN o bien ARN.

Miller et al., solicitud PCT WO 89/06700 dan a conocer un esquema de amplificacion de secuencias de acido nucleico basado en la hibridacion de una secuencia de promotor/cebador a un aDn monocatenario diana (“ADNmc”) seguido por transcripcion de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es clclico, es decir, no se producen nuevos moldes a partir de los transcritos de ARN resultantes. Otros metodos de amplificacion incluyen “race” y “PCR unilateral” (Frohman, 1990; O'Hara et al., 1989).

Tambien pueden usarse metodos basados en el ligamiento de dos (o mas) oligonucleotidos en presencia de acido nucleico que tiene la secuencia del “di-oligonucleotido” resultante, amplificando de ese modo el dioligonucleotido, en la etapa de amplificacion (Wu et al., 1989).

Los productos de amplificacion pueden analizarse mediante electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando metodos convencionales (vease, por ejemplo, Maniatis et al., 1982). Por ejemplo, puede usarse un gel de agarosa al 1% tenido con bromuro de etidio y visualizarse bajo luz UV. Alternativamente, los productos de amplificacion pueden marcarse de manera integral con nucleotidos radiomarcados o marcados fluorometricamente. Entonces pueden exponerse geles a pellcula de rayos x o visualizarse bajo los espectros de estimulacion apropiados, respectivamente.

Los procedimientos mutagenicos de la presente invencion pueden comprender cualquier enfoque mutagenico que pueda adaptarse a un sitio particular en un gen, es decir, mutagenesis especlfica de sitio o dirigida al sitio. Debido a que la presente invencion se basa en mutagenesis completa, la presente invencion contempla como realizaciones preferidas los procedimientos mutagenicos que son rapidos, eficientes y economicos.

En una realizacion, el procedimiento mutagenico utiliza tecnicas de slntesis qulmica. Al hacer esto, es posible colocar exactamente la sustitucion en una o mas ubicaciones particulares dentro del gen, y tambien definir especlficamente la naturaleza de las alteraciones. Se conocen bien metodos de slntesis qulmica para ADN dentro de la tecnica. Se prefieren en este sentido tecnicas de fase solida.

Una ventaja del metodo de fase solida de slntesis genica es la oportunidad de mutagenesis usando tecnicas de slntesis combinatoria. Las tecnicas de slntesis combinatoria se definen como las tecnicas que producen grandes colecciones o bibliotecas de compuestos simultaneamente, uniendo secuencialmente diferentes unidades estructurales. Pueden construirse bibliotecas usando compuestos libres en disolucion, pero preferiblemente el compuesto se une a un soporte solido tal como una perla, una partlcula solida o incluso se presenta sobre la superficie de un microorganismo.

Existen varios metodos para la slntesis combinatoria (Holmes et al., 1995; Burbaum et al., 1995; Martin et al., 1995; Freier et al., 1995; Pei et al., 1991; Bruce et al., 1995; Ohlmeyer et al., 1993), incluyendo slntesis dividida o slntesis paralela. La slntesis dividida puede usarse para producir pequenas cantidades de un numero relativamente grande de compuestos, mientras que la slntesis paralela producira mayores cantidades de un numero relativamente pequeno de compuestos. En terminos generales, usando la slntesis dividida, se sintetizan compuestos sobre la superficie de una micropartlcula. En cada etapa, las partlculas se reparten en varios grupos para la adicion del siguiente componente. Los diferentes grupos se recombinan entonces y se reparten para formar nuevos grupos. El procedimiento se repite hasta que se completa el compuesto. Cada partlcula contiene varias copias del mismo compuesto permitiendo una facil separacion y purification. La slntesis dividida solo puede realizarse usando un

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soporte solido.

Una tecnica alternativa conocida como slntesis paralela puede realizarse o bien en base solida o bien en disolucion. Usando la slntesis paralela, se sintetizan diferentes compuestos en receptaculos independientes, usando a menudo automatizacion. La slntesis paralela puede realizarse en una placa de microtitulacion en donde pueden anadirse diferentes reactivos a cada pocillo de una manera predefinida para producir una biblioteca combinatoria. La slntesis paralela es el enfoque preferido para su uso con tecnicas enzimaticas. Se entendera bien que existen muchas modificaciones de esta tecnica y pueden adaptarse para su uso con la presente invencion. Usando metodos combinatorios, puede sintetizarse un gran numero de moldes de genes mutantes.

Tambien pueden generarse genes mutantes mediante metodos semisinteticos conocidos en la tecnica (Barbas et al., 1992). Usando las regiones conservadas de un fragmento de anticuerpo como entramado, pueden insertarse regiones variables en combinaciones aleatorias una o mas cada vez para alterar la especificidad del fragmento de anticuerpo y generar sitios de union novedosos, especialmente en la generacion de anticuerpos frente a antlgenos no propicios para la inmunizacion tales como compuestos toxicos o labiles. Del mismo modo, puede variarse una secuencia de anticuerpo conocida introduciendo mutaciones aleatoriamente. Esto puede lograrse mediante metodos bien conocidos en la tecnica tal como el uso de PCR sensible a errores.

Usando los cebadores oligonucleotldicos apropiados, se usa PCR para la slntesis rapida del molde de ADN que contiene una o mas mutaciones en el gen de la protelna de union. La mutagenesis especlfica de sitio es una tecnica util en la preparacion de peptidos individuales, o protelnas o peptidos equivalentes funcionales biologicamente, a traves de mutagenesis especlfica del ADN subyacente. La tecnica proporciona ademas una facil capacidad para preparar y someter a prueba variantes de secuencia, incorporando una o mas de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o mas cambios de secuencia de nucleotidos en el ADN. La mutagenesis especlfica de sitio permite la produccion de mutantes a traves del uso de secuencias de oligonucleotidos especlficas que codifican para la secuencia de ADN de la mutacion deseada, as! como un numero suficiente de nucleotidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamano y complejidad de secuencia suficientes para formar un duplex estable en ambos lados de la union de delecion que esta atravesandose. Normalmente, se prefiere un cebador de 17 a 25 nucleotidos de longitud, con de 5 a 10 residuos en ambos lados de la union de la secuencia que esta alterandose.

La tecnica emplea normalmente un vector de bacteriofago que existe en forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Los vectores utiles en la mutagenesis dirigida al sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos vectores de fago estan disponibles comercialmente y su uso lo conocen generalmente bien los expertos en la tecnica. Se emplean tambien rutinariamente plasmidos bicatenarios mutagenesis dirigida al sitio, que elimina la etapa de transferir el gen de interes desde un fago hasta un plasmido.

En general, la mutagenesis dirigida al sitio se realiza obteniendo en primer lugar un vector monocatenario, o fusionando dos hebras de un vector bicatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica para la protelna deseada. Se prepara de manera sintetica un cebador de oligonucleotido que lleva la secuencia mutada deseada. Este cebador se aparea entonces con la preparacion de ADN monocatenario, teniendo en cuenta el grado de apareamiento erroneo cuando se seleccionan condiciones de hibridacion, y se somete a enzimas de polimerizacion de ADN tales como fragmento Klenow de polimerasa I de E. coli, con el fin de completar la slntesis de la hebra que lleva la mutacion. Por tanto, se forma un heteroduplex en el que una hebra codifica para la secuencia no mutada original y la segunda hebra lleva la mutacion deseada. Este vector de heteroduplex se usa entonces para transformar celulas apropiadas, tales como celulas de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposition de secuencia mutada.

La preparacion de variantes de secuencia del gen seleccionado usando mutagenesis dirigida al sitio se proporciona como medio de produccion de especies potencialmente utiles y no pretende ser limitativa, ya que hay otros modos en los que pueden obtenerse variantes de secuencia. Por ejemplo, pueden tratarse vectores recombinantes que codifican para el gen deseado con agentes mutagenicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia.

En determinadas aplicaciones, sustitucion de aminoacidos mediante mutagenesis dirigida al sitio, se aprecia que se requieren condiciones de menor rigurosidad. En estas condiciones, puede producirse hibridacion aun cuando las secuencias de sonda y hebra diana no son perfectamente complementarias, sino que tienen apareamientos erroneos en una o mas posiciones. Las condiciones pueden hacerse menos rigurosas aumentando la concentration de sal y disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, podrla proporcionarse una condition de rigurosidad media mediante NaCl de 0,1 a 0,25 M a temperaturas de 37°C a 55°C, mientras que podrla proporcionarse una condicion de baja rigurosidad mediante sal de 0,15 M a 0,9 M, a temperaturas que oscilan entre 20°C y 55°C. Por tanto, las condiciones de hibridacion pueden manipularse facilmente, y por tanto seran generalmente un metodo de election dependiendo de los resultados deseados.

En otras realizaciones, puede lograrse la hibridacion en condiciones de, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl

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75 mM, MgCl2 3 mM, ditiotreitol 10 mM, a temperaturas de entre aproximadamente 20°C y 37°C. Otras condiciones de hibridacion utilizadas podrlan incluir Tris-HCl aproximadamente 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 1,5 pM, a temperaturas que oscilan entre aproximadamente 40°C y 72°C. Tambien pueden usarse formamida y SDS para alterar las condiciones de hibridacion.

En una realizacion particular, puede emplearse PCR de solapamiento. En resumen, se usa un plasmido como molde para la primera tanda de pCr. Los productos de PCR de la primera tanda se purifican y se usan, junto con cebadores externos, en la reaccion de PCR de extension de solapamiento. Los productos finales contenlan la sustitucion dirigida al sitio de un aminoacido dado por todos los demas residuos de aminoacido posibles.

Los polipeptidos mutantes generados mediante la presente invencion pueden caracterizarse usando una variedad de tecnicas. En general, pueden analizarse productos proteicos para determinar el peso molecular aparente correcto usando SDS-PAGE. Esta proporciona una indicacion inicial de que el polipeptido, de hecho, se sintetizo. Cuando se compara con la molecula natural, tambien indica si esta teniendo lugar un plegamiento o procesamiento normal con el mutante. En este sentido, puede comprobarse que es util marcar el polipeptido. Alternativamente, el polipeptido puede identificarse mediante tincion del gel.

Mas alla de la mera slntesis, los anticuerpos pueden caracterizarse segun diversas propiedades y una gama extensa de funciones. Las propiedades incluyen punto isoelectrico, estabilidad termica, velocidad de sedimentacion y plegamiento. Una manera de examinar el plegamiento es la capacidad para reconocerse por una pareja de union relacionada. El principal ejemplo de esta funcion es la interaccion anticuerpo-antlgeno. Esta disponible una amplia variedad de diferentes formatos de inmunoensayo para este fin y se conocen bien en la tecnica. Principalmente, pueden determinarse cambios en o bien la afinidad o bien la especificidad cuando se pone en contacto el anticuerpo con un antlgeno especlfico o paneles de antlgenos relacionados.

Los inmunoensayos pueden dividirse generalmente en dos tipos: ensayos heterogeneos que requieren multiples etapas de separacion, y ensayos homogeneos que se realizan directamente. Los inmunoensayos heterogeneos en general implican un anticuerpo inmovilizado sobre una matriz solida. Se pone en contacto una muestra que contiene un ligando con el anticuerpo inmovilizado y se determina la cantidad de complejo formado sobre el soporte de matriz a partir de un marcador unido directa o indirectamente al complejo inmovilizado. Tal como se usa en el contexto de la presente invencion, ligando se define como una especie que interacciona con una molecula no identica formando un complejo estable, fuertemente unido. Para fines practicos, la afinidad de union es habitualmente mayor de 106 M-1 y esta preferiblemente en el intervalo de 109 - 1015 M-1. El ligando puede ser cualquiera de varios tipos de moleculas organicas, incluyendo hidratos de carbono aliclclicos, compuestos aromaticos polinucleares, compuestos halogenados, bencenoides, hidratos de carbono polinucleares, compuestos heteroclclicos de nitrogeno, compuestos heteroclclicos de azufre, compuestos heteroclclicos de oxlgeno, e hidratos de carbono de alcano, alqueno, alquino, etc. Son de particular interes moleculas biologicas, incluyendo aminoacidos, peptidos, protelnas, llquidos, sacaridos, acidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Por supuesto se entendera que estos son a modo de ejemplo solo y que pueden aplicarse metodos de inmunoensayo contemplados para detectar una gama extraordinariamente amplia de compuestos, siempre que pueda obtenerse un anticuerpo que se une al ligando de interes.

Pueden realizarse inmunoensayos heterogeneos como ensayos de tipo sandwich en los que una molecula de interes se hace reaccionar con un anticuerpo inmovilizado que se une especlficamente a esa molecula con una afinidad alta. En una segunda etapa, un conjugado formado a partir del mismo o diferente anticuerpo frente al antlgeno y una molecula marcadora se hace reaccionar con el complejo antlgeno-anticuerpo sobre la matriz de inmovilizacion. Tras la eliminacion del conjugado de marcador libre en exceso, se mide el conjugado de marcador unido, que es proporcional a la cantidad de ligando en la muestra.

La deteccion de la formation de inmunocomplejos se conoce bien en la tecnica y puede lograrse a traves de la aplicacion de numerosos enfoques. Estos enfoques se basan normalmente en la deteccion de una marca o un marcador, tal como cualquiera de las etiquetas o marcadores radioactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, electroquimioluminiscentes, biologicos o enzimaticos conocidos en la tecnica. Las patentes estadounidenses referentes al uso de tales marcadores incluyen las patentes estadounidense n.os 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Por supuesto, pueden encontrarse ventajas adicionales a traves del uso de un ligando de union secundario tal como un segundo anticuerpo o una disposicion de union de ligandos de biotina/avidina, tal como se conoce en la tecnica.

Los metodos preferidos para la deteccion incluyen radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELlSA), siendo ELISA el mas preferido debido a un aumento general de la sensibilidad. Los ELISA se usan de manera extensa en aplicaciones de biotecnologla, particularmente como inmunoensayos para una amplia gama de sustancias antigenicas. La sensibilidad del ELISA se basa en la amplification enzimatica de la senal.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “poner en contacto” se define como llevar los componentes de la reaccion a proximidad estrecha suficiente entre si para permitir que se produzca la interaccion deseada. La puesta en contacto puede lograrse mezclando los componentes en disolucion, por ejemplo, o mediante interaccion

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heterogenea tal como mediante contacto de flujo a traves de una columna o matriz de inmovilizacion que se une a uno de los componentes.

Los anticuerpos producidos y aislados mediante el metodo de la invencion se seleccionan para unirse a una diana predeterminada. Normalmente, la diana predeterminada se seleccionara en vista de su aplicabilidad como diana de diagnostico y/o terapeutica. La diana predeterminada puede ser un epltopo conocido o desconocido. Los anticuerpos se unen generalmente a un antlgeno predeterminado (por ejemplo, el inmunogeno) con una afinidad de al menos 1X107 M, preferiblemente con una afinidad de al menos 5X107 M-1 mas preferiblemente con una afinidad de al

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menos 1X10 M' a 1X10 M' o mas, algunas veces hasta 1X10 M' o mas. Frecuentemente, el antlgeno predeterminado es una protelna humana, tal como por ejemplo un antlgeno de superficie celular humano (por ejemplo, CD4, CD8, receptor de IL-2, receptor de EGF, receptor de PDGF), otra macromolecula biologica humana (por ejemplo, trombomodulina, protelna C, antlgeno de hidrato de carbono, antlgeno de Lewis sializado, L-selectina), o macromolecula asociada a enfermedad no humana (por ejemplo, LPS bacteriano, protelna de la capside de virion o glicoprotelna de la envuelta) y similares.

En otro ejemplo, se han publicado varios informes de la utilidad de diagnostico y terapeutica de scFv (Gruber et al., 1994 op. cit.; Lilley et al., 1994 op. cit.; Huston et al., Int. Rev. Immunol 1993, 10:a 195, Sandhu JS, Crit. Rev. Biotechnol., 1992,12: 437).

Pueden disenarse por ingenierla genetica anticuerpos de alta afinidad de la especificidad deseada y expresarse en una variedad de sistemas. Por ejemplo, se han producido scFv en plantas (Firek et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23: 861) y pueden prepararse facilmente en sistemas procariotas (Owens RJ y Young RJ, J. Immunol. Met., 1994,168: 149; Johnson S y Bird RE, Methods Enzymol., 1991, 203: 88). Ademas, los anticuerpos de cadena sencilla pueden usarse como base para construir anticuerpos completos o diversos fragmentos de los mismos (Kettleborough et al., Euro J. Immunol., 1994, 24: 952). La secuencia que codifica para la region variable puede aislarse (por ejemplo, mediante amplificacion por PCR o subclonacion) y someterse a corte y empalme para dar una secuencia que codifica para una region constante humana deseada para codificar para un anticuerpo de secuencia humana mas adecuado para usos terapeuticos en seres humanos en donde se minimiza preferiblemente la inmunogenicidad. El/los polinucleotido(s) que tiene(n) la(s) secuencia(s) codificante(s) completamente humana(s) pueden expresarse en una celula huesped (por ejemplo, a partir de un vector de expresion en una celula eucariota) y purificarse para dar una formulacion farmaceutica.

Los constructos de expresion de ADN incluiran normalmente una secuencia de ADN de control de la expresion operativamente unida a las secuencias codificantes, incluyendo regiones promotoras heterologas asociadas de manera natural. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresion seran sistemas promotores eucariotas en vectores que pueden transformar o transfectar celulas huesped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huesped apropiado, el huesped se mantiene en condiciones adecuadas para una expresion de alto nivel de las secuencias de nucleotidos, y la recoleccion y purification de los anticuerpos “disenados por ingenierla genetica” mutados.

Tal como se establecio anteriormente, las secuencias de ADN se expresaran en huespedes despues de que las secuencias se hayan unido operativamente a una secuencia de control de la expresion (es decir, situada para garantizar la transcription y traduction del gen estructural). Estos vectores de expresion normalmente pueden replicarse en los organismos huesped o bien como episomas o bien como una parte integral del ADN cromosomico del huesped. Comunmente, los vectores de expresion contendran marcadores de selection, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detection de las celulas transformadas con las secuencias de ADN deseadas (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.704.362).

Ademas de microorganismos eucariotas tales como levaduras, tambien pueden usarse cultivos celulares de tejidos de mamlfero para producir los polipeptidos de la presente invencion (vease, Winnacker, “From Genes to Clones”, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)). Se prefieren celulas eucariotas, porque se han desarrollado en la tecnica varias llneas de celulas huesped adecuadas que pueden secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las llneas celulares CHO, diversas llneas celulares COS, celulas HeLa, llneas celulares de mieloma, celulas B o hibridomas. Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir secuencias de control de la expresion, tales como un origen de replication, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 1986, 89: 49), y sitios de procesamiento de information necesarios, tales como sitios de union al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilacion y secuencias de terminador de la transcripcion. Secuencias de control de la expresion preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, y similares. La secuencia que codifica para la region variable puede aislarse (por ejemplo, mediante amplificacion por PCR o subclonacion) y someterse a corte y empalme para dar una secuencia que codifica para una region constante humana deseada para codificar para un anticuerpo de secuencia humana mas adecuado para usos terapeuticos en seres humanos en donde se minimiza preferiblemente la inmunogenicidad. El/los polinucleotido(s) que tiene(n) la(s) secuencia(s) codificante(s) completamente humana(s) pueden expresarse en una celula huesped (por ejemplo, a partir de un vector de expresion en una celula eucariota) y purificarse para dar una formulation farmaceutica.

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Los constructos de expresion de ADN incluiran normalmente una secuencia de ADN de control de la expresion operativamente unida a las secuencias codificantes, incluyendo regiones promotoras heterologas o asociadas de manera natural. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresion seran sistemas promotores eucariotas en vectores que pueden transformar o transfectar celulas huesped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huesped apropiado, el huesped se mantiene en condiciones adecuadas para una expresion de alto nivel de las secuencias de nucleotidos, y la recoleccion y purificacion de los anticuerpos “disenados por ingenierla genetica” mutados.

Tal como se establecio anteriormente, las secuencias de ADN se expresaran en huespedes despues de que las secuencias se hayan unido operativamente a una secuencia de control de la expresion (es decir, situada para garantizar la transcripcion y traduccion del gen estructural). Estos vectores de expresion normalmente pueden replicarse en los organismos huesped o bien como episomas o bien como una parte integral del ADN cromosomico del huesped. Comunmente, los vectores de expresion contendran marcadores de seleccion, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la deteccion de las celulas transformadas con las secuencias de ADN deseadas (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.704.362, que se incorpora en el presente documento como referencia).

Ademas de microorganismos eucariotas tales como levaduras, tambien pueden usarse cultivos celulares de tejidos de mamlfero para producir los polipeptidos de la presente invencion (vease, Winnacker, “From Genes to Clones”, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)). Se prefieren celulas eucariotas, porque se han desarrollado en la tecnica varias llneas de celulas huesped adecuadas que pueden secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las llneas celulares CHO, diversas llneas celulares COS, celulas HeLa, llneas celulares de mieloma, celulas B o hibridomas. Los vectores de expresion para estas celulas pueden incluir secuencias de control de la expresion, tales como un origen de replicacion, un promotor, un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 1986, 89: 49), y sitios de procesamiento de informacion necesarios, tales como sitios de union al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilacion y secuencias de terminador de la transcripcion. Secuencias de control de la expresion preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, citomegalovirus, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, y similares.

Puede aumentarse la transcripcion de ADN eucariota insertando una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son secuencias de actuacion en cis de entre 10 y 30 pb que aumentan la transcripcion por un promotor. Los potenciadores pueden aumentar eficazmente la transcripcion cuando estan o bien en 5' o bien en 3' con respecto a la unidad de transcripcion. Tambien son eficaces si se ubican dentro de un intron o dentro de la propia secuencia codificante. Normalmente, se usan potenciadores virales, incluyendo potenciadores de SV40, potenciadores de citomegalovirus, potenciadores de polioma y potenciadores de adenovirus. Tambien se usan comunmente secuencias de potenciador de sistemas de mamlfero, tales como el potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina de raton.

Los sistemas de vector de expresion de mamlfero tambien incluiran normalmente un gen marcador seleccionable. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen de timidina cinasa (TK) o genes procariotas que confieren resistencia a farmacos. Los primeros dos genes marcadores prefieren el uso de llneas celulares mutantes que carecen de la capacidad para crecer sin la adicion de timidina al medio de crecimiento. Entonces pueden identificarse celulas transformadas por su capacidad para crecer en medios no complementados. Los ejemplos de genes de resistencia a farmacos procariotas utiles como marcadores incluyen genes que confieren resistencia a G418, acido micofenolico e higromicina.

Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interes pueden transferirse a la celula huesped mediante metodos bien conocidos, dependiendo del tipo de celula huesped. Por ejemplo, se utiliza comunmente transfeccion con cloruro de calcio para celulas procariotas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato de calcio, lipofeccion o electroporacion para otras celulas huesped. Otros metodos usados para transformar celulas de mamlfero incluyen el uso de polibreno, fusion de protoplastos, liposomas, electroporacion y microinyeccion (vease, en general, Sambrook et al., citado anteriormente).

Una vez expresados, los anticuerpos, cadenas de inmunoglobulina mutadas individuales, fragmentos de anticuerpo mutados, y otros polipeptidos de inmunoglobulina de la invencion pueden purificarse segun procedimientos convencionales de la tecnica, incluyendo precipitacion con sulfato de amonio, cromatografla en columna de fraccionamiento, electroforesis en gel y similares (vease, en general, Scopes, R., Protein Purification, Springer- Verlag, N.Y. (1982)). Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad si se desea, los polipeptidos pueden usarse entonces terapeuticamente o en el desarrollo y la realizacion de procedimientos de ensayo, tinciones inmunofluorescentes, y similares (vease, en general, Immunological Methods, volumenes I y II, Eds. Lefkovits and Pernis, Academic Press, N.Y. N.Y. (1979 y 1981)).

Los oligopeptidos de la presente invencion pueden usarse para diagnostico y terapia. A modo de ilustracion y no de limitation, pueden usarse anticuerpos para tratar cancer, enfermedades autoinmunitarias o infecciones virales. Para el tratamiento de cancer, los anticuerpos se uniran normalmente a un antlgeno expresado preferentemente en celulas cancerosas, tales como erbB-2, CEA, CD33, y muchos otros antlgenos bien conocidos por los expertos en la

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tecnica. Para el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, los anticuerpos se uniran normalmente a un antlgeno expresado en celulas T, tal como CD4, el receptor de IL-2, los diversos receptores de antlgenos de celulas T y muchos otros antlgenos bien conocidos por los expertos en la tecnica (por ejemplo, vease Fundamental Immunology, 2a ed., W. E. Paul, ed., Raven Press: Nueva York, N.Y.). Para el tratamiento de infecciones virales, los anticuerpos se uniran normalmente a un antlgeno expresado sobre celulas infectadas por un virus particular tal como las diversas glicoprotelnas (por ejemplo, gB, gD, gE) de virus del herpes simple y citomegalovirus, y muchos otros antlgenos bien conocidos por los expertos en la tecnica (por ejemplo, vease Virology, 2a ed., B. N. Campos et al., eds., (1990), Raven Press: Nueva York, N.Y.).

Las composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos de la presente invencion son utiles para administracion parenteral, es decir, por via subcutanea, por via intramuscular o por via intravenosa. Las composiciones para administracion parenteral comprenderan comunmente una disolucion del anticuerpo o un coctel del mismo disuelto en un portador aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, agua, agua tamponada, solucion salina al 0,4%, glicina al 0,3% y similares. Estas disoluciones son esteriles y generalmente estan libres de materia particulada. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante tecnicas de esterilizacion convencionales, bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiere para aproximarse a las condiciones fisiologicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, etc. La concentracion de los anticuerpos mutantes en estas formulaciones puede variar ampliamente, es decir, desde menos del 0,01%, habitualmente al menos el 0,1% hasta tanto como el 5% en peso y se seleccionara principalmente basandose en los volumenes, viscosidades de fluidos, etc., segun el modo de administracion particular seleccionado.

Por tanto, podrla constituirse una composicion farmaceutica tlpica para inyeccion intramuscular para que contuviese 1 ml de agua tamponada esteril, y 1 mg de anticuerpo mutante. Una composicion tlpica para infusion intravenosa puede constituirse para que contenga 250 ml de solucion de Ringer esteril, y 10 mg de anticuerpo mutante. Los expertos en la tecnica conoceran o les resultaran evidentes metodos reales para preparar composiciones que pueden administrarse por via parenteral y se describen en mas detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 20a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (2000).

Fabricacion de candidatos y/o candidatos evolucionados

En una realizacion, el sistema eucariota es un sistema de mamlfero seleccionado de uno del grupo que consiste en llneas celulares CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 116, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MM1, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDAMB-468, LnCAP, NRK-49F y SP2/0; y esplenocitos de raton y PBMC de conejo.

En una realizacion, pueden usarse una amplia variedad de celulas huesped de mamlfero en la fabricacion del candidato, incluyendo celulas de fibroblastos (3T3, raton; BHK21, hamster sirio), celulas epiteliales (MDCK, perro; Hela, ser humano; PtK1, rata canguro), celulas plasmaticas ((SP2/0 y NS0, raton), celulas de rinon (293, ser humano; COS, mono), celulas de ovario (CHO, hamster chino), celulas embrionarias (R1 y E14,1, raton; H1 y H9, ser humano; PER C.6, ser humano).

En determinados aspectos, los anticuerpos recombinantes se producen en llneas celulares CHO y NS0 y SP2/0. En un aspecto especlfico, el sistema de mamlferos es una llnea celular CHO-S. Los sistemas de vector de expresion mas frecuentemente usados son sistemas de expresion de glutamina sintetasa y otros basados en genes de dihidrofolato reductasa.

En otra realizacion, el sistema eucariota es un sistema de celulas de levadura. En un aspecto, el sistema de celulas de levadura se selecciona de celulas de S. cerevisiae o Picchia.

En el metodo de la presente invencion, los huespedes usados para examinar moleculas evolucionadas son iguales que los huespedes usados para la fabricacion de coincidencias. En otro aspecto de la presente invencion, el sistema genetico usado para el descubrimiento y la evolucion de anticuerpos es exactamente igual que el sistema genetico usado para fabricar el anticuerpo para aplicaciones comerciales.

Farmacos biosimilares

Los farmacos biosimilares son productos terapeuticos basados en protelna que tienen una secuencia de aminoacidos identica (es decir composicion qulmica) que un farmaco etico aprobado que ya no esta protegido por una patente. En un aspecto, el metodo de CIAO es particularmente relevante para farmacos biosimilares. Aunque es esencial producir el anticuerpo terapeutico en una formulacion y composicion equivalentes, para que sea competitivo en el mercado, el farmaco biosimilar debe fabricarse tan rapida y economicamente como sea posible. Los medios de

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cultivo celular y el desarrollo de procedimientos son algunas de las partes mas costosas y que requieren mas tiempo de la preparation y production de un farmaco biosimilar.

El cambio de los codones de mutation silenciosa dentro de un anticuerpo terapeutico cambia el codon usado para la traduction de la protelna pero conserva la secuencia de aminoacidos dentro del anticuerpo. Estos cambios de codones en una variedad de posiciones dentro de una molecula, particularmente en el extremo amino-terminal pueden tener un impacto significativo sobre la expresion y en algunos casos incluso la glicosilacion. En un aspecto, el metodo de CIAO se usa para seleccionar y hacer evolucionar los codones de mutacion silenciosa en un anticuerpo dentro de una celula huesped similar a la usada en ultima instancia para la fabrication. Por tanto, puede reducirse el tiempo de procesamiento debido a los mayores rendimientos de anticuerpo y al hecho de que el anticuerpo se selecciono para expresarse en la llnea celular huesped, de modo que la mayorla de los problemas de fabricacion tradicionales se han descartado de la molecula. Ademas, seleccionando las moleculas en medios de cultivo baratos, libres de suero, pueden seleccionarse moleculas con codones que permiten una fabricacion y purificacion baratas.

Sin elaboration adicional, se cree que un experto en la tecnica puede utilizar, usando la description anterior, la presente invention en su extension mas completa. Los siguientes ejemplos deben considerarse ilustrativos y por tanto no son limitativos del resto de la divulgation de ninguna manera en absoluto.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generacion y examen de una biblioteca de anticuerpos

Este ejemplo describe el metodo de generar y examinar una biblioteca de anticuerpos humanos con presentation en la superficie de celulas de mamlferos para aislar anticuerpos humanos con actividad de union a un antlgeno diana usando la combination de clasificacion citometrica de flujo y ELISA.

Examen de biblioteca mediante analisis citometrico de flujo

1. Generar bibliotecas de anticuerpos humanos integrados de manera estable en celulas de mamlfero tal como se describe en los apendices 1.2, 1.3 y 1.4 a continuation.

2. Expandir clones de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos estables antes del analisis citometrico de flujo.

3. En el dla del analisis citometrico de flujo, lavar 1 x 107 celulas con 1 x PBS.

4. Desprender las celulas con medio de desprendimiento celular Detachin y recoger las celulas en 1 x PBS.

5. Centrifugar las celulas a 3000 rpm durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante.

6. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de 1 x PBS frlo y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.

7. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 ml de 2 mg/ml de protelna 001 humana purificada en 1 x PBS frlo.

8. Incubar en hielo durante 1 hora con mezclado ocasional a mano.

9. Centrifugar las celulas a 3000 rpm durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante.

10. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de 1 x PBS frlo y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.

11. Repetir las etapas 7 y 8.

12. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 ml de 1 ng/ml de anticuerpo policlonal de conejo anti-001 humana en 1 x PBS frlo con suero de cabra al 10%.

13. Incubar en hielo durante 30 minutos con mezclado ocasional a mano.

14. Centrifugar las celulas a 3000 rpm durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante.

15. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de 1 x PBS frlo y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.

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16. Repetir las etapas 7 y 8.

17. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 500 ml de anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con FITC y anticuerpo de cabra anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina en 1 x PBS frio con suero de cabra al 10%.

18. Incubar en hielo durante 30 minutos con mezclado ocasional a mano.

19. Centrifugar las celulas a 3000 rpm durante 5 minutos. Retirar el sobrenadante.

20. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de 1 x PBS frio y centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos.

21. Repetir las etapas 7 y 8.

22. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 1 ml de 1 x PBS frio con suero de cabra al 2%.

23. Continuar con el analisis citometrico de flujo usando MoFlo de Dako.

24. Preparar una ventana de clasificacion para incluir el 0,1% superior de las celulas totales en lo que se refiere a la razon de fluorescencia PE/FITC. Recoger las celulas que se encuentran dentro de la ventana de clasificacion en placas de 96 pocillos con 100 ml de medios de crecimiento.

Recuperacion de secuencias de region variable de cadena ligera y cadena pesada

1. Expandir los clones a partir de placas de 96 pocillos a placas de 6 pocillos. Cuando las celulas alcanzan el 80% de confluencia en las placas de 6 pocillos, continuar con al aislamiento de ADN genomico usando el kit DNeasy Tissue de Qiagen.

2. Retirar por aspiracion los medios de las celulas. Anadir 500 ml de 1 x PBS a cada 6 pocillos. Raspar las celulas de la placa con puntas de pipeta esteriles. Transferir las celulas raspadas en PBS a un tubo de microcentrifuga esteril.

3. Centrifugar las celulas durante 5 minutos a 3000 rpm.

4. Retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en 200 ml de 1 x PBS.

5. Anadir 20 ml de proteinasa K y 200 ml de tampon AL a la muestra, mezclar concienzudamente mediante agitacion con vortex e incubar a 56°C durante 10 minutos.

6. Anadir 200 ml de etanol a la muestra y mezclar concienzudamente mediante agitacion con vortex.

7. Pipetear la mezcla de la etapa 6 al interior de una columna de centrifugacion. Centrifugar a 8000 rpm durante un minuto. Desechar el flujo pasante.

8. Anadir 500 ml de tampon AW1 y centrifugar durante un minuto a 8000 rpm. Desechar el flujo pasante.

9. Anadir 500 ml de tampon AW2 y centrifugar durante 2 minutos a 14.000 rpm. Desechar el flujo pasante. Centrifugar de nuevo durante un minuto a 14.000 rpm. Asegurarse de que la membrana esta completamente seca.

10. Colocar la columna de centrifugacion en un tubo de microcentrifuga esteril y pipetear 200 ml de tampon AE directamente sobre la membrana.

11. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar durante un minuto a 8000 rpm para eluir el ADN genomico.

12. Someter a QC el ADN genomico preparando las siguientes reacciones en tubos de microcentrifuga de 1,5 ml:

ADNg 5 ml

10x tampon de carga de muestra 5 ml___________________________

Volumen total 10 ml

Cargar en un gel de agarosa al 0,8% - TAE bromuro de etidio 0,5 mg/ml. Usar marcador de tamano molecular de

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ADN de 1 kb como patron. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en 1X tampon TAE.

13. Preparar las siguientes reacciones de PCR en tubos de PCR esteriles:

ADNg 1 ml

2x mezcla maestra HotStar Taq 12,5 ml

Cebador directo de dominio variable* 0,5 ml Cebador inverso de dominio variable* 0,5 ml

H2O____________________________10,5 ml

Volumen total_____________________25 ml

*vease el apendice 1.2____________________

14. Colocar los tubos de PCR en el ciclador termico y comenzar el programa de ciclacion. Etapa de activacion inicial: 15 minutos, 95°C, ciclacion de 3 etapas

Desnaturalizacion: 40 segundos, 94°C

Apareamiento: 40 segundos, 55°C

Extension: 2 minutos, 72°C

Numero de ciclos: 30

Etapa de extension final: 10 minutos, 72°C

15. Someter a QC las reacciones de PCR preparando las siguientes reacciones en tubos de microcentrlfuga de 1,5 ml:

Reaccion de PCR 5 ml

10x tampon de carga de muestra 5 ml___________________________

Volumen total 10 ml

Cargar en un gel de agarosa al 1% - TAE bromuro de etidio 0,5 mg/ml. Usar marcador de tamano molecular de ADN de 1 kb como patron. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en 1X tampon TAE.

16. Preparar las siguientes reacciones de clonacion en tubos de microcentrlfuga de 1,5 ml usando el kit TOPO 2.1 de Invitrogen:

Reaccion de PCR 4 ml

Solucion salina 1 ml

Vector TOPO__________________1ml

Volumen total 6 ml

17. Mezclar las reacciones suavemente e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.

18. Anadir 2 ml de la reaccion de clonacion TOPO de la etapa 17 al interior de un vial de E. coli qulmicamente competente One Shot y mezclar suavemente.

19. Incubar en hielo durante 30 minutos.

20. Someter las celulas a choque termico durante 30 segundos a 42°C.

21. Transferir los tubos a hielo e incubar durante 2 minutos.

22. Anadir 250 ml de medio S.O.C. a temperatura ambiente.

23. Agitar los tubos horizontalmente a 37°C durante una hora a 200 rpm.

24. Extender 10 ml de la transformacion en una placa de LB-carbenicilina calentada nuevamente.

25. Incubar la placa durante la noche a 37°C.

26. Recoger 6 clones de cada transformacion para la secuenciacion.

27. Analizar las secuencias de region variable de cadena pesada y cadena ligera. Continuar a la segunda ronda de examen usando el metodo de ELISA.

Digerir vector y clones de anticuerpos humanos con enzimas de restriccion

5 Las reacciones dependeran de la(s) enzima(s) de restriccion elegida(s) y segun las instrucciones del fabricante; se facilitan ejemplos en el presente documento: Preparar las siguientes reacciones de digestion en un tubo de microcentrlfuga en hielo:

ADN de vector (2 mg) x ml

10x tampon Rest Enz x 10 ml

Agua libre de nucleasa c.s. hasta 97 ml

Rest Enz 1 (10 U/ml) 3 ml

Rest Enz 2 (10 U/ml)__________________3_ml_________

Volumen de reaccion total 100 ml

Clones de anticuerpos humanos (5 ug) x ml 10X tampon Rest Enz x 10 ml

Agua libre de nucleasa c.s. hasta 97 ml

Rest Enz 1 (10 U/ml) 3 ml

Rest Enz 2 (10 U/ml)__________________3_ml_________

Volumen de reaccion total 100 ml

1. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en microcentrlfuga.

2. Incubar la reaccion a 37°C durante la noche

10 Digerir mediante CIP vector y purificar con el kit de purificacion de PCR QIAquick

3. Anadir 2 ml de Apex fosfatasa al tubo de microcentrlfuga que contiene la reaccion de digestion del vector.

4. Incubar a 37°C durante 10 minutos.

5. Calentar a 70°C durante 5 minutos para inactivar la Apex fosfatasa.

6. Anadir 500 ml de tampon PBI a la microcentrlfuga.

15 7. Mezclar mediante vortex y centrifugar rapidamente.

8. Cargar 750 ml cada vez en una columna.

9. Centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto y decantar el liquido del tubo de recogida.

10. Repetir hasta que se haya procesado toda la muestra.

11. Lavar con 750 ml de tampon PE (con etanol anadido).

20 12. Centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto y decantar el liquido del tubo de recogida.

13. Colocar la columna de nuevo sobre el tubo de recogida y centrifugar de nuevo.

14. Poner la columna sobre nuevos tubos de microcentrlfuga y eluir con 50 ml de tampon EB.

Purificar en gel clones de anticuerpos humanos digeridos con enzimas de restriccion

1. Preparar las siguientes reacciones en un tubo de microcentrlfuga de 1,5 ml:

Clones de anticuerpos totalmente humanos digeridos con Rest Enz 100 ml

10x tampon de carga de muestra___________________________________3_jml________

Volumen total 103 ml

2. Cargar en un gel de agarosa al 1%-TAE bromuro de etidio 0,5 mg/ml. Usar marcador de tamano molecular de ADN de 1 kb como patron. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en 1X tampon TAE.

4. Anadir 3 volumenes de tampon QG a 1 volumen de gel.

5. Incubar a 50°C durante 10 minutos hasta que el trozo de gel se haya disuelto completamente. Anadir 1 volumen 5 de gel de isopropanol a la muestra y mezclar.

6. Colocar una columna de centrifugacion QIAquick en un tubo de recogida de 2 ml facilitado.

7. Aplicar la muestra a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.

8. Desechar el flujo pasante y colocar de nuevo la columna QIAquick en el mismo tubo de recogida.

9. Anadir 0,75 ml de tampon PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto.

10 10. Desechar el flujo pasante y centrifugar la columna QIAquick durante 1 minuto adicional a 17.900 x g

(13.000 rpm).

11. Colocar la columna QIAquick en un tubo de microcentrlfuga de 1,5 ml limpio.

12. Anadir 52 ml de tampon EB al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna durante 1 minuto. Dejar reposar la columna durante 1 minuto y entonces centrifugar durante 1 minuto.

15 Ligar el dominio variable de HC y LC humano en ADN de vector digerido

Preparar la siguiente reaccion de ligamiento en un tubo de microcentrlfuga en hielo:

ADN de vector digerido (100 ng) x ml

Dominio variable de HC y LC humano y ml

5X tampon ligasa de T4 4 ml

Agua libre de nucleasa c.s. hasta 19 ml

Ligasa de T4 (2.000 U/ml)______________l_m!_________

Volumen de reaccion total 20 ml

1. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en microcentrlfuga.

2. Incubar a temperatura ambiente durante 2 horas a 16°C durante la noche.

3. Transformar cada una de las mezclas de la reaccion de ligamiento en celulas E. colisupercompetentes.

20 4. Enfriar previamente tubos de fondo redondo de polipropileno BD Falcon de 14 ml en hielo. Preparar medio SOC

hasta 42°C.

5. Descongelar las celulas supercompetentes en hielo. Cuando esten descongeladas, mezclar suavemente y llevar allcuotas de 100 ul de celulas al interior de cada uno de los tubos enfriados previamente.

6. Anadir 1,7 ml de b-mercaptoetanol a cada allcuota de celulas. Incubar las celulas en hielo durante 10 minutos, 25 agitando suavemente cada 2 minutos.

7. Anadir 2 ml de la mezcla de reaccion de ligamiento a una allcuota de celulas. Golpear los tubos suavemente.

8. Incubar los tubos en hielo durante 30 minutos.

9. Calentar por impulsos los tubos en un bano de agua a 42°C durante 45 segundos.

10. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos.

30 11. Anadir 900 ml de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37°C durante 1 hora con agitacion a 225

250 rpm.

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12. Sembrar en placa 20 ml y 200 ml de la mezcla de transformacion en placas de agar LB que contienen carbenicilina.

13. Incubar las placas a 37°C durante la noche.

14. Contar colonias en las placas y recoger 6 colonias para secuenciacion y examen de PCR.

15. Elegir un clon con la secuencia correcta, preparar ADN de plasmido y continuar con la transfeccion en celulas 293F.

Transfeccion de celulas 293F

1. Una semana antes de la transfeccion, transferir celulas 293F a cultivo en monocapa en medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) complementado con suero.

2. Un dla antes de la transfeccion, sembrar en placa 0,1 x 105 celulas en 100 l de D-MEM complementado con suero por muestra de transfeccion en formatos de 96 pocillos.

3. Para cada muestra de transfeccion, preparar complejos de ADN-Lipofectamine.

4. Diluir 0,2 mg de ADN en 50 ml de medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente.

5. Diluir 0,125 ml de Lipofectamine en 50 ml de medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.

6. Combinar el ADN diluido con la Lipofectamine diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.

7. Anadir los 100 ml de complejos de ADN-Lipofectamine a cada pocillo que contiene celulas y medio. Mezclar suavemente sacudiendo la placa hacia delante y hacia atras.

8. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2.

9. Anadir 100 ml de D-MEM complementado con suero a cada pocillo tras 6 horas. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2 durante la noche.

10. Retirar por aspiracion el medio en cada pocillo. Lavar cada pocillo con 100 ml de 293 SFM II con L-glutamina 4 mM. Anadir 100 ml de 293 SFM II con L-glutamina 4 mM a cada pocillo.

11. Recoger el sobrenadante para ELISA a las 96 horas tras la transfeccion.

Apendice 1.1: Formulas de tampon

1 x PBS con suero de cabra al 2%

• 2 ml se suero de cabra

• 98 ml de 1 x PBS

50X tampon TAE

• 242 g de base Tris

• 57,1 ml de acido acetico glacial

• 37,2 g de Na2EDTA-2H2O

• Anadir H2O destilada hasta el volumen final de 1 litro 1X tampon TAE

• 20 ml de 50X tampon TAE

• 800 ml de H2O destilada

Gel de agarosa al 0,8% con bromuro de etidio

• 0,8 g de agarosa LE

• 100 ml de 1X tampon TAE

• Fundir la agarosa en un horno microondas y agitar para garantizar un mezclado uniforme

• Enfriar la agarosa hasta 55°C

5 • Anadir 2,5 ml de bromuro de etidio 20 mg/ml a la agarosa

• Verter sobre una plataforma de gel

Gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio

• 1 g de agarosa LE

• 100 ml de 1X tampon TAE

10 • Fundir la agarosa en un horno microondas y agitar para garantizar un mezclado uniforme

• Enfriar la agarosa hasta 55°C

• Anadir 2,5 ml de bromuro de etidio 20 mg/ml a la agarosa

• Verter sobre una plataforma de gel

LB

15 • 10 g de NaCl

• 10 g de triptona

• 5 g de extracto de levadura

• Anadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro

• Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N

20 • Someter a autoclave

Agar LB-carbenicilina

• 10 g de NaCl

• 10 g de triptona

• 5 g de extracto de levadura

25 • 20 g de agar

• Anadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro

• Ajustar el pH a 7,0 con NaOH 5 N

• Someter a autoclave

• Enfriar hasta 55°C

30 • Anadir 10 ml de carbenicilina 10 mg/ml esterilizada por filtracion

• Verter en placas Petri (placas de 25 ml/100 mm)

Medio SOC

• 0,5 g de NaCl

• 20 g de triptona

35 • 0,5 g de extracto de levadura

• 2 ml de glucosa al 20% esterilizada por filtracion

• Anadir H2O destilada hasta un volumen final de 1 litro

• Someter a autoclave

• Anadir 10 ml de MgCh 1 M esterilizado por filtracion y 10 ml de MgSOs 1 M esterilizado por filtracion antes de su

40 uso

Disolucion de lavado

• Tween-20 al 0,05% en PBS Disolucion de bloqueo

• Leche descremada Carnation al 2% en PBS

45 Suero bovino fetal inactivado por calor

• 500 ml de suero bovino fetal inactivado por calor en la botella original del vendedor

• Calentar durante 30 minutos a 56°C con mezclado cada 5 minutos

• Preparar allcuotas de 50 ml y almacenar a -20°C

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Medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero

• 500 ml de medio Eagle modificado por Dulbecco

• 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor

• 5 ml de aminoacidos no esenciales-MEM 10 mM

293 SFM II con L-glutamina 4 mM

• 500 ml de SFM II

• 10 ml de L-glutamina 200 mM

Disolucion de DEAE-dextrano

• 1 g de DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano)

• Disolver en 100 ml de agua destilada

• Esterilizar con filtro

Apendice 1.2: Construccion de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos

Pueden obtenerse todas las regiones V de cadena ligera kappa (Vk) y cadena pesada (Vh) de llnea germinal humana funcionales de la base de datos Vbase (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.u/) y alinearse. Entonces pueden analizarse las alineaciones con respecto a la diversidad, especialmente en las tres regiones de entramado. Entonces puede seleccionarse el numero deseado de genes de Vh y Vk de las agrupaciones de secuencias resultantes para la construccion de la biblioteca.

Clonacion de la region V

Se amplifican genes de la region V de cadena pesada y ligera (incluyendo las regiones de entramado 1, 2 y 3 y CDR1, CDR2 y CDR3) a partir de ADN genomico humano en dos fragmentos usando cebadores especlficos de genes. Entonces se combinan genes parciales de la region V mediante PCR de solapamiento. Se anade un ligador a las regiones V de LC de longitud completa mediante PCR anidada antes de la clonacion en un vector de expresion de mamlfero. Se confirma la secuencia de los dominios variables LC clonados (produciendo clones V de LC). Se clonan mediante TOPO los dominios variables de la cadena pesada y se confirma la secuencia (clones V de HC mediante TOPO). Se amplifican las regiones V de HC de secuencia confirmada a partir de los plasmidos correspondientes, se anade un ligador al extremo 3' y se clonan los productos de PCR resultantes en los clones de dominio variable V de LC para formar combinaciones Vk/VH y en un vector de mamlfero.

Expresion de IgG de longitud completa

La expresion de cadena pesada de IgG 1 y cadena ligera capa de longitud completa en el vector de mamlfero deseado puede dirigirse a partir de un unico promotor, por ejemplo, un promotor de CMV. Cada cadena va precedida por una senal de secrecion que dirige la cadena de polipeptido naciente al retlculo endoplasmatico (ER). Una senal de anclaje puede fusionarse al extremo C-terminal de la cadena pesada. Esta senal se escinde y se sustituye por un anclaje que une la IgG de longitud completa al exterior de la membrana celular tras la secrecion.

Apendice 1.3: Generacion de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos estables en celulas de mamlfero mediante transfeccion

1. Una semana antes de la transfeccion, transferir celulas CHO-S a cultivo en monocapa en medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) complementado con suero.

2. Un dla antes de la transfeccion, sembrar en placa 6 x 106 celulas en 15 ml de D-MEM complementado con suero por muestra de transfeccion en una placa de cultivo tisular de 10 cm. Preparar diez placas de 10 cm.

3. Para cada placa de 10 cm, preparar complejos de ADN-Lipofectamine siguiendo las etapas 4-7.

4. Diluir 25 mg de ADN de plasmido de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos Maxi-prep en 1,5 ml de medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente.

5. Diluir 60 ml de Lipofectamine en 1,5 ml de medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.

6. Combinar el ADN diluido con la Lipofectamine diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a

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temperatura ambiente.

7. Anadir los 3 ml de complejos de ADN-Lipofectamine a cada placa que contiene celulas y medio. Mezclar suavemente sacudiendo la placa hacia delante y hacia atras.

8. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2 durante la noche.

9. Cambiar el medio de cada placa por 15 ml de D-MEM complementado con suero. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2 durante 48 horas.

10. Desprender las celulas con medio de desprendimiento celular Detachin y resuspender las celulas en D-MEM complementado con suero.

11. Sembrar en placa 0,4 x 106 celulas en 10 ml de D-MEM complementado con suero con G418 800 mg/ml en una placa de cultivo tisular de 10 cm. Transferir todas las celulas transfectadas dando como resultado 150 placas de 10 cm.

12. Sembrar en placa 0,4 x 106 celulas CHO-S no transfectadas en 10 ml de D-MEM complementado con suero con G418 800 mg/ml en una placa de cultivo tisular de 10 cm.

13. Alimentar las celulas con D-MEM complementado con suero con G418 800 mg/ml cada 4 dlas.

14. Tras 14 dlas, inspeccionar las placas con celulas CHO-S no transfectadas. No debe haber celulas vivas en las placas.

15. Desprender las celulas transfectadas restantes con medio de desprendimiento celular Detachin y congelar las celulas en medios de congelacion a 1x107 8 9 10 celulas/ml.

Apendice 1.4: Generacion de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos estables en celulas de mamlfero mediante infeccion retroviral

1. Un dla antes de la transfeccion, sembrar en placa 6 x 106 celulas EcoPack-2 293 en 15 ml de D-MEM complementado con suero por muestra de transfeccion en una placa de cultivo tisular de 10 cm. Preparar diez placas de 10 cm.

2. Prepare el medio que contiene MBS. Esto se realiza inmediatamente antes de la transfeccion. Para cada placa de cultivo tisular de 10 cm, deben prepararse 12 ml de medio que contiene MBS.

3. Anadir 12 ml de medio que contiene MBS a cada placa de 10 cm y devolver las placas a la incubadora a 37°C. Esto debe realizarse 20-30 minutos antes de la adicion de la suspension de ADN.

4. Resuspender 10 mg de sedimento de ADN de plasmido de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos Maxiprep en 450 ml de H2O esteril y transferir el ADN a tubos de fondo redondo de poliestireno BD Falcon de 5 ml separados.

5. Anadir al ADN 50 ml de disolucion I y 500 ml de disolucion II del kit de transfeccion en mamlferos Transfection MBS de Stratagene.

6. Resuspender suavemente cualquier precipitado en la suspension de ADN pipeteando la suspension hacia arriba y hacia abajo con una pipeta fijada a 500 ml.

7. Incubar la suspension de ADN a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8. Retirar las placas de 10 cm que van a transfectarse de la incubadora y anadir la suspension de ADN sobre las placas en una forma gota a gota, agitando suavemente para impedir que las celulas se suban por la placa y para distribuir la suspension de ADN uniformemente.

9. Devolver las placas de cultivo tisular a la incubadora a 37°C.

10. Tras incubar durante 3 horas, retirar el medio de las placas y sustituirlo por 4 ml de D-MEM complementado con suero complementado con cloroquina 25 mM. Devolver las placas a la incubadora a 37°C.

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11. Tras incubar durante 6-7 horas adicionales, retirar el medio de crecimiento que contiene cloroquina 25 mM y sustituirlo por 4 ml de D-MEM complementado con suero sin cloroquina.

12. Incubar la placa en la incubadora a 37°C durante la noche.

13. Retirar el medio de las placas y sustituirlo por 3,0 ml de D-MEM complementado con suero reciente. Devolver las placas a la incubadora a 37°C.

14. Retirar las celulas de empaquetamiento productoras de virus de la incubadora.

15. Recoger el sobrenadante que contiene virus de la primera placa y filtrarlo a traves de un filtro de 0,45 mm al interior de un tubo conico esteril de 50 ml.

16. Llevar allcuotas del sobrenadante viral al interior de criovirales de 1,5 ml y someter a congelamiento rapido en un bano de hielo seco/etanol. Almacenar el sobrenadante viral a -80°C.

17. Sembrar en placa 0,5 x 106 celulas NIH-3T3 en 10 ml de D-MEM complementado con suero en una placa de cultivo tisular de 10 cm. Sembrar en placa 102 placas de cultivo tisular de 10 cm.

18. Someter a descongelacion rapida el sobrenadante mediante agitacion rapida en un bano de H2O a 37°C.

19. Diluir el virus en DMEM complementado con suero de ternero con disolucion de DEAE-dextrano con el tltulo de 0,3 x 105 partlculas virales/ml. Preparar 3 ml de virus diluidos por placa de 100 mm que va a infectarse (se infectara el 20% de las celulas). Preparar “coctel simulado” de medio de crecimiento mas DEAE-dextrano que va a usarse como control negativo.

20. Retirar por aspiracion el medio de las celulas NIH-3T3. Para cada placa, extender 3,0 ml virus diluidos uniformemente sobre las celulas. Devolver las placas a la incubadora a 37°C durante 3 horas.

21. Tras la incubacion de 3 horas, anadir 7,0 ml adicionales de D-MEM complementado con suero de ternero a cada placa y devolver las placas a la incubadora a 37°C. Incubar la placa durante 48 horas.

22. Sustituir el medio por 10 ml de D-MEM complementado con suero de ternero con G418 800 mg/ml en cada placa de cultivo tisular de 10 cm.

23. Alimentar las celulas con D-MEM complementado con suero de ternero con G418 800 mg/ml cada 4 dlas.

24. Tras 14 dlas, inspeccionar las placas con celulas NIH-3T3 infectadas de manera simulada. No debe haber celulas vivas en la placa.

25. Desprender las celulas transfectadas restantes con medio de desprendimiento celular Detachin y congelar las celulas en medio de congelamiento at 1 x 107 celulas/ml.

Ejemplo 2. Reacciones para la evolucion de posicion completa (CPE)

Reaccion de mutagenesis

Se disena un par de cebadores (mezcla de cebadores 1 y mezcla de cebadores 2) para cada codon que va a insertarse. El diseno dependera de la secuencia genica, y pueden usarse bases de datos de analisis de secuencia tales como Sequencher (Gene Codes Corporation) o VectorNTI® (Life Technologies) para disenar los cebadores. Para CPE, se disena un par de cebadores para cada codon que va a mutarse. Un codon diana degenerado (NNK o NNN) esta en el centro, flanqueado por 20 bases en cada lado (longitud total del cebador: 43 bases, clones 9f para secuenciacion para identificar mutantes unicos). El ADN de molde es ADN de vector con gen(es) diana.

Preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml en hielo:

Mezcla de cebadores 1 (2,5 mM) 5 ml

Mezcla de cebadores 2 (2,5 mM) 5 ml

10X tampon de ADN polimerasa Pfu turbo 2,5 ml

Molde de ADN (5, 10 25 ng) x ml

dNTP 2 ml

5

10

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25

Agua libre de nucleasa c.s. hasta 24,5 ml

ADN polimerasa Pfu turbo________________0,5 ml__________________

Volumen de reaccion total 25 ml

1. Preparar una reaccion de control negativo por una placa de 96 pocillos (sustituir cebadores por tampon TE).

2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en centrlfuga de sobremesa.

3. Ciclar las reacciones usando los parametros de ciclacion explicados resumidamente a continuation:

Segmento: Ciclos Temperatura Tiempo

1
1: 95°C 30 segundos

2: 18 95°C 30 segundos

55°C: 1 minuto

68°C: 16 minutos

Analisis de control de calidad

1. Para someter a QC las reacciones de amplification, preparar las siguientes reacciones en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos o tubos de PCR de pared delgada de 0,2 ml:

Reaccion de mutagenesis 5 ml

Agua 4 ml

Tampon de carga de muestra_____________1 ml

Volumen 10 ml

2. Cargar 10 ml en un gel de agarosa al 1%-TAE con bromuro de etidio 0,5 mg/ml. Usar un marcador de tamano molecular de ADN de 1 kb como patron. Correr el gel a 100 V durante 20-30 minutos en 1X tampon TAE.

Digerir las reacciones de mutagenesis con enzimas de restriction apropiadas para clonar en ADN de vector - Ejemplo para enzima de restriccion Dpnl

1. Anadir 0,5 ml de la enzima de restriccion Dpnl (10 U/ml) directamente a cada reaccion.

2. Mezclar suavemente y centrifugar brevemente (5 s) en una centrifuga de sobremesa.

3. Incubar a 37°C en maquinas de PCR durante 2 horas.

4. Transformar 6 mezclas de reaccion de cada una de las placas de 96 pocillos en celulas supercompetentes XLI Blue. Almacenar el resto de las reacciones a -20°C.

5. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar medio SOC hasta 42°C.

6. Descongelar las celulas supercompetentes XLI Blue en hielo. Cuando esten descongeladas, mezclar suavemente y llevar allcuotas de 50 ml de celulas al interior de cada uno de los tubos enfriados previamente.

7. Anadir 0,8 ml de beta-mercaptoetanol a cada allcuota de celulas. Incubar las celulas en hielo durante 10 minutos, agitando suavemente cada 2 minutos.

8. Anadir 2 ml de la mezcla de reaccion a una allcuota de celulas. Golpear los tubos suavemente.

9. Incubar los tubos en bloques frlos durante 30 minutos.

10. Calentar por impulsos los tubos en un bano de agua a 42°C durante 45 segundos.

11. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos.

12. Anadir 100 ml de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37°C durante 1 hora con agitation a 225250 rpm.

13. Sembrar en placa la mezcla de transformation completa en placas de agar LB que contienen carbenicilina.

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14. Incubar las placas a 37°C durante la noche.

15. Contar colonias en las placas y recoger 12 colonias de cada reaccion de transformacion para minipreparacion y secuenciacion.

Transformacion a gran escala

1. Descongelar las celulas supercompetentes XLI Blue en hielo. Descongelar 20 tubos de celulas competentes para 96 reacciones. Cuando esten descongeladas, anadir 4 ml de b-mercaptoetanol a cada tubo de 250 ul de celulas competentes. Incubar las celulas en hielo durante 10 minutos, agitando suavemente cada 2 minutos.

2. Enfriar previamente tubos de PCR de 0,2 ml en hielo. Calentar medio SOC hasta 42°C.

3. Llevar allcuotas de 50 ml de celulas al interior de cada uno de los tubos enfriados previamente.

4. Anadir 2 ml de la mezcla de reaccion a una allcuota de celulas. Golpear los tubos suavemente.

5. Incubar los tubos en bloques frlos durante 30 minutos.

6. Calentar por impulsos los tubos en un bano de agua a 42°C durante 45 segundos.

7. Incubar los tubos en hielo durante 2 minutos.

8. Anadir 100 ml de medio SOC precalentado e incubar los tubos a 37°C durante 1 hora con agitacion a 225-250 rpm.

9. Sembrar en placa la mezcla de transformacion completa en placas de agar LB que contienen carbenicilina.

10. Incubar las placas a 37°C durante la noche.

11. Hacer crecer las celulas en bloques de 96 pocillos para minipreparacion.

12. Preparar minipreparacion deADN usando el kit QIAVac 96 siguiendo el protocolo de fabricacion.

Ejemplo 3. Examinar para determinar la mejora en la afinidad de los anticuerpos

Transfeccion

Una semana antes de la transfeccion, transferir celulas 293F a cultivo en monocapa en medio Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) complementado con suero. Un dla antes de la transfeccion, sembrar en placa 0,2 x 105 y 0,4 x 105 celulas en 100 ml de D-MEM complementado con suero por muestra de transfeccion en formatos de 96 pocillos.

1. Para cada muestra de transfeccion, preparar complejos de ADN-Lipofectamine.

2. Diluir 0,2 mg de ADN en 50 ml medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente.

3. Diluir 0,125 ml de Lipofectamine en 50 ml de medio de suero reducido Opti-MEM. Mezclar suavemente e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.

4. Combinar el ADN diluido con la Lipofectamine diluida. Mezclar suavemente e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.

5. Anadir los 100 ml de complejos de ADN-Lipofectamine a cada pocillo que contiene celulas y medio. Mezclar suavemente sacudiendo la placa hacia delante y hacia atras.

6. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2.

7. Anadir 100 ml de D-MEM complementado con suero a cada pocillo tras 6 horas. Incubar las celulas a 37°C en una incubadora con el 5% de CO2 durante la noche.

8. Retirar por aspiracion el medio en cada pocillo. Lavar cada pocillo con 100 ml de 293 SFM II con L-glutamina 4 mM. Anadir 100 ml de 293 SFM II con L-glutamina 4 mM a cada pocillo.

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9. Recoger el sobrenadante para ELISA a las 96 horas tras la transfeccion.

ELISA funcional

1. Recubrir placas de 96 pocillos Nunc-Immuno Maxisorp con 100 ml de antlgeno 2 mg/ml en disolucion de recubrimiento.

2. Cubrir las placas con elementos de sellado e incubar durante la noche a 4°C.

3. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

4. Anadir 200 ml de disolucion de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.

5. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

6. Anadir 200 ml de disolucion de bloqueo. Agitar a 200 rpm durante 1 hora a temperatura ambiente.

7. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

8. Anadir duplicados de 100 ml/pocillo de anticuerpo control (2 mg/ml) en disolucion de bloqueo a las placas.

9. Anadir duplicados de 100 ml de sobrenadante procedente de la transfeccion (SOP 5A) a las placas.

10. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.

11. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

12. Anadir 200 mml de disolucion de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.

13. Repetir las etapas 11-12 3 veces.

14. Anadir 100 ml de dilucion 1:5000 de anticuerpo de cabra anti-ser humano purificado mediante afinidad conjugado con HRP en disolucion de bloqueo a cada pocillo.

15. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.

16. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

17. Anadir 200 ml de disolucion de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.

18. Repetir las etapas 17-18 3 veces.

19. Anadir 100 ml de sustrato TMB de Sigma a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos.

20. Anadir 100 ml de HCl 1 H para detener la reaccion.

21. Leer a 450 nm.

ELISA de cuantificacion

1. Recubrir placas de 96 pocillos Nunc-Immuno Maxisorp con 100 ml de anticuerpo de cabra anti-IgG humana especlfico de Fc purificado mediante afinidad 10 mg/ml en disolucion de recubrimiento.

3. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

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5. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

7. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

8. Anadir duplicados de 100 pl/pocillo de concentracion normalizada de IgG serica humana purificada en disolucion de bloqueo a las placas.

9. Anadir duplicados de 100 pl de sobrenadante procedente de la transfeccion (SOP 5A) a las placas.

10. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.

11. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

12. Anadir 200 pl de disolucion de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.

13. Repetir las etapas 11-12 3 veces.

14. Anadir 100 pl de dilucion 1:5000 de anticuerpo de cabra anti-ser humano purificado por afinidad conjugado con HRP en disolucion de bloqueo a cada pocillo.

15. Agitar a 200 rpm durante una hora a temperatura ambiente.

16. Decantar las placas y extraer con golpes suaves el llquido residual.

17. Anadir 200 pl de disolucion de lavado. Agitar a 200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.

18. Repetir las etapas 17-18 3 veces.

19. Anadir 100 pl de sustrato TMB de Sigma a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente y comprobar cada 2-5 minutos.

20. Anadir 100 pl de HCl 1 N para detener la reaccion.

21. Leer a 450 nm.

Ejemplo 4. Generacion y examen de una biblioteca de variantes de codones de Fc para expresion optima de anticuerpos

El presente ejemplo proporciona metodos para generar una biblioteca de variantes de codones de Fc y metodos de examen para obtener variantes de Fc optimizadas para expresion mejorada en celulas huesped de produccion en comparacion con la forma parental del polipeptido Fc.

A. Diseno y construccion de una biblioteca de variantes de codones de Fc

Para cada codon en la zona diana (en este caso la parte Fc de la molecula de IgG1 humana) se disena un par de cebadores degenerados (directo e inverso) que incluye el codon diana y 20 bases en cada lado. La 3a posicion del codon diana (posicion de titubeo) contiene bases mixtas (tabla 3) que permiten la generacion de todas las mutaciones silenciosas en la posicion diana usando el mismo codon (ejemplo A). Se disena un segundo conjunto de cebadores degenerados para la misma posicion de codon si el aminoacido correspondiente puede codificarse por otro codon (ejemplo B). Se mezclan los cebadores degenerados directo e inverso correspondientes 1:1, se aparean con el molde y se extienden para obtener los productos de longitud completa mediante desplazamiento de hebra usando una aDn polimerasa termoestable. El molde se digiere con Dpnl y se transforman los transforman productos de extension de longitud completa en E. coli. Se secuencian hasta 12 colonias por reaccion de mutagenesis. Se disponen los mutantes confirmados en cuanto a secuencia en placas de 96 pocillos y se guardan en glicerol. Las reservas en glicerol se usan para realizar minipreparaciones de ADN de plasmido para su transfeccion en celulas de mamlfero y su examen.

Tabla 3: Codigos para bases degeneradas en oligonucleotidos sinteticos

Slmbolo: Base mixta

R: A,G

Y: C,T

M: A,C

K: G,T

S: C,G

W: A,T

H: A,C,T

B: C,G,T

V: A,C,G

D: A,G,T

N: A,C,G,T

Ejemplo A: codon diana = CCC (prolina)

^■cebador directo: CCD, cebador inverso: HGG Ejemplo B: codon diana = TCG (serina)

5 ^ cebador directo 1: TCH, cebador inverso 1: DGA

^ cebador directo 2: AGY, cebador inverso 2: RCT

No se muestran las 20 bases que flanquean el codon diana. Longitud de cebador total: 43 bases.

B. Expresion y examen basado en ELISA de la biblioteca de variantes de codones de Fc

Se transfectaron clones de la biblioteca de variantes de codones de Fc en una llnea celular de mamlfero. Se 10 produjeron IgG de longitud completa y se secretaron al medio. Se examinaron los sobrenadantes de las variantes de codones de Fc expresadas para determinar el nivel de expresion de IgG superior al del clon parental usando ensayo de ELISA. Se normalizaron los datos de ELISA con ensayo de beta-galactosidasa que mide la eficacia de transfeccion. Las mejores coincidencias identificadas en el examen primario volvieron a transfectarse y a examinarse tres veces para confirmar el nivel de expresion aumentado.

15

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Metodo de evolucion y expresion de un anticuerpo en un huesped de produccion celular eucariota; comprendiendo el metodo:

a. seleccionar un anticuerpo molde;

b. hacer evolucionar el anticuerpo molde para permitir la produccion de un conjunto de anticuerpos mutantes en un huesped de produccion celular eucariota;

c. examinar los anticuerpos mutantes para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada;

d. seleccionar un anticuerpo mutante superior del conjunto de anticuerpos mutantes basandose en la optimizacion de la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada en comparacion con la misma propiedad, caracterlstica o actividad del anticuerpo molde; y

e. expresar el anticuerpo mutante superior en el mismo huesped de produccion celular eucariota que en la etapa (b) para cualquier escala comercial.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de seleccion (a) comprende:

a1. generar una biblioteca de anticuerpos anti-antlgeno en un huesped de produccion celular eucariota con presentacion en la superficie celular de anticuerpos;

a2. examinar la biblioteca para determinar al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada; y a3. seleccionar un anticuerpo molde de la biblioteca.

3. Metodo segun la reivindicacion 1 en el que el huesped de produccion celular eucariota se selecciona de celulas de fibroblasto de raton 3T3; celulas de fibroblasto de hamster sirio BHK21; celulas epiteliales de perro, MDCK; celulas epiteliales humanas Hela; celulas epiteliales de rata canguro PtK1; celulas plasmaticas de raton SP2/0; y celulas plasmaticas de raton NS0; celulas de rinon embrionario humano HEK 293; celulas de rinon de mono COS; celulas de ovario de hamster chino CHO, CHO-S; celulas embrionarias de raton R1; celulas embrionarias de raton E14.1; celulas embrionarias humanas H1; celulas embrionarias humanas H9; celulas embrionarias humanas PER C.6; celulas de levadura S. cerevisiae; y celulas de levadura Picchia.

4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que el huesped de produccion celular eucariota es CHO o HEK293.

5. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que las etapas de examen comprenden clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS).

6. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de hacer evolucionar comprende producir un conjunto de anticuerpos mutantes formados a partir del anticuerpo molde que tiene m regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en el que m es un numero entero de 1 a 6, comprendiendo cada una de dichas CDR n residuos de aminoacido, comprendiendo el metodo:

a. generar m x n conjuntos independientes de anticuerpos, comprendiendo cada conjunto anticuerpos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada de la CDR; en el que cada conjunto de anticuerpos difiere en la posicion individual predeterminada; y el numero de anticuerpos miembros diferentes generados es equivalente a m x n x X.

7. Metodo segun la reivindicacion 6 en el que m es 6.

8. Metodo segun la reivindicacion 1 en el que el anticuerpo molde es un fragmento de anticuerpo seleccionado de una cadena pesada, cadena ligera, dominio variable, dominio constante, region hipervariable, region determinante de la complementariedad 1 (CDR1), region determinante de la complementariedad 2 (CDR2) y region determinante de la complementariedad 3 (CDR3).

9. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de hacer evolucionar (b) comprende

h. generar n-1 conjuntos independientes de polipeptidos mutantes a partir del anticuerpo molde, comprendiendo cada conjunto polipeptidos miembros que tienen un numero X de residuos de aminoacido

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diferentes predeterminados en una posicion individual predeterminada del polipeptido; en el que cada conjunto de polipeptidos difiere en la posicion individual predeterminada; y el numero de polipeptidos miembros diferentes generados es equivalente a [n-1] x X;

y en el que la etapa de examen (c) comprende:

i. someter a ensayo cada polipeptido miembro para determinar la al menos una propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada;

j. identificar cualquier cambio en dicha propiedad, caracterlstica o actividad del polipeptido miembro en relacion con el anticuerpo molde;

k. crear un mapa funcional en el que el mapa funcional se usa para identificar posiciones y mutaciones en el polipeptido mutante que dan como resultado un mutante superior y/o una mutacion silenciosa en comparacion con el anticuerpo molde.

10. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que X es 19.

11. Metodo segun la reivindicacion 10, en el que dicha etapa de generacion comprende:

i. someter un polinucleotido que contiene codones que codifica para dicho anticuerpo molde a amplificacion basada en polimerasa usando un oligonucleotido degenerado 64 veces para cada codon que va a mutagenizarse, en el que cada uno de dichos oligonucleotidos degenerados 64 veces se compone de una primera secuencia homologa y una secuencia de triplete N,N,N degenerada, de modo que se genera un conjunto de polinucleotidos de progenie; y

ii. someter dicho conjunto de polinucleotidos de progenie a amplificacion clonal de manera que se expresan polipeptidos mutantes codificados por los polinucleotidos de progenie.

12. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la propiedad, caracterlstica o actividad predeterminada se selecciona de reduccion de la agregacion anticuerpo-protelna, potenciacion de la estabilidad de anticuerpo, aumento de la solubilidad de anticuerpo, introduction de sitios de glicosilacion, introduction de sitios de conjugation, reduccion de la inmunogenicidad, potenciacion de la expresion de protelnas, aumento de la afinidad antigenica, disminucion de la afinidad antigenica, cambio en la afinidad de union, cambio en la inmunogenicidad y potenciacion de la especificidad.

13. Metodo segun la reivindicacion 2, en el que la biblioteca de anticuerpos anti-antlgeno es una biblioteca de anticuerpos anti-antlgeno humanizados.

14. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de selection (d) comprende:

seleccionar el anticuerpo mutante superior basandose en una expresion mejorada en comparacion con el anticuerpo molde; y

en el que la etapa de expresion (e) comprende fabricar el anticuerpo mutante superior en el mismo huesped de production celular eucariota que en la etapa de hacer evolucionar (b).

15. Metodo segun la reivindicacion 1 en el que la etapa de hacer evolucionar (b) comprende una de evolution de posicion completa (CPE); evolucion de insertion de posicion completa (CPI); evolucion de deletion de posicion completa (CPD); evolucion de posicion completa (CpE) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS); evolucion de delecion de posicion completa (CPD) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS); o evolucion de delecion de posicion completa (CPD) seguida por slntesis combinatoria de protelnas (CPS).