ES2575131T3 - Inhibidores boropéptidos de enteropeptidasa y sus usos en tratamientos de obesidad, sobrepeso y/o enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de la grasa - Google Patents

Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Glu-Gly-Boro-Arg, Ala-Phe-Boro-Arg, Ac-Glu-Gly- Boro-Arg y Ac-Ala-Phe- Boro-Arg, en el que Ac es acetilo.

Description

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Inhibidores boropeptidos de enteropeptidasa y sus usos en tratamientos de obesidad, sobrepeso y/o enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de la grasa.

Descripcion

CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La presente invencion se refiere a nuevos oligopeptidos no absorbibles en base a boroanalogos de aminoacidos que incorporan una funcion protonable en su cadena lateral, tales como boroarginina, borolisina, boroornitina, y compuestos relacionados, que modulan selectivamente, regulan y/o inhibir enteropeptidasa. Estos compuestos se utilizan de forma individual, en combination o en asociacion con otros compuestos conocidos para el tratamiento de exceso de peso, la obesidad y las enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa.

ANTECEDENTES Y TECNICA ANTERIOR RELACIONADA

[0002] La obesidad es una enfermedad cronica de multiples facetas y es el problema nutricional mas frecuente en los Estados Unidos hoy en dla. La obesidad, una condition causada por un exceso de ingesta de energla en comparacion con el gasto de energla, contribuye a la patogenesis de la hipertension, diabetes no insulino dependiente mellitus de tipo II o, hipercolesterolemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, enfermedades del corazon, pancreatitis, y formas de cancer comunes, como el cancer de mama, cancer de prostata, cancer de utero y cancer de colon.

[0003] En la actualidad, solo un numero limitado de farmacos para el tratamiento de la obesidad estan disponibles comercialmente. Por desgracia, mientras que algunos de estos medicamentos pueden traer alivio a corto plazo para el paciente, aun no se ha logrado un exito del tratamiento a largo plazo. Tambien se describen metodos ejemplares de tratamiento de la obesidad en la patente de EE.UU.. N°s. 3.867.539; 4.446.138; 4.588.724; 4.745.122; 5.019.594; 5.300.298; 5.403.851; 5.567.714; 5.573.774; 5.578.613; y 5.900.411.

[0004] Uno de los farmacos actualmente disponibles para el tratamiento de la obesidad, desarrollado por Hoffman- LaRoche, es un inhibidor de la lipasa pancreatica (PL). La lipasa pancreatica es responsable de la degradation de los trigliceridos a monogliceridos. Sin embargo, se ha asociado con efectos secundarios tales como diarrea grave que resulta en la inhibition de la absorcion de una sola fraction especlfica de acidos grasos y, ha sido conocido para inducir reacciones alergicas. El tratamiento con inhibidores de la PL es por lo tanto muy desventajosa e incluso puede exponer al sujeto tratado a riesgos que amenazan la vida.

[0005] Recientemente, se ha sugerido que la absorcion de grasa se puede reducir mediante la inhibicion de la actividad de la protelna microsomal de trigliceridos de transferencia (MTP), que esta implicado en la formation y secretion de lipoprotelnas de densidad muy ligera (VLDL) y quilomicrones. Sharp et al, [Nature (1993) 365:65-69]. Y Wetterau et al, [Science (1994) 282:751-754,] demostraron que el gen de MTP es responsable de la enfermedad abetalipoproteinemia. EE.UU. N°s. 6.066.650, 6.121.283 y 6.369.075 describen composiciones que incluyen inhibidores de MTP, que tienen por objeto el tratamiento de diversas afecciones asociadas con la absorcion de la grasa excesiva. Sin embargo, los pacientes tratados con inhibidores de MTP sufren efectos secundarios importantes, incluyendo la esteatosis hepatica, que se atribuye a la actividad de MTP reducida tanto en el intestino como en el hlgado. Esto no es sorprendente, ya que las personas naturalmente deficientes para la actividad MTP desarrollaron hlgado graso [Kane y Havel (1989); Trastornos de la biogenesis y la secrecion de lipoprotelnas que contienen apolipoprotelna B. el pp 1139-1164 en: "La base metabolica de la enfermedad hereditaria" (Scrivers et al., eds). McGraw-Hill, Nueva York]. De hecho, la companla Brystol Myers Squibb, que desarrollaron inhibidores de MTP para el tratamiento de la obesidad, ha decidido recientemente abandonar este objetivo, debido a este efecto secundario de hlgado graso.

[0006] Los objetivos conocidos en la actualidad para el tratamiento de la obesidad y trastornos relacionados se pueden dividir en cuatro clases principales: (i) bloqueadores del apetito, que incluyen por ejemplo, el NPY (neuropeptido Y); (ii) estimuladores de saciedad, que incluyen, por ejemplo, el producto de la ob, genes db y aguti; (iii) agentes de quema de acido graso o de energla, que incluyen las UCP (protelnas de desacoplamiento); y (iv) inhibidores de absorcion de grasa, tales como los que actuan en PL y MTP en el intestino, se ha descrito anteriormente.

[0007] Como se ha discutido en la presente memoria, el uso de estos objetivos es muy limitado por su redundancia, su orientation multiple y/o su falta de especificidad de tejido.

[0008] Hay por lo tanto una necesidad ampliamente reconocida de, y serla altamente ventajoso tener composiciones y procedimientos para tratar la obesidad y enfermedades relacionadas y trastornos que carecen de las limitaciones anteriores.

[0009] Las proteasas de serina estan implicadas en un gran numero de procesos fisiologicos importantes. La inhibicion selectiva de una proteasa de serina dada es una de las estrategias para el tratamiento de condiciones

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patologicas asociadas con la actividad o la hiperactividad de estas proteasas de serina. A continuacion se muestra una lista no exhaustiva de los inhibidores de la proteasa de serina descritas en la literatura:

- inhibidores basados en fosforo tales como el diisopropilfosfofuloridato (DFP) (Jansen et al, (1952) Adv Enzymol 13: 321 a 343) o de analogos de difenilo de ester de fosfonato;

- proteasas de serina, tales como cetonas de trifluorometil (TFMKs) que contiene fluor;

- aldehldos basados en peptidos, cetonas clorometilo, fluorometilo, cetonas sales de dimetil sulfonio, a-ceto- acidos y amidas, esteres de a-ceto y a-ceto-aldehldos (glioxales);

- productos naturales, tales como los cicloteonamidas, derivados de la esponja marina Theonella sp japonesa.

- moleculas en base a estructura heteroclclica;

- heteorciclos y compuestos relacionados N-hidroxisuccinimida;

- isocumarinas tales como 3,4-dichloroisocoumarin;

- inhibidores basados en lactamicos p ;

- compuestos potenciados por el metal;

- Aprotinina (Trasylol®), que se utiliza para reducir el sangrado; y

- las serpinas (inhibidores de la proteasa de serina) como la antitrombina y a-1-antitripsina que tiene un papel en la coagulacion/trombosis y enfisema/A1AT, respectivamente.

[0010] El documento WO 95/09634 divulga analogos peptldicos electrofilos como inhibidores de proteasa de serinas similares a la tripsina. Los compuestos son dipeptidos en el que un derivado electrofllico de un a-aminoacido se conjuga con un a-aminoacido disustituido N-N. Los conjugados de a-aminoacido N,N desustituidos del analogo de aminoacido electrofilo son derivados de un aminoacido en el que el grupo a-amino es alquilado y acilado o diacilado para dar sustituyentes aliclclicos o clclicos.

[0011] El documento EP 0 293 881 da a conocer peptidos que comprenden derivados de acido boronico C-terminal de lisina, ornitina y arginina, homoarginina y los correspondientes analogos de isotiouronio de los mismos, que se describen como inhibidores reversibles de las proteasa de serinas similares a la tripsina, tales como trombina, calicrelna plasmatica y plasmina.

[0012] US 5 814 622 se refiere a compuestos derivados de acido boronico y a su uso como inhibidores de los inhibidores de proteasa de serinas similares a la tripsina de las proteasa de serinas. Se ha informado que los compuestos tienen diferentes e incrementados tiempos de coagulacion y la actividad a traves de la via oral.

[0013] WO 2006/050999 se refiere a un metodo para reducir la grasa corporal de un sujeto por medio de un agente capaz de regular hacia abajo la regulacion de la actividad y/o expresion de al menos uno de los componentes que participan en la digestion de protelnas y/o absorcion. Los agentes propuestos son un oligonucleotido dirigido a una secuencia de acido nucleico endogena que expresa al menos un componente que participan en dicha digestion de protelnas y/o absorcion o un inhibidor de la proteasa dirigida a al menos un componente que participa en la digestion de protelnas y/o absorcion.

[0014] Sin embargo, pocos compuestos han sido descritos como inhibidores de proteasa de serina con una inhibicion especlfica y selectiva de un objetivo unico. Por otra parte, ningun compuesto se ha descrito ni sugerido, para inhibir selectivamente y especlficamente la enteropeptidasa, y para ser utilizado en el tratamiento de la obesidad, el exceso de peso o enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa.

[0015] La enteropeptidasa es una proteasa de serina situada en la superficie de las celulas intestinales epiteliales (enterocitos) (Lancet 1969 19 de abril; 1 (7599): 812-3; Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003 Dec; 285 (6): G1235-41; Proc Soc Exp Biol Med 1994 Jun; 206 (2):. 114-8; Ciba Found Symp. 1979 Jan 16-18; (70): 169-87; Lancet 1982 Aug 28; 2(8296):504). El sustrato de la enteropeptidasa es tripsinogeno, un precursor de la tripsina. Enteropeptidasa convierte tripsinogeno en una molecula de tripsina. A su vez, la tripsina, que tambien es una proteasa de serina, convierte los precursores de una serie de enzimas digestivas, tales como procarboxipeptidasas A y B, quimotripsinogeno, prolipase de pancreas y pro-elastasa, en las formas activas de las enzimas (carboxipeptidasas A y B , quimotripsina, lipasa pancreatica y de la elastasa). Se requieren las ultimas formas activas de tales enzimas digestivas para el procesamiento y la absorcion final de protelna y materia grasa en el tracto gastrointestinal (GI).

[0016] Debido a que la enteropeptidasa se encuentra en la luz intestinal, la inhibicion de esta enzima requiere que los compuestos inhiben selectivamente enteropeptidasa sin interferir con que circulan las proteasas de serinas, tales como trombina y calicrelna.

[0017] Por lo tanto, hay una necesidad de compuestos para tratar la obesidad, el exceso de sobrepeso, as! como enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa, sobre una base a largo plazo que tiene un objetivo especlfico.

[0018] Es un objeto de la presente invencion proporcionar compuestos que inhiben la enteropeptidasa, y mas en

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particular que inhiben selectivamente enteropeptidasa. En particular, estos compuestos no son absorbibles, es decir, que no pasan desde el intestino a la sangre.

[0019] Es otro objeto de la presente invencion proporcionar compuestos que son derivados de boroanalogs de aminoacidos que incorporan una funcionalidad protonable en su cadena lateral, tales como borolisina, boroornitina y boroarginina, y son inhibidores fuertes, no absorbibles de enteropeptidasa.

[0020] Aun otro objeto de la invencion, son composiciones, especialmente composiciones farmaceuticas, que comprenden al menos uno de los compuestos descritos en la presente invencion.

[0021] Aun otro objeto de la presente invencion es el uso de al menos uno de los compuestos o de la composicion segun la invencion, para el tratamiento de la obesidad, el exceso de peso y las enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa. Un compuesto o una composicion de la invencion para uso en el tratamiento de la obesidad, el exceso de peso y enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa, tambien se proporciona.

[0022] Estos y otros objetos se consiguen por la presente invencion como se demuestra en el resumen de la invencion, la descripcion de las formas de realizacion preferidas y las reclamaciones.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0023] En un aspecto, la invencion se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Glu-Gly-Arg- Boro, Ala-Phe-Arg-Boro, Ac-Glu-Gly-Arg-Boro y Ac-Ala-Phe-Arg-Boro, donde Ac es acetilo.

[0024] En algunas realizaciones, boroarginina (Boro-Arg) resto comprende un grupo de la formula

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[0025] De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

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[0026] Los compuestos de acuerdo con la presente invencion inhiben la actividad enzimatica de enteropeptidasa. Preferiblemente, estos compuestos inhiben selectivamente la actividad enzimatica de la enteropeptidasa sobre otras proteasa de serinas. En alguna realizacion, los compuestos son no absorbible.

[0027] Los compuestos de la invencion se pueden proporcionar en forma de base libre o como una sal farmaceuticamente aceptable.

[0028] En otro aspecto, la invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos un compuesto como se describe anteriormente, y al menos un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

[0029] En otro aspecto, la invencion se refiere a un compuesto de acuerdo con la presente invencion, o una composicion que comprende dicho compuesto, para uso en el tratamiento de la obesidad en un mamffero, preferiblemente un ser humano.

[0030] En otro aspecto, la invencion se refiere a un compuesto de acuerdo con la presente invencion, o una composicion que comprende dicho compuesto, para uso en el tratamiento del exceso de peso en un mamffero, preferiblemente un ser humano.

[0031] En otro aspecto, la invencion se refiere a un compuesto de acuerdo con la presente invencion, o una composicion que comprende dicho compuesto, para su uso en el tratamiento, en un mamffero, preferiblemente un ser humano, de las enfermedades asociadas con el metabolismo anormal de la grasa, en el que dicha enfermedad

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metabolismo de la grasa se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedad gota, diabetes tipo II, la hiperglucemia, hiperinsulinemia, niveles elevados en sangre de acidos grasos o glicerol, slndrome X, complicaciones diabeticas, slndrome dismetabolico y enfermedades relacionadas, la hipercolesterolemia, aterosclerosis, hipertension, pancreatitis, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, accidente cerebrovascular, enfermedades coronarias del corazon, enfermedades vasculares perifericas, enfermedades arteriales perifericas, slndromes vasculares, trastornos relacionados con el colesterol y la lipodistrofia inducida por el farmaco.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

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de la enteropeptidasa de acuerdo con concentraciones

actividad

de la enteropeptidasa de acuerdo con concentraciones

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de la enteropeptidasa de acuerdo con concentraciones

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de la enteropeptidasa de acuerdo con concentraciones

Fig 1 es un grafico que muestra la crecientes de compuesto OBE 1999.

Fig 2 es un grafico que muestra la crecientes de compuesto OBE 2000.

Fig 3 es un grafico que muestra la crecientes de compuesto OBE 2001.

Fig 4 es un grafico que muestra la crecientes de compuesto OBE 2002.

Fig 5 es una tabla que muestra la IC50 (en nM) de enteropeptidasa, diversas proteasas de serina y otras familias de enzimas, en presencia de compuestos OBE 1999, OBE 2000, OBE 2001 o OBE 2002.

Fig 6 son las secuencias de nucleotidos y de protelnas de la enteropeptidasa humana (PRSS7). La primera llnea indica la secuencia de nucleotidos, agrupados por codones; la segunda llnea indica la secuencia de aminoacidos que corresponde a los codones anteriores con el codigo de tres letras. El primer codon de traduccion y el codon de parada estan en negrita. Numeracion del acido nucleico esta en el extremo derecho de la primera llnea, y la numeracion de los aminoacidos se indica bajo residuo de aminoacido (tercera llnea). Fig 7 representa ejemplos de procesos para sintetizar los compuestos de la invencion. (A): ejemplo de un procedimiento para la slntesis de la Acetil-Ala-Phe-BoroLisina (*pin: Grupo pinandiol); (B y Cv): primer ejemplo de un procedimiento para la slntesis de la Acetil-Ala-Phe-Boroarginina; (D): segundo ejemplo de un proceso para la slntesis de la Acetil-Ala-Phe-Boroarginina; este segundo proceso tambien permite la slntesis de la Acetil-Ala-Phe-BoroOrnitina (compuesto 8), ya que Acetil-Ala-Phe-BoroOrnithina es un compuesto intermedio en la slntesis de acetil-Ala-Phe-Boroarginina por este proceso; (E): la slntesis del grupo Acetil- Ala-Phe-OH, que se inserta en el paso 10 del proceso en la figura 7C o en el paso 7 del proceso en la figura 7D.

Fig 8 es un grafico que ilustra el seguimiento en dla del peso (en gramos) de los ratones que han recibido agua (vehlculo) en comparacion con los ratones que han recibido OBE2001 a una concentracion de 40 mg/kg/dla (B).

Fig 9 es un grafico que ilustra el seguimiento en minutos de los trigliceridos presentes en el plasma de

ratones que tienen agua recibida (disolvente), una dosis de OBE2001 (OBE 25 mg/kg) o dos dosis de

OBE2001 (OBE 25 + 25 mg/kg ).

Fig 10 es un grafico que ilustra el seguimiento de las horas de las protelnas marcadas en el plasma de

ratones que tienen agua recibida (disolvente), una dosis de OBE2001 (OBE 5 mg/kg) o dos dosis de

OBE2001 (OBE 50 mg/kg).

Fig 11 es una representacion esquematica del proceso utilizado para obtener un alelo constitutiva knockout enteropeptidasa (KO) en ratones, usando la delecion de los exones 23-28 del gen Prss7.

Fig 12 es una representacion esquematica de un vector que comprende el alelo de knockout de enteropeptidasa constitutiva (KO), as! como la secuencia de nucleotidos 17480 pb de este vector.

Fig 13 es el mapa de restriccion AflII del alelo de enteropeptidasa de tipo silvestre (arriba) y el knockout (KO) alelo enteropeptidasa (abajo).

Fig 14 es una Southern Blot con ADN genomico obtenido a partir de celulas madre embrionarias (ES) exitosamente transformadas con la enteropeptidasa KO alelo (A-D2 y A-E8) y se obtuvo con el ADN genomico de las celulas transformadas no (WT).

Fig 15 es una blot en la que los fragmentos de PCR se han ejecutado, a partir de una amplificacion simultanea con cebadores 1260_1 y 1260_2, y 1472_23 y 1472_24. El ADN genomico se ha extraldo de ratones heterologos (115695, 115702, 115706, 115707 y 115708) o ratones de tipo silvestre (115696 o 115705). 585bp (c): fragmentos de control; 412 pb (conv): alelo KO.

Fig 16 es una mancha en la que los fragmentos de PCR, obtenidos a partir de una amplificacion simultanea con el cebador 1472_23 y el cebador PRRS7 WT, y cebadores actina beta hacia adelante y beta actina hacia atras, se han ejecutado. El ADN genomico se ha extraldo de ratones heterologos (115755 y 115648) o cachorros KO homologos (1A, 2A, 3A, 4A y 5A); 533bp (c): WT alelo de enteropeptidasa; 300 pb: alelo de control (actina).

Fig 17 es una fotografla que muestra un raton homocigoto para el alelo de enteropeptidasa KO (Ho) y un raton heterocigoto para el alelo de enteropeptidasa KO (He), ambos de 7 dlas de edad.

Fig 18 es la secuencia de nucleotidos y protelnas de tripsina humana

DESCRIPCION DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS DE LA INVENCION

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[0033] La expresion "sal farmaceuticamente aceptable" significa una sal de acido o una sal basica que es adecuada o compatible con el tratamiento de la materia.

[0034] Por "inhibition de la actividad de la enteropeptidasa", se entiende que se obtiene una disminucion del 50% de la actividad in vitro de la enteropeptidasa, con una concentration del compuesto de la invention que es de menos de 10 pM, menos de 1 pM, a menos de 100 nM, menos de 10 nM o menos de 1 nM, para 1 nM de enteropeptidasa. Dicha concentracion se puede determinar como se describe en detalle en el punto 2.1. a continuation, y en particular el uso de Np tosilo Gly Pro Arg pNa como sustrato.

[0035] La expresion "inhibicion especlfica de la proteasa de tipo tripsina serina" se refiere a la inhibicion de las proteasas de la familia de proteasa de serina y mas particularmente a proteasa de serina de solo el subtipo de tipo tripsina. Por el contrario, la actividad de otras proteasas tales como peptidasas de cistelna, peptidasas aspartato, metalo-proteasas, lipasas y/o glucosidasas no se alteran por el compuesto de la invencion. En otra forma de realization, en combination con la anterior, la actividad de proteasa de serinas de tipo quimotripsina no se altera por el compuesto de la invencion.

[0036] La expresion "inhibicion selectiva de la enteropeptidasa" se refiere a la inhibicion de la enteropeptidasa solamente (in vivo), mientras que la actividad de otras proteasas de la misma subtipo (subtipo de tipo tripsina) no resultan modificadas por los compuestos de la invencion. Esta distincion entre la especificidad y la selectividad se ha hecho posible por el hecho de que los compuestos de la invencion son no absorbibles y por lo tanto la inhibicion se limita a la enteropeptidasa cuya ubicacion es intestinal.

[0037] La determination de la IC50 de los compuestos de la invencion sobre enteropeptidasa o en otra proteasa de serina se puede ensayar in vitro como se describe en los ejemplos a continuacion.

[0038] El termino "tratamiento" tal como se utiliza aqul, se refiere no solo a la perdida de peso del mamlfero despues de la administration de al menos un compuesto o la composition de la invencion, sino tambien para el mantenimiento del peso tal que hay un aumento de peso.

[0039] El termino "mamlfero" abarca cualquiera de los diversos animales de sangre caliente de vertebrados de la clase de los mamlferos, incluidos los humanos, caracterizados por una cubierta de pelo en la piel y, en las mujeres, las glandulas mamarias productoras de leche para alimentar a las crlas.

[0040] "Farmaceuticamente vehlculos o portadores aceptables" abarca cualquier sustancia que permite la formulation de los compuestos de la invencion dentro de una composicion. Un vehlculo es cualquier sustancia o combinacion de sustancias fisiologica logicamente aceptable es decir, apropiado para su uso en una composicion en contacto con un mamlfero, y por lo tanto no toxico. Ejemplos de tales vehlculos son soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua destilada, emulsiones tales como emulsiones aceite/agua y diversos tipos de soluciones esteriles de agentes humectantes.

[0041] "Obesidad", en general, se define en humano por lo menos 20% en el peso medio para la edad de la persona, el sexo y altura. La obesidad se define por un Indice de masa corporal (iMC = kg/m2) superior a 30. La obesidad tambien puede definirse por la circunferencia de la cintura absoluta (> 102 cm en hombres y > 88 cm en mujeres) o la relation cintura-cadera (WHR-) (RHO mas de 0,7 para las mujeres y mas de 0,9 para los hombres). "El exceso de peso" se define por un Indice de masa corporal que esta comprendida entre 25 y 29,9.

[0042] Mas especlficamente, en una primera realizacion, la presente invencion se refiere a compuestos que tienen una actividad inhibidora sobre la actividad enzimatica de enteropeptidasa. En otro aspecto, se proporcionan los compuestos siempre que tengan una actividad inhibidora selectiva de la actividad enzimatica de enteropeptidasa.

[0043] Los compuestos de la invencion se seleccionan del grupo que consiste en Glu-Gly-Arg-Boro, Ala-Phe-Boro- Arg, Ac-Glu-Gly- Boro-Arg y Ac-Ala-Phe- Boro-Arg, en el que Ac es acetilo.

[0044] En algunas realizaciones, boroArginina (Boro-Arg) resto comprende un grupo de la formula:

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[0045] De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

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[0046] Todos los compuestos de la invencion descritos en la presente solicitud estan bajo una forma de base libre o son sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.

[0047] Los compuestos de la invencion no son por lo menos uno de los siguientes:

- Ac-(D,L)Phe-boroArg-Ci0Hi6.BSA (acido sulfonico de benzeno), Ac-Phe-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Ac-Phe

boroArg-Ci0Hi6.HCl, H-(D)Phe-Pro-borolrg-Ci0Hi6.HBr.HCl, Boc-(D)Phe-Pro-borolrg-Ci0Hi6. HBr, Ac-Phe- borolrg-Ci0Hi6.HBr, Ac-Ala-Lys (Boc)-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Ac-Ala-Lys (Boc)-borolrg-Ci0Hi6.HBr, Boc- (D)Phe-Pro-boro-Arg-Ci0Hi6.BSA, Boc-(D)Phe-Phe-Borolrg-Ci0Hi6.HBr, H-(D)Phe-Pro-boroArg-Ci0Hi6.HCl, Boc-(D)Phe-Phe-boroOrn-Ci0Hi6. BSA, Boc-(D)Phe-Phe-boroArg-Ci0Hi6.BsA, Ac-Ala-Lys (Boc)-boroArg- Ci0Hi6.BSA, Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-Ci0Hi6.HCl, Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH.HCl, Boc-Leu-Gly-Leu-Ala- borolrg-Ci0Hi6.HBr, Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Boc-Leu-Gly- Leu-Ala-boroArg-Ci0Hi6.BSA, Bz-Pro-Phe-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Bz-Phe-Pro-boroArg-Ci0Hi6. BSA, Boc-Ala-Phe (D, L) borolrg- Ci0Hi2.HBr, Bz-Glu (OBu) Gly-borolrg-Ci0Hi6.HBr, Bz-Glu-Gly-boroArg-Ci0Hi6.BSA, Bz-Glu(OBu)Gly- boroOrg-Ci0Hi6.BSA, Bz-Glu (OBu) Gly-boroArg-Ci0Hi6.BSA, Bz-Pro-Phe-borolrg-Ci0Hi6.HBr, Z-Phe-Gly- Gly-borolrg-Ci0Hi6. HBr, Boc-Ala-Phe (D, L) borohomol-rg-Ci0Hi2.HBr, Bz-Pro-Phe-boroArg-OH.HCl, Bz- Pro-Phe-boroArg-F, H-(D)Phe- Pro-boroArg-Ci0Hi6.2HCl, H-(D)Phe-Phe-boroArg-Ci0Hi6.2HCl, Ac-Ala-Lys- boroArg-Ci0Hi6.2HCl, H-Leu-Gly-Leu-Ala-boroArg-Ci0Hi6.HCl.bsa, Boc-Ala-Phe(D,L)boroLys-Ci0Hi2.HCl, H- Ala-Phe- (D, L) boroLys-Ci0Hi2.2HCl, Boc-(D) Val-Leu-boroLys Ci0Hi2. HCl, Ac-Phe-boroLys-Ci0Hi2.HCl, Bz-Glu-Gly-boroArg-Ci0Hi6.BSA, H- (D)Phe-Phe-borolrg-Ci0Hi6.2HBr, H-Leu-Gly-Leu-Ala-borolrg -

Ci0Hi6.2HBr, H-Ala-Phe- (D, L) borolrg-Ci0Hi2.2HBr, Bz-Glu-Gly-borolrg-Ci0Hi6.HBr, H-Ala-Phe- (D, L) boroHomolrg-Ci0Hi2.2HBr , Ac-Ala-Lys-borolrg-Ci0Hi6.2HBr, Bz-borolrg-Ci0Hi2.HBr, Bz-boroOrn-

Ci0Hi2.BSA, Bz-boroArg-Ci0Hi2.BSA, Ac-Leu-Thr (OBu)-boroOrn-Ci0Hi6. BSA, Ac-Leu Thr (OBu) boroArg- Ci0Hi6.BSA, Ac-Leu-Thr-boroArg-Ci0Hi6.BSA, Ac-Lys (Boc) -Pro-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Ac- Lys (Boc) - Pro- boroArg-Ci0Hi6.BSA, Ac-Lys-Pro-boroArg-Ci0Hi6. BSA, Ac-Ala-Glu (OBu)-boroOrn-Ci0Hi6.BSA, Ac-Ala-Glu (OBu)-boroArg-Ci0Hi6.BSA, Ac-Ala-Glu-boroArg-Ci0Hi6. BSA, Boc-Val-Val-boroLys-Ci0Hi2.BSA, H- Val-Va]- boroLys-Ci0Hi2.BSA.TFA, Boc-(D)Phe-Phe-boroLys-Ci0Hi2.BSA, H-(D)Phe-Phe-boroLys-Ci0Hi2.BSA.TFA, Boc-Glu-Phe-boroLys-Ci0Hi2.BSA y piroGlu-Phe-boroLys-Ci0Hi2.BSA, se describe en US 5.i87.i57;

- Ac-boroArg-OH.HCl, da a conocer en Lebarbier et al.; letras (i998) Biorganic y Medicial Qulmica 8: 25732576;

- Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH, se describe en la Quan et al .; (i997) letras Biorganic y Medicial Qulmica 7 (i3):

- i595-i600;

- Ac-Ala-Lys-boroArg-OH2, descrito en Holyoak et al. (2003); Bioqulmica 42: 6709-67i8.

- Pro-Phe-OH-boroArg, da a conocer en Stadnicki et al. (i998); El FASEB Journal i2: 325-333.

- Bz-Nle-Lys-Lys-boroArg-OH2, da a conocer en Yien et al. (2006); Biorganic letras y Medicial Chemistry i6:36-39.

- H-Phe-Pro-boroArg, descrito en Kettner et al. (i990); El Journal of Biological Chemistry 265 (30): i8289- i8297.

- Pinanodiol Ac-Arg-Glu-Lys-boroArg, descrito en Komiyama et al. (2005); Agentes Antimicrobianos y Quimioterapia 49 (9): 3875 a 3882.

- (BOC) Ala-Val-Lys-boronato, descrito en Katz et al. (i995); Biochemistry 34: 8264-8280.

[0048] Las moleculas de la invencion se sintetizan usando procedimientos bien conocidos. A modo de ejemplo, la figura 7 da a conocer diversos procedimientos para sintetizar cualquier compuesto de la presente invencion. Los ejemplos descritos se refieren a la slntesis de un tripeptido borolisina (7A), un tripeptido de bororarginina y un tripeptido de boroornitina (7B a 7E). Estos ejemplos pueden aplicarse facilmente a la slntesis de otros compuestos descritos en el presente documento. Especialmente, la persona experta en la tecnica puede sustituir a la naturaleza y el numero de residuos de aminoacidos para ligarse a la boroArginina, borolisina o resto de boroornitina.

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[0049] Ademas de su caracterlstica estructural, los compuestos de la invencion tienen la capacidad de inhibir especlficamente la actividad de las proteasas de serina y especialmente la actividad de proteasas de serina subtipo de tipo tripsina. En otra realizacion, los compuestos de la invencion, y especialmente el tri o tetraboropeptides, tienen la capacidad de inhibir selectivamente la actividad de enteropeptidasa, enteropeptidases especialmente de mamlfero, y mas especialmente enteropeptidasa de humanos. La secuencia de la enteropeptidasa humana se divulga en la figura 6.

[0050] Tambien se proporciona una composicion que comprende uno o mas de un compuesto de la invencion, en especial 2, 3 o 4 compuestos.

[0051] Tal composicion puede tomar la forma de una composicion farmaceutica que se puede formular utilizando portadores farmaceuticamente ceutica aceptables bien conocidos en la tecnica, en dosis adecuadas.

[0052] En una realizacion particular, la composicion comprende ademas un excipiente farmaceuticamente adecuado o portador y/o vehlculo, cuando se utiliza para la administracion enteral o oral.

[0053] Tales portadores permiten que las composiciones farmaceuticas se formulen como comprimidos, plldoras, grageas, capsulas, llquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones.

[0054] Preparaciones farmacologicas para el uso oral se pueden hacer usando un excipiente solido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante y procesando la mezcla de granulos, despues de anadir auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o nucleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, malz, trigo, arroz o almidon de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil lulosa bracion, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; pollmeros y/o fisiologicamente aceptables, tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden anadirse agentes disgregantes, tales como pirrolidona de polivinilo reticulada, agar, o acido alglnico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

[0055] Los nucleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este proposito, las soluciones de azucar concentradas pueden usarse, que pueden contener opcionalmente goma arabe, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, dioxido de titanio, soluciones de laca y disolventes organicos o mezclas de disolventes adecuados. Colorantes o pigmentos pueden anadirse a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificacion o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.

[0056] Las composiciones farmaceuticas, que pueden usarse por via oral, incluyen capsulas de ajuste suave hechas de gelatina, as! como capsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las capsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos mezclados con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las capsulas blandas, los ingredientes activos pueden estar disueltos o suspendidos en llquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina llquida, o polietilenglicoles llquidos. Ademas, se pueden anadir estabilizantes. Todas las formulaciones para administracion oral deben estar en dosis adecuadas para la ruta de administracion elegida.

[0057] Para la administracion bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

[0058] Ademas de los ingredientes activos, estas composiciones farmaceuticas pueden tambien contener portadores farmaceuticamente adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmaceuticamente. Para mas detalles sobre las tecnicas para la formulacion y administracion pueden encontrarse en la ultima edicion de Remington Pharmaceutical Sciences (Maack Pubiishing Co., Easton, Pa.).

[0059] Los compuestos de la presente invencion se pueden administrar en combination con al menos otro farmaco, para conseguir efectos mejorados, por ejemplo, con otros farmacos que se dirigen las enzimas diferentes de la enteropeptidasa. Como ejemplo, los compuestos de la invencion se pueden combinar con el farmaco capaz de inhibir la adsorcion o el metabolismo de los trigliceridos.

[0060] La presente invencion se refiere al uso de cualquier compuesto como se define anteriormente, para el tratamiento de la obesidad, el exceso de peso y enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa. Por lo tanto, los compuestos de la invencion se pueden usar en el tratamiento de la obesidad, el exceso de peso y/o enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa, as! como para la fabrication de un medicamento para tratar la obesidad, el exceso de peso y/o enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de la grasa.

[0061] se proporciona un metodo para tratar un mamlfero que tiene obesidad, exceso de peso y/o que sufren de enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa, que comprende la administracion de al menos un compuesto o una composicion de la invencion a un mamlfero en necesidad del mismo.

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[0062] Cualquier compuesto de la invencion se puede utilizar para disminuir la absorcion in vivo de las protelnas. En otra realizacion, cualquier compuesto de la invencion puede utilizarse para disminuir la absorcion in vivo de los trigliceridos. En una realizacion adicional, cualquier compuesto de la invencion puede utilizarse para disminuir la absorcion in vivo de las protelnas y la absorcion in vivo de los trigliceridos.

[0063] En un aspecto adicional, independientemente o en combinacion con el uso de los compuestos de la invencion en la disminucion de absorcion, cualquier compuesto de la invencion se pueden usar para disminuir la ingesta de alimentos, es decir; para disminuir el apetito (bloqueador de apetito).

[0064] El compuesto o la composicion de la invencion se puede usar en dosis que van de 10 mg a 10 g por dla, o de 100 mg a 1 g por dla, una o varias veces al dla. La cantidad de compuesto o de la composicion de la presente invencion se puede administrar en dosis de acuerdo con la gravedad de la obesidad, la cantidad de exceso de peso, la edad del mamlfero y/o la salud general del mamlfero.

[0065] Los compuestos o composiciones de la invencion son adecuados para el tratamiento de diversas formas de obesidad y, en particular la obesidad resultante de causas ambientales (ingesta excesiva de nutrientes y/o un estilo de vida sedentario), como resultado de alteraciones geneticas (tales como gen FTO), resultando de una enfermedad medica (tales como hipotiroidismo, slndrome de Cushing, deficiencia de la hormona del crecimiento), como resultado de dejar de fumar, como resultado de medicamentos (como esteroides, antipsicoticos atlpicos o alguna medicacion para la fertilidad), y como resultado de trastornos neurologicos.

[0066] Tambien se contempla el tratamiento por al menos uno de los compuestos o por las composiciones de la invencion de enfermedades asociadas con un metabolismo anormal de grasa. Tales enfermedades son las siguientes: la enfermedad de gota (artritis metabolica), diabetes tipo II, la hiperglucemia, hiperinsulinemia, niveles elevados en sangre de acidos grasos o glicerol, slndrome X, complicaciones diabeticas, slndrome dismetabolico y enfermedades relacionadas, la hipercolesterolemia, la aterosclerosis, la hipertension, pancreatitis creatitis, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, accidente cerebrovascular, enfermedades coronarias del corazon, enfermedades vasculares perifericas, enfermedades arteriales perifericas, slndromes vasculares, trastornos relacionados con el colesterol (por ejemplo, LDL-patron B y LDL-patron L) y la lipodistrofia inducida por farmacos.

[0067] Tambien se proporciona un modelo animal en el que el gen de enteropeptidasa ha sido inactivado. Este modelo comprende un modelo de mamlfero (no humano) o un modelo murino (por ejemplo, un raton). Por "inactivado", se quiere decir que un gen de enteropeptidasa incorporado de este modelo codifica una protelna que tiene actividad de enteropeptidasa menos de 50% en comparacion con la enteropeptidasa de tipo silvestre. En una realizacion, la enteropeptidasa inactivada tiene menos de 40% de actividad de enteropeptidasa en comparacion con la enteropeptidasa de tipo silvestre. En otra realizacion, la enteropeptidasa del modelo animal con menos de 30% de actividad de enteropeptidasa en comparacion con la enteropeptidasa de tipo silvestre. En aun otra realizacion, la enteropeptidasa del modelo animal con menos de 20% o menos de 10% de actividad de enteropeptidasa en comparacion con la enteropeptidasa de tipo silvestre. En aun otra realizacion, la enteropeptidasa inactivada no tiene actividad peptidasa en absoluto. En otro aspecto, el porcentaje de actividad de enteropeptidasa se define de acuerdo a la conversion de tripsinogeno en tripsina.

[0068] El modelo de animal que tiene un gen de enteropeptidasa inactivado se puede obtener por cualquiera de las tecnicas convencionales conocidas por el experto en la tecnica para obtener un modelo animal knockout (KO), tal como mediante la insercion de una o mas sustituciones de aminoacido que afecta la actividad peptidasa de la enteropeptidasa o mediante la supresion de uno o varios exones del gen de enteropeptidasa. Cuando el modelo animal es un roedor, tal como un raton, las mutaciones pueden ser, por ejemplo, una delecion de los exones 23-28 del gen prss7 es decir, el homologo murino de enteropeptidasa humana.

[0069] Tambien se proporciona el uso de este modelo animal en el desarrollo de farmacos, por ejemplo, en la selection de farmacos o moleculas que tienen efectos sobre el peso. Por lo tanto, el modelo se puede utilizar en un proceso para determinar el efecto de un farmaco o una molecula en el peso que comprende (a) la administration de un farmaco para el modelo y (b) medir el peso del animal. El efecto de la droga se determina comparando el peso del animal administrado con dicho farmaco con los animales de control (que se administran con moleculas conocidas o con un placebo).

[0070] La expresion "efecto sobre el peso" significa que el farmaco o la molecula es capaz de aumentar el peso del modelo animal en comparacion con un placebo, o, por el contrario, para disminuir el peso del modelo animal en comparacion con un placebo. El efecto de la molecula se puede observar bajo un regimen calorico bajo, normal o alto.

[0071] La administracion del medicamento o la molecula para el modelo animal puede llevarse a cabo por via oral por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial o mediante sistemas de liberation sostenida.

EJEMPLOS

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A. Los experimentos in vitro

1. Materiales

1.1. Amortiguacion:

[0072]

- TN: Tris 50 mM pH = 7,5 NaCI 150 mM (Tris: Euromedex Ref 26-128-3097; NaCI: Euromedex Ref 1112);

- TCN: Tris 50 mM pH = 7,5 NaCl 150 mM CaCl2 10 mM;

- TCNB: Tris 50 mM pH = 7,5 NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, 0,05% de Brij 35 (Brij: sigma Ref B4184);

- Tris 25 mM pH 8;

- Amortiguacion pancreatica de lipasa: 25 mM Tris pH 9,2 - 0,1 mM CaCl2 - 20 mM sodio;

- Desoxicolato;

- Termolisina (Sigma, ref T7902);

- Sal disodica de fosforamidon (Sigma, ref R7385);

- Acido acetico (Sigma ref A0808)

1.2. Placas

[0073]

- Microplacas 384 pequeno volumen, clara (Greiner, ref 784101)

- Microplacas 384 negro de fondo plano (Corning, ref 3573)

- Placa 96 Nunc negro (VWR, ref 13.634,01)

- Placa 96 - 1/2 area (Corning, Ref 3695)

- Microplacas de 96 pocillos 800 pl unifiltro (Whatman, Ref 7700-1804)

1.3. Compuestos

[0074] La Tabla I siguiente enumera cuatro compuestos de la invencion (triboropeptides) y sus nombres.

Tabla I

Nombre

Compuesto/composicion Proteccion

Obe 1999

Ala-Phe-BoroArg 10 mM DMSO No

Obe 2000

Glu-Gly-BoroArg 10 mM DMSO No

Obe 2001

Acetilo-Ala-Phe-BoroArg 10 mM DMSO Si (acetilo en el primer Ala)

Obe 2002

Acetilo-Glu-Gly-BoroArg 10 mM DMSO Si (acetilo en el primer Glu)

1.4. Enzimas:

[0075] La Tabla II siguiente muestra las enzimas ensayadas para la inhibicion por los compuestos de la invencion, as! como los proveedores y las referencias comerciales asociadas.

Tabla II

Enzima

Proveedor, referencia

Enteropeptidasa humana recombinante

Sistema de RD, ref 1585SE

Tripsina de pancreas humano

SIGMA, ref T6424

Trombina de plasma humano

SIGMA, ref T1063

Calicrelna del plasma humano

SIGMA, ref K2638

Plasmina de plasma humano

SIGMA, ref P1867

Elastasa

C albiochem, ref 324682

Quimotri psina

Sigma, C8946 ref

DPP-IV (peptidasa de dipeptidil IV)

Sistema de RD, ref 1180-SE

Carboxipeptidasa recombinante humana A1

Sistema de RD, ref 2856-ZN

Carboxipeptidasa recombinante humana B1

Sistema de RD, ref 2897-ZN

Amilasa alfa de pancreas humano

Sigma, ref A9972

Lipasa

Sigma, ref L0382

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1.5. Sustratos:

[0076] La Tabla III a continuacion enumera los sustratos usados para el ensayo de la inhibicion de las enzimas anteriores por los compuestos de la invencion, asi como los proveedores y las referencias comerciales asociadas.

Tabla III

Sustrato

Proveedor, referencia Enzima correspondiente

N-p-T osil-Gly-Pro-Arg-pNA

SIGMA, ref T1637 Enteropeptidasa, tripsina y trombina

H-D-Pro-Phe-Arg-pNA

Chromogenix, ref S-2302 Calicreina

D-Ile-Phe-Lys-pNa

SIGMA, ref I6886 Plasmina

N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA

Sigma, ref S7388 Quimotripsina

Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA

Calbiochem, ref 324699 Elastasa

Ala-Pro-7-amido-4- trifluorometilcumarina

Calbiochem, ref 125510 DPPIV

N-(4-Metoxifenilazoformilo)Phe- OH sal de potasio

Bachem, ref M2245 Carboxipeptidasa A1

N-(4-Metoxifenilazoformilo)-Arg- OH HCl

Bachem, ref M2525 Carboxipeptidasa B1

6,8-difluoro-metilumbeliferil octanoato (DIFMu)

InVitrogen, ref D12200 Lipasa

Almidon Azul

Sigma, ref S7629 Alfa-amilasa

2. Protocolos

2.1. Ensayo de enteropeptidasa

- Activacion de la enteropeptidasa

[0077] Una mezcla de enteropeptidasa en 58.8nM (final) y termolisina en 1,58 ng/l (final) en tampon TCN se preparo; la mezcla se incubo a 37°C durante 30 minutos para la activacion. Se anadio fosforamidon (10 pM final) para detener la activacion por termolisina.

- Medicion de la actividad de enteropeptidasa sin inhibidor (control positivo)

[0078] En 17 pl de TCN, 1 pl de enzima activa (2,9 nm final) y 2 pl Np Tosyl Gly Pro Arg pNA (1 mM final) se

mezclaron, justo antes de la lectura. La absorbancia se midio a 405 nm en EnVision (Perkin Elmer).

- Inhibicion de placa de 384 pocillos pequeno volumen (20 pl final)

[0079] En 15 pl de TCN, 1 pl de enzima activa y 2 p l de inhibidor (compuesto de la invencion) a diferentes

concentraciones se mezclaron, y se incubaron a RT (temperatura ambiente) durante 30 minutos; Se anadio 2 p l Np Tosyl Gly Pro Arg PNA (1 mM final) justo antes de la lectura. La absorbancia se midio a 405 nm en EnVision (Perkin Elmer).

2.2. Trombina, tripsina, calicreina, plasmina, quimotripsina y ensayo de elastasa

[0080] La Tabla IV siguiente muestra las concentraciones finales de las enzimas ensayadas y los correspondientes sustratos, en la determination de la IC50 sin inhibidor (control positivo) y en los protocolos de inhibicion:

Tabla IV

Enzima

Sustrato

Tripsina 10 nM

N-p-tosil-Gly-Pro-Arg-pNA 1 mM

Trombina 10 nM

N-p-tosil-Gly-Pro-Arg-PNA 0,75 mM

Plasmina 50 nM

D-Ile-Phe-Lys-pNa 1 mM

Calicreina 10 nM

H-D-Pro-Phe-Arg-pNA 1 mM

Quimotripsina 50 nM

N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 0,5 mM

Elastasa 25 nM

Suc-Ala-Ala-Pro-Abu-pNA 0,5 mM

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Medicion sin inhibidor (control positivo)

[0081] En 17 |jl de TN, 1 ml de enzima y 2 |jl de sustrato se mezclo, justo antes de la lectura; La absorbancia se midio a 405 nm en EnVision (Perkin Elmer).

- Inhibicion de placa de 384 pocillos peaueno volumen (20 ul final)

[0082] En 15 jl de TN, 1 ml de enzima y 2 jl de inhibidor (compuesto de la invencion) a diferentes concentraciones se mezclaron y se incubaron a RT durante 30 minutos; Se anadio 2 jl de sustrato, justo antes de la lectura; La absorbancia se midio a 405 nm en EnVision (Perkin Elmer).

2.3 Ensayo de carboxipeptidasa A1 y B1

- Activation de la carboxipeptidasa A1

[0083] En 20 jl de TCNB, carboxipeptidasa A1 (100 jg/ml final) y tripsina (1 jg/ml final) se mezclaron y se incubaron a RT durante 2 horas.

- Activacion de la carboxipeptidasa B1

[0084] En 20 jl de TCNB, carboxipeptidasa B1 (100 jg/ml final) y tripsina (1 jg/ml final) se mezclaron y se incubaron a RT durante 1 hora.

[0085] La Tabla V a continuation se enumeran las concentraciones finales de las enzimas ensayadas y el sustrato correspondiente, en la determination de la IC50 sin inhibidor (control positivo) y en los protocolos de inhibition:

Tabla V

Enzima

Sustrato

Carboxipeptidasa A1, 20 nM

N-(4 - Matoxifenilazoformilo)-Phe-OH, sal de potasio 100 jM

Carboxipeptidasa B1, 20 nM

N-(4 - Matoxifenilazoformilo)-Arg-OH, HCl 100 jM

- Medicion sin inhibidor (control positivo)

[0086] En 17 jl de TN, 1 jl de enzima activada y 2 jl sustrato se mezclaron, justo antes de la lectura; La absorbancia se midio a 355 nm en EnVision (Perkin Elmer).

- Inhibicion de placa de 384 pocillos peaueno volumen (20 jl final)

[0087] En 15 jl de TN, 1 jl de enzima activada y 2 jl de inhibidor (compuestos de la invencion) a diferentes concentraciones, se mezclaron y se incubaron a TA durante 30 minutos; Se anadio 2 jl de sustrato, justo antes de la lectura; La absorbancia se midio a 355 nm en EnVision (Perkin Elmer).

2.4. Ensayo de DPPIV

- Medicion sin inhibidor (control positivo)

[0088] En 17 jl de Tris 25 mM pH 8, 1 jl de enzima (1 nM final) y 2 jl de sustrato (Ala-Pro-7-amido-4- trifluorometilcoumarina, a 100 jM final) se mezclaron, justo antes de la lectura. La absorbancia se midio en EnVision (Perkin Elmer)

(Excitation 400 nm/emision 505 nm).

- Inhibicion de 384 pocillos negro placa (20 jl final)

[0089] En 15 jl de Tris 25 mM pH 8, 1 jl de enzima (1 nM final) y 2 jl de inhibidor (compuestos de la invencion) a diferentes concentraciones se mezclaron, y se incubaron a TA durante 30 minutos. Se anadio 2 jl de sustrato (omethylcoumarin Ala-Pro-7-amido-4-trifluor-, a 100 mM final), justo antes de la lectura. La absorbancia se midio en EnVision (Perkin Elmer) (excitacion 400 nm/emision 505 nm).

2.5. Ensayo de amilasa pancreatica

- Medicion sin inhibidor (control positivo)

[0090] En 50 jl, 5 ml de amilasa (a una concentration de partida de 0,25 mg/ml) y 45 jl de almidon Azur (a una concentration de partida de 2% en NaH2Po4 20 mM/50 mM Na Cl pH 7) se mezclaron y se incubaron 1 h a 37°C con agitation. 20 jl solution de acido acetico (concentracion inicial de 2,75 M) se anadio, y la suspension se filtro.

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La absorbancia se midio en microplacas de 96 pocillos Whatman UNIFILTER a 595 nm.

- Inhibicion de placa negra de 96 pocillos

[0091] En 35.5 pl de tampon (NaH2PO4/NaCl 50 mM pH 7 a 37°C), 5 pl de amilasa (0,25 mg/ml) y 5 pl de inhibidor (compuestos de la invencion) a diferentes concentraciones, se mezclaron y se incubaron 30 minutos a RT. 4,5 pl de sustrato (almidon Azur 20% en tampon) se anadieron y se incubaron 1 hora a 37°C con agitacion. Despues, se anadieron 20 pl de solucion de acido acetico (2,75 M) y la suspension se filtro en una microplaca de 96 pocillos UNIFILTER Whatman. Se leyo la absorbancia a 595 nm en EnVision (PerkinElmer).

2.6. Ensayo de lipasa

- Medicion sin inhibidor (control positivo)

[0092] En 85 pl de tampon de lipasa, 5 pl de lipasa (56 U/ml final) y 10 pl de sustrato (DiFMu en 10 mM final) se mezclaron, justo antes de la lectura. La fluorescencia se midio en EnVision (Perkin Elmer) (excitacion 358 nm/emision 452nm).

- Inhibicion de 96 pocillos negro placa (20 pl final)

[0093] En 80 pl de tampon de lipasa, 5 pl de lipasa (56 U/ml final) y 5 pl de inhibidor (compuestos de la invencion) a diferentes concentraciones, se mezclaron y se incubaron a RT durante 30 minutos. Anadir 10 pl de sustrato (DiFMu a 10 pM final) justo antes de la lectura. La fluorescencia se midio en EnVision (Perkin Elmer) (excitacion 358 nm/emision 452nm).

3. Resultados

[0094] Como se muestra en las figuras 1 a 4, los 4 compuestos (OBE1999 a OBE2000), pertenecientes a la familia boropeptido, son particularmente eficaces in vitro contra enteropeptidasa e inhiben la actividad de enteropeptidasa, la maxima inhibicion IC50 constante, a una nanomolar intervalo de 7 a 63 nM. Ademas, estos cuatro compuestos son especlficos de las proteasas de serina, de tipo sub similar a la tripsina, y en contraste no inhiben las proteasas de serina de tipo quimotripsina, metalo-proteasas o glucosidasas (Figura 5).

[0095] Mas especlficamente, OBE1999 es un muy buen inhibidor de enteropeptidasa (IC50 de 33 nM). Sin embargo, tambien inhibe con una buena IC50 (7,5 a 29,8 nM) otras enzimas tales como la tripsina, la calicrelna y la plasmina. Desde la enteropeptidasa se encuentra especlficamente en el intestino luminal y este compuesto es no absorbible, este compuesto es un excelente molecula para inhibir selectivamente la enteropeptidasa, y por lo tanto no se espera para inhibir in vivo otra proteasa de serina (cuya ubicacion es no-intestinal) . En lo que se refiere a OBE2001, estas acciones de compuesto comparten el mismo perfil que el de OBE 1999 y por lo tanto cumple los mismos criterios de especificidad y selectividad.

[0096] OBE2000 es mas especlfica para enteropeptidasa y tripsina que los compuestos OBE1999 y OBE2001, con un bajo valor de IC50 para enteropeptidasa, y el alto valor de IC50 no solo para la trombina, sino tambien para la plasmina (7100 nM) y Calicrelna (260 nm). OBE2002 presenta el mismo perfil que OBE2000, a excepcion del bajo valor IC50 contra la calicrelna y plasmina en comparacion con OBE2000.

[0097] En consecuencia, estos resultados tambien muestran claramente que todos los compuestos ensayados tienen una notable eficacia en la inhibicion in vitro de enteropeptidasa, y pueden considerarse como moleculas prometedoras para futuros experimentos in vivo en animales y/o en los seres humanos. Estos compuestos se ha demostrado que cumplen al menos dos requisitos necesarios para el tratamiento: la especificidad de la inhibicion de proteasas de serina de subtipo de tipo tripsina, y la selectividad de la inhibicion de la enteropeptidasa.

B. EXPERIMENTOS IN VIVO

1. Efecto de OBE2001 en el peso

[0098] El objetivo de este primer experimento in vivo es determinar el efecto anti-obesidad de OBE2001 en un modelo de obesidad inducida por una dieta hiperlipldica en ratones.

[0099] OBE2001 (Acetil-Ala-Phe-BoroArg) se proporciona bajo la forma de sal (peso molecular de 568,3 g/mol). ratones machos suizos, 4 semanas de edad, se dividieron en 2 grupos de 10 animales cada uno, recibiendo el siguiente:

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Numero de grupo

Dieta Dosis

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Grasa alta, ad libitum Vehlculo (agua)

2

Grasa alta, ad libitum OBE2001 (40mg/kg/dla)

[0100] La administracion de OBE2001 se llevo a cabo como una solucion en agua. Tanto OBE2001 o vehlcuio (agua utiliza un control negativo) fueron administrados a los animales a diario por via oral en una administracion de peso corporal de 5 ml/kg.

[0101] En cuanto a la alimentacion de los animales, antes de los experimentos (perlodo de aclimatacion), la dieta normal (referencia No. 824050 comida SDSIDIETEX) estaba disponible ad libitum durante el periodo de aclimatacion. 7 dlas antes del comienzo del estudio, una dieta hipercalorica rica en grasas (45% de protelnas, 4,73 Kcal/g; referencia 824053 SDSIDIETEX) fue dado a los grupos 1 y 2.

[0102] Los animales se pesaron todos los dlas de D-8 (8 dlas antes del inicio del experimento), entonces a partir de D-5 hasta el final del estudio. De D1 (primer dla del experimento), se dio comida ad libitum.

Resultados

[0103] El peso corporal inicial (en g) de los ratones de los grupos 1 y 2 en D-1 (un dla antes del experimento), as! como la ganancia o perdida de peso en funcion del peso inicial (de D1 a D13) se resumen en la siguiente tabla y representado en la fig. 8.

Grupo

D-1 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7

1

Medio 28,3 -2,8 -0,3 1,0 2,3 2,7 3,2 3,9

SEM

0,7 0,2 0,1 0,2 0,3 0,4 0,4 0,5

2

Medio 28,5 -2,7 -1,2 -0,8 0,2 0,7 1,0 0,9

SEM

0,7 0,2 0,2 0,3 0,5 0,6 0,9 1,0

P

NS NS NS NS * * * *

Grupo

D8 D9 D10 D11 D12 D13

1

Medio 4,4 4,7 5,1 5,4 5,9 6,3

SEM

0,6 0,7 0,7 0,8 0,8 0,8

2

Medio 1,3 1,0 1,1 0,5 1,8 2,0

SEM

1,3 1,3 1,4 1,5 1,0 1,1

P

** ** ** ** ** **

Medio: Peso medio de los 10 ratones por grupo; SEM: error estandar del medio; NS: ninguna diferencia significativa entre los dos grupos (p> 0,05) ; *: p<0,05; **: p<0,01

[0104] Como se muestra en la Figura 8, este experimento mostro que el peso de los ratones que han recibido el compuesto OBE2001 es significativamente menor que el peso de los ratones del grupo control. Esta diferencia es significativa desde el dla 4 y altamente significativa desde el dla 8 (vease la tabla). En consecuencia, la administracion de OBE2001 en ratones da como resultado la disminucion del peso tan pronto como el dla 4.

2. Efecto de OBE2001 en la absorcion de trigliceridos

[0105] El alcance de este segundo experimento in vivo era analizar los efectos del compuesto OBE2001 sobre la absorcion de trigliceridos. Para tal fin, los ratones fueron inyectados con OBE2001, antes y/o despues de alimentacion forzada con una solucion enriquecida con colesterol y acidos grasos libres (clinoleic a 20%).

[0106] En este estudio, ratones machos Swiss CD1 de 7 semanas de edad se pesaron y se asignaron al azar para el peso corporal; 3 grupos de 5 ratones fueron constituidos por:

- Grupo 1 (solvant): grupo de control. Vehlculo (H2O + 2% de DMSO) en t-5min + solucion A (clinoleic 20% + colesterol) en t0.

- Grupo 2 (OBE 25+25): OBE2001 25mg/kg (antes y despues de alimentacion forzada). OBE2001 25 mg/kg (solucion B) en t-5min +OBE2001 25 mg/kg en la solucion A (solucion C) en t0.

- Grupo 3 (OBE 25): OBE2001 25 mg/kg (antes de sonda). Vehlculo (H2O + 2% de DMSO) en t-5min + OBE2001 25 mg/kg en solucion A (solucion C) en el instante t0.

[0107] 30 minutos antes del tratamiento (con solucion A, B o C) se recogio sangre por puncion orbital retro despues de una ligera anestesia (isoflurano), para determinar niveles trigliceridos basales (t0). Todas las soluciones se

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administraron por sonda oral a continuacion en t-5 (vehlcuio o solucion B) o t0 (solucion A o C). Despues de la administracion de la solucion A o C (que contiene acidos grasos + colesterol), se recogio sangre de nuevo por puncion orbital retro despues de una ligera anestesia (isoflurano) en el tiempo 60, 120, 180, 300 y 360 minutos para la medicion de los niveles de trigliceridos. En el tiempo de 360 minutos, los ratones fueron sacrificados.

[0108] Resultados: Los siguientes valores fueron obtenidos en diferentes momentos despues de la administracion de la solucion:

% de valor basal

Tiempo (min)

0 60 120 180 300 360

Grupo 1

100,0 227,30 298,72 203,76 109,67 89,41

Grupo 2

100,0 243,39 202,34 127,81 62,35 56,71

Grupo 3

100,0 293,17 269,24 126,45 70,22 60,92

[0109] Sonda oral con una solucion de clinoleico a 20% condujo a un aumento en los niveles de trigliceridos en la sangre en todos los grupos de estudio de las tres primeras horas. Los ratones tratados con OBE2001 en 25 mg/kg en el grupo 2 y 3 muestran una disminucion en la absorcion de trigliceridos en comparacion con el grupo de control 1 (Figura 9).

[0110] Ademas, para cada grupo, el area debajo de la curva se calculo de acuerdo a los valores de la tabla anterior.

Area debajo de la curva

Grupo 1

65453 % de disminucion

Grupo 2

48559 Grupo 2/grupo 1 26%

Grupo 3

56273 Grupo 3/grupo 1 14%

[0111] Este calculo demuestra que la absorcion general de trigliceridos se reduce en un 26% en el grupo 2 en comparacion al grupo 1, y de 14% en el grupo 3 en comparacion con el grupo 1. En consecuencia, estos resultados demuestran que OBE2001 es capaz de inhibir la enteropeptidasa y reduce significativamente la absorcion de los trigliceridos en los animales tratados.

3. Efecto de OBE2001 sobre la absorcion de protefnas

[0112] Este tercer experimento in vivo se diseno para obtener informacion sobre la absorcion de 14C-protelnas en ausencia o en presencia de OBE2001 a dos dosis diferentes (5 mg/kg o 50 mg/Kg) despues de una administracion oral a ratones machos Swiss.

[0113] 15-suizos (1 CD), los ratones machos de 5 semanas de edad y con un peso corporal medio de 0.021 6 0.002 kg se dividieron en 3 grupos:

- Grupo de control (G1; solvant) que contiene 5 ratones, recibio agua a 5 ml/Kg en t-5min y 14C-protelnas a 10 ml/Kg atT = 0min;

- Grupo 2 (G2) que contiene 5 ratones (OBE 5 mg/kg), recibio OBE2001 a 5 mg/Kg en t-5min y 14C-protelnas a 10 ml/Kg a T = 0min;

- Grupo 3 (G3) que contiene 52 ratones (OBE 50 mg/kg), recibio OBE2001 a 50 mg/Kg en t-5min y 14C- protelnas a 10 ml/Kg a T = 0 min.

[0114] Una preparacion que contiene 5 ml de Clinoleico 20 (Baxter Ref DDB9500) con 1 g de glucosa (Sigma; ref: G8270);: se preparo y 1 g de caselna (C3400 ref Sigma). Se anadio agua hasta que la solucion alcanzo los 10 ml. Despues de la concentracion de la solucion radiactiva que contiene 14C protelnas (GE Healthcare; ref: CFA626) (x10), se anadieron 200 pl de esta solucion radiactiva a 2,8 ml de la preparacion, con el fin de alcanzar una concentracion de ca 3,3 pCi/ml. Los animales se mantuvieron en ayunas antes de la administracion de este preparado radioactivo. La preparacion radiactivo se administro oralmente mediante sonda intragastrica con una sola dosis (aproximadamente 33,3 pCi/kg) en un volumen de ca 10 ml/kg de peso corporal.

[0115] OBE2001 se proporciono en una mezcla de dos sales (HCl y TFA) con una pureza del 90%. OBE2001 se administra por via oral mediante sonda intragastrica con una sola dosis de 5 mg/Kg para G2 y 50 mg/Kg para G3 en un volumen de ca 5 ml/kg de peso corporal.

[0116] Allcuotas de plasma se retiran y se colocan en 6 ml viales de plastico pesado previamente, en t+15, t+30, t+60, t+120 y t+240 min. Se anadieron aproximadamente 4 ml Pico-fluor 40 y despues de agitar, la radiactividad total contenida dentro de las diferentes muestras se determino por centelleo llquido usando un espectrometro de Packard

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1900 CA equipado con un sistema estandar externo (analisis espectral). Una curva de enfriamiento para fines de calibration se creo utilizando un conjunto 14C suministrado por Packard Instruments.

[0117] El recuento de Centelleo llquido (LS) se llevo a cabo con 2 sigma = 2%, y para una duration maxima de 5 minutos (de acuerdo con el metodo creado en el software 1900CA®). Valores dpm (desintegracion por minuto) de menos de dos veces el nivel de fondo del medio biologico blanco fueron reportados como BLQ (por debajo del llmite de cuantificacion).

Resultados:

[0118] Durante este experimento con animales, ningun rastro de la morbilidad o la mortalidad se produjo, y no se observo ningun efecto particular en relation con el regimen de dosificacion.

[0119] Una dosis/g Cmax de 0,9% + 0,27 administrada, produciendose en 15 min se observo para el grupo 1 (control), mientras que la Cmax para los grupos tratados tendio a ser menor. De hecho, para los grupos tratados (5 mg/kg y 50 mg/kg), la Cmax eran 0,58% + 0,54, y 0,54% + 0,24 de la dosis/g administrada respectivamente. Los datos cineticos tendlan a una meseta a las concentraciones de 1h a 4h post-administration alcanzando respectivamente 0,5% dosis/g administrada para el grupo 1 y 0,4% administraron dosis/g para los grupos 2 y 3 (Figura 10).

[0120] La media AUC para el grupo 1 fue 2.214 + 0,1875% dosis.h.g-1.AUC media significa para otros dos grupos fue respectivamente 1,8416 0,6402% dose.h.g-1 y 1.718 + 0,4366% dose.h.g-1.

[0121] Este resultado demuestra que la absorcion de protelna se reduce en gran medida en ratones que han recibido OBE2001 en comparacion con los ratones de control, en los primeros 30 minutos despues de la administration de protelnas, y que esta disminucion se mantiene durante al menos 4 horas.

C. Generacion de un raton Constitutive Knock Out (KO) para enteropeptidasa

[0122] Con el fin de comprobar que la enteropeptidasa es una protelna diana correcta en la lucha contra la obesidad, un raton knockout (KO) que imita la deficiencia de enteropeptidasa se ha producido para validar primero el objetivo y para su uso como un modelo animal para el desarrollo de farmacos.

[0123] La generacion de ratones knock out constitutivos consta de los siguientes pasos:

1. Orientation del vector de diseno y construction;

2. Celulas madre de orientacion C57BL/6 embrionarias (ES);

3. Generacion de ratones heterocigotos para la Knock Out Constitutivo;

4. Generacion de ratones homocigotos para el Knock Out Constitutivo.

1. Orientacion del vector de diseno y la construccion

[0124] El homologo murino de enteropeptidasa humana es llamado Prss7 y esta situado en el cromosoma de raton 16.

[0125] Con el fin de inactivar el gen de enteropeptidasa, exones 23-28, que codifican el dominio catalltico, han sido sustituido por un casete de NeoR FRT-flanqueado. El alelo KO constitutivo (exones 1-22) codifica una protelna C- terminal truncada que carece del dominio catalltico. El NeoR se ha extirpado a traves de la recombination mediada por FLP en vivo. La interferencia con la expresion del gen cola-a-cola posicionado (Chodl) a traves de esta modification del gen Prss7 no se puede excluir por completo. La sustitucion de los exones 23-28 (aproximadamente 15kb) con un casete FRT-Neo (aproximadamente 2 kb) disminuye la eficiencia de la recombinacion homologa. Una revision de la construccion de alelo KO se da a conocer en la Figura 11.

[0126] Esta estrategia de selection permitio la construccion de un vector que comprende una enteropeptidasa constitutiva de alelo KO (secuencia y el esquema representado en la Figura 12).

2. Celulas madre dirigidas C57BL/6 embrionarias (ES)

[0127] En un segundo paso, las celulas madre C57BL/6N embrionarias (ES) fueron transfectadas por el vector que comprende la enteropeptidasa constitutiva de alelo KO por electroporation. Se seleccionaron las celulas transformadas por su resistencia a G418 y ganciclovir. Hasta clones individuales 251 ES fueron recogidos y 2 ES clones positivos se obtuvieron (A-D2 y A-E8). En este paso, todas las celulas ES (CES) se cultivaron en celulas alimentadoras embrionarias resistentes a multiples farmacos sin antibioticos y se controlaron regularmente por PCR y ensayos luminometricos de la ausencia de contamination de bacterias y micoplasmas. El control de calidad (QC) cariotipo tambien se incluye (numero de cromosomas) de todos los clones y llneas embrionarias expandidas (para un ejemplo de una publication, informando de la generacion de ratones KO, ver Roberds et al. Genetica Molecular

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Humana, 2001, Vol 10, No12, 1317 -1324).

[0128] Antes de que se inyecta en blastocistos, los clones de celulas ES fueron ampliamente validados por analisis de Southern Blot Analysis con varias sondas. Por lo tanto, el ADN genomico de las celulas WT y clones A-D2 o A-E8 se digirio con AflII, se ejecutan en un gel y la membrana de transferencia se hibrido con una de estas sondas, la sonda 5E2 (secuencia: GCCGCACTATTTGCAGCATG) (Figura 13). La delecion de los exones 23-28 de Prss7 resulto en un fragmento de 11,7 kb Aflll (de la posicion 5373 a la posicion 17.180) en lugar del alelo de tipo silvestre (WT) de 18,8 kb (desde la posicion 5.373 a la posicion 24.211).

[0129] Como se muestra en la Figura 14, AD-2 y A-E8 clones tienen un alelo de tipo silvestre (18,8 kb), as! como un alelo KO (11,7 kb). Por el contrario, el tipo silvestre (WT) las celulas tienen dos WT (no eliminado) alelos (18,8 kb).

[0130] Estos resultados confirman que los clones AD-2 y A-E8 han incorporado con exito al alelo KO.

3. Generacion de ratones heterocigotos para Knock Out Constitutivo

[0131] En una tercera etapa, 2 clones de celulas ES se inyectaron en blastocistos de acogida diploides, y el blastocisto inyectado transfirieron en receptores pseudoprenadas (microoperacion en condiciones libres de patogenos especlficos (SPF)). Por lo tanto, heterocigoto (> 50%) quimeras color del pelaje se generaron y se criaron a heterocigosidad.

[0132] Para controlar el exito de esta tercera etapa, la descendencia se genotipo mediante el siguiente protocolo de PCR. ADN genomico, extraldo de la cola del raton, se amplifico simultaneamente con un primer conjunto de cebadores (cebadores 1472_23 con secuencia: CGTTACTATCCATCACCTAAGC y el cebador con la secuencia 1472_24 GGGAATTCAGCTGTGTCTGAAC) correspondientes a la enteropeptidasa alelo de KO, y un segundo conjunto de cebadores (cebador 1260_1: GAGACTCTGGCTACTCATCC y el cebador 1260_2: CCTTCAGCAAGAGCTGGGGAC) que corresponde a un control interno. El tamano de la enteropeptidasa de alelo KO era 412 pb (conv), y el tamano del control interno fue 585 pb (c).

[0133] Tal como se esperaba, la amplificacion de ADN genomico de ratones WT (115696 y 115705) dio una unica banda de 585 pb. Por el contrario, la amplificacion de ADN genomico de ratones heterocigotos (115695, 115702, 115706, 115707 y 115708) dio dos bandas, una para el alelo de control (585 pb) y uno para el alelo KO (412 pb) (Figura 15).

4. Generacion de cachorros homocigotos para enteropeptidasa

[0134] En una ultima etapa, se generaron crlas homocigotos para enteropeptidasa KO. Heterocigotos de enteropeptidasa KO se cruzaron y se obtuvieron 46 crlas. Entre los recien nacidos, el 30% (14 cachorros) eran homocigotos para la enteropeptidasa KO, el 50% eran heterocigotos (22 cachorros) y el 20% eran de tipo silvestre (homocigoto dominante para el gen de enteropeptidasa).

[0135] La presencia de la enteropeptidasa KO en una cepa homocigotica se comprobo por analisis de PCR, a partir de aDn genomico, extraldo de la cola del raton. El ADN genomico se amplifico simultaneamente con un primer conjunto de cebadores (cebador 1472_23 con la secuencia: CGTTACTATCCATCACCTAAGC y cebador PRRS7 con la secuencia ATCAAGGAATCTTGGGAGCA) correspondientes al alelo de enteropeptidasa Wt, y un segundo conjunto de cebadores (actina cebador directo: CGGAACCGCYCATTGGC y actina cebador inversa: ACCCACACTGTGCCCATCTA) correspondiente al control de actina. El tamano del alelo de enteropeptidasa era 533 pb, y el tamano del control de actina de 300 pb.

[0136] Como se puede ver en la figura 16, los fragmentos amplificados de los ratones heterocigotos, en los carriles denominados 115.755 y 115.648, presentan dos bandas, una correspondiente a la de control de actina (300 pb) y una a la enteropeptidasa de alelo Wt (533 bp). En contraste, los fragmentos amplificados de los recien nacidos 1A, 2A, 3A, 4A y 5A tiene un tamano de 300 pb y por lo tanto corresponden al solo control de actina, lo que demuestra que carecen de una enteropeptidasa de alelo WT.

5. Observaciones fenotfpicas

[0137] Los recien nacidos, obtenidos a partir del cruce de heterocigotos de knockout (KO) de enteropeptidasa, se cultivaron durante 7 dlas y se comparo su tamano.

[0138] Como se puede mostrar en la Figura 17, los homocigotos de raton para la enteropeptidasa KO (Ho) es dos veces mas pequena que el heterocigoto de raton para la enteropeptidasa KO (He).

[0139] Estos resultados demostraron que la enteropeptidasa es un buen objetivo para combatir la obesidad, ya que sus resultados de inhibicion completos especlficos en una disminucion significativa del tamano.

Claims (10)

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   Reivindicaciones

   1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en Glu-Gly-Boro-Arg, Ala-Phe-Boro-Arg, Ac-Glu-Gly- Boro-Arg y Ac-Ala-Phe- Boro-Arg, en el que Ac es acetilo.
2. 2. El compuesto de acuerdo con la reclamation 1, en la que el resto de boroarginina comprende un grupo de la formula:

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3. 3. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

   CH,

   H,N

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4. 4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 3,que inhibe la actividad enzimatica de la enteropeptidasa, preferiblemente que inhibe selectivamente la actividad enzimatica de la enteropeptidasa sobre otras proteasas de serina.
5. 5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 4, que es no absorbible.
6. 6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 5, que es en una base libre o una

   sal farmaceuticamente aceptable de la misma.
7. 7. Una composicion que comprende al menos un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 6, que comprende ademas opcionalmente al menos un vehiculo farmaceuticamente aceptable.
8. 8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 6 o la composicion de acuerdo con la reclamacion 7, para uso en el tratamiento de la obesidad en un mamifero, preferiblemente un ser humano.
9. 9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reclamaciones 1 a 6 o la composicion de acuerdo con

   la reclamacion 7, para uso en el tratamiento del exceso de peso en un mamifero, preferiblemente un ser

   humano.
10. 10. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reclamaciones 1 a 6 o la composicion de acuerdo con la reclamacion 7, para su uso en el tratamiento, en un mamifero, preferiblemente un ser humano, de las enfermedades asociadas con el metabolismo anormal de la grasa, en el que dicha enfermedad de metabolismo de grasa se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en enfermedad gota, diabetes de tipo II, hiperglucemia, hiperinsulinemia, niveles elevados en sangre de acidos grasos o glicerol, sindrome X, complicaciones diabeticas, sindrome dismetabolico y enfermedades relacionadas, la hipercolesterolemia, la aterosclerosis, la hipertension, pancreatitis, hipertrigliceridemia, hiperlipidemia, accidente cerebrovascular, enfermedades coronarias del corazon, enfermedades vasculares perifericas, enfermedades arteriales perifericas, sindromes vasculares, de colesterol y trastornos relacionados con la lipodistrofia inducida por farmacos.