ES2574825T3 - Análogos de glicolípidos útiles como inmunoadyuvantes - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula I: **Fórmula** donde R2, R3, R4 y R5 cada uno representan independientemente a H o a un grupo protector; X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido; Y es un alquileno C1-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos seleccionados independientemente de un enlazador alquenileno halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 e hidroxilo, o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta dos grupos; y Z es -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroátomo dentro de su estructura, y es opcionalmente sustituido; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

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Analogos de glicolipidos utiles como inmunoadyuvantes.

Area del invento

[0001] Este invento se refiere a analogos de glicolipidos que son ligandos para celulas NKT (celulas T eliminadoras naturales), que podrian ser utilizadas como inmuno - adyuvantes para incrementar el nivel de titulo de anticuerpos en el momento de la vacunacion.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

[0002] Los glicolipidos revelaron recientemente una variedad de diferentes propiedades inmunologicas. Entre ellas, se ha demostrado que pueden actuar como antfgenos cuando se presentan por moleculas CD1, asf como que pueden mejorar la respuesta inmunologica cuando se administran en combinacion con una vacuna.

[0003] Las moleculas CD1 son una familia de antfgenos altamente conservados que presentan protefnas similares funcionalmente a moleculas bien conocidas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC - Major Histocompatibility Complex). Mientras que las protefnas MHC presentan a peptidos, las protefnas CD1 enlazan y muestran una variedad de lfpidos y glicolipidos para los linfocitos T.

[0004] En los humanos, las varias isoformas son categorizadas como el grupo I (CD1a, b, c y e) y el grupo II (CDId) basandose en la similitud secuencial [Calabi, F.; Jarvis, J. M.; Martin, L.; Milstein, C., Two classes of CD1 genes (Dos clases de genes CD1), Eur. J. Immunol. 1989, 19, (2), 285-92]. Las estructuras de cristal del CD1 humano a [Zajonc, D. M. et al, Nat. Immunol. (2003), 4, 808-815], hCDlb [Gadola, S. D. et al,. Nat. Immunol. (2002), 3, 721726], hCD1d [Koch, M.; et al Nat. Immunol. (2005), 6, 819-826.] Y CD1d de raton (mCDId - mouse CD1d) [ Zeng, Z- H. et al Science (Ciencia) (1997), 277, 339-345; Zajonc, D. M. et al. J. Exp. Med. (2005), 202, 1517-1526], algunos en complejos con sus antfgenos pertinentes, han revelado como las diferencias en la topologfa de sus respectivas ranuras de enlace les permiten tener un nivel de especificidad de ligandos, mientras se mantiene la capacidad de presentar un conjunto diverso de lfpidos antigenicos.

[0005] En particular, el mCDId revelo una flexion general similar a las protemas de clase I de MHC. La cadena a se dobla entre los dominios ((a 1, a 2, y a 3) y esta asociada de cerca con p2m. Los dominios distales al y a2 de la membrana forman a la ranura de enlace, que es compuesta de un piso de laminas p anti-paralelo de 8 hebras atravesada por 2 helices a anti-paralelo [Zeng, Z.-H. et al Science (Ciencia) (1997), 277, 339-345]. Se demostro ademas que el mCDld podrfa acomodar a colas largas de lfpidos en 2 bolsillos hidrofobicos, designados A' y F', ubicados en la ranura de enlace. Ademas, las estructuras de hCD1b y hCD1a demostraron que CD1, cuando esta cargado con glicolipidos antfgenos, enlaza a la porcion lfpida en una ranura hidrofobica mientras facilita a la partfcula hidrofflica de azucar para hacer contacto con el receptor de la celula T.

[0006] Los lfpidos de mamfferos y de micobacterias son conocidos por ser presentados por los CD1a, CD1b, CD1c y Co1d humanos [Porcelli, S. A. y Modlin, R. L. (1999) Annu. Rev. Immunol. 17, 297-329]. La ceramida de alfa- galactosilo (a-GalCer - Alpha-galactosyl ceramide), un lfpido encontrado en la esponja marina Agelas mauritianus, ha sido, hasta la fecha, el ligando que ha sido mas estudiado para CD1d. La a-GalCer, cuando se enlaza a CD1d, estimula una produccion rapida de la citocinas Th1 y Th2 por las celulas T eliminadas naturales de Va14z (celulas Va14z NKT - Va14z natural killer T cells) en ratones, y los homologos humanos las celulas Vl 24z NKT y pueden ser ahora considerados como un modelo antigeno. Sin embargo, la significancia fisiologica en mamfferos permanece siendo un misterio, puesto que es enigmatico porque una ceramida de a-galactosilo de origen marino es un agonista tan potente.

a-GalCer:

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[0008] Las celulas Eliminadoras Naturales (NK - Natural Killer) comunmente comprenden aproximadamente del 10

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al 15% de la fraccion celular mononuclear en la sangre periferica normal. Historicamente, las celulas NK fueron identificadas por primera vez por su capacidad de lisar a ciertas celulas tumorales sin una inmunizacion o una activacion previa. Las celulas NK tambien realizan un rol crftico en la produccion de citocina, lo cual podrfa estar involucrado con el control del cancer, de infecciones y posiblemente en la implantacion fetal.

[0009] La admimstracion de a-GalCer junto con protefnas inmunogenicas resulto en una respuesta celular mejorada del NKT de CD4+ y CD8+ a antfgenos solubles a traves de la interaccion con celulas dendrfticas [Ian F. Hermans, 1. F. et al., J. Immunol. (2003), 171, 5140-5147]. La admimstracion de a-GalCer tambien mejoro la respuesta de los linfocitos B, provocando frecuencias mas altas de las celulas B de la memoria y niveles mas altos de anticuerpos en respuesta a inmunizaciones de refuerzo [Galli G. et al, PNAS, (2007), 104; 3984-3989]. Se ha utilizado para mejorar la eficacia de ciertos antfgenos peptfdicos. WO 2005/000348.

[0010] US 2007/238871 A1 describe analogos de glicolfpidos que sirven como ligandoos para las celulas NKT y a metodos de su uso en la regulacion de respuestas inmunologicas.

[0011] WO 2006/026389 A2 describe a alfa-galactosilceramidas y a glicosilceramidas que regulan a las celulas NKT. Tambien se presentan a composiciones farmaceuticas de estos compuestos y metodos para utilizarlas en vacunas, para activar a las celulas NKT, para estimular al sistema inmunologico, y para tratar a mamfferos.

[0012] Wu D et al. (PNAS, 2006, 103 (11) 3972-3977) describe la estructura y funcion de glicoesfingolfpidos enlazados al CD1d de ratones.

[0013] Masakazu et al. (J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 9022-9023) describe el descubrimiento que se basa en estructuras de glicolfpidos para la activacion de las celulas NKT reguladas por CD1d.

[0014] EP 1 776 963 A1 describe a hexosilceramidas como adyuvantes y sus usos en composiciones farmaceuticas, tales como en vacunas.

RESUMEN DEL INVENTO

[0015] Este invento se refiere a una nueva clase de compuestos inmunogenicos que son analogos de a-GalCer, correspondiendo a la estructura general que se muestra mas adelante y metodos sinteticos nuevos para su preparacion y su uso para mejorar la efectividad de vacunas. Estos compuestos suministran propiedades farmacocineticas mejoradas por sobre a-GalCer, y son similarmente efectivos para incrementar las respuestas inmunologicas cuando un antfgeno o vacuna es administrada.

[0016] En un sentido, el invento se refiere a compuestos de la formula I y a composiciones que contienen a aquellos compuestos:

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Donde R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente H o a un grupo protector;

X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido;

Y es un alquileno C1-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos seleccionados independientemente de un enlazador halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo e hidroxilo C1-C6, o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos; y Z es -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroatomo dentro de su estructura, y es opcionalmente sustituido; o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

[0017] Las composiciones que contienen a un compuesto de la formula I podrfan ser composiciones farmaceuticas, y a menudo incluyen a un portador farmaceuticamente aceptable. En algunas secciones, las composiciones incluyen ademas a por lo menos un antfgeno, que es seleccionado por su capacidad para provocar una respuesta inmunologica deseada. En ciertas secciones del invento se incluye a un compuesto de la formula I mezclado con una vacuna.

[0018] Tambien se presentan a metodos para elaborar compuestos de la formula I, y a intermedios nuevos utiles para hacer a los compuestos de la formula I.

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[0019] En un aspecto, el invento se refiere a compuestos de la formula I para su uso en un metodo para mejorar una respuesta inmunologica a un antfgeno, donde dicho metodo comprende la administracion de un compuesto de la formula I en un sujeto que es expuesto al antfgeno. Este metodo podna ser util para incrementar la efectividad de una vacuna para su administracion a sujetos humanos.

DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS

[0020]

La figura 1 demuestra la actividad de los compuestos sinteticos a traves de la activacion de hibridomas FF13 de celulas T cuando son presentados por APC (THP1). Como una medida de la activacion de las celulas T, se determino la liberacion de IL2 en el medio de cultivo despues de 48 horas de cultivo por medio de un ensayo ELISA. El eje Y muestra niveles de IL2 en pg/ml. El eje X es el monto de glicolfpidos en microgramos/mililitro.

La figura 2 resume la informacion de la actividad para 4 compuestos sinteticos tal como fue probado en un ensayo que mide la liberacion de IL/2 por celulas de hibridomas de NKT contactadas con un APC expuesto a los compuestos o a a-GalCer.

La figura 3 resume la informacion de la actividad in vivo para a-Gal GG y a-Gal LP sinteticos tal como se probo en un ensayo que midio la titulacion HI en ratones Balb/C. Se muestran las titulaciones Anti-H3N2 HI.

La figura 4 resume la informacion de la actividad in vivo para a-Gal GG y a-Gal LP sinteticos tal como se probo en un ensayo que midio las titulaciones IgG en ratones Balb/C. Las titulaciones IgG se muestran en EU/ml. Para cada triplete en el grafico la columna representa, desde la izquierda a la derecha, B, H1N1 y H3N2.

La figura 5 resume la informacion de la actividad in vivo para a-Gal GG y a-Gal LP sinteticos tal como se probo en un ensayo que midio las titulaciones IgG2a/IgG1 en ratones Balb/C. Las titulaciones IgG se muestran en EU/ml. Para cada pareja en el grafico, las columnas representan, de la izquierda a la derecha, a IgG2a y IgG1.

DESCRIPCION DETALLADA DE CIERTAS SECCIONES

Los Compuestos del Invento

[0021] Tal como se utiliza aqm, el termino “residuo hidrocarbilo” se refiere a un residuo que con tiene solamente carbono e hidrogeno, a menos que se especifique otra forma. El residuo podna ser alifatico o aromatico, de una cadena lineal, dclico, ramificado, saturado o insaturado, o cualquiera de sus combinaciones. El residuo hidrocarbilo, cuando se lo declara de esa forma, sin embargo, podna contener a heteroatomos adicionalmente a, o en vez de, los miembros carbonos e hidrogeno del grupo hidrocarbilo en sf Por lo tanto, cuando se menciona espedficamente que contiene heteroatomos, el grupo hidrocarbilo podna contener a heteroatomos dentro de la “estructura” del residuo hidrocarbilo, y cuando es sustituido opcionalmente, el residuo hidrocarbilo tambien podna tener uno o mas grupos de carbonilos, grupos aminos, grupos hidroxilos y similares en vez de uno o mas hidrogenos del residuo hidrocarbilo padre.

[0022] Tal como se utiliza en este documento, el termino “residuo inorganico” se refiere a un residuo que no contiene carbonos. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, halo, hidroxi, NO2 o NH2.

[0023] Tal como se utiliza en este documento, los terminos “alquilo”, “alquenilo”, y “alquinilo” incluyen a radicales de cadenas lineales, de cadenas ramificadas e hidrocarbilos dclicos monovalentes, y combinaciones de estos, que contienen solamente a C y a H cuando no son sustituidos. Ejemplos incluyen a metilo, etilo, isobutilo, ciclohexilo, ciclopentiletilo, 2-propenilo, 3-butinilo, y similares. El numero total de atomos carbonos en cada uno de esos grupos es a veces descrito en este documento, por ejemplo, cuando el grupo puede contener hasta 10 atomos carbonos puede ser representado como 1-10C o como C1-C10 o como C-10. Cuando a los heteroatomos (comunmente N, O y S) se les permite reemplazar a atomos carbonos tal como en los grupos heteroalquilos, por ejemplo, los numeros que describen al grupo, aunque todavfa se describen como, por ejemplo, C1-C6, representan la suma del numero de atomos carbonos en el grupo mas el numero de aquellos heteroatomos que estan incluidos en calidad de reemplazos de los atomos carbonos en el anillo o en la cadena que esta siendo descrita.

[0024] Comunmente, los sustituyentes de alquilos, alquenilos, y alquinilos del invento contienen a 1-10C (alquilos) o a 2-10C (alquenilo o alquinilo). Preferiblemente contienen a 1-8C (alquilo) o a 2-8C (alquenilo o alquinilo). A veces contienen a 1-4C (alquilo) o a 2-4C (alquenilo o alquinilo). Un solo grupo puede incluir mas de un tipo de enlaces multiples, o mas de un enlace multiple; aquellos grupos estan incluidos dentro de a la definicion del termino “alquenilo” cuando contienen a por lo menos un enlace doble carbono-carbono, y estan incluidos dentro del termino “alquinilo” cuando contienen a por lo menos un enlace triple carbono-carbono.

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[0025] Los grupos alquilos, alquenilos y alquinilos a menudo son sustituidos en la medida en que aquella sustitucion haga sentido qufmicamente. Sustituyentes comunes incluyen, pero no se limitan a, halo, =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, y NO2, donde R es independientemente H, un alquilo C1-C8, un heteroalquilo C2-C8, un acilo C1-C8, un heteroacilo C2-C8, un alquenilo C2-C8, un heteroalquenilo C2-C8, un alquinilo C2-C8, un heteroalquinilo C2-C8, un arilo C6-C10, o un heteroarilo C5-C10, y R es sustituido opcionalmente con halo, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', y NO2, donde cada R' es sustituido independientemente con H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, acilo C1-C8, hetero acilo C2-C8, arilo C6-C10 o hetero arilo C5-C10. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo tambien pueden ser sustituidos por acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10, cada uno de los cuales pueden ser sustituidos por los sustituyentes que son apropiados para el grupo especffico.

[0026] Los terminos “heteroalquilo”, “heteroalquenilo” y “heteroalquinilo” y similares son definidos similarmente a los grupos hidrocarbilos (alquilo, alquenilo y alquinilo) correspondientes, pero los terminos 'hetero' se refieren a grupos que contienen 1-3 heteroatomos de O, S o N o sus combinaciones dentro del residuo estructural; por lo tanto, por lo menos un atomo carbono de un grupo alquilo, alquenilo y alquinilo correspondiente es reemplazado por uno de los heteroatomos especificados para formar a un grupo heteroalquilo, heteroalquenilo o heteroalquinilo. Los tamanos comunes y preferidos para los heteroatomos de los grupos alquilos, alquenilos y alquinilos son generalmente los mismos que para los grupos hidrocarbilos correspondientes, y los sustituyentes que podrfan estar presentes en las heteroformas son los mismos que aquello descritos anteriormente para los grupos heterocarbilos. Por razones de estabilidad qufmica, tambien se entiende que, a menos que se especifique de otra forma, aquellos grupos no incluyen mas de 2 heteroatomos contiguos excepto cuando un grupo oxo esta presente en N o S, tal como un grupo nitro o sulfonilo.

[0027] Mientras que el termino “alquilo” tal como se utiliza en este documento incluye a los grupos cicloalquilo y cicloalquilalquilo, el termino “cicloalquilo” podna ser utilizado en este documento para describir a un grupo no aromatico carbocfclico que esta conectado por medio de un atomo carbono, y el termino “cicloalquilalquilo” podna ser utilizado para describir a un grupo no aromatico carbocfclico que esta conectado a la molecula a traves de un enlazador alquilo. Asimismo, el termino “heterocfclilo” podna ser utilizado para describir a un grupo cfclico no aromatico que contiene por a lo menos un heteroatomo como un miembro anular y que esta conectado a la molecula por medio de un atomo anular, que podna ser C o N; y el termino “heterociclilalquilo” podna ser utilizado para describir un grupo que esta conectado a otra molecula a traves de un enlazador. Los tamanos y sustituyentes que son adecuados para los grupos cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo y heterociclilalquilo son los mismos que aquellos descritos anteriormente para los grupos alquilos. Tal como se utiliza en este documento, estos terminos tambien incluyen anillos que contienen 1 o 2 enlaces dobles, siempre y cuando el anillo no sea aromatico.

[0028] Tal como se utiliza en este documento, el termino “acilo” abarca a grupos que contienen a radicales alquilos, alquenilos, alquinilos, arilos o arilalquilos adheridos a uno de las 2 posiciones disponible de valencia de un atomo carbono carbonilo, y heteroacilo se refiere a los grupos correspondientes donde por lo menos un carbono aparte del carbono carbonilo ha sido reemplazado por un heteroatomo escogido de N, O y S. Por lo tanto, los heteroacilos incluyen, por ejemplo, a -C(=O)OR y -C(=O)NR2 asf como los -C(=O)-heteroarilos.

[0029] Los grupos acilos y heteroacilos estan enlazados a cualquier grupo o molecula a la cual esten adheridos a traves de una Valencia abierta del atomo carbono carbonilo. Comunmente, son grupos acilos C1-C8, que incluyen a los grupos formilos, acetilos, pivaloilos y benzoilos, y heteroacilos C2-C8, que incluyen a metoxiacetilos, etoxicarbonilos, y 4-piridinoilos. Los grupos hidrocarbilos, los grupos arilos y las heteroformas de aquellos grupos que comprenden a grupos acilos y heteroacilos pueden ser sustituidos con los sustituyentes descritos en este documento como sustituyentes adecuados generalmente para cada uno de los componentes correspondientes del grupo acilo o heteroacilo.

[0030] Las partfculas “aromaticas” o partfculas “arilas” se refieren a partfculas monodclicas o bicfclicas fusionadas que tienen caracterfsticas bien conocidas de aromaticidad; ejemplos incluyen al fenilo y al naftilo. Asimismo, el termino “heteroaromatico” y “heteroarilo” se refieren a aquellos sistemas anulares monocfclicos o bicfclicos fusionados que contienen como miembros anulares a uno o mas heteroatomos seleccionados de O, S y N. La inclusion de un heteroatomo habilita la aromaticidad en anillos de 5 miembros, asf como en anillos de 6 miembros. Sistemas comunes heteroaromaticos incluyen a grupos aromaticos C5-C6 monocfclicos tales como piridilos, pirimidilos, piracinilos, tienilos, furanilos, pirrolilos, pirazolilos, tiazolilos, oxazolilos, e imidazolilos y partfculas bicfclicas fusionadas formadas al fusionar a uno de estos grupos monocfclicos con un anillo fenilo o con cualquiera de los grupos monocfclicos heteroaromaticos para formar un grupo bicfclico C8-C10 tal como el indolilo, bencimidazolilo, indazolilo, benzotriazolilo, isoquinolilo, quinolilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, pirazolopiridilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, cinnolinilo, y similares. Cualquier sistema monocfclico o bicfclico anular fusionado que tiene las caracterfsticas de aromaticidad en terminos de distribucion de electrones a traves del sistema anular esta incluido en esta definicion. Tambien incluye a grupos bicfclicos cuando por lo menos el anillo que esta directamente adherido al resto de la molecula tiene las caracterfsticas de aromaticidad. Comunmente, el sistema anular contiene a 5-12 atomos miembros anulares. Preferiblemente, los heteroarilos monocfclicos contienen a 5-6 miembros anulares,

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y los heteroarilos bicfclicos contienen a 8-10 miembros anulares.

[0031] Las partfculas arilas y heteroarilas podrfan ser sustituidas con una variedad de sustituyentes incluyendo a alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-C12, acilo C1-C8, y heteroformas de estos, cada una de las cuales puede por si misma ser sustituida aun mas; otros sustituyentes para partfculas arilas y heteroarilas incluyen a halo, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, y NO2, donde R es independientemente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, heteroalquinilo C2-C8, arilo C6-C10, heteroarilo C5-C10, arilalquilo C7-C12, o heteroarilalquilo C6-C12, y cada R es sustituida opcionalmente tal como se describio anteriormente para los grupos alquilos. Los grupos sustituyentes en un grupo arilo o heteroarilo podrfan, desde luego, ser sustituidos aun mas con los grupos descritos en este documento como adecuados para cada tipo de aquellos sustituyentes o para cada componente del sustituyente. Por lo tanto, por ejemplo, un sustituyente arilalquilo podrfa ser sustituido en la porcion arila con los sustituyentes aquf descritos como comunes para los grupos arilos, y podrfa ser sustituido aun mas en la porcion alquila con los sustituyentes aquf descritos como comunes y adecuados para los grupos alquilos.

[0032] Asimismo, el termino “arilalquilo” y “heteroarilalquilo” se refiere a sistemas anulares aromaticos y heteroaromaticos que son enlazados a sus puntos de adherencia a traves de un grupo de enlace tal como un alquileno, incluyendo a enlazadores cfclicos o acfclicos, saturados o insaturados, sustituidos o no sustituidos. Comunmente, el enlazador es un alquilo C1-C8 en una de sus heteroformas. Estos enlazadores podrfan incluir ademas a un grupo carbonilo, facilitandolos, por lo tanto, para suministrar sustituyentes como una partfcula acila o heteroacila. Un anillo arilo o heteroarilo en un grupo arilalquilo o heteroarilalquilo podrfa ser sustituida con los mismos sustituyentes descritos anteriormente para los grupos arilos. Preferiblemente, un grupo arilalquilo incluye a un anillo fenilo sustituido opcionalmente con los grupos definidos anteriormente para los grupos arilos y un alquileno C1-C4 que no ha sido sustituido o que ha sido sustituido con 1 o 2 grupos alquilos C1-C4 o grupos heteroalquilos, donde los grupos alquilos o heteroalquilos pueden ciclar para formar a un anillo tal como un ciclopropano, dioxolano, u oxaciclopentano. Asimismo, un grupo heteroarilalquilo incluye preferiblemente a un grupo heteroarilo monocfclico C5-C6 que es sustituido opcionalmente con los grupos descritos anteriormente como sustituyentes tfpicos de grupos arilos y un alquileno C1-C4 que no es sustituido o que es sustituido con 1 o 2 grupos alquilos o grupos heteroalquilos C1-C4, o incluye un anillo fenilo sustituido opcionalmente o un heteroarilo monocfclico C5-C6 y un heteroalquileno C1-C4 que es no sustituido o sustituido con 1 o 2 grupos alquilos o heteroalquilos C1-C4, donde los grupos alquilos o heteroalquilos pueden ciclar opcionalmente para formar un anillo tal como el ciclopropano, el dioxolano o el oxaciclopentano.

[0033] Cuando un grupo arilalquilo o heteroarilalquilo es descrito como sustituido opcionalmente, los sustituyentes podrfan estar en la porcion alquila o heteroalquila o en la porcion arila o heteroarila del grupo. Los sustituyentes que se presentan opcionalmente en la porcion alquila o heteroalquila son los mismos que aquellos descritos anteriormente para los grupos alquilos generalmente; los sustituyentes opcionalmente presentes en la porcion arila o heteroarila son los mismos que aquellos descritos anteriormente para los grupos arilos generalmente.

[0034] Los grupos “arilalquilos” tal como se utilizan en este documento son grupos hidrocarbilos si no son sustituidos, y son descritos por el numero total de atomos carbonos en el anillo y en el alquileno o en un enlazador similar. Por lo tanto, un grupo bencilo es un grupo arilalquilo C7-, y el feniletilo es un arilalquilo C8-.

[0035] El termino “heteroarilalquilo” tal como se describio anteriormente se refiere a una partfcula que comprende a un grupo arilo que es adherido a traves de un grupo enlazador, y se diferencia del “arilalquilo” en que por lo menos un atomo anular de la partfcula arila o un atomo en el grupo enlazador es un heteroatomo seleccionado de N, O y S. Los grupos heteroarilalquilos son descritos en este documento de acuerdo al numero total de atomos en el anillo y en el enlazador combinados, y ellos incluyen a los grupos arilos enlazados a traves de un enlazador heteroalquilo; a los grupos heteroarilos enlazados a traves de un enlazador hidrocarbilo tal como un alquileno; y a grupos heteroarilos enlazados a traves de un enlazador heteroalquilo. Por lo tanto, por ejemplo, un heteroarilalquilo C7- incluirfa a piridilmetilos, fenoxis y N-pirrolinotoxi.

[0036] El termino “alquileno” tal como se utiliza en este documento se refiere a un grupo hidrocarbilo bivalente; puesto que es bivalente, puede enlazar a otros 2 grupos entre sf. Comunmente, se refiere a -(CH2)n donde n es 1-8 y preferiblemente n es 1-4, donde cuando se ha especificado, un alquileno tambien puede ser sustituido por otros grupos, y puede tener otras longitudes, y las valencias abiertas no necesitan estar en extremos opuestos de una cadena. Por lo tanto, -CH(Me)- y - C(Me)2- tambien podrfa ser denominados alquilenos, asf como un grupo cfclico tal como ciclopropan-1,1-diilo. En los casos en los que un grupo alquileno es sustituido, los sustituyentes incluyen aquellos comunmente presentes en los grupos alquilos tal como se describe en este documento.

[0037] En general, cualquier grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo o arilo o arilalquilo o cualquier heteroforma de uno de estos grupos que es contenida en un sustituyente podrfa, en sf, ser sustituida opcionalmente por sustituyentes adicionales. La naturaleza de estos sustituyentes es similar a aquellos mencionados en referencia a los sustituyentes primarios per se, sf los sustituyentes no son descritos de otra forma. Por lo tanto, en los casos en los que una modalidad de, por ejemplo, R7 es alquilo, el alquilo podrfa ser sustituido opcionalmente por los sustituyentes remanentes listados como modalidades de R7 en los casos en los que esto hace sentido qufmico, y

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donde esto no reduce el limite de tamano suministrado para el alquilo per se; por ejemplo, un alquilo sustituido por un alquilo o por un alquenilo simplemente extenderfa el limite superior de los atomos carbonos para estas modalidades, y eso no esta incluido dentro del enfoque del invento. Sin embargo, un alquilo sustituido por un arilo, un amino, un alcoxi, =O, y similares estaria incluido dentro del enfoque del invento, y los atomos de estos grupos sustituyentes no estan contados en el numero utilizado para describir al grupo alquilo, al alquenilo, etcetera que se esta describiendo. Cuando ningun numero de sustituyentes es especificado, cada uno de aquellos grupos como alquilos, alquenilos, alquinilos, acilos o arilos podrian ser sustituidos con un numero de sustituyentes de acuerdo a sus valencias disponibles; en particular, cualquiera de estos grupos podria ser sustituido con, por ejemplo, atomos de fluor en cualquiera o en todas sus valencias disponibles.

[0038] El termino “heteroforma” tal como se utiliza en este documento se refiere a un derivado de un grupo tal como un alquilo, un arilo o un acilo, donde por lo menos un atomo carbono del grupo carbociclico designado ha sido reemplazado por un heteroatomo seleccionado de N, O y S. Por lo tanto, los heteroatomos de alquilos, alquenilos, alquinilos, acilos, arilos, y arilalquilos son heteroalquilos, heteroalquenilos, heteroalquinilos, heteroacilos, heteroarilos y heteroarilalquilos, respectivamente. Debe entenderse que no mas de 2 atomos de N, O o S son conectados ordinariamente en una forma secuencial, excepto cuando un grupo oxo esta adherido a N o S para formar un grupo nitro o sulfonilo. En los casos en que un grupo que esta descrito puede contener a heteroatomos opcionales dentro de la estructura o de, por ejemplo, la cadena alquila, los heteroatomos son seleccionados de N, O y S, a menos que se especifique de otra forma.

[0039] El termino “opcionalmente sustituidos” tal como se utiliza en este documento indica que el grupo o los grupos particulares que se estan describiendo podrian tener sustituyentes no hidrogenos, o el grupo o los grupos podrian tener uno o mas sustituyentes no hidrogenos. Si no se especifica de otra forma, el numero total de aquellos sustituyentes que podrian estar presentes es igual al numero de atomos H presentes en la forma no sustituida del grupo que se esta describiendo. Cuando un sustituyente opcional esta adherido por medio de un enlace doble, tal como un oxfgeno carbonilo (=O), el grupo absorbe a 2 valencias disponibles, asf que el numero total de sustituyentes que podrian incluirse es reducido de acuerdo al numero de valencias disponibles.

[0040] El termino “halo”, tal como es utilizado en este documento incluye a fluor, cloro, bromo y yodo. Lo que se prefiere a menudo es fluor y cloro.

[0041] El termino “aminos” tal como se utiliza en este documento se refiere a NH2, pero en los casos en los que un amino es descrito como “sustituido” u “opcionalmente sustituido”, el termino incluye a NR'R” donde cada R' y R” es independientemente H, o es un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, arilo o arilalquilo o una heteroforma de uno de estos grupos, y cada uno de los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, arilo o arilalquilo o las heteroformas de uno de estos grupos es sustituido opcionalmente con los sustituyentes descritos en este documento tal como sea adecuado para el grupo correspondiente. El termino tamil incluye formas donde R' y R” estan enlazados en conjunto para formar un anillo de 3-8 miembros que podria ser saturado, insaturado o aromatico y que contiene a 1-3 heteroatomos seleccionados independientemente de N, O y S como miembros anulares, y que es sustituido opcionalmente con los sustituyentes descritos como adecuados para los grupos alquilos o, si NR'R” es un grupo aromatico, es sustituido opcionalmente con los sustituyentes descritos como comunes para los grupos heteroarilos.

[0042] En un aspecto, el invento suministra compuestos de la formula I:

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donde R2, R3, R4 y R5 representan cada uno independientemente a H o a un grupo protector;

X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido;

Y es un alquileno C1-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos seleccionados independientemente de un enlazador halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo e hidroxilo C1-C6, o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos;

y Z es-OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener un heteroatomo dentro de su estructura, y es opcionalmente sustituido;

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o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.

[0043] En la formula I, cada uno de R2, R3, R4 y R5 puede ser H, o uno o mas de estos pueden ser un grupo protector. En algunas secciones, R2 y R3; o R3 y R4; o R4 y R5 pueden estar unidos entre si en un anillo; por ejemplo, cualquiera de estas parejas podrfa representar a un grupo protector acetonido. El 'grupo protector' incluye a los grupos convencionales acilos, alquilos, arilalquilos, sililos, y de otro tipo usados comunmente para la proteccion de un hidroxilo durante sfntesis organicas. Ejemplos especfficos incluyen a metilos, formilos, acetilos, metoxiacetilos, trimetilsililos, t-butildimetilsililos, metoximetilos, 2-trimetilsililetoximetilos, bencilos, dimetoxibencilos, alilos, metoxicarbonilos, aliloxicarbonilos, tricloroetoxicarbonilos, benciloxicarbonilos, y similares. En particular, cada uno de R2, R3, R4 y R5 pueden ser un grupo acilo C1-C10 sustituido opcionalmente, tal como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, benzoilo, metoxicarbonilo, benciloxicarbonilo o bencil-oxyiarbonilo, t-butoxicarbonilo sustituidos o un grupo arilmetilo opcionalmente sustituido tal como un bencilo, un metoxibencilo o undimetoxibencilo. Los compuestos donde uno o mas de R2, R3, R4 y R5 representan a uno de estos grupos protectores, y los restantes son cada uno H, son particularmente preferidos, porque pueden servir como intermedios para la sfntesis de compuestos adicionales del invento, por medio de modificaciones que son bien conocidas en la industria incluyendo mas desprotecciones; y tambien pueden ser administrados como inmuno-adyuvantes que actuan ya sea directamente o despues de una conversion in vivo a un compuesto donde cada uno de R2, R3, R4 y R5 es H.

[0044] En la formula I, X es preferiblemente una cadena lineal o un hidrocarbono ramificado que tiene 4-30 carbonos, y preferiblemente contiene a 10-30 carbonos. Los grupos alquilos de cadenas lineales que tienen 20-30 carbonos son preferidos, y un grupo alquilo de 25 carbonos a veces es preferido. Frecuentemente, X es un grupo alquilo, pero en algunas secciones es un grupo alquenilo o un grupo alquinilo. X puede no ser sustituido o puede ser sustituido con uno o mas sustituyentes adecuados para un grupo alquilo. Sustituyentes preferidos para X incluyen a halos, particularmente a F; y alcoxis, particularmente a alcoxis C1-C6 tales como metoxis, etoxis, isopropoxis y similares.

[0045] Y puede ser un alquileno C1-C6 o un alquileno C 2-C6, y puede ser no sustituida o puede ser sustituida con uno o mas grupos que a menudo son seleccionados de halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6, e hidroxilo cuando Y es un alquileno. Cuando Y es un alquenileno, los sustituyentes preferidos incluyen a halo, a alquilo C1-C6, a alcoxi C1-C6 y a haloalquilo C1-C6. En los casos en los que 2 sustituyentes estan presentes en Y, ya sea en un carbono individual o en carbonos conectados adyacentemente, los sustituyentes pueden ser apuntados entre si para formar un anillo que tenga de 5-6 miembros y opcionalmente tenga hasta 2 heteroatomos seleccionados de N, O y S en calidad de miembros anulares. En algunas secciones, Y es CH2 o CH2CH2 o (CH2)3 o (CH2)4, o una version en la cual el hidroxilo ha sido sustituido de uno de estos. En otras secciones, Y es -CH(OH)- CH(OH)-CH2-. En ciertas secciones, -Y-Z es representado por esta formula:

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[0046] Z es un grupo -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroatomo dentro de su estructura, cuyo heteroatomo es a veces O y a veces N o S, y R1 puede ser no sustituido o puede ser sustituido. Preferiblemente R1 es un grupo alquilo C4-C20 que puede ser no sustituido o puede ser sustituido, o es un grupo de la formula general -(CH2)m-OR1b, donde m es 1-6 y R1b es un grupo alquilo, un cicloalquilo, o un cicloalquilalquilo C1-C16, y R1b puede ser no sustituido o puede ser sustituido con los grupos presentes comunmente en los grupos alquilos, tales como un hidroxilo, un alcoxi C1-C6, un halo, y similares.

[0047] En ciertas modalidades de Z, R1 es una cadena alquilena C1-C6 enlazada a un anillo cicloalquilo, arilo o heteroarilo, por ejemplo, un grupo de la formula -(CH2)r-Rg donde r es un numero entero desde 1-6 y Rg representa un anillo que puede ser un anillo alicfclico o heterocfclico de 3-8 miembros, o un grupo aromatico o heteroaromatico de 5-10 miembros; y Rg puede ser sustituido. Ejemplos adecuados incluyen a -(CH2)2-4-Rg, donde Rg es un grupo monocfclico de 3-8 miembros, tal como ciclopropilos, ciclopentilos, ciclohexilos, furanilos, tetrahidrofuranilos, piranilos, tetrahidropiranilos, fenilos, piridilos, pirimidinilos, tienilos, y similares.

[0048] La presentacion tambien suministra un metodo sintetico nuevo que involucra formar al enlace glucosfdico entre la galactosa y la porcion aglicona que adhiere al carbono anomerico del anillo galactosilo antes de la formacion de la porcion lfpida de la porcion esfingosina. Tambien suministra intermedios utiles de la formula (Ila) e (Ilb) para elaborar a compuestos del invento. Por lo tanto, la presentacion suministra metodos para elaborar a los compuestos de la formula I tal como se describe anteriormente, utilizando intermedios de la formula general IIa o IIb:

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donde Nx es un grupo nitrogeno protegido, tal como en N3, NHC(O)X, NHC(O)J, o una imida tal como una succinimida o unaftalimida; donde J puede ser un grupo alquilo C1-C10 sustituido opcionalmente o un alcoxi C1-C10 sustituido opcionalmente o benciloxi sustituido opcionalmente; y Y y R2, R3, R4 y R5 son tal como se definen en la formula I.

[0049] Para los compuestos de la formula Ila e Ilb, cada uno de R2-R6 es preferiblemente un grupo protector, y no H. Grupos protectores preferidos incluyen a grupos removidos facilmente bajo condiciones reductoras o hidrogenolfticas, tales como el bencilo, el difenilmetilo, el benciloximetilo, el benciloxicarbonilo, y similares.

[0050] Ciertos compuestos del invento pueden ser obtenidos de intermedios comunes de este tipo, tal como se ilustra con los compuestos 7 y 10, utilizando metodos que son conocidos generalmente en la industria. Los intermedios que se muestran como ejemplo por los compuestos 7 y 10 son entregados convenientemente de un disacarido protegido apropiadamente de a-D-galactopiranosil-(1-5)-lixofuranosa, en el cual la partfcula lixosa es la precursora de la parte polar del analogo de esfingosina, tal como se muestra mas adelante. Otros compuestos del invento pueden ser hechos similarmente, utilizando materiales iniciales alternativos en vez de la lixofuranosa, para suministrar intermedios tales como Ila e Ilb. Estos contienen un grupo Nx que puede ser acilamina - NHC(O)X de la formula I, o puede ser un nitrogeno protegido tal como azida (-N3) o una succinimida o una amina acilada -NHC(O)J que puede ser cubierta en una amina libre (-NH2) o en la acilamina - NHC(O)X de la formula I por medio de metodos convencionales. En estas aminas aciladas, J puede ser un grupo alquilo C1-C10 sustituido opcionalmente, tal como el trifluorometilo o el triclorometilo; o puede ser un grupo alquioxi C1-C10 sustituido opcionalmente, tal como metoxi, etoxi, 2,2,2-tricloroetoxi, o t-butoxi; o puede ser un grupo benciloxi sustituido opcionalmente tal como benciloxi, metoxibenciloxi, dimetoxibenciloxi y similares. Estos pueden ser removidos del nitrogeno para suministrar a una amina libre (NH2) por medio de metodos ampliamente conocidos en la industria, y la amina libre (NH2) puede ser acilada usando condiciones convencionales de acilacion para introducir al grupo -C(O)X de la formula I. La azida puede ser reducida y acilada similarmente tal como se muestran en los ejemplos de este documento. En los casos en que Nx es una imida, esta puede ser convertida a la amina libre por metodos conocidos tales como el tratamiento con hidracina.

[0051] Los intermedios 7 o 10 puede ser aquilatados en el grupo hidroxilo libre o modificados en cualquiera de otras numerosas formas para generar a varios compuestos del invento, que contienen a varios grupos R1 que pueden ser lineales o ramificados, saturados o insaturados, y pueden contener a anillos alifaticos o aromaticos, heteroatomos u otros grupos funcionales. Ejemplos representativos de aquellos metodos incluyen a la alquilacion de un compuesto alcoholico de la formula IIa con un agente alquilante R1-LG1, y la alquilacion de un alcohol de la formula R1-OH con un compuesto de la formula IIb, bajo condiciones conocidas tales como las condiciones de eter de Williamson, donde la base es utilizada para promover la reaccion de alquilacion, y las condiciones Mitsunobu, donde una fosfina y un azodicarboxilato son usados comunmente para promover la reaccion de alquilacion.

[0052] Un intermedio de la formula IIa podrfa ser O-alquilado con un agente alquilante LG1-R1 para producir un compuesto de la formula I. R1 puede ser cualquiera de los grupos descritos anteriormente para R1 en la formula I. Alternamente, un intermedio de la formula IIb que tiene un grupo que abandona LG2 podrfa ser preparado, por ejemplo, de un compuesto de la formula IIa por medio de sistemas convencionales tales como una sulfonacion con un cloruro de sulfonilo o anhfdrido sulfonico, o una conversion a un alumno utilizando condiciones conocidas tales

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como CBr4 y trifenilfosfina. El compuesto de la formula Ilb es utilizado entonces para alquilatar un alcohol de la formula HBO-R1, suministrando un compuesto de la formula I. R1 en estas condiciones es tal como se definio anteriormente, y puede estar en una forma protegida, si comprende a un hidroxilo libre o a una amina libre. LG1 y LG2 en estas reacciones representan a grupos convencionales que abandonan, y a menudo son seleccionados de Cl, Br, I, y sulfonatos de alquilos o de arilos sustituidos opcionalmente, por ejemplo, -OSO2-J', donde J' es un alquilo C1-C10 sustituido opcionalmente o un arilo sustituido opcionalmente. Sulfonatos de alquilos o arilos adecuados que LG1 y/o LG2 pueden representar incluyen, por ejemplo, a mesilato (metanosulfonato), tosilato (toluenesulfonato), fenilsulfonato,trifluorometilsulfonato(triflato), y similares.

[0053] Mientras se ilustra por medio de esquemas y de ejemplos utilizando a grupos protectores especfficos en el grupo de galactosas, otros grupos protectores pueden ser utilizados tal como es conocido en la industria y tal como se debate en este documento brevemente. Grupos y metodos protectores adecuados para instalar y removerlos son descritos en Wuts y Greene, Protective Groups in Organic Synthesis (Grupos Protectores en Sfntesis Organica), 4a ed., Wiley Press (2006).

[0054] El esquema 1 ilustra la preparacion de intermedios 7. Reactivos y condiciones: a) oxido de tri-(1-pyrrolidina)- fosfina, b) i. tBuOK, DMSO, 80°C; ii. I2, piridina/H2O; c) NaBH4, EtoH; d) PivCl, piridina, DCM, temperatura del cuarto.; e) cloruro de clorometanosulfonilo, piridina; f) NaN3, DMF, 85°C; g) Bu4NOH (40%aq), dioxano. Esquema 1 tal como se muestra a continuacion:

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[0055] Tal como una persona con conocimiento normal en la industria podrfa apreciar, varios grupos Y para compuestos de la formula I pueden ser introducidos al utilizar otros alcoholes en vez de la lixosa protegida en el primer paso del esquema 1. En particular, el uso de otros azucares protegidos puede ser utilizado para introducir variaciones de Y que tengan una estereoqufmica relativa o absoluta diferente de aquella suministrada por la lixosa que se muestran los Esquemas.

[0056] Varios compuestos del invento pueden ser preparados facilmente a partir del compuesto 7 por medio de alquilacion del grupo hidroxi seguido por una reduccion de la azida a una amina, donde la amina puede ser acilada por medio de metodos convencionales para instalar a la porcion -C(O)-X del compuesto de la formula I. Los grupos protectores de bencilo en el anillo galactosilo pueden entonces ser removidos por hidrogenolisis o por otros medios tales como TMSI; y el grupo acetonido puede ser removido bajo condiciones acidas acuosas moderadas tal como se ilustra mas adelante y tal como es conocido en la industria. El orden de estos pasos de desproteccion no es limitado al orden especificado. En los casos en los que otros grupos protectores son utilizados en vez del bencilo, estos pueden ser removidos por medios convencionales tal como se conoce en la industria.

[0057] El esquema 2 ilustra la preparacion del intermedio 10. Reactivos y condiciones: a) catalizador Lindlar, H2, EtOH;

b) acido hexacosanoico, EDC, HOBT, DIPEA; c) Bu4NOH (40%aq), dioxano. Esquema 2 tal como se muestra continuacion:

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[0058] Asimismo, el compuesto 10 o un analogo del compuesto 10 que tenga un grupo X diferente puede ser utilizado como un precursor para la smtesis de los compuestos donde el grupo Z ha sido variado. Z puede ser introducido por medio de una variedad de metodos conocidos, mas notablemente una alquilacion directa del hidroxilo del compuesto 10 bajo condiciones basicas, utilizando agentes alquilantes convencionales tales como haluros de alquilo o sulfatos de alquilo o sulfonatos de alquilo (por ejemplo, el mesilato o el tosilato, etc.). Una vez que los grupos X y Z deseados han sido instalados, el compuesto puede ser desprotegido tal como se menciono anteriormente. Por lo tanto, al utilizar a los metodos ilustrados en este documento, varios compuestos del invento pueden ser preparados.

[0059] El esquema 3 ilustra el uso de 2 intermedios comunes 7 y 10 para generar a ciertos oxa-analogos de a- GalCer por medio de la alquilacion del grupo hidroxilo, la introduccion del acido graso (solamente para 11) y la desproteccion para suministrar a los compuestos seleccionados de la formula I.

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[0060] Reactivos y condiciones: a) KOH, 18-corona-6, nBuOCH2CH2OMs, THF; b) NaH, nBuOCH2CH2OMs, DMF; c) i. Catalizador Lindlar, H2, EtOH; ii. Acido hexacosanoico, EDC, HOBT, DIPEA; c) i. 4 N HCl en dioxano, DCM- MeOH 5:1, ii.

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[0061] Los compuestos 14-16 fueron elaborados similarmente, utilizando diferentes agentes de alquilacion para el

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paso (b). Otros compuestos de la formula I que tienen diferentes grupos X, Y y Z son preparados facilmente por medio de estos metodos utilizando materiales de inicio que pueden encontrarse facilmente en la industria.

[0062] En alguna seccion, los compuestos del invento son solubles en agua y en soluciones acuosas. Por ejemplo, el compuesto 15 es soluble en agua. En algunas secciones, los compuestos del invento tienen una solubilidad de por lo menos alrededor de 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, 7.5 mg/mL, 10 mg/mL, 12.5 mg/mL, 15 mg/mL, 17.5 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 75 mg/mL, 100 mg/mL, 150 mg/mL o 200 mg/mL en una solucion acuosa. En otras secciones, los compuestos del invento tienen una solubilidad acuosa mejorada por sobre otros compuestos comparables.

[0063] La evaluacion biologica de los compuestos del invento usa celulas Va14i NKT de raton inmortalizadas por medio de una funcion celular para generar hibridomas FF13 a traves de la presentacion de APC (THP1). Como una medida de la activacion de las celulas T, la liberacion IL2 en el medio del cultivo fue determinada despues de 48 horas de cultivo por medio de un ensayo ELISA.

[0064] Los resultados demostraron que los oxa-analogos de glucolfpidos sinteticos de a-GalCer son capaces de estimular una liberacion significativa de IL2 cuando son presentados por el APC a hibridomas de raton. Una comparacion con a-GalCer revelo que ellos tienen actividades similares, y algunos de los compuestos nuevos del invento son mas eficientes. El reemplazo de un grupo metileno de a-GalCer por un atomo de oxfgeno no interfiere con la funcion de estos compuestos una vez que estan cargados en el CD Id, y pueden hacerlos mas viables para cargarse en el CD Id y mejorar sus propiedades farmacocineticas. Por lo tanto, los compuestos de la formula I pueden ser utilizados en conjunto con por lo menos un antfgeno para incrementar la respuesta inmunologica provocada por el antfgeno. Por lo tanto, los compuestos del invento pueden ser utilizados en combinacion con uno o mas antfgenos que son utilizados para vacunaciones para incrementar la potencia del antfgeno y de la vacuna.

Sistemas de entrega

[0065] Las composiciones del invento podrfan incluir a por lo menos un compuesto de la formula 1 mezclado con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables. Aquellas composiciones podrfan ser administradas con una vacuna para vacunar a un sujeto, o podrfan ser entregadas en el mismo dfa que una vacuna es administrada al sujeto que va a ser vacunado. Frecuentemente el compuesto es mezclado con un antfgeno o con una vacuna, y los 2 son administrados como una sola dosis, ya sea por inyeccion o por ingestion o de otra forma. Comunmente el compuesto sera administrado como parte de un sistema de entrega de antfgenos, y mas comunmente es mezclado con un antfgeno o una vacuna en una sola composicion, que podrfa ser cualquier composicion de vacuna adecuada. Sistemas adecuados incluyen a emulsiones, a liposomas y a micropartfculas. Por lo tanto, una composicion podrfa comprender, por ejemplo, a una emulsion de aceite en agua a la cual se han agregado los agonistas descritos anteriormente, a liposomas que contienen a los agonistas descritos anteriormente o micropartfculas que contienen y/o presentan a los agonistas mencionados anteriormente.

Emulsiones

[0066] Las emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite son conocidas por su uso en vacunas. Las emulsiones O/W (aceite/agua - oil/water) son preferidas, y estas comunmente incluyen a por lo menos un aceite y a por lo menos un surfactante, con el o los aceites y el o los surfactantes siendo biodegradables (capaces de metabolizarse) y biocompatibles. Las gotas de aceite en la emulsion son en general menores a 5 pm de diametro, y podrfan incluso tener un diametro de sub-micrones, con estos tamanos pequenos siendo alcanzados con un microfluidizador para suministrar emulsiones estables. Gotas con tamanos menores que 220 nm son preferidas puesto que pueden ser sujetas a una esterilizacion de filtros.

[0067] El invento puede ser utilizado con aceites tales como aquellos de una fuente animal (tales como de pescado) o vegetal. Las fuentes para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de nuez, el aceite de soya, el aceite de coco, y el aceite de oliva, son los que pueden encontrarse mas facilmente, y son ejemplos de aceite de nuez. El aceite de jojoba tambien puede ser utilizado, por ejemplo, siendo obtenido del grano de la jojoba. Los aceites de semillas incluyen al aceite de cartamo, al aceite de semilla de algodon, al aceite de semilla de girasol, al aceite de semilla de sesamo, y similares. En el grupo de los granos, el aceite de mafz es el que puede encontrarse mas facilmente, pero el aceite de otros granos de cereales tales como el trigo, de la avena, del centeno, del arroz, del teff, de triticale y similares podrfan ser utilizados. Esteres de acidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanediol, aunque no ocurren naturalmente en aceites de semillas, podrfan ser preparados por medio de una hidrolisis, una separacion y una esterificacion de los materiales apropiados a partir de aceites de nueces y semillas. Grasas y aceites de leche de mamfferos son capaces de metabolizarse y podrfan, por lo tanto, ser utilizadas en la practica de este invento. Los procedimientos para la separacion, purificacion, saponificacion y otras formas necesarias para obtener aceites puros de fuentes animales son conocidas en la industria. La mayorfa de peces contienen aceites son capaces de metabolizarse que podrfan ser recuperados facilmente. Por ejemplo, el aceite de hfgado de bacalao, aceites de hfgado de tiburones, y aceites de ballenas tales como esperma de ballena son ejemplos de algunos de los aceites de pescados que podrfan ser utilizados en este documento. Un numero de aceites de cadenas ramificadas son sintetizados bioqufmicamente en unidades de isopreno de 5-carbonos y son

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generalmente denominadas de terpenoides. El aceite de hfgado de tiburon contiene un terpenoide ramificado y no saturado conocido como el escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, el cual es particularmente preferido en este documento. El escualano, el analogo saturado del escualeno, tambien es un aceite preferido. Los aceites de pescado, incluyendo al escualeno y al escualano, son faciles de encontrar fuentes comerciales o podrfan ser obtenidos por medio de metodos conocidos en la industria. Otros aceites preferidos que pueden utilizarse son los tocoferoles, incluyendo a los tocoferoles a, p, y, 6, £ o ^, pero los que utilizan a tocoferoles a son los preferidos (por ejemplo, DL-a-tocoferol). Tambien pueden utilizarse mezclas de aceites.

[0068] Los surfactantes pueden ser clasificados por su 'HLB' (balance hidrofilo/hidrofilo - hydrophile/lipophile balance). Los surfactantes preferidos del invento tienen un HLB de por lo menos 10, preferiblemente por lo menos 15, y mas preferiblemente por lo menos 16. El invento puede ser utilizado con surfactantes incluyendo, pero sin limitarse a: surfactantes de esteres de sorbatano de polioxietileno (comunmente denominados Tweens), especialmente polfticasorbato 20 y polisorbato 80; copolfmeros de oxido de etileno (EO - ethylene oxide], oxido de propileno (PO - propylene oxide), y/o oxido de butileno (BO - butylene oxide), vendidos bajo la marca comercial DOWFAX™, tal como copolfmeros de bloqueo lineal de EO/PO; octoxinoles, que podrfan variar de numero de grupos repetitivos etoxi (oxi-1,2-etanediilo), con el octoxinol-9 (Triton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interes; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolfpidos tales como la fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonifenoles, tales como las series Tergitol™ NP; esteres grasos de polioxietileno derivados de aceites de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como surfactantes Brij), tales como el eter de monolaurilo de trietilenglicol (Brij 30); y esteres de sorbitano (conocidos comunmente como SPANs), tales como trioleato de sorbitano (Span 85) y monolaurato de sorbitano. Surfactantes no ionicos son preferidos. Surfactantes preferidos para incluirse en emulsiones son el Tween 80 (monooleato de sorbitano de polioxietileno), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina o Triton X-100.

[0069] Mezclas de surfactantes pueden ser utilizadas, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. Una combinacion de un ester de sorbitano de polioxietileno tal como un monooleato de sorbitano de polioxietileno (Tween 80) y un octoxinol tal como el t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) tambien es adecuada. Otra combinacion util comprende a laureth 9 con un ester de sorbitano de polioxietileno y/o un octoxinol.

[0070] Montos preferidos de surfactantes (% masa) son: los esteres de polioxietileno (tales como Tween 80) del 0.01 al 1%, en particular alrededor del 0.1 por ciento; octil- o polioxietanoles de nonilfenoxis (tales como el Triton X-10, u otros detergentes en las series Triton) del 0.001 al 0.1 por ciento, en particular del 0.005 al 0.02 por ciento; esteres de polioxietileno (tales como laureth 9) del 0.1 a 20%, preferiblemente del 0.1 al 10% y en particular del 0.1 al 1% o alrededor de 0.5 por ciento. Adyuvantes especfficos de emulsiones de aceite en agua utiles para el invento incluyen, pero no se limitan a:

• Una emulsion de escualeno, Tween 80, y Span 85. La composicion de la emulsion en lo que se refiere al volumen puede ser alrededor del 5% de escualeno, alrededor del 0.5 por ciento de polisorbato 80 y alrededor de 0.5 por ciento de Span 85. En terminos de masa, estos indices se vuelven 4.3 por ciento de escualeno, 0.5 por ciento de polisorbato 80 y 0.48 por ciento de Span 85. El adyuvante es conocido como 'MF59'. La emulsion MF59 incluye ventajosamente a iones de citrato, por ejemplo, 10 mM de amortiguador de citrato de sodio.

• Una emulsion submicronica de escualeno, un tocoferol, y Tween 80. La emulsion podrfa incluir a una sustancia salina amortiguada de fosfato. Tambien podrfa incluir a Span 85 (por ejemplo, al 1%) y/o lecitina. Estas emulsiones podrfan tener desde el 2 al 10% de escualeno, desde el 2 al 10% de tocoferol y desde el 0.3 al 3% de Tween 80, y el fndice de masa de escualeno:tocoferol es preferiblemente <1 puesto que suministra una emulsion aceptable. El escualeno y el Tween 80 podrfan estar presentes a un fndice de volumen de alrededor de 5:2. Una emulsion como esas puede ser hecha al disolver a Tween 80 en PBS para generar el 2% de la solucion, luego mezclar a 90 ml de esta solucion con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5ml scualeno), y luego microfluidizar a la mezcla. La emulsion resultante puede tener gotas submicronicas de aceite, por ejemplo, con un diametro promedio de entre 100 y 250 nm, preferiblemente alrededor de 180 nm.

• Una emulsion conformada de un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsion podrfa incluir estos 3 componentes a un fndice de masa de alrededor de 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/mililitros de polisorbato 80, 100 pg/mililitro de Triton X-100 y 100 pg/mililitro de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deberfan incluir cualquier contribucion de estos componentes de antfgenos. La emulsion tambien podrfa incluir a escualeno. La emulsion podrfa incluir a 3d-MPL. La fase acuosa podrfa contener a un amortiguador de fosfato.

• Una emulsion de escualeno, polisorbato 80 y poloxamero 401 ("Pluronic™ L121"). La emulsion puede ser

formulada en una sustancia salina amortiguada de fosfato, pH 7.4. La emulsion es un portador util de entrega para dipeptidos de muramilo, y ha sido utilizada con treonil-MDP en el adyuvante “SAF-1” (0.05-1% de Thr- MDP, 5% de scualano, 2.5% de Pluronic L121 y

0.2% de polysorbate 80). Tambien puede ser utilizado sin el Thr-MDP, tal como en el adyuvante “AF” (5% de escualeno, 1.25% de Pluronic L121 y 0.2% polisorbato 80). Se prefiere la micro-fluidizacion. Hariharan, et al., Cancer (Cancer) Res. Vol 55, 3486-89 (1995).

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• Una emulsion de escualeno, un tocoferol, y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsion tan bien podrfa incluir a un 3d-MPL. La emulsion podrfa contener a un amortiguador de fosfato.

• Una emulsion que tiene entre 0.5-50% de un aceite, entre 0.1-10% de fosfolfpidos, y entre 0.05-5% de un surfactante no ionico. Tal como se describio en I WO 95/11700, componentes preferidos fosfolfpidos son la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol, el fosfatidilglicerol, el acido fosfatfdico, la esfingomielina y la cardiolipina. Tamanos submicronicos de tienen ventajas.

• Una emulsion submicronica de aceite en agua de un aceite que no puede metabolizarse (tal como un aceite mineral ligero) y por lo menos un surfactante (tal como la lecitina, el Tween 80 y el Span 80). Podrfan incluirse aditivos, tal como la saponina de QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipofilo (tal como el GPI-0100, producido al agregar a aminas alifaticas a desacilsaponina por medio del grupo carboxilo del acido glucuronico), bromuro de dimetildioctadecilamonio y/o (2-hidroxietil)propanediamina de N,N-dioctadecil-N,N-bis.

• Una emulsion en la cual una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) son asociados como micelas helicoidales. Refierase a WO2005/097181.

• Una emulsion que comprende a un aceite mineral, a un alcohol graso no ionico lipofflico etoxilado y a un surfactante no ionico hidrofflico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolfmero de bloqueo de polioxietileno-polioxipropileno). Refierase a WO2006/113373.

• Una emulsion que comprende a un aceite mineral, un alcohol etoxilado no ionico hidrofflico, y un surfactante no ionico lipofflico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolfmero de bloqueo de polioxietileno- polioxipropileno). Refierase a WO2006/113373.

Emulsiones de aceite en agua que comprenden a escualeno, con un diametro submicronico de gotas de aceite, son ideales.

Liposomas

[0071] Los liposomas son estructuras vesiculares que se basan en bicapas lfquidas que rodean a los compartimientos acuosos. Varios tipos de liposomas son conocidos en la industria. Pueden variar ampliamente en relacion a sus propiedades ffsico - qufmicas tales como su tamano, la composicion lipfdica, la carga superficial (cationica, neutral o anionica) y el numero y fluidez de las bicapas de fosfolfpidos. Por ejemplo, podrfan estar compuestas de solamente fosfolfpidos (neutrales y/o cargados negativamente) y/o colesterol. Podrfan ser mono- o multi-lamelares. Su utilizacion como adyuvantes es descrita en, por ejemplo, U.S. 6,090,406; US 5,916,588; EP-A- 0626169.

Micropartfculas

[0072] Las micropartfculas han sido descritas para su uso como adyuvantes en, por ejemplo, refierase a WO 98/33487 y a Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols, (Adyuvantes de Vacunas: Metodos de Preparacion y Protocolos de Investigacion) vol. 42 of Methods in Molecular Medicine (volumen 42 de Metodos en Medicina Molecular), O'Hagan, ed.. Micropartfculas preferidas son hechas de polfmeros biodegradables y no toxicos. Por ejemplo, podrfan ser hechas de un polfmero seleccionado de un grupo que consiste de: un poli(acido de a- hidroxi), un acido butfrico de polihidroxi, una policaprolactona, un poliortoester, un polianhfdrido, y un policianoacrilato. Copolfmeros de estos polfmeros pueden ser utilizados, por ejemplo, un copolfmero de D,L-lactida y caprolactona.

[0073] Polfmeros preferidos son poli(acidos de a-hidroxi), mas preferiblemente aquellos seleccionados del grupo que consiste de poli(L-lactida), poli(D,L-lactida) y poli(D,L-lactida-co-glicolido). Los polfmeros mas preferidos son los polfmeros de poli(D,L-lactida-co-glicolido), referidos como 'PLG'. Polfmeros poli(D,L-lactida-co-glicolido) preferidos son aquellos que tienen una tasa molar lactida/glicolido en el rango de 25:75 a 75:25, mas preferiblemente 40:60 a 60:40 por ejemplo, alrededor de 50:50. Un polfmero PLG con una mezcla 50:50, que contiene el 50% de D,L-lactida y el 50% de glicolido, suministrara copolfmeros de rapida reabsorcion mientras que un PLG con una mezcla 75:25 se degradara mas lentamente, y una mezcla 85:15 y 90:10, aun mas lentamente, debido a la componente lactida incrementada.

[0074] Estos polfmeros estan disponibles en una variedad de masas moleculares, y la masa molecular apropiada para un antfgeno especffico es determinada facilmente por una persona con conocimiento en la industria. Para las polilactidas, por ejemplo, una masa molecular adecuada estara en alrededor de 2000 a 5000. Para los PLG, masas moleculares adecuadas generalmente estaran en el orden de alrededor de desde 10,000 a alrededor de 200,000, preferiblemente desde alrededor de 15,000 a alrededor de 150,000, y mas preferiblemente desde alrededor de 50,000 a alrededor de 100,000. Un rango util es desde 30,000 Daltons a 70,000 Daltons.

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[0075] Las micropartfculas pueden tener un diametro en el rango de ~100nm a ~150 pm, mas preferiblemente entre ~200nm a - 30 pm de diametro, y mas preferiblemente desde ~500nm a ~10 pm de diametro. Comunmente seran sustancialmente esfericas.

[0076] Las micropartfculas pueden ser hechas en varias formas. Por ejemplo, tecnicas de doble evaporacion de emulsiones/solventes son conocidas, que involucran la formacion de una emulsion primaria que consiste de gotas de una solucion polimerica, que subsiguientemente es mezclada con una fase acuosa continua que contiene a un estabilizador/surfactante de partfculas. Mas particularmente, un sistema de evaporacion de solventes de agua en aceite en agua (w/o/w - water- in-oil-in-water) puede ser utilizado para formar a las micropartfculas. En esta tecnica, el polfmero particular es combinado con un solvente organico, tal como el acetato etflico, el dimetilcloruro (tambien llamado cloruro de metileno y diclorometano), acetonitrilo, acetona, cloroformo, y similares. El polfmero sera suministrado a alrededor de 2-15% mas preferiblemente alrededor del 4-10% y mas preferiblemente, una solucion del 6%, en un solvente inorganico. La solucion polimerica es emulsionada entonces utilizando, por ejemplo, un homogeneizador. La emulsion es combina entonces con un volumen mas grande de una solucion acuosa de un estabilizador de emulsiones tales como el alcohol polivinflico (PVA - polyvinyl alcohol) o la pirrolidona de polivinilo. El estabilizador de emulsiones es suministrado comunmente en alrededor del 2-15% de la solucion, mas comunmente a alrededor del 4-10% de la solucion. La mezcla es homogenizada entonces para producir una emulsion doble w/o/w estable. Los solventes organicos son evaporados entonces. Los parametros de la formulacion pueden ser manipulados para permitir la preparacion de micropartfculas pequenas (inferiores a 5 pm) y grandes (superiores a 30 pm). Por ejemplo, una agitacion reducida resulta en micropartfculas mas grandes, tal como lo hace un incremento en el volumen de la fase interna. El tamano de las partfculas puede ser determinado por medio de metodos rutinarios.

[0077] Asf como el uso de tecnicas de emulsiones dobles, las tecnicas de emulsiones individuales tambien pueden ser utilizadas. Las micropartfculas tambien puede ser formadas utilizando un secado de aerosol y coacervacion, o por medio de tecnicas de recubrimiento de suspension neumatica, tal como un revestimiento de bandeja y recubrimiento de Wurster. Tambien se puede utilizar la gelificacion ionica.

[0078] Despues de la preparacion, las micropartfculas pueden ser almacenadas tal como estan, o pueden ser congeladas-secadas para usos adicionales.

[0079] Las micropartfculas pueden ser tratadas opcionalmente para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo, con un detergente cationico, al como CTAB). Cambios en las caracterfsticas de la superficie pueden transformar las caracterfsticas de adsorcion de acuerdo al antfgeno que debe ser adsorbido.

Componentes inmunoactivos adicionales

[0080] Adicionalmente a los compuestos aquf descritos, composiciones del invento podrfan incluir a componentes inmunoestimuladores adicionales. Por ejemplo, podrfan incluir uno o mas de los siguientes: una sal de aluminio; una sal de calcio; una citocina; un ligando de CD40; una saponina; y/o un complejo inmuneestimulatorio (ISCOM - immunostimulatory complex). En algunas secciones, sin embargo, la composicion no contiene a aquellos componentes inmunesestimulatorios adicionales.

Sales de aluminio

[0081] Las sales de aluminio podrfan o no podrfan estar incluidas en las composiciones del invento. Sales adecuadas incluyen a adyuvantes conocidos en la industria como hidroxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero son utilizados unicamente por conveniencia, puesto que una descripcion precisa del compuesto qmmico real no esta presente. El invento puede utilizar cualquiera de los adyuvantes “hidroxido” o “fosfato” que en general se los usa como adyuvantes.

[0082] Los adyuvantes conocidos como “hidroxido de aluminio” son comunmente sales de oxihidroxido de aluminio, que usualmente son por lo menos parcialmente cristalinas. El oxihidroxido de aluminio, que puede ser representado por la formula AlO(OH), puede ser distinguido de otros compuestos de aluminio, tales como el hidroxido de aluminio Al(OH)3, por medio de espectroscopia de infrarrojo (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorcion a 1070 cm-1 y un arcen fuerte de 3090-3100cm'. Diseno de las vacunas, ch. 9. El nivel de cristalinidad de un adyuvante de hidroxido de aluminio es reflejado por el ancho de la banda de difraccion a una altura media (WHH - width of the diffraction band at half height), con partfculas con una mala cristalinidad que muestran una mayor amplitud de lfnea debido a tamanos mas pequenos de los granos. El area superficial se incrementa en la medida que se incrementa la WHH, y adyuvantes con valores de WHH mas altos han demostrado tener una mayor capacidad para una adsorcion de antfgenos. Una morfologfa fibrosa (por ejemplo, como la observada en los micro graficos de transmision de electrones) es comun para adyuvantes de hidroxido de aluminio. El pH de adyuvantes de hidroxido de aluminio es comunmente alrededor de 11, es decir, el adyuvante si tiene una carga superficial positiva a un pH fisiologico.

[0083] Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son comunmente hidroxifosfatos de aluminio, que a

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menudo tambien contienen un monto pequeno de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Podrfan obtenerse por medio de precipitaciones, y las condiciones y concentraciones de reaccion durante la precipitacion afectan al grado de fusion del fosfato para el hidroxilo en la sal. Los hidroxifosfatos generalmente tienen una tasa molar de PO4/Al de entre 0.3 y 1.2. Los hidroxifosfatos pueden distinguirse de AlPO4 rfgidos por la presencia de grupos hidroxilos. Por ejemplo, una banda del espectro IR a 3164 cm-1 (por ejemplo, cuando se lo calienta a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales. VACCINE DESIGN: THE SUBUNIT AND ADJUVANT APPROACH (DISENO DE LAS VACUNAS: EL METODO DE LA SUBUNIDAD Y DEL ADYUVANTE) (Powell y Newman, eds.), ch. 9, Plenum Press (1995).

[0084] La tasa molar PO4/Al3+ de un adyuvante de fosfato de aluminio generalmente sera de entre 0.3 y 1.2, preferiblemente de entre 0.8 y 1.2, y mas preferiblemente 0.95 ± 0.1. El fosfato de aluminio generalmente sera amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un ayudante comun es el hidroxifosfato amorfo de aluminio con una tasa molar PO4/Al de entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio generalmente sera especffico (por ejemplo, morfologfa similar a placas tal como se ha observado en micrograficos de electrones de transmision). Diametros comunes de las partfculas estan en el rango de 0.5-20 pm (por ejemplo, alrededor de 5-10 pm) despues de cualquier adsorcion de antfgenos.

[0085] El punto de carga cero (PZC - point of zero charge) de los fosfatos de aluminio tiene una relacion inversa al nivel de sustitucion de fosfato por hidroxilo, y este nivel de sustitucion puede variar dependiendo de las condiciones y la concentracion de reaccion de los reactivos utilizados para preparar a la sal por medio de precipitaciones. El PZC tambien es alterado al cambiar la concentracion de los iones de fosfato libres en la solucion (mas fosfato = mas PZC acido) o al agregar un amortiguador tal como el amortiguador de histidina (hace al PZC mas basico). Los fosfatos de aluminio utilizados de acuerdo al invento generalmente tendran un PZC de entre 4.0 y 7.0, mas preferiblemente entre 5.0 y 6.5, por ejemplo, alrededor de 5.7.

[0086] Es posible utilizar una mezcla de un hidroxido de aluminio y un fosfato de aluminio. En este caso podrfa haber mas fosfato de aluminio que hidroxido, por ejemplo, una tasa de masa de por lo menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

[0087] La concentracion de Al+++ en una composicion para su administracion a un paciente es preferiblemente menor que 10 mg/mililitro, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un rango preferido esta entre 0.3 y 1 mg/mililitro. Un maximo de 0.85 miligramos/dosis es preferido.

Sales de calcio

[0088] Una composicion del invento podrfa o no podrfa incluir a un adyuvante de fosfato de calcio. Varias formas adecuadas de fosfato de calcio son conocidas, tal como se describe en mas detalle a continuacion.

[0089] El Diseno de la vacuna, capftulo 8, explica como antfgenos pueden ser adsorbidos al fosfato de calcio ya sea por precipitaciones in situ de la sal en la presencia de los antfgenos o por medio de la adsorcion a una sal pre- formada.

[0090] Otros adyuvantes conocidos incluyen al fosfato de calcio. En vez de ser estrictamente Ca3(PO4)2, se informa que los adyuvantes son hidroxiapatitas no estequiometricas de la formula Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x y una carga superficial que depende del pH con un punto de carga cero (PZC - point of zero charge) de 5.5. Los adyuvantes pueden formar partfculas similares a agujas que tienen dimensiones de aproximadamente 10 nm x 150 nm, asf como placas de formas irregulares que tienen diametros de aproximadamente 20-30 nm. Composiciones adecuadas de fosfato de calcio son descritas, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos numero 5,676,976; WO 00/46147; WO 03/051394; y en la patente de Estados Unidos numero 6,355,271; y en la patente de Estados Unidos numero 5,851,670.

[0091] La tasa molar de Ca en relacion a P de los adyuvantes de fosfato de calcio puede variar, por ejemplo, de entre 1.35 y 1.83. Las propiedades de adsorcion del adyuvante han demostrado variar dependiendo de las condiciones utilizadas durante la precipitacion, por ejemplo, una mezcla lenta podrfa dar a un adyuvante con una capacidad mas baja de adsorcion que un adyuvante formado por medio de una mezcla rapida.

[0092] El monto de fosfato de calcio, medido como Ca++, podrfa ser de entre 0.1 miligramos/mililitro y 10 mg/mililitro, por ejemplo, de entre 0.5-5 mg/mililitro, preferiblemente de entre 0.75-3 mg/mililitro, de entre 0.9-1.5 miligramos/mililitro, o alrededor de entre 1 mg/mililitro.

[0093] El adyuvante de fosfato de calcio tiene la capacidad de adsorber antfgenos. Para un antfgeno especffico, por lo menos el 80% (por ejemplo, >85%, >90%, >92.5%, >95%, >97.5%, >97.5%, >98%, >99%, >99.5%, etc.) por masa del monto total de aquel antfgeno es adsorbido. Puesto que los adyuvantes de fosfato de calcio son insolubles, comunmente en las partfculas, el nivel de adsorcion puede ser medido convenientemente por medio de un metodo que involucra una centrifugacion y luego la determinacion del monto del antfgeno en uno (o ambos) de los materiales solubles o solidos.

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[0094] El invento puede ser utilizado con una variedad de antfgenos diferentes, incluyendo a antfgenos bacterianos, antfgenos virales, antfgenos de hongos, antfgenos de protozoos, antfgenos relacionados con tumores, etcetera.

[0095] Los antfgenos bacterianos podrfan ser de bacterias incluyendo, pero sin limitarse a: Neisseria (tal como N.meningitidis,N.gonorrhoeae), Streptococcus (tal como S.agalactiae, S.pneumoniae, S.pyogenes, S.mutans), Staphylococcus (tal como S.aureus), Corynebacterium diphtheriae, Clostridium (tal como C.difficle, C.tetani), Vibrio cholerae, Mycobacterium (tal como M.tuberculosis), Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Borrelia burgdorferi, Chlamydia (tal como C.trachomatis, C.pneumoniae), Yersinia pestis, Porphyramonas gingivalis, Moraxella catarrhalis.

[0096] Los antfgenos de protozoos podrfan ser de protozoos incluyendo, pero sin limitarse a: Plasmodium (tal como P.falciparum,P.vivax, P.malariae, P.ovale).

[0097] Los antfgenos virales podrfan ser de virus incluyendo, pero sin limitarse a: el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis E, el virus del polio, el virus de la rabia, el virus de las paperas, el virus del sarampion, el virus de la rubeola, el virus de la varicela, el virus de la influenza, el virus del Nilo occidental, el coronavirus SARS, el virus de inmunodeficiencia humana, el virus sincitial respiratorio, el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de encefalitis japonesa, el virus de encefalitis originada por garrapatas, el virus del herpes simple, el virus de Epstein-barr, el citomegalovirus humano, el virus del papiloma humano.

[0098] Los antfgenos podrfan tomar varias formas, por ejemplo, de bacterias completas, de viriones completos, de bacterias desactivadas, de viriones desactivados, de protefnas purificadas, de sacaridos purificados, de glicoconjugados, etcetera. En vez de administrar una protefna, sin embargo, es posible administrar un acido nucleico que sera interpretado in vivo para suministrar a la protefna in situ.

[0099] Cuando se utiliza a un antfgeno de sacaridos, es conjugado preferiblemente con una protefna portadora para mejorar la inmunogenicidad. Cualquier reaccion de conjugacion adecuada, con cualquier enlazador cuando fuese necesario.

[0100] En algunas secciones, antfgenos pueden ser conjugados con uno de los inmunopotenciadores. Composiciones farmaceuticas

[0101] Las composiciones del invento son farmaceuticamente aceptables. Podrfan incluir a componentes adicionalmente a los inmunopotenciadores de la formula I. Comunmente incluyen a uno o mas portadores farmaceuticos y/o excipientes. Una explicacion detallada de aquellos componentes esta disponible en REMINGTION: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (REMINGTON: LA CIENCIA Y LA PRACTICA DE LOS FARMACOS), 20ma ed. (2000).

[0102] Las composiciones generalmente estaran en una forma acuosa, y frecuentemente seran isotonicas. Para controlar la tonicidad, es preferido incluir una sal fisiologica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que podrfa estar presente en entre 1 y 20 mg/mililitros. Otras sales que podrfan estar presentes incluyen a cloruro de potasio, fosfato de dihidrogeno de potasio, fosfato de sodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etcetera.

[0103] Las composiciones generalmente tendran una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferiblemente entre 240-360 mOsm/kg, y mas preferiblemente caeran dentro del rango de 290-310 mOsm/kg.

[0104] Las composiciones podrfan incluir uno o mas amortiguadores. Amortiguadores comunes incluiran a: un amortiguador de fosfato, un amortiguador de Tris; un amortiguador de borato; un amortiguador de succinato; un amortiguador de histidina (particularmente con un adyuvante de hidroxido de aluminio); o un amortiguador de citrato. Los amortiguadores comunmente estaran incluidos en el rango de desde 5-20 mM.

[0105] El pH de una composicion generalmente estara entre 5.0 y 8.1, y mas comunmente entre 6.0 y 8.0, por ejemplo, entre 6.5 y 7.5, o entre 7.0 y 7.8.

[0106] La composicion es preferiblemente esteril. La composicion es preferiblemente no pirogenica, por ejemplo, que contiene <1 EU (unidad de endotoxinas - endotoxin unit, una medida estandar) por dosis, y preferiblemente inferior a 0.1 EU por dosis. La composicion es preferiblemente libre de gluten. La composicion podrfa incluir a conservantes.

[0107] Las formulaciones podrfan ser preparadas en una forma adecuada para su administracion sistemica. Las formulaciones sistemicas incluyen aquellas disenadas para ser inyectadas (por ejemplo, inyecciones

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intramusculares, intravenosas o subcutaneas) o podrfan ser preparadas para su administracion transdermica, transcutanea, transmucosa u oral. La administracion oral tambien es adecuada. Formas adecuadas incluyen a jarabes, capsulas, tabletas y similares tal como se entiende en la industria. La seleccion de una ruta particular para un sujeto especffico es normal en la industria. Por ejemplo, una entrega rectal a menudo es apropiada en casos en los que el sujeto experimenta nauseas y vomitos que evitan una entrega oral efectiva. Parches transdermicos comunmente son capaces de entregar una dosis de liberacion controlada durante varios dfas, y por lo tanto son adecuados para sujetos para los cuales esto es apropiado.

Metodos de tratamiento

[0108] Las composiciones del invento que comprenden a un compuesto de la formula I donde Y es un enlazador alquileno C1-C6 o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos son adecuados para su administracion a pacientes humanos, y son hechos para su uso en un metodo para elevar una respuesta inmunologica en un paciente, donde dicho metodo comprende el paso de administrar una composicion del invento al paciente. Esto podrfa involucrar a (a) administrar una composicion conformada de inmunopotenciadores y antfgenos, o (b), co-administrar una composicion inmunopotenciadora libre de antfgenos con una composicion que contiene antfgenos.

[0109] El invento tambien suministra una composicion del invento para su uso como un medicamento.

[0110] El invento tambien suministra una combinacion de 2 o mas inmunopotenciadores (tal como se definio anteriormente) para su uso para elevar una respuesta inmunologica de un paciente.

[0111] El invento tambien suministra (i) una combinacion de 2 o mas inmunopotenciadores, tal como se definio anteriormente, y (ii) un antfgeno, para su uso simultaneo por separado o secuencial en la inmunizacion.

[0112] El invento tambien suministra un antfgeno y un inmunopotenciador, tal como se definio anteriormente, para su uso en (a) un metodo para elevar una respuesta inmunologica en un paciente, o (b) un metodo para elevar la respuesta inmunologica en contra de un antfgeno en un paciente.

[0113] La respuesta inmunologica elevada por estos metodos y usos generalmente incluira una respuesta de anticuerpos (o una respuesta de celulas B) y/o una respuesta de celulas T.

[0114] El invento podrfa ser utilizado para elevar una respuesta inmunologica de la mucosa, por ejemplo, incluyendo una respuesta de IgA, tal como una respuesta secretoria de IgA. En vez de eso, o adicionalmente a eso, una respuesta de IgG tambien podrfa ser obtenida.

[0115] Los siguientes ejemplos son presentados para incrementar la comprension de ciertos aspectos y secciones del invento, pero no son considerados como limitantes del enfoque del invento.

Reactivos

[0116] Todos los qufmicos fueron comprados como una clase reactiva y son utilizados sin mas purificaciones. Todos los solventes fueron secados sobre bolsas moleculares de 4 A activadas recientemente.

Informacion general

[0117] La reaccion fue monitoreada con cromatograffa analftica de capa delgada (TLC - thin layer chromatography) en placas de que gel sflice de Merck 60 F254, y visualizadas bajo UV (254) y/o por coloracion con un 5% de H2SO4 en MeOH, molibdato acido de amonio cerico o KMnO4. Se realizo cromatograffa de columna de destellos en gel sflice Macherey-Nagel 60. Se grabaron espectros NMR en un espectrometro NMR de 300 MHz a 25 °C. El cambio qufmico (en ppm) fue determinado en solventes deuterados. Espectros de pruebas de protones adheridos (APT - attached proton test) de 13C fueron obtenidos en un espectrometro 300 (75 MHz) y fueron calibrados en relacion a los solventes deuterados.

Ejemplo 1

Sfntesis del intermedio comun 7

2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosM-(1^5)-2,3-O-isopropilideno-a-D-lixofuran6sido de alilo (1).

[0118] A una solucion de 5 g de bromuro de 2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosilo [Grayson, E. J. et al, J. Org. Chem. (2005), 70, 9740-9754] (8.34 mmol) y 1.5 g de 2,3-O-isopropilideno-a-D-lixofuranosido de alilo (6.42 mmol) en DCM se agregaron 4.4 mL de oxido de oxido de tri-(1-pirrolidina)-fosfina (19.6 mmol) [Mukaiyama, T. y Kobashi, Y., Chem. Lett. (2004), 33, 10-11]. La mexcla fue agitada a la temperatura del cuarto durante 24 horas luego fue diluida con EtOAc y filtrada sobre celita. Despues de la evaporacion del solvente, el crudo fue purificado por medio de una cromatograffa cuidadosa de destellos (tolueno/ EtOAc 95/5) generando 4.12 gramos de 1 (85%).

1H (CDCl3): 67.50-7.19 (m, 20 H), 5.92-5.77 (m, 1 H), 5.33-5.13 (m, 2 H), 5.01 (br s, 1 H), 5.00-4.50 (m, 9 H),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4.47(d,J=11.8, 1 H), 4.41 (d, J = 11.8, 1 H), 4.25 (dt, J = 6.1, J =-3.8, 1 H), 4.13-3.83 (m, 7 H), 3.58-3.51 (m, 2 H); 1.40(s,3H), 1.26 (s, 3 H). 13C (CDCl3): 6139.01, 138.70, 138.00, 128.44,128.40,128.33,117.51,112.57,105.00, 98.00, 85.15,79.83, 79.03, 78.41, 75.07, 74.87, 73.44, 73.17, 73.08, 67.87, 26.17, 25.04. Anal. calcd para: C45H52O10 (752.89) C,71.79; H, 6.96. Encontrado: C, 71.66; H, 6.88.

2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil-(1^5)-2,3-O-isopropilideno-D-lixofuranosa (2).

[0119] A una solucion de 2509 g (3.33 milimoles) de 1 en 34 ml de DMSO seco bajo argon, se agregaron 0.56 gramos (5 mmol) de tBuOK. La mezcla fue agitada durante 1.5 horas a 80 °C. Despues de enfriarse la mezcla fue diluida con EtOAc, la solucion organica fue lavada con agua (x1) y salmuera (x3), secada sobre sulfato de sodio y evaporada. El residuo fue disuelto en 65 ml de THF y a la solucion se agrego 13 ml de agua, 1.1 ml de piridinas y 1.69 gramos (6.66 milimoles) de yodo. Despues de 3 horas a la temperatura del cuarto la mezcla fue diluida con EtOAc, lavada con un 5% de tiosulfato acuoso de sodio, 1N de HCl, una solucion saturada de bicarbonato de sodio, y agua. La solucion fue secada con sulfato de sodio y el solvente fue evaporado. Una cromatograffa de destellos (tolueno/AcOEt 90/10) genero 2.16 gramos de 2 (91%).

*H (CDCl3): 67,49-7,20 (m, 20 H), 5.35 (br s, 1 H), 5.00-4.66 (m, 7 H), 4.60-4.52 (m, 2 H), 4.48-4.35 (m, 3 H), 4.11- 3.95(m, 4 H), 3.91-3.75 (m, 2 H), 3.55-3.44 (br d, 2 H), 3.40 (d, J=6.1, 1 H), 3.28 (br s, 1 H), 1.41 (s, 3H), 1.29 (s,3H).1sC(CDCl3):139.01, 138.75, 138.70, 128.47, 128.44, 128.37, 112.60, 101.13, 98.39, 98.05, 96.83, 85.54, 79.13,78.82,73.50, 73.31, 73.10, 69.33, 69.03, 68.79, 66.50, 66.13, 60.57, 26.15, 25.94, 25.20, 25.00, 21.22, 20.92, 14.30.Anal.calcd para: C42R48O10 (712.82) C, 70.77; H, 6.79. Encontrado: C, 70.92; H, 6.61.

(2R,3S,4R)-3,4-O-isopropilideno-1-O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil)-1,2,3,4,5-pentanepentol (3).

[0120] A una solucion de 2.1 gramos (2.85 milimoles) de 2 en 20 ml de EtOH, se agregaron 140 mg (res. 56 mmol)

de borohidruro de sodio. La mezcla fue agitada durante 2 horas a la temperatura del cuarto. La mezcla fue diluida con EtOAc, lavada con 1N de HCl, una solucion saturada de bicarbonato de sodio y agua. La solucion fue secada con sulfato de sodio y el solvente fue evaporado. Una cromatograffa de destellos (DCM/MeOH 97:3) genero 1.65 gramos de 3 (81%). 1H (CDC13): 7,49-7,20 (m, 20 H), 5.01-4.53 (m, 7 H), 4.47 (d, J = 11.8, 1 H), 4.38 (d, J = 11.8, 1 H), 4.22-3.87 (m, 9 H), 3.81-3.63 (m, 2 H), 3.55-3.44 (m, 2 H), 3.40 (dd, J = 8.8, J = 6.1, 1 H), 2.99 (br s, 1 H), 1.48 (s, 3 H), 1.31 (s, 3 H). 13C (CDCl3): 138.72, 138.55, 138.43, 128.53, 128.37, 128.35, 108.42,

104.53, 98.62, 79.11, 76.17, 74.96, 73.80, 73.65, 73.18, 70.03, 67.74, 61.28, 27.17, 25.18. Anal. calcd para: C42H50O10(714.84) C, 70.57; H, 7.05. Encontrado: C, 70.32; H, 7.25.

(2R,3S,4R)-3,4-O-isopropilideno-5-O-pivaloil-1-O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil)-1,2,3,4,5- pentanepentol (4).

[0121] A una solucion de 1,265 g (1.77 milimoles) de 3 en 28 ml de DCM seco bajo argon a 0 °C, se agregaron 0.65 mililitros de piridinas y 0.66 mililitros (5.3 milimoles) de cloruro de pivaloilo. A la mezcla se le dejo calentarse la temperatura del cuarto y se agito durante la noche. Despues de 26 horas la mezcla fue diluida con EtOAc, lavada con 1N de HCl, y salmuera (3x). La capa organica fue secada con sulfato de sodio y evaporada. La cromatograffa de destellos (Pet. Eter/EtOAc 75:25) genero 1.22 gramos de 4 (86%). 1H (CDCl3): 67.52-7.20 (m, 20 H, ArH) 4.83 (d, J = 3.7, 1 H), 4.92 (d, J = 11.3 Hz, , 1 H), 4.81 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 4.80 (d, J = 11.3 Hz, 1 H), 4.72 (d, J = 11.3 Hz, 1 H), 4.65 (d, J = 11.9 Hz, 1 H), 4.55 (d, J = 11.3 Hz, 1 H), 4.47 (d, J = 11.7 Hz, , 1 H),4.39 (d, J =11.7 Hz, 1 H), 4.264.32 (m, 3 H), 4.20 (m, 1 H), 4.03 (dd, J = 3.7, 9.8 Hz, 1 H), 3.99 (t, J = 6.5 Hz, 1 H), 3.95-3.88 (m, 2 H), 3.87 (br m, 1 H), 3.73 (dd, J = 6.4Hz, J = 10.4 Hz, 1 H), 3.55 (dd, J = 5.8 Hz, J = 10.4 Hz, 1 H), ); 3.51-3.41 (m, 2 H), 2.70 (d, J = 7.3 Hz, 1 H) 1.47 (s, 3 H), 1.31 (s, 3 H), 1.19 (s, 9 H). 13C (CDCl3); 6: 178.28, 138.84, 138.70, 138.61, 138.22, 128.55, 128.40, 128.21, 128.03, 127.84, 108.86, 98.57, 79.16, 76.57, 76.44, 75.27, 75.08, 74.89, 73.65, 73.60, 73.21, 70.73, 69.92, 69.18, 67.91, 63.74, 38.87, 27.33, 27.23, 25.19.

[0122] Anal. calcd para: C47H58O11 (798.96) C, 70.65; H, 7.32. Encontrado: C, 70.64; H, 7.44.

(2S,3S,4R)-2-azido-3,4-O-isopropilideno-5-O-pivaloil-1 -O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil)-1,3,4,5- pentanetetrol (6).

[0123] A una solucion de 1,21 g (1.52 milimoles) de 4 se agrego 30 ml de piridinas seca, bajo argon y se enfrio a 0 °C, se agrego 1.6 ml (1.77 milimoles) de cloruro de clorometanosulfonilo. A la reaccion se le permitio calentarse la temperatura del cuarto y se agito durante 5 horas. La mezcla fue diluida con EtOAc. La capa organica fue lavada con 1N de HCl, bicarbonato de sodio y salmuera, se seco con sulfato de sodio y se evaporo. El crudo fue filtrado a traves de una almohadilla corta de gel de sflice y se uso para el siguiente paso sin mas purificaciones.

[0124] El crudo fue disuelto en DMF seco (12 ml) bajo argon. Se agrego azida de sodio (0.45 gramos) y la mezcla fue calentada a 85 °C. Despues de 2.5 horas la mezcla fue diluida con DCM, lavada con agua (3x), la capa organica fue secada con sulfato de sodio y evaporada. Cromatograffa de destellos (Pet. Eter/EtOAc 85:15) 0.85 gramos de 4 (72% en 2 pasos). 1H (CDCl3): 67.48-7.20 (m, 20 H), 4.98-4.39 (m, 9H), 4.38-4.27 (m, 2 H), 4.24-4.16 (m, 2 H), 4.144.03 (m, 2 H), 4.01-3.91(m, 3 H), 3.74 (dd, J = 10.7 Hz, J = 5.8 Hz, 1 H). 3.55-3.43 (m, 3 H), 1.40 (s, 3H), 1.27 s, H),1.19(s,9H).13C(CDCl3);6: 178.3, 138.9, 138.7, 138.1, 128.4, 128.3, 127.9, 127.7, 109.1, 98.9, 78.7, 76.6,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

75.3,74.9,74.3,73.5,73.3,73.0,70.0, 69.2, 69.1, 62.5, 59.2, 38.9, 27.8, 27.3, 25.5. Anal. calcd para: C47H57N3O10 (823.97)C,68.51;H,6.97;N,5.10.Encontrado: C, 68.83; H, 6.71; N, 4.96.

(2S,3S,4R)-2-azido-3,4-O-isopropilideno-1-O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil)-1,3,4,5-pentanetetrol (7).

[0125] A una solucion de 0.5 g (0.6 milimoles) de 6 en dioxano (20 ml) se agrego 1.7 ml de una solucion de hidroxido detetrabutilamonio. La mezcla fue agitada durante 72 horas, luego diluida con EtOAc. La capa organica fue lavada con 1N de HCl, salmuera, secada con sulfato de sodio y evaporada. La cromatograffa de destellos (Pet. Eter/EtOAc 70:30) del crudo genero a 0.35 gramos (78%) de 7.

1H (CDCl3): 67.56-7.26 (m, 20 H), 4.96-4.52 (m, 7H), 4,47, (d, J = 11.8, 1 H), 4,39, (d, J = 11.8, 1 H), 4.25-4.20 (m,2H). 4.19-3.90 (m, 5 H), 3.81 (dd, J = 10.1, J = 2.4, 1 H), 3.74-3.64 (m, 2 H), 3.55-3.43 (m, 2 H), 1.40 (s, 3H), 1.29 (s,3H). 13C (CDCl3); 6: 138.91, 138.38, 138.32, 137.56, 128.44, 128.34, 127.67, 109.01, 98.92, 78.74, 76.63, 76.52, 75.29,74.82, 74.71, 73.54, 73.43, 72.92, 72.17, 69.92, 69.5, 61.14, 59.68, 27.52, 25.73. Anal. calcd para: C42H49N3O9(739.85)C, 68.18; H, 6.68; N, 5.68. Encontrado: C, 68.42; H, 6.41; N, 5.86.

Ejemplo 2

Sfntesis del intermedio comun 10

(2S,3S,4R)-2-(N-esacosanoilamino)-3,4-O-isopropilideno-5-O-pivaloil-1 -O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D- galactopiranosil)-1,3,4,5-pentanetetraol (9).

[0126] A una solucion de 0.5 gramos (0.6 milimoles) de 6 en EtOH (40 ml) un monto catalftico del catalizador Lindlar fue agregado y la mezcla fue agitada durante 4.5 horas bajo una atmosfera de hidrogeno. 0.107 g de di (15) 0.07). La mezcla fue diluida con DCM y filtrada a traves de celita dejando a 0.5 gramos de la amina cruda 8 que es utilizada directamente en el siguiente paso.

[0127] A una solucion del compuesto 8 en 20 ml de una mezcla 3:1 de DCM-DMF seca bajo Aragon a 0 °C, se

agregaron 296 mg (0.75 milimoles) de acido hexacosanoico. A la suspension se agrego EDC (145 mg, 0.75 milimoles), HOBT (102 mg, 0.75 milimoles) y finalmente una solucion de DIPEA (0.26 ml, 1.5 mmol) en DCM. Despues de 20 horas la mezcla fue diluida con EtOAc, lavada con 1N de HCl, una solucion saturada de bicarbonato de sodio y salmuera, secada con sulfato de sodio y el solvente fue evaporado. La cromatograffa de destellos (Pet. Eter/AcOEt 80:20) genero a 534 mg de 9 (72% en 2 pasos). 1H (CDCl3):

67.56-7.26 (m, 20 H), 6.43 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 4.96-4.55 (m, 6 H), 4.85 (d, J = 3.9 Hz, 1 H) 4,48, (d, J = 11.8, 1 H),4,36, (d, J= 11.8, 1 H), 4.28-3.80 (m, 10 H), 3.62-3.50 (m, 2 H); 3.35 (dd, J = 9.8 Hz, J = 5.5 Hz, 1 H), 2.03 (t, J = 7.3Hz, 2 H), 1.6-1.5 (m, 2 H), 1.42 (s, 3H), 1.28 (s, 3H), 1.25-1.22 (m, 46 H), 1. 18 (s, 9 H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz). 13C (CDCl3);6: 178.15, 172.95, 138.65, 138.39, 138.33, 137.51, 128.55, 128.50, 128.39, 128.18, 128.02, 127.91, 127.72, 127.60,108.86, 99.94, 79.01, 76.85, 75.44, 74.73, 74.68, 74.28, 73.73, 73.06, 70.64, 70.17, 69.68, 62.83, 48.47, 38.78,36.74,32.01, 29.80, 29.68, 29.54, 29.46, 27.84, 27.27, 25.82, 25.55, 22.78, 14.22. Anal. calcd para: C73H109NO11(1176.65)C,74.52; H, 9.34; N, 1.19. Encontrado: C, 74.81; H, 9.47; N, 1.06.

(2S,3S,4R)-2-(W-esacosanoilamino)-3,4-0-isopropilideno-1-0-(2,3,4,6-tetra-0-bencil-a-D-galactopiranosil)-

1.3.4.5- pentanetetraol (10).

[0128] El compuesto 10 fue obtenido tal como se describio para la preparacion del compuesto 7 a partir de 500 mg de 9. El producto fue purificado por medio de cromatograffa de destellos (Pet. Eter/EtOAc 50:50) generando 345 mg (76%) del compuesto 10. 1H (CDCl3): 67.54-7.26 (m, 20 H), 6.63 (m, 1 H), 4.95-4.54 (m, 7 H), 4,46, (d, J =11.6, 1 H), 4,35, (d, J =11.6, 1 H), 4.21-4.09 (m, 2 H), 4.09-3.80 (m, 7 H), 3.60-3.40 (m, 3 H), 3.35 (dd, J = 9.5 Hz, J = 5.2, Hz, 1 H), 2.44 (br s, 1 H), 2.03 (m, 1 H), 1.6-1.5 (m, 2 H), 1.39 (s, 3H), 1.29 (s, 3H), 1.25-1.22 (m, 46 H), 0.86 (t, J = 6.7Hz).13C(CDCl3); 6:173.47,138.52,138.33, 138.28, 137.73, 128.61, 128.52, 128.40, 128.21, 128.03, 127.92, 127.73, 127.61, 108.35, 100.21, 78.96, 77.97,74.98, 74.80, 74.60, 73.80, 73.01, 70.63, 69.98, 69.63, 61.04, 47.99, 36.68, 32.11, 29.81, 29.74, 29.62, 29.49, 28.34,25.76, 25.36, 22.98, 14.24. Anal. calcd para: C68H101NO10 (1092.53) C, 74.76;H,9.32;N,1.28.Encontrado:C,74.45;H,9.21;N, 1.16.

Ejemplo 3

Smtesis de los analogos de oxa de a-GalCer

(2S,3S,4R)-2-azido-5-(2-butoxietil)-3,4-O-isopropilideno-1-O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D-galactopiranosil)-

1.3.4.5- pentanetetraol (11).

[0129] A una solucion de 100 mg (0.135 milimoles) de 7 en DMF seco (3 ml) bajo argon, se agrego un 60% de NaH (11 mg, 0.27 milimoles) y mesilato de 2-butoxietilo. La mezcla fue agitada a 100 °C durante 2 horas. Se agregaron otros 2 eq de NaH y mesilato de 2-butoxietilo. Despues de 2 horas la mezcla fue aplacada con cloruro de amonio (solucion saturada) diluida en EtOAc, lavada con agua (4x), secada con sulfato de sodio y evaporada. La

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

cromatograffa de destellos (Pet. Eter/AcOEt 80:20) dio 74 mg (65%) de 11. 1H (CDCI3): 67.51-7.18 (m, 20 H), 4.94 (m, 1 H), 4.86-4.50 (m, 6 H), 4.47 (d, J=11.8 Hz, 1 H), 4,36 (d, J=11.8 Hz, 1 H);

4,33 (m, 1 H), 4.15-3.94 (m, 6 H), 3.80 (dd, J = 10.4, J = 4.3, 1 H), 3.72-3.44 (m, 8 H), 1,56 (m, 2 H), 1,40 (s, 3 H), 1.36(m, 2 H), 1.27 (s, 3 H), 0,90 (t, J = 7.2 Hz, 3 H). 13C (CDCl3): 6138.97, 138.45, 138.37, 137.60, 128.36, 128.31,

127.66.109.00, 98.91, 78.75, 76.67, 75.34, 74.81, 74.68, 73.53, 73.38, 72.81, 71.27, 70.96, 70.09, 69.64, 69.20,

69.06.59.61.32.00, 28.01, 26.00, 25.54, 14.89. Anal. calcd para: C48H61N3O10 (840.01) C, 68.63; H, 7.32; N, 5.00. Encontrado:C,68.81;H, 7.16; N, 4.83.

(2S,3S,4R)-5-O-(2-butoxietil)-2-(N-exacosanoilamino)-3,4-O-isopropilideno-1 -O-(2,3,4,6-tetra-O-bencil-a-D- galactopiranosil)-1,3,4,5-pentaentetraol (12).

[0130] A partir de 10: a una solucion de 100 mg (92 mmol) de 10, se agregaron 10 mg de KOH y 20 mg (0.1 milimoles) de mesilato de 2-butoxietilo. La mezcla fue agitada a 40 °C durante 20 horas y luego diluida con EtOAc. La capa organica fue lavada con salmuera, secada con sulfato de sodio y evaporada. La cromatograffa de destellos (tolueno/EtOAc 80:20) dio 75 mg (68%) de 12.

[0131] A partir de 11: el mismo procedimiento descrito para la preparacion de 9 a partir de 6 fue seguido generando al compuesto 12 en un 69% de produccion.

1H (CDCl3): 67.52-7.25 (m, 20 H), 6.42 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.94-4.87 (d, J = 3.8, 1 H), 4.82-4.55 (m, 6 H), 4.44 (d,J=11.8 Hz, 1 H), 4.38 (d, J = 11.8 Hz, 1 H), 4.21 (m, 1H), 4.14-3.88 (m, 6 H), 3.63-3.28 (m, 9 H), 2,03 (m, 2 H), 1.81-1.48(m, 4 H), 1,43 (s, 3 H), 1.32 (s, 1 H), 1.27-1.10 (m, 46 H), 0.92-0.80 (m, 6 H). 13C (CDCl3): 6172.84, 138.45,138.37,137.59, 128.49, 128.47, 128.05, 108.72, 99.62, 79.03, 76.70, 73.68, 73.56, 73.03, 71.05, 70.92, 65.34,48.02,36.79,32.03, 31.77, 29.57, 29.46, 28.05, 25.89, 22.80, 19.35, 14.03. Anal. calcd para: C74H113NO11 (1192.69)C,74.52;H,9.55;N, 1.17. Encontrado: C, 74.31; H, 9.67; N, 1.09.

(2S,3S,4R)-5-O-(2-butoxietil)-2-(N-exacosanoilamino)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-1,3,4,5-pentanetetraol (13).

[0132] A una solucion de 70 mg (0.06 milimoles) de 12 en 4 ml de dioxano a 0 °C, se agrego 0.08 mililitros de 4N de HCl en dioxano. A la mezcla se le permitio calentarse a la temperatura del cuarto y se agito durante 4 horas.

El solvente fue evaporado y el producto crudo fue entregado directamente al siguiente paso.

[0133] El crudo fue disuelto en 2 ml de una mezcla de CHCl3/MeOH. Se agregaron 30 mg de un 10% de Pd(OH)2/C y la mezcla fue agitada bajo una atmosfera de hidrogeno durante 3 horas. La mezcla fue filtrada a traves de celita y el solvente fue evaporado. La cromatograffa de destellos (DCM/MeOH 90:10) dio 29 mg (62% en 2 pasos) de 13.

1H (CDCl3/CD3OD 1:1): 64.87 (d, J = 2.9 Hz, 1 H), 4.21 (m, 1 H), 4.00-3.50 (m, 14 H), 3.46 (t, J = 6.7 Hz, 2 H), 3.30(m, 2 H), 2.18 (br t, J = 7.3, 2 H), 1.61-1.44 (m, 4 H), 1.40- 1.21 (m, 46 H), 0.95-0.80 (m, 6 H). 13C (CDCl3/CD3OD 1:1): 6174.72, 99.82, 72.57, 72.00, 71,20, 70.94, 70.42, 70.38, 70.16, 69.84, 69.74, 68.90, 66.92, 61.66,50.06,36.32,31.87,31.46, 29.61, 29.49, 29.29, 25.85, 22.59, 19.08, 13.71, 13.51. Anal. calcd para: C43H85NO11 (792.14)C,65.20;H,10.82;N, 1.77. Encontrado: C, 64.91; H, 11.03; N, 1.61.

En una forma similar se puede obtener a los compuestos 14 y 15.

Ejemplo 4

[0134] La secrecion de IL-2 por el reconocimiento de glicolfpidos por una lfnea celular de NKT de ratones.

[0135] Glicolfpidos: todos los analogos de a-GalCer fueron sintetizados tal como se describio. El a GalCer fue sintetizado de acuerdo a los metodos de la literatura [Figueroa-Perez, S. y Schmidt, R. R. (2000) Carbohydr. Res., 328, 95-102].

[0136] Losreceptores de CD1d con una sobreexpresion de THP1 (lfnea de celulas de leucemia monocftica aguda humana - Human acute monocytic leukemia cell line) fueron utilizados como APCs (celulas que presentan antfgenos - antigen presenting cells) y fueron cultivadas en un medio RPMI (glutamina 2 mM, NaPiruvato 1 mM, aminoacidos no esenciales 1%, kanamicina 100 pl/mililitros, FBS 10%, p-mercaptoetanol 0.01 mM).

[0137] Se utilizaron a celulas T reactivas de hibridoma FF13 de raton de CD1d que secretan IL2 como respuesta a una activacion para la evaluacion de los compuestos. Las celulas FF13 fueron cultivadas en un medio de RPMI1640 (glutamina 2 mM, NaPiruvato 1 mM, aminoacidos no esenciales 1%, kanamicina 100 pl/mililitro, FBS 10%, p- mercaptoetanol 0.01mM).

[0138] THP1 hCDld (celulas humanas THP-1 transfectadas con CD1D humano) e hibridomas FF13 de celulas NKT de raton fueron suministradas por University Hospital Basel.

[0139] Una solucion generica de DMSO (1 mg/mililitro) de los compuestos fue preparada, y diluida a diferentes concentraciones: 10 pg/mililitro; 1.1 pg/mililitro; 0.37 microgramos/mililitro; 0.12 microgramos/mililitro; 0.04 microgramos/mililitro; 0.01 microgramos/mililitro.

5

10

15

20

25

30

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40

45

50

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60

65

Estimulacion de FF13

[0140] En una placa de 96 pozos, THP1 (APC) en 90 pi de un medio libre de sueros (5x104 celulas) se cargo 10 pi de una solucion de los compuestos y se incubo durante 2 horas.

[0141] 100 pl de FF13 en un medio completo fueron agregados (10x104 por pozo) y despues de 48 horas las pruebas fueron evaluadas para detectar su produccion de IL2.

[0142] Las concentraciones de IL2 fueron evaluadas por medio de ELISA utilizando un anticuerpo de IL-2 anti-raton monoclonico (R&D System), un anticuerpo biotinado de deteccion de IL-2 anti - raton (R&D System) y SIGMA FAST OPD como un desarrollador de color. Todas las pruebas fueron realizadas por triplicado utilizando como estandar a un IL2 de raton recombinante (R&D System).

[0143] La figura 2 muestra los niveles liberados de IL2 por las celulas que fueron tratadas con los compuestos 1316, en comparacion al efecto con alfa-GalCer, en una prueba de hibridomas de celulas NKT. Las celulas de hibridomas de NKT espedficas de a-GalCer fueron agregadas a las celulas THP-1 transfectadas con CDld que fueron expuestas durante 2 horas a varias dosis del compuesto de prueba (desde alrededor de 0.1 a alrededor de 10 pg/mililitro), y los niveles de IL-2 en el medio fueron determinados 48 horas despues. Los compuestos 13 y 16 fueron tan efectivos como el a-GalCer a 10 micro molares, y los otros compuestos solamente fueron un poquito menos efectivos. Por lo tanto, el oxfgeno insertado en el grupo alquilo de los compuestos ceramidos no tienen un efecto perjudicial en la actividad, y variaciones significativas del grupo alquilo pueden ser hechas con solamente cambios modestos en la actividad.

Ejemplo 5

Comparacion in vivo entre el alfa-Gal GG y el alfa Gal LP sinteticos.

[0144] 2 diferentes fuentes de a-GalCer sinteticos fueron comparados. La comparacion in vivo de los efectos del "alfa-Gal GG" y "alfa-Gal LP" sinteticos en la presencia de antfgenos de la influenza fue hecha en ratones adultos Balb/C. Ambos a-GalCers fueron suministrados inicialmente disueltos en H2O y un 0.5 por ciento de Tween 20. Este material disuelto en Tween 20 fue administrado ya sea solo o en combinacion con una emulsion de escualeno en agua MF59. Los a-GalCers fueron agregados a MF59 (no formulados) o fueron incorporados al MF59 (formulados).

[0145] Grupos de 8 ratones adultos (de 7 semanas) fueron expuestos a 2 inmunizaciones, con una separacion de 3 semanas. Adicionalmente, un grupo de ratones no recibio ninguna administracion de ninguna composicion de vacuna y fue utilizado como un control. La composicion de inmunizacion comprende a un antfgeno de influenza “gripe” y para cada inmunizacion, cada raton recibio como antfgeno de influenza a 0.1 pg de A/Solomon H1N1, 0.1 pg de A/Wisconsin H3N2 o 0.1 Microgramos de B/Malasia. Para ratones tratados con un a-GalCer, cada raton recibio 0.1 pg de un a-GalCer por cada inmunizacion. Una inmunizacion fue administrada por medio de inyecciones intramusculares de una composicion de 50 pl en la pierna. 3 semanas despues de la primera administracion, la 2a inmunizacion fue entregada donde unos 50 pl adicionales de la vacuna en una pierna diferente fueron administrados. Cada una de las siguientes composiciones fueron administradas a un grupo de ratones:

Gripe;

Gripe y MF59;

Gripe y a-Gal GG

Gripe y MF59 y a-Gal GG

Gripe y MF59 y a-Gal GG, formuladas;

Gripe y a-Gal LP

Gripe y MF59 y a-Gal LP

Gripe y MF59 y a-Gal LP (formuladas).

[0146] La respuesta inmunologica a la composicion de vacunacion fue evaluada 2 semanas despues de la 2a administracion de inmunizacion. Las medidas de tftulo de HI (hemaglutinacion-inhibicion) y de tftulos de IgG fueron registradas y utilizadas como indicadores de la respuesta inmunologica. Los tftulos de HI fueron medidos utilizando un ensayo de HI y tftulos IgG tal como fueron medidos por ELISA. Un resumen de los resultados se encuentra en la figura 3, 4 y 5 y muestran los tftulos HI en respuesta a H3N2 (A/Wisconsin), los tftulos de IgG en respuesta a B (B/Malasia), H1N1 (A/Solomon) y H3N2 (A/Wisconsin), y subclases de tftulos de IgG, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 6

[0147] Comparacion in vivo entre el alfa-Gal LP y sus derivados.

[0148] Las comparaciones in vivo de los efectos de los compuestos a-Gal LP, 13, 14, 15 y 16 son hechos en ratones adultos Balb/C con antfgenos de influenza. Los compuestos 13-16 son sintetizados tal como se describio en la especificacion.

[0149] Grupos de 8 ratones adultos (de 7 semanas) fueron expuestos a 2 inmunizaciones, con 3 semanas de separacion. Adicionalmente, a 4 ratones no se les administro ninguna composicion de vacuna y fueron utilizados como el grupo de control. La composicion de inmunizacion comprende a un andgeno de la influenza “gripe” que incluye a 0.1 pg de hemaglutinina de cada una de las cepas 2008/09, es decir, similar a A/Brisbane/59/2007, similar a A/Brisbane//10/2007 y similar a B/Florida/4/2006. Para ratones que sedan tratados con un a-GalCer, cada raton recibe 0.1 pg de un a-GalCer para cada inmunizacion. Una inmunizacion es administrada por medio de inyecciones intramusculares de unos 50 pl de la composicion en la pierna. 3 semanas despues de la primera administracion, la 2a inmunizacion es entregada donde unos 50 pl adicionales de la composicion son administrados en una pierna diferente. Cada una de las siguientes composiciones son administradas a un grupo de ratones:

Gripe;

Gripe y adyuvante de MF59;

Gripe y a-Gal LP

Gripe y el compuesto 13 (H2O/Tween 20 0.5%), 14 (H2O/Tween 20 0.5%), 15 (H2O), o 16 (H2O/Tween 20 0.5%);

Gripe y MF59 / a-Gal LP; y

Gripe y MF59/compuesto 13, 14, 15, o 16.

[0150] La respuesta inmunologica a la composicion de vacunacion es evaluada 2 semanas despues de la 2a administracion de la inmunizacion. Mediciones de los tftulos de HI (hemaglutinacion-inhibicion), los tftulos de IgG y de las subclases de IgG son registradas y utilizadas como indicadores de la respuesta inmunologica. Los tftulos de HI son medidos utilizando un ensayo de HI y los tftulos de IgG son medidos por medio de Elisa.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Un compuesto de la formula I:

   imagen1

   donde R2, R3, R4 y R5 cada uno representan independientemente a H o a un grupo protector;

   X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido;

   Y es un alquileno C1-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos seleccionados independientemente de un enlazador alquenileno halo, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, haloalquilo C1-C6 e hidroxilo, o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta dos grupos;

   y Z es -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroatomo dentro de su estructura, y es opcionalmente sustituido; o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, donde X es un grupo alquilo no sustituido que tiene de 10-30 carbonos.
3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1 o 2, donde Y es -CH(OH)-CH(OH)-CH2-.
4. 4. El compuesto de la reivindicacion 3, donde -Y-Z es

   imagen2
5. 5. El compuesto de cualquiera de reivindicaciones 1-4, donde Z es -O-R1, donde R1 es un hidrocarbilo C4- C20.
6. 6. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde Z es -O-R1, donde R1 es (CH2)m-O-R1b, donde m es 1-6 y R1b es un alquilo, un cicloalquilo, o un cicloalquilalquilo C1-C16.
7. 7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de R2, R3, R4 y R5 es H.
8. 8. El compuesto de la reivindicacion 1, que es seleccionado de un grupo que consiste de

   imagen3

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   y

   imagen4
9. 9. Una composicion inmunogenica que comprende a un compuesto de la formula I:

   imagen5

   donde R2, R3, R4 y R5 cada uno representan independientemente H o a un grupo protector;

   X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido;

   Y es un enlazador alquileno C1-C6 o alquenileno C2-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos; y Z es -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroatomo dentro de su estructura, y es sustituido opcionalmente;

   o una de sus sales farmaceuticamente aceptables, y un antfgeno.
10. 10. Un compuesto de la formula I:

    imagen6

    donde R2, R3, R4 y R5 representa cada uno independientemente H o A un grupo protector; X es un grupo hidrocarbilo C4-C30 que puede ser sustituido;

    Y es un enlazador alquileno C1-C6 o C2-C6 que puede ser sustituido con hasta 2 grupos;

    5

    10

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    20

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    55

    60

    65

    y Z es -OR1, donde R1 es un grupo hidrocarbilo C4-C20 que puede contener a un heteroatomo dentro de su estructura, y es sustituido opcionalmente;

    o una de sus sales farmaceuticamente aceptables, para su uso en un metodo para incrementar la respuesta inmunologica provocada por un antfgeno en un sujeto que recibe al antfgeno.
11. 11. El compuesto para el uso de la reivindicacion 10, donde el antfgeno y el compuesto de la formula I son administrados al mismo tiempo o en el mismo dfa.
12. 12. El compuesto para el uso de la reivindicacion 10, donde el antfgeno es seleccionado de antfgenos bacterianos, antfgenos virales, antfgenos de hongos, antfgenos de protozoos y antfgenos relacionados con tumores.