ES2574403T3

ES2574403T3 - Composición antigénica de micobacterias

Info

Publication number: ES2574403T3
Application number: ES11794778.8T
Authority: ES
Inventors: Stephane Andre Georges Godart; Amina Laanan; Dominique Ingrid Lemoine
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2016-06-17
Anticipated expiration: 2031-12-14
Also published as: PT3023106T; EP3023106B1; HRP20191843T1; CO6751287A2; HUE027932T2; US20180071378A1; DK3023106T3; CY1122187T1; US9730992B2; ES2567190T3; CN103249431B; PL2651437T3; ZA201304014B; UY33802A; HRP20160606T1; SI3023106T1; UA110806C2; BR112013014599A2; KR20140029376A; JP5951633B2

Abstract

Una composición inmunógena que comprende un antígeno relacionado con Rv1196, en la que el antígeno relacionado con Rv1196 comprende (a) una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con la SEQ ID No: 1 o (b) un fragmento de SEQ ID No: 1 que tiene una longitud de al menos 350 aminoácidos y en la que la conductividad de la composición es de 5 mS/cm o menor y en la que el pH de dicha composición está en el intervalo de 7,0 a 9,0.

Description

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Las composiciones inmunógenas pueden comprender uno o más componentes antigénicos adicionales. Dichos componentes antigénicos adicionales no tienen que ser sensibles a la presencia de sales en la composición.

Los componentes antigénicos adicionales pueden estar destinados a reforzar o complementar las respuestas inmunitarias producidas por el antígeno relacionado con Rv1196 en el campo de la prevención y terapia de la tuberculosis o antígenos adicionales podrían asociarse con otros patógenos y son para la administración del antígeno relacionado con Rv1196 por motivos de comodidad. Cuando en la formulación hay presente una serie de componentes antigénicos, estos se pueden proporcionar en forma de polipéptidos individuales o proteínas de fusión. En algunas circunstancias, los componentes antigénicos adicionales pueden proporcionarse como un polinucleótido (o polinucleótidos).

Los derivados inmunógenos concretos de la proteína Rv1196 incluyen proteínas de fusión que comprenden una secuencia que tiene una identidad de al menos un 90 % con la SEQ ID No: 1, especialmente al menos del 95 %, por ejemplo al menos del 98 %, tal como al menos del 99 %.

Ejemplos de proteínas de fusión que contienen una proteína Rv1196 incluyen: M72 (SEQ ID No: 5) y variantes de la misma, tales como aquellas con restos de His adicionales en el extremo N terminal (por ejemplo, dos restos de His, como se proporciona en la SEQ ID No: 7; o una marca de polihistidina de cinco o en particular seis restos de His, que se pueden usar para la purificación de afinidad del níquel. Mtb72f (SEQ ID No: 9) que contiene el residuo se serina original que se ha mutado en M72, es otro derivado de M72, ya que son proteínas de Mtb72f con restos de His adicionales en el extremo N terminal (por ejemplo, dos restos de His; o una marca de polihistidina de cinco o en particular seis restos de His, que se pueden usar para la purificación de afinidad del níquel).

Es muy conocido que para las soluciones de administración parenteral tendría que haber una osmolalidad farmacéuticamente aceptable para evitar la distorsión o la lisis celular. En general, una osmolalidad farmacéuticamente aceptable significará que las soluciones tendrán una osmolalidad que es aproximadamente isotónica o un poco hipertónica. De forma adecuada, las composiciones inmunógenas de la presente invención tendrán una osmolalidad en el intervalo de 250 a 750 mOsm/kg, por ejemplo, el osmolalidad puede estar en el intervalo de 250 a 550 mOsm/kg, tal como en el intervalo de 280 a 500 mOsm/kg.

Se puede medir la osmolalidad de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica, tales como por el uso de un osmómetro comercialmente disponible, por ejemplo el Modelo 2020 Advanced® disponible de Advanced Instruments Inc. (EE.UU.).

Un "agente de isotonicidad" es un compuesto que se tolera fisiológicamente e imparte una tonicidad adecuada a una formulación para evitar el flujo neto de agua a través de las membranas celulares que están en contacto con la formulación.

En general, se usa cloruro de sodio (NaCl) como agente de tonicidad. Los presentes inventores han demostrado por primera vez que esos antígenos relacionados con Rv1196 son particularmente sensibles al "desplazamiento salino", un proceso en el que las proteínas en solución se juntan o coagulan cuando están en soluciones que contienen altas concentraciones de sal. En consecuencia, se proporcionan medios alternativos para asegurar que las composiciones inmunógenas de la invención tengan una osmolalidad farmacéuticamente aceptable.

En una realización particular, se proporcionan composiciones inmunógenas que comprenden además un agente de tonicidad no iónico. Un agente de tonicidad no iónico para su uso en una composición inmunógena necesitará el mismo ser farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, adecuado para su uso en seres humanos, así como ser compatible con el antígeno relacionado con Rv1196 y compatible además con otros componentes tales como el/los inmunoestimulante(s).

En una realización de la presente invención, los agentes de tonicidad no iónicos adecuados son polioles, azúcares (en particular, sacarosa, fructosa, dextrosa o glucosa) o aminoácidos tales como glicina. En una realización, el poliol es un alcohol de azúcar, especialmente un alcohol de azúcar C3-6. Los alcoholes de azúcar ejemplares incluyen glicerol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, ribitol, sorbitol, manitol, dulcitol e iditol. En un ejemplo específico de esta realización, un agente de tonicidad no iónico adecuado es sorbitol. El experto reconocerá que se puede conseguir una osmolalidad apropiada a través del uso de una mezcla de diferentes agentes de tonicidad. En una realización particular de la invención, el agente de tonicidad no iónico en las composiciones de la invención incorpora sacarosa y/o sorbitol.

En una realización, una concentración adecuada de poliol dentro de la composición inmunógena es de entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 15 % (p/v), en particular de entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 10 % (p/v), por ejemplo, entre aproximadamente un 3 y aproximadamente un 7 % (p/v), tal como entre aproximadamente un 4 y aproximadamente un 6 % (p/v). En un ejemplo específico de esta realización, el poliol es sorbitol.

En otra realización, la composición inmunógena comprende sacarosa y sorbitol. En estas circunstancias, la composición inmunógena puede contener de forma adecuada entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 15 % (p/v) de sacarosa y entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 15 % (p/v) de sorbitol, en particular

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entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 10 % (p/v) de sacarosa y entre aproximadamente un 2,5 y aproximadamente un 10 % (p/v) de sorbitol, por ejemplo, entre aproximadamente un 3 y aproximadamente un 7 % (p/v) de sacarosa y entre aproximadamente un 3 y aproximadamente un 7 % (p/v) de sorbitol, tal como entre aproximadamente un 4 y aproximadamente un 6 % (p/v) de sacarosa y entre aproximadamente un 4 y aproximadamente un 6 % (p/v) de sorbitol.

El pH de las composiciones inmunógenas debería ser adecuado para la administración parenteral. Normalmente, el pH estará en el intervalo de 6,0 a 9,0. De forma adecuada, El pH estará en el intervalo de 7,0 a 9,0, especialmente de 7,25 a 8,75, tal como de 7,5 a 8,5, en particular un pH de 7,75 a 8,25. Es de particular interés un pH de aproximadamente 8,0.

Se puede controlar el pH por el uso de tampones, incluyendo, por ejemplo, tampones Tris o de fosfato.

En una realización particular de la invención, la composición inmunógena comprende uno o más inmunoestimulantes.

En una realización, el inmunoestimulante puede ser una saponina. Una saponina particularmente adecuada para su uso en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina y se describió en primer lugar por Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p243-254) por tener actividad coadyuvante. Se han aislado fracciones purificadas de Quil A por HPLC que retiene la actividad coadyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento WO88/09336), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). La QS21 es una saponina natural derivada de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, células TH1 y una respuesta de anticuerpos IgG2a predominante. QS21 es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.

En una forma adecuada de la presente invención, el coadyuvante de saponina dentro de la composición inmunógena es un derivado de Quil A de saponaria Molina, en particular, una fracción inmunológicamente activa de Quil A, tal como QS17 o QS21, adecuadamente QS21.

De forma deseable, QS21 se proporciona en una composición menos reactógena en la que se desactiva con un esterol exógeno, tal como colesterol, por ejemplo. Existen varias formas concretas de composiciones menos reactógenas en las que QS21 se desactiva con un colesterol. En una realización específica, la saponina/esterol está en forma de una estructura de liposoma (tal como la descrita en el documento WO 96/33739, ejemplo 1). En esta realización, los liposomas contienen de forma adecuada un lípido neutro, por ejemplo, fosfatidilcolina, que de forma adecuada es no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidilcolina de yema de huevo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) o dilauril fosfatidilcolina. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que incrementa la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es de forma adecuada de un 1-20 % p/p, tal como de un 5-10 %. La proporción de esterol con respecto a fosfolípido es de un 1-50 % (mol/mol), de forma adecuada de un 20-25 %.

Los esteroles adecuados incluyen β-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, la composición inmunógena comprende colesterol como esterol. Estos esteroles son muy conocidos en la técnica, por ejemplo, el colesterol se da a conocer en el Índice de Merkc, 11ª Ed., página 341, como un esterol natural que se encuentra en la grasa animal.

Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21: esterol será normalmente del orden de

1:100 a 1:1 (p/p), de forma adecuada de entre 1:10 a 1:1 (p/p), y especialmente de 1:5 a 1:1 (p/p). De forma adecuada, está presente esterol en exceso, siendo la proporción QS21: esterol al menos de 1:2 (p/p). En una realización, la proporción QS21: esterol es de 1:5 (p/p). De forma adecuada, el esterol es colesterol.

En otra realización, la composición inmunógena comprende un inmunoestimulante que es un agonista del receptor similar a Toll 4 (TLR4). Por "agonista de TLR" se quiere decir un componente que puede provocar una respuesta de señalización a través de un camino de señalización de TLR, como un ligando directo o bien indirectamente a través de la generación de un ligando endógeno o exógeno (Sabroe y col., J Immunol 2003 p1630-5). Un agonista de TLR4 puede provocar una respuesta de señalización a través de un camino de señalización de TLR-4. Un ejemplo adecuado de un agonista de TLR4 es un lipopolisacárido, de forma adecuada, un derivado no tóxico de lípido A, en particular, monofosforil lípido A o más en particular monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL).

3D-MPL se comercializa con el nombre MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y en la memoria descriptiva se denomina MPL o 3D-MPL, véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. N.º 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y

4.912.094. 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de linfocitos T CD4+ con un fenotipo de IFN-gamma (Th1). 3D-MPL se puede producir de acuerdo con los procedimientos dados a conocer en el documento GB2220211A. Químicamente es una mezcla de un monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. En las composiciones de la presente invención se puede usar 3D-MPL de partícula pequeña para preparar la composición inmunógena. El 3D-MPL de partícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que se puede filtrar de forma estéril a través de un filtro de 0,22 um. Estas preparaciones se describen en el documento WO94/21292. De forma adecuada, se usa 3D-MPL en polvo para preparar las composiciones inmunógenas de la presente

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invención.

Otros antagonistas de TLR4 que se pueden usar son fosfatos de alquil glucosaminida (AGP) tales como los dados a conocer en el documento WO98/50399 o en la patente de los EE.UU. 6.303.347 (también se dan a conocer procesos para la preparación de AGP), de forma adecuada RC527 o RC529 o sales farmacéuticamente aceptables de AGP como se dan a conocer en la patente de los EE.UU. N.º 6.764.840. Algunos AGP son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4.

Otros agonistas de TLR4 adecuados son los descritos en el documento WO2003/011223 y en el documento WO2003/099195, tales como compuesto I, compuesto II y compuesto III dados a conocer en las páginas 4-5 del documento WO2003/011223 o en las páginas 3-4 del documento WO2003/099195 y en particular los compuestos dados a conocer en el documento WO2003/011223 como ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057m ER804058, ER804059, ER804442, ER804680 y ER804764. Por ejemplo, un agonista de TLR-4 adecuado es ER804057.

En una realización particular, la composición inmunógena comprende tanto una saponina como un agonista de TLR4. En un ejemplo específico, la composición inmunógena comprende QS21 y 3D-MPL.

Un agonista de TLR-4, tal como un lipopolisacárido, tal como 3D-MPL, se puede usar en cantidades de entre 1 y 100 ug por dosis humana de la composición inmunógena. Se puede usar 3D-MPL en un nivel de aproximadamente 50 ug, por ejemplo de entre 40 a 60 ug, de forma adecuada de entre 45 a 55 ug o de entre 49 y 51 ug o de 50 ug. En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende 3D-MPL en un nivel de aproximadamente 25 ug, por ejemplo, de entre 20 a 30 ug, de forma adecuada de entre 21 a 29 ug o de entre 22 a 28 ug o de entre 23 y 27 ug o de entre 24 y 26 ug, o de 25 ug.

Una saponina, tal como QS21, se puede usar en cantidades de entre 1 y 100 ug por dosis humana de la composición inmunógena. Se puede usar QS21 en un nivel de aproximadamente 50 ug, por ejemplo de entre 40 a 60 ug, de forma adecuada de entre 45 a 55 ug o de entre 49 y 51 ug o de 50 ug. En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende QS21 en un nivel de aproximadamente 25 ug, por ejemplo, de entre 20 a 30 ug, de forma adecuada de entre 21 a 29 ug o de entre 22 a 28 ug o de entre 23 y 27 ug o de entre 24 y 26 ug, o de 25 ug.

Cuando tanto un agonista de TLR4 como saponina están presentes en la composición inmunógena, entonces la proporción en peso de agonista de TLR4 con respecto a saponina es de forma adecuada de entre 1:5 a 5:1, de forma adecuada de entre 1:2 a 2:1, tal como aproximadamente 1:1. Por ejemplo, cuando 3D-MPL está presente en una cantidad de 50 ug o 25 ug, entonces QS21 también puede estar presente de forma adecuada en una cantidad de 50 ug o 25 ug, respectivamente, por dosis humana de la composición inmunógena. Determinadas composiciones inmunógenas de la presente invención comprenden QS21 y 3D-MPL, en una cantidad de entre 1 y 100 ug de cada por dosis humana, tales como en una cantidad de entre 10 y 75 ug de cada por dosis humana. Las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden comprender de forma adecuada QS21 y 3D-MPL, en una cantidad de entre 15 y 35 ug de cada por dosis humana, tales como en una cantidad de entre 20 y 30 ug de cada por dosis humana.

En una realización, el inmunoestimulante es un agonista de TLR9, por ejemplo como se establece en el documento WO2008/142133. En un ejemplo específico, este agonista de TLR9 es un oligonucleótido inmunoestimulador, en particular un oligonucleótido que contiene un motivo CpG no metilado. Estos oligonucleótidos son muy conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO96/02555, WO99/33488 y US5.865.462. Los agonistas de TLR9 adecuados para su uso en las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento son CpG que contienen oligonucleótidos, que contienen opcionalmente dos o más motivos CpG dinucleótidos separados por al menos tres, de forma adecuada al menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG es un nucleótido de citosina seguido de un nucleótido de guanina.

En una realización, el enlace internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o posiblemente un enlace fosforotioato, aunque también se pueden usar enlaces de fosfodiéster y otros internucleótidos, incluyendo oligonucleótidos con uniones de internucleótidos mezclados. Los procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en el documento US5.666.153, US5.278.302 y WO95/26204. Se contemplan oligonucleótidos que comprenden diferentes uniones internucleótidos, por ejemplo, fosfodiésteres de fosforotioato mezclados. Se pueden usar otros enlaces internucleótidos que estabilicen el oligonucleótido.

Los ejemplos de oligonucleótidos CpG adecuados para su inclusión en las composiciones inmunógenas descritas en el presente documento tienen las siguientes secuencias. En una realización, estas secuencias contienen uniones internucleótidas modificadas de fosforotioato.

OLIGO 1 (SEQ ID No: 9): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

OLIGO 2 (SEQ ID No: 10): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

OLIGO 3 (SEQ ID No: 11): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

OLIGO 4 (SEQ ID No: 12): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

OLIGO 5 (SEQ ID No: 13): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

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(continuación)

ug QS21: DO QS21 desactivado

0,5: 0,052 < LOD

0,6: 0,073 < LOD

0,7: 0,091 < LOD

0,8: 0,096 < LOD

0,9: 0,12 > 98,2%

1: 0,195 > 98%

1,1: 0,212 > 97,8%

1,2: 0,348 > 97,6%

1,3: 0,479 > 97,4%

1,4: 0,612 > 97,2%

1,5: 0,669 > 97%

2: 1,139 > 96%

2,5: 1,294 > 95%

3: 1,391 > 94%

5: 1,416 > 90%

Adyuvante*: 0,03 > 98,2 %

*50 ug de equivalente de QS21 sometido a prueba. Tampón de cloruro de sodio 150 mM.

Los datos anteriores se muestran gráficamente en la figura 1.

El Límite de detección en este ensayo está en 0,9 ug de QS21, y DO de 0,12

5 Se estimó que la desactivación de QS21 en una composición coadyuvante que comprendía cloruro de sodio 150 mM era de más de un 98,2 % para el equivalente de 50 ug de QS21 sometido a prueba. En el caso de un equivalente de 90 ug sometido a prueba, la conclusión es más de un 99 %.

Después, se comparó la desactivación de QS21 con una composición coadyuvante equivalente que comprendía sorbitol y cloruro de sodio de solo 5 mM. Se generaron los datos después del almacenamiento de ASA a 4 ºC o

10 después de estabilidad acelerada (7 días a 37 ºC). Para ASA en sorbitol, se realizó la curva estándar de QS21 en un tampón que contenía sorbitol.

Muestra: Punto temporal LDD QS21 desactivado

Composición coadyuvante (ASA) NaCl 150 mM: T0 < 1,4 > 97,2 %

7 días a 37 °C: < 0,9 > 98,2 %

Composición coadyuvante (ASA) sorbitol, NaCl 5 mM: T0 < 2 > 97,8 %

7 días a 37 °C: <1 > 96 %

11 meses a 4 ºC: <2 > 97,8 %*

Equivalente de 50 ug de QS21 sometido a prueba excepto * equivalente de 90 ug de QS21 sometido a prueba.

Se concluyó que QS21 se desactivaba adecuadamente en un tampón de cloruro de sodio bajo.

Ejemplo 4: Congéneres de MPL.

15 Químicamente, 3D-MPL es una mezcla de un monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Cada molécula de 3D-MPL separada se denomina un congénere. Es importante que la composición de congénere

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permanezca constante, sin cambios entre la proporción de congéneres. También es importante que cualquier tampón usado permita que la composición de congénere sea la misma que en los liposomas concentrados usados para preparar la composición coadyuvante.

Como se muestra en la figura 2, se examinó la composición de congénere en liposomas concentrados de 3D-MPL (liposomas concentrados LIP07-217, primera columna de la figura 2), una composición coadyuvante que comprendía liposomas de 3D-MPL y QS21 en un tampón de NaCl 150 mM (coadyuvante NaCl 150 mM, o ASA (NaCl 150 mM), segunda columna), y una composición coadyuvante que comprendía liposomas de 3D-MPL y QS21 en un tampón de sorbitol y NaCl 5 mM (coadyuvante sorbitol, o ASA (sorbitol), columnas 3-7).

También se examinó la composición de congénere en dos lotes de coadyuvante ASA (sorbitol) en el día 0 y 7 días después de la preparación y se mantuvo a 37 ºC para asegurar que no se producía evolución con el tiempo (véanse las últimas cuatro columnas de la figura 2).

Se determinó la distribución relativa de congéneres tetra-, penta-y hexa-acilados de MPL en liposomas concentrados o muestras de ASA (sorbitol) por detección IP-HPLC-Fluo (ARD). Se derivaron tanto los estándares como las muestras con dansilhidrazina, que introduce un cromóforo fluo-activo sobre el esqueleto disacárido. Se analizaron las muestras derivadas sobre una columna de fase inversa C18 usando hidróxido de tetrabutilamonio (TBAOH) como reactivo de par iónico. Se eluyeron los congéneres que contenían el mismo número de grupos acilo grasos en distintos grupos (tetraacilo, pentaacilo y hexaacilo). Se deduce la distribución de congéneres comparando el área de pico de cada grupo con el área de pico total de todos los congéneres de MPL.

La figura 2 muestra el porcentaje de cada congénere. No se encontró ninguna diferencia significativa en la composición de congénere entre tampones coadyuvantes, y la composición de congénere era compatible con el tiempo en el tampón de sorbitol.

Ejemplo 5: Preparación de composición coadyuvante ASA (sorbitol -2)

Se preparó una composición coadyuvante que comprendía monofosforil lípido A 3-des-O-acilado y QS21, en un nivel reducido con relación al ejemplo 1, en una formulación liposomal usando sorbitol como agente de tonicidad. Ésta se preparó como sigue:

Se preparó el coadyuvante por dilución 1:1 de ASA (sorbitol), preparado de acuerdo con el ejemplo 1, con una solución que contenía fosfato 10 mM, NaCl 5 mM, 4,7 % de sorbitol a pH 6,1.

La formulación final ASA (sorbitol -2) contenía 1 mg de DOPC, 250 ug de colesterol, 50 ug de 3D-MPL/ml y 50 ug de QS21/ml, un 4,7 % de sorbitol, cloruro de sodio 5 mM y fosfato 10 mM.

Ejemplo 6: Preparación de composición coadyuvante ASA (sorbitol -3)

A. Procedimiento de preparación de liposomas:

Se secó una mezcla de lípido (DOPC), colesterol y monofosforil lípido A 3-des-O-acilado en un disolvente orgánico a vacío. Después, se añadió una solución acuosa (solución salina tamponada con fosfato [NaCl 100 mM, fosfato 50 mM pH 6,1]) y se agitó el recipiente hasta que todo el lípido estaba en suspensión. Después, se prehomogeneizó esta suspensión con un mezclador de alto cizallamiento y se homogeneizó con alta presión hasta que el tamaño de los liposomas se redujo hasta alrededor de 90 nm ± 10 nm medido por DLS. Después, se filtraron de forma estéril los liposomas.

B. Formulación ASA:

Etapa 1: Dilución de liposomas concentrados

Se añadió tampón de fosfato Na2/K 100 mM pH 6,1, diluido 10 veces, a agua para inyección hasta alcanzar una concentración de tampón de fosfato de 10 mM en la formulación final. Después se añadió un 30 % (p/v) de solución de sorbitol en agua para inyección (WFI) hasta alcanzar una concentración de un 4,7 % en la formulación final (esto se agitó durante de 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

Después, se añadieron los liposomas concentrados (preparados de DOPC, colesterol y 3D-MPL a 40 mg/ml, 10 mg/ml y 2 mg/ml respectivamente) a la mezcla hasta alcanzar una concentración de 50 ug/ml de 3D-MPL en la formulación final.

Posteriormente, se agitó la mezcla durante de 15 a 45 minutos a temperatura ambiente.

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ug/ml en tres tampones diferente (tampón fosfato 10mM a pH 6,1, tampón Tris 20 mM a pH 7,5 y tampón Tris 20 mM a pH 8,5) que contenían concentraciones de cloruro de sodio finales de 0, 50, 150, 300 y 450 mM.

Las muestras se almacenaron durante 24 horas a 4 ºC o 25 ºC antes de analizar.

La nefelometría se realizó usando un Nepheloskan® Ascent, disponible en Thermo Fischer Scientific. Se realizó el análisis en microplacas transparentes UV Costar® disponibles de Corning Inc (EE.UU.).

Se realizó DLS usando un Dynapro Plate Reader de Wyatt Instruments. Se hizo funcionar el instrumento usando una longitud de onda de láser de 830 nm y una potencia de 50 mW. Se detectó luz dispersada a 153° a una temperatura de 22 °C. Se calculan el diámetro promedio y el índice de polidispersidad (IP) por el software de instrumento.

Resultados

Los hallazgos de este experimento se presentan en las figuras 3 y 4.

La nefelometría demuestra una tendencia general de menor claridad con el incremento de la concentración de sal, lo que indica que Rv1196 es sensible a la concentración de sal.

Para la mayoría de las muestras de DLS, la instrumentación no pudo determinar un tamaño de partícula específico (mostrado como NV en la Figura 4). No obstante, cuando se obtuvieron datos comparables (es decir, pH 8,5 con NaCl 0 o 150 nM), está claro que la concentración de cloruro sódico afecta al tamaño de particular medida en las composiciones inmunógenas de Rv1196.

Ejemplo 9: Preparación de antígenos de proteínas

M72 con dos restos de His N terminales (SEQ ID No: 7)

Construcción del vector de expresión de M72

Se generó una codificación de plásmido para la secuencia de aminoácidos de Mtb72f con una marca de 6-His adicional en el extremo N terminal por la unión secuencial en tándem de los marcos de lectura abiertos (ORF) que codificaban el fragmento C terminal de Mtb32a hasta el ORF longitud completa de Mtb39a seguido en el extremo C terminal con la porción N terminal de Mtb32a. Esto se llevó a cabo usando oligonucleótidos específicos de secuencia que contenían sitios de restricción única (EcoRI y EcoRV) y estaban desprovistos de los codones detención en los extremos C terminales (en el caso del fragmento C terminal de Mtb32a y Mtb39a) para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ADN genómico de la cepa de M. Tuberculosis H37Rv. usando este vector como plantilla, se realizó una mutación de Ser706 a Ala estuvo por mutagénesis dirigida a sitio. Se verificó la orientación apropiada de los insertos así como la mutación Ser706Ala por secuenciación de ADN.

Para obtener el vector que codifica para M72, que solo tiene 2 restos de His en el extremo N terminal, se borraron cuatro His haciendo uso de un sistema de mutagénesis dirigida a sitio comercial. Después de la verificación de la secuencia, extirpar la secuencia de codificación de M72 del plásmido por reacción enzimática, se purificó con gel y se ligó en un vector pET. Después, se verificó la secuencia del plásmido recombinante. Este plásmido codifica para M72 bajo el control de un promotor de T7. Se conduce la expresión de T7 ARN polimerasa a partir de un integrante genómico en el huésped de expresión y se induce usando un sistema basado en operón de lac (lacI) y una señal de inducción química de IPTG. Se proporciona el plásmido de expresión con resistencia a kanamicina.

Se transformó el plásmido que codifica para la proteína de fusión de M72 bajo el control de un promotor T7 en la cepa de HMS174 (DE3) de E.coli, usando un procedimiento de electroporación. Se secuenciaron la secuencia de codificación del inserto de M72 y las regiones flanqueantes en ambas cepas y se encontró que eran idénticas a la secuencia determinada de la construcción de plásmido original.

Fermentación

Se descongeló un vial de semilla de trabajo sedimentada a temperatura ambiente. Se preparó una predilución mezclando la semilla de trabajo con 4,9 ml de medio precultivo. Se usó 1 ml de la pre-dilución para inocular el precultivo líquido que consiste en 400 ml de medio precultivo complementado con 50 mg/l de sulfato de kanamicina y 10 g/l de glucosa.

Composición de medio precultivo

Ingrediente: Concentración

KH2PO4: 14,83 g/l

K2HPO4: 1,65 g/l

(NH4)2SO4: 5,82 g/l

Extracto de levadura: 6,21 g/l

(continuación)

Ingrediente: Concentración

Glicerol al 87 % (p/p): 14,54 ml/l

Solución de metal y sal(1):: 9,7 ml/l

-FeCl3 6H2O: 3,3 g/l

-MgSO4 7H2O: 58 g/l

-Solución de microelementos(2):: 116 ml/l

-ZnSO4 7H2O: 7,65 g/l

-MnSO4 H2O: 5,28 g/l

-CuSO4 5H2O: 1,1 g/l

-CoCl2 6H2O: 1,1 g/l

-H3BO3: 0,3 g/l

-Na2MoO4 2H2O: 2,64 g/l

-HCl 4N: 6,2 ml/l

Solución de biotina y CaCl2(2): -Biotina -CaCl2 2 H2O: 0,97 ml/l 0,05 g/l 61,7 g/l

El pH del medio está ajustado a 6,5 con solución de NaOH (25 %) Se filtra el medio a través de 0,22 um

(1) pH ajustado a 1,50 con solución de HCl (37 %); se filtra la solución a través de 0,22 um (2) Se filtra la solución a través de 0,22 um

Se incubó el precultivo en un matraz de agitación de 2 litros a 30 ºC bajo agitación (200 RPM) hasta que la DO650nm alcanzó un valor entre 2 y 4 (tiempo de incubación aproximado: 16 horas). Es ese estadio, se inoculó un fermentador de 72 litros (volumen total) que contenía 45 litros de medio de cultivo complementado con 34 mg/l de sulfato de kanamicina con 52 ml de precultivo líquido.

Composición de medio de cultivo

Ingrediente: Concentración

MgSO4 7H2O: 0,63 g/l

FeCl3 6H2O -Solución de microelementos(1): -ZnSO4 7H2O -MnSO4 H2O -CuSO4 5H2O: 0,056 g/l 1,91 ml/l 7,65 g/l 5,28 g/l 1,1 g/l

-CoCl2 6H2O -H3BO3 -Na2MoO4 2H2O -HCl 4N: 1,1 g/l 0,3 g/l 2,64 g/l 6,2 ml/l

HCl 37 %: 0,40 ml/l

Extracto de levadura: 35 g/l

(NH4)2SO4: 2,10 g/l

KH2PO4: 18,70 g/l

Glutamato de sodio: 2,5 g/l

Glicerol 87 %: 0,276 ml/l

Glucosa: 20 g/l

Solución de biotina(2):: 0,22 ml/l

-Biotina: 1 g/l

(continuación)

Ingrediente: Concentración

CaCl2 2 H2O: 0,21 g/l

Se filtra la solución a través de 0,22 um

(1) Se filtra la solución a través de 0,22 um (2) pH ajustado a 11,0 con solución de NaOH (25 %); se filtra la solución a través de 0,22 um

Durante la fase de crecimiento, se mantuvo el pH a 6,8  0,2 por adición periódica de un 25 % (v/v) de NH4OH y un 25 % (v/v) de H3PO4. Después de la incubación durante 16 horas a 30 ºC, se inició la alimentación semicontinua con medio de alimentación.

Composición de medio de alimentación

Ingrediente: Concentración

MgSO4 7H2O: 1,98 g/l

Ingrediente: Concentración

FeCl3 6H2O -Solución de microelementos(1): -ZnSO4 7H2O -MnSO4 H2O: 0,178 g/l 6,02 ml/l 7,65 g/l 5,28 g/l

-CuSO4 5H2O -CoCl2 6H2O -H3BO3 -Na2MoO4 2H2O -HCl 4N: 1,1 g/l 1,1 g/l 0,3 g/l 2,64 g/l 6,2 ml/l

HCl 37 %: 1,24 ml/l

Glutamato de sodio: 5 g/l

Extracto de levadura: 40 g/l

Glicerol 87 %: 590 ml/l

Solución de biotina(2): -Biotina: 2 ml/l 1 g/l

CaCl2 2 H2O: 0,66 g/l

Se filtra la solución a través de 0,22 um

Se mantuvo la temperatura a 30 ºC durante 2 horas adicionales, después se elevó hasta a 37 ºC hasta el final de la fermentación. Se fijó de forma constante el flujo de aire a 75 l/min y se mantuvo el oxígeno disuelto a un 17 % de 10 saturación por control de retroalimentación de la agitación y la presión. Se añadieron pequeñas cantidades de solución antiespumante según la demanda automáticamente. En el momento que DO650nm alcanzó un valor de 50 (5), se añadió isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM para inducir la expresión de M72. La fermentación terminó después de 5 horas desde que se inició la inducción de punto temporal. Se enfrió el cultivo celular hasta 15 ºC bajo agitación leve y se centrifugó (a 4 ºC) para obtener sedimentos celulares que se almacenaron a continuación

15 a -20 ºC en alícuotas.

Aislamiento de cuerpos de inclusión

Se descongelaron los sedimentos celulares recogidos de la recolección a temperatura ambiente y se rompen en tampón de lisis (Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0) con un homogeneizador de presión alta. A continuación, se centrifugó el lisado celular y se lavaron los sedimentos celulares resultantes (o cuerpos de inclusión, IB) con tampón 20 de lavado que contenía urea, Tris y NaCl. Se solubilizaron los IB con tampón de solubilización que contenía urea 8 M y se filtró a través de una membrana de 0,2 um. En primer lugar, se purificó esta solución filtrada por cromatografía de intercambio aniónico usando una columna de flujo rápido de Q Sepharose (QSFF). La elución de

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M72 tiene lugar con una solución de urea 6 M, bis-Tris propano 20 mM, NaCl 90 mM, pH 7,0.

Se purificó adicionalmente el M72 recogido por cromatografía de hidroxiapatita (HA), de la que se eluye con una solución de urea 6 M, bis-Tris propano 20 mM, NaCl 250 mM, pH 7,0. Se concentró la fracción recogida con un casete de membrana de 30 kDa y se sometió a diafiltración frente a Tris 20 mM, pH 7,5. Después, se esterilizó M72 a través de un filtro de 0,22 um. Después, se alicuotó la masa purificada y se almacenó a -70 ºC.

Ejemplo 10: Investigación de "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72 con diferentes concentraciones de sal a pH 6,1, 7,5 y 8,5.

Se investigó el impacto de la concentración de cloruro de sodio y del pH en la estabilidad del antígeno de M72, evaluado por tamaño y antigenicidad.

Procedimiento

Se diluyó antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 7, como se preparó en el ejemplo 9) hasta una concentración de 100 ug/ml en tres tampones diferente (tampón fosfato 10mM a pH 6,1, tampón Tris 20 mM a pH 7,5 y tampón Tris 20 mM a pH 8,5) que contenían concentraciones de cloruro de sodio finales de 0, 50, 150, 300 y 450 mM.

Se analizaron inmediatamente las muestras (T0), se almacenó durante la noche a 4 ºC antes de su análisis (T0 O/N)

o se almacenó a 25 ºC durante 24 horas antes de su análisis (T24h25 ºC).

Se realizó DLS usando un Malvern Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments (Reino Unido). Se hizo funcionar el instrumento usando una longitud de onda de láser de 633 nm y una potencia de 4 mW. Se detectó luz dispersada a 173° a una temperatura de 22 °C. Se calculan el diámetro promedio Z (Zav) y el índice de polidispersidad (IP) por el software de instrumento.

Se realizó la nefelometría usando un Nepheloskan® Ascent, disponible de Thermo Fischer Scientific. Se realizó el análisis en microplacas transparentes UV Costar® disponibles de Corning Inc (EE.UU.).

Se cuantificó la antigenicidad por un ELISA de tipo sándwich en el que se captura el antígeno por un anticuerpo policlonal de conejo específico de M72 y posteriormente se revela por un anticuerpo monoclonal de ratón específico de M72(Mtb39). Se presentan todas los valores medidos con relación a la antigenicidad esperada basándose en la proteína a granel purificada usada para preparar las formulaciones sometidas a prueba.

Resultados

Los hallazgos de este experimento se presentan en las figuras de 3 a 5.

Los resultados demuestran por primera vez que la estabilidad de soluciones que contienen un antígeno relacionado con Rv1196, específicamente M72, es sensible tanto al pH como a la concentración de cloruro del sodio. El impacto del cloruro de sodio sobre el tamaño del antígeno y la antigenicidad es mucho más notable cuando el pH es menor.

El tamaño del antígeno y la antigenicidad no son estables a pH 6,1, incluso en ausencia de cloruro de sodio. La adición de cloruro de sodio 50 mM a pH 6,1 condujo a un incremento de tamaño de desde 35 nm (cloruro de sodio 0 mM a T0) hasta 58 nm (T0) o 79 nm después de 24 horas a 25 ºC.

El tamaño de antígeno y la antigenicidad son relativamente estables a partir de 24 horas a 25 °C a pH 7,5 u 8,5, en particular en ausencia de cloruro de sodio o a una concentración de cloruro del sodio de 50 mM. No obstante, el incremento de la concentración de cloruro de sodio hasta 150 mM o mayor da como resultado un incremento claro en el tamaño del antígeno y una reducción en la antigenicidad.

En consecuencia, los beneficios de la presente invención se extienden a las secuencias que contienen antígenos relacionados Rv1196 y no solo a la propia secuencia de Rv1196

Ejemplo 11: Prevención de "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72, inmunoestimulantes y que usan sorbitol como agente de tonicidad

Para comparar la estabilidad de composiciones inmunógenas que contienen NaCl 150 mM con composiciones que usan sorbitol como agente de tonicidad, se monitorizó la estabilidad de varias muestras usando SEC-HPLC y ELISA.

Procedimiento

Se prepararon tres tortas de liofilización diferentes, de modo que cuando se combinan con las formulaciones coadyuvantes apropiadas de los ejemplos 5 y 7 se obtendría el pH deseado:

(a) M72 con dos restos de His N terminales – pH objetivo 8,5 en vacuna reconstituida

Se añadió un 15,75 % (p/v) de solución de sacarosa (preparada en agua para inyección) a agua para inyección

imagen11

(iii) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (NaCl 150 mM – 2) pH 7,5

10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 12,5 mM

5 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21

10 NaCl 150 mM Fosfato 10 mM pH 7,5

(iv) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 8,5

10 ug/ml de antígeno

15 5 % p/v de sacarosa Tris 40 mM 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol

20 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21 NaCl 5 mM 4,7 % p/v de sorbitol Fosfato 10 mM

25 pH 8,5

(v) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 8,0

10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 16 mM

30 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21

35 NaCl 5 mM 4,7 % p/v de sorbitol Fosfato 10 mM pH 8,0

(vi) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol – 2) pH 7,5

40 10 ug/ml de antígeno 5 % p/v de sacarosa Tris 12,5 mM 0,02 % p/v de Tween80 500 ug de DOPC

45 125 ug de colesterol 25 ug de 3D-MPL 25 ug de QS21 NaCl 5 mM 4,7 % p/v de sorbitol

50 Fosfato 10 mM pH 7,5

Análisis de la muestra

Se caracterizaron las composiciones inmunógenas reconstituidas descritas anteriormente después del almacenamiento a 25 ºC o 30 ºC (T0, T6h y T24h).

55 Se realizó un análisis SEC-HPLC por inyección en un Supelco TSK-Gel5000Pwxl (ID 7,8 mm x 30 cm) equilibrado en tampón Tris 20 mM pH 8,5, detección por UV a 210 nm e índice de flujo de 0,5 ml/min.

Se cuantificó la antigenicidad por un ELISA de tipo sándwich en el que se captura el antígeno por un anticuerpo

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Ejemplo 14: Investigación del "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72 con CaCl2 o MgSO4 a pH 6,1 y 8,0.

Para investigar el impacto de otras sales sobre la estabilidad del antígeno M72, las soluciones se prepararon con un intervalo de concentraciones de CaCl2 o MgSO4 y a diferentes niveles de pH. La inspección visual se utilizó como 5 una lectura de la estabilidad.

Procedimiento

Se diluyó antígeno a granel purificado (M72 con dos restos de His N terminales, SEQ ID No: 7) hasta una concentración de 100 ug/ml en dos tampones diferente (tampón succinato 10mM a pH 6,1, tampón Tris 10 mM a pH 8,0) que contenían cantidades especificadas de sales (NaCl 0 mM; 150 mM o 300 mM; CaCl2 40 mM, 80 mM o 160

10 mM; MgSO4 87,5 mM, 175 mM o 430 mM).

Se analizaron inmediatamente las muestras después de preparar.

Usando un medidor de la conductividad Mettler Toledo y 6 ml de cada muestra en un vial de vidrio siliconizado, se determinó la conductividad.

Resultados

Grupo: Sal Tampón pH (teórico) Conductividad (mS / cm) pH (medido) Observación Visual

A: 0 mM Succinato 10mM 6,1 1,1 6,3 Transparente

B: NaCl 150 mM Succinato 10mM 6,1 13,4 6,1 Transparente

C: NaCl 300 mM Succinato 10mM 6,1 20,0 6,1 Transparente

D: CaCl2 40 mM Succinato 10mM 6,1 8,0 6,1 Opalescente

E: CaCl2 80 mM Succinato 10mM 6,1 11,2 5,8 Opalescente + partículas grandes

F: CaCl2 160 mM Succinato 10mM 6,1 20,2 5,8 Opalescente + partículas grandes

G: MgSO4 87,5 mM Succinato 10mM 6,1 7,7 6,1 Opalescente

H: MgSO4 175 mM Succinato 10mM 6,1 12,4 5,9 Opalescente + partículas muy grandes

I: MgSO4 430 mM Succinato 10mM 6,1 20,4 5,9 Opalescente + partículas muy grandes

J: 0 mM Tris 10mM 8,0 0,463 8,0 Transparente

K: NaCl 150 mM Tris 10mM 8,0 12,13 8,0 Transparente

L: NaCl 300 mM Tris 10mM 8,0 21,1 8,0 Transparente

M: CaCl2 40 mM Tris 10mM 8,0 6,7 8,1 Partículas grandes

N: CaCl2 80 mM Tris 10mM 8,0 10,8 8,0 Opalescente + partículas grandes

O: CaCl2 160 mM Tris 10mM 8,0 19,7 8,0 Opalescente + partículas grandes

P: MgSO4 87,5 mM Tris 10mM 8,0 7,5 8,0 Partículas grandes

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(continuación)

Grupo: Sal Tampón pH(teórico) Conductividad (mS/ cm) pH(medido) Observación Visual

Q: MgSO4 175 mM Tris 10mM 8,0 10,9 8,2 Opalescente + partículas muy grandes

R: MgSO4 430 mM Tris 10mM 8,0 21,7 8,1 Opalescente + partículas muy grandes

Los resultados demuestran que las soluciones que contienen un antígeno relacionado con Rv1196 pueden ser sensibles a otras sales aparte de cloruro del sodio. El impacto del CaCl2 o el MgSO4 parece ser mucho más pronunciado que para el cloruro sódico a concentraciones o conductividad comparables.

Ejemplo 15: Investigación de "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden Mtb72f con diferentes concentraciones de sal a pH 6,1, 7,5 y 8,5.

Se investigó el impacto de la concentración de cloruro del sodio y del pH sobre la estabilidad del antígeno de Mtb72f, evaluado por tamaño.

Procedimiento

Se diluyó antígeno a granel purificado (Mtb72fcon 6 restos de His, SEQ ID No: 11) hasta una concentración de 100 ug/ml en tres tampones diferente (tampón fosfato 10mM a pH 6,1, tampón Tris 20 mM a pH 7,5 y tampón Tris 20 mM a pH 8,5) que contenían concentraciones de cloruro de sodio finales de 0, 50, 150, 300 y 450 mM.

Resultados

Los hallazgos de este experimento se presentan en las figuras 11 y 12.

Tanto la DLS como la nefelometría demuestran una tendencia general de que Mtb72f es sensible a la concentración de sales y al pH, de una manera similar a M72, como se muestra en los ejemplos anteriores. En consecuencia, los beneficios de la presente invención se aplican a los antígenos relacionados Rv1196 y no solo a la propia secuencia de M72.

En el caso de un número de muestras de DLS, la instrumentación no pudo determinar un tamaño de partícula específico (mostrado como NV en la Figura 14).

Ejemplo 16: Prevención del "desplazamiento salino" en composiciones que comprenden M72, inmunoestimulantes y que usan sorbitol como agente de tonicidad

Para comparar la estabilidad de composiciones inmunógenas que contienen NaCl 150 mM con composiciones que usan sorbitol como agente de tonicidad, se monitorizaron las muestras usando un ELISA alternativo.

Procedimiento

Se preparó la torta de liofilización como se ha descrito en el ejemplo 11 (específicamente el procedimiento (a), de modo que cuando se combinan con las formulaciones coadyuvantes apropiadas del ejemplo y 7 se obtendría un pH de 8,5.

La torta de liofilización descrita anteriormente se reconstituyó con 625 ul de las soluciones de coadyuvantes preparados en el Ejemplo 7. Después de la reconstitución con solución de coadyuvante, se obtuvieron las siguientes composiciones inmunógenas:

(i) M72 con dos restos de His N terminales – ASA (150 mM NaCl -2) pH 8,5

10 ug de antígeno (20 ug/ml)

5 % p/v de sacarosa

Tris 40 mM

5

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20

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40

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0,02 % p/v de Tween80

500 ug de DOPC

125 ug de colesterol

25 ug de 3D-MPL

25 ug de QS21

NaCl 150 mM

Fosfato 10 mM

pH 8,5

(ii) M72con dos restos de His N terminales – ASA (sorbitol -2)) pH 8,5

10 ug de antígeno (20 ug/ml)

5 % p/v de sacarosa

Tris 40 mM

0,02 % p/v de Tween80

500 ug de DOPC

125 ug de colesterol

25 ug de 3D-MPL

25 ug de QS21

NaCl 5 mM

4,7% p/v de sorbitol

Fosfato 10 mM

pH 8,5

Las composiciones inmunógenas descritas anteriormente reconstituidas se caracterizaron después de almacenamiento a 30 °C (T24h) y se compararon con una muestra preparada extemporáneamente (TO).

La antigenicidad se cuantificó mediante un sándwich de tipo ELISA indirecto en el que el antígeno es capturado por un anticuerpo policlonal de conejo específico de M72 y posteriormente se reveló mediante un anticuerpo monoclonal de ratón específico de M72 (Mtb39). Brevemente, la placa se recubre con anticuerpo policlonal de conejo anti-M72 a la dilución de 1/8000 en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco a 4 ºC y después de cuatro lavados se bloquearon las placas durante 1 hora a 37 ºC con tampón de saturación (PBS, 0,1 % de Tween 20, 1 % de BSA). Después de la etapa de lavado, el patrón de proteína (M72 purificado a granel: 1950 ug/ml), control interno (M72: 1768 µg/ml) y las muestras se cargan en pocillos de la primera columna de la placa a una concentración de aproximadamente 0,25µg/ml y después se realiza una dilución en serie por dos en el tampón de saturación (PBS, 0,025% de Tween 20) del pocillo 1 al 12 y se incuba 1h30 a 37 ºC. Después de la etapa de lavado, el complejo inmune se incuba después 1h a 37 °C con anticuerpo monoclinal anti-M72 a una dilución de 1/1000 en tampón de saturación (PBS, 0.025 % de Tween 20). Después de cuatro lavados, se añadió un anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo biotinilado a una dilución de 1/1000 en tampón de saturación (PBS, 0,025 % de Tween 20). Después de cuatro lavados, la señal se amplificó mediante la adición de peroxidasa de rábano con estreptavidina diluida a 1/4000 en tampón de saturación (PBS, 0,025 % de Tween 20). Después de cuatro lavados, la señal se reveló mediante orto diclorhidrato de fenilendiamina (OPDA) durante 15 minutos a TA y la reacción se detuvo mediante la adición de HCl 1M. La coloración es proporcional a la cantidad de anticuerpo anti-M72 unido, y se mide a 490 nm y 620 nm. Todas las etapas de lavado se realizaron con PBS, 0,025 % de Tween 20.

Todos los valores medidos se presentan en relación con la antigenicidad esperada sobre la base de la proteína purificada a granel utilizada para preparar las formulaciones ensayadas.

Resultados

Los resultados se muestran en la Figura 15. Los rombos indican las mediciones específicas para cada una de las tres muestras de ensayo, con una línea que indica el valor medio.

La recuperación de antígeno es bastante estable después de la reconstitución en composiciones de sal bajas utilizando sorbitol como agente de tonicidad a un pH de 8,5 hasta 24 horas a 30 ºC. La recuperación de ASA (sorbitol-2) fue del 83,5 % después de 24 horas (T0 87,1%, es decir, el 95,9 % de la antigenicidad relativa se mantuvo), mientras que la recuperación de ASA (NaCl-2) fue de 54,5 % después de 24 horas (T0 81,0 %, es decir, solo el 67,3 % de la antigenicidad relativa se mantuvo después del almacenamiento).

En resumen, el Ejemplos 8 demuestra por primera vez que el impacto perjudicial resultante del pH y la concentración de NaCl sobre la estabilidad de composiciones inmunógenas que contienen un antígeno relacionado con Rv1196. Ejemplo 14 extiende este trabajo para demostrar que otras sales también pueden tener un impacto perjudicial sobre la estabilidad de composiciones inmunógenas que contienen un antígeno relacionado con Rv1196, demostrando los Ejemplos 10, 11, 12, 15 y 16 que el efecto es también aplicable a otras secuencias.

La reformulación de las composiciones inmunógenas con un agente de tonicidad no iónico aborda los problemas de estabilidad del antígeno. Además, los Ejemplos 3, 4 y 12 demuestran la eliminación de sustancialmente todo el NaCl de la formulación inmunógena y su sustitución con sorbitol como un agente de tonicidad no tiene un impacto

Claims

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