ES2574303T3 - Método para determinar inhibidores de coagulación - Google Patents
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Abstract
Método para determinar un inhibidor de un factor de coagulación proteolíticamente activo en una muestra, el cual comprende los pasos de: a) proporcionar e incubar una mezcla de reacción que contiene i. una alícuota de la muestra ii. una cantidad definida de un factor de coagulación proteolíticamente activo, iii. al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulación proteolíticamente activo, pero no es disociado por éste en un enlace de péptido, iv. un primero y segundo componente de un sistema generador de señal los cuales interactúan de tal manera que surge una señal detectable si el primero y segundo componente del sistema formador de señal se llevan a proximidad espacial uno del otro y, en cuyo caso, el factor de coagulación proteolíticamente activo está asociado con el primer componente del sistema formador de señal o se asociará durante la incubación, y el ligando está asociado con el segundo componente del sistema formador de señal o se asociará durante la incubación; b) medir la señal del sistema formador de señal, en cuyo caso la altura de la señal es inversamente proporcional a la concentración de inhibidor en la muestra.
Description
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DESCRIPCION
Metodo para determinar inhibidores de coagulacion
La presente invencion se encuentra en el campo de los diagnosticos de coagulacion y se refiere a un metodo homogeneo para determinar inhibidores de factores de coagulacion proteollticamente activos (anticoagulantes) en una muestra, principalmente inhibidores directos de trombina y factor Xa, como tambien a un kit de ensayo para usarse en un metodo de este tipo.
Las terapias anticoagulantes comunes apuntan en primer lugar a la inhibition de los factores de coagulacion procoagulatorios trombina (factor Ila, Flla) y factor Xa (FXa). Se distingue entre anticoagulacion oral con antagonistas de vitamina K, como Coumadin por ejemplo, por lo cual se efectua una inhibicion de la slntesis de factor de coagulacion, y la anticoagulacion mediante inhibicion de los factores activos de coagulacion en la corriente sangulnea. Entre los anticoagulantes que inhiben o activan los factores activos de coagulacion en la corriente sangulnea se distinguen anticoagulantes con action directa y anticoagulantes con action indirecta. Los anticoagulantes con accion directa, tales como por ejemplo rivaroxaban, dabigatran o melagatran, se enlazan a la trombina o al factor Xa y por lo tanto son altamente especlficos. Anticoagulantes con accion indirecta como por ejemplo heparina se enlazan a inhibidores de factor de coagulacion endogenos tales como antitrombina, por ejemplo, e intensifican en muchas veces su accion anticoagulante.
Todos los anticoagulantes que inhiben los factores activos de coagulacion en la corriente sangulnea se distinguen por un patron especlfico de desactivacion. Determinadas clases de sustancias como, por ejemplo, heparina no fraccionada, de alto peso molecular, inhiben tanto la trombina como el factor Xa. Otras sustancias actuan de manera altamente especlfica, inhibiendo de esta manera trombina (por ejemplo, hirudin, dabigatran, melagatran) o factor Xa (por ejemplo, pentasacaridos como fondaparinux, rivaroxaban).
Inhibidores directos e indirectos de los factores de coagulacion procoagulatorios del sistema de coagulacion sangulnea, el factor Xa y trombina desempenan un papel creciente en el tratamiento y prevention de enfermedades cardiovasculares y tromboembolicas. Estos inhibidores pueden detectarse mediante ensayos establecidos actualmente solo de una manera muy compleja. Un ensayo simple y sensible para dicha sustancia serla importante tanto para monitorear la terapia como para detectar la presencia de dichas sustancias en una muestra de paciente anonima. Estos ensayos tendrlan que poder detectar una cantidad relativamente alta de inhibidores estructuralmente no relacionados de trombina o de F Xa de una manera altamente sensible.
En los ensayos cromogenicos aplicados en la actualidad para determinar anticoagulantes en la muestra de paciente que va a investigarse, que habitualmente se compone de plasma, se mezcla con un sustrato para un factor de coagulacion. Puesto que la mayorla de los factores de coagulacion sangulnea son endopeptidasas de serina, es decir hidrolasas que pueden disociar enlaces de peptido, principalmente se utilizan sustratos de peptido que se disocian tan especlficamente como es posible por el factor de coagulacion sangulnea que va a determinarse y que tienen un grupo de senal detectable. En los ensayos cromogenicos establecidos, incluso en los disponibles comercialmente, se utilizan principalmente los cromoforos para-nitroanilina (pNA) y acido 5-amino-2-nitro-benzoico (ANBA), los cuales tienen un maximo de absorcion a 405 nm. El color amarillo producido se determina normalmente por medio de fotometrla. Al determinar anticoagulantes, la concentration de color en la mezcla de ensayo es inversamente proporcional a la concentracion de anticoagulante en la muestra.
En un primer grupo de ensayos cromogenicos aplicados en la actualidad para determinar anticoagulantes que inhiben la actividad de factores de coagulacion sangulnea, la muestra de paciente que va a ensayarse se mezcla usualmente con una cantidad definida de un factor de coagulacion activado y con un sustrato para este factor de coagulacion. Cuanto mas anticoagulante este presente en la muestra, mas intensamente se inhibe el factor de coagulacion activado y menos sustrato se disocia. Ejemplos de ensayos comercialmente disponibles a base de este principio de ensayo son el ensayo de heparina Berichrom® de Siemens Healthcare Diagnostics para determinar heparina por medio de la inhibicion de factor Xa adicionado o el ensayo de actividad de hirudina de Siemens Healthcare Diagnostics para determinar hirudina por medio de la inhibicion de trombina adicionada.
En un segundo grupo de ensayos cromogenicos actualmente aplicados para determinar anticoagulante, la muestra de paciente que va a ensayarse se mezcla con un factor de coagulacion inactivo, un activador de coagulacion y con un sustrato cromogenico para el factor de coagulacion. Adicionando el activador de coagulacion primero se activa el factor de coagulacion inactivo adicionado. Cuanto mas anticoagulante este contenido en la muestra, mas intensamente se inhibe el factor de coagulacion activado y menos sustrato se disocia. Los ensayos comercialmente disponibles que se basan en este principio de ensayo son, por ejemplo, el ensayo Haemosys®-ECA T Test de JenAffin para la determination de inhibidores de trombina sinteticos, directos o el ensayo Haemosys®-ECA H Test de JenAffin para determinar hirudina por medio de la inhibicion de trombina/meizotrombina, el cual se forma adicionando protrombina y ecarina como activadores de coagulacion en la muestra.
Otro principio de ensayo para determinar anticoagulantes se encuentra descrito en la EP-A1-2 177 625. En este principio de ensayo igualmente se determina la disociacion de un sustrato especlfico al factor de coagulacion,
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aunque no con ayuda de sustratos cromogenicos sino con ayuda de un diferente sistema formador de senales. Este sistema comprende dos componentes que, al enlazarse simultaneamente al sustrato intacto, interaction debido a la cercana proximidad espacial y generan una senal detectable, por ejemplo fluorescencia o quimioluminiscencia. Como consecuencia de la disociacion de un enlace de peptido del sustrato, los dos componentes se separan uno de otro y, por lo tanto, no tiene lugar una senal. Cuanto mas anticoagulante este contenido en la muestra, mas intensamente se inhibe el factor activador de coagulacion, tanto menos sustrato se disocia y mas intensamente es la formacion de senal. La ventaja de los procedimientos de ensayo a base de fluorescencia o de quimioluminiscencia, frente a los ensayos cromogenicos, consiste fundamentalmente en que son mas sensibles y permiten mediciones en sangre entera.
La desventaja del metodo antes descrito, en el cual un sustrato disociable se "sujeta" hasta cierta medida entre los dos componentes del sistema de senalizacion consiste en que el ligando del sustrato en ambos lados del sitio de disociacion tiene que tener regiones para asociacion con los componentes de senalizacion. Los ligandos de sustrato son habitualmente sustratos de peptido sinteticos, de bajo peso molecular, que tienen dos residuos artificiales para la asociacion con los componentes que emiten senales, tales como, por ejemplo, una etiqueta bandera terminada en amino o un residuo de biotina terminado en carboxilo. Sin embargo, el acoplamiento de residuos de este tipo a sustratos de peptido con bajo peso molecular siempre esta unido al riesgo de que la estructura del peptido se modifique de tal manera que ya no pueda enlazarse o disociarse por parte de la enzima que va a detectarse, por lo cual proporcionar ligandos de sustrato adecuados es tecnicamente complejo.
Luego, es deseable modificar los metodos conocidos para determinacion de anticoagulantes en los cuales se utilizan dos componentes que interaction debido a la proximidad espacial y generan una senal detectable de tal manera que puedan utilizarse ligandos con bajo peso molecular que deban presentar de manera maxima un residuo artificial para la asociacion con uno de los componentes generadores de senales.
Este objetivo se logra mezclando una allcuota de una muestra, de la cual se sospecha que contiene un anticoagulante, con una cantidad definida de un factor de coagulacion activo de modo proteolltico y con un ligando que se enlaza al sitio activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por parte de este en un enlace de peptido, e inhibiendo la senal generada por el sistema formador de senales como resultado del enlazamiento del ligando al factor de coagulacion activado. El inhibidor del factor de coagulacion activado que esta contenido en la muestra, es decir el anticoagulante, compite de una manera dependiente de la concentracion con el ligando por el enlazamiento al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo y de esta manera inhibe la generacion de senal. Cuanto mas anticoagulante este contenido en la muestra tanto menor senal se genera.
La presente invencion se refiere por lo tanto a un metodo para determinar un inhibidor de un factor de coagulacion proteollticamente activo, es decir un anticoagulante, en una muestra, y el cual comprende los pasos de
a) Proporcionar e incubar una mezcla de reaccion que contiene
i. Una allcuota de la muestra,
ii. Una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo,
iii. Al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo, pero no se disocia por parte de este en un enlace de peptido,
iv. Un primero y un segundo componente de un sistema formador de senal que interaction de tal manera que surge una senal detectable cuando el primero y el segundo componente del sistema formador de senal se llevan a una proximidad espacial entre si y en cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo se asocia con el primer componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion y en cuyo caso el ligando esta asociado con el segundo componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion;
b) Medir la senal del sistema formador de senal, en cuyo caso la altura de la senal es inversamente proporcional a la concentracion de anticoagulante en la muestra.
El termino "anticoagulante" se utiliza con respecto a la presente invencion para inhibidores de factores de coagulacion proteollticamente activos que son de origen natural o sintetico y cuya utilizacion pretendida es la inhibicion del sistema de coagulacion in vivo en personas o animales. Esto incluye tambien sustancias de alto peso molecular como hirudina o heparina, que enlazan una enzima en diferentes sitios de enlazamiento aunque tambien compuestos de bajo peso molecular como rivaroxaban, dabigatran o melagatran, para los cuales es suficiente enlazarse solamente en el centro activo de la enzima con el fin de inhibir la reactividad. Los terminos "anticoagulante" e "inhibidor de un factor de coagulacion proteollticamente activo" se utilizan como sinonimos en el contexto de la invencion.
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En relacion con la presente invencion, por el termino "ligando" se entienden sustancias que se enlazan en el sitio activo de un factor de coagulacion proteoliticamente activo y, por lo tanto, compiten con un inhibidor por el sitio de enlazamiento. Sin embargo, no se disocian ligandos adecuados en un enlace de peptido por parte del factor de coagulacion proteoliticamente activo debido a que les falta un enlace de peptido disociable por parte de dicho factor de coagulacion proteoliticamente activo, es decir que no tienen un enlace de peptidilo (R-CONH-R, R = residuo de aminoacido) capaz de hidrolizarse por el factor de coagulacion proteoliticamente activo. Ambos ligandos de enlazamiento reversible e irreversible son adecuados.
El ligando puede ser una molecula producida sinteticamente, de modo recombinante o biotecnologico, o puede ser una molecula de existencia natural.
Un ligando puede ser un derivado de peptido cuya secuencia se deriva de la secuencia de un sustrato natural de la enzima. Un ligando derivado de peptido para los propositos de la presente invencion difiere de un sustrato de peptido en que no se disocia hidroliticamente por parte del factor de coagulacion proteoliticamente activo, mientras que la disociacion de un sustrato de peptido produce fragmentos que se liberan desde el sitio activo de la enzima y la enzima, sin modificaciones, proviene de la reaccion.
Derivados de peptido adecuados comprenden de modo preferido 3 a aproximadamente 150 residuos de aminoacidos. Para no poder disociarse por el factor de coagulacion proteoliticamente activo en un enlace de peptido, el grupo carboxilo carboxi-terminal de un derivado de peptido segun la invencion se reemplaza preferiblemente por un grupo funcional del grupo de aldehido (-CHO), cetona (-COR; R= alquilo o aril), trifluorometilcetona (-COCF3), acido a-cetocarboxilico (-COCOOH), a-cetoamida (-COCONHR; R= alquilo o arilo) y a-cetoester (-COCOOR; R= alquilo o arilo), ester (-COOR; R= alquilo o arilo), acido boronico (-B(OR)2), clorometilcetonas (-COCH2O) y sulfonilfluoruros (-SO2F). El derivado de peptido puede tener otras modificaciones estructurales, por ejemplo la utilizacion parcial de D-aminoacidos en lugar de L-aminoacidos de existencia natural.
La tabla 1 tiene ejemplos de grupos funcionales tipicos para ligandos de derivado de peptido de enlazamiento reversible e irreversible.
Tabla 1
- Tipo de ligando
- Grupo funcional
- irreversible
- Clorometilcetona -COCFhCl
- Fluoruro de sulfonilo -SO2F
- Ester -COOR (R=Alquilo o Aril)
- Acido boronico B(OR2) (R=Alquilo o Arilo)
- reversible
- Aldehido -CHO
- Cetona -COR (R=Alquilo o Arilo)
- T rifluorometilcetona -COCF3
- Acido a- cetocarboxilico -COCOOH
- a-Cetoamida -COCONHR (R=Alquilo o Arilo)
- a-Cetoester -COCOOR (R=Alquilo o Arilo)
Ejemplos de ligandos de derivado de peptido que se enlazan en el centro activo de trombina pero que no se disocian por esta en un enlace de peptido, son:
• H-D-Fe-Pro-Arg-H
• Me-D-Fe-Pro-Arg-H
• H-D-Fe-Pro-Agm
• H-D-Fe-Pro-Arg-CH2-Cl
• H-D-Fe-Pro-Arg-CH2F
• Boc-DL-Dpa-Pro-Arg-H
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• Ac-D-Fe-Pro-boroArg pinanodiol ester
• D-Fe-Pro-NH-CH(metoxipropil)-P(O)(OPh)2
Ejemplos de ligandos derivados de peptido que se enlazan en el centro activo del factor Xa pero no se disocian por este en un enlace de peptido son:
• D-Arg-Gly-Arg-H
• Dansilo-Glu-Gly-Arg-CH2Cl
Respecto de los ligandos derivados de peptido mencionados, vease tambien Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436.
Un ligando puede ser ademas un compuesto que no pertenece al grupo de los compuestos de peptido tales como, por ejemplo, un ester de arginina, un ester de amidinofenilalanina, un ester de p-guanidinofenilalanina, un ester de 3- amidinofenilalanina, un derivado dibasico de acido (amidinoaril)propanoico o un derivado de oxazolidinona.
Ligandos derivados de arginina que se enlazan en el sitio activo de trombina pero no se disocian por esta en un enlace de peptido son, por ejemplo, Na-arilsulfonilargininamida (Ri-SO2-Arg-N-R2/R3i Ri= grupo hidrofobico alifatico o aromatico) (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436).
Ligandos derivados de amidinofenilalanina que se enlazan en el centro activo de trombina pero no son disociados por esta en un enlace de peptido son, por ejemplo, Na-(l3-naftilsulfonil)-4-amidinofenilalanina piperidida o Na-(I3- naftilsulfonil-glucil)-4-amidinofenilalanina piperidida (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411436).
Un ligando derivado de p-guanidinofenilalanina, que se enlaza en el centro activo de trombina, pero no se disocia por parte de esta en un enlace de peptido es, por ejemplo, Tos-Gpa-piperidida (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436).
Un ligando derivado de ester de 3-amidinofenilalanina, el cual se enlaza en el centro activo del factor Xa, pero no se disocia por parte de este es, por ejemplo, Na-(l3-naftilsulfonil-glicil)-3-amidinofenilalanina (Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, 411-436).
Un ligando derivado de acido (amidinoaril)propanoico dibasico, que se enlaza en el centro activo del factor Xa, pero no se disocia por parte de este en un enlace de peptido, es, por ejemplo, acido (2S)-2-[4[[(3S)-1-acetimidoil-3- pirrolidinil]oxi]fenil]-3-(7-amidino-2-naphtil)propanoico (Nagahara, T. et al., J. Med. Chem. 1994, 37, 1200-1207).
Un ligando derivado de oxazolidinona que se enlaza en el centro activo del factor Xa, pero no se disocia por parte de este en un enlace de peptido, es por ejemplo 5-cloro-N-({(5S)-2-oxo-3-[4-(3-oxomorfolin-4-il)fenil]-1,3-oxazolidin-5- il}metil)tiofen-2-carboxamida (Roehrig, S., et al., J. Med. Chem. 2005, 48(19), 5900-5908).
Por ligando de enlazamiento reversible se entiende un ligando que dependiendo de la concentracion de al menos un inhibidor natural o sintetico puede desplazarse del centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo.
Ejemplos de ligandos adecuados que se enlazan a trombina de modo reversible son derivados de peptido tales como, por ejemplo, H-D-Fe-Pro-Arg-H, Me-D-Fe-Pro-Arg-H o H-D-Fe-Pro-Agm. En agmantina (Agm) el grupo carboxilo esta reemplazado por hidrogeno. Otros ligandos que se enlazan a la trombina de modo reversible son Na- arilsulfonilargininamida (R1-SO2-Arg-N-R2/R3) o derivados de amidinopiperidina tales como Na-(l3-naftilsulfonil)-4- amidinofenilalanina piperidida o derivados de p-guanidinofenilalanina (Gpa), amidinofenilalanina (Apa) como, por ejemplo, Tos-Gpa-piperidida y Tos-Apa-piperidida o tambien acidos peptido amino boronicos como por ejemplo Ac- D-Fe-Pro-NH-CH(CH2-fenil)-B-OPin y D-Ala-Pro-NH-CH(metoxipropil)-P(O)(OPh)2.
Ejemplos de ligandos adecuados que se enlazan de modo reversible al factor Xa son derivados de peptido tales como, por ejemplo, D-Arg-Gli-Arg-H o derivados de benzamidina y esteres de 3-amidinofenilalanina como por ejemplo Na-(l3-naftilsulfonil -glicil)-3-amidinofenilalanina.
Por ligando que se enlaza de manera irreversible se entiende un ligando el cual se enlaza en el centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo independientemente de la concentracion y el cual ya no puede desplazarse porque forma un enlace covalente con la enzima, por ejemplo y modifica la enzima de tal manera que el sitio activo se desactiva de modo reversible. Ligandos tlpicos que se enlazan de manera irreversible se componen de una parte que los introduce en el centro activo de la enzima y de un grupo qulmicamente reactivo que es capaz de formar enlaces covalentes con la enzima, es decir con la funcion hidroxilo de la serina en el centro activo en el caso de los factores de coagulacion proteollticamente activos. Para formar el enlace covalente con la enzima, una
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parte del grupo funcional se retira del ligando el cual, en la misma etapa de reaccion, se enlaza de modo covalente con la enzima.
Ejemplos de ligandos adecuados que se enlazan de modo irreversible a trombina son H-D-Fe-Pro-Arg-CH2-Cl o H- DFe-Pro-Arg-CH2F.
Un ejemplo de un ligando adecuado que se enlaza de modo reversible al factor Xa es dansilo-Glu-Gli-Arg-CH2Cl.
Pueden distinguirse ligandos que se enlazan de modo reversible e irreversible por su cinetica de reaccion. Al graficar 1/v, donde v es la velocidad de reaccion, frente a la concentracion de ligando (i) a concentracion constante de sustrato (S) se obtiene una recta. Al utilizar dos o mas concentraciones diferentes de sustrato (S1, S2... SN) las llneas se intersecan en un punto. El valor del eje de abscisa de este punto corresponde a -Ki, donde Ki corresponde a la constante de enlazamiento; vease la figura 3 fragmento (Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171). En caso de una inhibicion irreversible las curvas se encuentran en un solo punto sobre el eje x que nuevamente corresponde a -Ki.
Ligandos preferidos tienen una afinidad de enlazamiento hacia el factor de coagulacion proteollticamente activo la cual corresponde a la afinidad del anticoagulante que va a determinarse o es mas baja. Inhibidores de trombina utilizados como anticoagulantes presentan una constante de enlazamiento para trombina en el intervalo de 2,7 x 10' 14 Mol (hirudina) a 1,9 x 10-8 Mol (argatroban) (Prasa, D. et al., Thromb Haemost 77, 1997, 498-503). Los inhibidores de trombina tambien se enlazan, aparte de la trombina, al F Xa, aunque tambien con afinidad esencialmente mas baja, es decir con una constante de enlazamiento mas grande de 2,1 x 10-4 Mol, como por ejemplo argatroban (Prasa, D. et al., Thromb Haemost 78, 1997, 1215-1220). Los inhibidores de F Xa tiene una constante de enlazamiento en el intervalo de 8 x 10-11 Mol (apixaban) hasta 6,6 x 10-9 Mol (LY517717 difumarato), en cuyo caso los inhibidores de F Xa tambien se enlazan a trombina en cierta medida, aunque 10.000 veces mas debilmente, por ejemplo rivaroxaban (Perzborn, E., Hamostaseologie 3, 2009, 260-267). Ligandos reversibles pueden desplazarse de esta manera por el inhibidor que va a determinarse del centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo. De esta manera, los ligandos irreversibles con una afinidad seleccionada de modo correspondiente no pueden desplazar el medicamento a determinarse del centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo en un lapso de tiempo relevante. Por otra parte, la afinidad no tiene que ser demasiado baja porque de otra manera no puede producirse una senal.
La constante de enlazamiento de ligandos adecuados se encuentra, por lo tanto, de manera preferente en un intervalo de 0,0001 a 100.000 nM (10-13 a 10-4 M), particularmente preferible en un intervalo de 0,1 a 10.000 nM (1010 a 10-5 M), muy particularmente preferible en un intervalo de 1 a 1000 nM (10-9 a 10-6 M) .
En el contexto de la presente invencion, por el termino "muestra" ha de entenderse el material del cual se sospecha que contiene el anticoagulante que va a detectarse. El termino "muestra" comprende en particular fluidos o tejidos biologicos de humanos y animales tales como sangre, plasma, suero y tambien otros fluidos, secreciones o extractos corporales.
El metodo de la invencion comprende proporcionar e incubar una mezcla de reaccion que comprende una allcuota de la muestra, una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo, al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por este en un enlace de peptido, un primer y un segundo componente de un sistema formador de senales los cuales interaction de tal manera que surge una senal detectable cuando el primer y segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial entre si. El factor de coagulacion proteollticamente activo esta asociado o se asociara durante la incubacion con el primer componente del sistema formador de senal. El ligando esta asociado o se asociara durante la incubacion con el segundo componente del sistema formador de senal. A causa del enlazamiento del ligando al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo, los componentes del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro, por lo cual surge una senal detectable que se correlaciona con la actividad del factor de coagulacion proteollticamente activo en la mezcla de reaccion. El anticoagulante contenido en la muestra compite dependiendo de la concentracion con el ligando no disociable en un enlace de peptido por el enlazamiento al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo y de esta manera inhibe la generacion de senal. Cuanto mas anticoagulante este contenido en la muestra, menos senal se genera. Las senales formadas se miden y la altura de la senal es inversamente proporcional a la concentracion de anticoagulante en la muestra.
El metodo de la invencion es adecuado para determinar inhibidores de los factores de coagulacion proteollticamente activos trombina (factor Ila), factor Vila, factor IXa, factor Xa, factor XIa o factor Xlla.
De la especificidad del anticoagulante que va a determinarse depende cual factor de coagulacion activado y cual ligando se adicionan a la mezcla de reaccion.
Para la determination de una heparina, es decir una heparina no fraccionada de alto peso molecular (HMW Heparina) o una heparina de bajo peso molecular (LMW Heparin) o un heparinoide, en particular es adecuada la adicion de trombina o de factor Xa y la adicion de un ligando con especificidad de trombina o de factor Xa. Para la
determinacion de un inhibidor directo de trombina, por ejemplo de argatroban, melagatran, ximelagatran, bivalirudina, dabigatran, hirudina, lepirudina, MCC-977, SSR-182289, TGN-255, TGN-167, ARC-183 y odiparcil, principalmente es adecuada la adicion del factor IIa (trombina) y la adicion de un ligando con especificidad de trombina. Para la determinacion de un inhibidor directo de factor Xa, por ejemplo de rivaroxaban; apixaban;
5 otamixaban, los cuales se compilan en la nueva clase de sustancias de los xabanos; fondaparinux; LY 517717; YM 153; DU-176b; DX-9065a y KFA-1982 principalmente es adecuada la adicion de factor Xa y de un ligando especlfico de factor Xa.
El factor de coagulacion proteollticamente activo, anadido a la mezcla de reaccion puede ser un factor de coagulacion que haya sido aislado de tejidos o fluidos corporales animales o humanos, tales como, por ejemplo, 10 sangre o plasma, o aislado de los sobrenadantes o lisados de cultivos celulares animales o humanos, o de cultivos de celulas eucariotas o de microorganismos como bacterias u hongos que expresan un factor de coagulacion recombinante. Los metodos para activar zimogenos inicialmente inactivos de los diferentes factores de coagulacion son bien conocidos por el experto en la materia. Cual factor de coagulacion activado se adiciona a la mezcla de reaccion depende del anticoagulante que va a determinarse.
15 En una modalidad del metodo de la invencion, el factor de coagulacion proteollticamente activo tiene una primera contraparte de enlazamiento X de un par de enlazamiento X/Y, y el primer componente del sistema productor de senal se asocia con la segunda contraparte de enlazamiento Y del par de enlazamiento X/Y, por lo cual el factor de coagulacion proteollticamente activo, debido al enlazamiento de las contrapartes de enlazamiento X e Y, esta enlazado al primer componente del sistema formador de senal o se enlazara al primer componente del sistema 20 formador de senal durante la incubacion de la mezcla de reaccion.
Las contrapartes de enlazamiento X e Y son dos moleculas diferentes que se reconocen y se enlazan una a la otra de manera especlfica. Ejemplos de reconocimiento y enlazamiento especlficos son interacciones anticuerpo- antlgeno, interacciones de polinucleotido, etc.
Pares de enlazamiento adecuados X/Y son ante todo combinaciones de antlgeno/anticuerpo, en cuyo caso la 25 contraparte de enlazamiento X es un epitope antigenico del factor de coagulacion proteollticamente activo. El epitope antigenico puede ser un epitope de secuencia natural o un epitope estructural de la proteina natural. El epitope antigenico tambien puede ser una secuencia heterologa o un epitope estructural de un factor de coagulacion activo modificado. Ejemplos de secuencia heterologa o de epitope estructural son etiquetas FLAG, o HIS o de fluoresceina, que se utilizan principalmente para etiquetar peptidos o proteinas. Otros pares adecuados de 30 enlazamiento X/Y son polinucleotidos complementarios X e Y. La contraparte de enlazamiento Y, asociada con el primer componente del sistema formador de senales, debe escogerse de tal modo que pueda enlazarse especificamente con el factor de coagulacion proteollticamente activo. De manera preferida, la contraparte Y consiste en un anticuerpo o en un fragmento del mismo que enlaza antigeno. Pares de enlazamiento particularmente preferidos X/Y son etiqueta FLAG/etiqueta anti-FLAG-anticuerpo, etiqueta HIS /etiqueta anti-HIS-anticuerpo, 35 fluoresceina/anti-fluoresceina-anticuerpo, biotina/avidina y biotina/estreptavidina.
En otra modalidad del metodo de la invencion, el factor de coagulacion proteollticamente activo esta enlazado mediante un enlace covalente con el primer componente del sistema formador de senal.
En otra modalidad, el ligando que se adiciona a la mezcla de reaccion tiene una primera contraparte de enlazamiento A de un primer par de enlazamiento A/B para enlazarse al segundo componente del sistema formador 40 de senal el cual tiene convenientemente la segunda contraparte B del par de enlazamiento A/B. De modo particularmente preferido, el ligando tiene al menos un residuo de biotina como contraparte de enlazamiento A.
Las contrapartes de enlazamiento A y B son dos moleculas diferentes que se reconocen y se enlazan especificamente una a la otra. Ejemplos de reconocimiento y enlazamiento especlficos son interacciones anticuerpo- antigeno, interacciones de polinucleotido, etc.
45 Pares adecuados de enlazamiento A/B son ante todo combinaciones de antlgeno/anticuerpo, en cuyo caso la contrapartes de enlazamiento A es un epitope antigenico del ligando. El epitope antigenico puede ser un epitope de secuencia o de estructura de una proteina natural o de un fragmento de proteina. El epitope antigenico tambien puede ser un epitope heterologo de secuencia o de estructura de un peptido modificado. Ejemplos de epitope heterologo de secuencia o de estructura son etiquetas FLAG, o HIS o fluoresceina, que se utilizan principalmente 50 para etiquetar sustancias de bajo peso molecular, peptidos o proteinas. Otros pares adecuados de enlazamiento A/B son polinucleotidos complementarios A y B. La contraparte de enlazamiento B, asociada con el segundo componente del sistema formador de senal, debe seleccionarse de tal modo que el ligando pueda enlazarse de modo especlfico. De manera preferida, la contraparte de enlazamiento B se compone de un anticuerpo o de un fragmento del mismo que forma antigeno. Pares de enlazamiento particularmente preferidos A/B son etiqueta 55 FLAG/etiqueta anti-FLAG- anticuerpo, etiqueta HIS/etiqueta anti-HIS-anticuerpo, fluoresceina/anti-fluoresceina- anticuerpo, biotina/avidina y biotina/estreptavidina.
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Un par de enlazamiento posible A/B para asociacion de ligando con el segundo componente formador de senal debe escogerse basicamente de tal modo que no interfiera con un segundo par de enlazamiento posible X/Y para la asociacion del factor de coagulacion proteollticamente activo con el primer componente formador de senal debido a un enlazamiento mutuo.
Una ventaja de la presente invention es que el ligando usado puede, pero no necesita, tener una segunda contraparte artificial de enlazamiento de un par de enlazamiento.
En el contexto de la presente invencion, por el termino "sistema formador de senal" debe entenderse un sistema que comprende al menos un primero y un segundo componente los cuales interaction de tal manera que surge una senal detectable cuando se llevan a proximidad espacial entre si.
En una modalidad los componentes del sistema formador de senal son fases solidas en forma de partlculas, por ejemplo partlculas de latex cuya aglutinacion se determina por medio de turbidimetrla o nefelometrla. Para este proposito, el primer componente del sistema formador de senal consiste en una primera fase solida en forma de partlculas cuya naturaleza es tal que esta asociada o es asociable con el factor de coagulacion proteollticamente activo. La primera fase solida en forma de partlculas puede conectarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo por medio de un enlace covalente o por medio de un par de enlazamiento X/Y o sera capaz de conectarse al mismo por medio de un par de enlazamiento X/Y en la mezcla de reaction. Ademas, el segundo componente del sistema formador de senal consiste en una segunda fase solida en forma de partlculas cuya naturaleza es tal que esta asociada o es asociable con el ligando. La segunda fase solida en forma de partlculas puede estar enlazada con el ligando por medio de un enlace covalente o por medio de un par de enlazamiento A/B o esta enlazada mediante un par de enlazamiento A/B en la mezcla de reaccion. Los inmunoensayos basados en el principio de dispersion de la luz, intensificada por partlculas, son conocidos desde aproximadamente 1920 (para una vision general vease Newman, D.J. et al., Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 1992; 29: 22-42). Preferiblemente se utilizan partlculas de poliestireno con un diametro de 0,1 a 0,5 pm, particularmente preferible con un diametro de 0,15 a 0,35 pm. Preferiblemente se utilizan partlculas de poliestireno con funciones carboxilo o aldehldo. Ademas se utilizan preferiblemente partlculas de tipo cascara/nucleo. Las slntesis de las partlculas y acoplamiento covalente de ligandos se describe, por ejemplo, en Peula, J.M. et al., Covalent coupling of antibodies to aldehyde groups on polymer carriers. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 1995; 6: 779785.
En otra modalidad del metodo de la invencion, el sistema formador de senal comprende al menos un primer o segundo componente que interaction de tal manera que surge una senal detectable si se llevan a proximidad espacial entre si y pueden entrar en interaction uno con otro. Por una interaction entre los componentes debe entenderse principalmente una transferencia de energla, es decir la transferencia directa de energla entre los componentes, por ejemplo mediante radiation lumlnica o electronica, as! como por medio de una molecula qulmica reactiva como, por ejemplo, oxlgeno singlete de corta vida. La transferencia de energla puede efectuarse de un componente a otro pero tambien es posible una cascada de diferentes sustancias por medio de la cual se haga la transferencia de energla. Por ejemplo, los componentes pueden ser un par consistente en un donante de energla y un receptor de energla tales como, por ejemplo, agente de fotosensibilizacion y agente de quimioluminiscencia (EP- A2-0515194, LOCI® Technologie) o fotosensibilizador y fluoroforo (WO 95/06877) o yodo radioactivo <125> y fluoroforo (Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 8672 - 8676) o fluoroforo y agente para apagado de fluorescencia (US 3,996,345).
El primer componente y/o el segundo componente del sistema formador de senal que puede interactuar entre si, pueden asociarse de modo covalente con una fase solida en forma de partlculas o mediante interaccion especlfica o pueden incrustarse a la misma. Por el concepto de fase solida en forma de partlculas se entienden partlculas capaces de suspenderse tales como, por ejemplo, soles metalicas, partlculas de sllice, partlculas magneticas o especialmente preferible partlculas de latex. Se prefieren partlculas con un diametro de 0,01 - 10 micrometres, principalmente se prefieren partlculas con un diametro de 0,1 - 1 micrometres.
El primer componente del sistema formador de senal cuyos componentes interaction de tal manera que surge una senal detectable si se llevan a proximidad espacial uno del otro y pueden interactuar entre si, tiene una naturaleza tal que se encuentra asociado o es capaz de asociarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo. El primer componente del sistema formador de senal puede estar asociado o ser capaz de asociarse directamente con el factor de coagulacion proteollticamente activo. Preferiblemente, el primer componente del sistema formador de senal esta asociado o es capaz de asociarse indirectamente con el factor de coagulacion proteollticamente activo. Para este proposito, el primer componente del sistema formador de senal esta asociado con una fase solida en forma de partlculas la cual esta asociada adicionalmente de modo covalente, o mediante un par de enlazamiento X/Y, con el factor de coagulacion proteollticamente activo, o es capaz de asociarse por medio de un par de enlazamiento X/Y.
El segundo componente del sistema formador de senal cuyos componentes interaction de tal modo que surge una senal detectable cuando se llevan a proximidad espacial uno del otro y gracias a esto pueden entrar en interaccion entre si tiene una naturaleza tal que esta asociado o es capaz de asociarse con el ligando. El segundo componente
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del sistema formador de senal puede estar asociado o ser capaz de asociarse directamente con el ligando. Preferiblemente, el segundo componente del sistema formador de senal esta asociado o es capaz de asociarse indirectamente con el ligando. Para este proposito, el segundo componente del sistema formador de senal esta asociado con una fase solida en forma de partlculas, la cual esta asociada adicionalmente de modo covalente o mediante un par de enlazamiento A/B con el ligando o es capaz de asociarse mediante un par de enlazamiento A/B.
En una modalidad preferida del metodo de la invencion para determinar un inhibidor de un factor de coagulacion proteollticamente activo se mezcla la muestra adicionalmente con un inhibidor de agregacion de fibrina. Los inhibidores de agregacion de fibrina son sustancias que impiden la agregacion de monomeros de fibrina inducidos por trombina. De esta manera se impide que aparezca un coagulo de fibrina en una muestra que contiene fibrinogeno, lo cual podrla de otra manera tener un impacto negativo en la medicion, un ejemplo limitando la difusion y la neutralizacion. Inhibidores de agregacion de fibrina preferidos son peptidos sinteticos tales como, por ejemplo, un peptido de la secuencia glicina, prolina, arginina, prolina (disponible comercialmente como Pefabloc® FG, Pentapharm, Suiza). Otros peptidos preferidos que pueden utilizarse como inhibidores de agregacion de fibrina, principalmente el peptido preferido de la secuencia glicina, prolina, arginina, prolina, alanina se describen en EP-A2- 456 152.
En una modalidad preferida del metodo de la invencion para determinar un inhibidor directo de un factor de coagulacion proteollticamente activo, a la mezcla de reaccion adicionalmente se agrega una poliamina tal como Polybrene® (bromuro de hexadimetrina), espermina o polilisina. Las poliaminas inhiben la inhibicion directa del factor de coagulacion por heparinas. De esta manera, con el metodo de la invencion puede distinguirse entre induccion por heparina e inhibicion directa.
Despues que se ha suministrado la mezcla de reaccion que contiene la muestra, una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo, al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por el mismo en un enlace de peptido, y un primer y un segundo componente de un sistema formador de senal, la mezcla de reaccion es incubada por un tiempo limitado a fin de asegurar suficiente asociacion de factor de coagulacion proteollticamente activo, anticoagulante y ligando y, opcionalmente, del primer componente generador de senal con el factor de coagulacion proteollticamente activo y/o del segundo componente formador de senal con el ligando. El termino "suficiente" debe entenderse de tal modo que el metodo permita enteramente una determinacion cuantitativa de un inhibidor de un factor de coagulacion proteollticamente activo. La duracion optima de incubacion de un diseno de ensayo especificado puede determinarse experimentalmente. Puede proporcionarse la mezcla de reaccion en varios pasos individuales, en diferentes secuencias y diferentes tiempos de incubacion.
La senal o la modificacion de la senal como una funcion del tiempo que se produce en la mezcla de reaccion se correlacionan con la actividad o la cantidad del inhibidor del factor de coagulacion proteollticamente activo. La actividad o la cantidad de un inhibidor del factor de coagulacion proteollticamente activo pueden establecerse por medio de dicha correlacion con la ayuda de dicha senal o dicha modificacion de senal en el tiempo. Para este fin se prefiere llevar a cabo una calibracion usando un estandar. Dicho estandar posee una actividad o cantidad definidas del inhibidor del factor de coagulacion proteollticamente activo.
Otro objeto de la presente invencion son los kits de ensayo para realizar las diferentes modalidades del metodo de la invencion.
Un primer kit de ensayo contiene los siguientes componentes por separado:
i. Un primer reactivo que comprende una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo;
ii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por este en un enlace de peptido;
iii. Un tercer reactivo que contiene un primer componente de un sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo del primer reactivo; y
iv. Un cuarto reactivo que contiene un segundo componente de un sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el ligando del segundo reactivo.
Al usar un kit de ensayo de este tipo, cada componente se adiciona individualmente a la muestra o a la mezcla de reaccion y tiene lugar la asociacion del factor de coagulacion proteollticamente activo con el primer componente del sistema generador de senal y la asociacion de ligando con el segundo componente del sistema generador de senal durante la incubacion en la mezcla de reaccion. Esto tiene la ventaja de que el tercero y cuarto reactivo pueden ser respectivamente un reactivo de deteccion capaz de utilizarse universalmente, en tanto que la asociacion del factor de coagulacion proteollticamente activo o del ligando se efectua por medio de pares de enlazamiento convencionales A/B o X/Y, por ejemplo mediante estreptavidina/biotina, avidina/biotina, etiqueta Flag /etiqueta anti- Flag-anticuerpo o similares.
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Otro kit de ensayo contiene los siguientes componentes por separado:
i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo, en cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo se encuentra asociado con un primer componente de un sistema formador de senal;
ii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no es disociado por este en un enlace de peptido; y
iii. Un tercer reactivo que contiene un segundo componente del sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el ligando del segundo reactivo.
Al usar un kit de ensayo de este tipo solo tiene lugar la asociacion de ligando con el segundo componente del sistema formador de senal durante la incubacion en la mezcla de reaccion; el factor de coagulacion proteollticamente activo ya se encuentra asociado con el primer componente del sistema formador de senal.
Otro kit de ensayo contiene los siguientes componentes por separado:
i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo;
ii. Un segundo reactivo que contiene un primer componente de un sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo del primer reactivo; y
iii. Un tercer reactivo que contiene al menos un ligando se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo, pero no se disocia por este en un enlace de peptido, y en este caso el ligando se encuentra asociado con un segundo componente del sistema formador de senal.
Al usar un kit de ensayo de este tipo solamente tiene lugar la asociacion del factor de coagulacion proteollticamente activo con el primer componente del sistema formador de senal durante la incubacion en la mezcla de reaccion; el ligando ya se encuentra asociado con el primer componente del sistema formador de senal.
Otro kit de ensayo contiene los siguientes componentes por separado:
i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de factor de coagulacion proteollticamente activo, en cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo se encuentra asociado con un primer componente de un sistema formador de senal; y
ii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando el cual se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no es disociado por este en un enlace de peptido, y en este caso el ligando esta asociado con un segundo componente del sistema formador de senal.
Al usar un kit de ensayo de este tipo, tanto el factor de coagulacion proteollticamente activo como tambien el ligando se encuentran ya asociados con el respectivo componente del sistema formador de senal.
La ventaja de los kits de ensayo en los cuales el factor de coagulacion proteollticamente activo y/o el ligando ya se encuentran asociados con el respectivo componente generador de senal consiste, entre otras cosas en que se minimiza la cantidad de reactivos que van a utilizarse, gracias a lo cual se evitan etapas de dosificacion con pipeta y se reduce el riesgo de riesgos de dosificacion con pipeta.
Listado de abreviaturas
Ac Acilo-
Agm Agmantina
Ala Alanina
ANBA Acido 5-amino-2-nitro-benzoico Arg Arginina
B-f-P-R-H Biotinil-Ttds--D-Fe-Pro-Arg-H
Boc Carbonato de ter-butilo B-r-P-R-H Biotinil-Ttds--D-Arg-Pro-Arg-H
Dpa 13,13-Difenilalanina f D-Fenilalanina Gli Glicina
Gpa Guanidinofenilalanina 5 His Histidina
IPA Isopropilamida Ki Constante de enlazamiento Me Metil- Ph Fenil-
10 Fe Fenilalanina
pNA para-nitroanilina Pro Prolina r D-Arginina
R Coeficiente de correlacion 15 Tos Tosil-
Ttds Acido 4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiaminosucclnico Z-D-Leu Carbobenzoxi-D-leucina Description de las figuras Figura 1
20 Representation esquematica de un diseno de ensayo ejemplar para un diseno ejemplar de ensayo para un metodo
segun la invention para determinar inhibidores de trombina por medio de tecnologla LOCI. Trombina proteollticamente activa esta enlazada a una fase solida en forma de partlculas que ademas estan recubierta con un agente quimioluminiscente (Chemibead, CB). El segundo componente del sistema formador de senal esta compuesto de una fase solida en forma de partlculas que se encuentra recubierta con un fotosensibilizador y 25 ademas con estreptavidina (Sensibead, SB). Un ligando que se enlaza al centro activo de trombina pero no se disocia por esta y la cual tiene una marcacion con biotina y dicha marcacion se enlaza a la estreptavidina del Sensibeads, acerca espacialmente ambos componentes del sistema formador de senal. La excitation del foto sensibilizado con la luz provoca la generation de oxlgeno singlete de vida corta, el cual es capaz de activar el agente quimioluminiscente, gracias a lo cual se emite una senal luminiscente. Cuanto mas inhibidor de trombina 30 (anticoagulante) se encuentre contenido en una muestra, el cual compite con el ligando biotinilado no disociable por el enlazamiento con la trombina, menor sera la senal de luminiscencia que se genera.
Figura 2
Formula estructural del acido biotinil-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminamina succlnico amino terminal (Biotinil-Ttds) conector del ligando especlfico de trombina biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H y del ligando especlfico del factor Xa 35 biotinil-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H.
Figura 3
Determination de la constante de enlazamiento de trombina de biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H). Representacion de la dependencia inversa de la velocidad de reaccion de la concentracion de ligando en caso de concentraciones de sustrato cromogenicas de 4,2 y 0,5 mM en un ensayo de trombina segun el ejemplo 2.
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Determinacion de la constante de enlazamiento de trombina de biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H). Fragmento agrandado de la figura 3.
Figura 5
Determinacion de la constante de enlazamiento de trombina de Biotinil-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H). Representacion de la dependencia del valor inverso de la velocidad de reaccion de la concentracion delegando en caso de concentraciones de sustrato cromogenicas de 4,2 y 0,5 mM en un ensayo de trombina segun el ejemplo 2.
Figura 6
Determinacion de la constante de enlazamiento de F Xa de biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H). Representacion de la dependencia del valor inverso de la velocidad de reaccion de la concentracion delegando en caso de concentraciones de sustrato cromogenicas de 4, 2 y 0,5 mM en un ensayo de F Xa segun el ejemplo 3.
Figura 7
Determinacion de la constante de enlazamiento de F Xa de biotinil-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H). Representacion de la dependencia del valor inverso de la velocidad de reaccion de la concentracion de ligando en caso de concentraciones cromogenicas de 4, 2 y 0,5 mM en un ensayo de F Xa segun el ejemplo 3.
Figura 8
Generation de la senal de quimioluminiscencia en plasma humano estandar con diferentes concentraciones de los inhibidores de trombina fragmina, liquemina, argatroban, melagatran y refludan (hirudina), en cuyo caso el ligando biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H) fue empleado en conexion con Chemibeads recubiertas con trombina y Sensibeads recubiertas con estreptavidina.
Figura 9
Generacion de senal de quimioluminiscencia en plasma humano estandar con diferentes concentraciones de los inhibidores de FXa fragmina, liquemina y rivaroxaban y de los inhibidores de trombina refludan (hirudina) y argatroban, en cuyo caso el ligando biotinil-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H (B-r-G-R-H) se empleo en conexion con Chemibeads recubiertas con anticuerpo anti-FXa, Sensibeads recubiertas con FXa y estreptavidina.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la presente invention y no deben entenderse como una restriction.
Ejemplo 1: Slntesis de ligandos de trombina y factor Xa-biotinil-Ttds-aldehldo de peptido
Los aldehldos de peptido -D-Fe-Pro-Arg-H (vease Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, pagina 417) y -D-Arg-Gly-Arg-H (comparese Claeson, G., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 1994, pagina 426) fueron sintetizados sobre una fase solida, se alargaron con un espaciador Ttds (Ttds = acido 4,7,10-trioxa-1,13- tridecandiamino succlnico (Bartos, A. et al., 2009, Biopolymers 92(2), 110-115) y se les proporciono biotina. El compuesto biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H tiene un peso molecular de 930,15 g/mol y se denomina brevemente en lo sucesivo B-f-P-R-H. El compuesto biotinil-Ttds-D-Arg-Gly-Arg-H tiene un peso molecular de 899,10 g/mol y en lo sucesivo se denomina brevemente B-r-G-RH. La disociacion del aldehldo de peptido de la fase solida se efectuo con acido trifluoroacetico. Los compuestos se almacenaron a -20 °C en forma liofilizada. La estructura del conector biotina esta representada en la figura 2.
Ejemplo 2: Determinacion de las constantes de enlazamiento de trombina de los ligandos de aldehldo de peptido
Los datos geneticos de los ligandos de aldehldo de peptido se determinaron en formatos de ensayo cromogenicos midiendo la velocidad de la hidrolisis de sustratos de peptido cromogenicos los cuales compiten con los ligandos de aldehldo de peptido por el enlazamiento al centro activo de la respectiva encima, en diferentes concentraciones de sustrato y concentraciones de ligando de aldehldo de peptido. La constante de enlazamiento (Ki) se determino segun un metodo conocido (Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171).
La determinacion de la constante de enlazamiento de trombina se realizo con los reactivos del ensayo de actividad de hirudina de Siemens Healthcare Diagnostics. El ensayo de actividad de hirudina consiste en un reactivo liofilizado de trombina compuesto por trombina bovina, un inhibidor de heparina y aprotinina, un reactivo de sustrato cromogenicos liofilizado con una concentracion de 4 mmol/L de tos-Gli-Pro-Arg-ANBA-IPA (tosilglicil-L-propil-arginil- 5-amino-2-nitrobenzoilisopropilamida) despues de reconstitution. El reactivo de trombina se reconstituyo en solution reguladora de pH (trishidroximetilaminometano, NaCl, pH 8,2). Se prepararon diluciones del reactivo de sustrato con agua desionizada. Los ligandos de aldehldo de peptido, preparados segun el ejemplo 1, se disolvieron en agua y se emplearon como muestra. El ligando Br-G-R-H se utilizo en un intervalo de concentraciones desde 26,1 hasta 0,815 pM. El ligando B-f-P-R-H se utilizo en un intervalo de concentraciones desde 26,1 hasta 0 pM. la realization de los
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ensayos se efectua automaticamente en un analizador de coagulacion BCS® XP (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemania).
Una mezcla de reaccion fue mezclada conjuntamente tal como sigue:
30 |jl de muestra (ligando de aldehldo de peptido B-r-G-R-H o B-f-P-R-H),
150 jl de reactiva de trombina,
50 jl de reactivo de sustrato cromogenico (tos-Gli-Pro-Arg-ABNA-IPA).
Por medio del incremento de la densidad optica de la mezcla de reaccion a una longitud de onda de 405 nm se determino la velocidad de reaccion en mE/min. La densidad optica de la mezcla de reaccion se determino a intervalos de tiempo de 15 hasta 40 segundos para el ligando de aldehldo de peptido B-f-P-R-H o de 5-16 segundos para el ligandos dialdehldo de peptido B-r-G-R-H.
Los ligandos de enlazamiento reversible e irreversible pueden distinguirse por su cinetica de reaccion. Graficando 1/v, en cuyo caso v es la velocidad de reaccion, frente a la concentracion de ligando (i) a una concentracion constante (S) de un sustrato disociable se obtiene una llnea recta. Al usar dos o mas concentraciones diferentes de sustrato (S1, S2... Sn), dichas llneas intersecan en un solo punto. El valor del eje x de este punto corresponde a -Ki, donde Ki corresponde la constante de enlazamiento; vease, por ejemplo, Klebe, G., Wirkstoffdesign (Diseno de sustancias), segunda edicion, editorial Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2009, paginas 52-62 y Dixon, M., 1953, Biochem J, 55, 170-171). En caso de una inhibicion irreversible las curvas se encuentran en un punto sobre las arcillas el cual corresponde nuevamente a -Ki.
La tabla 2 muestra las concentraciones utilizadas en el ligandos de aldehldo de peptido B-f-P-R-H, as! como los valores inversos de las velocidades de reaccion obtenidas con las diferentes concentraciones del sustrato cromogenico.
Tabla 2
- 1/velocidad de reaccion [min/E]
- CB-f-P-R-H [jM]
- CSustrato = 4 mM CSustrato = 2 mM CSustrato = 0,5 mM
- 26,08696
- 14,58931 28,40843 121,67418
- 16,30435
- 9,30221 18,08682 74,54798
- 13,04348
- 7,61108 14,42763 59,11941
- 9,78261
- 5,84267 11,17905 43,90039
- 6,52174
- 4,08943 7,85565 32,28213
- 5,21739
- 3,25123 6,16548 24,75736
- 3,26087
- 2,13002 4,02645 15,77139
- 2,60870
- 1,77535 3,36951 13,19230
- 1,63043
- 1,18258 2,16372 8,49129
- 1,30435
- 0,99739 1,79279 7,17521
- 0,81522
- 0,72743 1,16912 4,77479
- 0,65217
- 0,67366 1,02929 4,16189
- 0,40761
- 0,53337 0,70084 2,64461
- 0,32609
- 0,50125 0,66133 2,38165
- 0,20380
- 0,42975 0,50607 1,63785
- 0,16304
- 0,43955 0,52101 1,71097
- 0,08152
- 0,41427 0,45943 1,56479
- 0,04076
- 0,39301 0,42471 1,74741
- 0,02038
- 0,38457 0,41376 1,86941
- 0
- 0,38254 0,41286 1,93034
Las curvas de regresion se graficaron en la region lineal de los graficos de 1/velocidad de reaccion como una funcion de la concentracion de ligando (Cb+p-r-h) a las diferentes concentraciones de sustrato (figuras 3 y 4). Para Csustrato = 0,5 mM, las concentraciones desde 0 hasta 0,04076 jM no estaban en la region lineal y por lo tanto se excluyeron. Se calcularon tres valores de Ki de las intersecciones de las curvas de regresion y de estos tres se calcularon luego un valor de K promedio y las intersecciones de los graficos. De los valores de K obtenidos de esta manera se calculo el valor medio K (tabla 3). Puesto que las intersecciones de las curvas de regresion no estan sobre el eje x, el enlazamiento del aldehldo de peptido con trombina es reversible. La constante de enlazamiento de trombina promedio KiM del ligando de aldehldo de peptido B-f-P-R-H es de 0,131 jmol (1,31 x 10-7 Mol). Puesto que las constantes de enlazamiento de los medicamentos relevantes (inhibidores de trombina, terapeuticamente efectivos y adecuados) son mas grandes, el compuesto de acuerdo con el metodo descrito, usando trombina como enzima activa de coagulacion, es adecuado para detectar inhibidores de trombina de alta afinidad.
13
Tabla 3
- Constante de enlazamiento de trombina (Ki) de B-f-P-R-H
- CSustrato (mM)
- Pendiente (min/E pM) Fragmento de eje (min/E) R2 Ki (pM)
- 4
- 0,5500 0,3497 0,9997 Ki1&2=0,106
- 2
- 1,0812 0,04059 0,9997 Ki1&3=0,141
- 0,5
- 4,5718 0,9175 0,9994 Ki2&3=0,147
- K medio:
- KiM=0,131
La tabla 4 muestra las concentraciones utilizadas en la mezcla de reaccion del ligando de aldehldo de peptido B-r-G- RH y los valores inversos de las velocidades de reaccion obtenidas con las diferentes concentraciones del sustrato 5 cromogenico.
Tabla 4
- 1/Velocidad de reaccion [min/E]
- CB-r-G-R-H [pM]
- CSustrato = 4 mM CSustrato = 2 mM CSustrato= 0,5 mM
- 26,08696
- 0,39497 0,42847 0,69034
- 16,30435
- 0,38645 0,41405 0,62639
- 13,04348
- 0,38853 0,40320 0,60905
- 9,78261
- 0,38047 0,41056 0,58021
- 6,52174
- 0,38410 0,40077 0,56372
- 5,21739
- 0,37614 0,39456 0,54078
- 3,26087
- 0,38074 0,39679 0,53851
- 2,60870
- 0,37303 0,38756 0,52827
- 1,63043
- 0,37478 0,38938 0,52245
- 1,30435
- 0,37579 0,39024 0,52112
- 0,81522
- 0,37556 0,38842 0,51597
Las curvas de regresion se graficaron en la region lineal de los graficos 1/velocidad de reaccion frente a la concentracion de ligando (CB-r-G-R-H) a las diferentes concentraciones de sustrato (figura 5). De las intersecciones de 10 las curvas de regresion se calcularon tres valores de Ki y de estas se calculo luego un valor promedio Ki y las intersecciones de los graficos. A partir de los valores de Ki obtenidos de esta manera se calculo el valor medio de Ki (tabla 5). Puesto que las intersecciones de las curvas de regresion no estan sobre el eje x, el enlazamiento del aldehldo de peptido con trombina es reversible. La constante de enlazamiento de trombina promedio KiM del ligando de aldehldo de peptido B-r-G-R-H es de 20,9 pmol (2,09 x 10"5 Mol). El ligando es adecuado por lo tanto de acuerdo 15 con el metodo descrito, usando trombina como enzima activa de coagulacion para determinar incluso inhibidores de trombina de baja afinidad.
Tabla 5
- Constante de enlazamiento de trombina (Ki) de B-r-G-R-H
- CSustrato (mM)
- Pendiente (min/E pM) Fragmento de eje (min/E) R2 Ki (pM)
- 4
- 0,000805 0,3746 0,8520 Ki1&2=17,4
- 2
- 0,001572 0,3880 0,9246 Ki1&3=22,3
- 0,5
- 0,006964 0,5122 0,9544 Ki2&3=23,0
- Ki medio:
- KiM=20,9
Ejemplo 3: Determination de las constantes de enlazamiento de F Xa de los ligandos de aldehldo de peptido
20 La determinacion de la constante de enlazamiento de F Xa se realizo con los reactivos del ensayo de heparina Berichrom® de Siemens Healthcare Diagnostics. El ensayo de heparina Berichrom® esta compuesto de:
• un reactivo de F Xa que se compone de una fraction de plasma liofilizada la cual contiene el factor Xa, y de aditivos tales como Tris, NaCl, EDTA y agentes preservantes,
• un reactivo de sustrato cromogenico (Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBA-metil-amida),
25 • un reactivo de dilution para reconstitution, y
• un reactivo sulfato de dextrano compuesto de sulfato de dextrano liofilizado.
5
10
15
20
25
30
Despues de la reconstitucion en 10 ml de reactivo de dilucion, la concentracion de sulfato de dextrano es de 0,02 g/l. El reactivo F Xa se reconstituye con el reactivo de sulfato de dextrano reconstituido. El reactivo de sustrato contiene despues de reconstitucion con 2 ml de agua desionizada 4 mmol/L de Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBA-metil-amida. Se prepararon diluciones del reactivo de sustrato con agua desionizada. Los ligandos de peptido de aldehldo preparados segun el ejemplo 1 se disolvieron en agua y se usaron como muestra. La realizacion de los ensayos se efectua automaticamente en un analizador de coagulacion BCS® XP (Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Alemania).
Una mezcla de reaccion se mezclo conjuntamente tal como sigue:
20 pl de agua,
15 pl de muestra (ligando aldehldo de peptido B-r-G-R-H o B-f-P-R-H),
15 ml de agua,
150 pl de reactivo de F Xa,
30 pl de reactivo de sustrato (Z-D-Leu-Gli-Arg-ANBA-metil-amida).
Mediante el incremento de la densidad optica de la mezcla de reaccion a una longitud se determino la velocidad de reaccion en mE/min. Para este proposito se determino la de reaccion en un intervalo de tiempo de 10 a 70 segundos.
La tabla 6 muestra las concentraciones del ligando aldehldo de peptido B-f-P-R-H, reaccion, as! como los valores inversos de las velocidades de reaccion obtenidas con las diferentes concentraciones del sustrato cromogenico.
de onda de 405 manometros densidad optica de la mezcla
empleadas en la mezcla de
Tabla 6
- 1/Velocidad de reaccion min/E]
- CB-f-P-R-H [pM]
- Csustrato "" 4 mM Csustrato “ 2 mM Csustrato _ 0,5 mM
- 13,04348
- 1,35879 2,49937 9,73911
- 8,15217
- 1,17310 2,14879 8,37740
- 6,52174
- 1,10558 1,97908 7,61262
- 4,89130
- 1,02567 1,83999 7,08399
- 3,26087
- 0,94477 1,71517 6,66273
- 2,60870
- 0,93172 1,67166 6,44104
- 1,63043
- 0,90212 1,59083 6,26347
- 1,30435
- 0,87349 1,56215 5,95893
- 0,81522
- 0,84935 1,52113 5,86778
- 0,65217
- 0,85137 1,50973 5,78490
- 0,40761
- 0,83380 1,48916 5,69390
- 0,32609
- 0,83198 1,48552 5,68996
- 0,20380
- 0,82383 1,47333 5,61861
- 0,16304
- 0,83329 1,48487 5,67486
- 0,10190
- 0,81565 1,46315 5,61945
- 0,08152
- 0,82180 1,46678 5,57154
- 0,04076
- 0,81738 1,45442 5,56930
- 0,02038
- 0,81918 1,45743 5,56461
- 0,01019
- 0,82168 1,45734 5,61679
- 0
- 0,83042 1,47267 5,68282
Las curvas de regresion se graficaron en la region lineal de los graficos de 1/velocidad de reaccion como una funcion de la concentracion de ligando (CB.f.P.R.H) a las diversas concentraciones de sustrato (figura 6). De las intersecciones de las curvas de regresion se calcularon tres valores de K y a partir de estos se calculo luego un valor medio de Ki y las intersecciones de los graficos. A partir de los valores de Ki obtenidos de esta manera, se calculo el valor medio de Ki (tabla 7). Puesto que las intersecciones de las curvas de regresion no estan en el eje x, el enlazamiento de aldehldo de peptido con F Xa es reversible. La constante de enlazamiento media de F Xa KiM del ligando de aldehldo de peptido B-f-PR-H es de 16,9 pmol (1,69 x 10-5 Mol). El indicando es adecuado por lo tanto segun el metodo descrito, usando F Xa como enzima activa de coagulacion, para determinar inhibidores de F Xa de baja afinidad.
Tabla 7
- Constante de enlazamiento de F Xa (Ki) de B-f-P-R-H
- CSustrato (mM)
- Pendiente (min/E pM) Fragmento de eje (min/E) R2 Ki (pM)
- 4
- 0,0421 0,8202 0,9975 Ki1&2=16,6
- 2
- 0,0806 1,4588 0,9987 Ki1&3=17,
- 0,5
- 0,3216 5,5934 0,9965 Ki2&3=17,2
- Ki medio:
- KiM=16,9
La tabla 8 muestra las concentraciones del ligando aldehldo de peptido B-r-G-RH, empleadas en la mezcla de reaccion, as! como los valores inversos de las velocidades de reaccion obtenidas con las diferentes concentraciones 5 de sustrato cromogenicas.
Tabla 8
- 1/Velocidad de reaccion min/E]
- CB-r-G-R-H [pM]
- CSustrato = 4 mM CSustrato = 2 mM CSustrato = 0,5 mM
- 13,04348
- 8,46963 19,61291 98,11308
- 8,15217
- 5,66889 12,99196 62,32312
- 6,52174
- 4,81865 10,44658 52,69400
- 4,89130
- 3,74536 8,24448 37,79438
- 3,26087
- 2,72840 5,52006 26,41568
- 2,60870
- 2,27442 4,62654 20,14413
- 1,63043
- 1,67882 3,14700 13,97126
- 1,30435
- 1,47587 2,80172 12,04614
- 0,81522
- 1,17709 2,11479 8,40260
- 0,65217
- 1,09950 1,97479 7,75440
- 0,40761
- 0,92591 1,65890 6,40799
- 0,32609
- 0,90610 1,61219 6,12959
- 0,20380
- 0,82623 1,45744 5,52072
Las curvas de regresion se graficaron en la region lineal de los graficos de 1/velocidad de reaccion como una funcion de la concentration de ligando (CB-r-G-R-H) a las diferentes concentraciones de ligando (figura 7). A partir de 10 las intersecciones de las curvas de regresion se calcularon tres valores Ki y a partir de estos se calculo un valor medio Ki y las intersecciones de los graficos. A partir de los valores de Ki obtenidos de esta manera se calculo el valor medio de Ki (tabla 9). Puesto que las intersecciones de las curvas de regresion no se encuentran sobre el eje X (de las abscisas), el enlazamiento del aldehldo de peptido con F Xa es reversible. La constante de enlazamiento de F Xa KiM del ligando aldehldo de peptido B-r-G-RH es de 0,332 pmol (3,32 x 10"7 Mol). Puesto que las constantes de 15 enlazamiento de los medicamentos relevantes (inhibidores de F Xa terapeuticamente efectivos y adecuados) son mas grandes, el compuesto de acuerdo con el metodo descrito, usando F Xa como enzima activa de coagulation, es adecuado para detectar inhibidores de F Xa de alta afinidad.
Tabla 9
- Constante de enlazamiento de F Xa (Ki) de B-r-G-R-H
- CSustrato (mM)
- Pendiente (min/E pM) Fragmento de eje (min/E) R2 Ki (pM)
- 4
- 0,6037 0,7187 0,9992 Ki1&2=0,358
- 2
- 1,4375 1,0169 0,9992 Ki1&3=0,321
- 0,5
- 7,3110 2,8743 0,9987 Ki2&3=0,316
- Ki medio:
- KiM=0,332
20 Ejemplo 4: Metodo segun la invention para determinar inhibidores de trombina por medio de reactivos LOCI
Como muestras se utilizaron plasma humano estandar y plasma humano estandar al cual se adicionaron concentraciones crecientes de inhibidores de trombina directos (hirudina, melagatran, argatroban) o indirectos (liquemina, fragmina).
Como sistema formador de senal se utilizo el sistema LOCI® que se compone de un compuesto quimioluminiscente 25 (2-(4-(N,N, di-tetradecil)-anilino-3-fenil tioxeno) y un fotosensibilizador (bis-(trihexil)-silicon-t-butilftalocianina). Tanto
el compuesto quimioluminiscente como tambien el fotosensibilizador estan acoplados a las partlculas de latex. En lo sucesivo tambien se utilizan los terminos "Chemibeads" para las partlculas recubiertas con el compuesto quimioluminiscente y "Sensibeads" para las partlculas recubiertas con el fotosensibilizador. La tecnologla LOCl aqul
5
10
15
20
25
30
35
40
45
utilizada se basa en que el compuesto quimioluminiscente acoplado a las partlculas de latex (Chemibeads) y el fotosensibilizador acoplado a las partlculas de latex (Sensibeads) se aproximan espacialmente uno al otro mediante un enlace con un analito, de modo que el oxlgeno singlete generado por el fotosensibilizador puede excitar al compuesto quimioluminiscente.
Las Chemibeads aqul utilizadas se recubren adicionalmente con trombina bovina. Para este proposito la trombina bovina se enlazo de modo covalente con las partlculas de latex. Las Sensibeads aqul utilizadas se recubrieron adicionalmente con estreptavidina.
En calidad de ligandos se utilizo el aldehldo de peptido biotinilido biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H (B-f-P-R-H).
En ausencia de un inhibidor de trombina, el ligando se enlaza a traves de su residuo de biotina con las Sensibeads recubiertas de estreptavidina y, por medio de su parte de peptido, con las Chemibeads recubiertas con trombina y se genera una senal quimioluminiscente (vease tambien la figura 1). En presencia de un inhibidor de trombina que compite con el ligando por el enlace a las Chemibeads recubiertas de trombina, pero que no puede enlazarse a las Sensibeads, la senal de quimioluminiscencia es inversamente proporcional a la concentracion de inhibidor de trombina.
Respectivamente se combinaron 2 pl de muestra, 10 pl del peptido inhibidor de polimerizacion de fibrina glicina- prolina-argina-prolina (10 mg/ml), 20 pl de Chemibeads (400 pg/ml) y 10 pl del ligando (1,25 pM) se incubaron durante 6 minutos. Despues de adicionar 20 pl de Sensibeads (600 pg/ml) y una incubacion de 10 minutos, la mezcla se completo con agua hasta 250 pl y se midio la senal de quimioluminiscencia. Tal como se muestra en la figura 8, la senal de quimioluminiscencia se disminuye dependiendo del tipo y de la concentracion de los inhibidores de trombina directos, dosificados. Las heparina (liquemina, fragmina), tambien dosificadas, que inhiben trombina indirectamente, conducen a una disminucion ostensible de la senal de quimioluminiscencia.
Ejemplo 5: Metodo segun la invencion para determinar inhibidores del factor Xa por medio de reactivos LOCI
Como muestras se utilizaron plasma humano estandar y plasma humano estandar al cual se adicionaron concentraciones crecientes de inhibidores de trombina directos o indirectos (hirudina, argatroban, liquemina) o de factor Xa (rivaroxaban, liquemina, fragmina).
Como sistema formador de senal se utilizo el sistema LOCI segun el ejemplo 4.
Las Chemibeads se recubrieron adicionalmente con un anticuerpo policlonal comercialmente disponible contra FXa. Para este proposito se enlazo el anticuerpo de modo covalente con las partlculas de latex en una proportion de acoplamiento de 10 mg de anticuerpo a 50 ng de partlculas. Las Sensibeads aqul utilizadas se recubrieron adicionalmente con estreptavidina.
Como ligando se utilizo el aldehldo de peptido biotinilado biotinil-Ttds-D-Arg-Gli-Arg-H (B-r-G-R-H).
En ausencia de un inhibidor de Fxa el ligando se enlaza a traves de su residuo de biotina con las Sensibeads recubiertas de estreptavidina y a traves de su parte de peptido con el FXa, el cual se enlaza a las Chemibeads recubiertas con anticuerpo, y se genera una senal de quimioluminiscencia (vease tambien la figura 1). En presencia de un inhibidor de F Xa que compite con el ligando para enlazarse a las Chemibeads recubiertas con F Xa, pero que no puede enlazarse a las Sensibeads, la senal de quimioluminiscencia es inversamente proporcional a la concentracion de inhibidor de FXa (por ejemplo, rivaroxaban). En presencia de un inhibidor de trombina (por ejemplo, argatroban o hirudina) por lo contrario la senal no se reduce puesto que el inhibidor de trombina no puede desplazar al ligando. Dagegen das Signal nicht reduziert, da der
Se mezclaron 10 pl de un reactivo que contiene F Xa humano (aproximadamente 1.000 IU/L) y peptido inhibidor de polimerizacion de fibrina glicina-prolina-argina-prolina (10 mg/ml) con 2 pl de muestra, 20 pl de Chemibeads (400 pg /mL) y 10 pl del ligando (6 pM) y se incubaron por 5 minutos. Despues de adicionar 60 pl de Sensibeads (200 pg/ml) y una incubacion de 10 minutos, la mezcla se lleno con agua hasta 260 pl y se midio la senal de quimioluminiscencia. Tal como se muestra en la figura 9, la senal de quimioluminiscencia disminuye dependiendo del tipo y de la concentracion de los inhibidores directos dosificados de F Xa y de trombina. Heparina (liquemina, fragmina), que tambien se dosificaron y que inhiben indirectamente a FXa, conducen a una disminucion ostensible de la senal de quimioluminiscencia.
Claims (20)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Metodo para determinar un inhibidor de un factor de coagulacion proteollticamente activo en una muestra, el cual comprende los pasos de:a) proporcionar e incubar una mezcla de reaccion que contiene1. una allcuota de la muestraii. una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo,iii. al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo, pero no es disociado por este en un enlace de peptido,iv. un primero y segundo componente de un sistema generador de senal los cuales interaction de tal manera que surge una senal detectable si el primero y segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro y, en cuyo caso, el factor de coagulacion proteollticamente activo esta asociado con el primer componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion, y el ligando esta asociado con el segundo componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion;b) medir la senal del sistema formador de senal, en cuyo caso la altura de la senal es inversamente proporcional a la concentracion de inhibidor en la muestra.
- 2. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en cuyo caso el ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo tiene una afinidad de enlazamiento de Ki = 10"13 hasta 10"4 M para el factor de coagulacion proteollticamente activo.
- 3. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en cuyo caso el primero y segundo componente del sistema formador de senal comprenden respectivamente una fase solida en forma de partlculas, y la aglutinacion de las fases solidas en forma de partlculas se mide en la mezcla de reaccion.
- 4. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en cuyo caso el primer componente del sistema formador de senal es un agente quimioluminiscente y el segundo componente del sistema formador de senal es un fotosensibilizador o viceversa y en cuyo caso la quimioluminiscencia se mide en la mezcla de reaccion.
- 5. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en cuyo caso el agente quimioluminiscente esta asociado con una primera fase solida en forma de partlculas y/o el fotosensibilizador esta asociado con una segunda fase solida en forma de partlculas.
- 6. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en cuyo caso el ligando tiene una primera contraparte de enlazamiento A de un primer par de enlazamiento A/B y en cuyo caso el segundo componente del sistema formador de senal tiene la segunda contraparte de enlazamiento B del primer par de enlazamiento A/B y el segundo componente del sistema formador de senal tiene la segunda contraparte de enlazamiento B del primer par de enlazamiento A/B y el ligando se encuentra asociado mediante enlace de las contrapartes de enlazamiento A y B con el segundo componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion.
- 7. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, en cuyo caso el ligando es un derivado de peptido.
- 8. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, en cuyo caso el ligando es un derivado de peptido que tiene un grupo terminal carboxilo del grupo de aldehldo, cetona, trifluorometilcetona, acido a-cetocarboxllico, a- cetoamida, a-cetoesteres, esteres, acido boronico, clorometilcetona y fluoruro de sulfonilo.
- 9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en cuyo caso las contrapartes de enlazamiento A y B se seleccionan de tal manera que forman un par de enlazamiento A/B del grupo de etiqueta FLAG/anticuerpo etiqueta anti-FLAG, etiqueta HIS/anticuerpo etiqueta anti-HIS, fluorescelna/anticuerpo anti-fluorescelna, biotina/avidina y biotina/estreptavidina.
- 10. Metodo segun una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo tiene una primera contraparte de enlazamiento X de un segundo par de enlazamiento X/Y y la segunda contraparte de enlazamiento Y del segundo par de enlazamiento X/Y se encuentra asociada con el primer componente del sistema formador de senal y el factor de coagulacion proteollticamente activo esta asociado mediante enlace de las contrapartes de enlazamiento X e Y con el primer componente del sistema formador de senal o se asociara durante la incubacion.51015202530354045
- 11. Metodo segun una de las reivindicaciones precedentes para determinar un inhibidor de trombina, en cuyo caso se proporciona y se incuba una mezcla de reaccion que contiene una cantidad definida del factor de coagulacion proteollticamente activo trombina.
- 12. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, en cuyo caso se proporciona y se incuba una mezcla de reaccion que contiene el peptido biotinil-Ttds-D-Fe-Pro-Arg-H, el cual se enlaza reversible mente al centro activo de trombina pero no se disocia por este.
- 13. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 11 o 12 para determinar un inhibidor de trombina del grupo de heparina, derivados de heparina, bivalirudina, hirudina, dabigatran, argatroban, melagatran, ximelagatran, lepirudina, MCC-977, SSR-182289, TGN-255, TGN-167, ARC-183 y odiparcil.
- 14. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10 para determinar un inhibidor de factor Xa, en cuyo caso se proporciona y se incuba una mezcla de reaccion que contiene una cantidad definida del factor de coagulacion proteollticamente activo factor Xa.
- 15. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 14 para determinar un inhibidor de factor Xa del grupo de heparina, derivados de heparina tales como fondaparinux, rivaroxaban, apixaban, otamixaban, LY 517717, YM 153, DU-176b, DX-9065a y KFA-1982.
- 16. Metodo de acuerdo con una de las reivindicaciones 14 o 15, en cuyo caso se proporciona y se incuba una mezcla de reaccion que contiene el peptido biotinil-Ttds-D-Arg-Gli-Arg-H, el cual se enlaza reversiblemente al centro activo de factor Xa, pero no es disociado por este.
- 17. Kit de ensayo para realizar un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 16, en cuyo caso el kit de ensayo contiene por separado los siguientes componentes:i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo;ii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por este en un enlace de peptido;iii. Un tercer reactivo que contiene un primer componente de un sistema formador de senal, el cual es capaz de asociarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo del primer reactivo; yiv. Un cuarto reactivo que contiene un segundo componente de un sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el ligandos del segundo reactivo;en cuyo caso el primero y segundo componente del sistema formador de senal interactuan de tal manera que surge una senal detectable si el primero y el segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro.
- 18. Kit de ensayo para realizar un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 16, en cuyo caso el kit de ensayo contiene por separado los siguientes componentes:i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo, en cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo esta asociado con un primer componente de un sistema formador de senal;ii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por este en un enlace de peptido; yiii. Un tercer reactivo que contiene un segundo componente del sistema formador de senal el cual es capaz de asociarse con el ligando del segundo reactivo;en cuyo caso el primero y segundo componente del sistema formador de senal interactuan de tal modo que surge una senal detectable cuando el primero y segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro.
- 19. Kit de ensayo para realizar un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 16, en cuyo caso el kit de ensayo contiene por separado los siguientes componentes:i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo;ii. Un segundo reactivo que contiene un primer componente de un sistema formador de senal que es capaz de asociarse con el factor de coagulacion proteollticamente activo del primer reactivo; yiii. Un tercer reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo pero no se disocia por este en un enlace de peptido, y el ligando esta asociado con un segundo componente del sistema formador de senal;en cuyo caso el primero y segundo componente del sistema formador de senal interaction de tal manera que surge 5 una senal detectable cuando el primero y el segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro.
- 20. Kit de ensayo para realizar un metodo segun una de las reivindicaciones 1 a 16, en cuyo caso el kit de ensayo contiene por separado los siguientes componentes:i. Un primer reactivo que contiene una cantidad definida de un factor de coagulacion proteollticamente activo, en 10 cuyo caso el factor de coagulacion proteollticamente activo esta asociado con un primer componente de un sistemaformador de senal; yii. Un segundo reactivo que contiene al menos un ligando que se enlaza al centro activo del factor de coagulacion proteollticamente activo, pero no se disocia por este en un enlace de peptido, y el ligando esta asociado con un segundo componente del sistema formador de senal;15 en cuyo caso el primero y el segundo componente del sistema formador de senal interaction de tal manera que surge una senal detectable, si el primero y segundo componente del sistema formador de senal se llevan a proximidad espacial uno del otro.
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