ES2573933T3

ES2573933T3 - Polímeros de impresión molecular selectivos para las nitrosaminas específicas del tabaco y sus procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2573933T3
Application number: ES07847322.0T
Authority: ES
Inventors: Anthony Rees; Johan Billing; Ecevit Yilmaz
Original assignee: British American Tobacco Investments Ltd IFI
Current assignee: British American Tobacco Investments Ltd IFI
Priority date: 2006-12-07
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2016-06-13
Anticipated expiration: 2027-11-26
Also published as: JP5313913B2; KR101426975B1; CN101547617A; AU2007329060A1; WO2008068153A2; DK2094119T3; EP2094119A2; US20140155555A1; US20110041859A1; BRPI0720149B8; AU2007329060B2; HUE029119T2; US8889795B2; CN101547617B; TW200838444A; ZA200903459B; CL2007003473A1; BRPI0720149B1; RU2504307C2; EP2094119B1

Abstract

Un polímero de impresión molecular selectivo para al menos una nitrosamina específica del tabaco (TSNA), que ha sido preparado utilizando materiales que comprenden: una TSNA o uno de sus análogos estructurales; un monómero funcional neutro; y un reticulante hidrófobo.

Description

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DESCRIPCION

PoKmeros de impresion molecular selectivos para las nitrosaminas espedficas del tabaco y sus procedimientos de uso

Campo de la invencion

En general, la presente invencion se refiere a polfmeros de impresion molecular y al uso de los polfmeros en el bioanalisis y la separacion de los metabolitos de la nicotina. Mas espedficamente, la invencion se refiere a polfmeros de impresion molecular que tienen especificidad por las nitrosaminas espedficas del tabaco e incluye metodos de uso de los polfmeros para tratar el tabaco, los sustitutos del tabaco y sus derivados, a fin de reducir el nivel de compuestos diana en el mismo.

Antecedentes de la invencion

En los campos de las ciencias medica, nutricional, ambiental y qmmica existe una creciente necesidad de una separacion selectiva de determinadas sustancias de mezclas complejas de sustancias relacionadas. El objetivo puede ser la extraccion cuantitativa de un determinado compuesto o compuestos, la medicion de su concentracion o la eliminacion selectiva de un determinado compuesto de una mezcla multicomponentes.

Los controles mas estrictos de salud han aumentado la demanda de metodos que permitan cuantificar sensible y selectivamente productos peligrosos y metabolitos de ciertas sustancias de uso diario generalizado. De particular preocupacion son los compuestos qmmicos relacionados con el uso de productos a base de tabaco, donde dichos compuestos estan originalmente presentes en la hoja de tabaco crudo o se generan durante el proceso de fumar. Los compuestos nitroso, como las nitrosaminas, se consideran de especial importancia en este sentido.

Con el objetivo de reducir la aparicion de los peligros relacionados con el habito de fumar, se han producido ciertos productos farmaceuticos que contienen solo la sustancia neuroactiva, nicotina, la sustancia reivindicada como la responsable de los aspectos de dependencia del material fumable.

Entre las formulaciones de nicotina destinadas al tratamiento para dejar de fumar, la goma de mascar de nicotina ha encontrado el uso mas generalizado. El control de calidad necesario durante la produccion incluye controlar los niveles de nicotina, asf como controlar los productos de oxidacion principales de la nicotina: cotinina, miosmina, nicotina-cis-N-oxido, nicotina-trans-N-oxido y beta-nicotirina. Tambien es deseable, si no necesaria, la cuantificacion de nornicotina, anatabina y anabasina. Se necesitan en el area mejores metodos y materiales para dicho control y dicha cuantificacion. El uso de estos sustitutos del cigarrillo puede hacer que se produzcan metabolitos nitrosamina de la nicotina in vivo por procesos metabolicos naturales durante la permanencia de la nicotina en los tejidos corporales. Los niveles de estos metabolitos permanecen por debajo de las concentraciones a las cuales se puede llevar a cabo la mayona de los procedimientos analfticos de manera cuantitativa. Por lo tanto ademas de metodos y materiales para utilizar durante la fabricacion del producto, siguen siendo necesarias mejores formas de controlar los bajos niveles de los metabolitos de la nicotina in vivo.

Junto con las necesidades sentidas en relacion con productos mas nuevos, los productos tradicionales de tabaco tambien requieren metodos y materiales para cuantificar, reducir o eliminar componentes del tabaco o el humo del tabaco. Dichos componentes incluyen las nitrosaminas espedficas del tabaco (TSNA) y sus precursores alcaloides: 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona ("NNK"), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)butanal ("NNA"), N- nitrosonornicotina ("NNN"), N-nitrosoanabasina ("NAB"), N-nitrosoanatabina ("NAT"), 4-(metilnitrosamino)-1-(3- piridil)-1 -butanol ("NNAL"), 4-(metilnitrosamino)-4-(3-piridil)-1-butanol ("iso-NNAL") y acido 4-(metilnitrosamino)-4-(3- piridil)butanoico ("iso-NNAC").

Para cuantificar adecuadamente la cantidad de dichos compuestos presentes en lfquidos biologicos humanos, se estan desarrollando metodos para analizar los alcaloides, especialmente los productos de descomposicion y metabolitos nitrosilados del tabaco. Los metodos de separacion cromatografica o de extraccion existentes utilizados para este analisis, carecen de la robustez, la sensibilidad y la velocidad necesarias para manejar la gran cantidad de muestras generadas cuando se hace una deteccion sistematica de la poblacion en general. Con los metodos existentes, la baja concentracion de nitrosaminas, presentes habitualmente en picogramos por mililitro, exige una preparacion de la muestra extensa con extracciones de multiples pasos y a menudo derivatizacion qmmica (por ejemplo deuteracion antes de espectrometna de masas) del analito antes del analisis. Una razon para esta complejidad es que los materiales para separacion existentes no son selectivos como podna ser, por ejemplo, un anticuerpo o receptor biologico para los metabolitos en cuestion, sino que mas bien dependen de las propiedades fisicoqmmicas como carga o hidrofobicidad de los metabolitos para el comportamiento de separacion. Estas propiedades fisicoqmmicas pueden ser compartidas por muchas otras moleculas irrelevantes en la muestra. Un metodo rapido y simple para el analisis de las TSNA es por lo tanto una importante necesidad medica analttica insatisfecha.

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En los ultimos anos han aparecido numerosos informes de reconocimiento selectivo de moleculas pequenas con materiales preparados por impresion molecular (poKmeros de impresion molecular o MIP). Los MIP son polfmeros que tienen sitios reactivos adaptados para unirse selectivamente a compuestos diana. Se han utilizado materiales de impresion molecular preparados de manera no covalente para el reconocimiento quiral de diversas moleculas pequenas como medicamentos, azucares, bases nucleotidicas y pesticidas asf como esteroides y hormonas peptfdicas. La elevada afinidad y selectividad por el analito diana que presentan algunos de los materiales impresos han justificado una comparacion con las fases de inmunoafinidad (IA) correspondientes. En contraste con las fases recien mencionadas, sin embargo, los materiales MIP son sencillos de preparar, estables en la mayona de los medios y reutilizables durante largos penodos de tiempo. Las aplicaciones de los materiales MIP en cromatograffa, separacion (continua o por lotes), deteccion qmmica o en ensayos espedficos estan, por lo tanto, en investigacion.

Otra aplicacion es la extraccion en fase solida (SPE) de analitos presentes en bajas concentraciones en muestras biologicas o en matrices complejas. La extraccion en fase solida puede conducir al enriquecimiento selectivo y la depuracion de un analito hasta niveles no alcanzables con los metodos existentes. Las extracciones en fase solida con polfmeros de impresion molecular (MISPE) han sido utilizadas en bioanalisis, analisis de alimentos y analisis ambientales. En estos ejemplos se obtiene el enriquecimiento selectivo y la depuracion del analito lo que resulta en mayor precision y reduccion del lfmite de deteccion (LOD) en la posterior cuantificacion cromatografica (por ej. HPLC) o por espectrometna de masas.

En vista de su elevada selectividad combinada con una buena afinidad por la molecula diana o un grupo de moleculas diana, los MIP han atrafdo un considerable interes de la industria alimentaria como una herramienta para mejorar la calidad de los alimentos. Esto requiere el uso de un MIP para la eliminacion selectiva de componentes no deseados de la matriz alimentaria. Puesto que estos componentes estan a menudo presentes en bajas concentraciones, la capacidad de saturacion del MIP no es por lo general un factor limitante.

Segun WO 05/112670, que esta espedficamente incorporada por referencia en el presente documento, se puede preferir tener un material MIP capaz de absorber selectivamente los derivados de la nicotina nitrosilados mas comunes, de matrices complejas como la orina, obteniendose una recuperacion cuantitativa y por lo tanto errores bajos en la estimacion de las concentraciones de sustancias qrnmicas. Los ejemplos de WO 05/112670 se limitan a los MIP preparados empleando como plantilla monomeros acidos o muy acidos como acido metacnlico (MAA), acido trifluorometacnlico (TFMAA), acido 4-vinilbenzoico y acido 4-vinilbencenosulfonico. Ademas de la cuantificacion tambien es bien conocido el intento de reducir los efectos nocivos del consumo de material que contiene tabaco y sustitutos del tabaco o sus mezclas, reduciendo los niveles de compuestos diana. Dichas reducciones se pueden hacer en el propio material o en uno de sus derivados como un extracto del material. La reduccion tambien se puede efectuar en los productos de la descomposicion termica del material, es decir, el humo inhalado por el fumador y el humo ambiental obtenidos por combustion, o los aerosoles producidos calentando el material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustion. Un metodo bien conocido para este tipo de reduccion es poner en contacto los productos de la descomposicion termica del material con un filtro que adsorba los componentes no deseados de los mismos. Un metodo alternativo consiste en la extraccion con solvente del material, por ejemplo segun se da a conocer en la memoria de la patente de Estados Unidos US-5601097. Segun dicha memoria, el contenido de protema del material de tabaco se reduce al tratar el tabaco con una solucion que contiene un surfactante para extraer polipeptidos, separar la solucion, extraer el surfactante y los polipeptidos de la solucion y recombinar la solucion con el material de tabaco. La memoria de la patente internacional WO 01/65954 da a conocer un proceso en el cual el tabaco se pone en contacto con un lfquido supercntico para extraccion como dioxido de carbono supercntico para reducir o eliminar selectivamente las nitrosaminas.

Estos procedimientos son igualmente aplicables al tabaco en sf mismo y a los sustitutos del tabaco, es decir, materiales naturales o sinteticos con caractensticas similares a las del tabaco natural que habilitan que se puedan consumir de una manera similar al tabaco, ya sea fumandolos, mascandolos, inhalandolos o de otra manera.

Ha habido un intento de eliminar la nicotina del humo del tabaco empleando MIP, como se informo en Liu, Y., et al., Molecularly imprinted Solid-Phase Extraction Sorbent for Removal of Nicotine from Tobacco Smoke, Analytical Letters, Vol. 36, No. 8, pp 1631-1645 (2003). El MIP descrito en el artfculo fue disenado para unirse a la nicotina y no a los metabolitos de la nicotina mas toxicos como las nitrosaminas. No esta claro si el MIP fue de hecho selectivo para la nicotina puesto que el metodo cientffico que produda los datos careda de elementos clave de verificacion del control. Como se describe en WO 05/112670, los MIP selectivos para las TSNA se pueden utilizar para tratar productos del tabaco y asf reducir los niveles de uno o mas compuestos nitroso de los productos del tabaco. Tales MIP encuentran ademas uso en el analisis y la cuantificacion de las TSNA in vivo, habitualmente en relacion con el consumo de productos del tabaco, y en la preparacion y la evaluacion de productos distintos del tabaco. Por consiguiente, a pesar de los avances sigue siendo una necesidad en el area contar con nuevos MIP y metodos para emplear los mismos en el campo de la nicotina y los metabolitos de la nicotina.

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Resumen de la invencion

La presente invencion satisface las necesidades del area al proporcionar MIP unicos que son particularmente selectivos para los compuestos nitroso.

Los MIP de la invencion se pueden obtener copolimerizando uno o mas monomeros funcionales neutros y un reticulante hidrofobo en presencia de un analogo estructural de una nitrosamina, en un medio de polimerizacion que contenga un iniciador de radicales libres, despues de lo cual se separa la plantilla del MIP.

La invencion incluye el uso de los MIP para extracciones analtticas y preparativas, en cromatograffa, para el tratamiento previo de la muestra analftica, en sensores qmmicos o como un filtro de fase solida para la extraccion de las TSNA de sustancias o dispositivos que contienen nicotina.

Segun una realizacion, se proporciona un polfmero de impresion molecular selectivo para al menos una nitrosamina espedfica del tabaco (TSNa), donde el polfmero se preparo empleando materiales que conteman una TSNA o un analogo estructural de la misma, un monomero funcional neutro y un reticulante hidrofobo. El analogo estructural de una TSNA podna ser un analogo enamina de una TSNA o un analogo sulfonamida de una TSNA o un analogo amida de una TSNA, por ejemplo, un analogo formamida de una TSNA. El monomero funcional neutro se podna elegir del grupo que consiste en metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol y monometacrilato de glicerol. El reticulante hidrofobo se podna elegir del grupo que consiste en dimetacrilato de etilenglicol (EDMA), trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) y divinilbenceno (DVB). En la realizacion de la invencion, el polfmero podna ser selectivo para NNK, NNA, NNN, NAB, NAT, NNaL, iso-NNAL o iso-NNAC.

Segun otra realizacion de la invencion, se proporciona un artfculo para fumar, que comprende un material para fumar y un polfmero de impresion molecular de acuerdo con la realizacion descrita previamente.

Segun otra realizacion de la invencion, un filtro de humo puede contener un polfmero de impresion molecular de acuerdo con lo anterior.

Segun otra realizacion de la invencion, un kit puede estar compuesto por un polfmero de impresion molecular de acuerdo con lo anterior e indicaciones de uso de los polfmeros de impresion molecular para realizar al menos de: la deteccion, la cuantificacion o la separacion de nitrosaminas en una muestra.

Segun otra realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para preparar un polfmero de impresion molecular selectivo para las TSNA, que comprende copolimerizar al menos un monomero funcional neutro y al menos un reticulante hidrofobo en presencia de al menos un analogo estructural de TSNA en un medio de polimerizacion que contenga al menos un iniciador de radicales libres para producir un polfmero de impresion molecular unido a un analogo estructural de TSNA y separar el analogo estructural de TSNA del polfmero de impresion molecular.

Segun otra realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para reducir el nivel de al menos una TSNA en un producto del tabaco, que comprende tratar el producto del tabaco con un polfmero de impresion molecular segun la invencion. El producto del tabaco se podna producir por descomposicion termica de un material que contenga tabaco, un sustituto del tabaco o una de sus mezclas, por ejemplo, calentando el material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustion, por combustion del material o poniendo en contacto un material que contenga tabaco, un sustituto del tabaco o una de sus mezclas con un solvente.

Segun otra realizacion de la invencion se proporciona un metodo para fabricar un material de tabaco, que comprende los pasos de tratar un material que contiene tabaco, un sustituto del tabaco o una de sus mezclas con un solvente para producir un extracto, poner en contacto el extracto con un polfmero de impresion molecular segun la invencion con el fin de reducir su nivel en el extracto y combinar el extracto tratado con el material de tabaco extrafdo.

En esta memoria, "producto del tabaco" significa un material que contiene tabaco (que incluye hoja de tabaco o tallos de tabaco), o un sustituto del tabaco, o una mezcla de tabaco y sustitutos del tabaco, y los derivados de dicho material, incluidos los extractos del material, el humo producido por la descomposicion termica del material y los aerosoles producidos al calentar el material por debajo de su temperatura de combustion.

Cuando el producto del tabaco es un derivado producido por la descomposicion termica del material que contiene tabaco o un sustituto del tabaco, la descomposicion se puede efectuar por combustion del material, como en un cigarrillo convencional, o calentando el material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustion, de conformidad con un proceso utilizado en algunos productos alternativos del tabaco conocidos, para producir un aerosol que es inhalado por el consumidor.

Alternativamente, el producto del tabaco puede ser un derivado producido poniendo en contacto un material que contiene tabaco o un sustituto del tabaco con un solvente. En particular, la invencion proporciona un metodo de

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fabricacion de un material para fumar que comprende los pasos de extraer el material fumable con un solvente, tratar el extracto con un MIP selectivo para al menos un compuesto nitroso a fin de reducir su nivel en el extracto y combinar el extracto tratado con el material fumable.

En este proceso, el material fumable puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo hebras finas, tallos, trocitos, laminas cortadas, tallos triturados o cualquiera de sus combinaciones. El solvente puede ser acuoso o no acuoso como metanol, etanol o un medio de extraccion de lfquido supercntico, como dioxido de carbono supercntico lfquido. La extraccion se puede llevar a cabo bajo cualquier condicion que favorezca la extraccion del tabaco de compuestos que contienen nitrogeno.

La invencion tambien incluye un artfculo para fumar compuesto por tabaco o un sustituto del tabaco y un MIP selectivo para la eliminacion de al menos un compuesto nitroso a partir de la descomposicion termica de uno de sus productos.

El artfculo para fumar de la invencion puede adoptar cualquier forma convencional, por ejemplo un cigarrillo, habano o purito. En particular el artfculo para fumar puede consistir en una barrita de material para fumar opcionalmente en una envoltura, con o sin un filtro. La envoltura puede ser de papel, hoja de tabaco, tabaco reconstituido o un sustituto del tabaco. Alternativamente, cuando, por ejemplo, el artfculo para fumar esta disenado para producir bajas emisiones de humo ambiental o menores niveles de productos de pirolisis en el humo que inhala el usuario, la envoltura puede estar compuesta por material inorganico no combustible como un material ceramico. El filtro puede ser de cualquier material adecuado, por ejemplo acetato de celulosa fibrosa, polipropileno o polietileno, o papel.

El material para fumar es preferentemente tabaco pero puede ser un sustituto del tabaco por ejemplo un material para fumar que no sea tabaco. Los ejemplos de materiales para fumar que no son tabaco, son materiales vegetales secados y curados que incluyen materiales frutales y un material sintetico para fumar como el que se puede producir a partir de alginatos y una sustancia generadora de aerosol como glicerol. El material para fumar tambien puede comprender una mezcla de tabaco y materiales para fumar que no son tabaco. Cuando el material para fumar comprende tabaco, el tabaco puede ser de cualquier tipo adecuado, o una de sus mezclas, que incluyen laminas o tallos curados al aire, curados al fuego, curados con aire caliente o curados al sol y pueden haber sido procesados utilizando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, el tabaco se puede cortar, triturar, expandir o reconstituir. El material para fumar tambien puede incluir aditivos convencionales, como mejorantes, colorantes, humectantes (como glicerol y propilenglicol), rellenos inertes (como tiza) y aromatizantes (como azucar, regaliz y cacao).

La invencion tambien se puede aplicar al tabaco destinado al consumo oral o nasal por aspiracion, masticacion o ingestion nasal, en lugar de fumarlo. Dichos productos incluyen tabaco de mascar, rape y snus.

El MIP se puede incorporar en el material fumable. En consecuencia, la invencion incluye un material para fumar que contiene un MIP selectivo para la eliminacion de al menos una nitrosamina espedfica del tabaco, de los productos de la descomposicion termica del material fumable. Alternativamente, cuando el artfculo para fumar consiste en una barrita de material fumable en una envoltura, el MIP se puede incorporar en la envoltura. Por lo tanto, la invencion incluye un material de envoltura de artfculos para fumar que contiene un polfmero de impresion molecular selectivo para la eliminacion de un componente diana de los productos de la descomposicion termica de un material para fumar. La envoltura puede ser de un material a base de celulosa como un papel o un material a base de tabaco como tabaco reconstituido.

Los artfculos para fumar preferidos de la invencion son los cigarrillos, compuestos por una barrita de tabaco, una envoltura y un filtro que incluyen un MIP selectivo para la eliminacion de al menos una nitrosamina espedfica del tabaco, de los productos de la descomposicion termica de un material fumable.

La invencion tambien incluye un filtro de humo que contiene un MIP selectivo para la eliminacion de al menos una nitrosamina espedfica del tabaco, de los productos de la descomposicion termica del material para fumar. El filtro de humo se puede producir por separado del artfculo para fumar, por ejemplo en forma de un cigarrillo o una boquilla, o puede estar integrado en el artfculo para fumar, por ejemplo en forma de un cigarrillo con una punta de filtro.

Los filtros de humo en forma de puntas de filtro pueden tener cualquier construccion convencional. Por ejemplo un filtro tipo "dalmata" que comprende una seccion de material de filtro fibroso, como acetato de celulosa y el MIP en forma particulada y distribuido en toda la seccion. Alternativamente el filtro puede estar en forma de un filtro tipo "cavidad", que comprende varias secciones en donde el MIP puede estar entre dos secciones adyacentes de material de filtro fibroso. El filtro de humo tambien puede comprender otros materiales adsorbentes como una resina de intercambio ionico, una zeolita, sflice, alumina o amberlite.

Durante el uso, el humo pasa a traves del filtro, el MIP adsorbe y retiene selectivamente los componentes diana del humo y el humo filtrado es suministrado al fumador.

Los filtros de humo y artfculos para fumar segun la invencion pueden incluir medios para proteger el MIP del humo, o reducir su exposicion a este, cuando estan en uso. Esto se puede lograr de varias maneras diferentes. Por ejemplo

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el filtro de humo puede comprender un elemento filtrante para adsorber los materiales de la fase vapor o particulada del humo. Dichos elementos filtrantes pueden comprender un adsorbente general como carbon activado, que puede estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo hebras, partfculas, granulos, tela o papel. El elemento filtrante tambien puede ser un adsorbente selectivo como una resina de intercambio ionico, una zeolita, sflice, alumina o amberlite. Los medios para proteger el MIP pueden incluir dos o mas de dichos elementos filtrantes de diferentes composiciones, por ejemplo un primer elemento filtrante de acetato de celulosa y un segundo elemento filtrante de carbon activado. La provision de varios elementos filtrantes en filtros de humo y artfculos para fumar es bien conocida, y se pueden utilizar cualquier configuracion convencional del filtro y metodos asociados de construccion.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra un esquema del procedimiento para la smtesis de un polfmero impreso;

La figura 2 muestra nitrosaminas espedficas del tabaco;

La figura 3 muestra analogos isostericos de las nitrosaminas;

La figura 4A muestra ejemplos de analogos objetivos basados en amidas y sulfonamidas;

La figura 4B muestra un analogo de la enamina diana (MPAPB) utilizado como plantilla para preparar un MIP para la extraccion de NNAL;

La figura 5 muestra la estructura qmmica del metacrilato de 2-hidroxietilo;

La figura 6 muestra la estructura qmmica del dimetacrilato de etilenglicol;

La figura 7 muestra los resultados de la extraccion de N-nitrosopiperidina y nicotina donde la plantilla 1 es formamida, la plantilla 2 es enamina y la plantilla 3 es sulfonamida;

La figura 8 muestra el porcentaje de las TSNA y la nicotina extrafdas de la solucion acuosa;

La figura 9 muestra el porcentaje de las TSNA liberadas despues de un lavado con agua;

La figura 10 muestra el porcentaje de las TSNA y la nicotina extrafdas de la solucion acuosa;

La figura 11 muestra el porcentaje de las TSNA liberadas despues de un lavado con agua;

La figura 12 muestra el porcentaje de nicotina sin retener despues de cinco cargas de la muestra separadas;

La figura 13 muestra el porcentaje de NNN sin retener despues de cinco cargas de la muestra separadas;

La figura 14 muestra el porcentaje de NNK sin retener despues de cinco cargas de la muestra separadas;

La figura 15 muestra el porcentaje de NAT sin retener despues de cinco cargas de la muestra separadas;

La figura 16 muestra el porcentaje de NAB sin retener despues de cinco cargas de la muestra separadas;

La figura 17 es una vista de un corte transversal con elevacion lateral, parcialmente longitudinal y parcialmente separado, de un artfculo para fumar con un filtro de humo segun la invencion; y

La figura 18 es una vista similar a la de la figura 17 de un artfculo para fumar con un filtro de humo alternativo segun la invencion.

En la figura, caractensticas similares se indican como numeros de referencia.

Descripcion detallada de la invencion

La impresion molecular consta habitualmente de los pasos siguientes: (1) un compuesto de plantilla, que puede ser la molecula diana o un analogo estructural de la misma, se deja interaccionar en solucion con un monomero o monomeros funcionales elegidos, para formar un complejo de plantilla-monomero; (2) el complejo de plantilla- monomero se copolimeriza con un monomero reticulante lo que resulta en una matriz polimerica que incorpora el compuesto de plantilla; (3) el compuesto de plantilla se extrae de la matriz del polfmero para formar un MIP que se puede utilizar para la union selectiva de la molecula diana.

Antes del paso (3), en el que se prepara el MIP como un polfmero solido (o monolito) generalmente se lo parte y tamiza para obtener una fraccion del tamano deseado del material particulado. Cuando se prepara por metodos de polimerizacion en suspension o emulsion, dichos partido y tamizado son innecesarios puesto que el tamano de partfcula puede ser controlado dentro de los lfmites deseados durante el proceso de polimerizacion. El material

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particulado preparado por cualquiera de los metodos mencionados antes se puede empacar en una columna de extraccion cromatografica o de fase solida, y usar para la separacion cromatografica de la plantilla de los otros componentes de una mezcla, incluidas las moleculas con estructuras o funcionalidades similares.

Los sitios reactivos del polfmero de impresion molecular expuestos al retirar el compuesto de plantilla, estaran en una configuracion estereoqmmica apropiada para la reaccion con nuevas moleculas de la molecula diana. Como resultado, los polfmeros de impresion molecular se pueden utilizar para la union selectiva de la molecula diana.

La ruta 'no covalente' se ha usado ampliamente para generar sitios de union de impresion molecular. Esta hace uso del autoensamblaje no covalente del compuesto de plantilla y los monomeros funcionales para formar el complejo de plantilla-monomero, seguido de la polimerizacion por radicales libres en presencia de un monomero reticulante y finalmente la extraccion del compuesto de plantilla. La impresion covalente, en la cual la molecula de plantilla y un monomero o monomeros adecuados se unen covalentemente antes de la polimerizacion, tambien se puede llevar a cabo segun metodos conocidos. Las propiedades de union de los MIP formados por cualquiera de los metodos anteriores se pueden examinar mediante una nueva union de la molecula de plantilla.

La polimerizacion se realiza en presencia de un solvente formador de poros, un porogeno. Para estabilizar las interacciones electrostaticas entre los monomeros funcionales y el compuesto de plantilla, el porogeno se elige a menudo entre los solventes aproticos de baja a moderada polaridad. Los compuestos de plantilla exhiben a menudo solubilidad de moderada a alta en los medios de polimerizacion y estos, o sus analogos estructurales, se pueden utilizar por lo tanto directamente en este procedimiento estandar.

Si bien es posible utilizar la propia molecula diana como plantilla, se prefiere comunmente un analogo estructural de la molecula diana porque: (a) la molecula diana puede ser inestable en las condiciones de polimerizacion, o puede inhibir la polimerizacion; (b) la molecula diana puede no estar disponible en cantidades suficientes debido a la complejidad de su smtesis o costo, o ambos; (c) la plantilla puede ser insoluble o poco soluble en la mezcla previa a la polimerizacion; (d) el MIP puede quedar contaminado con bajos niveles de la molecula diana en regiones poco accesibles de la matriz polimerica, que puede drenar del MIP durante el uso; y/o (e) el o los analitos diana pueden representar un riesgo significativo para la salud y no se deben utilizar como plantilla(s). En el caso de los compuestos nitroso, particularmente los compuestos conocidos como TSNA descritos a continuacion, a menudo es mas conveniente utilizar sus analogos funcionales como compuestos de plantilla. Por ejemplo, derivados sulfonamida, enamina o amida, por ejemplo, formamida de las TSNA pueden ser compuestos de plantilla, vease la figura 2 por ejemplos de los mismos.

Cuando el MIP se deriva usando un analogo funcional del compuesto diana, el analogo funcional debe ser isosterico y preferentemente tambien isoelectronico con el compuesto diana, o puede contener una subestructura del compuesto diana donde pueden ser probables fuertes interacciones.

Segun se usa en este documento un "analogo estructural" de una molecula no es identico a la molecula original, pero es similar en parte o totalmente a una parte o toda la molecula original en cuanto a la forma molecular, la distribucion de los electrones u otras caractensticas.

Los compuestos nitroso, particularmente las nitrosaminas, que tienen la formula general O=N-N(Ri)(R2) estan entre los numerosos ingredientes del tabaco y el humo del tabaco que se ha sugerido que tienen un efecto nocivo para el consumidor. Es de interes para la presente invencion el grupo de las nitrosaminas que estan presentes naturalmente en el tabaco, las TSNA, vease la figura 2.

Posibles analogos isostericos para la union dirigida a las nitrosaminas se ven en la figura 3. Las moleculas que se muestran son todas derivadas de la amina original y se pueden sintetizar en un solo paso a partir de la amina secundaria y el correspondiente aldehudo o cloruro de acido. Los modelos moleculares de la enamina (Figura 4B) demostraron una buena complementariedad esterica con NNAL.

Los MIP descritos en WO 05/112670 muestran resultados prometedores cuando se utilizan para el analisis y la extraccion de numerosos metabolitos de la nicotina, de soluciones analfticas, lfquidos corporales y materiales del tabaco. Sin embargo, como las TSNA presentan un campo de interes espedfico y estrecho, la investigacion sobre nuevas formas de recuperar estos compuestos de diversos materiales es continua. En ese sentido, se ha evaluado la formacion de MIP utilizando nuevos materiales y metodos.

El diseno de nuevos MIP comenzo con la eleccion de una plantilla adecuada. Como se senalo antes, la plantilla imparte selectividad al polfmero e idealmente debe ser qmmicamente estable, facilmente disponible, facil de manipular e impartir propiedades de union selectiva. Como uno de los objetivos de la invencion es reducir la exposicion humana a las nitrosaminas, estas no fueron posibles plantillas. En cambio, se pudieron usar formamidas, enaminas y sulfonamidas (vease la figura 2) para reemplazar el grupo nitroso dada su geometna similar y la posesion de una carga negativa parcial en la misma posicion.

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El monomero, el reticulante y las condiciones de polimerizacion (p. ej., solvente o porogeno, iniciador y temperatura) tambien influyen en las propiedades del MIP final. Los monomeros evaluados fueron el monomero acido MAA asf como el monomero neutro metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), vease la figura 5. El reticulante, que finalmente forma el grueso del polfmero, tambien influye en si el polfmero es hidrofilo o hidrofobo. Por lo tanto se evaluaron el reticulante PETRA hidrofilo y el EDMA hidrofobo, vease la figura 6. Para la polimerizacion, se evaluaron tanto la iniciacion termica como fotoqmmica. Los experimentos iniciales indicaron que los MIP neutros, hidrofobos, impresos con una enamina o sulfonamida y preparados empleando polimerizacion UV mostraron resultados sorprendentes. Se llevo a cabo un analisis de seguimiento que incluyo un MIP acido y uno hidrofilo para comparar, los resultados se resumen a continuacion.

A modo de explicacion y no limitante, la invencion se describira mas detalladamente haciendo referencia a una serie de ejemplos. La invencion se refiere a las moleculas de plantilla, a los materiales polimericos disenados para unir las TSNA presentes en sistemas organicos o acuosos y finalmente al uso de dichos materiales, por ejemplo, en las separaciones analtticas o preparativas, en cromatograffa, para el pretratamiento de la muestra analttica y en sensores qmmicos. A menos que se describa lo contrario, los materiales se pueden adquirir en el comercio o se pueden preparar por tecnicas convencionales.

Ejemplo 1: Preparacion de los MIP para la evaluacion

Se prepararon doce MIP diferentes que representan todas las posibles combinaciones de tres plantillas (formamida, enamina y sulfonamida), dos monomeros (acido y neutro) y dos reticulantes (hidrofilo e hidrofobo). Los MIP se evaluaron empleando una mezcla 1:1 de N-nitrosopiperidina y (-)-nicotina en agua. Tambien se generaron polfmeros de referencia no impresos y se evaluaron en condiciones similares. Los resultados se resumen en la figura 7. Ejemplos de la preparacion de plantillas de enamina y piridina carbinol asf como una descripcion adicional de los metodos que se pueden utilizar para los propositos de la presente invencion se pueden encontrar en WO 05/112670.

Como resulta evidente de la figura 7, los MIP que utilizan monomeros acidos se unen a grandes cantidades de nicotina. Para las aplicaciones en las que se descartaran las TSNA mientras que los niveles de nicotina deben permanecer inafectados, entonces, dicho monomero es menos favorecido. Ademas, es evidente que los MIP con un reticulante hidrofobo son mejores para unirse a las nitrosaminas que los MIP hidrofilos.

Ejemplo 2: Preparacion de los MIP para comparacion analttica

En vista del rendimiento sorprendentemente positivo de los MIP hidrofobos neutros, como se resume en la figura 7, se eligieron para el analisis posterior los MIP hidrofobos neutros, impresos con plantillas de enamina o sulfonamida y polimerizados usando UV. Para la comparacion, tambien se incluyo en la muestra el MIP hidrofilo de mejor rendimiento. Se prepararon siete MIP utilizando los parametros resumidos en la tabla 1.

Tabla 1.

Nombre: Plantilla Monomero Reticulante

MIP 1: f1 0 HEMA EDMA

MIP 2: f* O PETRA PETRA

MIP 3: 1 o=s=o 1 0 HEMA EDMA

MIP 4: Analogo de NNAL HEMA EDMA

MIP 5: Analogo de NNAL HEMA EDMA

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Nombre: Plantilla Monomero Reticulante

MIP 6: NL 1 jf o=s=o HEMA EDMA

MIP 7: HEMA EDMA

: if r

Ejemplo 3: Evaluacion de los MIP elegidos con mezclas de TSNA/nicotina

Se prepararon columnas de SPE, cada una con 25 mg de los MIP 1-7. A cada columna se le agrego 1 ml de solucion acuosa que contema 0.30 pg/ml de TSNA total y se le anadio 0.2 pg/ml de nicotina. Se utilizo HPLC para determinar la cantidad de TSNA que no habfa sido extrafda de cada columna, tomando en consideracion el calculo del material extrafdo, vease la figura 8. Se hizo pasar 1 ml de agua a traves de cada columna y se determino la cantidad de TSNA liberada, cuando la hubo, vease la figura 9. Cada una de las figuras 8 y 9 representa el promedio de los dos experimentos

Basado en el fuerte rendimiento de los MIP hidrofobos neutros, la evaluacion de los MIP 1 y 3-7 se repitio usando 1 ml de solucion de prueba que contema 0.30 pg/ml de TSNA total y 4 pg/ml de nicotina en tampon de fosfato de pH 6.3 (fuerza ionica 0.09). Los resultados se muestran en las figuras 10 y 11, donde ambos representan un promedio de dos experimentos. Como se puede ver, los MIP, 1, 3 y 4 se comportaron mejor reteniendo el 100% de la TSNA permitiendo simultaneamente que la mayor parte de la nicotina pasara sin trabas.

Tambien se evaluo el rendimiento de los MIP, 1, 3 y 4 a pH 5.3 y 7.3. A medida que aumento el pH, la retencion de nicotina aumento de aproximadamente 10% a 30%, lo que indica que cuando la nicotina no debe ser afectada, el rendimiento optimo se alcanza con un pH ligeramente acido. Tambien se evaluo un MIP acido formado con el monomero acido MAA y el reticulante hidrofobo EDMA utilizando las mismas condiciones, a pH 6.3, este retuvo aproximadamente el 90% de la nicotina.

La regeneracion de los MIP se realizo usando TFA al 0.5% en lavado con MeOH. Tambien se pueden usar otras mezclas acido/alcohol.

Ejemplo 4: Evaluacion de los MIP elegidos con TSNA espedficas y nicotina

Despues de encontrar el rendimiento sorprendentemente positivo de los MIP, 1, 3 y 4 en los experimentos descritos antes, se llevo a cabo una evaluacion adicional. Se prepararon columnas de SPE con 25 mg de MIP molido y se cargaron cinco cargas de solucion de prueba, 1 ml cada vez, en las columnas. La solucion de prueba tema aproximadamente 80 ng/ml de cada uno de NNN, NNK, NAT, 40 ng/ml de NAB y 4 pg/ml de nicotina en tampon de fosfato de pH 6.3 (fuerza ionica 0.09). Despues de cargar cada muestra la cantidad de nicotina y cada TSNA sin retener se determino mediante HPLC. Tambien se evaluo un polfmero de control no impreso. Los resultados se muestran en las figuras 12-16. Como se ve en las figuras, aproximadamente el 10% de la nicotina se une a los MIP en el primer paso de carga. Esto satura el MIP con nicotina y agregar mas muestra en la columna no resulta en una retencion mas significativa de la nicotina. NNN es la mas debilmente unida al MIP y el avance se ve en el segundo paso de la carga. Cada uno de los MIP, 1, 3 y 4 es excelente para retener NNK, NAB y NAT. Por lo tanto, la combinacion de monomero funcional neutro, plantilla de enamina o sulfonamida y reticulante hidrofobo, resulta en una sorprendentemente alta retencion de TSNA de una muestra mixta reteniendo simultaneamente solo una minima cantidad de nicotina.

Dichos MIP son particularmente atractivos para las aplicaciones en las que se deben extraer las TSNA de una muestra pero la nicotina no debe ser afectada, como el tratamiento del tabaco o el humo del tabaco para eliminar las TSNA. Ademas, dichos MIP se pueden utilizar en una capacidad analttica para medir la cantidad de TSNA en una muestra de un producto o una muestra de un paciente. En tales casos, si la nicotina es un componente de interes se puede cuantificar la cantidad de nicotina retenida por el MIP y se pueden emplear otros metodos, por ejemplo, se pueden utilizar MIP espedficos para la nicotina, para cuantificar la cantidad remanente de nicotina en la muestra. El paso siguiente de evaluacion de los niveles de nicotina se podna hacer antes o despues del uso de los MIP espedficos para las TSNA de la presente invencion.

Ejemplo 5: Uso de un MIP de la invencion en el tratamiento de extractos de tabaco

El polfmero producido segun los parametros descritos antes se puede incorporar en una columna de SPE y la columna se puede acondicionar segun sea necesario. Los monomeros neutros funcionales utilizados en el polfmero

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

podnan ser, por ejemplo, HEMA, acrilamida, metacrilamida, N-metacrilamida, monoacrilato de glicerol, monometacrilato de glicerol o 2-(4-vinilfenil)-1,3-propanodiol. Los reticulantes hidrofobos podnan ser, por ejemplo, EDMA, TRIM, DVB, m-diisopropenilbenceno, dimetacrilato de tetrametilenglicol, tetraacrilato de pentaeritritol, N,N'- Metilenbisacrilamida, N,N'-Etilenbisacrilamida, N,N'-Butilenbisacrilamida, N,N'-Hexametilenbisacrilamida. Se conocen otros materiales aplicables, vease, por ejemplo, Molecularly Imprinted Material: Science and Technology, Yan, M; Ramstrom, O; Eds., Marcel Dekker, Nueva York, 2005.

La hoja de tabaco cortada o triturada se puede extraer con agua durante 15-25 minutos a 60 °C. El tabaco se separa de la solucion por filtracion y se seca. La solucion se pasa a traves de la columna de SPE y la TSNA es absorbida del extracto. Despues la columna se drena y la solucion se concentra por evaporacion de la pelfcula, el concentrado se recombina luego con el tabaco extrafdo y secado al aire. El rendimiento del MIP se puede evaluar eluyendo del MIP los compuestos unidos usando 2 x 1 ml de metanol con 0.5% de TFA y analizando el extracto mediante HPLC- UV.

Ejemplo 6: Uso de un MIP de la invencion en el tratamiento de extractos de tabaco

Empleando un proceso de extraccion continua, se carga hoja de tabaco triturada de tipo mezcla US en una primera camara de extraccion en la cual se introduce dioxido de carbono supercntico. Despues de ponerse en contacto con el tabaco, el dioxido de carbono se introduce en una segunda camara de extraccion que contiene un MIP segun la invencion. Una vez que hizo contacto con el polfmero, el dioxido de carbono se regresa a la primera camara de extraccion y se vuelve a poner en contacto con el tabaco. El proceso dclico se continua hasta que el contenido de TSNA en el tabaco se ha reducido al nivel deseado, con lo cual el dioxido de carbono es expulsado del sistema, y el tabaco retirado de la primera camara. Despues se regenera el MIP de la segunda camara para su reutilizacion.

Ejemplo 7: Uso de un MIP de la invencion para el analisis de la muestra

Se prepara una columna de SPE agregando 25 mg de MIP segun la invencion. Se agrega una muestra de prueba a la columna, por ejemplo 5 ml de orina humana que potencialmente contiene TSNA. Se permite que la muestra pase a traves de la columna, que despues podna ser sometida al vado para eliminar todo el lfquido y asegurar que el material del MIP esta seco. Se puede realizar un lavado para eliminar cualquier compuesto que interfiera que pueda haber estado asociado no espedficamente con el MIP, por ejemplo 1 ml de agua destilada. Despues de secar las TSNA se pueden recuperar del MIP usando, por ejemplo, 1 ml de DCM y cuantificar por HPLC.

Ejemplo 8: Uso de un MIP de la invencion en artfculos para fumar

Con referencia a las ilustraciones, las figuras 17 y 18 ilustran artmulos para fumar en forma de cigarrillos con una barrita 1 de tabaco empaquetada en una envoltura 2 unida a un filtro de humo 3 por medio de un papel de boquilla 4. Para mayor claridad, el papel de boquilla 4 se muestra separado de la envoltura 2, pero en la practica estan en estrecho contacto.

En la figura 17, el filtro de humo 3 comprende tres elementos filtrantes cilmdricos 3a, 3b, 3c. El primer elemento filtrante 3a en el extremo de la boca del filtro tiene 7 mm de longitud, esta compuesto por fibra de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de plastificante triacetina y tiene una cafda de presion de 25 mm de columna de agua en su longitud. El segundo elemento filtrante 3b, colocado centralmente, es una cavidad de 5 mm de longitud que contiene 150 mg de granulos de carbon activado. El tercer elemento filtrante 3c adyacente a la barrita 1 tiene 15 mm de longitud, una cafda de presion de 90 mm de columna de agua en su longitud, y contiene 80 mg de fibra de acetato de celulosa. La fibra esta impregnada con 4% en peso de triacetina y tiene 80 mg de MIP espedfico para TSNA como se describe en este documento, distribuidos uniformemente en todo su volumen en un estilo "Dalmata".

El cigarrillo que se muestra en la figura 18 es similar al de la figura 17, excepto que el filtro de humo 3 tiene cuatro elementos filtrantes cilmdricos coaxiales 3a, 3b, 3c y 3d. El primer elemento filtrante 3a en el extremo de la boca del cigarrillo tiene 5 mm de longitud y esta compuesto por fibra de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de plastificante triacetina. El segundo elemento filtrante 3b, colocado adyacente al primer elemento filtrante 3a es una cavidad de 5 mm de longitud que contiene 200 mg de MIP espedfico para TSNA, producido como se describe en este documento. El tercer elemento filtrante 3c adyacente al segundo elemento filtrante 3b tiene 10 mm de longitud y esta compuesto por fibra de acetato de celulosa impregnada con 7% en peso de triacetina. El cuarto elemento filtrante 3d esta entre el tercer elemento filtrante 3c, tiene 7 mm de longitud y contiene 80 mg de carbon activado granular. Un anillo de orificios de ventilacion 5 esta formado en el papel de boquilla 4 en un plano radial A-A que suministra aire al tercer elemento filtrante 3c aproximadamente unos 3 mm de por delante de la union con el cuarto elemento filtrante 3d cuando se inhala el humo a traves del cigarrillo.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

REIVINDICACIONES

1. Un poUmero de impresion molecular selectivo para al menos una nitrosamina espedfica del tabaco (TSNA), que ha sido preparado utilizando materiales que comprenden:

una TSNA o uno de sus analogos estructurales;

un monomero funcional neutro; y

un reticulante hidrofobo.
2. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho analogo estructural de una TSNA es un analogo enamina de una TSNA.
3. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho analogo estructural de una TSNA es un analogo amida de una TSNA, como una formamida.
4. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho analogo estructural de una TSNA es un analogo sulfonamida de una TSNA.
5. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho monomero funcional neutro se elige del grupo que consiste en metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol y monometacrilato de glicerol.
6. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho reticulante hidrofobo se elige del grupo que consiste en dimetacrilato de etilenglicol (EDMA), trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM) y divinilbenceno (DVB).
7. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NNK.
8. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NNA.
9. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NNN.
10. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NAB.
11. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NAT.
12. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para NNAL.
13. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para iso-NNAL.
14. Un polfmero de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el polfmero es selectivo para iso-NNAC.
15. Un ardculo para fumar que comprende:

un material para fumar; y

un polfmero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14
16. Un filtro de humo, que contiene un polfmero segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
17. Un kit, compuesto por:

un polfmero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14; e

indicaciones de uso del polfmero de impresion molecular para realizar al menos una de: la deteccion, la cuantificacion o la separacion de nitrosaminas en una muestra.
18. Un metodo para preparar un polfmero de impresion molecular selectivo para las TNSA, que comprende:

copolimerizar al menos un monomero funcional neutro y al menos un reticulante hidrofobo en presencia de al menos un analogo estructural de TSNA en un medio de polimerizacion que contenga al menos un iniciador de radicales libres para producir un polfmero de impresion molecular unido a un analogo estructural de TSNA; y

separar el analogo estructural de TSNA del polfmero de impresion molecular.
19. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que el monomero funcional se elige del grupo que consiste en HEMA, acrilamida, metacrilamida, monoacrilato de glicerol y monometacrilato de glicerol.

10

15
20. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 18, en el que el reticulante se elige del grupo que consiste en EDMA, TRIM y DVB.
21. Un polfmero de impresion molecular producido por el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 18-20.
22. Un metodo para reducir el nivel de al menos una TSNA en un producto del tabaco, que comprende tratar el producto del tabaco con un polfmero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14
23. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que el producto del tabaco es producido por descomposicion termica de un material que contiene tabaco, un sustituto del tabaco o una mezcla de estos.
24. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que el producto del tabaco es producido por calentamiento del material a una temperatura por debajo de su temperatura de combustion.
25. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que el producto del tabaco es producido por combustion del material.
26. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 22, en el que el producto del tabaco es producido poniendo en contacto un material que contiene tabaco, un sustituto del tabaco o una mezcla de estos con un solvente.
27. Un metodo de fabricacion de un material del tabaco, que comprende los pasos de:

tratar un material que contiene tabaco, un sustituto del tabaco o una mezcla de estos con un solvente para producir un extracto;

poner en contacto el extracto con un polfmero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 de modo de reducir el nivel de este en el extracto; y

combinar el extracto tratado con el material del tabaco extrafdo.