ES2569417T3 - Uso de flagelinas del género Marinobacter como adyuvantes vacunales - Google Patents
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Abstract
Uso de flagelinas del género Marínobacter como adyuvantes vacunales. La presente invención se basa en el uso de dos flagelinas recombinantes F y FR de Ia especie Marínobacter algicola (cepa DG893T), como adyuvantes vacunales capaces de desarrollar una respuesta inmune específica, contra péptidos o proteínas fusionados a dichas flagelinas, o administrados sin fusionar conjuntamente con las flagelinas. También Ia presente invención describe nuevas estrategias de vacunación combinada, basadas en las dos flagelinas de
Description
USO DE FLAGELINAS DEL GÉNERO MARINOBACTER COMO ADYUVANTES VACUNALES
La presente invención puede adscribirse al campo técnico de la medicina, preferentemente dentro de la rama de la inmunología, así como a la industria farmacéutica, específicamente en el campo tecnológico del desarrollo de vacunas. 5
La presente invención se refiere al uso de flagelinas recombinantes de bacterias de la especie Marinobacter algicola, como adyuvantes vacunales, capaces de desarrollar una respuesta inmune específica, contra péptidos o proteínas, fusionadas o sin fusionar, a dichas flagelinas. La presente invención también se refiere a vacunas que combinan flagelinas de bacterias de la especie Marinobacter algicola y flagelinas de bacterias de la especie Salmonella typhimurium. 10
Flagelina es el nombre genérico de la proteína estructural principal que forma el flagelo de las bacterias. Son estructuras cilíndricas de diversa longitud (aprox. 530 nm) y alrededor de 21 nm de diámetro [1]. Los flagelos se observan tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas, son estructuras de longitud diversa que permiten el movimiento de las 15 bacterias en medios líquidos. El flagelo bacteriano aparte de estar formado por la flagelina, también lo constituyen otras muchas proteínas que intervienen en el ensamblaje, en la interacción con las envueltas externas de la célula, o que participan en procesos quimiotácticos.
El estudio de la estructura por difracción de rayos-X de la flagelina de bacterias del género Salmonella ha permitido ahondar en el conocimiento de su función e implicaciones biológicas [1, 2]. La flagelina puede jugar un papel importante 20 en la patogénesis bacteriana [3] y se ha definido como un prototipo de “patrón molecular asociado a patógenos” (PAMPs) ya que es capaz de activar el sistema inmune innato a través de la interacción con receptores específicos [4], [5].
La mayoría de las flagelinas bacterianas son reconocidas por el receptor “Toll-like-5” (TLR5), que se localiza en la membrana de células epiteliales y células del sistema inmune: monocitos, linfocitos T, células NK y células dendríticas 25 inmaduras. TLR5 es uno de los receptores de la familia “Toll-like” que tienen la capacidad de interaccionar con PAMPs [6], teniendo cada TLR la capacidad de reconocer PAMPs específicos [7]. Una vez que la flagelina se une a TLR5, se inicia una cascada de transducción de señales a través de MyD88 (Myeloid differentiation primary response gene 88) para mediar en la producción de citocinas necesarias para el desarrollo y regulación de una respuesta inmune innata y adaptativa del hospedador [8-10]. La unión de la flagelina de Salmonella al TLR5 es muy específica y actúa con una 30 gran afinidad, a concentraciones tan bajas como 8.5x10-10 M [11]. Por otro lado, también es conocido que flagelinas de algunas bacterias no son capaces de activar el sistema inmune cuando se produce una infección natural, es decir no se unen al receptor TLR5 para inducir la respuesta inflamatoria [12]. El escape inmunológico de estas flagelinas se ha circunscrito a bacterias de los subgrupos alfa y épsilon (Helicobacter pylori, por ejemplo), mientras que las flagelinas respondedoras, aquellas que activan el sistema inmune del huésped, serían de los grupos beta y gamma [12]. El 35 análisis molecular y funcional de las flagelinas no respondedoras, aquéllas que no activan el sistema inmune del huésped, llevaron a definir una región específica de interacción de las flagelinas con el receptor TLR5, siendo esta región específica, la comprendida entre los aminoácidos 89-96 de las secuencias proteicas de las flagelinas [13].
El documento WO2005/070455 describe adyuvantes vacunales mucosos que contienen flagelinas originadas a partir de Vibrio vulnificus, Salmonella typhimurium, and Listeria monocytogenes como componente activo [14]. Lee S et al. (2006) 40 describe la muy potente actividad del adyuvante mucoso de una flagelina mayor de Vibrio vulnificus (FlaB), cuando se co-administra con la toxina del tétanos (TT) [15].
La mayoría de las vacunas actuales se componen del antígeno de interés y de adyuvantes [16], [17]. A pesar que los adyuvantes mejoran la respuesta inmune, también pueden provocar efectos secundarios adversos como ocurre con el adyuvante completo de Freund [18], [19], o incluso como es el caso de otros adyuvantes aprobados por la FDA o la 45 EMEA. Para solucionar dicho problema asociado a la fabricación de vacunas y mejorar la efectividad de las mismas, se ha utilizado la flagelina de Salmonella typhimurium como adyuvante vacunal, ya que se ha demostrado que esta flagelina en fusión transcripcional a péptidos o proteínas induce frente a ellas una respuesta inmune humoral y celular, innata y adaptativa, muy rápida y potente. Algunas de las vacunas basadas en la flagelina de Salmonella se han dirigido contra el cólera [20], influenza [21], 20[22], peste (Yersinia pestis) [23], 22[24], malaria (Plasmodium falciparum) [25], y 50 el virus West Nile [26].
La bacteria Salmonella se clasifica actualmente en las especies S. bongori y S. enterica [27]. La mayoría de las Salmonella que infectan a mamíferos y aves pertenecen a S. enterica, que se divide en seis subespecies (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, indica) con aproximadamente 2000 serotipos definidos en base a diferencias en composición de lipopolisacáridos (LPS) y antígenos del flagelo [27]. Algunos serotipos son exclusivos de hospedador 55 como S. typhi (humanos) y S. pullorum (aves), y otros mayoritariamente adaptados a algún hospedador como S. cholerae-suis (porcinos), S. abortus-ovis (ovinos), y S. dublin (bovinos) [27].
La infección por Salmonella provoca la aparición de inmunidad celular y humoral contra diversos antígenos de dicha bacteria. Uno de estos antígenos es la flagelina, como así lo demuestran diversos estudios realizados en personas de origen caucásico de Dinamarca y Estados Unidos [28]-[29]. En un estudio aleatorio de población en EE. UU, el 30% tenían anticuerpos anti-flagelina de Salmonella [30]. Por otro lado, la capacidad de respuesta a flagelina en infecciones con bacterias es diversa, encontrándose altos respondedores y bajos respondedores a la reinmunización con flagelina 5 [29]; atribuyéndose estos resultados a ciertos genotipos Gm de la flagelina [29]. Asimismo, las aves y otros animales son muy susceptibles de infección por Salmonella entérica [31]. Por tanto, las infecciones por Salmonella se producen en distintas especies y países, lo que indica la importancia del alcance de estas patologías, y por ello desde hace años se han establecido programas de control en humanos, mientras que es una enfermedad de declaración obligatoria en bovinos, ovinos y caprinos (http://www.oie.int/esp/maladies/es_classification2009.htm?e1d7). Todos estos datos indican 10 que un porcentaje importante de la población que se infecta presenta anticuerpos contra la flagelina de Salmonella.
La mayoría de variantes de Salmonella tienen dos tipos de genes distintos que codifican para la flagelina, aunque sólo se expresa la flagelina de uno de estos genes a un tiempo. La bacteria es capaz de alternar la expresión de las dos flagelinas denominadas flagelina de fase 1 y flagelina de fase 2. El operon que controla la síntesis de la flagelina de fase 1 también codifica un represor de la síntesis de la flagelina de fase 2, y viceversa. Es posible que el mecanismo de 15 cambio de fase 1 a fase 2 de síntesis de la flagelina sea consecuencia del intento de la bacteria de evitar la inmunidad celular
Un estudio reciente [32] ha aclarado mucho sobre los aspectos relacionados con la inmunogenicidad de la flagelina de Salmonella typhimurium. Los ratones que se inmunizan en sucesivas ocasiones con la flagelina producen anticuerpos que neutralizan la capacidad de interacción TLR5-flagelina. Estos anticuerpos se dirigen principalmente frente a la 20 región hipervariable (RHPV) de la flagelina. La obtención de diversas flagelinas cuyas regiones hipervariables son eliminadas en distintos grados, ha permitido observar que estas flagelinas modificadas conservan su capacidad de interacción con TLR5, y reaccionan menos con un suero de ratón hiperinmune obtenido de inmunizarse con la flagelina salvaje. Sin embargo, la reactividad de un suero de ratón hiperinmune tras inmunizarse con una versión de flagelina sin RHPV, es muy similar entre la flagelina salvaje y otras sin RHPV, lo que indica que existen anticuerpos neutralizantes de 25 las regiones conservadas de las flagelinas, incluyendo las regiones de interacción con TLR5. Por otro lado, la eliminación completa de la RHPV impide que la flagelina modificada inicie con normalidad la producción de citocinas inflamatorias (CCL20 y CXCL2) a nivel sistémico, si bien esta alteración en la flagelina no produce el mismo efecto a nivel de mucosas [32]. Es decir, cuando esta flagelina es inyectada falla en la producción de mediadores inflamatorios, pero tiene un comportamiento adecuado cuando se aplica a mucosas. En resumen, todos estos datos indican que: 30
1. La función de la flagelina puede ser neutralizada por anticuerpos preexistentes contra la flagelina salvaje (completa). Los anticuerpos generados contra una flagelina salvaje se dirigen fundamentalmente contra la región hipervariable.
2. Si se elimina la región hipervariable completamente, los anticuerpos generados contra la flagelina reconocen los dominios conservados entre los que se encuentra la región de interacción con TLR5. Por tanto, sería 35 preferible no eliminar la región hipervariable puesto que es más inmunodominante, y así los anticuerpos generados no van dirigidos contra la región de interacción con TLR5.
3. Distintas versiones de la flagelina sin fragmentos de RHPV son funcionales al activar TLR5 a nivel de mucosas, pero no funcionan igual a nivel sistémico, salvo una de las versiones obtenidas que posee parte de RHPV, que sí se comporta como la flagelina salvaje. Sin embargo, ésta puede ser neutralizada, aunque en 40 menor medida que la salvaje, por anticuerpos de sueros que han reaccionado contra la flagelina salvaje [30].
Todo lo expuesto indica que una vacuna basada en la flagelina de Salmonella capaz de activar el sistema inmune en todas sus formas, no podría usarse de forma repetida porque los anticuerpos preexistentes neutralizarían su potencial.
Por todo ello, sería un hito muy interesante para el desarrollo y aplicación de vacunas basadas en flagelinas, el disponer de otras flagelinas que indujeran la misma activación del sistema inmune innato y escaparan de la respuesta 45 inmunológica desencadenada frente a las flagelinas de Salmonella.
En este sentido, la presente invención ha descubierto sorprendentemente que las vacunas basadas en flagelinas de bacterias marinas de la especie Marinobacter algicola son igual, o incluso más efectivas, que las vacunas basadas en las flagelinas de Salmonella. Al ser las bacterias de Marinobacter algicola, bacterias marinas, la infección previa de organismos no acuáticos es muy poco probable. Incluso se desconoce hasta la fecha, si dicha bacteria es capaz de 50 infectar a organismos acuáticos. Hasta la fecha se han reconocido 12 especies de Marinobacter aisladas de distintas fuentes como conductos de extracción de crudo en plataformas marinas [33], en aguas termales de costa [34], aguas templadas [35] y aguas antárticas [36], suelos salinos [37] y sedimentos marinos [38]. Del estudio en laboratorio de diferentes algas se han aislado tres cepas de bacterias del género Marinobacter, que se han denominado Marinobacter algicola, procediendo dos del Mar Amarillo en la costa de Corea (DG893T y DG1136) y una de la Ría de Vigo en Galicia 55 (GC21V) [39].
Al igual que en Salmonella, la bacteria Marinobacter algicola posee dos genes que codifican para dos flagelinas. Así, en la presente invención se describe el uso de las dos secuencias proteicas recombinantes de las flagelinas de la especie Marinobacter algicola (cepa DG893T), denominadas flagelina F y flagelina FR, capaces de inducir y desarrollar una respuesta inmune específica por si solas, sin la ayuda de otros adyuvantes, indicando que dichas flagelinas son 60 capaces de interaccionar de manera apropiada con el receptor TLR5, desencadenando la respuesta inmunológica. Pero
también, la presente invención pone de manifiesto que las flagelinas F y FR de Marinobacter algicola pueden fusionarse a péptidos, proteínas o antígenos vacunales, o bien administrarse conjuntamente con dichos péptidos y proteínas, pero sin fusionarse a los mismos, y desarrollar una respuesta inmune específica.
Además, se pone de manifiesto la escasa reactividad cruzada existente entre las flagelinas descritas en la presente invención del género Marinobacter y la flagelina de Salmonella. Esta escasa reactividad entre las flagelinas de ambas 5 especies se debe a la relativa baja homología de secuencia existente entre ambas flagelinas (33%-36%). Es muy destacable el hecho de que la baja reactividad cruzada entre dichas flagelinas supone una ventaja en la efectividad de las vacunas basadas en las flagelinas de Marinobacter, ya que como hemos comentado anteriormente, podría existir una neutralización parcial de vacunas basadas en la flagelina de Salmonella en sujetos que hayan sufrido infección o contacto previo frente a Salmonella, o bien que hayan sido inmunizados previamente con la flagelina de Salmonella. Sin 10 embargo, es muy poco probable tener inmunidad previa frente a bacterias del género Marinobacter ya que es una bacteria marina, que no se conoce que infecte al ser humano u otros organismos, y la probabilidad de contacto con organismos no marinos y producir en ellos una respuesta inmunológica es muy baja.
También se describen las diferentes estrategias de vacunación combinada basadas en la utilización de las dos flagelinas de Marinobacter descritas en la presente invención y la flagelina de Salmonella typhimurium. Así, en este 15 sentido, los individuos que previamente hayan estado en contacto con Salmonella, podrían vacunarse utilizando las flagelinas de Marinobacter (F y FR), mientras que aquellos individuos no expuestos a Salmonella previamente, podrían llevar a cabo una estrategia diferente: en primer lugar, se podrían inmunizar con una vacuna basada en la flagelina de Marinobacter y posteriormente aplicar otra vacuna basada en la flagelina de Salmonella. Así, se potenciaría el uso de estas vacunas para múltiples antígenos sin restar eficacia por seroneutralización cruzada entre flagelinas. 20
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
La presente invención se basa en el uso de dos flagelinas recombinantes, de la especie Marinobacter algicola (cepa 25 DG893T), como adyuvantes vacunales capaces de desarrollar una respuesta inmune específica contra péptidos o proteínas fusionados a dichas flagelinas, o bien administrados conjuntamente sin fusionar. También se definen estrategias de vacunación combinada basadas en las dos flagelinas de Marinobacter algicola y la flagelina de Salmonella typhimurium, así como los métodos de síntesis de los adyuvantes vacunales que comprenden las flagelinas descritas en la presente invención. 30
Descripción de las figuras
Figura 1. Niveles de IL-8 medidos por ELISA tras la estimulación de células CACO-2 en presencia de distintas flagelinas de Marinobacter (Flagelina F y FR) y Salmonella typhimurium (Flagelina STF y STF4DUD). STF4DUD: flagelina recombinante purificada de Salmonella typhimurium (STF) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD (DUD es 35 una secuencia génica que codifica para un péptido de unión a dineína). Como controles negativos se han cultivado las células en presencia de PBS y en ausencia de PBS (MOCK). La figura representa la media aritmética de los niveles de IL-8 de dos mediciones realizadas mediante ELISA. Los resultados se expresan como la densidad óptica medida a 490 nm (eje Y).
Figura 2. Nivel de anticuerpos IgG (dilución 1/100) contra la secuencia DUD inducida por las distintas flagelinas y 40 medido mediante ELISA. Los datos representados corresponden a las medias aritméticas de todos los animales (n=5) dentro de cada grupo. Los resultados se expresan como la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de dos mediciones realizadas. STF4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con la flagelina recombinante purificada de Salmonella typhimurium (STF) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. F4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con la flagelina 45 recombinante purificada de Marinobacter (F) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. FR4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con la flagelina recombinante purificada de Marinobacter (FR) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. F4DUD-in: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía intranasal con la flagelina recombinante purificada de Marinobacter (F) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. 4DUD: se corresponde con el control negativo del 50 experimento. Representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con 4 copias en tándem del epítopo DUD, sin flagelinas.
Figura 3. Título de anticuerpos IgG (dilución 1/12800) contra la secuencia DUD inducida por las distintas flagelinas y medido mediante ELISA. Los resultados se expresan como la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de dos mediciones realizadas. STF4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía 55 subcutánea con la flagelina recombinante purificada de Salmonella typhimurium (STF) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. F4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con la flagelina recombinante purificada de Marinobacter (F) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. FR4DUD: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con la flagelina
recombinante purificada de Marinobacter (FR) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. F4DUD-in: representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía intranasal con la flagelina recombinante purificada de Marinobacter (F) fusionada a 4 copias en tándem del epítopo DUD. 4DUD: se corresponde con el control negativo del experimento. Representan los niveles de IgG obtenidos en el suero de ratones inmunizados vía subcutánea con 4 copias en tándem del epítopo DUD, sin flagelinas. 3x4DUD: es otro control negativo del experimento. Representa tres 5 veces el valor de densidad óptica del tetrapéptido 4DUD. Dicho valor de densidad óptica sirve como línea de corte a partir de la cual todos los sueros deberían estar por encima para concluir que son capaces de producir una respuesta inmune potente.
Figura 4. Título de anticuerpos IgG contra la secuencia 4M2-2009 inducida por la flagelina de fusión FR-4M2-2009 y medido mediante ELISA. 4M2-2009: se corresponde con las 4 copias en tándem del epítopo M2-2009, perteneciente al 10 virus de la gripe de la cepa pandémica A/Castilla-La-Mancha/GP13/2009/H1N1. Los resultados se expresan como la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de dos mediciones realizadas. El eje X representa el grado de dilución de los sueros. R1, R2, R3 y R4 representan el suero de los ratones inoculados con la flagelina FR-4M2-2009. C1, C2, C3 y C4 representa el suero de los ratones control que fueron inoculados con el péptido M2-2009 en PBS.
Figura 5. Título de anticuerpos IgG que reconocen la flagelina STF de Salmonella typhimurium, y que están presentes 15 en sueros anti-flagelina de Salmonella typhimurium (grupo de sueros A), en sueros anti-flagelina F de Marinobacter (grupo de sueros B), y en un suero anti-4DUD (suero D1). Se representa la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de 2 mediciones realizadas. En el eje X se representa el suero de cada individuo de menor a mayor dilución (ver leyenda).
Figura 6. Título de anticuerpos IgG que reconocen la flagelina F de Marinobacter, y que están presentes en sueros anti-flagelina F de Marinobacter (grupo de sueros B), en sueros anti-flagelina de Salmonella typhimurium (grupo de sueros 20 A), y en un suero anti-4DUD (suero D1). Se representa la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de 2 mediciones realizadas. En el eje X se representa el suero de cada individuo de menor a mayor dilución (ver leyenda).
Figura 7. Título de anticuerpos IgG que reconocen la flagelina STF de Salmonella typhimurium, y que están presentes en un suero anti-flagelina STF de Salmonella typhimurium (suero A1), en sueros anti-flagelina FR de Marinobacter (grupo de sueros C), y en un suero anti-4DUD (suero D1). Se representa la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de 25 2 mediciones realizadas. En el eje X se representa el suero de cada individuo de menor a mayor dilución (ver leyenda).
Figura 8. Título de anticuerpos IgG que reconocen la flagelina FR de Marinobacter, y que están presentes en sueros anti-flagelina FR de Marinobacter (grupo de sueros C), en sueros anti-flagelina de Salmonella typhimurium (grupo de sueros A), y en un suero anti-4DUD (suero D1). Se representa la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de 2 mediciones realizadas. En el eje X se representa el suero de cada individuo de menor a mayor dilución (ver leyenda). 30
Figura 9. Título de anticuerpos IgG que reconocen la flagelina F de Marinobacter, y que están presentes en sueros anti-flagelinas F y FR de Marinobacter. Se representa la densidad óptica medida a 405 nm (eje Y) de 2 mediciones realizadas. Las barras enladrilladas representan el suero de ratones que contiene anticuerpos anti-flagelina FR (Marinobacter). Las barras negras y las barras con líneas oblicuas respectivamente representan el suero de 2 ratones diferentes que contiene anticuerpos anti-flagelina F (Marinobacter). 35
Descripción detallada de la invención
La invención describe el uso de las flagelinas denominadas F y FR de la especie Marinobacter algicola (cepa DG893T) como adyuvantes vacunales y vacunas propiamente dichas, capaces de desarrollar una respuesta inmune específica 40 contra péptidos, proteínas o antígenos vacunales fusionados a las flagelinas, o administrados sin fusionar junto con estas flagelinas. También define nuevas estrategias de vacunación combinada basadas en las dos flagelinas de Marinobacter algicola y la flagelina de Salmonella typhimurium (STF). Además de los métodos de síntesis de los adyuvantes vacunales que comprenden las flagelinas descritas en la presente invención.
Para demostrar la capacidad vacunal y adyuvantadora, in vitro e in vivo, de las flagelinas F y FR de Marinobacter, 45 respecto a la flagelina STF de Salmonella typhimurium, en la presente invención se han utilizado diferentes versiones de las secuencias génicas codificantes de las proteínas recombinantes de las flagelinas mencionadas. Por un lado, las secuencias génicas codificantes de las flagelinas recombinantes por sí solas (F, FR y STF), y por otro lado, las secuencias génicas codificantes de las flagelinas recombinantes fusionadas a diferentes epítopos. Por epítopo se entiende una secuencia proteica de una macromolécula que es reconocida por el sistema inmunológico, 50 específicamente por anticuerpos, células B o células T, y que además es capaz de generar respuesta inmunológica.
En la presente invención se han utilizado como epítopos la secuencia génica que codifica para un péptido de unión a dineína (DUD) y la secuencia génica que codifica para un péptido utilizado como diana vacunal del virus de la influenza o gripe. El péptido DUD está formado por la secuencia génica responsable de la unión de la proteína p54 (proteína responsable de la unión del virus de la peste porcina africana (PPA) a la célula hospedadora) [40] a una secuencia 55 génica específica de las cadenas ligeras de la dineína, DLC8. La secuencia aminoacídica responsable de la unión de la proteína p54 a la cadena ligera de la dineína DCL8, la constituye un epítopo de 13 aminoácidos (SEQ ID NO:13) de dicha proteína p54 [41]. El péptido utilizado como diana vacunal frente al virus de la influenza, es el péptido conocido como ectodominio de la proteína M2 (M2e). La proteína M2 tiene un papel importante en el ciclo viral del virus influenza.
Forma un canal iónico que posibilita la entrada de protones al virus, disminuyendo el pH y permitiendo la disociación de la proteína de la matriz M1 de la ribonucleoproteína NP, para finalmente descargar todo el contenido en el citoplasma de la célula infectada. La región M2e está especialmente conservada. En la presente invención se ha seleccionado la región M2e del virus de la gripe de la cepa pandémica A/Castilla-La-Mancha/GP13/2009/H1N1 (M2-2009), que codifica para un péptido de 24 aminoácidos (SEQ ID NO:27). Anticuerpos frente a los epítopos SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:27, 5 no aparecen en animales tras ser inmunizados en ausencia de adyuvantes con las proteínas recombinantes p54 y M2 respectivamente, únicamente aparecen en animales hiperinmunizados frente al virus de la PPA y frente al virus influenza, respectivamente, por lo que podemos decir que estos epítopos son buenos modelos para comprobar la capacidad vacunal y adyuvantadora de las flagelinas de Marinobacter F y FR respecto a la flagelina STF de Salmonella typhimurium. 10
Estudios previos han demostrado que la respuesta inmune que se desarrolla frente a cuatro copias en tándem de un epítopo, es mayor que frente a una sola copia ese epítopo [22]. Por este motivo, para demostrar la capacidad adyuvantadora-vacunal de las flagelinas de Marinobacter, la presente invención, ha utilizado las proteínas recombinantes de la flagelina F por sí sola (SEQ ID NO:20), de la flagelina F unida a una cola de histidinas y a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:2), de la flagelina F fusionada a cuatro copias en tánden del péptido DUD modificado 15 dando lugar a la flagelina F de fusión F4DUD (SEQ ID NO: 24) y la indicada flagelina F de fusión F4DUD unida a una cola de histidinas y a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:6). También, en la presente invención se ha utilizado las proteínas recombinantes de la flagelina FR sola (SEQ ID NO:22), de la flagelina FR fusionada a una cola de histidinas y a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:4), de la flagelina FR fusionada a cuatro copias en tánden del péptido DUD modificado dando lugar a la flagelina FR de fusión FR4DUD (SEQ ID NO: 26) y de dicha flagelina FR de fusión FR4DUD 20 unida a una cola de histidinas y a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:8). Además, se han utilizado las proteínas recombinantes de la flagelina FR fusionada a cuatro copias en tánden del péptido M2-2009 dando lugar a la flagelina FR de fusión FR4M2-2009 (SEQ ID NO:31) y de la flagelina FR de fusión FR4M2-2009 unida a una cola de histidinas y a una secuencia KDEL (SEQ ID NO:29). Por último, se ha utilizado la flagelina de Salmonella typhimurium (STF) sola (SEQ ID NO:15), flagelina STF fusionada a cuatro copias en tánden del péptido DUD modificado y unido a una cola de 25 histidinas y a una secuencia KDEL dando lugar a la flagelina STF de fusión STF4DUD (SEQ ID NO: 10). El péptido DUD modificado (SEQ ID NO: 14) se diferencia del péptido DUD sin modificar (SEQ ID NO: 13) en que contiene una secuencia de aminoácidos de la región de unión de p54 ampliada con cinco aminoácidos más en su extremo 3´ y siete aminoácidos más en su extremo 5´, con el fin de que el reconocimiento de los epítopos para el desarrollo de la respuesta humoral sea lo más parecido posible a la respuesta inducida por la proteína completa en condiciones 30 fisiológicas.
Así la presente invención analiza la funcionalidad y la capacidad adyuvante-vacunal de las flagelinas F y FR de Marinobacter algicola (cepa DG893T) en distintas versiones: F (SEQ ID NO:2), FR (SEQ ID NO:4), F4DUD (SEQ ID NO:6), FR4DUD (SEQ ID NO:8) y FR4M2-2009 (SEQ ID NO:29). Las flagelinas F4DUD (SEQ ID NO:6) y FR4DUD (SEQ ID NO:8), son las flagelinas F y FR que llevan 4 copias en tándem del péptido DUD fusionado en su extremo 3’. 35 La flagelina FR4M2-2009 (SEQ ID NO: 29), es la flagelina FR que lleva 4 copias en tánden del pétido M2-2009, fusionado en su extremo 3´. Con el fin de comparar la actividad y función de las flagelinas de Marinobacter, también se ha obtenido la flagelina de Salmonella typhimurium en las siguientes versiones: STF (SEQ ID NO:15) y STF4DUD (SEQ ID NO:10), siendo esta última una flagelina de fusión que lleva 4 copias en tándem del péptido DUD fusionado en su extremo 3’. 40
Los genes de las flagelinas F (SEQ ID NO:1) y FR (SEQ ID NO:3) de Marinobacter algicola utilizados en la presente invención, se sintetizaron químicamente a partir de su secuencia primaria de ADN (Genbank: NZ_ABCP01000018.1). En cambio, el gen de la flagelina STF de Salmonella typhimurium se obtuvo a partir del ADN de Salmonella typhimurium mediante la amplificación por PCR con cebadores específicos de secuencia SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12. Todas las secuencias de las flagelinas solas: F, FR y STF, y de las flagelinas de fusión con el epítopo en 45 tándem, ya sea el epítopo DUD o el epítopo M2-2009: F4DUD, FR4DUD, STF4DUD y FR4M2-2009; incluyen en su extremo 3´ ó 5´, una cola de histidinas para que las proteínas recombinantes expresadas posteriormente, ya sea mediante el sistema baculovirus-células de insecto, o mediante la transformación de bacterias con los plásmidos portadores de dichas secuencias, sean más fáciles de purificar posteriormente mediante cromatografía, aunque puede utilizarse cualquier método o sistema reconocido en el estado de la técnica que facilite la posterior purificación de dichas 50 proteínas recombinantes. Además, también se ha incluido en todas las secuencias de las flagelinas descritas en la presente invención, la secuencia de aminoácidos “KDEL” que sirve para la retención de las proteínas en retículo endoplásmico quedando así menos expuestas a degradación, incrementándose finalmente la obtención de la proteína expresada. De la misma manera que se ha comentado anteriormente, se puede utilizar cualquier secuencia aminoacídica capaz de evitar la degradación de las proteínas recombinantes obtenidas. En el caso particular de la 55 presente invención, incrementándose la obtención de las flagelinas de interés F, F4DUD, FR, FR4DUD, FR4M2-2009, STF y STF4DUD.
La presente invención pone de manifiesto la capacidad de las flagelinas de Marinobacter para evocar una respuesta inmune similar a la desencadenada por la flagelina STF de Salmonella typhimurium, tanto a nivel in vitro, siendo capaz de inducir la liberación de la citocina IL-8 al medio extracelular en cultivos celulares en presencia de las flagelinas F y 60 FR (Figura 1); como in vivo, llegándose a obtener niveles similares de anticuerpos IgG anti-DUD (Figura 2) en muestras de sueros procedentes de ratones inmunizados vía subcutánea (sc) o intranasal (in) con las flagelinas de fusión purificadas de Marinobacter, F4DUD y FR4DUD, respecto a los ratones inmunizados con la flagelina de fusión de
Salmonella typhimurium STF4DUD (Figuras 2 y 3). De la misma manera se obtuvieron altos niveles de anticuerpos IgG anti-4M2-2009 en muestras de sueros procedentes de ratones inmunizados vía subcutánea con las flagelinas de fusión purificadas FR-4M2-2009, frente a los niveles obtenidos en los sueros de ratones control inmunizados con el péptido M2-2009 en PBS (Figura 4). Por lo tanto, estos resultados ponen de evidencia que las flagelinas de Marinobacter interaccionan de manera apropiada con el receptor TLR5, y de forma similar a la flagelina de Salmonella typhimurium. 5
Las secuencias aminoacídicas de las flagelinas F y FR de Marinobacter, que interaccionan con TLR5 desencadenando la activación del sistema inmune, son distintas a las de Flagelina de Salmonella typhimurium. Estas secuencias aminoacídicas de interacción entre el receptor TLR5 y las flagelinas FR y F vienen definidas por SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17 respectivamente. En la presente invención también se ha demostrado que la secuencia de interacción de la flagelina F ampliada con algún aminoácido más en su región 3´ (SEQ ID NO: 18) sigue siendo capaz de unirse al 10 receptor TLR5 y desencadenar la activación del sistema inmune. Mediante los programas bioinformáticos BLAST y CLUSTAL W [42-44], se ha analizado la homología existente entre las secuencias proteicas de las flagelinas F (SEQ ID NO:20) y FR (SEQ ID NO:22) de Marinobacter algicola (Cepa DG893T) y la flagelina STF (SEQ ID NO:15) de Salmonella typhimurium poniendo en evidencia que:
a) Cuando se analizan las secuencias completas de todas las flagelinas mencionadas, la homología entre F 15 y FR es de un 63%, entre F y STF es de un 33%, y entre FR y STF es de un 36%.
b) Cuando se analizan las regiones más conservadas (excluyendo la parte central que es hipervariable) que corresponden a los primeros 170 aminoácidos de la zona amino-terminal, y a los 90 aminoácidos últimos (zona carboxilo-terminal) de las flagelinas mencionadas, la homología entre F y FR es de un 78%, entre F y STF es de un 55%, y entre FR y STF es de un 57%. 20
En esta invención también se ha analizado la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-flagelina de Salmonella typhimurium frente a las flagelinas de Marinobacter, y viceversa, así como la reactividad cruzada entre ambas flagelinas de Marinobacter (Figuras 5-9). La finalidad de dicho análisis ha sido estudiar la presencia de anticuerpos capaces de reconocer distintas flagelinas, después de un proceso de inmunización estándar, aunque en la presente invención se han utilizado dosis de flagelinas vacunales más elevadas de lo necesario (30 g) para desarrollar una respuesta inmune 25 efectiva con dichas moléculas. Como se ha comentado con anterioridad, los anticuerpos generados frente a la flagelina con la que se inmunizó (por ejemplo, de Salmonella typhimurium) podrían ser específicos de regiones que no interaccionan con el TLR5 o de regiones que sí son importantes en este reconocimiento. En definitiva, la aparición de estos anticuerpos puede neutralizar la funcionalidad de nuevas administraciones de flagelina vacunal, por lo que hace más complicado el uso reiterado como vacuna de la flagelina de un mismo organismo. Por otro lado, la ausencia de 30 reconocimiento de los anticuerpos generados por la flagelina de la especie Salmonella typhimurium respecto a las flagelinas de Marinobacter, y viceversa, permitiría establecer nuevas estrategias de vacunación, que solventaran dicho problema.
Los resultados mostrados en la presente invención indican que los anticuerpos anti-flagelina F de Marinobacter reconocen levemente, en general, la flagelina de Salmonella typhimurium STF (Figura 5), teniendo el suero que es más 35 positivo en anticuerpos anti-F entre 16 y 32 veces menos reconocimiento sobre la flagelina de Salmonella (STF) que un suero positivo. Los sueros anti-flagelina FR también reaccionan levemente ante la flagelina STF, si bien el suero más positivo reconoce 32 veces menos la flagelina STF que un control positivo (Figura 7).
Por su parte los anticuerpos anti-flagelina (STF) de Salmonella typhimurium reconocen levemente la flagelina F (Figura 6), y es prácticamente inexistente el reconocimiento de la flagelina FR de Marinobacter (Figura 8) a dilución 1/100. Los 40 sueros anti-flagelina de Salmonella typhimurium tienen un título de IgG mayor de 1/12800, y que podría alcanzar 1/25600, lo que indica que la escasa reactividad cruzada entre las flagelinas de Marinobacter (especialmente FR) y Salmonella typhimurium se explicaría por su baja homología de secuencia que corresponde a un 33%-36%. Sin embargo, los anticuerpos anti-F y anti-FR presentan una reactividad cruzada con las flagelinas de Marinobacter FR y F, respectivamente. Este hecho se explica por el grado de homología existente entre las flagelinas F y FR que corresponde 45 al 63% de la estructura completa, y a un 78% de la estructura que representa las zonas más conservadas, como se ha mencionado anteriormente.
La presente invención describe una nueva estrategia de vacunación basada en el uso de las flagelinas F y FR de Marinobacter. Por un lado, propone utilizar vacunas basadas en la flagelina F o FR en aquellos individuos que hayan estado en contacto con Salmonella typhimurium y presenten anticuerpos anti-flagelina de Salmonella por infecciones 50 previas o por inmunización previa con la flagelina de Salmonella typhimurium, pudiendo estos individuos vacunarse con al menos una dosis efectiva de una de las flagelinas de Marinobacter unida o administrada conjuntamente a un epítopo específico para generar la inmunidad y por otro lado, vacunarse con al menos otra dosis efectiva de la otra flagelina de Marinobacter unida o administrada conjuntamente a otro epitopo diferente del anterior, generando así doble inmunidad frente a dos epítopos diferentes. Por otro lado, se propone que en aquellos individuos no expuestos a Salmonella 55 previamente, ni inmunizados aún con su flagelina, se les podría inmunizar primero con al menos una dosis efectiva de una vacuna basada en cualquiera de las flagelinas de Marinobacter (F o FR) y posteriormente se les aplicaría al menos otra dosis efectiva basada en la flagelina de Salmonella, preferentemente basada en la flagelina de Salmonella typhimurium, y viceversa, es decir, inmunizarles primero con al menos una dosis efectiva de una vacuna basada en la flagelina de Salmonella, preferentemente Salmonella typhimurium y en segundo lugar inmunizarles con al menos una 60 dosis efectiva de una vacuna en cualquiera de las flagelinas de Marinobacter (F o FR). Otra estrategia de vacunación a contemplar en individuos que no presentan inmunidad previa frente a la flagelina de Salmonella, preferentemente
Salmonella typhimurium es inmunizarlos con al menos una dosis efectiva de una vacuna basada en esta flagelina, posteriormente inmunizarlos con al menos una dosis efectiva de una vacuna basada en una de las flagelinas de Marinobacter unida o administrada conjuntamente a un epítopo específico para generar la inmunidad y por otro lado, inmunizarlos al menos una dosis efectiva de una vacuna basada en la otra flagelina de Marinobacter unida o administrada conjuntamente a otro epitopo diferente del anterior, generando así triple inmunidad frente a tres epítopos 5 diferentes. El orden de administración de las dosis efectivas de las vacunas en los individuos se puede realizar indistintamente, primero vacunando con las vacunas basadas en las flagelinas de Marinobacter y en segundo lugar vacunando con la vacuna basada en la flagelina de Salmonella typhimurium y viceversa. Mediante las estrategias de vacunación descritas en la presente invención se potencia el uso de las vacunas para múltiples antígenos sin restar eficacia por posible seroneutralización cruzada entre flagelinas. 10
Así uno de los objetos de la presente invención se refiere a un adyuvante vacunal que comprende al menos una flagelina del género Marinobacter, preferentemente de la especie Marinobacter algicola.
En otra realización preferida, el adyuvante vacunal de la invención puede fusionarse al menos a un epítopo capaz de generar respuesta inmunológica preferentemente 4 copias en tándem. En otra realización preferida de la invención, los epítopos capaces de generar respuesta inmunológica, no se fusionan al adyuvante vacunal, sino que pueden ser 15 administrados conjuntamente con él, pero sin estar fusionados al mismo.
En otra realización preferida, el adyuvante vacunal de la invención comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18.
En otra realización preferida, el adyuvante vacunal de la invención se caracteriza por contener, al menos, una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID 20 NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:29 ó SEQ ID NO:31 ó una secuencia de aminoácidos codificada por: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28 ó SEQ ID NO:30.
Otro objeto de la presente invención se refiere a una vacuna que comprende al menos un adyuvante vacunal según se ha descrito anteriormente, opcionalmente comprendiendo otros adyuvantes vacunales, además también puede contener 25 un epítopo capaz de generar respuesta inmunológica, pero no fusionado al adyuvante vacunal.
Otro objeto de la presente invención se refiere al método de síntesis de adyuvantes vacunales caracterizados por comprender al menos una flagelina bacteriana del género Marinobacter caracterizado por:
a) Seleccionar al menos una de las secuencias génicas que codifican para flagelinas del género Marinobacter.
b) Clonar al menos una de las secuencias génica del paso anterior en un vector de expresión. 30
c) Generar organismos modificados mediante la inserción de vector del paso anterior.
d) Crecer los organismos modificados del paso anterior en condiciones adecuadas para favorecer la expresión de al menos una de las secuencias incluidas en el vector
e) Aislar al menos una de las proteínas expresadas por los organismos portadores del vector de expresión del paso anterior. 35
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque las secuencias génicas que codifican para las flagelinas se selecciona preferentemente entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:30.
En una realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque a las secuencias génicas que codifican para las flagelinas del género Marinobacter se les puede añadir al menos un epítopo capaz de generar respuesta 40 inmunológica específica, preferentemente 4 copias en tándem.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque a las secuencias génicas de las flagelinas del género Marinobacter se le puede añadir una secuencia génica que codifica para un péptido capaz de facilitar el aislamiento o purificación de la flagelina. Esta secuencia puede ser añadida tanto en el extremo 3´ como en el extremo 5´, siendo preferentemente añadida en el extremo 3´. 45
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque la secuencia que codifica para una secuencia peptídica capaz de facilitar el aislamiento o purificación de la flagelina es preferentemente una cola de histidinas.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque a las secuencias génicas de las flagelinas del género Marinobacter también se les puede añadir una secuencia génica que codifica para un péptido capaz de evitar 50 la degradación de la flagelina, siendo preferentemente una secuencia que codifica para el péptido KDEL.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque el vector de expresión utilizado se selecciona preferentemente los comprendidos en las cepas: CECT 7633, CECT 7634, CECT 7635 y CECT 7636.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque los organismos modificados se seleccionan preferentemente entre virus y bacterias. 55
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque los virus son preferentemente baculovirus.
En otra realización preferida, el método de la invención se caracteriza porque los virus generados mediante el método de la invención son preferentemente Baculovirus y se utilizan para transfectar células de mamífero o de insecto, siendo preferentemente utilizadas las células de insecto.
Otro objeto de la presente invención se refiere a un vector de expresión que se caracteriza por comprender cualquiera de las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID 5 NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:30 y que se selecciona preferentemente entre cualquiera de los comprendidos en las cepas: CECT 7633, CECT 7634, CECT 7635 y CECT 7636.
Es otro objeto de la presente invención los virus transformados con cualquiera de los vectores de expresión mencionados anteriormente, siendo preferentemente baculovirus.
Es otro objeto de la presente invención las bacterias transformadas con cualquiera de los vectores de expresión 10 mencionados anteriormente, siendo preferentemente bacterias de la cepa E.coli DH5.
Otro objeto de la presente invención son las células infectadas con los virus transformadas vectores descritos anteriormente, pudiendo ser células de mamífero o insecto.
Otro objeto de la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las secuencias seleccionadas entre: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8; SEQ ID 15 NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31 para la fabricación de adyuvantes vacunales y/o vacunas.
Es otro objeto de la presente invención un método de vacunación que comprende la administración a un individuo, de al menos, una dosis efectiva de una vacuna que comprenda los adyuvantes vacunales de la invención. 20
En una realización preferida, el método de vacunación de la invención se caracteriza porque comprende además la administración a un individuo, de al menos, una segunda dosis efectiva de una vacuna que comprenda, al menos, una flagelina de Salmonella typhimurium como adyuvante vacunal, antes o después de la administración de la dosis cualquiera de las vacunas según se han descrito en la presente invención.
La dosis efectiva, es aquella dosis mínima capaz de producir el efecto deseado. En el caso de la presente invención se 25 entiende por dosis efectiva aquella dosis mínima capaz de inducir una respuesta inmunológica específica en los individuos a los que se les administra una vacuna. Se pueden administrar diferentes dosis de cada una de las vacunas, hasta conseguir la inmunidad en el individuo.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS SEGÚN EL TRATADO DE BUDAPEST 30
Las cepas de Escherichia coli DH5 portadoras de los plásmidos utilizados en la presente invención fueron depositados en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia, España) el día 26 de Noviembre del año 2009 con nº de depósito:
CECT 7633: pFastBac-FR4DUD-HisKdel; contiene la secuencia génica que codifica para la flagelina recombinante FR de Marinobacter, unida a 4 copias en tándem del epítopo DUD. 35
CECT 7634: pFastBac-F4DUD-HisKdel; contiene la secuencia génica que codifica para la flagelina recombinante F de Marinobacter, unida a 4 copias en tándem del epítopo DUD.
CECT 7635: pFastBac-F-HisKdel; contiene la secuencia génica que codifica para la flagelina recombinante F de Marinobacter.
CECT 7636: pFastBac-FR-HisKdel; contiene la secuencia génica que codifica para la flagelina 40 recombinante FR de Marinobacter.
Todas ellas comprenden además la secuencia génica que codifica para una cola de histidinas y para el péptido KDEL.
Los ejemplos que se detallan a continuación tienen como objetivo ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.
Ejemplo 1. Obtención y purificación de las secuencias recombinantes de las flagelinas. 45
En la presente invención se estudian la funcionalidad y la capacidad adyuvante-vacunal de las flagelinas F y FR de Marinobacter algicola (cepa DG893T). Con el fin de comparar la actividad y función de las flagelinas de Marinobacter, también se ha obtenido y utilizado la flagelina STF de Salmonella typhimurium.
Los genes F y FR de las flagelinas de Marinobacter algicola se sintetizaron químicamente (MrGene, Alemania) a partir de las secuencias primarias de DNA de ambas flagelinas SEQ ID NO:19 y SEQ ID NO:21 respectivamente. 50 Posteriormente a dichas secuencias se les añadió una secuencia que codifica para una cola de histidinas (para facilitar la purificación de la proteína recombinante obtenida) y una secuencia que codifica para el péptido KDEL (evita la degradación de la proteína recombinante obtenida). Por otro lado, a partir del DNA de Salmonella typhimurium (GenBank: AY649721) se obtuvo el gen de la flagelina mediante la amplificación por reacción en cadena de la
polimerasa con cebadores específicos, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12. Las condiciones de PCR fueron: 5 min a 96 ºC; 30 ciclos de 20 seg a 96 ºC, 30 seg a 60 ºC, 1 min y 45 seg a 72 ºC; y un ciclo final de 10 min a 72 ºC.
Como se ha comentado anteriormente, en todas las secuencias génicas de las flagelinas se han incluido en su extremos 3’ (aunque puede incluirse también en el extremo 5´), una secuencia que codifica para una cola de histidinas, utilizada posteriormente para la purificación de dichas proteínas tras su expresión y una región que codifica para el péptido 5 “KDEL” que sirve para la retención de proteínas en retículo endoplásmico, quedando así menos expuesta la proteína recombinante a su degradación, e incrementándose así la obtención de de la proteína expresada. Además, todas las secuencias génicas de DNA de las flagelinas utilizadas, incluían dianas de restricción (Bam HI y Xba I) para posteriormente ser clonadas en el plásmido pFastbac. Para la transformación y crecimiento de los diferentes plásmidos portadores de las secuencias de las flagelinas de la invención, se ha usado la cepa Escherichia coli DH5. Dichas 10 cepas fueron depositadas en la Colección Española de Cultivos tipo con número de depósito CECT 7633 (pFastBac-FR4DUD-HisKdel), CECT 7634 (pFastBac-F4DUD-HisKdel), CECT 7635 (pFastBac-F-HisKdel) y CECT 7636 (pFastBac-FR-HisKdel).
Las proteínas recombinantes de las flagelinas se obtuvieron mediante dos mecanismos diferentes, por un lado, utilizando baculovirus recombinantes mediante el uso del sistema comercial “Bac-to-Bac® Baculovirus system” 15 (Invitrogen, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante y posteriormente transfectando células de insecto (utilizadas como biobactoría) con dichos baculovirus recombinantes, para obtener las flagelinas recombinantes. El otro mecanismo de obtención de las flagelinas recombinantes fue mediante la obtención de un plásmido recombinante específico para la transformación de bacterias BL21(DE3)pLysS siguiendo las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, Reino Unido). Posteriormente la expresión de las proteínas recombianates de las flagelinas en dichas bacterias se indujo mediante la 20 adición al medio de cultivo bacteriano de IPTG (isopropil-b-D-tiogalactósido, es un inductor artificial del gen lacZ, determinante de la -galactosidasa).
Para la obtención de las flagelinas recombinantes a partir de los baculovirus recombinantes generados, estos se crecieron hasta alcanzar un título de 108 pfu/mL. Posteriormente, con dichos baculovirus recombinantes se transfectaron durante 72 horas, células de insecto Sf21 y Sf9 de la especie Spodoptera frugiperda, que crecen en monocapa y 25 suspensión, respectivamente. Transcurrido este tiempo se procedió a purificar las flagelinas recombinantes mediante cromatografía de afinidad gracias a la cola de histidinas (Clontech-Takara Bio Europe, Francia; Amocol, Alemania) que llevan incorporada todas las flagelinas expresadas.
Para la obtención de las flagelinas recombinantes mediante la transformación de bacterias, se procedió de la siguiente manera. A partir de los plásmidos con las secuencias de las flagelinas de la invención, y mediante digestión con las 30 enzimas de restricción Bam HI y Hind III, se aisló el fragmento de interés que contiene la flagelina de fusión junto con la cola de histidinas y la secuencia KDEL, y se clonó mediante procedimientos estándar (rapid DNA ligation kit, Roche, España) en el vector pRSET-A (Invitrogen, Reino Unido), para dar lugar al plásmido recombinante pRSETA unido a la secuencia de la flagelina de interés. Con el plásmido recombinante pRSETA se transformaron bacterias BL21(DE3)pLysS siguiendo las recomendaciones del fabricante (Invitrogen, Reino Unido). La expresión de la proteína 35 en estas bacterias transformadas se indujo tras añadir IPTG a una concentración final de 1mM. La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad como se ha explicado previamente.
Ejemplo 2. Estudio in vitro de la actividad de las flagelina F y FR de Marinobacter.
Para analizar la actividad in vitro de las flagelinas recombinantes F y FR de Marinobacter obtenidas mediante el método 40 comercial “Bac-to-Bac® Baculovirus system” (Invitrogen, USA), se utilizaron células humanas de carcinoma de colon CACO-2 que expresan el receptor TLR5 de forma constitutiva. Cuando TLR5 se activa en estas células induce la activación de MyD88 para finalmente secretar IL8 al medio extracelular [8-10].
Se cultivaron células CACO-2 (0.5 ml) en una placa de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca) con una confluencia del 80% y una concentración de 5x105 células/pocillo. Posteriormente se añadió al medio de cultivo las proteínas recombinantes 45 de las flagelinas STF (Salmonella typhimurium) utilizadas como control positivo, F y FR (Marinobacter algicola) a una concentración final de 1 ug/mL, y se incubaron durante 18 horas a 37º C en atmósfera al 5% de CO2. Como controles negativos se utilizaron muestras a las que no se les añadió nada (MOCK) y otras a las que se les añadió PBS. Transcurrido dicho tiempo, se recogieron los sobrenadantes y 100 uL de los mismos se usaron en la determinación de los niveles secretados de la citocina IL-8 mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (eBioscience, Ltd, 50 Reino Unido). La densidad óptica se midió a 490 nm tras detener la reacción de revelado.
Los niveles de IL-8 secretados por las células CACO-2 cultivadas en presencia de las distintas flagelinas, se muestran en la Figura 1. Las flagelinas F y FR de Marinobacter inducen la secreción de IL-8, mediante la activación de TLR5, a unos niveles similares a los que induce la flagelina de Salmonella typhimurium (STF) sola o en fusión con el péptido 4DUD (STF4DUD). Por otro lado, los controles negativos de CACO-2 (PBS y MOCK) muestran una densidad óptica 55 muy baja, lo que indica la validez del ensayo. Los valores representados corresponden a las medias aritméticas de dos ensayos independientes.
Ejemplo 3. Estudio “in vivo” de capacidad vacunal e inmunogenicidad de las flagelinas de fusión de Marinobacter F y FR unidas a 4 copias en tándem del epítopo DUD.
Para analizar in vivo la capacidad vacunal e inmunogenicidad de las flagelinas F y FR de Marinobacter obtenidas mediante el método comercial “Bac-to-Bac® Baculovirus system” (Invitrogen, USA), se han inmunizado por la vía subcutánea (sc), grupos de 5 ratones con 30 ug de las flagelinas de fusión purificadas STF4DUD (Salmonella 5 typhimurium), F4DUD y FR4DUD (Marinobacter algicola). También se ha inmunizado por vía intranasal (in) un grupo de 5 ratones con la proteína F4DUD. Como grupo control se han inoculado 5 ratones con el tetrapéptido DUD (4DUD). Se aplicaron 3 inmunizaciones, sin adyuvantes, a los días 0, 15 y 30 del ensayo, y se obtuvieron muestras de sangre de todos los animales, antes de cada inmunización y 15 días después de la última inmunización, si bien los estudios serológicos de la presencia de anticuerpos se realizaron con los sueros tras la segunda inmunización. 10
De la sangre extraída a cada uno de los grupos de animales que incluyen el ensayo, se aisló el suero y fue analizado mediante ELISA indirecto sobre placas de de plástico Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) tapizadas con 500 ng de proteína purificada p54, la cual contiene el epítopo DUD. La proteína se deja adsorber a 4ºC durante toda la noche. El análisis se realizó usando 100 uL/pocillo, partiendo de una dilución 1/100 de los sueros y diluciones seriadas a la mitad (1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800) con buffer BSA-PBST, compuesto de 2%-BSA 15 (albúmina de suero bovino) en buffer fosfato al 0,1% de Tween 20 (PBST). Las diluciones de los sueros se dejan incubar durante 60 minutos, y posteriormente se lavan los pocillos con 300 uL de PBST. Después, los pocillos se incubaron durante 60 minutos con 100 uL de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG conjugado con HRP (peroxidasa de rábano) a una dilución 1/2000 (Amersham, UK). Después los pocillos se lavaron con buffer PBST. Para el revelado, se añadieron 100 uL/pocillo de ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)) (KPL, EEUU). La reacción 20 de la peroxidasa se deja desarrollar durante 15 minutos a temperatura ambiente, y se mide la densidad óptica a 405 nm en un lector de ELISA (Multiskan EX, Thermo Electron Corp, EEUU).
En la figura 2 se muestra la presencia de anticuerpos IgG anti-DUD presente en los sueros de los distintos grupos de ratones a día 30, usando una dilución 1/100 de dichos sueros. En dicha figura se pone de manifiesto, que las flagelinas de Marinobacter, cuando se inoculan por vía subcutánea, inducen una respuesta inmune humoral frente al epítopo DUD 25 tan potente como lo hace la flagelina STF de Salmonella typhimurium, mientras que el péptido 4DUD por sí solo, no es capaz de inducir anticuerpos. Los datos representados en la figura 2 corresponden a las medias aritméticas de todos los animales dentro de cada grupo. Así, la Tabla 1 muestra los máximos y mínimos de densidad óptica media a 405nm para cada grupo de muestras de suero de ratones. Por otro lado, la respuesta de anticuerpos IgG inducida por F4DUD cuando se inocula por vía intranasal (in) es muy buena, aunque ligeramente inferior (en la media aritmética) a la 30 obtenida por vía subcutánea (sc) (figura 2 y tabla 1).
Tabla 1. Medias aritméticas de los valores máximos y mínimos de anticuerpos IgG anti-DUD presente en los sueros de los ratones inmunizados con las flagelinas de fusión FR4DUD, F4DUD STF4DUD y F4FUDin (intranasal).
- Máximo Mínimo
- FR4DUD
- 2,28 1,63
- F4DUD
- 2,494 2,115
- STF4DUD
- 2,541 2,023
- F4DUDin
- 2,144 1,236
35
Los sueros de los animales inmunizados con las flagelinas de Marinobacter (F4DUD y FR4DUD) y Salmonella typhimurium (STF4DUD) tienen anticuerpos IgG anti-4DUD a un título mayor de 1/12800 (figura 3), ya que los valores de densidad óptica de todos los sueros están por encima del punto de corte definido como 3 veces el valor de densidad óptica del tetrapéptido 4DUD (figura 3). Estos datos nos indican que las flagelinas de fusión (con el epítopo DUD) de Marinobacter, inducen una respuesta inmune muy potente contra dicho epítopo DUD, sin la ayuda de adyuvantes, 40 llegando a alcanzar títulos de anticuerpos mayores de 1/12800. Estos resultados indican que las flagelinas de Marinobacter interaccionan de manera apropiada con TLR5, activando el sistema inmune de forma potente, de manera similar a la flagelina de Salmonella typhimurium, pero sin tener los posibles perjuicios asociados a dichas flagelinas en aquellos individuos que posean una inmunidad previa a Salmonella typhimurium.
45
Ejemplo 4. Estudio “in vivo” de capacidad vacunal de la flagelina de fusión de Marinobacter FR unida a 4 copias en tándem del epítopo M2-2009.
En este ejemplo se ha estudiado la capacidad vacunal e inmunogénica “in vivo” de la flagelina FR de Marinobacter en fusión transcripcional a 4 copias en tándem del péptido M2-2009 (SEQ ID NO:27) en el extremo 3’ (c-terminal) de dicha flagelina FR. La secuencia del péptido M2 corresponde al virus de la gripe de la cepa pandémica A/Castilla-La 50 Mancha/GP13/2009(H1N1) (GenBank: FJ985750), y que en la presente invención se ha denominado 4M2-2009 (SEQ ID NO:27). Esta flagelina FR recombinante se ha obtenido a partir del plásmido pFastbac-FR-4M2-2009 (SEQ ID
NO:29). A partir de este plásmido y mediante digestión con las enzimas de restricción Bam HI y Hind III, se aisló el fragmento de interés que contiene la flagelina de fusión junto con la cola de histidinas y la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 29), y se clonó mediante procedimientos estándar (rapid DNA ligation kit, Roche, España) en el vector pRSET-A (Invitrogen, Reino Unido), para dar lugar a un plásmido recombinante pRSETA-FR4M2-2009 (SEQ ID NO:33). Con este plásmido recombinante se transformaron bacterias BL21(DE3)pLysS siguiendo las recomendaciones del fabricante 5 (Invitrogen, Reino Unido). La expresión de la proteína en estas bacterias transformadas se indujo tras añadir IPTG a una concentración final de 1mM. La purificación se realizó mediante cromatografía de afinidad.
Para evaluar la inmunogenicidad de la flagelina recombinante FR-4M2-2009, se inocularon por la vía subcutánea (sc) 4 ratones con 10 ug de dicha flagelina purificada y como grupo control se inocularon 4 ratones con 10 g del péptido 4M2-2009 en PBS. Se aplicaron 2 inmunizaciones, sin adyuvantes, a los días 0, y 15 del ensayo, y se obtuvieron muestras 10 de sangre de todos los animales, antes de cada inmunización y 15 días después de la última inmunización, si bien los estudios serológicos de la presencia de anticuerpos se realizaron con los sueros tras la segunda inmunización.
De la sangre extraída se aisló el suero y fue analizado mediante ELISA indirecto sobre placas de de plástico Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca) tapizadas con 500 ng de una proteína carrier que contiene las 4 copias del péptido M2-2009. El ELISA se realizó usando 100 L/pocillo, partiendo de una dilución 1/100 de los sueros y diluciones seriadas 15 a la mitad (1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800) con buffer BSA-PBST, y realizando los pasos explicados previamente.
En la figura 4 se muestra el nivel de anticuerpos IgG anti-4M2-2009 presente en los sueros de los 4 ratones estudiados (R1, R2, R3 y R4). Se observa un título elevado de anticuerpos en los ratones inmunizados con FR-4M2-2009 respecto a los ratones control (C1, C2, C3 y C4), indicando que esta flagelina es funcional y apropiada a la hora de generar una 20 respuesta inmune contra el epítopo 4M2-2009.
Ejemplo 5. Reactividad cruzada entre las flagelinas F y FR de Marinobacter y la flagelina STF de Salmonella.
Para el estudio de la reactividad cruzada que pueda existir entre las flagelinas de Marinobacter (F y FR) y la flagelina de Salmonella thyphimurium (STF) (obtenidas mediante el método comercial “Bac-to-Bac® Baculovirus system” (Invitrogen, 25 USA)), se estudiaron todos los sueros de cada grupo de animales inmunizados con las distintas versiones de flagelinas-4DUD. El estudio se realiza después de una pauta estándar de inmunización como se describe en el Ejemplo 2.
5.1. Reactividad cruzada frente la flagelina STF de Salmonella.
Para analizar la reactividad cruzada existente entre la flagelina STF y los anticuerpos anti-flagelinas F de Marinobacter y STF de Salmonella, como control positivo, se tapizaron placas de cultivo de 96 pocillos, antes mencionadas, con 500 ng 30 de proteína STF purificada previamente mediante cromatografía de afinidad basada en la presencia de la cola de histidinas, como se ha explicado anteriormente. La proteína STF purificada se deja adsorber sobre la placa de cultivo a 4ºC durante toda la noche. Para el análisis se estudiaron los sueros de ratones inmunizados con la flagelina STF4DUD (grupo de sueros A), como control positivo, y los sueros de ratones que contenían anticuerpos contra la flagelina F4DUD (grupo de sueros B) (figura 5). Se siguió el procedimiento de ELISA indirecto descrito anteriormente partiendo de los 35 sueros a una dilución 1/100 y haciendo diluciones seriadas a la mitad con el buffer BSA-PBST hasta alcanzar la dilución 1/12800. El resultado (figura 5) muestra que los sueros de animales inmunizados con STF4DUD (grupo de sueros A) contienen gran cantidad de anticuerpos anti-STF que se unen a la proteína purificada STF presente en la placa de cultivo, alcanzando un título mayor de 1/12800. Por su parte, los sueros de ratones inmunizados con F4DUD (grupo de sueros B) presentan una reactividad muy baja frente a la flagelina STF, con excepción del suero B5 que es único que sí 40 presenta reactividad, aunque con niveles de anticuerpos 32 veces menos que los controles positivos (grupo de sueros A). Los títulos de anticuerpos IgG contra la flagelina F (grupo de sueros B) se muestran en la figura 6, donde se aprecia que el suero B5 tiene más título de anticuerpos que el resto de sueros de ese grupo. Sin embargo, la respuesta inducida frente a DUD en cada uno de los ratones de ese grupo fue muy buena (representado en la figura 2). Por tanto, puede haber muy buena inmunidad frente al epítopo que lleva en fusión la flagelina, pero una inmunidad heterogénea frente a 45 la flagelina vacunal.
Estos resultados indican que puede no haber reacción cruzada entre los anticuerpos generados contra la flagelina F de Marinobacter y la flagelina STF de Salmonella typhimurium, pero que, si existe, es 32 veces menor respecto de un suero muy positivo (mayor de 1/12800).
También se ha ensayado la reacción cruzada entre la flagelina STF de Salmonella y los anticuerpos anti-FR (grupo de 50 sueros C) (figura 7), mostrando un comportamiento similar al observado para los anticuerpos anti-F. Sólo uno de los cinco sueros del grupo de ratones inmunizados con la flagelina FR4DUD (grupo de sueros C) presenta más reactividad cruzada frente STF (suero C3), aunque esta reactividad se puede cuantificar en 32 veces menos que los controles positivos a STF. El suero C3 presenta más título de anticuerpos anti-FR (3200>IgG>6400) que el resto de sueros de su grupo (figura 8). Se puede decir que aquellos sueros más positivos de animales inmunizados con la flagelina FR de 55 Marinobacter reconocerían en menor medida la flagelina de Salmonella typhimurium.
5.2. Reactividad cruzada frente a flagelina F de Marinobacter.
Para analizar la reactividad cruzada existente entre la flagelina F y los anticuerpos anti-flagelinas STF de Salmonella typhimurium y F de Marinobacter, como control positivo, se realizó el mismo protocolo experimental detallado
anteriormente, tapizándose la placa de cultivo con 500 ng de la flagelina F purificada mediante cromatografía de afinidad. Se analizaron los sueros de ratones que contienen anticuerpos contra la flagelina STF4DUD (grupo de sueros A) y los sueros de ratones que contienen anticuerpos contra la flagelina F4DUD (grupo de sueros B), que servirán como control positivo. El resultado (figura 6) muestra que los sueros de animales inmunizados con F4DUD (grupo de sueros B) reaccionan positivamente al reconocimiento de la flagelina F, y se aprecia que la positividad va disminuyendo con la 5 dilución de los sueros. Por otra parte, los sueros de ratones inmunizados con STF4DUD (grupo de sueros A) presentan una reacción cruzada escasa con la flagelina F de Marinobacter, siendo muy débilmente positivos a una dilución 1/100, y teniendo entre 16 y 32 veces menos reactividad que los sueros con anticuerpos anti-flagelina F, que actúan como control positivo. Estos sueros anti-STF que dan esta escasa reactividad son, sin embargo, muy positivos para el reconocimiento de STF (figuras 3 y 5) con títulos IgG anti-STF mayores de 1/12800, y que posiblemente alcancen 10 1/25600 (figura 5).
5.3. Reactividad cruzada frente a flagelina FR de Marinobacter.
Para analizar la reactividad cruzada existente entre la flagelina FR y los anticuerpos anti-flagelinas STF de Salmonella typhimurium y FR de Marinobacter, como control positivo, se realizó el mismo protocolo experimental detallado anteriormente, tapizándose la placa de cultivo con 500 ng de la flagelina FR purificada mediante cromatografía de 15 afinidad. Se estudiaron los sueros de ratones que contienen anticuerpos contra la flagelina FR4DUD (grupo de sueros C) y los sueros de ratones que contienen anticuerpos contra la flagelina STF4DUD (grupo de sueros A). El resultado (figura 8) muestra que los sueros de animales inmunizados con FR4DUD (grupo de sueros C) reaccionan positivamente al reconocimiento de la flagelina FR, y se aprecia que la positividad va disminuyendo con la dilución de los sueros. Por otra parte, los antisueros que reconocen la flagelina STF (grupo de sueros A) (tras la inmunización con STF4DUD), no 20 reconocen prácticamente la flagelina FR, suponiendo entre 64 y 128 veces menos reconocimiento que los sueros positivos con anticuerpos anti-STF, los cuales son muy positivos para la detección de STF (figuras. 3 y 5) con títulos IgG anti-STF mayores de 1/12800, y que posiblemente alcancen 1/25600 (figura 5).
5.4. Reactividad cruzada frente a flagelina F de los sueros anti-flagelinas F y FR de Marinobacter.
Para analizar la reactividad cruzada existente entre ambas flagelinas de Marinobacter, se realizó un ELISA utilizando 25 sueros de ratones que contienen anticuerpos anti-flagelinas de Marinobacter FR y F, estos últimos como controles positivos. Se tapizaron placas de cultivo de 96 pocillos con 500 ng de la flagelina F purificada mediante cromatografía de afinidad. Se analizaron sueros de ratón que contiene anticuerpos contra la flagelina FR4DUD y sueros de ratón que contienen anticuerpos contra la flagelina F4DUD (control positivo). El resultado (figura 9) muestra que el suero anti-FR (barras enladrilladas) tiene una densidad óptica de 0,838, un poco menor que la obtenida por el control positivo (barras 30 negras) con una densidad óptica de 1,14, siendo estos valores los correspondientes a la dilución 1/100 del suero. El otro suero analizado con anticuerpos anti-F4DUD (barras con líneas negras oblicuas) presenta un valor a dilución 1/100 de densidad óptica de 0.329, lo que indica que no se ha comportado como un buen control positivo, porque aun siendo positivo tiene menos anticuerpos que su homólogo (barras negras, densidad óptica de 1,14).
En resumen, estos resultados indican la flagelina F de Marinobacter tiene una reactividad cruzada algo menor, pero 35 considerable, frente a los anticuerpos anti-flagelina FR que respecto a los anticuerpos anti-flagelina F. Esto se puede explicar por la homología de secuencia de aminoácidos entre ambas flagelinas F y FR de Marinobacter.
En la presente invención, se han obtenido resultados sobre el reconocimiento muy escaso de la flagelina de Salmonella typhimurium (STF) por parte de sueros anti-flagelina F de Marinobacter (figura 6) y, en especial, el prácticamente nulo reconocimiento de STF por parte de anticuerpos anti-FR de Marinobacter. Estos hechos se podrían explicar por las 40 diferencias de homología de secuencias aminoacídicas entre proteínas. La flagelina de Salmonella debe poseer determinantes antigénicos inmunodominantes contra los que se producen anticuerpos, y estos determinantes, o no están presentes en las flagelinas F y FR, o algún cambio de secuencia de aminoácidos no les permite ser reconocidos. Es importante indicar que en la pauta de inmunización contra STF4DUD no han aparecido anticuerpos frente a regiones de interacción con TLR5, puesto que si estos existieran darían positivo en la reactividad frente a sueros anti-F y anti-FR. 45
La existencia de anticuerpos anti-flagelina de Salmonella typhimurium por infecciones previas o por el uso vacunal previo de la flagelina de Salmonella, puede inhibir de forma progresiva hasta la anulación total la funcionalidad de vacunas basadas en la flagelina de Salmonella typhimurium. En este sentido, la presente invención nos permite concretar la administración de las flagelinas F y FR (preferentemente) vacunales de Marinobacter a individuos con gran cantidad de anticuerpos anti-flagelina de Salmonella con seguridad de que las flagelinas vacunales de Marinobacter no 50 van a ser reconocidas por los anticuerpos preformados contra la flagelina de Salmonella typhimurium, generados tras un procedimiento de inmunización con elevadas dosis de flagelina de Salmonella typhimurium como el descrito.
Así, individuos de cualquier especie expuestos a Salmonella typhimurium, o vacunados con la flagelina de Salmonella typhimurium, que presenten cierto título de anticuerpos preformados contra ésta flagelina de Salmonella, se podrían vacunar con las flagelinas de Marinobacter (F o FR), en pautas de inmunización estándar, con la seguridad de que estas 55 flagelinas vacunales de Marinobacter no van a ser reconocidas por los anticuerpos preformados anti-flagelina de Salmonella typhimurium. Por otro lado, en aquellos individuos no expuestos a Salmonella typhimurium previamente, se podría usar otra estrategia vacunal administrando inicialmente cualquiera de las dos flagelinas de Marinobacter (F o FR) y posteriormente administrar otra vacuna basada en la flagelina de Salmonella, o viceversa, es decir, administrar la flagelina vacunal de Salmonella y posteriormente la flagelina vacunal de Marinobacter. Así, se potenciaría el uso de 60 estas vacunas para múltiples antígenos sin restar eficacia por seroneutralización cruzada entre flagelinas. Estos
resultados, por tanto, permiten establecer nuevas estrategias de administración de múltiples vacunas basadas en flagelinas, aplicando únicamente las vacunas de flagelinas de Marinobacter, o en conjunción con vacunas de flagelina de Salmonella.
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Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Adyuvante vacunal que comprende al menos una flagelina del género Marinobacter, preferentemente de la especie Marinobacter algicola.
- 2. Adyuvante vacunal la reivindicación 1, en que la al menos una flagelina se fusiona a al menos a un epítopo capaz de 5 generar respuesta inmunológica, preferentemente en forma de 4 copias en tándem del mismo.
- 3. Adyuvante vacunal según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:31, o una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID 10 NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:30.
- 4. Vacuna que comprende al menos un adyuvante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
- 5. Vacuna que comprende al menos un adyuvante vacunal según la reivindicación 1 y al menos un epítopo capaz de generar respuesta inmune, no fusionado a dicho adyuvante.
- 6. Método de síntesis de adyuvantes vacunales caracterizados por comprender al menos una flagelina bacteriana del 15 género Marinobacter caracterizado por:a) Seleccionar al menos una de las secuencias génicas que codifican para flagelinas del género Marinobacterb) Clonar al menos una de las secuencias génicas del paso anterior en un vector de expresión, en el que el vector de expresión se selecciona preferiblemente entre aquellos comprendidos en las siguientes cepas: CECT 7633, CECT 7634, CECT 7635 y CECT 7636, 20c) Generar bacterias o virus, preferiblemente baculovirus, modificados mediante la inserción de vector del paso anterior.d) Crecer las bacterias o virus modificados del paso anterior en condiciones adecuadas para favorecer la expresión de al menos una de las secuencias que codifican para flagelinas del género Marinobacter incluidas en el vector, y 25e) Aislar al menos una de lasflagelinas del género Marinobacter expresadas por las bacterias o virus que portan el vector de expresión del paso anterior.
- 7. Método según la reivindicación 6 caracterizado por que las secuencias génicas que codifican para las flagelinas del género Marinobacter se seleccionan preferentemente entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28 y SEQ ID NO:30. 30
- 8. Método según la reivindicación 6 caracterizado por que las secuencias génicas que codifican para las flagelinas del género Marinobacter comprenden adicionalmente una secuencia génica que codifica para al menos un epítopo capaz de generar respuesta inmunológica específica, preferentemente en forma de 4 copias en tándem del mismo.
- 9. Método según las reivindicaciones 6 a 8 caracterizado por que las secuencias génicas de las flagelinas del género Marinobacter comprenden adicionalmente una secuencia génica que codifica para un péptido capaz de facilitar el 35 aislamiento o purificación de la flagelina, preferentemente una secuencia que codifica para una cola de histidinas.
- 10. Método según la reivindicación 9 caracterizado por que las secuencias génicas de las flagelinas del género Marinobacter comprenden adicionalmente una secuencia génica que codifica para un péptido capaz de evitar la degradación de la flagelina, preferentemente una secuencia génica que codifica para el péptido KDEL.
- 11. Método de acuerdo con las reivindicaciones 6-10 caracterizado por que los virus modificados son utilizados 40 preferentemente para transfectar células de mamífero o, más preferentemente, células de insecto.
- 12. Uso de cualquiera de las secuencias seleccionadas entre: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23. SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30 y SEQ ID NO:31, para la fabricación de adyuvantes vacunales y/o vacunas. 45
- 13. Vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5 para su uso en un método de vacunación.
- 14. Vacuna para uso en vacunación de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la vacuna de las reivindicaciones 4 o 5 es administrada antes o después de la administración de al menos una dosis efectiva de una vacuna que comprende, al menos, una flagelina de Salmonella.50
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