ES2568938T3 - Composiciones y procedimientos de tratamiento de trastornos que implican apoptosis de células epiteliales - Google Patents

Abstract

Un péptido de Lactobacillus que comprende un fragmento de p40, en el que el fragmento comprende la SEQ ID NO: 6, y en el que el péptido contiene no más de 100 aminoácidos de la molécula p40 definida por la SEQ ID NO: 2.

Description

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I. Proteínas solubles probióticas

Como se analiza a continuación, los inventores han purificado y caracterizado dos proteínas solubles de Lactobacillus que se denominan p75 y p40. Las secuencias N-terminales y secuencias peptídicas internas de estas proteínas se determinaron, como se describe a continuación. Se diseñaron múltiples cebadores oligonucleotídicos basados en las secuencias de los correspondientes genes de L. casei 334 y secuencias de ADN flanqueantes en el genoma de L. casei (números de acceso a NCBI GeneBank COG0791 y COG3883), y estos cebadores se usaron para amplificar por PCR secuencias relacionadas del ADN genómico de LGG.

El análisis de secuencia de un conjunto de productos de PCR clonados reveló la presencia de una ORF de 1236 pb, que codifica de forma predicha una proteína de 412 aminoácidos con una masa molecular calculada de 42 kDa (FIG. 1D). La secuencia deducida de longitud completa de aminoácidos de p40 (SEQ ID NO: 2) era un 79 % idéntica a la secuencia de una proteína de 396 aminoácidos de función desconocida de L. casei 334 (NCBI GeneBank COG3883).

El análisis de secuencia de otro conjunto de productos de PCR clonados reveló la presencia de una ORF parcial que era >1488 pb de longitud; la ORF de longitud completa no se amplificó satisfactoriamente. La secuencia deducida de aminoácidos de p75 estaba muy estrechamente relacionada con una hidrolasa asociada a pared celular de 493 aminoácidos de L. casei 334 (NCBI GeneBank COG0791), y mostraba una identidad del 70 % y del 93 % con dos regiones diferentes de esta proteína de L. casei 334. La masa molecular predicha de la hidrolasa asociada a pared celular de longitud completa de L. casei 334 (49 kDa) difiere sustancialmente de la masa molecular de la proteína p75 de LGG.

Un análisis de las secuencias génicas de p40 y p75 de LGG y las secuencias de aminoácidos N-terminales determinadas de forma experimental de las proteínas codificadas indica que ambos genes codifican proteínas con secuencias señal N-terminales. La presencia de secuencias señal es coherente con la hipótesis de que p40 y p75 se secretan de forma activa al sobrenadante de cultivo por LGG. La secuencia génica de p40 y la secuencia génica parcial de p75 no muestran relación significativa, y las secuencias de aminoácidos N-terminales determinadas de forma experimental de estas dos proteínas no están relacionadas. Por tanto, en base a los datos de secuencia disponibles, no existen evidencias que sugieran que p40 es un producto de degradación de p75. Sin embargo, es posible que pudiera haber similitud de secuencia entre p40 y la parte C-terminal no caracterizada de p75.

A. Péptidos p40

La presente invención depende en parte de la observación de los inventores de fragmentos de la molécula p40 -los primeros 60 aminoácidos de la secuencia de p40 de longitud completa normal (SEQ ID NO:4), un fragmento que carece del líder, encontrado en los restos 29-60 de la SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:6). Los 28 restos NH2-terminales de esta molécula, que comprenden una secuencia líder putativa, se cree que no son necesarios para la función.

Por tanto, los péptidos de la presente invención pueden comprender no más de 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 restos de la SEQ ID NO: 2, pero incluyendo al menos la SEQ ID NO:6, y opcionalmente incluyendo al menos la SEQ ID NO:4. Los péptidos pueden incluir opcionalmente otros segmentos no de p40.

Adicionalmente, péptidos con homología significativa a los péptidos de la presente invención muy probablemente ejercen efectos similares. Por lo tanto, se desvelan en el presente documento péptidos aislados de forma natural, recombinantes, o sintéticos con >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % de similitud de secuencia con los péptidos de Lactobacillus.

Los segmentos p40 pueden estar unidos adicionalmente a otros segmentos peptídicos que confieren propiedades adicionales, tales como estabilización, direccionamiento celular. Además, los péptidos pueden comprender aminoácidos no naturales incluyendo D-aminoácidos y uno o más de los aminoácidos no naturales, analizados adicionalmente a continuación.

B. Purificación o enriquecimiento de proteínas y péptidos

En líneas generales, "purificado" se referirá a una composición de proteína específica que se ha sometido a fraccionamiento para retirar componentes no proteicos y otras diversas proteínas, polipéptidos, o péptidos, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad, que puede evaluarse, por ejemplo, por ensayos de proteínas, como se describe en el presente documento a continuación, o como sería conocido para un experto en la materia para la proteína, polipéptido o péptido deseado.

Cuando se usa la expresión "sustancialmente purificado", esta se referirá a una composición en que la proteína, polipéptido o péptido específico forma el componente principal de la composición, tal como constituyendo aproximadamente el 50 % de las proteínas en la composición o más. En realizaciones preferidas, una proteína sustancialmente purificada constituirá más del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o incluso más de las proteínas en la composición.

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Se cultivó Lactobacillus rhamnosus cepa GG (LGG) del siguiente modo. Se incubó LGG en caldo MRS de Lactobacillus a 37 ºC durante 24 horas, después se diluyó en caldo MRS y se incubó a 37 ºC hasta alcanzar fase log con densidad determinada por DO 0,5 a A600. Se precipitó LGG del caldo MRS (1000 x g, 15 min) y se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para tratar las células o preparar medio de cultivo celular condicionado por LGG.

Loa péptidos de la presente invención pueden sintetizarse en solución o en un soporte sólido de acuerdo con técnicas convencionales. Están disponibles en el mercado diversos sintetizadores automáticos y pueden usarse de acuerdo con protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, (1984); Tam y col., (1983); Merrifield, (1986); y Barany y Merrifield (1979), Houghten y col., (1985). En algunas realizaciones, se contempla la síntesis de péptidos usando máquinas automatizadas de síntesis de péptidos, tales como las disponibles en Applied Biosystems (Foster City, CA). Los péptidos de la presente invención pueden aislarse, y dializarse exhaustivamente para retirar moléculas indeseadas de pequeño peso molecular y/o liofilizarse para una formulación más fácil en un vehículo deseado.

En ciertas realizaciones, los péptidos p40 pueden expresarse de forma recombinante en células huésped heterólogas y posteriormente purificarse (por ejemplo, usando centrifugación y/o cromatografía). Como se analiza a continuación, se contempla una diversidad de composiciones y procedimientos para su uso en la producción recombinante de estas proteínas.

1. Vectores

El término "vector" se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico vehículo en la cual puede insertarse una secuencia de ácido nucleico para la introducción en una célula donde puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", que significa que es foránea a la célula en que tiene que introducirse el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia en la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en que no se encuentra habitualmente la secuencia. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus de animales, y virus de plantas), y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC). Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector a través de técnicas recombinantes convencionales (véase, por ejemplo, Maniatis y col., 1989 y Ausubel y col., 1994, ambos incorporados en el presente documento por referencia).

El término "vector de expresión" se refiere a cualquier tipo de construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un ARN capaz de transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN después se traducen en una proteína, polipéptido, o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una diversidad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida de forma funcional en una célula huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y traducción, los vectores y vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen otras funciones también y se describen infra.

Los ácidos nucleicos que codifican péptidos p40 se exponen en las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 9. Las secuencias pueden modificarse, dada la capacidad de varios codones diferentes de codificar un único aminoácido, codificando al mismo tiempo la misma proteína o polipéptido. También puede emprenderse optimización de selección de codones a la luz del organismo particular usado para expresión recombinante.

a. Promotores y potenciadores

Un "promotor" es una secuencia de control que es una región de una secuencia de ácido nucleico en que está controlado el inicio y tasa de transcripción. Puede contener elementos genéticos en que pueden unirse proteínas reguladoras y moléculas, tales como ARN polimerasa y otros factores de transcripción, para iniciar la transcripción específica de una secuencia de ácido nucleico. Las expresiones "posicionado de forma funcional", "unido de forma funcional", "bajo el control", y "bajo el control transcripcional" significan que un promotor está en una localización y/u orientación funcional correcta en relación a una secuencia de ácido nucleico para controlar el inicio de la transcripción y/o expresión de esa secuencia.

Un promotor generalmente comprende una secuencia que funciona posicionando el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El mejor ejemplo conocido de esto es la caja TATA, pero en algunos promotores que carecen de una caja TATA, tales como, por ejemplo, el promotor para el gen de la desoxinucleotidiltransferasa terminal de mamífero y el promotor para los genes tardíos de SV40, un elemento concreto superpuesto al propio sitio de inicio ayuda a fijar el sitio de inicio. Elementos promotores adicionales regulan la frecuencia del inicio de la transcripción. Típicamente, estos se localizan en la región 30-110 pb cadena arriba del sitio de inicio, aunque varios promotores han demostrado contener elementos funcionales cadena abajo del sitio de inicio también. Para llevar una secuencia codificante "bajo el control de" un promotor, se posiciona el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción de la fase de lectura transcripcional "cadena abajo" de (es decir, 3' de) el promotor elegido. El promotor "cadena arriba" estimula la transcripción del ADN y promueve la expresión del ARN codificado.

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El espaciado entre los elementos promotores frecuentemente es flexible, de modo que se conserva la función del promotor cuando los elementos se invierten o mueven respecto unos de otros. En el promotor tk, el espaciado entre los elementos promotores puede aumentarse hasta 50 pb separados antes de que la actividad empiece a disminuir. Dependiendo del promotor, parece que elementos individuales pueden funcionar de forma cooperativa o independiente para activar la transcripción. Un promotor puede usarse o no junto con un "potenciador", que se refiere a una secuencia reguladora de acción en cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

Un promotor puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, que puede obtenerse aislando las secuencias no codificantes 5' localizadas cadena arriba del segmento codificante y/o exón. Dicho promotor puede mencionarse como "endógeno" o "homólogo". Asimismo, un potenciador puede ser uno asociado de forma natural con una secuencia de ácido nucleico, localizado cadena abajo o cadena arriba de esa secuencia. Como alternativa, se obtendrán ciertas ventajas posicionando el segmento de ácido nucleico codificante bajo el control de un promotor recombinante, exógeno o heterólogo, que se refiere a un promotor que no está asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Un potenciador recombinante o heterólogo también se refiere a un potenciador no asociado normalmente con una secuencia de ácido nucleico en su entorno natural. Dichos promotores o potenciadores pueden incluir promotores o potenciadores de otros genes, y promotores

o potenciadores aislados de cualquier otro virus, o célula procariota o eucariota, y promotores o potenciadores no "de origen natural", es decir, que contienen diferentes elementos de diferentes regiones reguladoras de la transcripción, y/o mutaciones que alteran la expresión. Por ejemplo, promotores que se usan muy habitualmente en construcción de ADN recombinante procariota incluyen los sistemas promotores de β-lactamasa (penicilinasa), lactosa y triptófano (trp).

Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija de forma eficaz la expresión del segmento de ADN en el orgánulo, célula, tejido, órgano, u organismo elegido para la expresión. Los expertos en la materia de biología molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores, y combinaciones de tipo celular para la expresión de proteínas, (véase, por ejemplo, Sambrook y col. 1989, incorporado en el presente documento por referencia). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles, y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir una expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor poder ser heterólogo o endógeno.

Adicionalmente, también podría usarse cualquier combinación de promotor/potenciador (según, por ejemplo, la base de datos de promotores eucariotas EPDB, en el sitio web epd.isb-sib.ch/) para dirigir la expresión. El uso de un sistema de expresión citoplasmático T3, T7 o SP6 es otra realización posible. Las células eucariotas puede soportar la transcripción citoplasmática a partir de ciertos promotores bacterianos si se proporciona la polimerasa bacteriana apropiada, como parte del complejo de suministro o como una construcción adicional de expresión genética.

b. Señales de inicio

También puede requerirse una señal específica de inicio para la traducción eficaz de secuencias codificantes. Estas señales incluyen un codón de inicio ATG o secuencias adyacentes. Puede necesitarse proporcionar señales exógenas de control de la traducción, incluyendo el codón de inicio ATG. Un experto en la materia será fácilmente capaz de determinar esto y de proporcionar las señales necesarias. Es bien sabido que el codón de inicio debe estar "en fase" con la fase de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción del inserto completo. Las señales exógenas de control de la traducción y codines de inicio pueden ser naturales o sintéticas. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción apropiados.

c. Sitios de clonación múltiple

Los vectores pueden incluir un sitio de clonación múltiple (MCS), que es una región de ácido nucleico que contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, cualquiera de las cuales puede usarse junto con tecnología recombinante convencional para digerir el vector (véase, por ejemplo, Carbonelli y col., 1999, Levenson y col., 1998, y Cocea, 1997, incorporados en el presente documento por referencia). "Digestión con enzima de restricción" se refiere a escisión catalítica de una molécula de ácido nucleico con una enzima que funciona solamente en localizaciones específicas en una molécula de ácido nucleico. Muchas de estas enzimas de restricción están disponibles en el mercado. El uso de dichas enzimas es ampliamente comprendido por los expertos en la materia. Frecuentemente, un vector se linealiza o fragmenta usando una enzima de restricción que corta dentro del MCS para posibilitar que se liguen secuencias exógenas al vector. "Ligamiento" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico, que pueden ser contiguos o no entre sí. Las técnicas que implican enzimas de restricción y reacciones de ligamiento son bien conocidas para los expertos en la materia de tecnología recombinante.

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d. Sitios de corte y empalme

La mayoría de las moléculas de ARN eucariotas transcritas experimentarán corte y empalme de ARN para retirar los intrones de los transcritos primarios. Los vectores que contienen secuencias eucariotas genómicas pueden requerir sitios de corte y empalme donantes y/o aceptores para asegurar el apropiado procesamiento del transcrito para la expresión de la proteína (véase, por ejemplo, Chandler y col., 1997, incorporado en el presente documento por referencia).

e. Señales de terminación

Los vectores o construcciones de la presente invención generalmente comprenderán al menos una señal de terminación. Una "señal de terminación" o "terminador" está compuesta de las secuencia de ADN implicadas en la terminación específica de un transcrito de ARN por una ARN polimerasa. Por tanto, en ciertas realizaciones, se contempla una señal de terminación que finaliza la producción de un transcrito de ARN. Un terminador puede ser necesario in vivo para conseguir niveles deseables de mensaje.

Los terminadores contemplados para su uso en la invención incluyen cualquier terminador conocido de la transcripción descrito en el presente documento o conocido para un experto en la materia, incluyendo, aunque sin limitación, por ejemplo, las secuencias de terminación de genes, tales como por ejemplo, el terminador de la hormona bovina de crecimiento o secuencias víricas de terminación, tales como, por ejemplo, el terminador de SV40. En ciertas realizaciones, la señal de terminación puede ser una ausencia de secuencia transcribible o traducible, tal como debido a un truncamiento de secuencia.

f. Señales de poliadenilación

En expresión, particularmente expresión eucariota, una típicamente incluirá una señal de poliadenilación para realizar la apropiada poliadenilación del transcrito. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la práctica satisfactoria de la invención, y puede emplearse cualquiera de estas secuencias. Las realizaciones preferidas incluyen la señal de poliadenilación de SV40 o la señal de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento, conveniente y conocida por funcionar bien en diversas células dianas. La poliadenilación puede aumentar la estabilidad del transcrito o puede facilitar el transporte citoplasmático.

g. Orígenes de replicación

Para propagar un vector en una célula huésped, puede contener uno o más sitios de origen de replicación (a menudo llamados "ori"), que es una secuencia específica de ácido nucleico en que se inicia la replicación. Como alternativa, puede emplearse una secuencia de replicación autónoma (ARS) si la célula huésped es levadura.

h. Marcadores de selección y detección

En ciertas realizaciones de la invención, las células que contienen una construcción de ácido nucleico de la presente invención pueden identificarse in vitro o in vivo incluyendo un marcador en el vector de expresión. Dichos marcadores conferirían un cambio identificable a la célula permitiendo una fácil identificación de las células que contienen el vector de expresión. En líneas generales, un marcador de selección es uno que confiere una propiedad que permite la selección. Un marcador de selección positiva es uno en que la presencia del marcador permite su selección, mientras que un marcador de selección negativa es uno en que su presencia evita su selección. Un ejemplo de un marcador de selección positiva es un marcador de resistencia a fármaco.

Habitualmente, la inclusión de un marcador de selección de fármaco ayuda en la clonación e identificación de transformantes, por ejemplo, genes que confieren resistencia a neomicina, puromicina, higromicina, DHFR, GPT, zeocina e histidinol son marcadores útiles de selección. Además de marcadores que confieren un fenotipo que permita la discriminación de transformantes en base a la implementación de condiciones, también se contemplan otros tipos de marcadores incluyendo marcadores de detección tales como GFP, cuya base es el análisis colorimétrico. Como alternativa, pueden utilizarse enzimas de detección tales como la timidina quinasa (tk) o cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del virus del herpes simple. Un experto en la materia también conocería el modo de emplear marcadores inmunológicos, posiblemente junto con análisis FACS. No se cree que el marcador usado sea importante, siempre que sea capaz de expresarse simultáneamente con el ácido nucleico que codifica un producto génico. Ejemplos adicionales de marcadores de selección y detección son bien conocidos para los expertos en la materia.

i. Vectores plasmídicos

En ciertas realizaciones, se contempla un vector plasmídico para su uso para transformar una célula huésped. En general, los vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y control que se obtienen de especies compatibles con la célula huésped se usan junto con estos huéspedes. El vector habitualmente porta un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. En un ejemplo no limitante, a menudo se transforma E. coli usando derivados de pBR322, un plásmido derivado de una especie de E. coli. pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y

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genes de virulencia de VIH, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef se delecionan haciendo que el vector sea biológicamente seguro.

Los vectores lentivíricos recombinantes son capaces de infectar células no en división y pueden usarse para transferencia génica tanto in vivo como ex vivo y expresión de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, se describe lentivirus recombinante capaz de infectar una célula no en división donde se transfecta una célula huésped adecuada con dos o más vectores que portan las funciones de empaquetado, concretamente gag, pol y env, así como rev y tat en la patente de Estados Unidos 5.994.136, incorporada en el presente documento por referencia. Uno puede dirigir el virus recombinante por unión de la proteína de envuelta con un anticuerpo o un ligando particular para dirigirlo a un receptor de un tipo celular particular. Insertando una secuencia (incluyendo una región reguladora) de interés en el vector vírico, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor en una célula diana específica, por ejemplo, el vector ahora es específico de diana.

Otros vectores víricos. Pueden emplearse otros vectores víricos como construcciones de vacuna en la presente invención. Pueden emplearse vectores derivados de virus tales como virus vaccinia (Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988), virus sindbis, citomegalovirus y virus del herpes simple. Ofrecen varias características atractivas para diversas células de mamífero (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal y Sugden, 1986; Coupar y col., 1988; Horwich y col., 1990).

Virus modificados. Un ácido nucleico a suministrarse puede alojarse dentro de un virus infeccioso que se ha modificado por ingeniería para que exprese un ligando específico de unión. La partícula vírica por tanto se unirá específicamente a los receptores afines de la célula diana y suministrará los contenidos a la célula. Un nuevo enfoque diseñado para permitir el direccionamiento específico de vectores retrovíricos se desarrolló en base a la modificación química de un retrovirus por la adición química de restos de lactosa a la envuelta vírica. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos mediante receptores de sialoglucoproteína.

Se diseñó otro enfoque para dirigir retrovirus recombinantes en que se usaban anticuerpos biotinilados contra una proteína de envuelta retrovírica y contra un receptor celular específico. Los anticuerpos se acoplaron mediante los componentes de biotina usando estreptavidina (Roux y col., 1989). Usando anticuerpos contra antígenos del complejo principal de histocompatibilidad clase I y clase II, demostraron la infección de una diversidad de células humanas que albergan esos antígenos superficiales con un virus ectópico in vitro (Roux y col., 1989).

2. Suministro del vector y transformación de células

Se cree que los procedimientos adecuados para suministro de ácido nucleico para transformación de un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo para su uso con la presente invención incluyen casi cualquier procedimiento por el cual pueda introducirse un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo, como se describe en el presente documento o como conocería un experto en la materia. Dichos procedimientos incluyen, aunque sin limitación, suministro directo de ADN tal como por transfección ex vivo (Wilson y col., 1989, Nabel y col, 1989), por inyección (patentes de Estados Unidos 5.994.624, 5.981.274, 5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 y 5.580.859, cada una incorporada en el presente documento por referencia), incluyendo microinyección (Harland y Weintraub, 1985; patente de Estados Unidos 5.789.215, incorporada en el presente documento por referencia); por electroporación (patente de Estados Unidos 5.384.253, incorporada en el presente documento por referencia; Tur-Kaspa y col., 1986; Potter y col., 1984); por precipitación con fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, 1973; Chen y Okayama, 1987; Rippe y col., 1990); usando DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol (Gopal, 1985); por carga sónica directa (Fechheimer y col., 1987); por transfección mediada por liposomas (Nicolau y Sene, 1982; Fraley y col., 1979; Nicolau y col., 1987; Wong y col., 1980; Kaneda y col., 1989; Kato y col., 1991) y transfección mediada por receptor (Wu y Wu, 1987; Wu y Wu, 1988); por bombardeo con microproyectiles (solicitudes PCT N.º WO 94/09699 y 95/06128; patentes de Estados Unidos 5.610.042; 5.322.783 5.563.055, 5.550.318, 5.538.877 y 5.538.880, y cada una incorporada en el presente documento por referencia); por agitación con fibras de carburo de silicio (Kaeppler y col., 1990; patentes de Estados Unidos 5.302.523 y 5.464.765, cada una incorporada en el presente documento por referencia); por transformación mediada por Agrobacterium (patentes de Estados Unidos 5.591.616 y 5.563.055, cada una incorporada en el presente documento por referencia); por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y col., 1993; patentes de Estados Unidos 4.684.611 y 4.952.500, cada una incorporada en el presente documento por referencia); por captación de ADN mediada desecación/inhibición (Potrykus y col., 1985), y cualquier combinación de dichos procedimientos. A través de la aplicación de técnicas tales como estas, puede transformarse de forma estable o transitoria uno o más orgánulos, células, tejido u organismos.

a. Transformación ex vivo

Los expertos en la materia conocen procedimientos para transfectar células y tejidos vasculares retirados de un organismo en un entorno ex vivo. Por ejemplo, se han alterado genéticamente células endoteliales caninas por transferencia génica retrovírica in vitro y se han trasplantado en un canino (Wilson y col., 1989). En otro ejemplo, se transfectaron células endoteliales de cerdo enano de Yucatán por retrovirus in vitro y se trasplantaron en una arteria usando un catéter de doble globo (Nabel y col., 1989). Por tanto, se contempla que pueden retirarse células o tejidos y transfectarse ex vivo usándolo los ácidos nucleicos de la presente invención. En aspectos particulares, las células

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o tejidos trasplantados pueden colocarse en un organismo. En facetas preferidas, se expresa un ácido nucleico en las células o tejidos trasplantados.

b.

Inyección

En ciertas realizaciones, puede suministrase un ácido nucleico a un orgánulo, a una célula, un tejido, o un organismo mediante una o más inyecciones (es decir, una inyección con aguja) tal como, por ejemplo, de forma subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc. Los procedimientos de inyección de vacunas son bien conocidos para los expertos en la materia (por ejemplo, inyección de una composición que comprende una solución salina). Realizaciones adicionales de la presente invención incluyen la introducción de un ácido nucleico por microinyección directa. La microinyección directa se ha usado para introducir construcciones de ácido nucleico en ovocitos de Xenopus (Harland y Weintraub, 1985). La cantidad de vector usada puede variar según la naturaleza del antígeno así como el orgánulo, célula, tejido u organismo usado.

c. Electroporación

En ciertas realizaciones de la presente invención, se introduce un ácido nucleico en un orgánulo, una célula, un tejido o un organismo mediante electroporación. La electroporación implica la exposición de una suspensión de células y ADN a una descarga eléctrica de alto voltaje. En algunas variantes de este procedimiento, ciertas enzimas degradantes de la pared celular, tales como enzimas degradantes de pectina, se emplean para volver a las células receptoras dianas más susceptibles a transformación por electroporación que las células no tratadas (patente de Estados Unidos 5.384.253, incorporada en el presente documento por referencia). Como alternativa, las células receptoras pueden hacerse más susceptibles a transformación por herida mecánica.

La transfección de células eucariotas usando electroporación ha sido bastante satisfactoria. Se han transfectado linfocitos pre-B de ratón con genes de inmunoglobulina kappa humana (Potter y col., 1984), y se han transfectado hepatocitos de rata con el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (Tur-Kaspa y col., 1986) de este modo.

Para lograr la transformación por electroporación en células tales como, por ejemplo, células vegetales, se pueden emplear tejidos desmenuzables, tales como un cultivo en suspensión de células o callo embriogénico o como alternativa se pueden transformar embriones inmaduros u otro tejido organizado directamente. En esta técnica, se degradarían parcialmente las paredes celulares de las células elegidas exponiéndolas a enzimas degradantes de pectina (pectoliasas) o por herida mecánica de un modo controlado. Ejemplos de algunas especies que se han transformado por electroporación de células intactas incluyen maíz (patente de Estados Unidos 5.384.253; Rhodes y col., 1995; D’Halluin y col., 1992), trigo (Zhou y col., 1993), tomate (Hou y Lin, 1996), soja (Christou y col., 1987) y tabaco (Lee y col., 1989).

También se pueden emplear protoplastos para transformación por electroporación de células vegetales (Bates, 1994; Lazzeri, 1995). Por ejemplo, se describe la generación de plantas de soja transgénicas por electroporación de protoplastos derivados de cotiledones por Dhir y Widholm en la solicitud de patente internacional n.º WO 9217598, incorporada en el presente documento por referencia. Otros ejemplos de especies para las que se ha descrito la trasformación con protoplastos incluyen cebada (Lazzeri, 1995), sorgo (Battraw y col., 1991), maíz (Bhattacharjee y col., 1997), trigo (He y col., 1994) y tomate (Tsukada, 1989).

d. Fosfato cálcico

En otras realizaciones de la presente invención, se introduce un ácido nucleico a las células usando precipitación con fosfato cálcico. Se han transfectado células KB humanas con ADN de adenovirus 5 (Graham y Van Der Eb, 1973) usando esta técnica. También de este modo, se han transfectado células de ratón L(A9), ratón C127, CHO, CV-1, BHK, NIH3T3 y HeLa con un gen marcador de neomicina (Chen y Okayama, 1987), y se transfectaron hepatocitos de rata con una diversidad de genes marcadores (Rippe y col., 1990).

e. DEAE-dextrano

En otra realización, se suministra un ácido nucleico en una célula usando DEAE-dextrano seguido por polietilenglicol. De este modo, se introdujeron plásmidos indicadores en células de mieloma y eritroleucemia de ratón (Gopal, 1985).

f. Carga por sonicación

Realizaciones adicionales de la presente invención incluyen la introducción de ácido nucleico por carga sónica directa. Se han transfectado fibroblastos LTK-con el gen de la timidinaquinasa por carga por sonicación (Fechheimer y col., 1987).

g. Transfección mediada por liposoma

En una realización adicional de la invención, puede atraparse un ácido nucleico en un complejo lipídico tal como, por ejemplo, un liposoma. Los liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una membrana de bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas por

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ADN mediante bombardeo de partículas pero no son necesarias en sí mismas y por sí mismas.

Una realización ilustrativa de un procedimiento para suministrar ADN a una célula por aceleración es el sistema de suministro de partículas por biolística, que puede usarse para impulsar partículas recubiertas con ADN o células a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, en una superficie de filtro cubierta con células, tal como por ejemplo, células de plantas monocotiledonias cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de modo que no se suministran a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que un tamiz intermedio entre el aparato de proyectiles y las células a bombardear, reduce el tamaño de agregado de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación reduciendo el daño infligido sobre las células receptoras por proyectiles que son demasiado grandes.

3. Células huésped

Como se usa en el presente documento, los términos "células", "línea celular", y "cultivo celular" pueden usarse de forma intercambiable. Todos estos términos también incluyen su descendencia, que es todas y cada una de las generaciones posteriores. Se entiende que toda la descendencia puede no ser idéntica debido a mutaciones deliberadas o accidentales. En el contexto de la expresión de una secuencia heteróloga de ácido nucleico, "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota, e incluye cualquier organismo transformable que sea capaz de replicar un vector y/o expresar un gen heterólogo codificado por un vector. Una célula huésped puede usarse, y se ha usado, como receptor para vectores. Una célula huésped puede "transfectarse" o "transformarse", que se refiere a un proceso por el cual se transfiere o introduce ácido nucleico exógeno a la célula huésped. Una célula transformada incluye la célula objeto principal y su descendencia. Como se usa en el presente documento, los términos células o células huésped "modificadas por ingeniería" o "recombinantes" pretenden hacer referencia a una célula en que se ha introducido una secuencia exógena de ácido nucleico, tal como, por ejemplo, un vector. Por lo tanto, las células recombinantes son distinguibles de células de origen natural que no contienen un ácido nucleico introducido de forma recombinante.

En ciertas realizaciones, se contempla que pueden coexpresarse ARN o secuencias proteicas con otros ARN o secuencias proteicas seleccionadas en la misma célula huésped. La coexpresión puede conseguirse por cotransfección de la célula huésped con dos o más vectores recombinantes distintos. Como alternativa, puede construirse un único vector recombinante para incluir múltiples regiones codificantes distintas para ARN, que después podrían expresarse en las células huésped transfectadas con el único vector.

En ciertas realizaciones, la célula o tejido huésped puede estar comprendido en al menos un organismo. En ciertas realizaciones, el organismo puede ser aunque sin limitación, un procariota (por ejemplo, una eubacteria, una arqueobacteria) o un eucariota (levadura), como entendería un experto en la materia (véase, por ejemplo, la página web phylogeny.arizona.edu/tree/phy-logeny.html).

Están disponibles numerosas líneas celulares y cultivos para su uso como célula huésped, y pueden obtenerse a través de la American Type Culture Collection (ATCC), que es una organización que sirve como archivo para cultivos vivos y materiales genéticos (sitio web en atcc.org). Un huésped apropiado puede determinarse por un experto en la materia en base a la estructura del vector y el resultado deseado. Puede introducirse un plásmido o cósmido, por ejemplo, en una célula huésped procariota para replicación de muchos vectores. Los tipos celulares disponibles para replicación y/o expresión del vector incluyen, aunque sin limitación, bacterias, tales como E. coli (por ejemplo, E. coli cepa RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC n.º 31537) así como E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófica, ATCC n.º 273325), DH5α, JM109, y KC8, bacilos tales como Bacillus subtilis; y otras enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, diversas especies de Pseudomonas así como varios huéspedes bacterianos disponibles en el mercado tales como células competentes SURE® y células SOLOPACK™ Gold (STRATAGENE®, La Jolla). En ciertas realizaciones se contemplan particularmente células bacterianas tales como E. coli LE392 como células huésped para virus fágicos.

Ejemplos de células huésped eucariotas para replicación y/o expresión de un vector incluyen, aunque sin limitación, HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos, y PC12. Muchas células huésped de diversos tipos celulares y organismos están disponibles y serían conocidas para los expertos en la materia. Asimismo, puede usarse un vector vírico junto con una célula huésped eucariota o procariota, particularmente una que sea permisiva para replicación o expresión del vector.

Algunos vectores pueden emplear secuencias de control que les permitirán replicarse y/o expresarse en células tanto procariotas como en células eucariotas. Un experto en la materia entendería adicionalmente las condiciones en las cuales incubar todas las células huésped descritas anteriormente para mantenerlas y permitir la replicación de un vector. También se entiende y se conocen técnicas y condiciones que permitirían producción a gran escala de vectores, así como la producción de los ácidos nucleicos codificados por vectores y sus polipéptidos, proteínas, o péptidos afines.

4. Sistemas de expresión

Existen numerosos sistemas de expresión que comprenden al menos una parte o todo de las composiciones analizadas anteriormente. Pueden emplearse sistemas basados en procariotas y/o eucariotas para su uso con la

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II. Trastorno de células epiteliales (TCE)

La aplicación clínica eficaz de probióticos se ha limitado por la biodisponibilidad y bioseguridad de la manipulación de la flora bacteriana en el tracto gastrointestinal. Un enfoque innovador es a través del desarrollo de proteínas derivadas de bacterias probióticas como reactivos terapéuticos. Los inventores han purificado previamente y clonado una proteína secretada por Lactobacillus rhamnosus GG, p40, que protege el epitelio intestinal del daño tisular inducido por DSS y colitis de un modo dependiente del receptor (R) de EGF. Este trabajo aquí ha identificado composiciones peptídicas de 180, 60, y 32 aminoácidos de longitud, que pueden usarse para prevenir o tratar un trastorno que implica apoptosis patológica de células epiteliales. En una realización, se causa apoptosis de células epiteliales o se mantiene por citoquinas.

En ciertas realizaciones, el TCE prevenido o tratado por la presente invención puede ser una enfermedad inflamatoria del intestino tal como colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. Sin embargo, la expresión "enfermedad inflamatoria del intestino" o "EII", como se usan en el presente documento, describen una amplia clase de enfermedades caracterizadas por inflamación de al menos parte del tracto gastrointestinal. Los síntomas de EII pueden incluir inflamación del intestino y provocar calambres abdominales y diarrea persistente. Las enfermedades inflamatorias del intestino incluyen colitis ulcerosa (CU), enfermedad de Crohn (EC), colitis indeterminada, colitis crónica, enfermedad discontinua o desigual, pouchitis, proctitis, inflamación ileal, inflamación extracolónica, inflamación granulomatosa en respuesta a criptas rotas, ulceras aftosas, inflamación transmural, colitis microscópica, diverticulitis y colitis por desvío. Los péptidos de la presente invención también pueden ser particularmente útiles para promover una función intestinal sana de bebes o neonatos prematuros/poco desarrollados, y afecciones que afectan a estos pacientes tales como enterocolitis necrotizante. Las aplicaciones también pueden incluir mantenimiento de un estado intestinal sano antes de la aparición de un TCE o durante la recuperación de una intervención por TCE, por ejemplo, remisión inducida farmacológica o quirúrgicamente de una enfermedad o afección. Aplicaciones adicionales también pueden incluir infecciones gastrointestinales, tales como las causadas por cólera, rotavirus o E. coli enterotoxigénica. Pueden incluir adicionalmente otras afecciones tales como síndrome del intestino irritable (SII) u otras afecciones o malestares asociados con apoptosis de células epiteliales, integridad comprometida de la barrera, o intestino o función de las células epiteliales alterada de otro modo.

A. Colitis ulcerosa

La colitis ulcerosa es una enfermedad que causa inflamación y llagas, llamadas úlceras, en el revestimiento del intestino grueso. La inflamación habitualmente sucede en el recto y la parte inferior del colon, pero puede afectar al colon completo. La colitis ulcerosa raramente afecta al intestino delgado excepto por la sección final, llamada el íleo terminal. La colitis ulcerosa también puede llamarse colitis o proctitis. La inflamación hace que el colon se vacíe frecuentemente, causando diarrea. Se forman úlceras en lugares donde la inflamación ha eliminado las células que revisten el colon; las úlceras sangran y producen pus.

La colitis ulcerosa puede suceder en personas de cualquier edad, pero más a menudo comienza entre las edades de 15 y 30, o menos frecuentemente entre las edades de 50 y 70. Los niños y adolescentes a menudo desarrollan la enfermedad. La colitis ulcerosa afecta a hombres y mujeres por igual y parece transmitirse de padres a hijos en algunas familias. Abundan las teorías acerca de las causas de la colitis ulcerosa, pero nadie las ha demostrado. La teoría más popular es que el sistema inmunitario del organismo reacciona a un virus o a una bacteria usando inflamación continuada en la pared intestinal. Las personas con colitis ulcerosa tienen anormalidades del sistema inmunitario, pero los doctores no conocen si estas anormalidades son una causa o un resultado de la enfermedad. La colitis ulcerosa no está causada por angustia emocional o sensibilidad a ciertos alimentos o productos alimenticios, pero estos factores pueden desencadenar síntomas en algunas personas.

Los síntomas más comunes de colitis ulcerosa son dolor abdominal y diarrea sangrante. Los pacientes también pueden experimentar fatiga, pérdida de peso, pérdida de apetito, sangrado rectal, y pérdida de fluidos corporales y nutrientes. Aproximadamente la mitad de los pacientes tienen síntomas leves. Otros padecen fiebre frecuente, diarrea sangrante, nauseas, y calambres abdominales intensos. La colitis ulcerosa también puede causar problemas tales como artritis, inflamación del ojo, enfermedad hepática (hepatitis, cirrosis y colangitis esclerosante primaria), osteoporosis, erupciones cutáneas, y anemia. Nadie sabe de forma segura porqué aparecen problemas fuera del colon. Los científicos creen que estas complicaciones pueden suceder cuando el sistema inmunitario activa la inflamación en otras partes del organismo. Algunos de estos problemas se van cuando se trata la colitis.

Puede requerirse un examen físico exhaustivo y una serie de ensayos para diagnosticar la colitis ulcerosa. Pueden hacerse pruebas sanguíneas para comprobar la anemia, que podría indicar sangrado en el colon o recto. Las pruebas de sanguíneas también pueden descubrir un alto recuento de glóbulos blancos, que es un signo de inflamación en alguna parte del organismo. Ensayando una muestra de deposición, el doctor puede detectar sangrado o infección en el colon o recto. El doctor puede hacer una colonoscopia o sigmoidoscopia. Para cualquier ensayo, el doctor inserta un endoscopio-un tubo iluminado, flexible y largo conectado a un ordenador y monitor de TV, en el ano para ver el interior del colon y el recto. El doctor será capaz de ver cualquier inflamación, sangrado, o úlcera en la pared del colon. Durante el examen, el doctor puede hacer una biopsia, que implica tomar una muestra de tejido del revestimiento del colon para verla con un microscopio. También puede requerirse una placa de rayos-x con enema de bario del colon. Este procedimiento implica llenar el colon con bario, una solución blanca de aspecto

yesoso. El bario se muestra blanco en película de rayos-x, permitiendo al doctor una visión clara del colon, incluyendo cualquier úlcera u otra anormalidad que puede haber.

El tratamiento de la colitis ulcerosa depende de la gravedad de la enfermedad. Muchas persones se tratan con medicación. En varios casos, un paciente puede necesitar cirugía para retirar el colon enfermo. La cirugía es la única 5 cura para la colitis ulcerosa. Algunas personas cuyos síntomas se desencadenan por ciertos alimentos son capaces de controlar los síntomas evitando alimentos que alteren sus intestinos, como alimentos altamente sazonados, frutas y vegetales sin procesar, o azúcar de la lecha (lactosa). Cada persona puede experimentar la colitis ulcerosa de forma diferente, de modo que se ajusta el tratamiento para cada individuo. Es importante el apoyo emocional y psicológico. Algunas personas tienen remisiones -periodos en que los síntomas se van -que duran meses o incluso

10 años. Sin embargo, los síntomas de la mayoría de los pacientes finalmente vuelven. Este patrón de cambio de la enfermedad significa que uno nunca puede saber cuánto ha ayudado un tratamiento. Algunas personas con colitis ulcerosa pueden necesitar cuidados médicos durante algún tiempo, con visitas regulares al doctor para controlar la afección.

El objetivo de la terapia es inducir y mantener la remisión, y mejorar la calidad de vida de personas con colitis 15 ulcerosa. Están disponibles varios tipos de fármacos:

● Aminosalicilatos -fármacos que contienen ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), ayudan a controlar la inflamación. La sulfasalazina es una combinación de sulfapiridina y 5-ASA y se usa para inducir y mantener la remisión. El componente sulfapiridina transporta el 5-ASA antiinflamatorio al intestino. Sin embargo, la sulfapiridina puede conducir a efectos secundarios tales como incluyendo nauseas, vómitos, acidez, diarrea, y cefalea. Otros

20 agentes 5-ASA tales como olsalazina, mesalamina, y balsalazida, tienen un vehículo diferente, ofrecen menos efectos secundarios, y pueden usarse por personas que no pueden tomar sulfasalazina. Los 5-ASA se dan por vía oral, a través de un enema, en un supositorio, dependiendo de la localización de la inflamación en el colon. La mayoría de las personas con colitis ulcerosa leve o moderada se tratan con este grupo de fármacos en primer lugar.

25 ● Corticosteroides -tales como prednisona e hidrocortisona también reducen la inflamación. Pueden usarse por personas que tienen colitis ulcerosa moderada a grave o que no responden a fármacos 5-ASA. Los corticosteroides, también conocidos como esteroides, pueden darse por vía oral, intravenosa, a través de un enema, o en un supositorio, dependiendo de la localización de la inflamación. Estos fármacos pueden causar efectos secundarios tales como ganancia de peso, acné, vello facial, hipertensión, cambios de humor, y un riesgo

30 aumentado de infección. Por esta razón, no se recomiendan para uso a largo plazo.

● Inmunomoduladores -tales como como azatioprina y 6-mercapto-purina (6-MP) reducen la inflamación afectando al sistema inmunitario. Se usan para pacientes que no han respondido a 5-ASA o corticosteroides o que son dependientes de corticosteroides. Sin embargo, los inmunomoduladores son de acción lenta y pueden tardar 6 meses antes de observarse un beneficio completo. Los pacientes que toman estos fármacos se controlan para

35 complicaciones incluyendo pancreatitis y hepatitis, un recuento reducido de glóbulos blancos, y un riesgo aumentado de infección. Puede usarse ciclosporina A con 6-MP o azatioprina para tratar colitis ulcerosa grave activa en personas que no responden a corticosteroides intravenosos.

Pueden darse otros fármacos para relajar al paciente o aliviar el dolor, diarrea, o infección.

Ocasionalmente, los síntomas son tan graves que la persona debe hospitalizarse. Por ejemplo, una persona puede

40 tener un sangrado grave o diarrea grave que cause deshidratación. En dichos casos, el doctor intentará detener la diarrea y la pérdida de sangre, fluidos, y sales minerales. El paciente puede necesitar una dieta especial, alimentarse a través de vena, medicaciones, o a veces cirugía.

A aproximadamente el 25-40 % de los pacientes con colitis ulcerosa finalmente se les deberán retirar sus cólones a causa de hemorragia masiva, enfermedad severa, rotura del colon, o riesgo de cáncer. Algunas veces el doctor

45 recomendará retirar el colon si los tratamientos médicos fracasan o si los efectos secundarios de los corticosteroides u otros fármacos amenazan la salud del paciente. La cirugía para retirar el colon y el recto, conocida como proctocolectomía, va seguida por uno de los siguientes:

● Ileostomía, en que el cirujano crea una pequeña abertura en el abdomen llamada estoma, y une el extremo del intestino delgado llamado el íleon, al mismo. Los residuos viajarán a través del intestino delgado y saldrán del

50 cuerpo a través del estoma. El estoma es de aproximadamente el tamaño de una cuarta parte y está habitualmente localizada en la parte derecha inferior del abdomen cerca de la zona de la cintura. Se cose una bolsa sobre la abertura para recoger los residuos, y el paciente vacía la bolsa según lo necesario.

● Anastomosis ileonal, u operación de reposición, que permite al paciente tener movimientos intestinales normales porque conserva parte del ano. En esta operación, el cirujano retira la parte enferma del colon y el interior del

55 recto dejando los músculos exteriores del recto. El cirujano después une el íleon al interior del recto y el ano creando una bolsa. Los residuos se almacenan en la bolsa y pasan a través del ano del modo habitual. Los movimientos del intestino pueden ser más frecuentes y acuosos que antes del procedimiento. La inflamación de la bolsa (pouchitis) es una posible complicación.

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No todas las operaciones son apropiadas para todas las personas. Qué cirugía adoptar depende de la gravedad de la enfermedad y las necesidades del paciente, las expectativas y el estilo de vida. Las personas que afrontan esta decisión obtendrán la máxima información posible hablando con sus doctores, las enfermeras que trabajan con pacientes de cirugía de colon (terapeutas enterostomales), y con otros pacientes de cirugía de colon. Las organizaciones de apoyo al paciente pueden dirigir a las personas a grupos de apoyo y otras fuentes de información.

La mayoría de las personas con colitis ulcerosa nunca necesitarán una cirugía. Si llega a convertirse en necesaria la cirugía, sin embargo, algunas personas encontrarán malestar en saber que después de la cirugía, la colitis se cura y la mayoría de las personas vive una vida normal, vidas activas.

B. Enfermedad de Crohn

La enfermedad de Crohn se caracteriza por inflamación intestinal y el desarrollo de estenosis intestinal y fístulas; la neuropatía a menudo acompaña estos síntomas. Una hipótesis para la etiología de la enfermedad de Crohn es que un fallo de la barrera mucosa intestinal, posiblemente resultante de susceptibilidades genética y factores ambientales (por ejemplo, hábito de fumar), expone al sistema inmunitario a antígenos del lumen intestinal incluyendo antígenos bacterianos y alimenticios (por ejemplo, Soderholm y col., 1999; Hollander y col., 1986; Hollander, 1992). Otra hipótesis es que la infección intestinal persistente por patógenos tales como Mycobacterium paratuberculosis, Listeria monocytogenes, Escherichia coli anormal, o paramixovirus, estimula la respuesta inmunitaria; o como alternativa, los síntomas resultan de una respuesta inmunitaria mal regulada a antígenos ubicuos, tales como microflora intestinal normal y los metabolitos y toxinas que producen (Sartor, 1997). La presencia de anticuerpos IgA e IgG anti-Sacccharomyces cerevisiae (ASCA) en el suero se encontró que era en gran medida diagnóstica de enfermedad de Crohn pediátrica (Ruemmele y col., 1998; Hoffenberg y col., 1999).

Recientes esfuerzos por desarrollar herramientas de diagnóstico y tratamiento contra enfermedad de Crohn se han centrado en el papel central de las citoquinas (Schreiber, 1998; van Hogezand y Verspaget, 1998). Las citoquinas son proteínas o factores secretados pequeños (5 a 20 kD) que tienen efectos específicos sobre las interacciones célula a célula, comunicación intercelular, o el comportamiento de otras células. Las citoquinas se producen por linfocitos, especialmente linfocitos TH1 y TH2, monocitos, macrófagos intestinales, granulocitos, células epiteliales, y fibroblastos (revisado en Rogler y Andus, 1998; Galley y Webster, 1996). Algunas citoquinas son proinflamatorias (por ejemplo, TNF-α, IL-1(α y β), IL-6, IL-8, IL-12, o factor inhibidor de leucemia (LIF)); otras son antiinflamatorias (por ejemplo, antagonistas del receptor de IL-1, IL-4, IL-10, IL-11, y TNF-β). Sin embargo, pueden solapar y tener redundancia funcional en sus efectos en ciertas afecciones inflamatorias.

En casos activos de enfermedad de Crohn, se secretan concentraciones elevadas de TNF-α e IL-6 en la circulación sanguínea, y se producen TNF-α, IL-1, IL-6, e IL-8 en exceso de forma local por células de la mucosa (id.; Funakoshi y col., 1998). Estas citoquinas pueden tener efectos de largo alcance sobre sistemas fisiológicos incluyendo el desarrollo de huesos, hemotopoyesis, y la función hepática, de tiroides, y neuropsiquiátrica. Además, un desequilibrio de la relación IL-1β/IL-1ra, en favor de IL-1β proinflamatoria, se ha observado en pacientes con enfermedad de Crohn (Rogler y Andus, 1998; Saiki y col., 1998; Dionne y col., 1998; pero véase Kuboyama, 1998). Un estudio sugirió que los perfiles de citoquinas en muestras de deposición podrían ser una herramienta útil de diagnóstico para enfermedad de Crohn (Saiki y col., 1998).

Los fármacos antiinflamatorios, tales como 5-aminosalicilatos (por ejemplo, mesalamina) o corticosteroides, típicamente se prescriben, pero no siempre son eficaces (revisado en Botoman y col., 1998). La inmunosupresión con ciclosporina a veces es beneficiosa para pacientes resistentes a o intolerantes a corticosteroides (Brynskov y col., 1989). En la enfermedad de Crohn, se distorsiona una respuesta inmunitaria mal regulada hacia inmunopatología mediada por células (Murch, 1998). Pero los fármacos inmunosupresores, tales como ciclosporina, tracolimus, y mesalamina se han usado para tratar casos resistentes a corticosteroides de enfermedad de Crohn con éxito desigual (Brynskov y col., 1989; Fellerman y col., 1998). No obstante, la corrección quirúrgica finalmente es necesaria en el 90 % de los pacientes; el 50 % experimentan resección colónica (Leiper y col., 1998; Makowiec y col., 1998). La tasa de recidiva después de cirugía es alta, requiriendo el 50 % cirugía adicional en 5 años (Leiper y col., 1998; Besnard y col., 1998). Otras terapias incluyen el uso de diversos antagonistas de citoquinas (por ejemplo, IL-1 ra), inhibidores (por ejemplo, de la enzima convertidora de IL-1β y antioxidantes) y anticuerpos anticitoquina (Rogler y Andus, 1998; van Hogezand y Verspaget, 1998; Reimund y col., 1998; Lugering y col., 1998; McAlindon y col., 1998). Se han intentado los anticuerpos monoclonales contra TNF-α con algún éxito en el tratamiento de enfermedad de Crohn (Targan y col., 1997; Stack y col., 1997; van Dullemen y col., 1995).

Otro enfoque para el tratamiento de enfermedad de Crohn se ha centrado en erradicar al menos parcialmente la comunidad bacteriana que puede activar la respuesta inflamatoria y remplazarla con una comunidad no patogénica. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.599.795 desvela un procedimiento para la prevención y tratamiento de enfermedad de Crohn en pacientes humanos. Este procedimiento se dirigió a esterilizar el tracto intestinal con al menos un antibiótico y al menos un agente antifúngico para eliminar la flora existente y remplazarla con diferentes bacterias seleccionadas y bien caracterizadas tomadas de seres humanos normales. Borody mostró un procedimiento de tratamiento de enfermedad de Crohn por eliminación al menos parcial de la microflora intestinal existente por lavado y remplazo con una nueva comunidad bacteriana introducida por inóculo fecal a partir de un donante humano explorado para enfermedad o por una composición que comprende especies de Bacteroides y

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las personas con enfermedad celíaca comen alimentos o usan productos que contienen gluten, su sistema inmunitario responde dañando el intestino delgado. Las protuberancias minúsculas, con forma de dedo que revisten el intestino delgado se dañan o destruyen. Las llamadas vellosidades, normalmente permiten que los nutrientes de los alimentos se absorban en el torrente sanguíneo. Sin vellosidades sanas, una persona queda malnutrida, independientemente de la cantidad de alimento comido.

Como el sistema inmunitario del propio organismo causa el daño, la enfermedad celíaca se considera un trastorno autoinmunitario. Sin embargo, también se clasifica como una enfermedad de mala absorción porque no se absorben nutrientes. La enfermedad celíaca también es conocida como esprúe celíaco, esprúe no tropical, y enteropatía sensible a gluten. La enfermedad celíaca en una enfermedad genética, que significa que continúa en las familias. Algunas veces, la enfermedad se activa o queda activa por primera vez después de cirugía, embarazo, nacimiento de un bebé, infección vírica, o estrés emocional grave.

Los datos sobre prevalencia de enfermedad celíaca son anecdóticos. En Italia, aproximadamente 1 de cada 250 personas y en Irlanda aproximadamente 1 de cada 300 personas tienen enfermedad celíaca. Recientes estudios han demostrado que puede ser más común en África, Sudamérica, y Asia que lo que se creía previamente. Hasta hace poco, se creía que la enfermedad celíaca no era común en los Estados Unidos. Sin embargo, estudios han demostrado que la enfermedad celíaca es muy común. Hallazgos recientes estiman que aproximadamente 2 millones de personas en Estados Unidos tienen enfermedad celíaca, o aproximadamente 1 de cada 133 personas. Entre las personas que tienen un pariente de primer grado diagnosticado con enfermedad celíaca, tanto como 1 de cada 22 personas puede tener la enfermedad. La enfermedad celíaca podría estar mal diagnosticada en Estados Unidos por varias razones incluyendo (i) los síntomas celíacos pueden atribuirse a otros problemas; (ii) muchos doctores no tienen conocimiento sobre la enfermedad; y (iii) solamente una pequeña cantidad de laboratorios de Estados Unidos están experimentados y especializados en el ensayo de enfermedad celíaca. Se necesita más investigación para conocer la prevalencia verdadera de la enfermedad celíaca entre los americanos.

La enfermedad celíaca afecta a las personas de forma diferente. Pueden aparecer síntomas en el sistema digestivo,

o en otras partes del organismo. Por ejemplo, una persona podría tener diarrea y dolor abdominal, mientras que otra persona podría estar irritable o deprimida. De hecho, la irritabilidad es uno de los síntomas más comunes en niños. Los síntomas de enfermedad celíaca pueden incluir uno o más de los siguientes: gases, hinchazón y dolor abdominal recurrente, diarrea crónica, palidez, deposiciones malolientes o grasas, pérdida/ganancia de peso, fatiga, anemia inexplicada, dolor óseo o articular, osteoporosis, osteopenia, cambios en el comportamiento, entumecimiento de las piernas (por daño nervioso),calambres musculares, convulsiones, períodos menstruales ausentes (a menudo a causa de excesiva pérdida de peso), infertilidad, abortos recurrentes, crecimiento retardado, retraso en el desarrollo en bebés, llagas pálidas dentro de la boca (llamadas úlceras aftosas), decoloración de los dientes o pérdida de esmalte, y erupción cutánea pruriginosa (dermatitis herpetiforme).

Una persona con enfermedad celíaca puede no tener síntomas. Las personas sin síntomas aún están en riesgo de las complicaciones de la enfermedad celíaca, incluyendo malnutrición. Cuanto más tiempo permanece una persona sin diagnosticar y sin tratar, mayor es la probabilidad de desarrollar malnutrición y otras complicaciones. La anemia, crecimiento retardado, y pérdida de peso son signos de malnutrición: El organismo no está obteniendo suficientes nutrientes. La malnutrición es un problema grave en niños porque necesitan nutrición adecuada para desarrollarse apropiadamente.

La cantidad de tiempo que una persona se alimenta de leche materna, la edad en que una persona empieza a comer alimentos que contienen gluten y la cantidad de alimentos que contienen gluten que se come son tres factores que se cree que desempeñan un papel en el momento y el modo en que aparece la celiaquía. Algunos estudios han demostrado, por ejemplo, que cuanto más tiempo está una persona alimentándose de leche materna, más tarde aparecen los síntomas de enfermedad celíaca y más infrecuentes son los síntomas.

Reconocer la enfermedad celíaca puede ser difícil porque algunos de sus síntomas son similares a los de otras enfermedades. De hecho, algunas veces la enfermedad celíaca se confunde con síndrome del intestino irritable, anemia por deficiencia de hierro causada por pérdida de sangre menstrual, enfermedad de Crohn, diverticulitis, infecciones intestinales, y síndrome de fatiga crónica. Como resultado, la enfermedad celíaca a menudo está sin diagnosticar o mal diagnosticada.

Recientemente, los investigadores descubrieron que personas con enfermedad celíaca tienen niveles mayores de los normales de ciertos anticuerpos en la sangre. Los anticuerpos son proteínas protectoras producidas por el sistema inmunitario en respuesta a substancias que el organismo percibe como amenazantes. Los autoanticuerpos son proteínas que reaccionan contra las moléculas o tejidos del propio organismo. Para diagnosticar la enfermedad celíaca los médicos habitualmente ensayan la sangre para medir los niveles de inmunoglobulina A (IgA), anticuerpos antitransglutaminasa tisular (tTGA) e IgA antiendomisio (AEA). Antes de ensayarse, se debe seguir comiendo una dieta normal que incluya alimentos con gluten, tal como panes y pastas. Si una persona deja de comer alimentos con gluten antes del ensayo, los resultados pueden ser negativos para enfermedad celíaca incluso si realmente está presente la enfermedad celíaca.

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Si los ensayos y síntomas sugieren enfermedad celíaca, el doctor realizará una biopsia de intestino delgado. Durante la biopsia el doctor retira un trozo pequeño de tejido del intestino delgado para comprobar el daño a las vellosidades. Para obtener la muestra tisular, el doctor facilita un endoscopio a través de la boca y el estómago hasta el intestino delgado. Usando instrumentos pasados a través del endoscopio, el doctor entonces toma la muestra.

La detección de enfermedad celíaca implica ensayar la presencia de anticuerpos en la sangre de personas sin síntomas. Los americanos no se exploran de forma rutinaria para enfermedad celíaca. El ensayo para anticuerpos relacionados con celiaquía en niños menores de 5 años de edad puede no ser fiable. Sin embargo, como la enfermedad celíaca es hereditaria, los miembros de la familia, particularmente los parientes de primer grado-que significa progenitores, hermanos, o niños de personas que se han diagnosticado-pueden desear un ensayo para la enfermedad. Aproximadamente del 5 al 15 por ciento de un pariente de primer grado de una persona afectada también tendrá la enfermedad. De aproximadamente el 3 al 8 por ciento de personas con diabetes tipo 1 tendrá enfermedad celíaca confirmada por biopsia y del 5 al 10 por ciento de las personas con síndrome de Down se diagnosticará con enfermedad celíaca.

El único tratamiento para la enfermedad celíaca es seguir una dieta sin gluten. Cuando una persona se diagnostica por primera vez con enfermedad celíaca, el doctor habitualmente pide a la persona que trabaje con un dietista sobre un plan de dieta sin gluten. Un dietista es un profesional sanitario que está especializado en alimentación y nutrición. Algunas personas con enfermedad celíaca pueden aprender de un dietista el modo de leer listas de ingredientes e identificar alimentos que contienen gluten para tomar decisiones informadas en la tienda de comestibles y cuando comen fuera. La mayoría de las personas, siguiendo esta dieta detendrán los síntomas, curaran el daño intestinal existente, y evitarán daño adicional. Las mejoras comienzan en días de comenzar la dieta. El intestino delgado habitualmente se cura completamente en 3 a 6 meses en niños y adultos más jóvenes y en 2 años en adultos mayores. Curado significa una persona que ahora tiene vellosidades que pueden absorber nutrientes de los alimentos al torrente sanguíneo.

Para permanecer bien, las personas con enfermedad celíaca deben evitar el gluten durante el resto de sus vidas. Comer algo de gluten, no importa como de pequeña sea la cantidad, puede dañar el intestino delgado. El daño sucederá en cualquiera con la enfermedad incluyendo personas sin síntomas apreciables. Dependiendo de la edad de la personas en el diagnóstico, algunos problemas no mejorarán, tales como el crecimiento retardado y la decoloración de los dientes.

Algunas personas con enfermedad celíaca no muestran mejora con la dieta sin gluten. La afección se llama enfermedad celíaca insensible. La razón más común para una mala respuesta es que pequeñas cantidades de gluten aún están presentes en la dieta. Las advertencias de un dietista que está especializado en la educación de pacientes a cerca de la dieta sin gluten es esencial para conseguir los mejores resultados.

Raramente, la lesión intestinal continuará a pesar de una dieta estrictamente sin gluten. Las personas en esta situación tienen intestinos gravemente dañados que no pueden curar. Como sus intestinos no están absorbiendo suficientes nutrientes, necesitan recibir directamente nutrientes en sus torrentes sanguíneos a través de una vena (vía intravenosa). Las personas con esta afección pueden necesitar evaluarse para complicaciones de la enfermedad. Los investigadores ahora están evaluando tratamientos con fármacos para enfermedad celíaca insensible.

Una dieta sin gluten significa no comer alimentos que contengan trigo (incluyendo espelta, triticale, y kamut), centeno, y cebada. Los alimentos y productos hechos a partir de estos cereales tampoco están permitidos. En otras palabras, una persona con enfermedad celíaca no debe comer la mayoría de las semillas, pastas, cereales, y muchos alimentos procesados. A pesar de estas restricciones, las personas con enfermedad celíaca pueden comer una dieta bien equilibrada con una diversidad de alimentos incluyendo pan y pasta sin gluten. Por ejemplo, las personas con enfermedad celíaca pueden usar patata, arroz, soja, amaranto, quinoa, alforfón, o harina de judía en lugar de harina de trigo. Pueden compra pan, pasta, y otros productos sin gluten de tiendas que tienen alimentos orgánicos, u otros productos de compañías alimenticias especiales. Los productos sin gluten están disponibles de forma creciente en tiendas normales. El gluten también se usa en algunas medicaciones. Debe comprobarse con el farmacéutico para saber si las medicaciones usadas contienen gluten. Como el gluten también se usa a veces como aditivo en productos inesperados, es importante leer todas las etiquetas. Si los ingredientes no están enumerados en la etiqueta del producto, el fabricante del producto debe proporcionar la lista a petición. Con la práctica, la detección de gluten se convierte en una segunda naturaleza.

El daño al intestino delgado y los problemas resultantes de absorción de nutrientes ponen a una persona con enfermedad celíaca en riesgo de malnutrición y anemia así como varias enfermedades y problemas de salud. El linfoma y adenocarcinoma son cánceres que pueden desarrollarse en el intestino. La osteoporosis es una afección en que los huesos se vuelven débiles, quebradizos, y propensos a rotura. Una mala absorción de calcio contribuye a la osteoporosis. Los abortos y malformaciones congénitas de los bebés, tales como defectos del tubo neural, son riesgos para mujeres embarazadas con enfermedad celíaca no tratada a causa de problemas de absorción de nutrientes. La corta estatura se refiere a ser de altura significativamente por debajo del promedio. La corta estatura se produce cuando la enfermedad celíaca en la niñez evita la absorción de nutrientes durante los años en que la

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Entamoeba histolytica). Dichas infecciones se tratan con tratamientos convencionales de antibióticos y combinación de antibióticos.

III. Terapias de combinación

Una composición peptídica de la presente invención puede administrare en combinación con otro agente para el tratamiento de un trastorno de células epiteliales que implica apoptosis patológica. Combinando agentes, puede conseguirse un efecto aditivo sin aumentar al mismo tiempo la toxicidad (si la hay) asociada con una monoterapia. Además, es posibles que puedan observarse efectos más que aditivos ("sinergia"). Por tanto, las terapias de combinación son un modo común de explotar los nuevos regímenes terapéuticos. En una realización, las composiciones peptídicas de la presente invención se usan en combinación con un agente terapéutico actualmente usado para tratar un TCE. Dicho enfoque puede inducir efectos aditivos o sinérgicos, o puede permitir el uso de dosis inferiores de cualquiera o ambos componentes, manteniendo de ese modo la eficacia reduciendo al mismo tiempo el potencial de efectos adversos causados por uno cualquiera de los componentes. En otra realización, los péptidos de la presente invención se administran a un paciente antes o después de cirugía para ayudar en un resultado quirúrgico eficaz a corto plazo o largo plazo. El tratamiento con péptido puede preceder, ser concurrente con y/o seguir al otro u otros agentes en intervalos que varían de minutos a semanas. En realizaciones donde el tratamiento con péptido y otro u otros agentes se aplican por separado a una célula, tejido u organismo, generalmente se aseguraría que no pasa un período significativo de tiempo entre el momento de cada suministro, de modo que el tratamiento con péptido y el agente o agentes aún serían capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula, tejido u organismo. Por ejemplo, en dichos casos, se contempla que se puede poner en contacto la célula, tejido u organismo con dos, tres, cuatro o más modalidades de forma sustancialmente simultánea (es decir, en menos de aproximadamente un minuto) con el tratamiento con péptido. En otros aspectos, puede administrarse uno o más agentes de forma sustancialmente simultánea, en aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos, aproximadamente 60 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 13 horas, aproximadamente 14 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 16 horas, aproximadamente 17 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 19 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 21 horas, aproximadamente 22 horas, aproximadamente 23 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 26 horas, aproximadamente 27 horas, aproximadamente 28 horas, aproximadamente 29 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 31 horas, aproximadamente 32 horas, aproximadamente 33 horas, aproximadamente 34 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 37 horas, aproximadamente 38 horas, aproximadamente 39 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 41 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 43 horas, aproximadamente 44 horas, aproximadamente 45 horas, aproximadamente 46 horas, aproximadamente 47 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 1 día, aproximadamente 2 días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días, aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 21 días, aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, o aproximadamente 8 semanas o más, y cualquier intervalo derivable de los mismos, antes y/o después de administrar el péptido.

Pueden emplearse diversos regímenes de combinación del tratamiento con péptidos de la presente invención y uno

o más agentes. Ejemplos no limitantes de dichas combinaciones se muestran a continuación, en los que un péptido de la presente invención es "A" y un agente diferente es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/BB/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

Por tanto, las terapias con péptido de la presente invención pueden usarse junto con otras terapias que se usan para el tratamiento de trastornos analizados anteriormente. En particular, se contemplan antibióticos y agonistas de EGFR como agente de combinación apropiado.

IV. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la materia que las técnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y aún obtener un resultado parecido o similar sin alejarse del espíritu y alcance de la invención.

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Coomassie. Dos de las proteínas más abundantes tenían masas moleculares de aproximadamente 75 kDa y 40 kDa. Para purificar estas proteínas de LGG-s se cargó el LGG-s filtrado en medio de intercambio iónico UNOsphere™ S con grupos funcionales cargados negativamente, y se eluyeron las proteínas unidas usando Tris 30 mM (pH 7,3) que contenía concentraciones progresivamente crecientes de NaCl de 0,1 M a 0,8 M. las proteínas eluidas se analizaron por SDS-PAGE para identificar las proteínas contenidas en cada fracción (datos no mostrados). La proteína de 75 kDa (p75) y la proteína de 40 kDa (p40) eluyeron de la resina de intercambio catiónico a concentraciones de NaCl de 0,25 M y 0,5 M respectivamente (FIG. 1A). El análisis de SDS-PAGE indicó que el procedimiento de cromatografía separaba satisfactoriamente p75 y p40.

Se generaron anticuerpos policlonales anti-p75 y anti-p40 usando p75 o p40 cromatográficamente purificados. El análisis de transferencia de Western indicó que el antisuero anti-p75 reconocía solamente p75 (FIG. 1B), y el antisuero anti-p40 reaccionaba tanto con p40 como con p75 (FIG. 1C). Los sueros preinmunes no reaccionaban con p75 o p40 (FIG. 1B-C). Los experimentos de experimentos de inmunotransferencia indicaron que la preparación de p75 purificada no estaba contaminada con p40, y la preparación de p40 purificada no estaba contaminada con p75 (FIG. 1B-C).

Caracterización de las proteínas p75 y p40. Como primera etapa en la caracterización de p75 y p40, se determinaron las secuencias N-terminales y las secuencias peptídicas internas de estas proteínas, como se describe en los procedimientos. Cuando se comparaban las secuencias en la base de datos de genoma microbiano del NCBI, las secuencias peptídicas de p75 y p40 estaban muy estrechamente relacionadas con dos proteínas codificadas de forma predicha por el genoma de L. casei 334 (números de acceso a NCBI GenBank COG0791 y COG3883, respectivamente). Se diseñaron múltiples cebadores oligonucleotídicos basados en la secuencias de los correspondientes genes de L. casei y secuencias de ADN flanqueantes en el genoma de L. casei, y estos cebadores se usaron para amplificar por PCR secuencias relacionadas del ADN genómico de LGG.

El análisis de secuencia de un conjunto de productos clonados de PCR reveló la presencia de una ORF de 1236 pb, que se había predicho que codificaba una proteína de 412 restos de aminoácido con una masa molecular calculada de 42 kDa (FIG. 1D). La secuencia de aminoácidos N-terminal determinada de forma experimental de p40 de LGG, así como una secuencia peptídica interna de p40, se identificaron dentro de la secuencia deducida de aminoácidos codificada por esta ORF (FIG. 1D). La secuencia deducida de aminoácidos de longitud completa de p40 era un 79 % idéntica a la secuencia de una proteína de 396 aminoácidos de función desconocida en L. casei 334 (NCBI GenBank COG3883).

El análisis de secuencia de otro conjunto de productos clonados de PCR reveló la presencia de una ORF parcial que era > 1488 pb de longitud; la ORF de longitud completa no se amplificó satisfactoriamente. La secuencia de aminoácidos N-terminal determinada de forma experimental de p75 y las secuencias peptídicas internas de p75 se identificaron dentro de la secuencia deducida de aminoácidos codificada por esta ORF parcial (FIG. 1D). La secuencia deducida de aminoácidos de p75 estaba muy estrechamente relacionada con una hidrolasa asociada a pared celular de 493 aminoácidos de L. casei 334 (NCBI GenBank COG0791), y mostraba un 70 % y un 93 % de identidad con dos regiones diferentes de esta proteína de L. casei 334. La masa molecular predicha de la hidrolasa asociada a pared celular de longitud completa de L. casei 334 (49 kDa) difiere sustancialmente de la masa molecular de la proteína p75 de LGG.

Un análisis de las secuencias génicas de p40 y p75 de LGG y las secuencias de aminoácidos N-terminales determinadas de forma experimental de las proteínas codificadas indica que ambos genes codifican proteínas con secuencias señal N-terminales. La presencia de secuencias señal es coherente con la hipótesis de que p40 y p75 se secretan de forma activa en el sobrenadante de cultivo por LGG. La secuencia génica de p40 y la secuencia génica de p75 parcial no muestran relación significativa, y las secuencias de aminoácidos N-terminales determinadas de forma experimental de estas dos proteínas no están relacionadas. Por tanto, en base a los datos de secuencia disponibles, no existen evidencias que sugieran que p40 es un producto de degradación de p75. Sin embargo, es posible que pudiera haber una similitud de secuencia entre p40 y la parte C-terminal no caracterizada de p75.

p75 y p40 estimulan la activación de Akt en células del epitelio intestinal. Como los inventores han informado de que factores recuperados de LGG-s estimulan la activación de Akt (Yan y Polk, 2002), primero determinaron el efecto de p75 y p40 sobre esta ruta de transducción de señales. Las células se trataron con diversas concentraciones de p75 y p40 y se determinó la activación de Akt por análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo contra Akt fosforilado. Los inventores descubrieron que p75 a 10-1000 ng/ml y p40 a 1-100 ng/ml estimulaban la activación de Akt de un modo dependiente de la concentración en células epiteliales de colon de ratón o humano (FIG. 2A). Se eligieron p75 a 100 ng/ml y p40 a 10 ng/ml para experimentos posteriores en este trabajo porque estas son las concentraciones mínimas para inducir activación detectable de Akt. Como controles, los inventores ensayaron la fracción de flujo continuo de la columna de intercambio iónico y la fracción eluida de la columna con NaCl 0,1 M; ninguna de estas preparaciones contenía p75 o p40, y ninguna de estas preparaciones activó Akt (datos no mostrados). Como con LGG-s, la activación de Akt por p75 o p40 fue dependiente de PI3K porque los inhibidores de PI3K, LY294002 y Wortmanina (datos no mostrados) bloqueaban la activación por p75 y p40 de Akt (FIG. 2B). Como los inventores han informado previamente de que LGG, pero no LGG-CM inhibe la activación estimulada por TNF de p38 (Yan y Polk, 2002), ensayaron si las proteínas purificadas de LGG-s modulan este ruta de señalización. De forma similar a LGG-CM, p75 y p40 no mostraron efectos sobre la activación por TNF

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de p38 (FIG. 2D). Además, p75 y p40 tampoco fueron capaces de inducir la activación de ERK1/2 o p38 o la degradación de IκBα (tratamientos de 15 min a 4 horas, los datos de tratamiento de 2 horas se muestran en la FIG. 2D), o de inhibir los efectos de TNF sobre estas rutas (FIG. 2D). Por lo tanto, p75 y p40 purificados son selectivos en su actividad para regular la transducción de señales en células del epitelio intestinal.

p75 y p40 inhiben la apoptosis de células del epitelio intestinal y las lesiones de cultivo orgánico inducidas por TNF. Para determinar los papeles biológicos de proteínas purificadas de LGG-s, los inventores a continuación evaluaron los efectos de p75 y p40 sobre la apoptosis inducida por citoquinas en células del epitelio intestinal. Los inventores detectaron apoptosis de células del epitelio intestinal y la distinguieron de necrosis usando tres procedimientos diferentes. Los ensayos TUNEL e ISOL miden la apoptosis por marcaje específico de ADN genómico fragmentado con desoxinucleotidiltransferasa terminal o ADN ligasa T4, respectivamente. La tinción con Anexina V detecta apoptosis basada en Anexina V conjugada a FITC que se une específicamente a fosfatidilserina una vez expuesta a la capa exterior de la membrana plasmática durante el proceso apoptótico (van Engeland y col., 1998).

La apoptosis inducida por TNF detectada por ensayo TUNEL en células KSR-/-MCE, una línea celular de colon de ratón nula para la expresión de KSR que experimenta apoptosis después de tratamiento con TNF (Yan y col., 2004), se inhibió por p75 o p40 (FIG. 3A-B). Como se esperaba, también se inhibió la apoptosis inducida por TNF por cocultivo de LGG (Yan y Polk, 2002). Estos resultados se confirmaron en células HT29, una línea celular de intestino humano por tinción con Anexina V-FITC. La combinación de "cóctel de citoquinas" de TNF interleuquina (IL)-1α, e IFN-γ indujo apoptosis en células HT29 que se revirtió por tratamiento con p75 o p40 (FIG. 3C-D).

Para determinar el potencial de p75 y p40 de regular la homeostasis epitelial del colon, los inventores realizaron cultivo orgánico de colon y observaron los efectos directos de p75 y p40 sobre el epitelio de colon ex vivo como se detalla en procedimientos. Secciones histológicas preparadas para evaluación de lesiones mostraron que TNF inducía necrosis masiva de la mucosa y alteración de la integridad epitelial en explantes de colon. El cocultivo con p75, p40 y LGG con TNF restauró la integridad del epitelio del colon y la estructura de criptas de las criptas del colon (FIG. 4).

El cocultivo de explantes de tejido de colon con TNF indujo apoptosis epitelial del colon conteniendo el 75 % de las criptas más de 10 células apoptóticas. Este efecto se disminuyó en 3 veces por cotratamiento con p75 o p40 (p < 0,005, FIG. 5A-B). Como la caspasa 3 es un regulador principal del programa apoptótico, y la activación de Akt dependiente de PI3K ha demostrado evitar la activación de caspasa 3 inducida por TNF (Trencia y col., 2003), los inventores determinaron el efecto de p75 y p40 sobre la actividad caspasa 3 usando inmunotinción con un anticuerpo anti-caspasa 3 activa. La activación de caspasa 3 estimulada por TNF en células del epitelio intestinal, se inhibió significativamente por cocultivo con p75 o p40 (FIG. 5C-D).

Por tanto, en líneas celulares de epitelio intestinal de ratón y humano y explantes cultivados de colon de ratón usando tres ensayos apoptóticos diferentes, tanto p75 como p40 ejercen efectos inhibidores significativos sobre la apoptosis inducida por TNF. Estos efectos pueden estar implicados en papeles protectores sobre lesiones epiteliales del intestino inducidas por TNF.

p75 y p40 estimulan el crecimiento de células del epitelio intestinal. El equilibrio homeostático entre la proliferación y la apoptosis regula la morfología y función normal del epitelio gastrointestinal. Las bacterias probióticas han demostrado potenciar la proliferación de células del epitelio intestinal (Ichikawa y col., 1999). Además, se ha informado de que PI3K y Akt desempeñan un papel crítico en la regulación de esta respuesta proliferativa en células del epitelio intestinal (Sheng y col., 2003). Por lo tanto, los inventores evaluaron los efectos de p75 y p40 sobre la proliferación celular usando un ensayo de proliferación basado en MTS. Tanto p75 como p40 promovieron el crecimiento de células YAMC, que se inhibía por el inhibidor de PI3K, LY294002, pero no por el inhibidor de MEK, PD98059 (FIG. 6A). Para caracterizar adicionalmente los efectos de p75 y p40 sobre la proliferación celular del intestino, se usó tinción PCNA para detectar núcleos proliferativos. p75 y p40 potenciaron la cantidad de núcleos PCNA positivos (FIG. 6B-C). Estos resultados sugieren que p75 y p40 ayudan a restaurar la integridad del epitelio intestinal después de lesión inducida por TNF a través no solamente de la prevención de la apoptosis, sino también de la potenciación de la proliferación.

La inmunorreducción de p75 y p40 de LGG-CM bloquea los efectos biológicos de LGG-CM sobre células del epitelio intestinal. Para ensayar por otro enfoque si p75 y p40 son necesarios para los efectos reguladores de LGG-CM sobre las células de epitelio intestinal, se usaron anticuerpos contra p75 y p40 para inmunoprecipitación secuencial para inmunorreducir tanto p75 como p40 de LGG-CM. La inmunoprecipitación con estos dos anticuerpos, pero no los sueros preinmunes, eliminaron de forma eficaz p75 y p40 de LGG-CM (FIG. 7A). Estas fracciones de LGG-CM inmunorreducidas se usaron para tratar células o explantes de cultivo de colon. La inmunorreducción de p75 y p40 de LGG-CM atenuó la activación de Akt (FIG. 7B). Además, LGG-CM, pero no LGG-CM inmunorreducido, prevenía las lesiones ulcerosas inducidas por TNF, incluyendo necrosis de la mucosa y alteración de la integridad epitelial (FIG. 7C) y la apoptosis epitelial en cultivos orgánicos de colon (FIG. 7D-E). La inmunorreducción individual de p75 o p40 atenuó parcialmente la activación de Akt y la respuesta antiapoptótica (datos no mostrados). Estos resultados indican que p75 y p40 son necesarios para la regulación por LGG-CM de las células del epitelio intestinal y sugieren que pueden tener funciones redundantes.

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Expresión específica de cepa de p75 y p40 por lactobacilos. Como los inventores han informado de que la regulación por lactobacilos probióticos de la supervivencia celular es específica de cepa (Yan y Polk, 2002), los inventores a continuación investigaron si la expresión de proteínas p75 y p40 solubles también era específica de cepa. Para abordar esta cuestión, estudiaron otras tres cepas de Lactobacillus, Lactobacillus casei 334, Lactobacillus casei 393, y Lactobacillus acidophilus, que se sabe que regulan la función intestinal (Resta-Lenert y Barrett, 2006; Tien y col., 2006) o la proliferación de linfocitos y la inmunidad (Gill y col., 2000). Se separaron proteínas derivadas de medios condicionados de 105 de estas cepas respectivas de Lactobacillus por SDS-PAGE (FIG. 8A). Antisueros p75 y p40 reconocieron proteínas de tamaño similar en sobrenadante de cultivo de L. casei 393-CM, pero no se detectaron proteínas inmunorreactivas en sobrenadante de cultivo de L. acidophilus-CM (FIG. 8B). El antisuero p40 reconoció una proteína de 38 kDa producida por L. casei 334-CM (FIG. 8B), que es coherente con la relación entre p40 de LGG y una proteína de función desconocida codificada por L. casei (NCBI GenBank COG3883). Fue detectable una débil reactividad del antisuero p75 con una proteína de L. casei de 75 kDa solamente si se sobreexponían las películas (datos no mostrados).

Para investigar los efectos de factores solubles producidos por estas especies de Lactobacillus sobre células epiteliales, se cocultivaron bacterias con las células epiteliales pero se separaron físicamente por un filtro (0,2 µM), de modo que cualquier efecto observado estuviera mediado por factores solubles. Aunque todas las cepas estimularon la activación de Akt e inhibieron la apoptosis inducida por citoquinas cuando estaban en contacto directo con células epiteliales, los sobrenadantes de LGG, L. casei 334, y L. casei 339, pero no L. acidophilus promovieron la activación de Akt (FIG. 8C) y evitaron la apoptosis inducida por TNF (FIG. 8D). La producción específica de cepa de proteínas p75 y p40 solubles y la correlación entre la expresión de estas proteínas y los fenotipos observables proporciona evidencias adicionales de que estos componentes bacterianos pueden promover la supervivencia celular del epitelio intestinal e inhibir la apoptosis inducida por citoquinas.

p75 y p40 estimulan la activación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) que regula Akt encélulas del epitelio intestinal. La señalización del receptor de EGF es un regulador corriente arriba conocido para la activación de PI3K que conduce a activación de Akt. Por lo tanto, los inventores ensayaron la necesidad del receptor de EGF en la activación por p75 y p40 de Akt. Descubrieron que p75 y p40 estimulan la activación del receptor de EGF en células de colon de ratón adulto joven (YAMC), que se inhibe por el inhibidor de tirosina quinasa del receptor de EGF, AG1478 (FIG. 9). Además, p75 y p40 no lograron activar Akt en células de epitelio de colon de ratón (MCE) knock out para el receptor de EGF (EGFR-/-) (FIG. 10A), que se rescata por el receptor de EGF de tipo silvestre (wt), pero no reexpresión del receptor de EGF de quinasa inactiva (ki) en células MCE (FIG. 10B). Estos resultados indican que el receptor de EGF puede mediar la regulación por p75 y p40 de la activación de Akt en células del epitelio intestinal.

p40 previene y trata la colitis inducida por DSS de un modo dependiente de EGFR. Como el modelo de ratón de DSS bien caracterizado de colitis aguda está caracterizado por producción aumentada de citoquinas inflamatorias y apoptosis de células epiteliales, los inventores investigaron los efectos preventivos y terapéuticos de p40 sobre lesión epitelial de colon inducida por DSS y colitis in vivo.

Para evaluar la capacidad de p40 de prevenir la colitis, se administró p40 al inicio del tratamiento con DSS hasta que se sacrificaron los ratones. El tratamiento con DSS durante 4 días o 7 días indujo lesión aguda y colitis con ulceración masiva de colon, daño de las criptas, e inflamación grave. Estas anormalidades se redujeron por cotratamiento con perlas que contenían p40 en ratones wt, pero no en ratones EGFRwa2 (FIG. 16A). Se valoró la lesión e inflamación del epitelio del colon por un patólogo ciego al tratamiento. La administración de DSS a ratones wt indujo colitis grave (valores 7,6 ± 1,6 y 14,3 ± 2,0, después de 4 y 7 días de tratamiento con DSS, respectivamente). El tratamiento con p40 disminuyó significativamente la lesión y la inflamación (valores 6,1 ± 1,1, p < 0,05, y 11,1 ± 1,7, p < 0,01, después de 4 y 7 días de tratamiento con DSS respectivamente). La administración de perlas solamente (sin p40) no tuvo efecto sobre la colitis inducida por DSS (valores 8,3 ± 1,4 y 13,4 ± 2,1, después de 4 y 7 días de tratamiento con DSS) (FIG.16B). En contraste con lo que se observó en ratones wt, el tratamiento con perlas que contenían p40 no mejoró los valores de lesión o inflamación en ratones EGFRwa2 con un EGFR deficiente en quinasa (FIG. B).

Para evaluar la capacidad de p40 de mejorar colitis establecida, se trataron ratones con DSS durante 4 días para inducir colitis y después se administró p40 mediante sonda nasogástrica durante los siguientes 3 días antes de sacrificar los ratones. Para comparar la eficacia relativa de p40 con terapias conocidas para colitis, los ratones se trataron con mesalamina o hidrocortisona durante 3 días después de tratamiento con DSS. La lesión e inflamación inducidas por DSS (valor 9,7 ± 2,1) se disminuyó significativamente por tratamiento con p40 (valor 6,7 ± 2,7, p < 0,05) en ratones wt (FIG. 16C). En ratones EGFRwa2, p40 no logró reducir la inflamación inducida por DSS. Además, el tratamiento con p40 redujo significativamente el acortamiento de colon inducido por DSS en ratones wt, pero no en EGFRwa2 (FIG. 16D). Se redujo la colitis inducida por DSS por tratamiento con mesalamina (valor 9,2 ± 1,5) e hidrocortisona (valor 8,3 ± 3,8) (FIG. 16C). Sin embargo, la mesalamina e hidrocortisona produjeron una pequeña disminución en la lesión e inflamación en ratones tratados con DSS, y los resultados no fueron estadísticamente significativos.

También se ensayaron los efectos de p40 sobre colitis en el modelo de ratón de colitis inducida por oxazolona dirigida por Th-2. Similar a los resultados en el modelo de DSS, los inventores descubrieron que p40 reducía

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Patente de Estados Unidos 5.384.253 Patente de Estados Unidos 5.440.013 Patente de Estados Unidos 5.443.826 Patente de Estados Unidos 5.446.128 5 Patente de Estados Unidos 5.464.765 Patente de Estados Unidos 5.475.085 Patente de Estados Unidos 5.538.877 Patente de Estados Unidos 5.538.880 Patente de Estados Unidos 5.550.318 Patente de Estados Unidos 5.563.055 Patente de Estados Unidos 5.580.859 Patente de Estados Unidos 5.589.466 Patente de Estados Unidos 5.591.616 Patente de Estados Unidos 5.599.795 15 Patente de Estados Unidos 5.610.042 Patente de Estados Unidos 5.618.914 Patente de Estados Unidos 5.656.610 Patente de Estados Unidos 5.670.155 Patente de Estados Unidos 5.672.681 Patente de Estados Unidos 5.674.976 Patente de Estados Unidos 5.702.932 Patente de Estados Unidos 5.710.245 Patente de Estados Unidos 5.736.524 Patente de Estados Unidos 5.780.448 25 Patente de Estados Unidos 5.789.215 Patente de Estados Unidos 5.840.833 Patente de Estados Unidos 5.859.184 Patente de Estados Unidos 5.871.986 Patente de Estados Unidos 5.929.237 Patente de Estados Unidos 5.945.100 Patente de Estados Unidos 5.981.274 Patente de Estados Unidos 5.994.136 Patente de Estados Unidos 5.994.624 Patente de Estados Unidos 6.013.516

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