ES2566169T3

ES2566169T3 - Diagnóstico de enfermedad cardiovascular

Info

Publication number: ES2566169T3
Application number: ES12152464.9T
Authority: ES
Inventors: James V. Snider; Sven Jacobson
Original assignee: Critical Care Diagnostics Inc
Current assignee: Critical Care Diagnostics Inc
Priority date: 2006-05-01
Filing date: 2007-05-01
Publication date: 2016-04-11
Anticipated expiration: 2027-05-01
Also published as: EP2482078A1; DK2482078T3; JP5377289B2; JP2014095724A; US20190120852A1; US20100009356A1; ES2380711T3; AU2007248160B2; JP5676789B2; JP5467120B2; JP2009535649A; EP2482078B1; PL2482078T3; CA2650963C; EP2021796B1; WO2007130962A3; JP6008933B2; WO2007130962A2; US10203339B2; EP2021796A2

Abstract

Un procedimiento in vitro de diagnóstico de la enfermedad cardiovascular (ECV) en un sujeto que tiene un índice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25, o la función renal alterada, comprendiendo el procedimiento: determinar el IMC del sujeto y, si el IMC del sujeto es igual o superior a 25, seleccionar al sujeto, o evaluar la función renal del sujeto y, si el sujeto tiene la función renal alterada, seleccionar al sujeto; y determinar los niveles del péptido natriurético de tipo B (BNP), dímero D y del receptor de interleucina 1 de tipo 1 (ST2) en una muestra biológica del sujeto; en el que el nivel de BNP, y el nivel de ST2 del sujeto indican si el sujeto tiene ECV.

Description

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DESCRIPCION

Diagnostico de enfermedad cardiovascular Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a procedimientos para la deteccion de insuficiencia ca^aca y embolia pulmonar en individuos con un mdice de masa corporal (IMC) alto y en aquellos con la funcion renal alterada.

Antecedentes

Se ha demostrado que los niveles de peptidos natriureticos, como el peptido natriuretico de tipo B (BNP) y BNP N- terminal-pro (NT-proBNP) son diagnosticos de enfermedades cardiovasculares (Clerico y Erndin, Clin. Chem. 50:3350 (2004)). No obstante, se sabe y acepta en el campo que algunos sujetos presentan niveles de peptido natriuretico menores de lo esperado con respecto a un sujeto “normal” para el mismo nivel de enfermedad. El mecanismo exacto de este fenomeno no se sabe. Estos sujetos incluyen personas con la funcion renal alterada (Anwaruddin y col., J. Am. Coll. Cardiol. 47(1):91-7 (2006); McCullough y col., Am. J. Kidney Dis. 41(3):571 -9 (2003)), y personas con sobrepeso (mdice de masa corporal (IMC) de 25-29) u obesos (IMC > 30) (Krauser y col., Am. Heart J. 149(14):744- 50 (2005); McCord y col., Arch. Intern. Med. 164 (20); 2247-52 (2004)).

Sumario

Un procedimiento in vitro de diagnostico de una enfermedad cardiovascular (ECV) en un sujeto con un mdice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25 o la funcion renal alterada, comprendiendo el procedimiento:

determinar el mdice de masa corporal del sujeto (IMC) y, si el IMC del sujeto es superior o igual a 25, seleccionar

al sujeto, o evaluar la funcion renal de un sujeto y, si el sujeto presenta la funcion renal alterada, seleccionar al

sujeto; y

determinar los niveles de BNP y de ST2 soluble en una muestra biologica del sujeto seleccionado;

en los que el nivel de BNP y de ST2 soluble indica si el sujeto tiene una ECV.

La presente invencion se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que, al contrario que los peptidos natriureticos (NP), el biomarcador ST2 (tambien conocido como receptor de interleucina 1 de tipo 1 (IL1RL1)) no se ve afectado por el mdice de masa corporal (IMC) alto ni por la funcion renal alterada y, por tanto, proporciona un mejor pronostico e informacion diagnostica que los NP en sujetos con un (IMC) alto o la funcion renal alterada. Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen determinar si un sujeto tiene un IMC alto y/o insuficiencia renal y si el sujeto tiene una o ambas afecciones, seleccionar el sujeto y determinar los niveles de IL1LR1 y, opcionalmente, del BNP y/o dfmero D en el sujeto. Estos procedimientos se pueden usar para diagnosticar enfermedades cardiovasculares (ECV), por ejemplo smdrome coronario agudo (SCA), insuficiencia cardfaca (IC) y embolia pulmonar (EP) en el sujeto, por ejemplo en sujetos con disnea.

Los inventores tambien describen procedimientos que incluyen determinar los niveles de IL-33 ademas de, o como alternativa a, determinar los niveles de ST2.

En un aspecto, la invencion proporciona procedimientos para diagnosticar enfermedades cardiovasculares (ECV), por ejemplo smdrome coronario agudo (SCA), insuficiencia cardfaca (IC) o embolia pulmonar (EP) en un sujeto que tiene un mdice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25. Los procedimientos incluyen determinar el IMC del sujeto y si el IMC del sujeto es igual o superior a 25, seleccionar el sujeto y determinar los niveles de ST2 y los niveles del BNP u opcionalmente del dfmero D, en la sangre, plasma o suero del sujeto. La relacion entre los niveles de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo un nivel de referencia que representa un nivel de sfST2 en un sujeto que no tiene ECV indica si el sujeto tiene eCv. Como se describe en el presente documento, si los niveles de BNP del sujeto son inferiores a 500 pg/ml, por ejemplo 100-500 pg/ml, y los niveles del dfmero D son inferiores a 500 |ig/l, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo un nivel de referencia que representa un nivel de ST2 en un sujeto que no tiene IC, indica si el sujeto tiene IC. Como se describe en el presente documento, si el nivel de BN del sujeto es inferior a 100 |ig/l y el dfmero D es 500-4000 |ig/l, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo nivel de referencia que representa un nivel de ST2 en un sujeto que no tiene EP, indica si el sujeto tiene EP.

En otro aspecto, la invencion proporciona procedimientos para diagnosticar enfermedad cardiovascular (ECV), por ejemplo smdrome coronario agudo (SCA), insuficiencia cardfaca (IC) y embolia pulmonar (EP) en un sujeto que tiene la funcion renal alterada. Los procedimientos incluyen evaluar la funcion renal del sujeto y si el sujeto tiene la funcion renal alterada, seleccionar el sujeto y determinar un nivel de ST2 y un nivel de BNP y opcionalmente del dfmero D, en la sangre, plasma o suero del sujeto. La relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo un nivel de referencia que representa un nivel de ST2 en un sujeto que no tiene ECV, indica si el sujeto tiene ECV. Como se describe en el presente documento, si el nivel de BNP del sujeto es inferior a 500 pg/ml, por ejemplo 100-500 pg/ml, y el nivel del dfmero D es inferior a 500 |ig/l, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo nivel de referencia que representa un nivel de ST2 en un sujeto que no tiene IC, indica si el sujeto tiene IC. En algunas realizaciones, el nivel de BNP es inferior a 100 pg/ml y el nivel de dfmero D es

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500-4000 □ g/ml, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2, por ejemplo un nivel de referencia que representa un nivel de ST2 en un sujeto que no tiene EP, indica si el sujeto tiene eP.

Como se describe en el presente documento, el nivel de referencia representa un nivel en un sujeto que no tiene ECV, por ejemplo no tiene SCA. IC y/o EP. En algunas realizaciones, por ejemplo en las que el nivel de biomarcador de ST2 se mide usando un inmunoensayo, por ejemplo un ensayo de inmunosorcion ligado a enzimas (ELISA), por ejemplo como se ha descrito en el Ejemplo 1, el nivel de referencia es de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml, por ejemplo el nivel puede ser de 0,20, 0,23, 0,25, 0,27 o 0,29 ng/ml de suero y los valores superiores al nivel indican la presencia de ECV, por ejemplo SAC, IC y/o EP. Si se emplea una tecnica analttica distinta del ELISA descrito en el ejemplo 1, el nivel de referencia de ST2 puede ser diferente del descrito en el presente documento. No obstante, los numeros espedficos citados en el presente documento se interpretaran como equivalentes a los correspondientes numeros generados usando otras tecnicas analfticas.

En general, determinar un nivel de ST2, BNP y/o dfmero D en un sujeto incluye obtener una muestra biologica del sujeto, poner en contacto composiciones de union con la muestra, en las que las composiciones de union se unen espedficamente a ST2. BNP y dfmero D, y medir o determinar la union espedfica de la composicion de union a la muestra. Las composiciones de union pueden ser, por ejemplo, anticuerpos que se unen espedficamente a polipeptidos de ST2, BNP y el dfmero D (p. ej., un Ac anti-ST2, un Ac anti-BNP y un Ac anti-Dfmero D) o sondas oligonucleotfdicas que se unen espedficamente a polinucleotidos de ST2, BNP y dfmero D (p. ej., una sonda espedfica de ST2, una sonda espedfica de BNP y una sonda espedfica de dfmero D).

Los procedimientos tambien pueden incluir determinar los niveles de uno o mas biomarcadores adicionales, por ejemplo NT-proANP, proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, nitrogeno ureico en sangre (BUN), enzimas de la funcion hepatica, albumina y endotoxina bacteriana.

En algunas realizaciones, determinar si el sujeto tiene la funcion renal alterada incluye determinar la tasa de filtracion glomerular (TFG) y/o los niveles de creatinina en suero. El sujeto tiene alteracion leve, moderada o grave de la funcion renal si tienen una TGF o un nivel de creatinina en suero en la Tabla 1:

Tabla 1

Grado: TFG (ml/minuto) Creatinina en suero (^mol/litro)

Leve: 20-50 150-300

Moderado: 10-20 300-700

Grave: < 10 > 700

En el presente documento tambien se proporcionan kits para diagnostico de enfermedad cardiovascular (ECV), que incluyen tres anticuerpos diferentes que se unen espedficamente a polipeptidos de ST2, BNP y dfmero D, respectivamente, o a tres sondas de acido nucleico diferentes que se unen espedficamente a los acidos nucleicos que codifican ST-2, BNP y dfmero D, respectivamente, e instrucciones de uso en un procedimiento descrito en el presente documento.

“Regulado por incremento”, como se usa en el presente documento, se refiere a un incremento de la expresion de un gen y/o su polipeptido codificado. “Incremento de la expresion” se refiere a incrementar (es decir, hasta un nivel detectable) la replicacion, transcripcion y/o traduccion de IL-33, ya que la regulacion por incremento de cualquiera de estos procedimientos tiene un incremento de la concentracion/cantidad del polipeptido codificado por el gen. Por el contrario, “regulacion por disminucion” o “expresion disminuida”, como se usa en el presente documento, se refiere a una reduccion de la replicacion, transcripcion y/o traduccion del gen de la IL-33y/o su polipeptido codificado. La regulacion por incremento o la regulacion por disminucion de la expresion genica puede determinarse directamente detectando un incremento o disminucion, respectivamente, del nivel de ARNm del gen o del nivel de expresion proteica del polipeptido codificado por el gen, usando cualquier medio adecuado conocido en la tecnica, tal como hibridacion de acido nucleico o procedimientos de deteccion de anticuerpos, respectivamente, y en comparacion con los controles. “Expresion”, como se usa en el presente documento, se refiere a la expresion de acido nucleico y/o polipeptido.

Como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un marnffero, por ejemplo un ser humano. En todas las realizaciones se pueden usar acidos nucleicos, polipeptidos humanos y sujetos humanos.

Como se usa en el presente documento, una “muestra biologica” incluye una o mas de sangre, suero, plasma, orina y tejido corporal. En algunas realizaciones, una muestra es una muestra de sangre o suero.

A menos que se defina en contra, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que un experto en la tecnica a la que esta invencion pertenece entiende habitualmente. Los

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procedimientos y materiales se describen en el presente documento para usar en la presente invencion; tambien se pueden usar otros procedimientos adecuados y materiales conocidos en la tecnica. Los materiales, procedimientos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no estan destinados a ser limitantes.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y a partir de las figuras y de las reivindicaciones.

Descripcion de los dibujos

La FIG 1 es una curva de caractensticas operativas del receptor (ROC) del segundo estudio prospectivo, aleatorizado de evaluacion de la supervivencia con amlodipina (PRAISE-2), que ilustra las caractensticas de la poblacion del estudio, edad, peso, altura, IMC, fraccion de eyeccion ventricular izquierda (LVEF), creatinina, ST2t1, norepinefrina (NEt1), epinefrina (Et1), dopamina (DAt1), angiotensina (ANGtl), malondialdetudo (MDAtl), adrenolutina (ADRtl), ANPtl y BNPtl. "t1" se refiere a un nivel tomado una primera vez.

La FIG. 2 es una curva ROC para BNP y la proporcion de ST2 Ratio en el estudio PRAISE-2; las dos medidas tienen una AUC similar, siendo la de BNP algo mayor.

La FIG 3 es una curva ROC para la utilidad pronostica de BNP y la proporcion ST2 en individuos de IMC alto, en este caso la proporcion de sT2 tiene una AUC mayor.

La FIG. 4 es un grafico de cajas de los niveles de ST2 en sujetos con varios IMC (< 25, 25-29, y > 30), que muestra que no existe una diferencia significativa en los niveles de ST2 entre los IMC.

Las FIG. 5A-B son graficos de cajas que ilustran la Tasa de Filtracion Glomerular (GFR, 5A) media y los niveles de ST2 (5B) en una poblacion de sujetos con insuficiencia renal de moderada a grave.

La FIG. 6 es un grafico de barras que ilustra la distribucion de los niveles de ST2 en la poblacion descrita en el Ejemplo 3, que muestra que la gran mayona de sujetos en la poblacion tiene niveles de ST2 inferiores a 0,2 ng/ml.

Descripcion detallada

La evaluacion clmica de la enfermedad cardiovascular (ECV) usando peptidos natriureticos (NP) en sujetos con un mdice de masa corporal (IMC) alto o la funcion renal alterada se ve complicado por el hecho de que estos sujetos tienen niveles de peptido natriuretico inferiores a lo esperado para un sujeto “normal” para el mismo nivel de enfermedad. El mecanismo exacto de este fenomeno no se sabe. No obstante, una teona, sin desear que sea limitante, es que los niveles de NP menores en sujetos obesos y con sobrepeso y en sujetos con la funcion renal alterada pueden estar relacionados con los mecanismos de eliminacion para los NP, que pueden tener un componente tanto renal como epitelial. El ST2, aunque posiblemente se produzca de un modo similar a los NP, no sufren estas limitaciones. Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen el uso de ST2 (y/o de IL-33, el ligando de ST2) en estos sujetos especiales, para los que los NP pueden proporcionar informacion erronea.

Metodologia general

Los procedimientos generales para usar los niveles de ST2 para diagnostico se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. 2004/0048286 de Lee y col.

Los procedimientos descritos en el presente documento son particularmente utiles en poblaciones de sujetos para los que los NP son menos utiles en el diagnostico y pronostico de la ECV. Estos sujetos incluyen los que tienen un IMC alto, por ejemplo sujetos con sobrepeso (IMC de 25-29) o sujetos obesos (IMC > 30). Por tanto, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen determinar el IMC de un sujeto y, si el sujeto tiene sobrepeso o es obeso, seleccionar al paciente (p. ej., seleccionar los sujetos en base a su IMC). Estos sujetos tambien incluyen los que presentan alteracion renal. Por tanto, en algunas realizaciones, los procedimientos incluyen determinar si un sujeto tiene la funcion renal alterada y si el sujeto tiene la funcion renal alterada, seleccionar al paciente.

En general, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen evaluar los niveles de ST2 en una muestra biologica (p. ej., sangre, suero, plasma, orina o muestra de tejido corporal) y, opcionalmente, de BNP y/o del dfmero D en un sujeto, por ejemplo un mairnfero, por ejemplo un ser humano. Estos niveles proporcionan informacion sobre la presencia de ECV, por ejemplo IC y/o EP, en un sujeto. Por ejemplo, un diagnostico de ECV, por ejemplo IC en un sujeto con un nivel ambiguo de BNP, se puede confirmar mediante la presencia de niveles elevados de ST2 y bajos del dfmero D. Un diagnostico de ECV, por ejemplo EP en un sujeto con un nivel ambiguo del dfmero D, se puede confirmar mediante la presencia de niveles elevados de ST2 y bajos de BNP.

La evaluacion de los niveles circulantes de ST2, BNP o dfmero D en un sujeto normalmente incluye una muestra biologica del sujeto, por ejemplo suero o sangre. Los niveles de ST2, BNP y dfmero D en la muestra se pueden determinar midiendo los niveles de polipeptido en la muestra usando procedimientos conocidos en la tecnica y/o descritos en el presente documento, por ejemplo inmunoensayos, tales como ensayos de inmunosorcion ligada a enzimas (ELISA). Como alternativa, los niveles de ARNm de ST2, BNP y dfmero D se pueden medir, de nuevo usando procedimientos conocidos en la tecnica y/o descritos en el presente documento, por ejemplo mediante PCR cuantitativa y analisis de transferencia Northern.

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Un anticuerpo que “se une espedficamente” a un antigeno, se une preferentemente al antigeno en una muestra que contiene otras protemas. El termino “anticuerpo”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de inmunoglobulina o parte inmunologicamente activa de la misma, es decir una porcion de union a antigeno. Ejemplos de partes inmunologicamente activas de las moleculas de inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab) y F(ab')2 que se pueden generar tratando el anticuerpo con una enzima como, por ejemplo, pepsina. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, recombinante, por ejemplo quimerico o humanizado, completamente humano, no humano, por ejemplo murino, monoespedfico o monocatenario. En algunas realizaciones tiene una funcion efectora y puede fijar el complemento.

Una “sonda” es un acido nucleico que tiene una longitud de al menos 10, y menos de 200 (habitualmente menos de aproximadamente 100 o 50) pares de bases. Una sonda que “se une espedficamente a” un acido nucleico diana hibrida con la diana en condiciones de rigurosidad alta. Como se usa el presente documento, la expresion “hibrida en condiciones de rigurosidad alta” describe condiciones de hibridacion y lavado. Como se usa el presente documento, condiciones de rigurosidad alta son fosfato sodico 0,5M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o mas lavados de 0,2X de SSC, SDS al 1% a 65 °C. Los expertos en la tecnica conocen procedimientos para realizar ensayos de hibridacion de acido nucleico y se pueden encontrar en Ausubel y col., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

La deteccion se puede facilitar por acoplamiento (p. ej., pegar ffsicamente) del anticuerpo o la sonda a una sustancia detectable (p. ej., marcaje de anticuerpo). Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostetico adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, rodamina, diclorotriazinilamina fluorescema, cloruro de dansilo, puntos cuanticos o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa,

J 1 J J 1 125 131 35 3 J

luciferina y acuorina, y ejemplos de materiales radioactivos adecuados incluyen I, I, S o H.

Se pueden usar ensayos diagnosticos con matrices biologicas, tales como celulas vivas, extractos celulares, lisados celulares, celulas fijadas, cultivos celulares, fluidos corporales o muestras forensicas. Anticuerpos conjugados para fines diagnosticos o kits incluyen anticuerpos acoplados a pigmentos, isotopos, enzimas y metales, vease, por ejemplo, Le Doussal y col., New Engl. J. Med. 146:169 175 (1991); Gibellini y col., J. Immunol. 160:3891-3898 (1998); Hsing y Bishop, New Engl. J. Med. 162:2804-2811 (1999); Everts y col., New Engl. J. Med. 168:883-889 (2002). Existen varios formatos de ensayo, tales como radioinmunoensayos (RIA), ELISA y lab en un chip (patente de EE.UU. n° 6.176.962 y 6.517.234).

En los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar tecnicas conocidas en bioqmmica y biologfa molecular (vease, por ejemplo, Maniatis y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Sambrook y Russell, Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Wu, Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif (1993); y Ausbel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley y Sons, Inc, New York, N.Y. (2001)).

Una vez que se ha determinado el nivel de ST2, el nivel se puede comparar con un nivel de referencia o correlacionar directamente con un valor conocido que corresponde a la presencia o ausencia de ECV. Por ejemplo, el nivel de referencia representara un nivel umbral, por encima del cual el sujeto tiene ECV, por ejemplo SCA, PE o IC, y/o tiene una gravedad dada de una ECV, por ejemplo SCA, IC o EO, por ejemplo enfermedad grave. El nivel de referencia escogido puede depender de la metodologfa usada para medir los niveles de ST2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuando los niveles circulantes de ST2 solubles se determinan usando un inmunoensayo, por ejemplo como se ha descrito en el presente documento, el nivel de referencia es de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml, por ejemplo 0,20, 0,23 o 0,29 ng/ml de suero, y un nivel de ST2 superior al nivel de referencia indica que el sujeto tiene ECV, por ejemplo SCA, EP o IC, y/o tiene ECV grave, por ejemplo SCA, EP o IC grave; estos niveles de referencia se aplican cuando los niveles se determinan usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 del presente documento. Por ejemplo, el nivel de referencia es un intervalo de niveles.

Los procedimientos descritos en el presente documento incluyen determinar los niveles de IL-33 ademas de, o como alternativa a, los niveles de ST2. Por ejemplo, se determinan los niveles tanto de ST2 como de IL-33 y la informacion de la comparacion de ambos biomarcadores con sus respectivos niveles de referencia proporciona una informacion acumulada sobre la presencia de ECV y/o la presencia de ECV grave en el sujeto. Por ejemplo, la proporcion entre ST2 e IL-33 puede determinarse y la proporcion compararse con una proporcion de referencia que representa una proporcion umbral por encima de la cual el sujeto tiene ECV y/o tiene ECV grave. Como alternativa o ademas de, la presencia y/o niveles de los complejos IL33/ST2 se pueden determinar y comparar con un nivel de referencia para proporcionar informacion sobre la presencia de ECV, por ejemplo SCA, EP o IC, en un sujeto, por ejemplo los niveles del complejo superiores a un umbral seleccionado indicana que el sujeto tiene ECV, por ejemplo SCA, EP o IC.

En algunas realizaciones, los procedimientos incluyen el uso de procedimientos diagnosticos adicionales. Se puede

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usar cualquier procedimiento diagnostico conocido en la tecnica y un experto en la tecnica podra seleccionar procedimientos diagnosticos que sean adecuados para los smtomas del sujeto. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen otros procedimientos diagnosticos ademas de, o como alternativa a, la medicion de otros biomarcadores, por ejemplo mediciones ffsicas de la funcion pulmonar o la funcion ca^aca, como se conocen en la tecnica.

Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento pueden tambien incluir medir los niveles de ST2, opcionalmente de BNP y/o dfmero D, y uno o mas biomarcadores adicionales, por ejemplo biomarcadores que ayudan al diagnostico del sujeto. Como ejemplo, para un sujeto con dolor toracico o disnea se pueden medir los biomarcadores indicativos de enfermedad cardfaca o cardiovascular, por ejemplo troponina cardfaca (cTn), por ejemplo cTnl o cTnT, NT-proBNP, proBNP, NT-proANP, proANP, y/o ANP; como alternativa, o ademas de, se pueden medir biomarcadores adicionales de enfermedad pulmonar. Por tanto, en sujetos que presentan con smtomas que incluyen IM en sus diagnosticos diferenciales, los procedimientos pueden incluir la medicion de niveles de cTnl, para determinar si el sujeto esta sufriendo un IM. Un experto en la tecnica apreciara que hay una serie de procedimientos diagnosticos adicionales que se pueden usar, en funcion de la situacion y del estado del sujeto.

En el presente documento tambien se incluyen kits que incluyen un reactivo para la deteccion de los polipeptidos o acido nucleico de ST2. BNP y dfmero D, por ejemplo anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen espedficamente a uno de los polipeptidos de ST2, BNP y dfmero D), o sondas de acido nucleico (es decir, sondas que son complementarias de todo o parte de uno de los acidos nucleicos de ST2, BNP y dfmero D) e instrucciones de uso en un procedimiento descrito en el presente documento.

Los procedimientos descritos en el presente documento son utiles en el diagnostico de sujetos con ECV, por ejemplo SCA, EP o IC. En los procedimientos descritos en el presente documento, si un sujeto con sobrepeso u obeso (p. ej., un sujeto con un IMC de 25-29 o 30 o superior) tiene niveles ambiguos, por ejemplo bajos o moderados, de BNP (es decir < 500 pg/ml de suero), de dfmero D inferiores a 500 |ig/l en plasma y elevados de ST2 (p. ej., niveles por encima de una referencia, por ejemplo 0,2 ng7ml de suero), se puede diagnosticar al sujeto ECV, por ejemplo IC, y se le puede trata en consecuencia, por ejemplo con intervencion quirurgica o farmaceutica, y/o cambio en el estilo de vida, a pesar de los niveles bajos o moderados de BNP.

En los procedimientos descritos en el presente documento, si un sujeto (p. ej., un sujeto con un IMC de 25-29 o 30 o superior) tiene niveles bajos de BNP (es decir < 100 pg/ml en suero), niveles ambiguos del dfmero D, p. ej., 5004000 |ig/l en plasma, y elevados de ST2 (p. ej., niveles por encima de una referencia, por ejemplo 0,2 ng/ml de suero), se puede diagnosticar al sujeto ECV, por ejemplo EP, y se le puede tratar en consecuencia, por ejemplo con terapia anticoagulante, a pesar de sus niveles ambiguos de dfmero D.

ST2/Receptor de la interleucina 1 de tipo 1 (IL1RL1)

El gen de SR2 es un miembro de la familia de receptores de la interleucina 1, cuyo producto proteico existe en forma transmembrana asf como en forma de un receptor soluble que es detectable en suero (Kieser y col., FEBS Lett. 372(2-3): 189.93 (1995); Kumar y col., J. Biol. Chem. 270(46): 27905-13 (1995); Yanagisawa y col., FEBS Lett. 302(l):51-3 (1992); Kuroiwa y col., Hybridoma 19(2):151-9 (2000)). Recientemente se ha descrito que el ST2 esta marcadamente regulado por incremento en un modelo experimental de insuficiencia cardfaca (Weinberg y col., Circulation 106(23):2961-6 (2002)), y los resultados preliminares sugieren que las concentraciones de ST2 pueden estar elevados en aquellos con IC grave cronica (Weinberg y col., Circulation 107(5):721-6 (2003)) asf como en aquellos con infarto de miocardio agudo (IM) (Shimpo y col., Circulation 109(18):2186-90 (2004)).

Se piensa que la forma transmembrana de ST2 desempena un papel en la modulacion de las respuestas de las celulas T colaboradoras de tipo 2 (Lohning y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95(12):6930-5 (1998); Schmitz y col., Immunity 23(5):479-90 (2005)), y puede desempenar un papel en el desarrollo de tolerancia en estados de inflamacion grave o cronica (Brint y col., Nat. Immunol. 5(4):373-9 (2004)), mientras que la forma soluble de ST2 esta regulada por incremento en fibroblastos con crecimiento estimulado (Yanagisawa y col., 1992, citado anteriormente). Los datos experimentales sugieren que el gen de ST2 esta marcadamente regulado por incremento en estados de estiramiento de miocitos (Weinberg y col., 2002, citado anteriormente) de un modo analogo a lo que ocurre en la induccion del gen del BNP (Bruneau y col., Cardiovasc. Res. 28(10):1519-25 (1994)).

Tominaga, FEBS Lett. 258:301-304 (1989), aislo genes murinos espedficamente expresados por estimulacion del crecimiento en celulas BALB/c-3T3; denominaron uno de estos genes St2 (para el gen 2 expresado por estimulacion del crecimiento). El gen de ST2 codifica dos productos proteicos: ST2 (IL1RL1), que es una forma secretada soluble; y ST2L, un receptor transmembrana que es muy similar a los receptores de la interleucina 1. El Comite de Nomenclatura HUGO designo el homologo humano de ST2, cuya clonacion se describio en Tominaga et al., Biochim. Biophys. Acta. 1171:215-218 (1992), como receptor de interleucina 1 de tipo 1 (IL1RL1). Los dos terminos se usan de forma intercambiable en el presente documento.

La secuencia del ARNm de la isoforma soluble mas corta de ST2 se puede encontrar en GenBank con numero de registro NM_ 003856.2 y la secuencia polipeptfdica esta en GenBank con numero de registro NP_003847.2; la secuencia del ARNm de la forma mas larga del ST2 humano esta en GenBank con numero de registro

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NM_016232.4; la secuencia polipeptidica esta en NP_057316.3. Se dispone de informacion adicional en las bases de datos publicas en GenelD: 9173, MIM ID # 601203 y UniGene No. Hs.66. En general, en los procedimientos descritos en el presente documento se mide la forma soluble del polipeptido ST2.

En la tecnica se conocen procedimientos para detectar y medir el ST2, por ejemplo como se describe en las publicaciones de patente de EE.UU. n° 2003/0124624, 2004/0048286 y 2005/0130136. Los kits para medir el polipeptido ST2 tambien estan disponibles comercialmente, por ejemplo el kit de ELISA para ST2 fabricado por Medical &. Biological Laboratories Co., Ltd. (MBI. International Corp., Woburn, MA), n° 7638. Ademas, en la publicacion de patente de EE.UU. n° 2005/0250156 se describen procedimientos para medir el ST2 y otros biomarcadores.

Por ejemplo, el nivel de ST2 se determina una vez, por ejemplo en la presentacion. En algunas realizaciones, el nivel de sT2 se determina a uno o mas de 2, 4, 6, 8, 12, 18 y/o 24 horas, y/i 1-7 dfas despues del inicio de los smtomas.

Por ejemplo, el nivel de ST2 se determina mas de una vez; en este caso, se puede usar la medicion mas elevada. En algunas realizaciones en las que el nivel de ST2 se determina mas de una vez se puede usar el nivel mas elevado o se puede usar el cambio en los niveles. Los niveles de ST2 tambien se pueden determinar multiples veces para evaluar la respuesta de un sujeto a un tratamiento. Por ejemplo, se puede comparar un nivel de sT2 tomado tras la administracion de un tratamiento, por ejemplo una o mas dosis o ciclos de un tratamiento, con los niveles de ST2 antes de iniciar el tratamiento, por ejemplo un nivel basal. El cambio en los niveles de ST2 indicana si el tratamiento era eficaz; por ejemplo, una reduccion de los niveles de ST2 indicana que el tratamiento era eficaz.

Por ejemplo, los procedimientos incluyen determinar la identidad de la secuencia de nucleotidos en RefSNP ID:rs1041973.

Interleucina-33 (IL-33)

En los procedimientos descritos en el presente documento se pueden medir los niveles de IL-33 en lugar de o ademas de los niveles de ST2.

Recientemente se ha identificado a la IL-33 como el ligando de ST2 y se ha descrito la presencia de mayores niveles de IL-33 en varios trastornos inflamatorios (vease Schmitz y col., Immunity 23(5):479-90 (2005); publicacion de patente de EE.UU. n° 2005/0203046). Tambien se puede determinar la proporcion entre ST2 e IL-33.

La protema IL-33 se expresa en forma de molecula inactiva, pre-IL-33, que se activa tras la escision producida por la caspasa I, que tiene como resultado un peptido de IL-33 activo asf como el producto peptfdico de la escision, pro-IL- 33. Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen medir uno, dos o las tres formas de IL-33 madura, pre-IL33 y/o pro-IL33, todos ellas incluidas en el termino "IL-33".

La secuencia de acido nucleico de IL-33 se puede encontrar en GenBank con numero de registro NM_033439.2, y la secuencia de polipeptidos esta en GenBank con numero de registro NP_254274.1. Se dispone de informacion adicional en las bases de datos publicas en GeneID: 90865, MIM ID # *608678, y UniGene No. Hs.348390, la IL-33 tambien se conoce como marco de lectura abierto 26 en el cromosoma 9 (C9ORF26); factor nuclear de venulas endoteliales altas (NFHEV) e interleucina 33. Vease tambien Backkevold y col., Am. J. Path. 163: 69-79 (2003).

Procedimientos para medir los niveles del polipeptido IL-33 y de acido nucleico se conocen en la tecnica, vease, por ejemplo, Schmitz y col., Immunity 23(5):479-90 (2005); publicacion de patente de EE.UU. n° 2005/0203046.

indice de Masa Corporal (IMC)

La obesidad influye en la expresion de BNP en la IC cronica. Se sabe que hay una relacion inversa significativa entre el mdice de masa corporal (IMC) y los niveles de BNP.

El IMC se determina mediante el peso en relacion con la altura y equivale al peso de la persona en kilogramos dividido por la altura en metros cuadrados (IMC= kg/m2). En la Tabla 2 se proporcionan las interpretaciones aceptadas.

Tabla 2

Categoria: IMC

Bajo peso: < 18,5

Peso normal: 18,5-24,9

Sobrepeso: 25-29,9

Obeso: > 30

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Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir determinar la altura de un sujeto, determinar el peso de un sujeto y calcular el IMC a partir de los valores determinados de este modo. Como alternativa, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir revisar el historial medico de un sujeto para determinar su IMC.

En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir seleccionar sujetos que tienen un IMC de 30 o superior (es decir, sujetos obesos).

Funcion renal

Las medidas de la funcion renal pueden incluir resultados de creatinina en suero, asf como la tasa de filtracion glomerular (TFG) estimada (vease, por ejemplo, Levey y col., Ann. Intern. Med. 130(6):461-70 (1999)). Normalmente, la alteracion renal se clasifica en tres grados, que se muestran en la Tabla 3,

Tabla 3

Grado: TFG (ml/minuto) Creatinina en suero (^mol/litro)

Leve: 20-50 150-300

Moderado: 10-20 300-700

Grave: < 10 > 700

Por tanto, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir determinar los niveles de creatinina en suero de un sujeto y la TFG. Como alternativa, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir revisar el historial medico de un sujeto para determinar sus niveles de creatinina en suero y/o la TFG.

BNP

El peptido natriuretico de tipo B (BNP) es un marcador de insuficiencia cardfaca. Los niveles de BNP se puede determinar en, por ejemplo, sangre entera o suero, usando la metodologfa estandar. Por ejemplo, se dispone comercialmente de una serie de kits de ensayo, por ejemplo el Triage BNP Test (Biosite, inc., San Diego, CA), un ensayo en el lugar de la atencion en sangre entera o plasma y producir resultados en aproximadamente 15 minutos; un inmunoensayo de tipo sandwich quimioluminiscente (Bayer HealthCare Diagnostics, Tarrytown, NY) para BNP que es nm en las plataformas ADVlA Centaur y ACS:180; un inmunoensayo basado en micropartfculas (Abbott Laboratories, Abbott Park, lL) para BNP que se realiza en la plataforma AxSYM; y un ensayo inmunoenzimatico quimioluminiscente (Biosite, Inc., San Diego, CA) para BNP que se realiza en las siguientes plataformas Beckman Coulter: Access, Access 2, Synchron LXI y the UniCel DXI. Existe un ensayo electroquimioluminiscente (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) para medir el NT-proBNp.

Los intervalos de referencia para BNP y NTproBNP vanan en funcion de una serie de factores. Los siguientes intervalos son para usar cuando los niveles de BNP se miden usando un procedimiento de tipo ELISA y un experto en la tecnica podra determinar que niveles obtenidos usando otros procedimientos son equivalentes. Si el nivel de BNP es > 500 pg/ml, la IC es muy probable. Los niveles de BNP de 100-500 pg/ml a menudo se describen como una "zona gris", en la que el diagnostico es menos seguro. En sujetos delgados, si los niveles de BNP < 100 pg/ml, es improbable la IC, no obstante, la obesidad influye sobre la expresion de BNP en la IC cronica (Mehra y col., J Am Cell Cardiol. 43(9):1590-1595 (2004)), por lo que niveles < 100 pg/ml no descartan la insuficiencia cardfaca en sujetos obesos (Sliver y col., Cong. Heart Fail. 10(5 suppl. 3):1-30 (2004)).

Dimeros D

Un dfmero D es un producto final estable de la degradacion de la fibrina. Niveles mayores de dfmeros D en sangre se asocian con mayor formacion de fibrina y fibrinolisis y, por tanto, son diagnosticos de afecciones asociadas con estos procedimientos.

En la tecnica se conocen procedimientos para determinar los niveles de dfmero D en sangre. Entre los kits de ensayo disponibles comercialmente se incluyen VIDAS D-Dimer Exclusion (bioMerieux, Durham, NC) un ELISA rapido ya automatizado; Minutex® D-dimer, Biopool Auto-Dimer™ (un ensato inmunoturbidimetrico automatizado para la lectura por los analizadores a longitudes de onda de 540 - 880 nm), MiniQuant™, AMAX Auto D-Dimer™ (ensayo automatizado del dfmero D para instrumentos AMAX), y ensayos Accuclot D-Dimer™ (un ensayo semicuantitativo) (Trinity Biotech, Bray, Co. Wicklow, Irlanda); y el ensayo HemosIL™ D-Dimer (Instrumentation Laboratory, distribuido por Beckman Coulter), un ensayo inmunoturbidimetrico completamente automatizado.

Niveles en plasma del dfmero D superiores a 4000 |ig/ml se correlacionan considerablemente con la presencia de EP aguda y los niveles inferiores a 500 se pueden usar para descartar EP (vease, por ejemplo, Perrier y col., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156(2):492-496 (1997)). Niveles en plasma del dfmero D de 500-4000 |ig/l son mas

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ambiguos debido al numero de afecciones que activan los procesos de coagulacion y fibrinolftico.

Otros biomarcadores

Los procedimientos descritos en el presente documento tambien pueden incluir la medicion de niveles de otros biomarcadores ademas de ST2 y/o IL-33. Biomarcadores adecuados incluyen NT-proBNP, proBNP, BNP, NT- proANP, proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, dfmeros D (productos de degradacion de fibrina reticulada cuyo nivel se eleva tras la formacion de coagulos), BUN (nitrogeno ureico en sangre), enzimas de la funcion hepatica, IL-6 y/o endotoxina bacteriana. En la tecnica se conocen procedimientos para medir estos biomarcadores, vease, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE.UU. n° 2004/0048286 y 2005/0130136 de Lee y col.; Dhalla y co., Mol. Cell Biochem. 87:85-92 (1989); Moe y col., Am. Heart J, 139-587-95 (2000). Las enzimas de funcion hepatica incluyen alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP) y bilirrubina total (BILT).

Por ejemplo, se determinan los niveles de ST2 y de uno o mas biomarcadores adicionales, y la informacion de la comparacion de los biomarcadores con sus respectivos niveles de referencia proporciona informacion acumulada sobre la presencia de ECV en el sujeto y/o el nivel de gravedad de ECV en el sujeto.

Ejemplos

La invencion se describe adicionalmente en los ejemplos siguientes, que no limitan el ambito de la invencion descrita en las reivindicaciones.

Ejemplo 1: Ensayo ELISA de tipo sandwich

Este ejemplo usa el kit de ELISA de ST2 fabricado por Medical & Biological Laboratories Co., Ltd. (MBL International Corp., Woburn, MA), n° 7638. Este kit es un ensayo ELISA de tipo sandwich usando anticuerpos monoclonales para captura y deteccion. Este procedimiento esta destinado para analizar una placa completa de muestras analizadas por duplicado con un factor de dilucion de 1:3 y sigue minuciosamente el protocolo de los fabricantes. Los kits se almacenaran a 4 °C hasta su uso. El procedimiento descrito en este ejemplo esta optimizado para suero o plasma recogido en tubos con anticoagulante citrato o EDTA. El plasma recogido en tubos con anticoagulante heparina no se usara en este ensayo, ya que la heparina se une a sT2 e inhibe la medicion mediante este protocolo de ELISA. Las muestras de plasma o suero se pueden usar frescas o almacenadas congeladas. Este ensayo no se ve afectado de forma adversa por hasta 3 ciclos de congelacion y descongelacion de las muestras de plasma.

Los reactivos deberan prepararse frescos a partir de un kit nuevo inmediatamente antes de realizar los ensayos. Dejar el kit equilibrar hasta temperatura ambiente antes de usar. Los reactivos no tratados explfcitamente mas adelante son proporcionados listos para usar por el fabricante.

1. Solucion de lavado- el fabricante suministra la solucion de lavado como una solucion concentrada 10X. Para hacer 1 litro de solucion de lavado, diluir 100 ml del concentrado 10X proporcionado con 900 ml de agua destilada.

2. Solucion de deteccion- la solucion de deteccion se prepara diluyendo el concentrado detector a 1:101 con el diluyente detector. Para una placa completa de 96 pocillos se requieren 10 ml de solucion de deteccion. Para preparar 10 ml de solucion de deteccion, use una pipeta para transferir ml del diluyente detector de color azul a un tubo de polipropileno de tapa naranja 15 ml. Anadir 100 |il del concentrado de deteccion a este volumen del diluyente detector.

a. NOTA: este reactivo se debera preparar durante la primera etapa de incubacion del ensayo.

3. Reserva de calibracion- reconstituir la protema calibradora disolviendo la protema liofilizada en la cantidad de agua destilada definida por el fabricante para este lote de fabricacion, para dar una solucion de reserva de 8 ng/ml. Esta especificacion del volumen esta incluida en la ficha del producto.

Preparacion de patrones y muestras:

• Lo siguiente se preparara en tubos de polipropileno marcados de 1,5 ml para transferir a la placa de ensayo con el pipeteador P200.

Patrones:

La curva estandar se prepara fabricando diluciones en serie de 2 de la solucion de reserva de 8 ng/ml.

1. Usando una pipeta P1000, transferir 250 |il del diluyente de ensayo a 8 tubos de polipropileno de 1,5 ml marcados S1-S8.

2. Usando la misma pipeta P1000, transferir 250 |il de la solucion de reserva de Calibracion de 8 ng/ml al tubo S1. Este tubo es ahora la protema de calibracion de 4 ng/ml.

a. Mezclar perfectamente pipeteando suavemente 3 veces tomando precauciones para no crear burbujas.

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3. Usando la misma pipeta P1000 y una punta nueva para cada uno reactivo del tubo S1 al tubo S2, repetir la mezcla.

4. Repetir la etapa 3 para S2 a s3, S3 a S4, S4 a S5, S5 a S6 y S6 a tanto no se transferira la protema de calibracion a este pocillo.

a Ahora, los tubos S1-S6 y S8 tendran 250 |il del reactivo y el tubo S7 tendra 450 |il

Muestras

La placa se prepara de modo que cada muestra se analiza como su dilucion 1:3 por duplicado. En la Tabla 4 a continuacion se muestra un ejemplo de organizacion.

1. Marcar un tubo de polipropileno de 1,5 ml para cada muestra.

2. Usando una pipeta P200, transferir 160 |il del diluyente de ensayo a cada tubo.

3. Usando una pipeta P200, transferir 80 |il o suero o plasma de la muestra 1 al tubo 1. Mezclar cuidadosamente pipeteando 3 veces sin formar burbujas.

4. Continuar transfiriendo muestras a los tubos de muestras repitiendo la etapa 2 para cada muestra. Procedimiento:

1. Usando la pipeta P200, transferir los patrones y las muestras de suero diluido rapidamente a la placa de ensayos de 96 pocillos.

a. Fijar la pipeta P200 para 100 |il

b. Transferir 100 |il de las diluciones de la curva estandar a cada una de las columnas 1 y 2 en la placa de ensayo

c. Transferir 100 |il de cada una de las muestras de suero a la placa de ensayo en exactamente las mismas posiciones que se muestran en el mapa de la placa siguiente.

2. Cubrir la placa de ensayo con la tapa proporcionada a tal efecto e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

3. Usando el autolavador de placas, lavar las placas 4 veces.

4. Detector: Usando la pipeta multicanales de 8 canales transferir 100 |il de la solucion de deteccion a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

a. NOTA: este reactivo se debera preparar durante la primera etapa de incubacion.

b. NOTA: usar un vaso de reactivos desechable para esta adicion de reactivo. usar SIEMPRE un vaso de reactivos desechable fresco para cada reactivo. No es necesario cambiar las puntas de la pipeta durante esta etapa.

5. Lavar la placa como en la etapa 3

6. Sustrato: usando la pipeta multicanales de 8 canales transferir 100 |il del sustrato a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

a. El fabricante del reactivo del sustrato lo proporciona listo para usar.

7. Terminacion: Al finalizar la incubacion del sustrato usando la pipeta de multiples canales de 8 canales, transferir 100 |il de la solucion de terminacion a cada pocillo.

a. El fabricante del reactivo Solucion de Terminacion lo proporciona listo para usar.

8. Leer la placa a 450 nm con correccion de fondo a 620 nm.

a. La placa se leera en un plazo de 30 minutos despues de detener la reaccion.

9. Introducir las lecturas de absorbancia en la hoja de calculo proporcionada para el analisis.

Tabla 4 Mapa de placa de ensayo de 96 pocillos de Ejemplo

de los siguientes, transferir 250 |il del S7, S8 sera el blanco del reactivo, por

: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A: 4,0 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33

B: 2,0 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34

C: 1,0 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35

D: 0,5 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36

(continuacion)

: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

E: 0,25 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37

F: 0,125 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38

G: 0,0625 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39

H tb: 0,0 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40

Ejemplo 2: PRAISE-2

El segundo estudio aleatorizado y prospectivo de evaluacion de supervivencia con amlodipina (PRAISE-2) fue un 5 ensayo aleatorizado, doble ciego, de diseno prospectivo para identificar predictores de ecocardiograffa de la supervivencia entre pacientes con miocardiopatfa no isquemica e insuficiencia cardfaca y para determinar los componentes de la informacion ecocardiografica y pronostica con respecto a la informacion basal demografica y clmica (Cabell y col., Am. Heart J. 147(1):151-7 (2004)). En el estudio ecocardiografico PRAISE-2 participaron cien pacientes; de ellos, 93 teman analisis ecocardiograficos fallidos e interpretables. Se extrajeron muestras de suero 10 basales y a las 2 semanas y se determinaron los niveles de IL1RL1 como se describe en el Ejemplo 1.

El analisis de la curva de las caractensticas operativas del receptor (ROC) se realizo usando el software Analyse-It (Analyse-It, Ltd, Leeds. Reino Unido). La curva ROC se muestra en la Figura 1 y la informacion de la AUC (area bajo la curva) para los parametros de la muestra que se muestran en la Figura 1 se proporciona en la Tabla 5 siguiente. El analisis de la ROC proporciona un resumen de todos los marcadores evaluados por su valor pronostico en la 15 situacion basal (II). Una AUC indicana un resultado neutro; cualquier resultado por encima de 0,5 indica un incremento de la precision de la prediccion en base a dicha medicion, mientras que un resultado inferior a 0,5 indica una perdida de precision (es decir, la variabilidad es alta para dicho marcador) y ausencia de correlacion con el parametro medido.

Tabla 5: Resultados de la ROC del PRAISE

Variable: AUC p

Edad: 0,620 0,027

Altura: 0,562 0,250

Peso: 0,425 0,168

IMC: 0,391 0,043

LVEF: 0,421 0,146

Creatinina: 0,599 0,066

ST2t1: 0,611 0,040

NEt1: 0,632 0,015

Et1: 0,496 0,941

DAt1: 0,637 0,012

ANGt1: 0,471 0,587

MDAt1: 0,541 0,451

ADRr1: 0,504 0,934

ANPt1: 0,811 0,000

BNPt1: 0,779 0,000

El valor de ST2 para prediccion del criterio de valoracion se comparo con otros marcadores en tres grupos de IMC.

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Los resultados, mostrados en la Tabla 6, indican que para los pacientes con un IMC alto, el ST2 (p. ej., la proporcion de ST2) es un predictor mas fuerte que BNP. Los numeros negativos en el grupo del peso de en medio para ST2 pueden deberse a la presencia de niveles anomalos en algunos sujetos.

Tabla 6: Prediccion del criterio de valoracion PRAISE en 3 grupos de IMC

Grupo de IMC: Predictor R S.E. Sig.

Menor de 25: Log BNP tiempo 0 2,472 1,301 0,058

Edad: 0,032 0,032 0,319

Sexo: 0,274 0,986 0,781

Proporcion ST2: 3,094 1,997 0,121

25 a 30:: Log BNP tiempo 0 4,031 1,467 0,006

Edad: 0,042 0,037 0,258

Sexo: -0516 0-960 0,591

Proporcion ST2: -0,764 1,643 0,642

Mayor de 30: Log BNP tiempo 0 1,283 0,966 0,184

Edad: 0,008 0,039 0,844

Sexo: -2,128 1,056 0,044

Proporcion ST2: 6,581 2,539 0,010

La ROC de PRAISE para BNP y la proporcion de ST2 tambien se calcularon. Los resultados, mostrados en la Figura 2 y la Tabla 7, indican que la proporcion de ST2 es comparable a BNP en toda la poblacion del PRAISE, que incluyo sujetos tanto sin sobrepeso como no obesos, asf como sujetos en los que la IC se habfa estabilizado; los niveles de sT2 tienden a retornar a los valores basales cuando la IC se estabiliza.

Tabla 7: ROC para BNP y proporcion ST2

Predictor: AUC SE p Inferior Superior

BNPt1: 0,783 0,043 0,000 0,698 0,868

Proporcion ST-2: 0,660 0,054 0,004 0,555 0,766

La utilidad pronostica de BNP y de la proporcion de ST2 se calculo para los individuos con un IMC alto; los resultados, mostrados en la Tabla 8 y la Figura 3, demuestran que la proporcion de ST2 es un predictor mejor que BNP en el grupo de IMC alto, ya que tiene una AUC mayor y una correlacion mejor

Tabla 8: Utilidad pronostica para BNP y proporcion de ST2 en IMC alto

Grupo IMC: Predictor AUC BE p Inferior Superior

Menor de 25: BNP basal 0,788 0,077 0,002 0,637 0,939

Proporcion ST2: 0,717 0,082 0,022 0,555 0,878

25-29: BNP basal 0,864 0,055 0,000 0,756 0,972

Proporcion ST2: 0,521 0,097 0,829 0,330 0,711

30 y superior: BNP basal 0,669 0,100 0,102 0,473 0,865

Proporcion ST2: 0,772 0,083 0,009 0,609 0,934

Estos resultados indican que ST2 es predictor del resultado en pacientes con insuficiencia cardfaca compensados cuando se usa como un cambio en el tiempo y proporciona resolucion pronostica adicional en pacientes con un IMC alto.

Ejemplo 3: El ST2 no esta afectado por el IMC

5 En el estudio PRIDE se recluto a 600 sujetos con disnea para analizar la utilidad del NT-proBNP en el diagnostico y pronostico de la insuficiencia cardfaca (IC) aguda. En el reclutamiento se obtuvo una muestra de sangre con enmascaramiento, se proceso y se congelo a -80 °C. Para los fines de analisis de ST2 se descongelo una alfcuota de sangre citada (segundo ciclo de congelacion-descongelacion) y se analizo la concentracion de la protema ST2- El efecto del IMC sobre los niveles de ST2 se analizo.

10 Los resultados se muestran en la Figura 4 y la Tabla 9. La mediana de los valores de ST2 fue la misma en los tres grupos de IMC y el IIC fue casi identico tambien.

Tabla 9: IMC y niveles de ST2

IMC: ST2 (mediana, ng/ml) Intervalo intercuartilico (ng/ml)

< 25 (n= 77): 0,56 0,31-1,39

25-29,9 (n= 65): 0,46 0,23-1,13

>30 (n= 66): 0,48 0,23-1,04

Estos resultados demuestran que, al contrario que BNP, los niveles de ST2 no estan afectados por el IMC.

15 Ejemplo 4- Las concentraciones de ST2 no estan afectadas por la insuficiencia renal

El efecto de la alteracion renal sobre las concentraciones de ST2 se evaluo en una poblacion de 135 pacientes con insuficiencia renal moderada o grave. Ninguno de los pacientes estaba recibiendo dialisis y a ninguno se le habfa diagnosticado anteriormente ECV. Todos los pacientes fueron evaluados usando la tasa de filtracion glomerular (TFG en ml/min) determinada mediante el procedimiento de la Modificacion de la dieta en la nefropatfa (MDRD) 20 como medida de la funcion renal. En cada sujeto tambien se realizaron determinaciones ecocardiograficas y del calcio en las arterias coronarias (CA) para detectar ECV latente. Tambien se evaluaron multiples biomarcadores.

La estadfstica descriptiva para esta cohorte se muestra en la Tabla 10; la TFG media y el ST2 se ilustran graficamente en las Figuras 5A-B.

Tabla 10: Tasa de filtracion glomerular (TFG) y niveles de ST2

: TFG Niveles de ST2 (ng/ml)

Media: 34,5 0,122

Mediana: 34 0,107

Error tipico: 0,989 0,005

Desviacion tipica: 11,4 0,059

Coeficiente de variacion: 33,3 48,346

IC 95 % inferior: 32,5 0,112

IC 95 % superior: 36,4 0,132

Percentil 25: 27 0,090

Percentil 75: 43 0,127

Mmimo: 8 0,068

Maximo: 59 0,476

Recuento: 135 135

10

En esta cohorte de pacientes con enfermedad cronica estable, solo diez (8 %) ternan niveles de ST2 superiores a 0,2, el mayor de los cuales fue 0,476 ng/ml. Esta distribucion de los valores de ST2 se muestra en la Figura 6. Esto era lo esperado en esta poblacion de sujetos con insuficiencia renal cronica tratada; no se esperaria ver niveles de ST2 muy altos.

Se realizo un analisis de correlacion de Pearson en esta poblacion para determinar si habfa una correlacion entre los niveles de ST2 y la funcion renal, medido mediante TFG o aclaramiento de creatinina. Los resultados se muestran en las tablas 11 y 12.

Tabla 11: Resultados de la correlacion de Pearson- TFG y ST2

Estadistica descriptiva

Variable: Media Desviacion tipica Error tipico N

TFG: 34,5 11,5 0,989 135

ST2 (ng/ml): 0,122 0,059 0,005 135

Matriz de correlacion (R)

: TFG ST2 (ng/ml)

TFG: 1,000 0,028

ST2 (ng/ml): 0,028 1,000

Significacion de correlacion (P)

: TFG ST2 (ng/ml)

TFG: - 0,748

ST2 (ng/ml): 0,748 -

Tabla 12: Resultados de la correlacion de Pearson-Aclaramiento de creatinina y ST2

Estadistica descriptiva

Variable: Media Desviacion tipica Error tipico N

Cribado Cr: 2,175 0,859 0,081 113

ST2 (ng/ml): 0,122 0,058 0,006 113

Matriz de correlacion (R)

: Cribado de Cr ST2 (ng/ml)

Cribado de Cr: 1,000 -0,018

ST2 (ng/ml): -0,018 1,000

(continuacion)

Estadistica descriptiva

Significacion de la correlacion (P)

: Cribado de Cr ST2 (ng/ml)

Cribado de Cr: - 0,851

ST2 (ng/ml): 0,851 -

Estos resultados demuestran que, como era de esperar en esta poblacion de sujetos con insuficiencia renal cronica tratada, no existe una correlacion entre los niveles de ST2 y la TFG (p= 0,75) o el aclaramiento de creatinina (p= 5 0,851) en esta poblacion. Esto indica que la insuficiencia renal, por sf misma, no produce una elevacion de los

niveles de ST2.

Los mismos analisis se llevaron a cabo en una poblacion de 139 sujetos en el hospital San Diego Veteran's Administration Hospital. Todos los sujetos habfan sido diagnosticados previamente de insuficiencia cardfaca aguda descompensada (ICAD) y el nivel medio de ST2 fue aproximadamente dos veces el observado en la poblacion de 10 pacientes con insuficiencia renal cronica, pero no IC (veanse las Tablas 11-12). Existe una correlacion casi ubicua entre la insuficiencia renal y la insuficiencia cardfaca, con una confluencia de casi el 80 % de los pacientes con IC en estadio III/IV que tambien tiene la funcion renal alterada (Fonarow y Heywood, Am. J. Med. (2006) 119(12A):S17- S25). Por tanto, dado que la ICAD se correlaciona con los niveles de ST2, cabna esperar ver una correlacion entre la insuficiencia renal (medida mediante la TFG) y los niveles de ST2. Esto es exactamente lo que se observo, como 15 se muestra en las Tablas 13 y 14.

Tabla 13: Resultados de la correlacion de Pearson- TFG y ST2 en la ICAD

Estadistica descriptiva

Variable: Media Desviacion tipica Error tipico N

TFG: 59,1 25,3 2,143 139

ST2 (ng/ml): 0,283 0,332 0,028 139

Matriz de correlacion (R)

: TFG ST2 (ng/ml)

TFG: 1,000 -0,062

ST2 (ng/ml): -0,062 1,000

Significacion de la correlacion (P)

: TFG ST2 (ng/ml)

TFG: 0,470

ST2 (ng/ml): 0,470 -

5

10

15

20

25

Tabla 14: Resultados de la correlacion de Pearson- TFG y proporciones de ST2 en la ICAD

Estadistica descriptiva

Variable: Media Desviacion tipica Error tipico N

TFG: 59,1 25,3 2,143 139

Proporcion ST2: 1,038 3,038 0,258 139

Matriz de correlacion (R)

: TFG Proporcion ST2

TFG: 1,000 -0,161

Proporcion ST2: -0,161 1,000

Significacion de la correlacion (P)

: TFG ST2 (ng/ml)

TFG: - 0,058

Proporcion ST2: 0,058 -

Estos resultados demuestran que, en los sujetos con ICAD, los valores de ST2, se representen como un nivel unico o como una proporcion, se correlacionan con medidas de insuficiencia renal, pero son independientes de la insuficiencia renal; por tanto, no existe una relacion causal entre los dos. En su lugar, ambas variables estan relacionadas e interaccionan de forma independiente con un tercer parametro (en este caso, insuficiencia cardfaca).

OTRAS REALIZACIONES

Debe entenderse que aunque la invencion se ha descrito junto con la descripcion detallada de la misma, con la anterior descripcion se pretende ilustrar, y no limitar, el alcance de la invencion, que esta definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La divulgacion se describe adicionalmente en el presente documento en las clausulas siguientes:

1. Un kit para diagnosticar enfermedades cardiovasculares (ECV), comprendiendo el kit anticuerpos que se unen espedficamente a ST2, BNP y el dfmero D, o a sondas de acido nucleico que se unen espedficamente a acidos nucleicos que codifican ST2, BNP y el dfmero D, e instrucciones de uso en un procedimiento de diagnostico de insuficiencia cardiaca (IC) o una embolia pulmonar (EP) en un sujeto que presenta uno o los dos de (i) un mdice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25, o (ii) la funcion renal alterada.

2. Un procedimiento de diagnostico de la enfermedad cardiovascular (ECV) en un sujeto que tiene uno o ambos de (i) mdice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25, o (ii) la funcion renal alterada, comprendiendo el procedimiento:

uno o los dos de:

(A) determinar el IMC del sujeto y, su el IMC del sujeto es igual o superior a 25, seleccionar al sujeto; o

(B) evaluar la funcion renal del sujeto y, si el sujeto tiene la funcion renal alterada, seleccionar al sujeto; y

determinar los niveles de BNP, dfmero D y ST2 en una muestra biologica del sujeto;

en el que el nivel de BNP, el nivel de dfmero D y el nivel de ST2 del sujeto indica si el sujeto tiene ECV.

3. El kit de la clausula 1 o el procedimiento de la clausula 2, en el que la ECV es insuficiencia cardfaca (IC) o embolia pulmonar (EP).

4. El kit de la clausula 1 o el procedimiento de la clausula 2, en el que el nivel de BNP, el nivel del dfmero D y el nivel de ST2 se detectan en una muestra biologica que comprende sangre, plasma o suero.

5. El procedimiento de la clausula 2, en el que si el nivel de BNP del sujeto es inferior a 500 pg/ml y el nivel del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

d^ero D es inferior a 500 |ig/l, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2 indica si el sujeto tiene IC.

6. El procedimiento de la clausula 2, en el que si el nivel de BNP del sujeto es inferior a 100 pg/ml y el nivel del dfmero D es 500-4000 |ig/l, la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2 indica si el sujeto tiene EP.

7. El procedimiento de la clausula 5, en el que el nivel de referencia de ST2 representa un nivel en un sujeto que no tiene IC.

8. El procedimiento de la clausula 5, en el que el nivel de referencia de ST2 es de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml en suero y valores por encima de dicho nivel indican la presencia de IC.

9. El procedimiento de la clausula 6, en el que el nivel de referencia de ST2 representa un nivel en un sujeto que no tiene EP.

10. El procedimiento de la clausula 6, en el que el nivel de referencia de ST2 es de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml en suero y valores por encima de dicho nivel indican la presencia de EP.

11. El procedimiento de la clausula 2, en el que el nivel de BNP del sujeto es de 100-500 pg/ml.

12. El procedimiento de la clausula 2, que ademas comprende determinar un nivel en un sujeto de uno o mas biomarcadores adicionales.

13. El procedimiento de la clausula 12, en el que los otros biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en NT-proANP, proANP, ANP, troponina, CRP, creatinina, nitrogeno ureico en sangre (BUN), enzimas de la funcion hepatica, albumina y endotoxina bacteriana.

14. El procedimiento de la clausula 2, en el que la determinacion de si el sujeto tiene la funcion renal alterada comprende determinar la tasa de filtracion glomerular (TFG) y/o el nivel de creatinina en suero y el sujeto tiene la funcion renal alterada si tiene una TFG o un nivel de creatinina en suero de los mostrados en la tabla siguiente:

Grado: TFG (ml/minuto) Creatinina en suero (^mol/litro)

Leve: 20-50 150-300

Moderado: 10-20 300-700

Grave: < 10 > 700

15. El kit de la clausula 1, en el que un sujeto tiene la funcion renal alterada si tienen una TFG inferior a 50 ml/minuto.

16. El kit de la clausula 1 o el procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el sujeto tiene un IMC superior o igual a 30.

17. El kit de la clausula 1 o el procedimiento de la clausula 2, en el que el sujeto tiene un IMC de 25 a 29.

18. Un procedimiento de diagnostico de enfermedad cardiovascular (ECV) en un sujeto con la funcion renal alterada, comprendiendo el procedimiento:

evaluar la funcion renal del sujeto y, si el sujeto tiene la funcion renal alterada, seleccionar al sujeto; y determinar un nivel de ST2 en una muestra biologica del sujeto;

en el que la relacion entre el nivel de ST2 y un nivel de referencia de ST2 indica si el sujeto tiene ECV.

19. El procedimiento de la clausula 18, en el que el nivel de referencia de ST2 representa un nivel en un sujeto que no tiene ECV.

20. El procedimiento de la clausula 18, en el que el nivel de referencia de ST2 es de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng/ml en suero y valores por encima de dicho nivel indican la presencia de ECV.

21. El procedimiento de la clausula 18, en el que el nivel de referencia de ST2 representa un nivel en un sujeto que no tiene ECV.

22. El procedimiento de la clausula 18, en el que la ECV es insuficiencia cardfaca (IC) o embolia pulmonar (EP).

23. El procedimiento de la clausula 18, en el que la muestra biologica comprende sangre, plasma o suero.

24. El procedimiento de la clausula 18, que ademas comprende determinar un nivel en un sujeto de uno o mas biomarcadores adicionales.

25. El procedimiento de la clausula 24, en el que los otros biomarcadores se seleccionan del grupo que consiste en BNP, dfmero D, NT-proANP y ANP, troponina, CRP, creatinina, nitrogeno ureico en sangre (BUN), enzimas de la funcion hepatica, albumina y endotoxina bacteriana.

26. El procedimiento de la clausula 18, en el que la determinacion de si el sujeto tiene la funcion renal alterada comprende determinar la tasa de filtracion glomerular (TFG) y/o el nivel de creatinina en suero y el sujeto tiene la funcion renal alterada si tiene una TFG o un nivel de creatinina en suero de los mostrados en la tabla siguiente:

Grado: TFG (ml/minuto) Creatinina en suero (^mol/litro)

Leve: 20-50 150-300

Moderado: 10-20 300-700

Grave: < 10 > 700

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro de diagnostico de la enfermedad cardiovascular (ECV) en un sujeto que tiene un mdice de masa corporal (IMC) superior o igual a 25, o la funcion renal alterada, comprendiendo el procedimiento:

determinar el IMC del sujeto y, si el IMC del sujeto es igual o superior a 25, seleccionar al sujeto, o evaluar la funcion renal del sujeto y, si el sujeto tiene la funcion renal alterada, seleccionar al sujeto; y determinar los niveles del peptido natriuretico de tipo B (BNP), dfmero D y del receptor de interleucina 1 de tipo 1 (ST2) en una muestra biologica del sujeto;

en el que el nivel de BNP, y el nivel de ST2 del sujeto indican si el sujeto tiene ECV.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la ECV es insuficiencia cardfaca o embolia pulmonar.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el sujeto tiene disnea o dolor toracico.
4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el nivel de ST2 soluble se determina en el momento de la presentacion o 1-7 dfas despues del inicio de los smtomas en el sujeto.
5. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas determinar un nivel en el sujeto de uno o mas de otros biomarcadores seleccionados opcionalmente del grupo que consiste en peptido natriuretico N-terminal proatrial (NT-proANP), peptido natriuretico atrial (ANP), troponina, protema C reactiva CRP, creatinina, nitrogeno ureico en sangre (BUN), enzimas de la funcion hepatica, albumina y endotoxina bacteriana.
6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la determinacion de si el sujeto tiene la funcion renal alterada comprende determinar la tasa de filtracion glomerular (TFG) y/o el nivel de creatinina en suero, y el sujeto tiene la funcion renal alterada si tiene una TFG o un nivel de creatinina en suero de los mostrados en la tabla siguiente:

Grado

TFG (ml/minuto) Creatinina en suero (^mol/litro)

Leve

20-50 150-300

Moderado

10-20 300-700

Grave

< 10 > 700
7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que un sujeto tiene la funcion renal alterada si tiene una TFG inferior a 50 ml/minuto.
8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el sujeto tiene un IMC superior o igual a 30 o el sujeto tiene un IMC de 25 a 29.
9. El procedimiento de la reivindicacion 1, que ademas comprende la determinacion ffsica de la funcion pulmonar o la funcion cardfaca.
10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el nivel de BNP y el nivel de ST2 soluble se detectan en una muestra biologica que comprende sangre, plasma o suero.