ES2564789T3

ES2564789T3 - Métodos para el aislamiento y la expansión de células T reguladoras derivadas de sangre de cordón

Info

Publication number: ES2564789T3
Application number: ES05813998.1T
Authority: ES
Inventors: Wayne R. Godfrey; Carl June
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2004-09-15
Filing date: 2005-09-14
Publication date: 2016-03-29
Anticipated expiration: 2025-09-14
Also published as: EP1796474A2; WO2006031926A9; US9187727B2; US20120282694A1; US9273282B2; JP5409827B2; CA2581063C; US20060062763A1; CA2581063A1; AU2005284793A1; EP1796474A4; JP4974892B2; EP1796474B1; AU2005284793B2; JP2012105664A; WO2006031926A2; WO2006031926A3; JP2008513014A

Abstract

Método para proporcionar células Treg, que son células supresoras potentes, a partir de una población de células sanguíneas con fenotipo CD45RA+, para suprimir la proliferación de células T con una actividad supresora potente mayor del 95% de supresión de reacción mixta de linfocitos alergénica, comprendiendo el método: a) aislar una población de células mononucleares de una muestra de sangre de cordón umbilical humana; b) poner en contacto dicha población de células mononucleares con un anticuerpo que se une específicamente a CD25 en condiciones adecuadas para la formación de un complejo célula mononuclear-anticuerpo; c) separar sustancialmente dicho complejo célula mononuclear-anticuerpo de dicha población de células mononucleares; aislando de ese modo dichas células Treg a partir de una población de células sanguíneas con fenotipo CD45RA+; y d) que comprende multiplicar las células Treg aisladas obtenidas tras c) cultivando dichas células Treg sin células alimentadoras en un medio que comprende un anticuerpo frente a CD3, un anticuerpo frente a CD28 y adicionalmente IL-2.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para el aislamiento y la expansion de celulas T reguladoras derivadas de sangre de cordon Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para proporcionar celulas T reguladoras (Treg) aisladas de sangre de cordon humana.

Antecedentes de la invencion

Las celulas T reguladoras (Treg) CD4+CD25+ que surgen de manera natural pueden restringir o alterar la mayona de los tipos de respuestas inmunitarias (Sakaguchi, 2004, Annu. Rev. Immunol., 22: 531-562). Inicialmente, se describio que las celulas Treg eran cnticas para el control de la autoinmunidad (Sakaguchi, et al, 1995, J. Immunol, 155: 11511164; Shevach, 2000, Annu. Rev. Immunol., 18: 423-449), y se encontro que en la transferencia adoptiva preveman enfermedades autoinmunitarias experimentales. Mas recientemente, se ha mostrado que las Treg suprimen respuestas inmunitarias alogenicas y pueden prevenir el rechazo de trasplantes (Hall, et al., 1998, J. Immunol., 161: 5147-5156; Wood, et al, 2003, Nat. Rev. Immunol, 3: 199-210). Ademas, estas celulas pueden limitar las respuestas inmunitarias antitumorales (Peng L, et al, 2002, J. Immunol, 169: 4811-4821; Gallimore, et al, 2002, Immunology, 107: 5-9) y antimicrobianas (Belkaid Y, et al, 2002, Nature, 420: 502-507). Por tanto, las Treg CD4+CD25+ parecen ser elementos de control centrales de la inmunorregulacion, y la comprension de su biologfa es importante a la hora de realizar esfuerzos dirigidos a manipular terapeuticamente las respuestas inmunitarias.

Las celulas Treg estan mejor caracterizadas en ratones donde constituyen el 5-10% de las poblaciones de celulas T CD4+ de ganglios linfaticos y bazo. Se generan tanto a traves de mecanismos de desarrollo tfmicos centrales en ratones libres de patogenos, como mediante mecanismos de generacion o expansion perifericos escasamente definidos (Apostolou, et al, 2002, Nat. Immunol, 3: 756-763; Shevach et al, 2002, Nat. Rev. Immunol, 2: 389-400). Hasta la fecha, las celulas Treg se han definido principalmente mediante la coexpresion de antfgenos CD4+ y CD25+ en aislamiento nuevo. CD25 asf como otros marcadores de Treg murinas, CTLA4 (CD 152) y GITR (receptor de tipo TNF inducido por glucocorticoides), son todos ellos antfgenos de activacion en celulas T convencionales, y por tanto no son espedficos. FoxP3, una protema nuclear que se piensa que funciona como represor de la transcripcion, es un marcador mas nuevo que se considera que es mas espedfico para las celulas Treg (Ramsdell, et al, 2003, Curr. Opin. Immunol, 15: 718-24). Se demostro que tras la activacion (basada en receptor de celulas T, espedfico de antfgeno o anti-CD3), las celulas Treg no podfan suprimir espedficamente la proliferacion de las celulas T tanto CD4+ como CD8+. El mecanismo de supresion no esta claro, e in vitro, parece requerir un contacto celula-celula. Un resultado funcional de la supresion es la produccion afectada de IL-2 (Thornton, et al, 1998, J. Exp. Med., 188: 287296; Shevach, et al, 2001, Immunol. Rev., 182: 58-67). In vivo, el mecanismo de supresion es mas controvertido demostrando algunos estudios la dependencia de citocinas inmunosupresoras (Asseman, et al., 1999, J. Exp. Med., 190: 995-1004), que no se requieren para la supresion in vitro.

Estudios en modelos de raton de trasplante de medula osea (BMT) han mostrado que las celulas CD4+CD25+ nuevas o expandidas en cultivo pueden retrasar o prevenir la enfermedad (Taylor et al, 2002, Blood, 99: 3493-3499, Hoffmann, et al, 2002, J. Exp. Med., 196: 389-399; Cohen, et al, 2002, J. Exp. Med., 196: 401-406). Estudios anteriores han demostrado que las Treg expandidas de manera policlonal ex vivo durante 10 dfas con anticuerpo anti- CD3 mas IL-2, pueden ser eficaces en la prevencion de la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD; Taylor, et al, 2002, Blood, 99: 3493-3499). La expansion ex vivo de celulas Treg con APC alogenicas irradiadas mas IL-2 exogena tambien es eficaz para suprimir la GVHD (Cohen, et al, 2002, J. Exp. Med., 196: 401-406). En algunos sistemas modelo, las celulas Treg pueden prevenir la GVHD y todavfa permitir los efectos de injerto contra leucemia (GVL) (Edinger, et al, 2003, Nat. Med., 9: 1144-1150; Jones, et al, 2003, Biol. Blood Marrow Transplant, 9: 243-56; Trenado, et al, 2003, J. Clin. Invest., 112: 1688-96). Ademas, estudios en modelos de enfermedad autoinmunitaria de raton han demostrado que las celulas CD4+CD25+ espedficas de antfgeno (TCR transgenico) expandidas en cultivo pueden prevenir o incluso tratar la diabetes (Tang, et al, 2004, J. Exp. Med., 199: 1455-1465). Por consiguiente, las celulas Treg desempenan un papel en la terapia de inmunosupresion clmica en trasplante, ya que las celulas Treg humanas pueden aislarse y expandirse en cultivo para generar un numero suficiente para su infusion in vivo.

Aunque los datos en ratones son muy prometedores, todavfa sigue existiendo el problema practico de aislar celulas Treg puras de sangre humana. En ratones jovenes, las celulas CD4+CD25+ son moderadamente abundantes y el subconjunto CD25+ es facilmente evidente. En seres humanos, las celulas CD25+ no estan tan diferenciadas de una poblacion, ya que existen una poblacion grande y solapante de celulas atenuadas para CD25. Es posible que la copurificacion de celulas T convencionales con Treg sea la base para la actividad supresora moderada o variable observada en estudios de celulas CD4+CD25+ humanas (Baecher-Allan, et al, 2004, Semin. Immunol., 16: 89-98). Se ha notificado que la clasificacion celular por FACS del 1,7% maximo de las celulas que expresan CD25+ (celulas CD25alto) permite el aislamiento de celulas supresoras (Baecher-Allan, et al, 2001, J. Immunol., 167: 1245-1253). Se requirio un enfoque basado en perlas magneticas riguroso para aislar poblaciones de celulas Treg derivadas de sangre de adulto suficientemente puras como para que celulas CD4+CD25+ generen lmeas celulares supresoras potentes. Aun asf, solo pudieron generarse lmeas celulares fuertemente supresoras en un subconjunto

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(aproximadamente en un tercio) de donantes, y la potencia se correlacionaba con la pureza de la lmea celular (Godfrey, et al., 2004, Blood, 104: 453-461). Se ha notificado que la clasificacion por FACS de celulas CD25alto (el 2,1% superior) permite la generacion de una lmea celular supresora mas constante a partir de sangre de adulto (Hoffmann, et al., 2004, Blood. 104: 895-903).

La purificacion de celulas Treg a partir de sangre de adulto es posible, pero diffcil. Los intentos anteriores usando purificacion mediante clasificacion celular activada por magnetismo (MACS) para aislar celulas Treg de sangre de adulto que sean suficientemente puras para una actividad supresora constante han dado como resultado variabilidad en la funcion celular. Esta variabilidad se debe en gran medida a la presencia de celulas de memoria atenuadas para CD25 que se solapan con las celulas Treg. El uso de un clasificador celular ha facilitado el aislamiento de celulas Treg (Baecher-Allan, et al., 2001, J. Immunol, 167: 1245-1253), y ha permitido la generacion de lmeas celulares supresoras a partir de sangre de adulto (Hoffmann, et al., 2004, Blood, 104: 895-903). Sin embargo, en un informe se encontro que poblaciones incluso clasificadas de celulas CD25+ derivadas de sangre de adulto (el 2,9% superior) conteman una mezcla de celulas T convencionales y reguladoras en analisis de clonacion y funcional (Levings, et al., 2002, J. Exp. Med., 196: 1335-1346).

Aproximadamente el 20% de las celulas de sangre de adulto CD4+CD25+ expresan CD45RA. No se espera que este antfgeno se exprese en celulas supresoras, ya que se ha descrito en varios informes que son positivas para CD45RO (generalmente expresion mutuamente exclusiva, excepto de manera transitoria durante la activacion de celulas indiferenciadas). Sin embargo, el aislamiento de estas celulas resulto mucho mejor que el de las celulas CD45RA para generar lmeas celulares supresoras (se encontro que 12/12 lmeas celulares aisladas mediante este metodo eran supresoras potentes). En celulas T indiferenciadas, la variante de corte y empalme de CD45RA se expresa sobre la superficie de las celulas T. Una vez que una celula T se diferencia para dar una celula de memoria, habitualmente expresa la isoforma CD45RO (publicacion estadounidense n.° 20050196386).

Se ha mostrado previamente que la sangre de cordon contiene celulas CD4+CD25+ mediante clasificacion celular activada por fluorescencia (FaCs) (Paganelli, et al., 1994, Cell Immunol, 155: 486-489; Ng, et al, 2001, Blood 98: 2736-2744; Wing, et al, 2002, Immunology 106: 190-199). Sin embargo, se han notificado pocos datos sobre la funcion de estas celulas. Un informe ha deducido la funcion suprimida basandose en el analisis de frecuencia de LDA (Ng, et al, 2001, Blood 98: 2736-2744). El unico informe que evaluo la actividad funcional de celulas CD4+CD25+ recien aisladas, no revelo supresion de respuestas espedficas de antfgeno. Ademas, no hubo reactividad espedfica de antfgeno aumentada de celulas CD4+ tras la deplecion de celulas CD25+. Sin embargo, se observo una supresion moderada en ensayos de cocultivo de celulas T basados en anticuerpos anti-CD3, (el 60% a una razon de celula respondedora/supresora de 1/1) (Wing, et al, 2003, Eur. J. Immunol, 33: 579-587). Por tanto, los estudios anteriores indicaron que la mayona de las celulas CD25+ derivadas de sangre de cordon todavfa no eran suficientemente maduras como para ser supresoras (Wing K, et al, 2003, Eur. J. Immunol. 33: 579-587).

Por consiguiente, hasta la presente invencion, se reconodan las propiedades y los beneficios de las celulas Treg, pero se desconoda el metodo para aislar y generar un numero suficiente de celulas supresoras potentes. Por tanto, existfa una necesidad reconocida de metodos para aislar y expandir celulas Treg. La presente invencion satisface esta necesidad.

Sumario de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo para proporcionar celulas T reguladoras a partir de una poblacion de celulas sangumeas con fenotipo CD45RA+, en el que las celulas Treg suprimen la proliferacion de celulas T. El metodo de la presente invencion comprende aislar una poblacion de celulas mononucleares de una muestra de sangre de cordon umbilical humana, poner en contacto la poblacion de celulas mononucleares con un anticuerpo que se une espedficamente a CD25 en condiciones adecuadas para la formacion de un complejo celula mononuclear-anticuerpo, y separar sustancialmente el complejo celula mononuclear-anticuerpo de dicha poblacion de celulas mononucleares, aislando de ese modo una celula T reguladora de una poblacion de celulas sangumeas con fenotipo CD45RA+. El metodo comprende ademas cultivar la celula T reguladora sin celulas alimentadoras en un medio que comprende un anticuerpo frente a CD3 y un anticuerpo frente a CD28 y comprende ademas IL-2. En una realizacion de la invencion, la poblacion de celulas sangumeas con fenotipo CD45RA+ procede de sangre de cordon umbilical, preferiblemente de una muestra de cordon umbilical humano.

Breve descripcion de las figuras

El sumario anterior, asf como la siguiente descripcion detallada de la invencion, se entenderan mejor cuando se lean conjuntamente con los dibujos adjuntos. Para el fin de ilustrar la invencion, se representan en los dibujos determinadas realizaciones de la invencion. Sin embargo, la invencion no se limita a las disposiciones e instrumentalidades precisas de las realizaciones representadas en los dibujos. Todas las barras de error representan una desviacion estandar por encima y por debajo de la media.

La figura 1, que comprende las figuras IA a ID, es una serie de imagenes que representan analisis de FACS para la expresion de CD45RA y CD45RO y purificaciones optimas de celulas CD45RA+ y CD45RO+.

La figura 2 es una imagen que representa que las celulas CD45RA+ no expresan CD25 ni siquiera a los niveles mas

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altos, y que las celulas brillantes para CD25 no expresan de manera detectable CD45RA.

La figura 3, que comprende las figuras 3A y 3B, es una serie de imagenes que representan la actividad supresora potente en celulas CD45RA+ medida mediante una reaccion mixta de linfocitos.

La figura 4, que comprende las figuras 4A a 4D, es una serie de imagenes que representan que las celulas CD45RA son negativas para CTLA-4 (figura 4A) y HLA-DR (figura 4B). Las celulas brillantes para CD25+ son HLA-DR+ (figura 4C) y se tinen de manera doble para CTLA-4 intracelular, representando por tanto dos subconjuntos de celulas distintos.

La figura 5 es un grafico que representa la actividad supresora de las celulas CD45RA+ (RA+), las celulas HLA-DR+ (DR+) y las celulas dobles negativas (DN). La actividad supresora mas potente es evidente en las celulas CD45RA+, la potencia media en las celulas dobles negativas y la menor potencia en las celulas HLA-DR+.

La figura 6, que comprende las figuras 6A a 6D, es una serie de imagenes que representan que las celulas de sangre de cordon CD4+CD25+ son una poblacion distinta. La figura 6 comprende diagramas de FACS representativos de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), celulas mononucleares de sangre de cordon (CBMC) y celulas CD4+CD25+ purificadas de ambas fuentes. La figura 6 es representativa de 10 donantes y 10 experimentos de purificacion celular. La figura 6A representa distintas poblaciones de celulas CD4+ y CD25+ en sangre de cordon con una amplia separacion de celulas CD25+ de celulas CD25. La figura 6B es una imagen que representa que las celulas CD4+CD25+ constituyen el 1-2% de las PBMC, y que un gran numero de estas celulas estan atenuadas para CD25 (flecha). La figura 6C es una imagen que representa que las celulas CD25+ purificadas a partir de sangre de cordon mediante microperlas anti-CD25 constituyen una poblacion mas pura. La figura 6D es una imagen que representa celulas CD25+ purificadas a partir de sangre de adulto mediante microperlas anti-CD25 directas.

La figura 7 es una imagen que representa que las celulas CD25+ de sangre de cordon son CD45RA+ y que muestra que las celulas CD25+ purificadas de sangre de cordon son predominantemente CD45RA+.

La figura 8, que comprende las figuras 8A a 8D, es una serie de imagenes que demuestran que las celulas CD4+CD25+ derivadas de sangre de cordon en cultivo suprimen marcadamente una reaccion mixta de linfocitos (MLR) medido mediante inhibicion de la proliferacion. La figura 8A es un grafico que representa las curvas cineticas de proliferacion a lo largo de una MLR de una semana. Las celulas derivadas de sangre de cordon bloquean esencialmente MLR (•), las lmeas celulares de adulto seleccionadas directamente mediante MACS tienen una funcion supresora debil (D) y las celulas de adulto seleccionadas de manera rigurosa (linaje CD25++) tienen potencia moderada (■). Las celulas CD25 no son supresoras (*).

La figura 8A es representativa de 10 experimentos. La figura 8B es un diagrama de dispersion que demuestra la uniformidad de la supresion en el dfa 6 de MLR de lmeas celulares derivadas de sangre de cordon (•), frente a lmeas celulares de adulto mediante MACS directa (□), o lmeas de adulto purificadas de manera rigurosa (linaje- CD25++) (■). La figura 8C es un grafico que representa numeros graduados de celulas Treg cultivadas anadidas a una reaccion de MLR para determinar el numero mmimo necesario para lograr una inhibicion potente. Hasta una dilucion de 1:32 (aproximadamente 1.560 supresores/50.000 respondedores) afecto marcadamente a MLR cuando se usaron lmeas celulares supresoras derivadas de sangre de cordon (•), frente a 1:16 para un subconjunto potente seleccionado de lmeas de adulto purificadas de manera rigurosa (linaje- pCD25++) (A). Se representan dos lmeas de cada una, representativas de 6 lmeas celulares supresoras derivadas de sangre de cordon y de adulto. La figura 8D es un grafico que representa la maduracion de celulas dendnticas (DC) antes de la MLR, mediante combinacion con lipopolisacarido (LPS) o TNF/polilC. La inclusion de estos factores estimulantes en MLR no evita la supresion. La figura 8D es representativa de 3 experimentos.

La figura 9, que comprende las figuras 9A a 9B, es una serie de imagenes que demuestran que las celulas CD4+CD25+ cultivadas suprimen marcadamente la acumulacion de citocinas en MLR, tal como se analiza mediante la evaluacion de los niveles de citocinas. La figura 9A es un grafico que representa una afectacion en la acumulacion de citocinas producidas por celulas T activadas, espedficamente se observa IL-2, IFN-gamma, GM-CSF, TNF-alfa, IL-5 e IL-10. No puede detectarse alteracion en la acumulacion de TGF-beta 1. La figura 9A representa los niveles de IL-2 en el dfa 2, y de otras citocinas en el dfa 6, los tiempos respectivos de maximo de acumulacion en cultivos de MLR control. La figura 9B es un grafico que representa la alteracion minima de los niveles de quimiocinas en puntos de tiempo tempranos (dfa 2), y las disminuciones moderadas en los niveles en puntos de tiempo tardms (dfa 7) para RANTES, IL-8 y MIP-1a. La figura 9 es representativa de 4 experimentos de MLR.

La figura 10, que comprende las figuras 10A y 10B, es una imagen que representa diagramas representativos de una comparacion de citrometna de flujo de lmeas celulares derivadas de CD25+, CD25- y CD25 tras 3-4 semanas de expansion en cultivo. La figura 10A es una imagen que demuestra que la expresion de CD25 y CTLA4 intracelular sigue siendo alta en celulas T de sangre de cordon, que la expresion es inferior en celulas T derivadas de adulto y que la expresion vuelve en gran medida al nivel inicial para las lmeas celulares derivadas de CD25. La figura 10B es una imagen que representa que la expresion de CD62L y CD27 permanece de manera uniformemente alta en lmeas de celulas T de sangre de cordon, tambien en un subconjunto de las lmeas de adulto, y que disminuye en las lmeas

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celulares derivadas de CD25. La figura 10 es representativa de 10 lmeas celulares analizadas cada una a las 4 semanas de cultivo.

La figura 11, que comprende las figuras 11A y 11B, es una imagen que representa la expresion de protema y ARNm de FoxP3. La figura 11A es un grafico que representa los niveles de ARNm de FoxP3 evaluados mediante un analisis de PCR en tiempo real. Las muestras son celulas recien aisladas (CD25 nuevo), lmeas celulares tras 4 semanas de cultivo (Cx CD25) y lmeas celulares cultivadas 4 semanas 24 horas tras la reestimulacion con perlas anti-CD3/CD28 (CD25 reestim.), tal como se indica. Los datos se representan como comparacion en veces con los niveles de ARNm presentes en celulas T CD8+ (CD8) recien aisladas. La figura 11B es una serie de imagenes de una analisis de inmunotransferencia de tipo Western de la expresion de protema FoxP3 en celulas cultivadas durante 4 semanas y reestimuladas con perlas anti-CD3/CD28 durante el tiempo indicado. Se uso histona H3 como control de carga para protemas nucleares. La figura 11 es representativa de 4 experimentos independientes.

La figura 12, que comprende las figuras 12A a 12D, es una serie de imagenes que representan defectos de produccion de citocinas y expresion de LAP en la superficie celular 48 horas tras la reestimulacion de lmeas supresoras. La figura 12A es un grafico que representa lmeas celulares reactivadas con perlas anti-CD3/CD28. La figura 12B es un grafico que representa celulas CD25 y CD25+ reactivadas con PMA/ionomicina. La figura 12C es una imagen que representa la expresion de CD69, OX40 (CD 134) y GITR intacto. La figura 12D es una imagen que representa que la expresion de LAP en la superficie celular es espedfica para las lmeas celulares derivadas de CD25+. Las lmeas celulares en reposo fueron negativas para estos antfgenos de activacion antes de la reestimulacion.

La figura 13, que comprende las figuras 13A a 13D, es una serie de imagenes que representan un examen de multiples anticuerpos neutralizantes y protemas de fusion para determinar los efectos funcionales sobre la supresion de una MLR de celulas T CD4+-DC. La figura 13A es un grafico que representa que anticuerpos frente a los factores inmunosupresores IL-10 y TGF beta, asf como anticuerpos anti-IL10R, o combinaciones de los tres, no revierten la supresion mediada por lmeas de celulas Treg en cultivo. La figura 13B es un grafico que representa que anticuerpos frente a moleculas de senalizacion negativas, CTLA4 y PDl, no revierten la supresion. La figura 13C es una imagen que representa la falta de supresion de anticuerpos frente a GITR o GITR-L. Los anticuerpos agonistas frente a OX40 revierten parcialmente la supresion mientras que los anticuerpos frente a OX40L potencian parcialmente la supresion. La figura 13D es un grafico que representa que los multiples anticuerpos neutralizantes frente a TGF y receptores solubles no impiden la funcion efectora de las celulas supresoras. Las figuras 13A a C son representativas de 6 experimentos independientes, la figura 13D es representativa de 3 experimentos independientes.

Descripcion detallada de determinadas realizaciones de la invencion

La presente invencion engloba un metodo para el aislamiento y la expansion de una poblacion potenciada de celulas T reguladoras (Treg) que tienen el fenotipo CD45RA+. El termino “potenciado”, tal como se usa en el presente documento se refiere a al menos el 20% mas, preferiblemente el 30%, preferiblemente el 40%, incluso mas preferiblemente el 50%, incluso de manera mas preferible aproximadamente el 60%, incluso mas preferiblemente el 60%, incluso mas preferiblemente el 70%, incluso mas preferiblemente el 80%, incluso mas preferiblemente el 90%, e incluso mas preferiblemente el 100% mas que un objeto que no esta potenciado. Como ejemplo, una poblacion potenciada de celulas reguladoras tiene al menos el 20% mas de celulas reguladoras que una poblacion que no esta potenciada. Se encontro que la fuente preferida de tales celulas era sangre de cordon umbilical humana. Los metodos para producir un gran numero de celulas Treg supresoras potentes activas de otras fuentes, tales como sangre humana de adulto, han quedado frustrados por la presencia de celulas T de memoria que expresan CD25 a niveles de bajos a moderados (celulas atenuadas para CD25), y celulas T activadas convencionales (CD25+) que interfieren con la purificacion de celulas Treg. El termino “Treg” se usa en el presente documento para referirse a una celula T reguladora que expresa tanto CD4 (CD4+) como CD25 (CD25+). Sin embargo, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, ambos tipos de celulas T (de memoria y activadas) no estan presentes generalmente, o lo estan en un numero bajo, en sangre de cordon umbilical. Esto se debe, tal como se da a conocer en el presente documento, a que las celulas de sangre de cordon se desarrollan en un entorno protegido y estan inmunologicamente indiferenciadas. Por tanto, la presente invencion demuestra que las celulas Treg CD25+ en sangre de cordon umbilical se purifican mas facilmente que las derivadas de otras fuentes, tales como sangre periferica de adulto humano.

Una celula que es “CD25+” o que “expresa CD25” se compara en el presente documento con una celula que es CD25 o que no expresa un nivel detectable de CD25. Una celula que esta “atenuada para CD25”, tal como se usa en el presente documento tiene un nivel detectable inferior de expresion de CD25 que una celula CD25+ o una celula “brillante para CD25”. Ademas, el cultivo y la multiplicacion de estas celulas se facilitan y se simplifican porque no son necesarias celulas alimentadoras para expandir las poblaciones de celulas Treg. Las celulas Treg son cnticas para tolerancia de autoinjerto y aloinjerto en ratones. Los estudios de Treg humanas se han visto dificultados por el bajo numero presente en sangre periferica y por la diffcil purificacion. Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que la sangre de cordon es una fuente superior para el aislamiento de Treg y la generacion de lmeas celulares en comparacion con la sangre de adulto. Se purificaron celulas CD4+CD25+ de sangre de cordon y se generaron lmeas celulares que mostraban de manera constante actividad supresora potente, con una supresion

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de MLR alogenica >95% (29/30 donantes). Las celulas Treg cultivadas bloquearon la acumulacion de citocinas en MLR, con inhibicion de la produccion de quimiocinas. Estas lmeas celulares expresaron de manera uniforme CD25, CD62L, CCR7, CD27 y CTLA4 intracelular. Ademas, se expreso espedficamente la protema FoxP3, pero no el ARNm. Tras la reestimulacion con perlas anti-CD3/CD28, las celulas Treg cultivadas produjeron citocinas mmimas (IL-2, IFN-gamma e IL-10), y expresaron preferiblemente protema asociada a latencia de TGF-beta. Sin embargo, la produccion de citocinas se restablecio a los niveles normales mediante la reestimulacion con PMA/ionomicina. La funcion de las celulas supresoras cultivadas derivadas de sangre de cordon fue predominantemente independiente de IL-10 y TGF-beta. Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que la sangre de cordon contiene un numero significativo de celulas precursoras de celulas Treg, que pueden presentar una funcion supresora potente tras la activacion del cultivo. Las muestras de sangre de cordon en bancos pueden servir como fuente facilmente disponible de celulas Treg para inmunoterapia.

El metodo de la presente invencion proporciona celulas Treg aisladas de muestras de sangre de cordon umbilical humana que tienen capacidades de supresion de citocinas y actividad supresora mas potentes que las derivadas de otras fuentes. En marcado contraste con la tecnica anterior, los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que las celulas Treg aisladas de sangre de cordon umbilical humana tienen una capacidad potente para suprimir la proliferacion de celulas T y para suprimir citocinas dependientes de activacion de celulas T. Ademas, los datos presentes demuestran ademas que las celulas CD4+CD25+ de sangre de cordon pueden formar celulas supresoras potentes tras aislamiento y cultivo. El metodo de la presente invencion proporciona la purificacion de celulas Treg usando un sistema de purificacion basado en anticuerpos directo sencillo para aislar tales celulas supresoras. Tras la activacion y multiplicacion con perlas anti-CD3/CD28 y cultivo en IL-2, las celulas CD4+CD25+ derivadas de sangre de cordon adquirieron una funcion supresora potente, que se mantuvo durante largos periodos de tiempo. Tambien se da a conocer un metodo para inhibir la proliferacion de celulas T y un metodo para inhibir la produccion de citocinas.

Hasta la fecha, todos los ensayos de fenotipo y funcion de celulas supresoras revelan que las celulas derivadas de sangre de cordon, y las celulas derivas de adulto mas puras, tienen perfiles similares. El analisis de citometna de flujo, el potencial de produccion de citocinas y el perfil funcional han sido todos ellos esencialmente iguales. Por tanto, los datos dados a conocer en el presente documento indican que ambos tipos de lmeas, cuando son puras, expresan potencia y mecanismos supresores equivalentes, y la ventaja de la sangre de cordon se refiere principalmente a la facilidad de purificacion y cultivo.

La disponibilidad de un gran numero de celulas supresoras ha permitido la caracterizacion bioqmmica y molecular de estas celulas especiales. Usando los metodos dados a conocer en el presente documento, pueden generarse mas de 300 millones de celulas supresoras potentes y uniformes a partir de una unidad de sangre de cordon de calidad para investigacion de tamano promedio (-300 de millones de celulas) sin un clasificador celular. Estos resultados demuestran una recuperacion de celulas CD4+CD25+ del 1% y una expansion de 100 veces en cultivo. Este numero de celulas permite la caracterizacion adicional de alteraciones de senalizacion de TCR, regulacion y funcion de FoxP3, y mecanismos efectores supresores. Ademas, una utilidad importante de estas celulas es permitir pruebas clmicas de una nueva forma de inmunoterapia. Las lmeas celulares supresoras pueden ser utiles para potenciar la induccion de tolerancia a aloinjertos o para modular por disminucion enfermedades autoinmunitarias.

La presente invencion comprende un metodo para proporcionar celulas Treg a partir de una muestra de sangre de cordon umbilical. Los artmulos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o mas de uno (es decir, a al menos uno) de los objetos gramaticales del artmulo. A modo de ejemplo, “una celula Treg” significa una celula Treg o mas de una celula Treg. La celula Treg aislada usando los metodos de la presente invencion, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, inhibe la proliferacion de celulas T. El metodo de la presente invencion comprende aislar una poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon de una muestra de sangre de cordon umbilical. Una “poblacion” se usa en el presente documento para referirse a un grupo de celulas que tienen una caractenstica fenotfpica sustancialmente similar, tal como ser celulas mononucleares, o expresar CD25RA. Los metodos para aislar celulas mononucleares de una muestra biologica, tal como una muestra de sangre de cordon, se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, usar tecnicas de centrifugacion en gradiente de densidad de modo que se separen los componentes sangumeos, tales como plasma y eritrocitos, de las celulas mononucleares. Los metodos para aislar celulas mononucleares de una muestra de sangre incluyen la tecnica de Ficoll-Hypaque.

Las celulas mononucleares de sangre de cordon asf aisladas pueden someterse a deplecion de celulas que expresan determinados antfgenos, incluyendo, pero sin limitarse a, CD34, CD8, CD 14, CD 19 y CD56. La deplecion de estas celulas puede llevarse a cabo usando un anticuerpo aislado, una muestra biologica que comprende un anticuerpo, tal como ascitis, un anticuerpo unido a un soporte ffsico y un anticuerpo unido a una celula. El termino “anticuerpo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de inmunoglobulina que puede unirse espedficamente a un epttopo espedfico en un antfgeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos normalmente son tetrameros de moleculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invencion pueden existir en una variedad de formas incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, asf como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos humanizados (Harlow et al, 1999, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY;

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Harlow et al, 1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York: Houston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al, 1988, Science 242:423-426). Mediante el termino “se une espedficamente”, tal como se usa en el presente documento, quiere decirse un compuesto, por ejemplo, una protema, un acido nucleico, un anticuerpo, y similar, que reconoce y se une a una molecula espedfica, pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moleculas en una muestra.

El anticuerpo usado en el metodo de la presente invencion puede unirse a un soporte ffsico, tal como una perla magnetica, una perla Dynal, una microperla, una columna, una columna de adsorcion y una membrana de adsorcion. La conjugacion de un anticuerpo a un soporte ffsico se conoce bien en la tecnica. Id. Alternativamente, puede adquirirse un anticuerpo conjugado a un soporte ffsico, tal como una perla magnetica, de una variedad de fuentes, tal como Milteny Biotec (Auburn, CA).

En la presente invencion son utiles una variedad de anticuerpos. Tal como entendera un experto en la tecnica, cualquier anticuerpo que pueda reconocer y unirse a un antfgeno CD de interes, tal como CD25, CD4, CD34, CD8, CD14, CD19 y CD56 es util en la presente invencion. Los metodos para obtener y usar tales anticuerpos se conocen bien en la tecnica. Por ejemplo, se generan anticuerpos policlonales utiles en la presente invencion inmunizando conejos segun tecnicas inmunologicas convencionales bien conocidas en la tecnica {vease, por ejemplo, Harlow et al, 1988, citado anteriormente). Tales tecnicas incluyen inmunizar un animal con una protema quimerica que comprende una parte de otra protema tal como una protema de union a maltosa o una parte de polipeptido con etiqueta de glutation (GSH), y/o un resto de manera que la protema marcadora se vuelve inmunogenica (por ejemplo, una protema marcadora conjugada con hemocianina de lapa californiana, KLH) y una parte que comprende los residuos de aminoacido de la protema marcadora respectiva. Las protemas quimericas se producen clonando los acidos nucleicos apropiados que codifican para la protema marcadora en un vector de plasmido adecuado para este fin, tal como pero sin limitarse a, pMAL-2 o pCMX.

Sin embargo, la invencion no debe interpretarse que se limita unicamente a los metodos que incluyen estos anticuerpos o a estas partes de los antfgenos proteicos. Mas bien, debe interpretarse que el metodo incluye otros anticuerpos, tal como se define el termino en otra parte en el presente documento, protemas marcadoras de superficie de celulas Treg, o partes de las mismas. Ademas, debe interpretarse que el metodo engloba anticuerpos, entre otros, que se unen a las protemas de celulas Treg y que pueden unirse a la protema presente en inmunotransferencias de tipo Western, en disolucion en inmunoensayos ligados a enzimas, en ensayos de FACS, en ensayos de clasificacion celular activada por magnetismo (MACS) y en microscopia de inmunofluorescencia.

Un experto en la tecnica apreciara, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que el anticuerpo puede unirse espedficamente a cualquier parte de la protema marcadora y que la protema de longitud completa puede usarse para generar anticuerpos espedficos para la misma. Sin embargo, la presente invencion no se limita a usar la protema de longitud completa como inmunogeno.

Mas bien, la presente invencion incluye el uso de una parte inmunogenica de la protema para producir un anticuerpo que se une espedficamente a una protema de superficie de celulas Treg espedfica.

Los anticuerpos pueden producirse inmunizando un animal tal como, pero sin limitarse a, un conejo, un raton o una cabra, con una protema de la invencion, o una parte de la misma, inmunizando un animal usando una protema que comprende al menos una parte de un antfgeno de superficie de celulas Treg, o una protema de fusion que incluye una parte de polipeptido de etiqueta que comprende, por ejemplo, una parte de polipeptido de etiqueta de protema de union a maltosa, unida covalentemente con una parte que comprende los residuos de aminoacido apropiados. Un experto en la tecnica apreciara, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que tambien pueden usarse fragmentos mas pequenos de estas protemas para producir anticuerpos que se unen espedficamente a una protema de superficie de celulas Treg.

Los anticuerpos engloban anticuerpos policlonales, monoclonales, sinteticos y similares. La presente invencion comprende ademas el uso de fragmentos de anticuerpos biologicamente activos, tales como un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv y un fragmento scFv de un anticuerpo. Un experto en la tecnica entendera, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que la caractenstica crucial del anticuerpo de la invencion es que el anticuerpo se une espedficamente con una protema de superficie de celulas Treg. Es decir, el anticuerpo de la invencion reconoce una celula Treg o un fragmento de la misma (por ejemplo, una parte inmunogenica o determinante antigenico de la misma), en inmunotransferencias de tipo Western, en inmunotincion de celulas, o inmunoprecipitados de la protema usando metodos convencionales bien conocidos en la tecnica.

Un experto en la tecnica apreciara, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que los anticuerpos pueden usarse para inmunoprecipitar y/o purificar por inmunoafinidad su antfgeno relacionado tal como se describe en detalle en otra parte en el presente documento, y adicionalmente, usando metodos bien conocidos en la tecnica. Ademas, el anticuerpo puede usarse para aislar una celula Treg en una poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon derivada de una muestra de sangre de cordon umbilical. Por tanto, mediante el uso de un anticuerpo frente a un marcador de superficie de celulas Treg, tal como CD25, puede identificarse, enriquecerse o aislarse una celula Treg. Un experto en la tecnica entendera, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que cualquier marcador, ya sea nativo o modificado por ingeniena

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genetica, expresado sobre la superficie de una celula Treg, es por tanto util en la presente invencion.

El experto en la tecnica apreciara, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que la presente invencion incluye el uso de o bien un unico anticuerpo que reconoce un unico antigeno de celula Treg pero que la invencion no se limita al uso de un unico anticuerpo. En su lugar, la invencion engloba el uso de al menos un anticuerpo, pudiendo dirigirse los anticuerpos a antfgenos de celulas Treg iguales o diferentes.

La generacion de anticuerpos policlonales se logra inoculando el animal deseado con el antfgeno y aislando los anticuerpos que se unen espedficamente al antfgeno del mismo usando metodos de produccion de anticuerpos convencionales tales como los descritos en, por ejemplo, Harlow et al. (1988, citado anteriormente).

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra fragmentos de peptido o la longitud completa de una protema o peptido pueden prepararse usando procedimientos de preparacion de anticuerpos monoclonales bien conocidos, tales como los descritos, por ejemplo, en Harlow et al. (1988, Id.) y en Tuszynski et al. (1988, Blood, 72: 109-115). Tambien pueden sintetizarse cantidades del peptido deseado usando tecnologfa de smtesis qmmica. Alternativamente, puede clonarse ADN que codifica para el peptido deseado y expresarse a partir de una secuencia de promotor apropiada en celulas adecuadas para la generacion de grandes cantidades de peptido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el peptido se generan a partir de ratones inmunizados con el peptido usando procedimientos convencionales tal como se hace referencia en el presente documento.

El acido nucleico que codifica para el anticuerpo monoclonal obtenido usando los procedimientos descritos en el presente documento puede clonarse y secuenciarse usando tecnologfa que esta disponible en la tecnica, y se describe por ejemplo, en Wright et al. (1992, Critical Rev. Immunol. 12: 125-168), y las referencias citadas en el mismo. Ademas, el anticuerpo de la invencion puede “humanizarse” usando la tecnologfa descrita en, por ejemplo, Wright et al., id., y en las referencias citadas en el mismo, y en Gu et al. (1997, Thrombosis and Hematocyst, 77:755759), y otros metodos de humanizacion de anticuerpos bien conocidos en la tecnica o que van a desarrollarse.

Una vez expresados, pueden purificarse anticuerpos completos, dfmeros derivados de los mismos, cadenas ligeras y pesadas individuales, u otras formas de anticuerpos segun procedimientos convencionales conocidos en la tecnica.

Puede generarse una biblioteca de anticuerpos en fago. Para generar una biblioteca de anticuerpos en fago, en primer lugar se obtiene una biblioteca de ADNc a partir de ARNm que se afsla de celulas, por ejemplo, el hibridoma, que expresan la protema deseada que va a expresarse en la superficie del fago, por ejemplo, el anticuerpo deseado. Se producen copias de ADNc del ARNm usando transcriptasa inversa. Se obtiene el ADNc espedfico para fragmentos de inmunoglobulina mediante PCR y se clona el ADN resultante en un vector de bacteriofago adecuado para generar una biblioteca de ADN en bacteriofago que comprende genes de inmunoglobulina espedficos para el ADN. Los procedimientos para obtener una biblioteca en bacteriofago que comprende ADN heterologo se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente.

El bacteriofago que codifica para el anticuerpo deseado puede modificarse por ingeniena genetica de manera que la protema se presenta sobre la superficie del mismo de tal manera que esta disponible para unirse a su protema de union correspondiente, por ejemplo, el antfgeno contra el que se dirige el anticuerpo, tal como un antfgeno de superficie de celulas Treg. Por tanto, cuando se incuban bacteriofagos que expresan un anticuerpo espedfico en presencia de una celula que expresa el antfgeno correspondiente, el bacteriofago se unira a la celula. El bacteriofago que no expresa el anticuerpo no se unira a la celula.

Los anticuerpos usados en la presente invencion se ponen en contacto con la poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon aisladas de una muestra de cordon umbilical humano en condiciones adecuadas para la formacion de un complejo celula mononuclear de sangre de cordon-anticuerpo. Es decir, el metodo de la presente invencion comprende poner en contacto una poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon con un anticuerpo que se une espedficamente a una celula Treg en la poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon de modo que el anticuerpo se une a un antfgeno, incluyendo CD25, sobre la celula Treg. “Condiciones adecuadas” se usa en el presente documento para referirse a temperatura, pH, tampones, tiempo y otros factores que facilitan la union de un anticuerpo a su antfgeno relacionado o a una celula, tal como una celula Treg. Las condiciones que son adecuadas para la union de un anticuerpo a un antfgeno o a una celula, o a un antfgeno en una celula, se conocen bien en la tecnica y son habitualmente desde aproximadamente 4°C hasta aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 37°C durante un periodo de tiempo de desde aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 5 minutos hasta aproximadamente 30 minutos hasta aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 24 horas. Se conocen bien en la tecnica diversos tampones e incluyen, por ejemplo, Tris, solucion salina tamponada con fosfato, y similares. Se describen diversos ejemplos de condiciones adecuadas para la formacion de un complejo celula mononuclear de sangre de cordon-anticuerpo en, por ejemplo, Harlow et al, 1988, citado anteriormente.

El metodo de la presente invencion comprende ademas la etapa de separar sustancialmente el complejo celula mononuclear de sangre de cordon-anticuerpo de una poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon. Es decir, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, el presente metodo de aislar

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una celula Treg que inhibe la proliferacion de celulas T de una muestra de sangre de cordon umbilical comprende separar sustancialmente tal celula Treg de otras celulas mononucleares de sangre de cordon en una muestra. Tal como se usa el termino en el presente documento, “separado sustancialmente de” o “separar sustancialmente” se refiere a la caractenstica de una poblacion de primeras sustancias que estan alejandose de una poblacion de segundas sustancias, en el que la poblacion de primeras sustancias no esta desprovista necesariamente de la segunda sustancia, y la poblacion de segundas sustancias no esta desprovista necesariamente de la primera sustancia. Sin embargo, una poblacion de primeras sustancias que se “separa sustancialmente de” una poblacion de segundas sustancias tienen un contenido mediblemente inferior de segundas sustancias en comparacion con la mezcla no separada de sustancias primera y segunda.

Pueden emplearse diversas tecnicas para separar una celula Treg unida a un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti- CD25, de celulas que no tienen un marcador de superficie celular unido a un anticuerpo retirando las celulas Treg unidas al anticuerpo de la mezcla celular de celulas mononucleares de sangre de cordon. Alternativamente, pueden emplearse diversas tecnicas para separar la celula Treg que contiene un marcador de superficie celular unido a un anticuerpo de celulas que no tienen un marcador de superficie celular unido a un anticuerpo retirando de la mezcla celular la celula Treg no unida a un anticuerpo.

En una realizacion, se usa el marcador de superficie celular CD25 para separar celulas Treg unidas a anticuerpo de celulas T y otras celulas mononucleares de sangre de cordon no conjugadas con anticuerpo. En un aspecto de la invencion, los anticuerpos pueden unirse a un soporte solido para permitir la separacion en bruto. Las tecnicas de separacion empleadas deben maximizar la conservacion de viabilidad de la fraccion que va a recogerse. Para separaciones “relativamente en bruto”, es decir, separaciones en las que hasta el 10%, habitualmente no mas de aproximadamente el 5%, preferiblemente no mas de aproximadamente el 1%, de las celulas totales presentes que tienen el marcador, pueden permanecer con la poblacion de celulas que va a retenerse, pueden emplearse diversas tecnicas de eficacia diferente. La tecnica particular empleada dependera de la eficacia de la separacion, de la citotoxicidad de la metodologfa, de la facilidad y velocidad del rendimiento, y de la necesidad de equipo y/o capacidad tecnica complejos, estando todo ello dentro de la capacidad del experto habitual en la tecnica.

Los procedimientos para la separacion pueden incluir separacion magnetica, usando perlas magneticas recubiertas con anticuerpo o perlas Dynal, cromatograffa de afinidad, agentes citotoxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o usados conjuntamente con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complemento y citotoxinas, y “cribado” con anticuerpo unido a una matriz solida, por ejemplo, una placa, u otra tecnica conveniente. Las tecnicas que proporcionan la separacion precisa incluyen clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de complejidad, por ejemplo, una pluralidad de canales de color, canales de deteccion de dispersion de la luz de angulo bajo u obtusos, canales de impedancia, etc., asf como clasificadores celulares activados por magnetismo.

De manera conveniente, los anticuerpos pueden conjugarse con marcadores, tales como perlas magneticas, que permiten una separacion directa, biotina, que puede eliminarse con avidina o estreptavidina unida a un soporte, fluorocromos, tales como FITC, que pueden usarse con un clasificador celular activado por fluorescencia, o similares, para permitir la facilidad de separacion de un tipo celular particular. Puede emplearse cualquier tecnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las celulas restantes. Otras tecnicas incluyen, pero no se limitan a, partfculas densas para centrifugacion en densidad, una columna de adsorcion, una membrana de adsorcion, y similares.

En una realizacion de la invencion, un anticuerpo espedfico para un marcador de superficie celular derivada de sangre de cordon se conjuga con una perla magnetica. Se pone en contacto una poblacion de celulas mononucleares derivadas de sangre de cordon con el conjugado perla magnetica-anticuerpo, en condiciones adecuadas para la union del conjugado de anticuerpo a un antfgeno de superficie de celulas Treg, tal como CD25, que presenta el antfgeno. Tras la incubacion en condiciones adecuadas para la union, tal como, pero sin limitarse a, una incubacion a 4°C durante 20 minutos, se seleccionan las celulas Treg positivas para el antfgeno haciendo pasar toda la muestra a traves de un aparato de separacion basado en magnetismo. Tras la evacuacion o elucion de la disolucion libre del aparato, solo permaneceran las celulas que contienen marcador retenido magneticamente. Entonces se eluyen del aparato las celulas Treg que contienen el antfgeno, dando como resultado una poblacion enriquecida, aislada o purificada de celulas Treg. En un aspecto de la invencion, un marcador de Treg es CD25.

Tras el aislamiento sustancial de las celulas que comprende un antfgeno de celulas a Treg, tal como CD25, generalmente en al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, incluso de manera mas preferible aproximadamente el 80%, incluso de manera mas preferible aproximadamente el 90% o mas del 90%, las celulas pueden separarse mediante un clasificador celular activado por fluorescencia u otra metodologfa que tenga alta especificidad, tal como clasificacion celular activada por magnetismo (MACS). Pueden emplearse analisis de multiples colores con FACS lo cual es particularmente conveniente.

Para aumentar la rigurosidad del presente metodo para proporcionar una celula Treg a partir de una muestra de sangre de cordon umbilical humana, puede ponerse en contacto de nuevo una celula Treg que se ha separado sustancialmente de una poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon con un anticuerpo que se une espedficamente a CD25 en condiciones adecuadas para la formacion de un complejo celula mononuclear de sangre

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de cordon-anticuerpo seguido por la separacion sustancial del complejo celula mononuclear de sangre de cordon- anticuerpo de la poblacion de celulas mononucleares de sangre de cordon. Esta etapa puede realizarse una o mas veces para aislar una celula Treg humana de una muestra de sangre de cordon umbilical.

La presente invencion comprende ademas multiplicar, expandir o cultivar de otro modo una celula Treg aislada usando los metodos dados a conocer en el presente documento. Tal como se demuestra mediante los datos dados a conocer en el presente documento, multiplicar una celula Treg aislada mediante los metodos de la presente invencion puede realizarse multiplicando por aproximadamente 100 veces usando los metodos dados a conocer en el presente documento. Tras el aislamiento, se incuba una celula Treg en medio celular en un aparato de cultivo durante un periodo de tiempo o hasta que las celulas alcancen la confluencia antes de hacer pasar las celulas a otro aparato de cultivo. El aparato para cultivar puede ser cualquier aparato de cultivo usado comunmente en el cultivo de celulas in vitro. Preferiblemente, el nivel de confluencia es mayor del 70% antes de hacer pasar las celulas a otro aparato de cultivo. Mas preferiblemente, el nivel de confluencia es mayor del 90%. Un periodo de tiempo puede ser cualquier tiempo adecuado para el cultivo de celulas in vitro. El medio de celulas Treg puede reemplazarse durante el cultivo de las celulas Treg en cualquier momento. Preferiblemente, el medio de celulas Treg se reemplaza cada de 3 a 4 dfas. Las celulas Treg se recogen entonces del aparato de cultivo tras lo cual las celulas Treg pueden usarse inmediatamente o crioconservarse para almacenarse para su uso en un tiempo posterior. Las celulas Treg pueden recogerse mediante tripsinizacion, tratamiento con EDTa, o cualquier otro procedimiento usado para recoger celulas de un aparato de cultivo.

Se usan diversos terminos para describir celulas en cultivo. Un cultivo celular se refiere generalmente a celulas tomadas de un organismo vivo y que se hacen crecer en condiciones controladas. Un cultivo celular primario es cultivo de celulas, tejidos u organos tomados directamente de un organismo y antes del primer subcultivo. Las celulas se expanden en cultivo cuando se colocan en un medio de crecimiento en condiciones que facilitan el crecimiento y/o la division celulares, dando como resultado una poblacion mayor de las celulas. Cuando se expanden las celulas en cultivo, la velocidad de proliferacion celular se mide normalmente por la cantidad de tiempo requerido para que las celulas se doblen en numero, lo que se conoce de otra forma como tiempo de duplicacion.

Cada ronda de subcultivo se denomina un pase. Cuando se subcultivan celulas, se dice que se han sometido a pases. Una poblacion espedfica de celulas, o una lmea celular, se denomina en ocasiones o se caracteriza por el numero de veces que se ha sometido a pases. Por ejemplo, una poblacion de celulas cultivadas que se ha sometido a pases diez veces puede denominarse un cultivo P10. El cultivo primario, es decir, el primer cultivo tras el aislamiento de celulas del tejido, se designa P0. Tras el primer subcultivo, las celulas se describen como un cultivo secundario (P1 o pase 1). Tras el segundo subcultivo, las celulas se convierten el cultivo terciario (P2 o pase 2), y asf sucesivamente. Los expertos en la tecnica entenderan que puede haber muchas duplicaciones de la poblacion durante el periodo de los pases; por tanto el numero de duplicaciones de la poblacion de un cultivo es mayor que el numero de pases. La expansion de celulas (es decir, el numero de duplicaciones de la poblacion) durante el periodo entre pases depende de muchos factores, incluyendo pero sin limitarse a la densidad de siembra, el sustrato, el medio y el tiempo entre pases.

El medio usado para multiplicar las celulas Treg de la presente invencion comprende un anticuerpo frente a CD3, y un anticuerpo frente a CD28, y una citocina, preferiblemente, pero sin limitarse a, IL-2. Esto se debe, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, a que una celula aislada mediante los metodos de la presente invencion puede multiplicarse aproximadamente 100 veces cultivando la celula con un anticuerpo que se une a CD3, y un anticuerpo que se une a CD28, e IL-2. Ademas, tal como tambien se da a conocer en el presente documento, las celulas multiplicadas usando los metodos de la presente invencion son celulas supresoras potentes y uniformes. Ademas, puesto que las celulas Treg de la presente invencion estan inmunologicamente indiferenciadas, tales celulas pueden administrarse a un animal, preferiblemente a un mairnfero, incluso mas preferiblemente a un ser humano, para suprimir una reaccion inmunitaria, tal como las comunes a enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis multiple, GVHD, potenciacion de induccion de tolerancia a aloinjertos, rechazo de trasplantes y similares. Ademas, las celulas de la presente invencion pueden usarse para el tratamiento de cualquier estado en el que es deseable una respuesta inmunitaria disminuida o inhibida de otro modo, especialmente una respuesta inmunitaria mediada por celulas, para tratar o aliviar la enfermedad.

El anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28 usados en los metodos de la presente invencion pueden ser cualquiera de los anticuerpos conocidos en la tecnica, los dados a conocer en otra parte en el presente documento, o los que aun han de descubrirse. Ademas, y preferiblemente, los anticuerpos usados en la presente invencion se conjugan o se unen de otro modo a una perla, tal como una perla magnetica o una perla Dynal. Tales perlas se conocen en la tecnica y se describen en otra parte en el presente documento.

El medio usado en la presente invencion comprende ademas una citocina, preferiblemente IL-2. Esto se debe, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, a que la adicion de IL-2 al medio usado en los metodos de la presente invencion da como resultado una expansion aproximada de 100 veces de las celulas Treg. IL-2 y otras citocinas se conocen bien en la tecnica y estan disponibles comercialmente de varias fuentes.

La celula Treg comprende ademas determinados marcadores antigenicos, algunos de los cuales estan presentes

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cuando una celula Treg se a^sla de una muestra de sangre de cordon umbilical, algunos de los cuales estan presentes cuando la celula Treg se multiplica, se cultiva o se expande de otro modo segun los metodos de la presente invencion. Tales marcadores antigenicos son utiles en la identificacion de una celula Treg, y permiten que un experto en la tecnica determine si una celula Treg aislada y multiplicada segun los metodos de la presente invencion tiene las propiedades y actividades biologicas de una celula Treg de la presente invencion. Tales actividades biologicas incluyen, pero no se limitan a, supresion de una respuesta inmunitaria alogenica, inhibicion de la acumulacion de citocinas en una respuesta inmunitaria acompanada por menos inhibicion de la produccion de quimiocinas, la produccion de IL-2, IL-1o e interferon gamma, la expresion de protema asociada a latencia de TGF- beta (LAP), y actividad supresora independiente de IL-10 y TGF-beta. Los marcadores sobre la celula Treg de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, CD25, Cd4, CTLA4, CD27, CD26L y Fox P3.

La presente patente ilustra ademas un metodo para inhibir la proliferacion de una celula T. Tal inhibicion puede producirse in vitro o in vivo, preferiblemente en un animal, mas preferiblemente en un mairnfero, incluso mas preferiblemente en un ser humano. Esto se debe, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, a que se inhibio la proliferacion de celulas T de HLA no coincidente en una reaccion mixta de linfocitos (MLR) en un factor mayor de aproximadamente el 95% en presencia de una celula Treg aislada y multiplicada segun los metodos de la presente invencion. Ademas, tal como se demuestra por los datos dados a conocer en el presente documento, las celulas Treg aisladas y/o multiplicadas segun los metodos de la presente invencion son supresores potentes de la proliferacion de celulas T a razones de desde aproximadamente 1:16 hasta aproximadamente 1:32 (celula Treg: celula T). Ademas, las celulas Treg producidas mediante el metodo de la presente invencion son activas para suprimir una respuesta inmunitaria cuando una celula presentadora de antfgeno, tal como una celula dendntica, esta madura y activada. Por tanto, estas celulas pueden usarse para inhibir respuestas inmunitarias activas o para prevenir una respuesta inmunitaria.

La patente ilustra la puesta en contacto de una celula T con una celula Treg aislada y/o expandida segun los metodos de la presente invencion de manera que se inhibe la proliferacion de una celula T. La celula Treg puede administrarse usando tecnicas bien conocidas en la tecnica de modo que una celula Treg entra en contacto, o esta en proximidad, con una celula inmunitaria, tal como una celula T, una celula dendntica, una celula plasmatica, y similares.

El metodo ilustrado para inhibir la proliferacion de una celula T usando una celula Treg aislada y/o cultivada segun los metodos de la presente invencion engloba la preparacion y el uso de composiciones farmaceuticas que comprenden una celula Treg de la invencion como principio activo. Una composicion farmaceutica de este tipo puede consistir en el principio activo solo, como una combinacion de al menos un principio activo (por ejemplo, una dosis eficaz de una celula Treg) en una forma adecuada para su administracion a un sujeto, o la composicion farmaceutica puede comprender el principio activo y uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables, uno o mas componentes (activos y/o inactivos) adicionales, o alguna combinacion de estos.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “portador farmaceuticamente aceptable” significa una composicion qmmica con la que puede combinarse el principio activo y que, tras la combinacion, puede usarse para administrar el principio activo a un sujeto.

Las formulaciones de las composiciones farmaceuticas descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier metodo conocido o desarrollado mas adelante en la tecnica de farmacologfa. En general, tales metodos preparatorios incluyen la etapa de llevar el principio activo a asociacion con un portador o uno o mas de otros componentes auxiliares y entonces, si es necesario o deseable, conformar o envasar el producto en una unidad de dosis unica o de multiples dosis.

Aunque las descripciones de composiciones farmaceuticas proporcionadas en el presente documento se dirigen principalmente a composiciones farmaceuticas que son adecuadas para la administracion de manera etica a seres humanos, el experto en la tecnica entendera que tales composiciones son generalmente adecuadas para su administracion a animales de todos los tipos. Se entiende bien la modificacion de las composiciones farmaceuticas adecuadas para su administracion a seres humanos con el fin de hacer que las composiciones sean adecuadas para su administracion a diversos animales, y el farmacologo veterinario experto en la tecnica puede disenar y realizar tal modificacion con experimentacion meramente habitual, si la hay. Los sujetos en los que se contempla la administracion de las composiciones farmaceuticas incluyen, pero no se limitan a, seres humanos y otros primates, mai^eras incluyendo mai^eras comercialmente relevantes tales como primates no humanos, ganado, cerdos, caballos, cabras, gatos y perros, aves incluyendo aves comercialmente relevantes tales como pollos, patos, gansos y pavos, peces incluyendo peces de piscifactona y peces de acuarios, y crustaceos tales como marisco de piscifactona.

Las composiciones farmaceuticas pueden prepararse, envasarse o comercializarse en formulaciones adecuadas para administracion oral, rectal, vaginal, parenteral, topica, pulmonar, intranasal, intralesional, bucal, oftalmica, intravenosa, intraorganica u otra via de administracion. Otras formulaciones contempladas incluyen nanopartfculas proyectadas, preparaciones liposomales, eritrocitos liberados que contienen el principio activo y formulaciones basadas en inmunologfa.

Una composicion farmaceutica puede prepararse, envasarse o comercializarse a granel/como una dosis unitaria

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individual, o como una pluralidad de dosis unitarias individuals. Tal como se usa en el presente documento, una “dosis unitaria” es una cantidad diferenciada de la composicion farmaceutica que comprende una cantidad predeterminada del principio activo. La cantidad del principio activo es generalmente igual a la dosificacion del principio activo que se administrana a un sujeto o una fraccion conveniente de una dosificacion de este tipo tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de una dosificacion de este tipo.

Las cantidades relativas del principio activo, el portador farmaceuticamente aceptable y cualquier componente adicional en una composicion farmaceutica variaran dependiendo de la identidad, el tamano y el estado del sujeto tratado y dependiendo adicionalmente de la via por la que va a administrarse la composicion. A modo de ejemplo, la composicion puede comprender entre el 0,1% y el 100% (p/p) de principio activo.

Ademas del principio activo, una composicion farmaceutica puede comprender ademas uno o mas agentes farmaceuticamente activos adicionales. Los agentes adicionales contemplados particularmente incluyen agentes antiemeticos y eliminadores tales como eliminadores de cianuro y cianato y otros compuestos inhibidores inmunitarios, tales como ciclosporina, esteroides, anticuerpos frente a citocinas proinflamatorias, citocinas inhibidoras, tales como IL-10, y similares.

Pueden prepararse formulaciones de liberacion controlada o sostenida de una composicion farmaceutica usando tecnologfa convencional.

Tal como se usa en el presente documento, “administracion parenteral” de una composicion farmaceutica incluye cualquier via de administracion caracterizada por la rotura ffsica de un tejido de un sujeto y la administracion de la composicion farmaceutica a traves de la rotura en el tejido. La administracion parenteral incluye por tanto, pero no se limita a, la administracion de una composicion farmaceutica mediante inyeccion de la composicion, mediante la aplicacion de la composicion a traves de una incision quirurgica, mediante la aplicacion de la composicion a traves de una herida no quirurgica que penetra en el tejido, y similares. En particular, se contempla que la administracion parenteral incluye, pero no se limita a, inyeccion subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal y tecnicas de infusion de dialisis renal.

Las formulaciones de una composicion farmaceutica adecuadas para administracion parenteral comprenden el principio activo combinado con un portador farmaceuticamente aceptable, tal como agua esteril o solucion salina isotonica esteril. Tales formulaciones pueden prepararse, envasarse o comercializarse en una forma adecuada para administracion en bolo o para administracion continua. Las formulaciones inyectables pueden prepararse, envasarse o comercializarse en forma de dosificacion unitaria, tal como en ampollas o en recipientes de multiples dosis que contienen un conservante. Las formulaciones para administracion parental incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, disoluciones, emulsiones en vehuculos acuosos u oleosos, pastas y formulaciones biodegradables o de liberacion sostenida implantables. Tales formulaciones pueden comprender ademas uno o mas componentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de suspension, estabilizantes o de dispersion.

Las composiciones farmaceuticas pueden prepararse, envasarse o comercializarse en forma de una disolucion o suspension acuosa u oleosa inyectable esteril. Esta suspension o disolucion puede formularse segun la tecnica conocida, y puede comprender, ademas del principio activo, componentes adicionales tales como los agentes de dispersion, agentes humectantes o agentes de suspension descritos en el presente documento. Tales formulaciones inyectables esteriles pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no toxico aceptable por via parenteral, tal como agua o 1,3 butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no se limitan a, solucion de Ringer, disolucion isotonica de cloruro de sodio y aceites fijos tales como mono o digliceridos sinteticos. Otras formulaciones administrables por via parenteral que son utiles incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparacion liposomal o como un componente de un sistema de polfmero biodegradable. Las composiciones para liberacion sostenida o implantacion pueden comprender materiales hidrofobos o polimericos farmaceuticamente aceptables tales como una emulsion, una resina de intercambio ionico, un polfmero ligeramente soluble o una sal ligeramente soluble.

La celula Treg expandida usando los metodos de la presente invencion puede administrarse a un animal, preferiblemente a un ser humano. Cuando se administran las celulas Treg de la invencion, la cantidad de celulas administradas puede oscilar entre aproximadamente 100.000 celulas y aproximadamente 300 mil millones de celulas infundiendose las celulas en el animal, preferiblemente, un paciente humano que las necesita. Aunque la dosificacion precisa administrada variara dependiendo de cualquiera de varios factores, incluyendo pero sin limitarse a, el tipo de animal y el tipo de estado patologico que esta tratandose, la edad del animal y la via de administracion.

La celula Treg puede administrarse a un animal con una frecuencia de varias veces al dfa, o puede administrarse menos frecuentemente, tal como una vez al dfa, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, o incluso menos frecuentemente, tal como una vez cada varios meses o incluso una vez al ano o menos. La frecuencia de la dosis sera facilmente evidente para el experto en la tecnica y dependera de cualquiera de varios factores, tales como, pero sin limitarse al, el tipo y la gravedad de la enfermedad que esta tratandose, el tipo y la edad del animal, etc.

Una celula Treg puede coadministrarse con otros compuestos diversos (citocinas, farmacos quimioterapicos,

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farmacos inmunosupresores, entre muchos otros). Alternativamente, el/los compuesto(s) puede(n) administrate con una hora, un dfa, una semana, un mes, o incluso mas, de antelacion con respecto a la celula Treg, o cualquier permutacion de los mismos. Ademas, el/los compuesto(s) puede(n) administrate una hora, un dfa, una semana o incluso mas, tras la administracion de una Treg, o cualquier permutacion de los mismos. La frecuencia y el regimen de administracion resultaran facilmente evidentes para el experto en la tecnica y dependeran de cualquiera de varios factores tales como, pero sin limitarse a, el tipo y la gravedad de la enfermedad que esta tratandose, la edad y el estado de salud del animal, la identidad del compuesto o los compuestos que estan administrandose, la via de administracion de los diversos compuestos y la celula Treg, y similares.

Ademas, un experto en la tecnica apreciara, basandose en la divulgacion proporcionada en el presente documento, que cuando la celula Treg va a administrarse a un mairnfero, las celulas pueden tratarse de modo que esten en un “estado de no crecimiento”; es decir, las celulas no pueden dividirse cuando se administran a un mai^ero. Tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento, las celulas pueden irradiarse para hacer que no puedan crecer o dividirse una vez administradas a un mai^ero. Se conocen en la tecnica otros metodos, incluyendo haptenizacion (por ejemplo, usando dinitrofenilo y otros compuestos), para hacer que las celulas que van a administrarse, especialmente a un ser humano, no puedan crecer.

La patente ilustra diversos kits que comprenden los reactivos usados para aislar una celula Treg de una muestra de sangre de cordon umbilical humana. El kit comprende un anticuerpo que se une espedficamente a una molecula sobre la superficie de una celula Treg, tal como CD25, un aplicador y materiales de instrucciones que describen el uso del kit para realizar los metodos de la invencion. Aunque mas adelante se describen kits a modo de ejemplo, el contenido de otros kits utiles resultara evidente para el experto en la tecnica a la luz de la presente divulgacion. Mediante el termino “aplicador”, tal como se usa el termino en el presente documento, quiere decirse cualquier dispositivo incluyendo, pero sin limitarse a, una jeringa hipodermica, una pipeta, y similares, para administrar los compuestos y composiciones de la invencion.

“Material de instrucciones”, tal como se usa el termino en el presente documento, incluye una publicacion, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresion que puede usarse para comunicar la utilidad de la composicion y/o el compuesto en el kit para lograr el alivio o el tratamiento de las diversas enfermedades o trastornos enumerados en el presente documento. De manera opcional o alternativa, el material de instrucciones puede describir uno o mas metodos de alivio de las enfermedades o trastornos en una celula o un tejido o un mai^ero, incluyendo tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento.

La invencion describe ademas un kit para multiplicar una Treg a partir de una muestra de sangre de cordon umbilical humana. El kit comprende un anticuerpo que se une espedficamente a CD3 y un anticuerpo que se une espedficamente a cD28. Los anticuerpos del presente kit pueden ser anticuerpos aislados, anticuerpos unidos a un soporte ffsico, tal como una perla magnetica, u otros anticuerpos descritos en otra parte en el presente documento o conocidos en la tecnica. El kit puede comprender ademas una citocina, tal como IL-2, para cultivar, multiplicar o expandir de otro modo una celula Treg de la presente invencion. El kit se usa conforme a los metodos dados a conocer en la invencion. El kit puede comprender ademas un aplicador y un material de instrucciones para el uso del mismo.

La invencion se describe ahora haciendo referencia a los ejemplos siguientes. Estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos.

Ejemplos

EJEMPLO 1 - Aislamiento y cultivo de celulas CD45RA+ de sangre periferica humana de adulto Purificacion mediante MACS de celulas CD25+ y CD25 para cultivo

Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de preparaciones de capa leucodtica, que se derivaban de la sangre completa de donantes voluntarios sanos normales (Memorial Blood Centers, Minneapolis, MN). Se centrifugaron celulas de capa leucodtica rica en leucocitos sobre capas de Ficoll-Hypaque para recoger PBMC. Se aislaron celulas CD25+ usando las siguientes microperlas basadas en anticuerpo indirectas. Se tineron PBMC con anticuerpo anti-CD25-FITC, clon 2A3 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), se lavaron y entonces se unieron secundariamente a microperlas de multiples clases anti-FITC (5 microlitros/107 celulas, Miltenyi Biotec, Auburn, CA) y se seleccionaron positivamente. Volvieron a aplicarse las celulas CD25+ a una segunda columna, se lavaron y volvieron a eluirse. Tras la purificacion en columna, se desprendieron las perlas de multiples clases anti-FITC. Las celulas CD25+ se sometieron a deplecion adicionalmente de celulas que expresaban CD8, CD14, CD19, CD20 y CD56 con un coctel de microperlas recubiertas con AcM para la deplecion de linaje. Entonces se seleccionaron estas celulas con deplecion de linaje CD25+ (DC-8x-menos) para detectar CD45RA mediante seleccion positiva directa con microperlas anti-CD45RA (20 microlitros/ 107 celulas, Miltenyi). En algunos casos, se aislo una purificacion adicional de celulas anti-HLA-DR+ de las celulas CD45RA mediante seleccion positiva con microperlas anti-HLA-DR (20 microlitros/107 celulas, Miltenyi). Las celulas CD25 se sometieron a deplecion adicionalmente de CD25 mediante una segunda ronda de deplecion con microperlas anti- CD25 directas (20 microlitros/107 celulas, Miltenyi). Tras la deplecion de CD25, se seleccionaron entonces estas

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celulas positivamente para CD4 con microperlas anti-CD4 directas (20 microlitros/107 celulas, Miltenyi).

Cultivo de celulas CD25+ y CD25

Se cultivaron celulas CD25+ aisladas, subconjuntos de CD25+ o celulas control CD4+CD25 a 1 millon de celulas totales/ml en placas de 24 pocillos. Se anadio un numero igual de celulas alimentadoras CD4+CD25 irradiadas a los cultivos. Se anadieron Dynabeads recubiertas con AcM anti-CD3/CD28 (Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA) a una razon 3:1 de perlas con respecto a celulas como estimulo de crecimiento, y se anadio una dosis moderada de IL-2 en el dfa 3, a 50 Ul/ml en el medio nuevo (Chiron, Emeryville, CA) (Godfrey, et a/., 2004, Blood, 104: 453-461; Levine, et a/., 1998, J. Hematother., 7: 437-48). Para cultivos de sangre de cordon, no se requenan celulas alimentadoras para el cultivo o la conservacion de la funcion supresora, y por tanto no se usaron. Se dividieron los cultivos celulares segun fuese necesario, aproximadamente 1/3 cada 3 dfas durante la fase de crecimiento rapido. El medio de cultivo era RPMI-1640 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA) complementado con FCS al 10% (Invitrogen- Gibco), y L-glutamina, penicilina y estreptomicina.

Las lmeas celulares aisladas anteriormente usando una estrategia basada en MACS para el aislamiento de celulas CD4+CD25+ para la generacion de la lmea celular Treg a partir de sangre de adulto mostraban potencia variable, lo que estaba provocado posiblemente por celulas T convencionales contaminantes. Para mejorar la estrategia de purificacion, se analizaron celulas CD25+ para detectar subconjuntos mediante analisis de citometna de flujo. Un subconjunto de celulas CD4+CD25+ podna estar enriquecido adicionalmente en celulas supresoras, o a la inversa, un subconjunto podna estar enriquecido en celulas T convencionales. El enfoque descrito en el presente documento era caracterizar marcadores de subconjuntos, purificar selectivamente estos subconjuntos celulares y luego evaluar su capacidad para formar lmeas celulares con funcion supresora potente.

Los primeros marcadores analizados fueron CD45RO, un marcador de celulas de memoria, y CD45RA, un marcador de celulas T indiferenciadas. Se ha notificado que el subconjunto CD45RO+ de celulas CD4+CD25+ contiene las celulas supresoras, ya que las celulas CD4+CD25+CD45RO+ recien aisladas conteman la mayor parte de la actividad supresora de celulas CD4+CD25+ (Jonuleit, et a/., 2001, J. Exp. Med, 193: 1285-1294). Las celulas CD4+CD25+CD45RO-menos teman una actividad supresora minima en ensayos funcionales (MLR alogenica secundaria). Se sugirio que las celulas CD4+CD25+CD45RO-menos eran celulas T convencionales. Puesto que las celulas T convencionales normalmente producen un sobrecrecimiento de celulas supresoras en cultivo, se investigo la deplecion de las celulas CD4+CD25+CD45RO-menos como medio para mejorar la generacion de lmeas celulares.

Se evaluaron celulas CD4+CD25+ purificadas para detectar la expresion de CD45RA y CD45RO mediante analisis de FACS (figura 1). Las celulas CD25+ coexpresaban CD45RO en aproximadamente el 80% de las celulas (media del 80%, intervalo de 62-89, n=6). Las celulas CD25+ tambien conteman un subconjunto de celulas que coexpresaban CD45RA en aproximadamente el 20% de las celulas (media del 24%, intervalo 15-38, n=6). El alto nivel de expresion de estos antfgenos era mutualmente excluyente, pero hay un numero significativo de celulas dobles positivas que expresan solo bajas cantidades de ambos antfgenos, y un diagrama de puntos de dos colores revela un espectro de expresion completo. Las celulas CD45RA+ no expresaban CD25 a los niveles mas altos, y las celulas brillantes para CD25, que se pensaba que eran celulas Treg verdaderas, parecen no expresar CD45RA (figura 2). Estos datos indican por tanto que la deplecion del subconjunto CD45RA enriquecena adicionalmente las celulas Treg CD45RO+, y se intento la eliminacion de estas celulas CD4+CD25+CD45RA+.

El sistema de purificacion indirecta con una microperla escindible permitm la purificacion de celulas CD25+, la eliminacion de la perla magnetica y luego la deplecion de las celulas CD45RA1. Usando una capa leucodtica tfpica, el material de partida tema aproximadamente 500 millones de celulas, y a traves de purificacion se obtuvieron aproximadamente 10 millones de celulas CD25+, 7 millones de celulas negativas para el linaje CD25+, 5 millones de celulas CD45RA-menos y 1 millon de celulas CD45RA+. Se representan las purificaciones a partir de dos donantes (figura 1). Se cultivaron estas diversas poblaciones de CD25+ con una ronda de estimulacion con perlas anti-CD3/28. Tras 3 semanas, se sometieron a prueba las lmeas celulares para determinar su capacidad para suprimir MLR alogenica.

Para evaluar la funcion supresora de estas lmeas celulares, se uso un ensayo de MLR alogenica de HLA no coincidente como lectura funcional. Los ensayos de MLR que responde a CD4+ y estimulada con DC son muy robustos y constantes entre donantes, y por tanto sirvieron como medicion convencional de la supresion. Se examinaron inicialmente todas las lmeas celulares para detectar actividad supresora en MLR tras 2-3 semanas de cultivo, y luego se analizaron adicionalmente a lo largo de las siguientes 3-4 semanas.

Sorprendentemente, fueron las lmeas celulares derivadas de CD45RA+ (que se esperaba que fuesen celulas T convencionales y que carecieran de actividad) las que demostraron una potente actividad supresora (figura 11). En cambio, las lmeas derivadas de celulas CD45RA-menos teman una funcion supresora muy escasa. Se sometieron a prueba doce donantes de lmeas celulares, y las lmeas celulares 10/12 rA demostraron una potente actividad supresora y las lmeas celulares 2/12 RA-menos demostraron actividad similar. Estos datos, y el porcentaje de supresion mediada por estas lmeas celulares se representan en un diagrama de dispersion, que tambien incluye celulas seleccionadas CD25+ normales de sangre de adulto y sangre de cordon (figura 3).

Dos subconjuntos principales de celulas CD25+ humanas. CD45RA* y HLA-DR+

El analisis adicional de subconjuntos de celulas CD25+ revelo que las celulas CD45RA+ eran distintas de las celulas Treg humanas brillantes para CD25+, descritas de manera clasica (Baecher-Allan, et a/., 2001, J. Immunol., 167: 1245-1253; Godfrey, et a/., 2004, Blood 104: 453-461; Hoffmann, et a/., 2004, Blood 104: 895-903). Informes previos 5 han indicado que estas celulas son CD25+ hi, y positivas para CTLA-4 (Jonuleit, et a/., 2001, J. Exp. Med., 193: 1285-1294). Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran que las celulas CD45RA son distintas. En diagramas de puntos de dos colores, se mostro que las celulas CD45RA eran negativas para CTLA-4 intracelular (figura 4A), negativas para HLADR (figura 4B). La doble tincion para CD25 frente a HLA-DR revela que las celulas HLA-DR+ son las celulas brillantes para CD25+ (figura 4C), y se tinen de manera doble para CTLA-4 10 intracelular (figura 4D). Esto demuestra dos subconjuntos celulares distintos.

La purificacion de las celulas HLA-DR se realizo mediante seleccion positiva adicional de la poblacion de celulas Cd45RA(-). Esto dejo tres subconjuntos de celulas CD25+, las celulas CD45RA+, las celulas hLa-DR+ y los “dobles negativos”. Se cultivaron los tres subconjuntos y se sometieron a prueba para detectar la funcion supresora. Las lmeas celulares derivadas de CD45RA+ mediaban en la funcion supresora mas potente. Las celulas dobles 15 negativas mediaban en un nivel medio de supresion y las HLA-DR+ mediaban en la peor actividad supresora (figura 5).

EJEMPLO 2- Las celulas CD45RA+ humanas de adulto suprimen la proliferacion de celulas T

Celulas respondedoras y estimuladoras para cultivos de ensayo de reaccion mixta de linfocitos (MLR)

Se aislaron celulas T respondedoras CD4+CD25 de preparaciones de capa leucodtica derivadas de la sangre 20 completa de donantes voluntarios sanos normales (Memorial Blood Centers, Minneapolis, MN). Se centrifugaron las celulas sobre Ficoll-Hypaque para recoger PBMC. En primer lugar se sometieron a deplecion las PBMC de celulas CD25+ con microperlas recubiertas con AcM anti-CD25 (Miltenyi-Biotec), antes de aislar celulas T CD4+ mediante seleccion positiva con microperlas magneticas recubiertas con AcM anti-CD4 (Miltenyi-Biotec). Las celulas eran de manera rutinaria puras al 96-98% mediante analisis de FACS. Se generaron celulas dendnticas (DC) inmaduras a 25 partir de monocitos CDH+ (Sallusto y Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med., 179: 1109-1118), se aislaron de PBMC, mediante purificacion basada en perlas magneticas (Miltenyi-Biotec), y se cultivaron en medio X-vivo-15 (BioWhittaker, Walkersville, MD) a 1 millon de celulas/ml complementado con GM-CSF (50 ng/ml final) e IL-4 (20 ng/ml final; R&D Systems, Minneapolis, MN). Se cultivaron las celulas durante 5-10 dfas antes de su uso como estimuladores en MLR. Para algunos experimentos, se maduraron DC con LPS (Sigma, St. Louis, MO) (100 ng/ml), 30 o TNF-alfa (20 ng/ml final) y Poli I:C, un ligando agonista de receptor de tipo Toll (TLR)-3 (20 |ig/ml final) (Sigma) durante dos dfas (Godfrey, et a/, 2004, Blood 103: 1158-1165; Cella, et a/, 1999, J. Exp. Med., 189: 821-829). Se irradiaron estimuladores de DC a 30 Gy.

Cultivo de ensayo de MLR

Se cultivaron 5x104 celulas T CD4+CD25 respondedoras y 5x103 celulas presentadoras de antfgeno (APC) 35 estimuladoras de DC por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos. Se anadieron lmeas de celulas T convencionales o supresoras cultivadas a 2,5x10 por pocillo para ensayos convencionales, o en numeros graduados para experimentos de titulacion. Para experimentos de bloqueo de anticuerpos, se usaron 104, o 5x103 celulas supresoras. El medio de cultivo era RPMI-1640 complementado con FCS al 10%. Se pulsaron los pocillos en los dfas 3, 5, 6 y 7 con 3H-timidina durante las ultimas 16 horas de cultivo. Cada punto de tiempo tema 6 replicas. Los 40 resultados se expresaron en cuentas por minuto. Se recogieron los datos con un contador beta directo (sin centelleo lfquido), por tanto la magnitud de los resultados era menor pero proporcionalmente correcta.

Analisis de citocinas

Se eliminaron por centrifugacion las celulas de los sobrenadantes de cultivo de MLR y se congelaron almuotas a -80°C. Para reestimulaciones, se usaron perlas anti-CD3/CD28 a una razon 1:1 de perlas con respecto a celulas. Se 45 evaluaron los sobrenadantes mediante el sistema de ensayo Luminex con un sistema de multiples analitos basado en perlas de latex (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Potencia de la supresion mediada por lmeas celulares derivadas de CD45RA+

Se realizaron experimentos de titulacion para evaluar adicionalmente la potencia de supresion. La disminucion del numero de supresores anadidos a cultivos de MLR estimulados con DC convencionales demostro que se mantema 50 casi toda la actividad inhibidora de supresores derivados de sangre de cordon a una razon de 1:16 o 1:32 (tan solo 1500 celulas supresoras con respecto a 50.000 respondedoras). Esto es ligeramente mas potente (~2 veces) que las lmeas celulares derivadas de adulto mas potentes seleccionadas (linaje” CD25+).

Como evaluacion adicional de la potencia, se evaluaron lmeas celulares supresoras en MLR donde habfan madurado los estimuladores de DC. La activacion/maduracion de DC con lipopolisacarido (LPS), (ligando de TLR4), 55 o la combinacion de TNF/polilC (ligando de TLR 3 analogo de ARN bicatenario), no condujo a la evitacion de la supresion. Ademas, la inclusion de LPS o TNF/PolilC en el cultivo de MLR, tampoco evito la supresion. Por tanto, las

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celulas Treg derivadas de CD45RA+ tanto eran potentes como activaban DC, expresando abundantemente moleculas coestimuladoras y citocinas. Ademas, las DC y las moleculas coestimuladoras expresadas no pod^an evitar el efecto supresor de las celulas CD4+CD25+.

Las celulas supresoras derivadas de CD45RA+ alteran la produccion de citocinas en MLR

Para determinar los efectos de las lmeas celulares supresoras sobre celulas T respondedoras en ensayos de MLR, se evaluaron los sobrenadantes de cultivo para detectar la presencia y la magnitud de multiples citocinas. La adicion de celulas supresoras a ensayos de MLR redujo marcadamente la acumulacion de citocinas dependientes de activacion de celulas T, incluyendo IL-2, IFN-gamma, GM-CSF, TNF-a e IL-10. La acumulacion de citocinas dependientes de activacion era minima en todos los puntos de tiempo durante la MLR suprimida. Estos datos demuestran una alteracion marcada de la activacion de celulas T.

La reactivacion de lmeas celulares supresoras induce produccion de citocinas minima

Para determinar las capacidades funcionales de las lmeas de celulas T supresoras frente a convencionales, se evaluo su potencial para la produccion de citocinas y la expresion de moleculas de superficie celular tras la reestimulacion. Se reestimularon las lmeas celulares con perlas anti-CD3/CD28 para lograr una reactivacion potente, y se recogieron los sobrenadantes en puntos de tiempo definidos para el analisis del contenido en citocinas mediante ensayo basado en perlas Luminex. Las lmeas celulares derivadas de CD45RA+ no produjeron esencialmente IL-2, IFN-y ni IL-10, mientras que las lmeas celulares derivadas de CD25 control produjeron altos niveles de estas citocinas. La acumulacion de TNF, GM-CSF e IL-5, y la quimiocina IL-8, estaba tambien notablemente reducida en comparacion con lmeas celulares control.

EJEMPLO 3- Aislamiento y cultivo de sangre de cordon humana que tiene un fenotipo CD45RA+

El papel cntico de celulas Treg en el trasplante y la inmunologfa de sangre de cordon no se ha apreciado generalmente (Barker, et al, 2003, Crit. Rev. Oncol. Hematol., 48: 35-43). Muchos investigadores usan CD4+ totales seleccionadas de poblaciones de sangre de cordon como modelo representativo de celulas T verdaderamente indiferenciadas para fines de caracterizacion inmunologica (Kaminski, et al, 2003, Blood 102: 4608-4617). Sin embargo, a la luz de los datos dados a conocer en el presente documento, puede ser necesario reevaluar algunos estudios previos con celulas CD4+ con deplecion de CD25 (Jonuleit, et al, 2000, J. Exp. Med., 192: 1213-1222). Estas celulas pueden ser un factor contribuyente a la baja tasa de GVHD experimentada en trasplante de sangre de cordon (CBT) (Wadlow, et al, 2002, Biol. Blood. Marrow. Transplant., 8: 637-647).

Purificacion mediante MACS de celulas T CD25+ y CD25 CD4+

Se aislaron celulas T CD25+ y CD25-CD4+ de sangre de cordon umbilical (Cruz Roja, Saint Paul, MN). Se prepararon celulas mononucleares de sangre de cordon mediante centrifugacion sobre Ficoll-Hypaque segun las directrices del fabricante. Tras la deplecion de CD34+ con microperlas magneticas (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), se aislaron celulas CD25+ mediante seleccion positiva con microperlas magneticas anti-CD25 conjugadas directamente (4 microlitros por 107 celulas; Miltenyi Biotec). Entonces se aplicaron las celulas a una segunda columna magnetica, se lavaron y volvieron a eluirse. Tras el procedimiento de doble columna, las celulas eran de manera rutinaria puras a >90% (para CD4/CD25) mediante analisis de FACS. Entonces se aplico la fraccion distinta de CD25 a otra columna magnetica para someter a deplecion cualquier celula CD25+ restante, antes del aislamiento de celulas CD4+CD25- mediante seleccion positiva con microperlas recubiertas con AcM anti-CD4 (Miltenyi Biotec). La purificacion rigurosa de celulas CD25+ de adulto uso microperlas anti-CD25-FITC y anti-FITC (2 microlitros por 107 celulas), y paso sobre columna magnetica y elucion durante dos ciclos. A esto le siguio la liberacion de las perlas magneticas, y la posterior deplecion de linaje con microperlas conjugadas directas anti-CD8, CD14, CD19 y CD56 (lin-CD4+CD25++) tal como se describe en Godfrey, et al. (2004, Blood 104: 453-461).

Cultivo de celulas Tree de sangre de cordon

Se cultivaron celulas CD4+CD25+ aisladas o celulas CD4+CD25 control tal como se describe en Godfrey, et al. (2004, Blood 104: 453-461) con Dynabeads recubiertas con AcM anti-CD3/CD28 (obtenidas de la Universidad de Pensilvania y descritas en Levine, et al, 1998, Hematother., 7:437-448) a una razon de tres a uno de perlas con respecto a celulas. Se cultivaron las celulas a 1 millon de celulas totales/ml en placas de 24 pocillos. Se anadio IL-2 el dfa 3 a 50 UI/ml (Chiron, Emeryville, CA). En contraposicion al estudio anterior, se cultivaron todas las lmeas sin celulas alimentadoras. Para cultivos de sangre de cordon, la adicion de celulas alimentadoras irradiadas (celulas CD4+CD25-) (Godfrey, et al. 2004, Blood 104: 453-461), no era util ni para la expansion ni para la conservacion de la funcion supresora, por tanto se omitieron las celulas alimentadoras para simplificar el protocolo de cultivo. Se dividieron los cultivos celulares segun fuese necesario, aproximadamente de uno a tres cada tres dfas durante la fase de crecimiento rapido. El medio de cultivo era RPMl-1640 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA) complementado con suero de ternero fetal al 10% (FCS; Invitrogen-Gibco), y L-glutamina, penicilina y estreptomicina.

La sangre de cordon contiene una poblacion distinta de celulas CD4+CD25+

Se ha mostrado que las celulas mononucleares de sangre de cordon (CBMC) contienen celulas T CD4+ que

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coexpresan CD25. Por tanto, los presentes resultados dan a conocer una evaluacion del potencial de estas celulas para generaciones de lmeas celulares supresoras y funciones supresoras. Se uso analisis de FACS para confirmar que las CBMC conteman una poblacion significativa de celulas T CD4+ que coexpresan CD25+, y que esta era una poblacion de celulas diferenciada (figura 6A). En cambio, la sangre de adulto contiene celulas T CD4+ con un amplio espectro de niveles de CD25, incluyendo una gran poblacion de celulas atenuadas para CD25 no supresoras (figura 6B). Aproximadamente el 5% de las celulas T CD4+ de sangre de cordon expresaban de manera distinta CD25+ (media del 5,2%, intervalo 2,3-9,5%, n=20), un porcentaje ligeramente mayor que el presente en celulas T CD4+ de sangre periferica de adulto (media del 3,8% de CD4+). Para la comparacion directa de la purificacion, se aislaron celulas Treg CD25+ de sangre tanto de adulto como de cordon usando un protocolo basado en MACS identico (seleccion basada en anticuerpo anti-CD25 directa). Las celulas CD25+ purificadas de sangre de cordon conteman una poblacion mas centrada de celulas brillantes para CD25+ (MFI 320 frente a 130), y menos celulas atenuadas para CD25 o negativas para CD25 (figura 6C), media del 9% (intervalo 5-21%, n=10) y del 3% (intervalo 1-9%, n=10) respectivamente. En comparacion, se encontro que las celulas CD25+ derivadas de sangre de adulto conteman mas celulas atenuadas para CD25 y negativas para CD25 (figura 6D), media del 30% (intervalo 25-38%, n=10), y del 10% (intervalo 2-24%, n=10) respectivamente.

Las celulas CD25+ de sangre de cordon son CD45RA+

Se purificaron celulas CD25+ de sangre den cordon mediante seleccion directa. Se tineron para CD25 y CD45RA. Las celulas son predominantemente CD45RA1 (figura 7).

Lmeas celulares derivadas de CD4CD25+ de sangre de cordon seleccionadas mediante MACS tienen de manera sistematica una potente funcion supresora

Las celulas Treg CD25+ derivadas de adulto purificadas de manera rigurosa estimuladoras con perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28, complementadas con IL-2, inducen expansion significativa. Se uso esta estrategia de cultivo para generar lmeas celulares a partir de celulas CD4+CD25+ de sangre de cordon o de adulto purificadas, asf como celulas CD4+CD25 de sangre de cordon para comparacion. Las celulas CD4+CD25+ derivadas de sangre de cordon se expandieron facilmente en cultivo; aproximadamente 100 veces a lo largo de tres semanas con una unica estimulacion inicial. Tras de tres a cuatro semanas, las lmeas celulares dejaron de expandirse en numero, y se mantuvieron en IL-2. Por tanto, las curvas de crecimiento de estas lmeas celulares eran similares a las de las lmeas celulares CD4+CD25+ derivadas de sangre de adulto.

EJEMPLO 4- Las celulas de sangre de cordon CD45RA+ suprimen la proliferacion de celulas T Celulas estimuladoras y respondedoras para cultivos de reaccion mixta de linfocitos (MLR)

Se aislaron celulas T respondedoras CD4+CD25 de preparaciones de capa leucocftica derivadas de la sangre completa de donantes voluntarios sanos normales (Memorial Blood Centers, Minneapolis, MN). Se centrifugaron las celulas sobre Ficoll-Hypaque para recoger PBMC. En primer lugar se sometieron a deplecion las PBMC de celulas CD25+ con microperlas recubiertas con AcM anti-CD25 (Miltenyi-Biotec), antes de aislarse celulas T CD4+ mediante seleccion positiva con microperlas magneticas recubiertas con AcM anti-CD4 (Miltenyi-Biotec). Las celulas eran de manera rutinaria puras al 96-98% mediante analisis de FACS. Se generaron celulas dendnticas (DC) inmaduras a partir de monocitos CD14+ (Sallusto, et al, 1994, J. Exp. Med., 179: 1109-1118), se aislaron de PBMC, mediante purificacion basada en perlas magneticas (Miltenyi-Biotec), y se cultivaron en medio X-vivo-15 (BioWhittaker, Walkersville, MD) a 1 millon de celulas/ml complementado con GM-CSF (50 ng/ml final) e IL-4 (20 ng/ml final) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Se cultivaron las celulas durante 5-10 dfas antes de su uso como estimuladores en MLR. Para algunos experimentos, se maduraron DC con LPS (Sigma, St. Louis, MO) (100 ng/ml), o TNF-alfa (20 ng/ml final) y Poli I:C, un ligando agonista de receptor de tipo Toll (TLR)-3 (20 |ig/ml final) (Sigma) durante dos dfas (Spisek, et al, 2001, Cancer Immunol. Immunother., 50: 417-427; Godfrey, et al, 2004, Blood 103: 1158-1165). Se irradiaron estimuladores de DC a 30 Gy.

Cultivo de ensayo de MLR

Se cultivaron 5x104 celulas T CD4+CD25 respondedoras y se cultivaron 5x103 APC estimuladoras de DC por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos. Se anadieron lmeas de celulas T supresoras o convencionales cultivadas a 2,5x104 por pocillo para ensayos convencionales, o numeros graduados para experimentos de titulacion. Para experimentos de bloqueo de anticuerpos, se usaron 104 o 5x103 celulas supresoras. El medio de cultivo era RPMI- 1640 complementado con FCS al 10%. Se pulsaron los pocillos los dfas 3, 5, 6 y 7 con 3H-timidina durante las ultimas 16 horas de cultivo. Cada punto de tiempo tema 6 replicas. Se expresaron los resultados en cuentas por minuto. Se recogieron los datos con un contador beta directo (sin centelleo lfquido), por tanto la magnitud de los resultados era menor pero proporcionalmente correcta.

Funcion supresora de celulas QfTiA tal como se determina mediante analisis de MLR

Para evaluar la funcion supresora de las lmeas celulares, se uso un ensayo de MLR alogenico de HLA no coincidente como lectura funcional. Los ensayos de MLR que responde a cD4+ y estimulada con DC son muy robustos y constantes entre donantes, y por tanto sirvieron como medicion convencional de la supresion. Se

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examinaron inicialmente todas las lmeas celulares para detectar actividad supresora en MLR tras 2-3 semanas de cultivo, y luego se analizaron adicionalmente a lo largo de las siguientes 3-4 semanas. Sorprendentemente, las lmeas celulares derivadas de celulas CD25+ de sangre de cordon eran supresoras de manera constante y potente (figura 8A). Se aislaron lmeas celulares supresoras potentes de 29 de 30 donantes, donde la inhibicion de la proliferacion era normalmente >95% (figura 8b). Las lmeas celulares control derivadas de celulas CD25 de sangre de cordon o de adulto no eran supresoras (figura 8B). Las lmeas celulares derivadas de celulas CD25+ de adulto (aisladas directamente), manifestaron actividad supresora debil y variable (figuras 8A y 8B). Se notifico anteriormente que se requena seccion basada en MACS rigurosa para generar lmeas celulares significativas, potentes, supresoras en un subconjunto de donantes adultos. La supresion mediada por estas lmeas (linaje CD25++) se representa en las figuras 8A y 8b, lo que demuestra la constancia notable de las lmeas celulares derivadas de sangre de cordon.

Para evaluar adicionalmente la potencia de supresion, se emprendieron experimentos de titulacion. La disminucion del numero de supresores anadidos a cultivos de MLR estimulados con DC revelo que se mantema casi toda la actividad inhibidora de supresores derivados de sangre de cordon a una razon de 1:16 o 1:32 (tan solo 1500 celulas supresoras con respecto a 50.000 celulas respondedoras). Esto es mas potente (~2 veces) que las lmeas celulares derivadas de adulto mas potentes seleccionadas (lin- pCD25+) (figura 2C). Las lmeas celulares derivadas de celulas CD25+ de adulto seleccionadas directamente eran escasamente supresoras tras la titulacion.

Como evaluacion adicional de la potencia, se evaluaron lmeas celulares supresoras en MLR donde habfan madurado los estimuladores de DC. La activacion/maturacion de DC con lipopolisacarido (LPS), (ligando de TLR4), o la combinacion de TNF/polilC (ligando de TLR 3 analogo de ARN bicatenario) (Cella, et al, 1999, J. Exp. Med., 189: 821-829), no evito la supresion (figura 2D). Ademas, la inclusion de LPS o TNF/PoliIC en el cultivo de MLR no evito la supresion. Por tanto las celulas Treg derivadas de cordon eran tan potentes como las lmeas celulares de adulto mejor seleccionadas, y las DC activadas, que expresan abundantemente moleculas y citocinas coestimuladoras, no podfan evitar su efecto supresor.

Las celulas supresoras de sangre de cordon alteran la produccion de citocinas con menos efecto sobre la produccion de quimiocinas

Para determinar los efectos de las lmeas celulares supresoras sobre celulas T respondedoras en ensayos de MLR, se evaluaron los sobrenadantes para detectar la presencia y la magnitud de multiples citocinas. La adicion de celulas supresoras a ensayos de MLR redujo notablemente la acumulacion de citocinas dependientes de activacion de celulas T, incluyendo IL-2, IFN-gamma, GM-CSF, TNF-a e IL-10. De manera importante, los niveles de acumulacion de TGF-beta-i no paredan estar alterados. La acumulacion de citocinas dependientes de activacion era minima en todos los puntos de tiempo durante la MLR suprimida, representandose los resultados en el tiempo de la deteccion maxima en DC-MLR control (figura 9A). Estos datos demuestran una marcada alteracion de activacion de celulas T. Para determinar los efectos de la supresion sobre la expresion de quimiocinas seleccionadas, se evaluaron sobrenadantes de MLR para detectar la expresion de IL-8 (CXCL8), MIP-Ia (CCL3) y RANTES (CCL5), quimiocinas proinflamatorias. En puntos de tiempo tempranos, no se observo ningun efecto sobre la acumulacion (figura 9B). Sin embargo, en puntos de tiempo tardfos en MLR, la acumulacion disminuyo en aproximadamente el 50-75%. Por tanto, parece que la produccion de quimiocinas se ve menos afectada por la supresion, y hay cierto grado de selectividad en los efectos de celulas supresoras.

Estudios de celulas Treg CD4+CD25+ tanto de ser humano como de raton no han revelado un mecanismo de accion claro de la supresion in vitro (Shevach, 2002, Nat. Rev. Immunol., 2: 389-400). De manera consecuente con estudios previos, las celulas supresoras cultivadas derivadas de sangre de cordon requenan contacto celular para realizar su funcion (no supriirnan a traves de una membrana semipermeable), y no eran citotoxicas. Puesto que se notifica de manera variable que TGF beta es un factor primario en la supresion mediada por celulas Treg (Chen, et al, 2003, Cytokine Growth Factor Rev., 14: 85-89), y se notifico que rLAP alteraba la funcion supresora (Nakamura, et al, 2004, J. Immunol., 172: 834-842), se evaluo cuidadosamente la ruta de TGF-beta con multiples reactivos neutralizantes, incluyendo rLAP. Se encontro que multiples antagonistas de TGF-beta, incluso en diversas combinaciones, afectaban mmimamente a la supresion. Anticuerpos neutralizantes frente al factor inmunosupresor IL-10 o su receptor no tuvieron ningun efecto sobre la supresion. Esto concuerda con la falta de produccion de IL-10 por las celulas supresoras de sangre de cordon incluso con estfmulos activantes muy fuertes. Por tanto, en el sistema de MLR in vitro dado a conocer en el presente documento, ni TGF-beta ni IL-10 parecen ser los mediadores primarios de la supresion, y las moleculas que median en la supresion siguen sin caracterizarse.

EJEMPLO 5- Caracterizacion de celulas Treg CD25RA+ de adulto humanas

Anticuerpos monoclonales

Para evaluar la purificacion, se tineron celulas con anticuerpo anti-CD25-PE (clon M-A251) (BD Pharmingen, San Diego, CA), que no se bloquea por microperlas anti-CD25. Otros anticuerpos para citometna de flujo inclman anticuerpo anti-CD4-PerCP (clon SK.3), de (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA); anticuerpo anti-CD 152-PE (BNI3), anticuerpo anti-CD27-FITC (M-T271), anticuerpo anti-CD62L-APC (Dreg56), anticuerpo anti- CD69-FlTC (FN50), anticuerpo anti-CD134 (ACT35), de (BD Pharmingen); y anticuerpo anti-GITR-PE (110416), de

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(R&D Systems). En experimented funcionales disenados para bloquear la supresion, se usaron anticuerpos neutralizantes a 10 |ig/ml. Los anticuerpos inclman anticuerpo anti-CTLA4(BNI3) (BD Pharmingen), anticuerpo anti- PDl (Jl16) (eBioscience, San Diego, CA), anticuerpo anti-OX40 (L106) de (Becton Dickinson) y anticuerpo anti-GITR (MAB689), anticuerpo anti-GITR-L (MAB6941), anticuerpo anti-OX40L (mAb10541), anticuerpo anti-IL10 (MAB217), anticuerpo anti-IL10-Receptor-alfa (MAB274), anticuerpo anti-TGFbeta-1,2,3 (1D11), anticuerpo anti-TGFbeta-1 (MAB1835), anticuerpo anti-TGFbeta 1/1,2 de pollo policlonal (AF-101-NA), de (R&D Systems).

Las celulas supresoras cultivadas funcionan independientemente de IL-10 y TGF-beta

Para determinar si las lmeas celulares supresoras cultivadas funcionan a traves de protemas reguladoras negativas de superficie celular o inmunosupresoras solubles conocidas, se trataron ensayos supresores de DC-MLR con anticuerpos monoclonales neutralizantes o bloqueantes. Se evaluaron los ensayos para detectar la reversion de la supresion mediante la reanudacion de la proliferacion. Inicialmente, se sometieron a prueba anticuerpos frente a IL- 10, IL10R y TGF-betai 2 3 solos o en diversas combinaciones con efecto mmimo. Solo combinando los tres anticuerpos a altas dosis (30 |ig/ml) se observo una reversion moderada y probablemente no espedfica de los efectos de supresion. Los cultivos control tratados con los tres anticuerpos tambien demostraron un aumento de la proliferacion, similar a celulas Treg tratadas con los tres anticuerpos.

Citometna de flujo

Para la tincion de inmunofluorescencia, se tineron las celulas durante 30 minutos a 4°C. Se lavaron las celulas y se procesaron en un citometro FACS Calibur (Becton Dickinson). Se analizaron los datos mediante el software FlowJo version 4.5 (Treestar, Ashland, OR). Se realizo la tincion intracelular usando celulas fijadas en paraformaldefudo al 2%, seguido por permeabilizacion y tincion en tampon que contema saponina al 0,1%.

Analisis estadfstico

Todas las barras de error representan una desviacion estandar por encima y por debajo de la media.

Fenotipo de lmeas supresoras derivadas de CD45RA+

Se analizaron las lmeas celulares mediante citometna de flujo para detectar antigenos asociados con fenotipo de celulas supresoras. Se cultivaron lmeas celulares supresoras en paralelo con lmeas celulares derivadas de CD4+CD25 que sirvieron como controles de celulas T convencionales. Las lmeas celulares mantuvieron un fenotipo y una funcion relativamente estables durante las siguientes 3-5 semanas. Las lmeas celulares CD25+ derivadas de CD45RA+ mantienen una expresion notablemente uniforme de multiples antfgenos, incluyendo CD25, CTLA4 intracelular, CD27 y CD62L. En comparacion, las lmeas celulares derivadas de CD45RA(-) eran heterogeneas para estos antfgenos.

Las lmeas celulares CD25+ derivadas de CD45RA+ mantuvieron una alta expresion de CD25 de superficie celular y CTLA4 intracelular, un patron de expresion considerado tfpico del fenotipo de las celulas Treg. Esto se produce a pesar del hecho de que otros antfgenos de activacion tales como CD69, CD71 y OX40 han regresado a la expresion de nivel inicial. Las lmeas celulares supresoras derivadas de CD45RA+ tambien expresan uniformemente tanto CD62L como CD27. Dentro de las lmeas celulares supresoras derivadas de adulto potentes, las celulas con funcion supresora residen dentro de este subconjunto doble positivo (Godfrey, et al., 2004, Blood 104: 453-461). Las lmeas celulares derivadas de CD25 tambien mantienen la expresion de CD27, pero a un menor nivel que las lmeas celulares derivadas de CD25+. Este patron de expresion atenuado para CD27 tambien se observo con lmeas celulares derivadas de CD25 derivadas de adulto (Godfrey, et al, 2004, Blood 104: 453-461).

EJEMPLO 6- Caracterizacion de celulas Treg derivadas de sangre de cordon humana

PCR en tiempo real

Se extrajo el ARN total usando reactivo TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) o RNAeasy (Qiagen, Valencia, CA). Se sintetizo ADNc a partir de 1 |ig de cada muestra de ARN usando mezcla maestra universal Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se usaron 10 ng en cada reaccion de qPCR. Se procesaron todas las muestras AU por duplicado. Se adquirieron cebadores y sondas para FoxP3 y ciclofilina A de Applied Biosystems. Se realizo la PCR en tiempo real usando el instrumento ABI Prism 7900 (Advanced Biosystems). Se determinaron los niveles de mensaje de FoxP3 tras normalizar los datos para ciclofilina A.

Inmunotransferencia de tipo Western

Se prepararon extracted nucleares segun las directrices del fabricante usando Active Motif (Carlsbad, CA) y se cargaron 70 |ig de protema por carril. Se procesaron las muestras en minigeles de Bis-Tris al 10% NuPage (Invitrogen). Se transfirieron las protemas a membranas de PVDF y se incubaron con anticuerpo de cabra anti- FoxP3 (AB2481) (Abeam, Cambridge, MA), seguido por anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra-peroxidasa del rabano. Se revelaron las inmunotransferencias con el sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal WestPico (Pierce, Rockford, IL).

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Analisis de citocinas

Se eliminaron por centrifugacion las celulas de sobrenadantes de cultivo de MLR y se congelaron almuotas a -80°C. Para las reestimulaciones, se usaron perlas anti-CD3/CD28 a una razon de uno a uno de perlas con respecto a celulas, o se usaron PMA a 2 ng/ml e ionoimicina a 500 ng/ml. Se cultivaron las celulas a 1 millon de celulas/ml de medio en placas de 24 pocillos. Se evaluaron los sobrenadantes mediante el sistema de ensayo Luminex con un sistema de multiples analitos basado en perlas de latex (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Anticuerpos monoclonales

Para evaluar la purificacion, se tineron las celulas con anticuerpo anti-CD25-PE (clon M-A251) (BD Pharmingen, San Diego, CA), que no esta bloqueado por microperlas anti-CD25. Otros anticuerpos para la citometna de flujo inclrnan anticuerpo anti-CD4-PerCP (clon SK3; Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA); anticuerpo anti- CD152-PE (BNB), anticuerpo anti-CD27-FITC (M-T271), anticuerpo anti-CD62L-APC (Dreg56), anticuerpo anti- CD69-FITC (FN50), anticuerpo anti-CD134 (ACT35), de (BD Pharmingen); y anticuerpo anti-GITR-PE (110416), anticuerpo anti-LAP biotinilado (27240) de (R&D Systems). En experimentos funcionales disenados para bloquear la supresion, se usaron anticuerpos neutralizantes a 10 |ig/ml. Los anticuerpos inclrnan anticuerpo anti-CTLA4 (BNI3) (BD Pharmingen), anticuerpo anti-PDl (Jl 16) (eBioscience, San Diego, CA), anticuerpo anti-OX40 (L106; Becton Dickinson), y anticuerpo anti-GITR (MAB689), anticuerpo anti-GITR-L (MAB6941), anticuerpo anti-OX40L (MAB10541), anticuerpo anti-IL10 (MAB217), anticuerpo anti-IL10-Receptor-alfa (MAB274), anticuerpo anti- TGFbeta-u.s OD1 1), anticuerpo anti-TGFbeta-i (MAB1835), anticuerpo anti-TGFbetai/i 2 de pollo policlonal (AF-101- NA), anticuerpo anti-TGFbetaRH de cabra policlonal (AF-241-NA), anticuerpo anti-LAP (MAB246), anticuerpo antiLAP de cabra policlonal (AF-246-NA), LAP recombinante (246-LP), y TGF-betaRII-Ig recombinante (1003-RT; R&D Systems).

Citometna de flujo

Para la tincion de inmunofluorescencia, se tineron las celulas durante 30 minutos a 4°C. Se lavaron las celulas y se procesaron en un citometro FACS Calibur (Becton Dickinson). Se analizaron los datos mediante el software FlowJo version 4.5 (Treestar, Ashland, OR). Se realizo la tincion intracelular usando celulas fijadas en paraformaldelmdo al 2%, seguido por permeabilizacion y tincion en tampon que contema saponina al 0,1%.

Expresion de FoxP3 y fenotipo de lmeas supresoras derivadas de sangre de cordon

Se analizaron las lmeas celulares mediante citometna de flujo para detectar antfgenos asociados con fenotipo de celulas supresoras. Se cultivaron lmeas celulares supresoras en paralelo con lmeas celulares derivadas de CD4+CD25 que sirvieron como controles de celulas T convencionales. Se evaluaron las lmeas celulares tras 3 semanas de cultivo, momento en el que la activacion basada en perlas casi se habfa resuelto, y las celulas habfan regresado a un estado mas quiescente. Las lmeas celulares mantuvieron un fenotipo y una funcion relativamente estables durante las siguientes 3-5 semanas. Las lmeas celulares CD25+ derivadas de cordon mantienen una expresion notablemente uniforme de multiples antfgenos, incluyendo CD25, CTLA4 intracelular, CD27 y CD62L (figura 10A). En comparacion, las mejores lmeas celulares supresoras derivadas de adulto, generadas mediante la purificacion mas rigurosa, eran ligeramente heterogeneas para estos antfgenos (figuras 10A y 10B).

Las lmeas celulares CD25+ derivadas de cordon manteman una alta expresion de CD25 de superficie celular y CTLA4 intracelular, un patron de expresion considerado tfpico del fenotipo de celulas Treg (figura 10A). Esto se produce a pesar del hecho de que otros antfgenos de activacion tales como CD69, CD71 y OX40 han regresado a la expresion de nivel inicial. Las lmeas celulares supresoras derivadas de cordon tambien expresan uniformemente tanto CD62L como CD27 (figura 10B). Se demostro anteriormente que dentro de lmeas celulares supresoras derivadas de adulto potentes, las celulas con funcion supresora residen dentro de este subconjunto doble positivo (Godfrey, et al., 2004, Blood 104: 453-461). Las lmeas celulares derivadas de CD25 tambien mantienen la expresion de CD27, pero a un nivel menor que lmeas celulares derivadas de CD25+. Este patron de expresion atenuado para CD27 tambien se observo con lmeas celulares derivadas de CD25 derivadas de adulto (Godfrey, et al, 2004, Blood 104: 453-461).

Se ha propuesto que la expresion del factor de transcripcion FoxP3 es el marcador mas espedfico para celulas reguladoras en ratones (Ramsdell, et al., 2003, Curr. Opin. Immunol., 15: 718-24). Los resultados dados a conocer en el presente documento demuestran que el mensaje de FoxP3 se expresaba a niveles superiores en celulas y lmeas CD25+ en comparacion con celulas T y lmeas CD25 . Las celulas CD25+ recien aisladas de sangre de cordon conteman aproximadamente 64 veces mas mensaje que celulas CD4+CD25 , o celulas T CD8+ nuevas (figura 11A). Las lmeas celulares derivadas de CD25+ cultivadas conteman 2-4 veces mas mensaje que celulas CD25+ recien aisladas. Aunque los niveles de mensaje son bajos en celulas CD25 en aislamiento, aumentan aproximadamente 25-30 veces en cultivo. Esto se produjo incluso con deplecion exhaustiva de celulas atenuadas/positivas para CD25 antes del cultivo (figura 11A). La reestimulacion adicional de los cultivos celulares de 3-6 semanas de edad con perlas anti-CD3/CD28 no aumento la expresion de mensaje, sino que mas bien disminuyo ligeramente en ambos tipos de lmeas celulares.

En contraposicion a los datos con niveles de mensaje de ARNm, la inmunotransferencia de tipo Western con un

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anticuerpo policlonal revelo que la expresion de protema FoxP3 se expresaba principalmente en las Imeas celulares derivadas de CD25+. A pesar de la expresion del mensaje, las lmeas celulares derivadas de CD25 expresaban niveles mmimos/de fondo de protema FoxP3 (figura 11B). De manera importante, la reestimulacion de las lmeas celulares CD25+ aumento notablemente la expresion de protema FoxP3. El aumento en el nivel de protema FoxP3 se produjo a pesar del cambio mmimo (disminucion real) en los niveles de mensaje. La reestimulacion de celulas CD25 no indujo todavfa protema FoxP3 en lmeas celulares derivadas de CD25.

Los datos dados a conocer en el presente documento demuestran varias facetas interesantes de la regulacion de protema y mensaje de ARNm de FoxP3. Y lo que es mas importante, se encontro que la protema FoxP3 era relativamente espedfica para celulas supresoras derivadas de CD25+, y estaba mmimamente presente en lmeas celulares derivadas de CD25. Tambien se determino que incluso lmeas derivadas de celulas T CD4+ sometidas a deplecion exhaustiva de CD25 podnan producir cantidades significativas de mensaje de FoxP3 tras la activacion del cultivo, aproximadamente 20-30 veces mas frente a celulas CD25 en reposo. La discordancia entre expresion de protema y ARNm de FoxP3 indica que los niveles de mensaje de FoxP3 no identifican ni cuantifican necesariamente celulas supresoras. Ademas, celulas CD25+ reestimuladas expresaban mucha mas protema FoxP3 a pesar de la disminucion de los niveles de mensaje. Estos hallazgos indican que la expresion de FoxP3 aumenta con la activacion, y sugieren que mecanismos postranscripcionales pueden contribuir a la regulacion de la expresion de protema FoxP3.

La reactivacion de lmeas celulares supresoras induce una produccion de citocinas minima y una expresion potenciada de LAP TGF-beta de superficie

Para determinar las capacidades funcionales de las lmeas de celulas T supresoras frente a convencionales, se evaluaron estas celulas para determinar su potencial para la produccion de citocinas y la expresion de moleculas de superficie celular tras reestimulacion. Se reestimularon las lmeas celulares con perlas anti-CD3/CD28 para lograr una reactivacion potente, y se recogieron los sobrenadantes en puntos de tiempo definidos para el analisis del contenido en citocinas mediante ensayo basado en perlas Luminex. Las lmeas celulares derivadas de CD25+ no produjeron esencialmente IL-2, IFN-y ni IL-10 (figura 12A), mientras que las lmeas celulares derivadas de CD25 control produjeron altos niveles de estas citocinas. La acumulacion de TNF, GM-CSF, IL-5 y la quimiocina IL-8 tambien se redujo notablemente en comparacion con lmeas celulares control (figura l2A). En cambio, la acumulacion de TGF-beta, y las quimiocinas MIPIa y RANTES no eran significativamente diferentes entre diferentes lmeas celulares.

La reestimulacion de las lmeas celulares con los agentes farmacologicos PMA e ionomicina, que pueden evitar rutas de senalizacion proximales, conduce a niveles casi equivalentes de produccion de citocinas por las lmeas celulares derivadas tanto de CD25+ como de CD25 (figura 12B). Por tanto, las lmeas celulares derivadas de CD25+ parecen tener alteraciones de senalizacion de TCR y CD28 proximales que impiden la produccion normal de multiples citocinas. Ademas, las lmeas celulares derivadas de CD25+ teman una produccion alterada de la citocina inmunosupresora IL-10, que no se restauro por la estimulacion con PMA/ionomicina. Esto sugiere que la produccion de IL-10 no es probablemente un mecanismo de supresion importante que se ve afectado por las lmeas celulares derivadas de CD25+.

Para determinar si la activacion general de lmeas celulares CD25+ derivadas de sangre de cordon estaba alterada, se evaluo la expresion de antfgenos de activacion de superficie celular mediante analisis de citometna de flujo. Se reestimularon las lmeas celulares con perlas anti-CD3/CD28 y se evaluaron tras el cultivo durante la noche para detectar expresion de CD69, OX40 (CD 134) y GITR. Los tres antfgenos volvfan a expresarse en las lmeas celulares derivadas tanto de CD25+ como de CD25 (figura 12C). La expresion de OX40 y GITR pareda ligeramente potenciada en las lmeas celulares derivadas de CD25+ frente a las lmeas celulares cD25 reactivadas (McHugh, et al, 2002, Immunity 16: 311-323). De manera importante, la reactivacion de las lmeas celulares CD25+ estaba relativamente intacta, tal como se determino mediante analisis de expresion de antfgenos de activacion de superficie celular, en contraposicion a los resultados mostrados para la acumulacion de citocinas.

Se ha notificado que la expresion en la superficie celular de la protema asociada a latencia (LAP) TGF beta, la protema precursora de TGF beta, esta asociada con celulas Treg (Nakamura, et al, 2004, J. Immunol, 172: 834-842). Ademas, se ha notificado recientemente que formas recombinantes de esta protema neutralizan parcialmente la funcion supresora (Nakamura, et al, 2004, J. Immunol, 172: 834-842). Por tanto, se evaluo la expresion de LAP en las lmeas celulares derivadas de CD25+ y CD25. Ni la lmea CD25+ ni la CD25 expresaban esta protema tras el cultivo durante 3-6 semanas, sin embargo, tras la reestimulacion con perlas anti-CD3/CD28, habfa una expresion distinta de LAP de superficie celular en las lmeas celulares derivadas de CD25+ (figura 12D), pero no en las lmeas celulares derivadas de CD25 . No pudo detectarse expresion en la superficie celular de TGF-beta.

Se encontro que las celulas supresoras (en la reestimulacion) teman un potencial limitado para la produccion de citocinas. Habfa una falta profunda de produccion de IL-2, IFN-gamma e IL-10, y una capacidad notablemente reducida para producir GM-CSF, TNF, IL-5 e IL-8. En cambio, la activacion tal como se evaluo por la expresion regulada por incremento de CD69, OX40 y GITR, y la produccion de MIP-Ia y RANTES, estaba generalmente intacta. De manera interesante, se restauro la capacidad de produccion de citocinas con estimulacion con PMA/ionomicina. Esto indica un bloqueo de senalizacion de TCR proximal parcial en las celulas supresoras, y

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concuerda con las caractensticas de respuesta anergica de las celulas supresoras a la estimulacion con TCR.

Las celulas supresoras cultivadas funcionan mediante un mecanismo desconocido independiente de IL-10, TGF- beta y multiples moleculas coestimuladoras

Para determinar si las lmeas celulares supresoras cultivadas funcionan a traves de protemas reguladoras negativas de superficie celular o inmunosupresoras solubles conocidas, se trataron ensayos supresores de DC-MLR con anticuerpos monoclonales neutralizantes o bloqueantes. Se evaluaron los ensayos para detectar la reversion de la supresion mediante la reanudacion de la proliferacion. Inicialmente, se sometieron a prueba anticuerpos frente a IL- 10, IL-10R y TGF-beta 1,2,3 solos o en diversas combinaciones con efecto mmimo. Solo combinando los tres anticuerpos a altas dosis (30 |ig/ml) se observaron efectos moderados y probablemente no espedficos (figura 13A). Los cultivos control tratados tambien demostraron un aumento de la proliferacion. Tambien se sometieron a prueba anticuerpos frente a las moleculas de senalizacion coestimuladoras negativas CTLA4 y PDl y se encontro que no teman esencialmente ningun efecto por sf mismas, sino de nuevo solo en combinacion se observo un efecto marginal sobre la supresion (figura 13B). Se sometieron a prueba anticuerpos agonistas frente a receptores cuya senalizacion se notifica que suprime o reduce la funcion supresora de celulas Treg murinas en reposo, GlTR (Ji, et al, 2004, J. Immunol., 172: 5823-5827) y OX40 (CD134) (Takeda, et al, 2004, J. Immunol, 172: 3580-3589), y se encontro que teman efectos mmimos sobre las celulas supresoras cultivadas. El anticuerpo agonista frente a OX40 pareda alterar la funcion supresora en algunos donantes mas que en otros (media del 32% de reversion, n=6, intervalo 15-75%). Sin embargo, el anticuerpo agonista frente a OX40 tambien aumentaba la magnitud de la MLR control, en correlacion aproximada con la magnitud de reversion de la supresion (figura 13C). Anticuerpos frente a OX40L inhibfan la MLR (con variabilidad de donante) pero tambien aumentaban la magnitud aparente de la supresion (media del 96% de supresion, n=5, intervalo 90-98%, frente al 90% para cultivos control) (figura 7C).

Debido a la expresion aumentada de LAP de superficie celular espedfica en celulas supresoras cultivadas reactivadas, y a la importancia sugerida de TGF-beta para la funcion supresora (Nakamura, et al., 2004, J. Immunol, 172: 834-842; Chen, et al, 2003, Cytokine Growth Factor Rev., 14: 85-89), se evaluaron multiples agonistas de la ruta de TGF beta. Se sometieron a prueba anticuerpos neutralizantes, tanto monoclonales como policlonales, receptores solubles, LAP recombinante y anticuerpo frente a LAP en el sistema de MLR. Ninguno de los reactivos solos o en multiples combinaciones pudo revertir la supresion mediada por las lmeas celulares Treg cultivadas. Se realizaron experimentos con un menor numero de celulas supresoras, espedficamente una razon 1:10 de celulas respondedoras con respecto a estimulador, para minimizar la potencia de la supresion, dando como resultado una inhibicion de aproximadamente el 50% en MLR control. Incluso en estas condiciones, se observaron efectos mmimos (figura 13D).

Estos estudios demuestran que la sangre de cordon, en comparacion con la sangre de adulto, es una fuente mejorada para el aislamiento y cultivo de celulas Treg. Se aislaron lmeas celulares supresoras potentes de practicamente todos los donantes, y estos resultados se obtuvieron con una purificacion basada en MACS directa sencilla. Los perfiles de citometna de flujo de la expresion de antfgeno en lmeas celulares Treg de sangre de cordon eran sorprendentemente uniformes. Se uso este sistema para caracterizar adicionalmente el fenotipo y la funcion de celulas supresoras.

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REIVINDICACIONES

Metodo para proporcionar celulas Treg, que son celulas supresoras potentes, a partir de una poblacion de celulas sangumeas con fenotipo CD45RA+, para suprimir la proliferacion de celulas T con una actividad supresora potente mayor del 95% de supresion de reaccion mixta de linfocitos alergenica, comprendiendo el metodo:

a) aislar una poblacion de celulas mononucleares de una muestra de sangre de cordon umbilical humana;

b) poner en contacto dicha poblacion de celulas mononucleares con un anticuerpo que se une espedficamente a CD25 en condiciones adecuadas para la formacion de un complejo celula mononuclear-anticuerpo;

c) separar sustancialmente dicho complejo celula mononuclear-anticuerpo de dicha poblacion de celulas mononucleares; aislando de ese modo dichas celulas Treg a partir de una poblacion de celulas sangumeas con fenotipo CD45RA+; y

d) que comprende multiplicar las celulas Treg aisladas obtenidas tras c) cultivando dichas celulas Treg sin celulas alimentadoras en un medio que comprende un anticuerpo frente a CD3, un anticuerpo frente a CD28 y adicionalmente IL-2.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo que se une espedficamente a CD25, dicho anticuerpo frente a CD3 o dicho anticuerpo frente a CD28 se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo aislado, una muestra biologica que comprende un anticuerpo, un anticuerpo unido a un soporte ffsico y un anticuerpo unido a una celula.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo sintetico, un fragmento biologicamente activo de un anticuerpo, y combinaciones de los mismos.

Metodo segun la reivindicacion 3, en el que dicho fragmento biologicamente activo se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv y un fragmento scFv.

Metodo segun la reivindicacion 2, en el que dicho soporte ffsico se selecciona del grupo que consiste en una microperla, una perla magnetica, una columna de absorcion y una membrana de adsorcion.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicho complejo celula mononuclear-anticuerpo se separa sustancialmente de dicha poblacion de celulas mononucleares mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) y clasificacion celular activada por magnetismo (MACS).

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se repiten las etapas b) y c).

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que dicha celula Treg expresa antfgenos CD25, CD4 y CTLA4 y uno o mas antfgenos seleccionados del grupo que consiste en CD27, CD26L y FoxP3.

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