ES2562433T3

ES2562433T3 - Clasificación óptica de células

Info

Publication number: ES2562433T3
Application number: ES07823906.8T
Authority: ES
Inventors: Michael Macdonald; Kishan Dholakia; Igor Andreev
Original assignee: University of St Andrews
Current assignee: University of St Andrews
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2016-03-04
Anticipated expiration: 2027-09-20
Also published as: CA2698488C; GB0618605D0; EP2063988B1; GB0700737D0; WO2008035080A1; EP2063988A1; US20100047761A1; CA2698488A1; US8962235B2

Abstract

Un método para clasificar una mezcla de células diferentes, que comprende: proporcionar un canal único con solo una salida; introducir en el canal una mezcla de células en un fluido; en una región de clasificación del canal, desviar de forma óptica un tipo de células de la mezcla de células a fin de provocar que las células desviadas fluyan en dirección a o se desvíen de una región de procesamiento celular que se extiende solo parcialmente a lo ancho del canal corriente abajo de la región de clasificación del canal, y destruir o desactivar, por medio de un haz de láser, solo las células que fluyen en la región de procesamiento celular o tratar y/o muestrear células que fluyen en la región de procesamiento celular, y/o medir una característica de las células que fluyen en la región de procesamiento celular.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Clasificacion optica de celulas

La presente invention se refiere a la clasificacion optica de celulas Antecedentes de la invencion

Existen numerosos esquemas de clasificacion o separation de partlculas, que van desde electroforesis en gel, electroforesis capilar y centrifugation analltica, hasta las novedosas barreras entropicas. J. Han, H. G. Craighead, Science 288, 1026-1029 (12 de mayo de 2000) y D. Nykypanchuk, H. H. Strey, D. A. Hoagland, Science 297, 987990 (9 de agosto de 2002) describen ejemplos de estos esquemas. La mayorla de estas tecnicas conocidas separan una mezcla polidispersa en un fluido que fluye en bandas que contienen partlculas que se desplazan a diferentes velocidades por la direction del flujo. Normalmente esto conduce a un procesamiento por lotes. En la electroforesis se utiliza un gel para obtener una movilidad dependiente del tamano. La recuperation de las fracciones se consigue mediante el procesamiento posterior del gel. Sin embargo, a pesar de su uso y eficacia extendidos, esta metodologla es lenta y cabe destacar que, debido al tamano limitado del poro, presenta dificultades para separar objetos a nivel de tamano microscopico, por ejemplo celulas, cromosomas y materia coloidal.

Asimismo, se utilizan geles artificiales asimetricos bidimensionales fabricados de forma litografica. Ejemplos de estos se describen por D. Ertas, Physical Review Letters 80, 1548-1551 (16 de febrero de 1998); T. A. I Duke, R. H. Austin, Physical Review Letters 80, 1552-1555 (16 de febrero de 1998) y C. F. Chou et al., Biophysical Journal 83, 2170-2179 (octubre de 2002). Estos geles proporcionan una separacion transversal respecto a la direccion del flujo. Debido a esto, pueden operarse de forma continua, con diversas fracciones recogidas mediante canales de recogida diferentes. No obstante, la clasificacion basada en la difusion resulta poco practica por su lentitud a escala microscopica.

En los ultimos anos se ha experimentado un crecimiento en la exploration del movimiento de partlculas en entornos opticos. Un ejemplo de esto se describe en el artlculo "Kinetically Locked-in Colloidal Transport in an Array of Optical Tweezers" de P. T. Korda et al, Physical Review Letters 89, numero 12, art. n.° 128301 (16 de septiembre de 2002). En este caso, se deja que una monocapa de esferas coloidales fluya por una serie de capturas opticas distintas. Variando la orientation de la serie de capturas, puede variar la direccion del flujo de las esferas. Por este motivo, se ha sugerido que podrla utilizarse la red para fraccionar de manera continua partlculas mesoscopicas. Sin embargo, debido al uso de una red de capturas distintas localizadas, la canalization bloqueada de manera cinetica observada por vectores reticulares de bajo Indice se limito intrlnsecamente a desviaciones de angulo pequeno. En la practica, esto limita la funcionalidad de la red para su uso en el fraccionamiento.

El documento PCT/GB2004/001993 describe otro esquema de fraccionamiento optico. En este caso, se utilizan redes opticas tridimensionales para la clasificacion y el fraccionamiento de material biologico y coloidal en un flujo microfluldico. Las partlculas diferentes siguen trayectorias distintas a traves del entorno y, en consecuencia, salen en puntos diferentes. La selectividad y la base de esta forma de clasificacion es la afinidad de partlculas obtenidas en las caracterlsticas del entorno optico. Esto tambien se describe por M. MacDonald, G. Spalding y K. Dholakia, en Nature 426, 421 (2003), y por A. M. Lacasta, et al., en Physical Review Letters (2005), 94, 188902. Incluso en ausencia de flujo de fluidos pueden utilizarse patrones opticos periodicos para la clasificacion, vease, L. Paterson et al., Applied Physics Letters (2005), 87, 123901.

El documento US 2006/0177940 describe un metodo para separar y analizar partlculas en un flujo microfluldico. El metodo comprende proporcionar un canal microfluldico con una serie de capturas opticas estaticas dispuestas en su interior. A continuation se proporciona un flujo de la solution a traves del canal, en el que la solution contiene una o mas partlculas. Las partlculas se separan, se desvlan o se retienen mediante capturas opticas estaticas que se posicionan en una forma predeterminada, y, si se desea, se centran en una trayectoria para fines anallticos.

En el documento US 2006/0170912 se desvela un metodo adicional de clasificacion de celulas.

Sumario de la invencion

Segun la presente invencion, se proporciona un metodo y un sistema de clasificacion definidos en las reivindicaciones independientes. Algunas caracterlsticas preferentes se definen en las reivindicaciones dependientes.

Proporcionando una disposition muy simple de canal y clasificando de forma optica celulas en este canal, no se requiere separacion flsica de celulas clasificadas en canales separados.

De manera adicional o alternativamente, el segundo proceso optico puede ser alguna forma de espectroscopia, tal como espectroscopia Raman, descrita en nuestra solicitud de patente en tramite GB 0611289.0.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

La clasificacion optica puede realizarse utilizando un entorno o patron optico definido por un dispositivo acustico- optico, descrito en nuestra solicitud de patente en tramite GB 0618606.8.

Breve descripcion de los dibujos

A continuacion se describiran diversos aspectos de la invencion, solo a modo de ejemplo, y con referencia a los dibujos adjuntos, de los cuales:

La Figura 1 es una seccion transversal de un canal microfluldico con una region de clasificacion celular y una region de eliminacion celular;

La Figura 2 muestra una variante en la disposicion de la Figura 1, y

La Figura 3 muestra una disposicion alternativa de clasificacion celular microfluldica.

Descripcion especffica de los dibujos

Las Figuras 1 y 2 muestran un canal unico microfluldico para clasificar, por ejemplo celulas. El canal es cillndrico con una seccion transversal constante, sus extremos definen una entrada y una salida. El canal presenta una region de clasificacion en serie con una region de procesamiento celular, por ejemplo una region de eliminacion celular optica. Se inyecta un analito de interes en un extremo del microcanal, que fluye por el canal y en la region de clasificacion, en la que la clasificacion se realiza utilizando medios opticos.

Las tecnicas para realizar esto se conocen en la materia y por tanto no se describiran con detalle. La clasificacion optica se realiza utilizando una disposicion optica que es eficaz en una region localizada del canal, y no a lo largo de toda su longitud.

Una vez clasificadas las celulas, se desplazan corriente abajo en el flujo de fluidos en direccion a la region de eliminacion celular. Esta region se extiende solo parcialmente sobre la trayectoria del flujo, por lo que algunas celulas entran en ella, pero otras no. En esta region las celulas se eliminan mediante un laser que las hace o bien inviables o las destruye. Para lograr esto, una parte, normalmente el centro, del canal, que se mide a lo ancho, se ilumina con un laser en una longitud de onda y potencia media/potencia maxima que destruira o danara cualquier celula. El material que luego se recoge desde el otro extremo del conducto contiene un flujo enriquecido en celulas, ya que solo las celulas que no han pasado por la region de eliminacion son viables.

La Figura 1 muestra como puede crearse un flujo puro de celulas a partir de una mezcla de celulas A y B, pero con la perdida de casi la mitad de las especies de celulas deseadas. En este caso, la region de eliminacion celular se extiende sobre una parte inferior del canal y el potencial/entorno optico en la region de clasificacion optica se dispone de manera que las celulas B se desvlan en direccion a la parte inferior del canal, pero las celulas A no se ven sustancialmente afectadas y permanecen repartidas en el canal. Cuando la mezcla de partlculas fluye en direccion a la region de eliminacion celular, las celulas A estan presentes en la region superior del canal, pero una mezcla de las celulas A y B esta presente en la region inferior del canal. Puesto que la region de eliminacion celular se extiende parcialmente sobre la parte inferior del canal, las celulas A en la region superior pasan sin verse afectadas, mientras que las celulas en la mezcla A y B se danan o destruyen o de otro modo permanecen biologicamente inactivas. Por lo tanto, en la salida del canal solo se encuentran activas las celulas A, proporcionando as! un analito enriquecido.

La Figura 2 muestra una variante de la Figura 1, en la que una mezcla de muestra de celulas A y B puede clasificarse y procesarse para proporcionar un enriquecimiento de aproximadamente 50 %, mientras garantiza al mismo tiempo que no se destruyan celulas de las especies deseadas. En este caso, la region de eliminacion celular se extiende sobre la parte superior del canal. Como antes, el potencial/entorno optico en la region de clasificacion optica se dispone de manera que las celulas B se desvlan en direccion a la parte inferior del canal segun fluya el fluido por la region de clasificacion celular, pero las celulas A no se ven sustancialmente afectadas y permanecen repartidas a traves del canal. Por consiguiente, cuando la mezcla de celulas A y B fluye en direccion a la region de eliminacion celular, las celulas A estan presentes en la region superior del canal, pero una mezcla de celulas A y B esta presente en la region inferior del canal. En este caso, puesto que la region de eliminacion celular se extiende parcialmente sobre la region superior del canal, las celulas A solo se exponen a la radiacion de eliminacion. Por consiguiente, como la llamada mezcla A y B fluye por la region de eliminacion celular, las celulas A en la region superior se vuelven biologicamente inactivas, mientras que las celulas en la mezcla A y B en la zona inferior no se ven afectadas.

Mientras que la disposicion de la Figura 2 da lugar a una mezcla de celulas vivas en la salida, esta mezcla presentara mas celulas B que celulas A. Volviendo a circular el fluido se produciran mayores niveles de enriquecimiento. Esto podrla lograrse simplemente mediante el cambio de las regiones de clasificacion y eliminacion celular, invirtiendo el flujo y reiniciando el proceso. Este enfoque podrla ser fascinante cuando se intenta clasificar las especies celulares con una poblacion muy baja en comparacion con otros tipos celulares en el analito.

Se utilizan las disposiciones de la Figura 1 o la Figura 2 en funcion de la relacion de las especies celulares que

3

entran en el canal, del nivel de enriquecimiento requerido por el usuario, sin tener en cuenta que sea aceptable o no perder el 50 % de las celulas deseadas.

Podrlan procesarse las celulas clasificadas como alternativa para causar danos. Por ejemplo, en el ejemplo de la 5 Figura 1, las celulas A en la parte superior del canal podrlan orientarse selectivamente y formar poros mediante un segundo laser, de manera tal que puede transfectarse en ellas un agente qulmico o genetico en el medio. Como ejemplo, la transfeccion podrla utilizarse para ensayar la resistencia a antibioticos o para expresar la protelna verde fluorescente. En una realizacion preferente, la salida del laser de formacion de poros se encuentra en forma de un haz de Bessel pero tambien puede logarse con un haz gaussiano. Como se describe en el documento 10 WO2006/059084, esto puede proporcionar ventajas tecnicas significativas. Por consiguiente, en la salida habra una

poblacion seleccionada de celulas que se han tratado. Otra opcion es obtener datos Raman de las celulas clasificadas. Esto puede realizarse utilizando las tecnicas descritas en nuestra solicitud de patente en tramite GB 0611289.0.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para clasificar una mezcla de celulas diferentes, que comprende:

proporcionar un canal unico con solo una salida; introducir en el canal una mezcla de celulas en un fluido;

en una region de clasificacion del canal, desviar de forma optica un tipo de celulas de la mezcla de celulas a fin de provocar que las celulas desviadas fluyan en direccion a o se desvlen de una region de procesamiento celular que se extiende solo parcialmente a lo ancho del canal corriente abajo de la region de clasificacion del canal, y destruir o desactivar, por medio de un haz de laser, solo las celulas que fluyen en la region de procesamiento celular o tratar y/o muestrear celulas que fluyen en la region de procesamiento celular, y/o medir una caracterlstica de las celulas que fluyen en la region de procesamiento celular.
2. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el canal unico presenta una entrada unica y la mezcla de tipos celulares se introduce por esa entrada.
3. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tratamiento de celulas que fluyen en la region de procesamiento celular comprende la formacion de poros en las celulas de la region de procesamiento celular.
4. Un metodo segun la reivindicacion 3, que comprende introducir material en las celulas sometidas a la formacion de poros.
5. Un metodo segun la reivindicacion 1, en el que medir una caracterlstica de las celulas que fluyen en la region de procesamiento celular comprende realizar una medicion espectroscopica.
6. Un metodo segun la reivindicacion 5, en el que la medicion espectroscopica es un espectro Raman.
7. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal unico es un microcapilar.
8. Un sistema para clasificar celulas, que comprende

un canal unico con solo una salida y medios de desviacion optica de celulas dentro de ese canal en una region de clasificacion del canal a fin de provocar que las celulas desviadas fluyan en direccion a o se desvlen de una region de procesamiento celular corriente abajo de la region de clasificacion del canal, en donde la region de procesamiento celular se extiende solo parcialmente a lo ancho del canal, y

un laser para destruir o desactivar solo las celulas que fluyen en la region de procesamiento celular o medios para tratar y/o muestrear celulas que fluyen en la region de procesamiento celular y/o medios para medir una caracterlstica de las celulas que fluyen en la region de procesamiento celular.
9. Un sistema segun la reivindicacion 8, en el que el canal unico tiene una entrada unica y una mezcla de celulas se introduce por esa entrada.
10. Un sistema segun la reivindicacion 8, en el que los medios de tratamiento comprenden un laser que permite efectuar una formacion de poros en celulas de la region de procesamiento celular.
11. Un sistema segun la reivindicacion 10, que comprende medios para introducir material en las celulas a las que se han practicado poros.
12. Un sistema segun la reivindicacion 8, que comprende medios para medir un espectro caracterlstico, opcionalmente medios para medir un espectro Raman.
13. Un sistema segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el canal unico es un microcapilar.