ES2561728A1 - Modelo animal no humano para transtornos del espectro autista, ansiedad y/o depresion - Google Patents
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Abstract
Modelo animal no humano para trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.#La invención da a conocer un modelo de animal transgénico para los trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión, que comprende de manera estable integrado en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4, en el que dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior del animal. Por lo tanto, la invención se refiere a un método para generar este modelo y un método para probar fármacos y fármacos candidatos para el tratamiento de trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
Description
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MODELO ANIMAL NO HUMANO PARA DESÓRDENES DEL ESPECTRO AUTISTA.
ANSIEDAD Y/O DEPRESIÓN
DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a un animal transgénico no humano útil como modelo animal para trastornos del espectro autista, ansiedad y / o depresión. El animal transgénico no humano de la invención comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga integrada de manera estable que codifica la proteína GluK4, en el que dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior (prosencéfalo) del animal. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo técnico del tratamiento de trastornos neurológicos, principalmente, autismo, ansiedad o depresión.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los trastornos del espectro autista o ASDs (colectivamente referidos en este documento como autismo) incluyen un grupo de trastornos neuroconductuales graves y enigmáticos que generalmente se manifiestan en la infancia y persisten para toda la vida. Los ASDs comprenden un conjunto de trastornos del desarrollo que alteran la interacción social y la comunicación, causan en el afectado sentimientos y emociones inestables y, en muchos casos, afectan el desarrollo cognitivo. Los ASDs también se llaman trastornos generalizados del desarrollo, ya que no es un término que designa un tipo de trastorno del desarrollo, sino un término que designa, en un sentido amplio, enfermedades que comparten varios síntomas característicos. En los últimos años, la prevalencia de ASDs en cada país ha aumentado, y por tanto los costes sociales y económicos asociados con ASD han aumentado y la calidad de vida de la familia del paciente ha disminuido. Por esta razón, los estudios sobre el establecimiento de la causa de la ASD y el desarrollo de agentes para el tratamiento de ASD han sido cada vez más necesarios. Con respecto a la causa de ASD, se han estudiado varios factores de riesgo, y la tendencia genética, infección viral, metabolismo anormal y otros factores ambientales incluyendo métodos de crianza, típicamente han sido reconocidos como factores de riesgo y causas.
En los últimos años, se han llevado a cabo estudios en modelos animales sobre la influencia de ciertos factores genéticos de ASD, y a través de estudios genéticos en
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pacientes con ASD se han encontrado varios genes que se creen estrechamente relacionados con este desarreglo. Debido a que los ASDs muestran una alta heredabilidad en comparación con otros trastornos mentales, tales estudios sobre los factores genéticos del autismo son importantes para ampliar la comprensión de las causas biológicas de los ASDs y para desarrollar agentes terapéuticos eficaces contra ellos.
Los modelos animales pueden proporcionar un recurso valioso para el estudio de neuropatologías, así como para el ensayo de compuestos terapéuticos y tratamientos destinados a retardar o detener el trastorno que imitan. Debido a la complejidad genética de los trastornos del espectro autista, las cepas de ratones con una deleción o mutaciones en genes relacionados con autismo se han convertido en una herramienta esencial para investigar los mecanismos moleculares y de desarrollo neurológico subyacente ASD. Los modelos disponibles de ratón para autismo se pueden encontrar en la Iniciativa Simón Foundation Autism Research Initiative (SFARI). Los genes de ASDs sindrómicos se definen como aquellos genes que predisponen al autismo en el contexto de un trastorno sindrómico. Éstos incluyen, pero no se limitan a, CNTNAP2, FMR1, MECP2, NF1, PTEN, SHANK3, TSC1/2 y UBE3A (Provenzano, G. etal. 2012. Disease Markers 33, 225-239).
Durante el desarrollo, el cerebro humano está conformado por las entradas sensoriales y experiencias cognitivas. En este período, la estructura y función de las conexiones neuronales, esenciales para el rendimiento del cerebro, pueden ser alteradas por los cambios en la configuración molecular de sus sinapsis. En el sistema glutamatérgico, por ejemplo, la hiper o hipo-actividad inducida por varios factores representa un modelo atractivo para estudiar la fisiopatología de los trastornos mentales graves. De hecho, se ha encontrado una anomalía cromosómica que altera un gen que codifica para un receptor de glutamato ionotrópico de la clase kainato en individuos con esquizofrenia y en individuos con esquizofrenia y retraso mental (Pickard, B. S. et al. 2012. Human Molecular Genetics 21, 3513-3523). Los genes que dirigen la función sinóptica también parecen influir en el riesgo de autismo (Levy D. et al. 2011. Neuron 70, 886-897; Gilman, S.R. et al. 2011. Neuron 70, 898-907) y, curiosamente, algunos de ellos pertenecen a la familia de subunidades del receptor de glutamato de tipo kainato, como GRIK2 y GRIK4 (Griswold, AJ et al. 2012. Molecular Genética Humana 21, 3513 a 3523). Estudios recientes indican que las mutaciones de novo en la línea germinal y variantes numéricas de copia representan los factores de
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riesgo más significativos para los trastornos del espectro autista de lo reconocido previamente. Éste es el caso de GRIK4, asignado a la citobanda 11q23.3-q24.1, que se encontró duplicada de novo en un caso de autismo (Griswold, A.J. et al. 2012 citado ad supra). Actualmente, no hay modelos animales representativos de ASD procedentes de mutaciones de línea germinal y/o variantes de número de copia.
Los trastornos de ansiedad son algunos de los trastornos psicológicos más prevalentes. La ansiedad es una emoción, conectada a la respuesta del organismo a factores estresogénicos, mientras que los factores de riesgo pueden ser evitables. Los trastornos de ansiedad se clasifican como trastornos de ansiedad no relacionados con el estrés o estrés-relacionados. Trastornos de ansiedad relacionados con el estrés incluyen el trastorno de adaptación y la respuesta de estrés agudo; trastornos de ansiedad no relacionados con el estrés son el trastorno de pánico y el trastorno de ansiedad generalizada. La ansiedad puede ser estudiada en modelos animales. Existen modelos de animales donde el rasgo de ansiedad o el estado de ansiedad ha sido inducido en laboratorio. Por ejemplo, las patentes US6,353,152 y US6,060,642 representan modelos animales para la ansiedad. Sin embargo, los modelos animales descritos en dichas patentes alcanzan un bajo grado de ansiedad y no imitan los episodios agudos de la ansiedad en seres humanos.
En vista de lo anterior, existe una necesidad en el estado de la técnica de proporcionar nuevos modelos animales no humanos para los trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión que representan los múltiples fenotipos de estos trastornos en seres humanos.
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La presente invención se refiere en general a un animal transgénico no humano que puede ser utilizado como un modelo animal no humano para el estudio de los trastornos del espectro del autismo, ansiedad y/o depresión. Dicho animal transgénico se caracteriza porque comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 integrada de manera estable, en donde dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior del animal transgénico. Como consecuencia, el nivel de proteína GluK4 en el animal transgénico (el nivel resultante de la suma de los niveles de proteína GluK4 homologa y heteróloga) se incrementa con respecto al nivel de dicha proteína en el animal no transgénico.
Los ratones que expresan GluK4 de la presente invención se generaron mediante la introducción de 5 copias de la etiqueta Myc en fase con el codón de inicio de GRIK4 y bajo el control del promotor de CaMKII. A continuación, las consecuencias fisiológicas y conductuales de la sobre-expresión del gen GRIK4 en el cerebro anterior del ratón fueron evaluadas utilizando una batería de pruebas electrofisiológicas y comportamentales Como puede verse en el Ejemplo 1, los resultados obtenidos mostraron que el modelo animal transgénico generado reproduce algunos endofenotipos observados en el autismo, imitando la situación en los seres humanos con ASD.
En base a este descubrimiento, los inventores han desarrollado varios aspectos inventivos que se describen en detalle a continuación.
El animal transgénico no humano de la invención
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención se refiere a un animal transgénico no humano que comprende integrada de forma estable en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4, en el que dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior del animal (en lo sucesivo, " animal no humano de la invención").
La expresión "integrado de forma estable en su genoma" se refiere a una secuencia de nucleótidos que está, bien integrado en un cromosoma comprendido en una célula
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o en un animal, por ejemplo, en un cromosoma endógeno o como parte de un cromosoma artificial, o está presente en una forma extracromosómica que no se diluya o pierda durante las divisiones celulares durante el tiempo de vida de la célula. Por ejemplo, un vector viral que no se integra en el genoma de una célula huésped, tal como un vector adenoviral, se conoce como integrado de forma estable en el genoma de una célula, si la célula es una célula que no se divide, tal como una neurona post- mitótica. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 se integra en un cromosoma del animal no humano de la invención y no se diluye o pierde durante el tiempo de vida de la célula. Los descendientes de estas células transfectadas, por lo tanto, también expresan el nuevo gen, resultando en una línea celular transfectada de manera estable.
El término "heterólogo" se refiere a un gen o parte de un gen en un organismo huésped que se deriva de una especie diferente que el organismo huésped. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 es una secuencia de nucleótidos exógena con respecto al animal transgénico no humano. Dicho gen que deriva de una especie diferente de la célula huésped/animal también puede ser llamado "transgén".
La proteína GluK4 es un subtipo de receptor de kainato perteneciente a la familia de canales iónicos activados por ligando que está codificada por el gen GRIK4. Se puede utilizar una secuencia nucleotídica que codifica cualquier proteína GluK4 en el contexto de la presente invención. Ejemplos de proteínas GluK4 incluyen, pero no se limitan a, la proteína GluK4 de rata (Rattus norvegicus), la proteína GluK4 humana (Homo sapiens), la proteína GluK4 de ratón (Mus musculus), la proteína GluK4 de la rata topo (Nannospalax galili), la proteína GluK4 de caballo (Equus przewalskii), la proteína GluK4 de conejo (Oryctolagus cuniculus), la proteína GluK4 de hámster chino (Cricetulus griseus) y la proteína GluK4 de chimpancé común (Pan troglodytes). En una realización particular, la proteína GluK4 es la proteína GluK4 de rata.
Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas están disponibles en bases de datos públicas y se pueden recuperar fácilmente por el experto en el estado de la técnica. Sin embargo, los ejemplos de secuencias de aminoácidos de las proteínas GluK4 incluyen, pero no se limitan a, la proteína GluK4 de Rattus norvegicus (SEQ ID NO: 1, número de acceso NCBI NP_036704 versión NP_036704.1 GI: 10242377), la
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proteína GluK4 de Homo sapiens (SEQ ID NO: 3, NCBI número de acceso AAI46653.1 versión AAI46653.1 Gl: 148921519), la proteína GluK4 de Mus musculus (SEQ ID NO: 4, NCBI número de acceso Q8BMF5, versión Q8BMF5.2 Gl: 341940775), la proteína GluK4 de Nannospalax galili (SEQ ID NO : 5, NCBI número de acceso XP_008824232, Versión XP_008824232.1 Gl: 674105958), la proteína GluK4 de Equus przewalskii (SEQ ID NO: 6, NCBI número de acceso XP_008511947, versión XP_008511947.1 Gl: 664709971), la proteína GluK4 de Oryctolagus cuniculus (SEQ ID NO : 7, NCBI número de acceso XP_008258709.1, versión XP_008258709.1 Gl: 655601372), la proteína GLUK4 de Cricetulus gríseus (SEQ ID NO: 8, NCBI número de acceso XP_007631296, versión XP_007631296.1 Gl: 625279300), y la proteína GluK4 de Pan troglodytes (SEQ ID NO : 9, NCBI número de acceso Q5IS46, Gl versión Q5IS46.1: 61213662). En otra realización particular, la proteína GluK4 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Se debe destacar que la invención no se limita a estas secuencias específicas y que secuencias de proteínas GluK4 adicionales son conocidas en el estado de la técnica.
En vista de lo anterior, la persona experta en la técnica entiende que la proteína GluK4 para ser utilizada en la presente invención se puede derivar de varias fuentes, siendo dicho proteínas variantes funcionalmente equivalentes de cada uno. Así, en el contexto de la presente invención también se contempla variantes funcionalmente equivalentes de la SEQ ID NO: 1. El término "variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1" se refiere a una proteína (o polipéptido) que comprende una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, deleciones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácidos específicos en una o más posiciones específicas en la proteína, y que tiene la misma función que la SEQ ID NO: 1, es decir, pertenece a la familia de receptores de glutamato, mediando la transmisión sinóptica excitatoria. Un ensayo para evaluar si la proteína es una variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1 es, por ejemplo, el ensayo que se describe en los Ejemplos de la solicitud de patente y que comprende la medición de la KAR mediada por las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCkar) en el animal transgénico no-humano que comprende la variante. También sería posible para probar la funcionalidad de la proteína mediante la realización de un ensayo como el descrito en la figura 1b, en donde la secuencia de nucleótidos exógena se ha expresado en células HEK293 junto con un plásmido que codifica subunidades GluK2, donde la corriente sólo podría ser inducida por el agonista ATPA siempre que el producto de dicha secuencia de nucleótidos heteromerice con subunidades GluK2 para formar receptores funcionales.
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Por lo tanto, las variantes de la proteína GluK4 pueden ser (i) una en el que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, (ii) una en el que hay uno o más residuos de aminoácidos modificados, por ejemplo, los residuos que son modificados por la unión de grupos sustituyentes, (iii) una en la que la proteína es una variante de procesamiento (splice-variant) de las proteínas de la presente y/o (iv) fragmentos de las proteínas invención. Los fragmentos incluyen proteínas generadas a través de la escisión proteolítica (proteólisis incluyendo multi-sitio) de una secuencia original. Las variantes se consideran dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de la enseñanza en el presente documento.
Por lo tanto, en una realización particular, la proteína GluK4 comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 95, 96, 97, 98 ó 99% a la SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, la proteína GluK4 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En el contexto de la presente invención, el término "identidad de secuencia" se refiere a la homología entre dos secuencias de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos se dice que son homólogas al exhibir un cierto nivel de similitud. Si dos secuencias homólogas están estrechamente relacionadas o más alejadas se indica con "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alta o baja, respectivamente. Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de una proteína a una secuencia de una segunda proteína. El grado de identidad entre dos proteínas se determina usando algoritmos informáticos y métodos que son ampliamente conocidos por las personas expertas en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente mediante el algoritmo BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].
Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas GluK4 mencionadas anteriormente pueden obtenerse de bases de datos públicas, tales como el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Sin embargo, en una realización
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particular, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO. 2 (Rattus norvegicus, NCBI número de acceso NM_012572, versión NM_012572.1 Gl: 10242376).
Una de las características del animal no humano de la invención es que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 se expresa en el cerebro anterior del animal.
El término "cerebro anterior", también llamado prosencéfalo, se refiere a la parte anterior de las tres divisiones principales del cerebro de los vertebrados en desarrollo. El cerebro anterior es la parte más grande del cerebro, la mayor parte del mismo está formada por la corteza cerebral. Otras estructuras importantes que se encuentran en el cerebro anterior incluyen el tálamo, el hipotálamo y el sistema límbico (una colección de estructuras dentro del cerebro anterior, incluyendo la amígdala y el hipocampo).
Por lo tanto, en una realización particular, la secuencia de nucleótidos se expresa en el hipocampo y/o en el neocórtex.
El término "hipocampo" se refiere a la parte del cerebro que está implicada en la formación, organización y almacenamiento de la memoria. Se encuentra debajo de la corteza cerebral; y en los primates se encuentra en el lóbulo temporal medial, debajo de la superficie cortical. Contiene dos partes principales entrelazadas: el cuerno de Amón y el giro dentado.
El término "neocórtex" o “neocorteza” se refiere a la mayor parte de la corteza cerebral, que abarca los dos hemisferios cerebrales, formadas por seis capas, etiquetadas desde el exterior, I a VI.
Cualquier método conocido en el estado de la técnica para crear animales transgénicos se puede utilizar para obtener el animal transgénico no humano de la invención. Éstos se darán a conocer en detalle más adelante en otros aspectos de la invención.
Como la persona experta entenderá, la secuencia de nucleótidos tiene que estar unida a una secuencia reguladora de la expresión que controle la transcripción de dicha
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secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, en otra realización particular, la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 está unida operativamente a una secuencia reguladora de la expresión. Una secuencia reguladora de la expresión es un segmento de una molécula de ácido nucleico que se refiere a una secuencia promotora o una secuencia aguas arriba (upstream) (tal como un promotor), en la que la activación de los mismos regula (aumentando o disminuyendo) la transcripción de una secuencia de ácido nucleico unida de manera operativa a la misma. Tal como se utiliza en esta descripción, la expresión "operativamente unida" significa que el polinucleótido está dentro de la pauta de lectura correcta para su expresión bajo el control de dichas secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras útiles para la presente invención pueden ser secuencias nucleares que promueven o, alternativamente, secuencias potenciadoras y/u otras secuencias que regulan el aumento de la expresión del polinucleótido. En otra forma de realización más particular, la secuencia reguladora de la expresión es un promotor y/o un potenciador.
El promotor puede ser constitutivo o inducible. Si se desea la expresión constante del polinucleótido, entonces se usa un promotor constitutivo. Ejemplos de promotores constitutivos bien conocidos incluyen el promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor CAGS, un promotor de ubiquitina-C, y similares. Un gran número de otros ejemplos de promotores constitutivos son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar en la aplicación de la invención. Si se desea la expresión controlada del polinucleótido, entonces se debe utilizar un promotor inducible. El nivel de expresión con frecuencia puede ser controlado variando la concentración del inductor de modo que el promotor inducible se estimula más fuertemente o débilmente y, por consiguiente, la concentración del producto transcrito del polinucleótido se ve afectada. Ejemplos de promotores inducibles bien conocidos son: un promotor sensible a andrógenos o estrógenos, un promotor sensible a la doxiciclina, un promotor de metalotioneína, o un promotor de respuesta a ecdisona. Otros ejemplos son bien conocidos en la técnica y pueden ser utilizados para implementar la invención. Además, puede desearse una expresión específica de la secuencia de nucleótidos de interés. En este caso, se pueden utilizar en la presente invención un promotor específico del tipo de célula o un promotor específico del tejido. Por ejemplo, el promotor puede ser específico de células neuronales, específico del cerebro, específico de las neuronas, o específico de células gliales, por ejemplo, el promotor tau, el promotor de la CaMK, el promotor de la Nestina, el promotor GAFP, el promotor de la Tubulina III, u otro promotor conocido
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por los expertos en la técnica por ser activo específicamente en una de estas células de los tejidos. Por lo tanto, en una realización particular, el promotor es un promotor específico del Sistema Nervioso Central, tales como el promotor de la Enolasa Específica de Neuronas (NSE). En una realización particular, el promotor es el promotor de CaMKII alfa o el promotor del gen GRIK4
Como se mencionó anteriormente, el animal transgénico no humano de la invención se caracteriza porque comprende integrada de manera estable en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4, en el que dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior del animal transgénico. Como consecuencia, el nivel de proteína GluK4 en el animal transgénico (el nivel resultante de la suma de los niveles de proteína GluK4 homologas y heterólogas) se incrementa con respecto al nivel de dicha proteína en el animal no transgénico. La presencia de un aumento de los niveles de la proteína GluK4 en el animal puede ser debido a la presencia en el genoma de más de una copia de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4. Por lo tanto, en otra realización particular, el animal transgénico no humano de la invención comprende al menos 2, 3 o 4 copias de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4.
Cualquier animal no humano puede ser utilizado para expresar la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 en su genoma, obteniendo el animal transgénico no humano de la invención. Ejemplos de animal no humano incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, preferiblemente, roedores (ratón, rata, conejillo de indias, rata-topo, etc), primates no humanos, tales como monos o chimpancés. Por lo tanto, en otra realización particular, el animal transgénico no humano de la invención es un mamífero, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en mono, cerdo, rata y ratón.
El animal no humano transgénico de la invención puede tener cualquier fondo genético de los conocidos en el estado de la técnica por un experto en la técnica, es decir, dicho animal transgénico no humano puede venir de un animal de tipo salvaje (WT) o de un animal no humano con un fondo genético incorporando cualquier marcador molecular que está directa o indirectamente relacionado con el autismo, ansiedad o depresión.
Usos del animal transgénico no humano de la invención
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Como se explicó anteriormente, el animal transgénico no humano se caracteriza porque comprende una proteína heteróloga secuencia de nucleótidos que codifica de manera estable GluK4 insertado en su genoma, causando un aumento en los niveles de proteína GluK4. Sorprendentemente, esto origina que el comportamiento de los animales transgénicos imite los síntomas humanos de ASD, la depresión y/o ansiedad. En consecuencia, el animal transgénico no humano de la invención es útil como un modelo animal no humano de dichas enfermedades.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del animal transgénico no humano de la invención como un modelo animal para trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
La invención se dirige al uso de un animal transgénico no humano de la invención para la detección, descubrimiento, la identificación, evaluación y validación de compuestos potencial mente útiles para el tratamiento y/o prevención de ASD, la depresión y/o ansiedad.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para la detección, descubrimiento, identificación, evaluación y/o validar un compuesto para el tratamiento del ASD, la ansiedad y/o depresión, en adelante procedimiento de la invención, que comprende:
(a) administrar un compuesto candidato a un animal transgénico no humano de la invención y
(b) determinar el efecto del compuesto candidato en el comportamiento de dicho animal transgénico no humano, o alternativamente, la determinación del nivel de expresión de la proteína GluK4.
Tal y como se utiliza en este documento, los términos "autismo" y "trastornos del espectro autista" (ASDs) se utilizan indistintamente para describir en general tres de los cinco trastornos del desarrollo que se describen en el Manual Diagnóstico y Estadístico IV (DSM IV-TR): trastorno autista, trastorno de Asperger y el trastorno generalizado del desarrollo no especificado (American Psychiatric Association, 2000). Las características clínicas del autismo incluyen alteraciones en tres categorías de interacciones de comportamiento recíproco sociales, comunicación verbal y no verbal, y actividades propias de su edad e intereses.
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Tal y como se usa aquí, el término "ansiedad" se refiere a un miedo a un objeto no definido, es decir, una reacción emocional ofensiva y agonizante que tenemos en una situación amenazante y peligrosa que puede resultar en resultados negativos. El término "trastornos de ansiedad" se refiere a un trastorno mental en el que surge la ansiedad sin razón y un nivel de ansiedad es demasiado alto. Es decir, este término se refiere a un caso en el que se plantea la excesiva angustia psicológica debido a la ansiedad mórbida o dificultad grave y que se produce en la adaptación a la vida real. Ejemplos de trastornos de ansiedad incluyen, pero no se limitan a, un trastorno de pánico, fobia, un trastorno obsesivo-compulsivo, un trastorno de estrés postraumático, trastorno de estrés agudo, trastorno de ansiedad generalizada, y un trastorno de ansiedad por separación.
Un "trastorno de pánico" es un síntoma de ansiedad extrema en la que el miedo surge de repente y sin ningún motivo, seguido de sofoco o de fuertes latidos del corazón. Es decir, el trastorno de pánico es un trastorno que tiene varios sucesos de ataque de pánico y que pueden ocurrir debido a una fatiga, excitación, comportamientos sexuales, o impactos emocionales. Sin embargo, por lo general, el trastorno de pánico, no puede predecirse y ocurre de repente.
La "fobia" se refiere a un trastorno de ansiedad caracterizado por evitar una situación en particular o sujeto debido a la ansiedad y el miedo de la situación en particular o tema grave. 1) La fobia específica es un trastorno caracterizado por un miedo irracional recurrente y conductas de evitación de un tema o situación particular. 2) La fobia social es un trastorno que se caracteriza por mostrar repetidamente conductas evasivas por miedo a una situación social donde se produce la interacción entre las personas. 3) La agorafobia es un trastorno que se caracteriza por mostrar en varias ocasiones el temor de un lugar o situación en particular.
El "trastorno obsesivo-compulsivo" es un trastorno de ansiedad caracterizado por pensamientos recurrentes no deseados, es decir obsesiones y comportamientos.
El "trastorno de estrés postraumático" es un trastorno de ansiedad caracterizado por una ansiedad persistente en respuesta a un suceso aterrador.
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El "trastorno de estrés agudo" es un trastorno de ansiedad que muestra síntomas similares a los del trastorno de estrés postraumático y que se caracteriza por mostrar síntomas disociativos en respuesta a un evento traumático.
El "trastorno de ansiedad generalizada" es un trastorno de ansiedad caracterizado por la ansiedad crónica y preocupación excesiva con respecto a varias situaciones.
El "trastorno de ansiedad por separación" es una condición en la que un individuo experimenta ansiedad excesiva respecto a la separación de las personas a las que el individuo tiene un fuerte apego emocional. Si la ansiedad por separación excede de un rango normal e interfiere con una vida social normal, esto se puede definir como un estado mórbido. A este respecto, el trastorno de ansiedad de separación se refiere a un caso en el que la ansiedad por separación es excesiva y por lo tanto interfiere con las actividades normales.
Como se usa en este documento, el término "depresión" se refiere a un trastorno del cerebro que comprende los sentimientos y síntomas en un individuo que interfieren con su capacidad para trabajar, dormir, estudiar, comer y disfrutar de la vida. Los ejemplos de trastornos depresivos incluyen, pero no se limitan a, el trastorno depresivo mayor persistente [tal como la depresión psicótica, la depresión posparto, el trastorno afectivo estacional (SAD)] y el trastorno bipolar.
El término "depresión mayor" se refiere a los síntomas severos que interfieren con la capacidad para trabajar, dormir, estudiar, comer y disfrutar de la vida. Un episodio puede ocurrir sólo una vez en la vida de una persona, pero más a menudo, una persona tiene varios episodios.
El término "trastorno depresivo persistente" se refiere a un estado de ánimo depresivo que dura por lo menos 2 años. Algunas formas de depresión son ligeramente diferentes, o pueden desarrollarse bajo circunstancias únicas. Estas incluyen, pero no se limitan a:
• La depresión psicótica, que se produce cuando una persona sufre una depresión grave más alguna forma de psicosis, como tener creencias falsas perturbadoras o una ruptura con la realidad (delirios) o ver o escuchar cosas perturbadoras que otros no pueden oír o ver (alucinaciones).
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• La depresión postparto, que es mucho más grave que los "baby blues" que experimentan muchas mujeres después de dar a luz, cuando los cambios hormonales y físicos y la nueva responsabilidad de cuidar a un recién nacido puede ser abrumador. Se estima que del 10 al 15 por ciento de las mujeres experimentan depresión posparto después de dar a luz.
• El trastorno afectivo estacional (SAD), que se caracteriza por la aparición de la depresión durante los meses de invierno, cuando hay menos luz solar natural. La depresión generalmente se levanta durante la primavera y el verano. El SAD se puede tratar efectivamente con terapia de luz, pero casi la mitad de las personas con SAD no mejoran con la terapia de luz sola. Los medicamentos antidepresivos y la psicoterapia pueden reducir los síntomas del SAD, ya sea solo o en combinación con terapia de luz.
El término "trastorno bipolar", también llamado enfermedad maníaco-depresiva, se refiere a los cambios de humor, el ciclismo en el individuo desde los máximos extremos (por ejemplo, manía) a bajas extremas (por ejemplo, depresión).
En un primer paso, el método de la invención comprende administrar un compuesto candidato a un animal transgénico no humano de la invención.
Los compuestos candidatos o bajo ensayo pueden ser compuestos de cualquier naturaleza, por ejemplo, un producto químico, biológico, microbiológico, etc compuestos aislados o mezclados con uno o más compuestos diferentes, e incluyen compuestos con una composición y estructura conocida o desconocida, productos farmacéuticos con cualquier aplicación terapéutica conocida, productos biológicos, productos microbiológicos, etc., por ejemplo, compuestos químicos orgánicos o inorgánicos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, extractos, etc.
En un segundo paso, el método de la invención comprende determinar el efecto del compuesto candidato en el comportamiento de dicho animal transgénico no humano.
En el animal transgénico no humano de la invención se reproducen algunos endofenotipos vistos en el autismo, ansiedad y/o depresión, por ejemplo, un comportamiento social deteriorado, un déficit en su interacción social, menor actividad que en los animales no transgénicos, la falta de motivación (aumento de períodos sedentarios), anhedonia, comportamiento repetitivo, comunicación defectuosa (por
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ejemplo, la vocalización), etc.; si después de administrar el compuesto candidato al animal transgénico no humano de la invención, el animal cambia uno o más de los mencionados endofenotipos a comportamientos con más interacción social, aumento de la actividad, periodos menos sedentarios, etc; entonces se puede concluir que el compuesto candidato es útil para tratar trastornos del espectro autista, ansiedad y / o depresión.
El término "tratamiento" o "tratar" se refieren a mejorar, atenuar, disminuir o eliminar uno o más de los síntomas de trastornos del espectro autista, la ansiedad y/o la depresión. Por tanto, en el contexto de la presente invención, se considera que un compuesto es útil para tratar trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión cuando uno o más de los síntomas asociados a dichos trastornos se mejora, atenuada, disminuida o eliminada (debido a la administración al sujeto de dicha composición).
El cambio en el comportamiento del animal transgénico no humano de la invención después de administrar el compuesto objeto de ensayo se puede evaluar mediante el uso de una batería de pruebas de comportamiento. Dichas pruebas son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y en la práctica de rutina para la persona experta en la técnica. Cualquiera de ellas puede ser utilizada en el contexto de la presente invención. Las pruebas de comportamiento incluyen, pero no se limitan a, test de interacción social de las tres cámaras, prueba de natación forzada, laberinto elevado en cruz, ensayo en campo abierto y la caja de luz-oscuridad.
Alternativamente, el segundo paso del método de la invención puede comprender determinar el nivel de expresión de la proteína GluK4. Como se explicó anteriormente, el animal transgénico no humano de la invención se caracteriza porque comprende integrado de manera estable en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 y, como consecuencia, el nivel de proteína GluK4 en el animal transgénico (el nivel resultante de la suma de los niveles de proteína GluK4 homólogas y heterólogas) se incrementa con respecto al nivel de dicha proteína en el animal no transgénico. En el contexto de la presente invención, el término "homólogo" es equivalente al término "endógeno" y ambos se refieren a la proteína GluK4 expresada de forma natural por el animal.
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Por lo tanto, si después de administrar el compuesto candidato al animal transgénico no humano de la invención, el nivel de proteína GluK4 en el animal (el nivel resultante de la suma de los niveles de proteína GluK4 homologas y heterólogas) es menor que el nivel de proteína en GluK4 el animal no transgénico equivalente, es indicativo de que el compuesto candidato es útil para tratar trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
Los métodos para determinar los niveles de proteína en una muestra biológica son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y son práctica de rutina para un experto.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del animal transgénico no humano de la invención en el cribado, descubrimiento, identificación, evaluación y/o validación de un compuesto o terapia para tratar trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
Por otro lado, el animal transgénico no humano de la invención, por ejemplo, un ratón, puede, además, ser utilizado mediante su cruzamiento con otros animales no humanos de la misma especie para obtener animales no humanos que tienen el genotipo y el fenotipo característicos de sus progenitores. Los ejemplos de animales no humanos que se pueden cruzar con el animal no humano de la invención incluyen: animales no humanos knock-out para el gen GRIK4, u otros genes directa o indirectamente relacionados con ASDs, ansiedad y/o depresión; animales no humanos que expresan variaciones alélicas, polimorfismos o mutaciones en genes implicados en ASDs, la ansiedad y/o la depresión, o de otros animales no humanos que pueden ser utilizados como modelos animales de ASDs, ansiedad y/o depresión.
Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, también se contempla la progenie, la descendencia o descendientes del animal transgénico no humano de la invención.
Métodos para producir el animal transgénico no humano de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de producción de un modelo animal no humano de autismo que comprende la expresión en el cerebro anterior de un animal no humano una secuencia heteróloga de nucleótidos que codifica la
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proteína GluK4, en el que la secuencia heteróloga de nucleótidos se integra de forma estable en el genoma del animal no humano.
Los métodos para expresar genes en animales no humanos son ampliamente conocidos por la persona experta en la técnica. Por ejemplo, el gen de interés (en la presente invención la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 o transgén) puede ser introducido en el animal no humano mediante el uso de un vector que comprende el gen de interés unido operativamente a una secuencia reguladora, lo que aumenta la expresión del mismo.
En una realización particular, el gen de interés codifica la proteína GluK4 que comprende la secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100% con la SEQ ID NO: 1. En otra realización particular, el gen de interés que codifica la proteína GluK4 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 En otra realización particular, la proteína GluK4 es la proteína GluK4 de rata.
En otra realización particular, la secuencia reguladora es un promotor y/o un potenciador (enhancer), preferiblemente, el promotor es un promotor específico del Sistema Nervioso Central, más preferiblemente, el promotores el promotor de CaMKII alfa o el promotor del gen GRIK4. En otra realización particular, la expresión comprende la introducción de al menos 2, 3 ó 4 copias de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 en el genoma del animal no humano. Por lo tanto, el vector comprende 2, 3 ó 4 copias del transgén. Todas estas realizaciones particulares se han descrito en los párrafos anteriores.
A continuación, el vector puede introducirse en la célula huésped deseada mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, transformación, transducción, electroporación, infección, microinyección, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, liposomas, LIPOFECTINA (TM) (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD.), fusión de lisosomas, lípidos catiónicos sintéticos, uso de una pistola génica o vector transportador de ADN, de tal manera que el transgén se transmite a la descendencia de la línea. Las realizaciones particularmente preferidas de la invención abarcan los métodos de introducción del vector que contiene el transgén mediante inyección pronuclear de un transgénico construir en el mononúcleo de un embrión de ratón y la infección con un vector viral
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que comprende el transgén. En realizaciones preferidas, un vector que contiene el transgén se introduce en cualquier material genético nucleico que finalmente forma parte del núcleo del cigoto del animal que se hará transgénico, incluyendo el núcleo del cigoto. En una realización, el transgén puede ser introducido en el núcleo de una célula germinal primordial que es diploide, por ejemplo, una espermatogenia o un oogonio.
Cuando se desarrolla una transfección estable, los investigadores utilizan marcadores de selección para distinguir las transfecciones transitorias de las estables. La coexpresión de un marcador con el gen de interés permite a los investigadores identificar y seleccionar las células que tienen el nuevo gen integrado en su genoma mientras que también se selecciona contra las células transfectadas transitoriamente. La eficiencia de la integración depende de la técnica de transfección y del vector empleado. Con el fin de identificar y seleccionar células integradoras, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, para la resistencia a los antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con la secuencia del gen de interés, por ejemplo, la secuencia del gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse por selección de fármacos (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán). Tales métodos son particularmente útiles en métodos que implican la recombinación homologa en células de mamífero (por ejemplo, en células madre embrionarias murinas) antes de la introducción de las células recombinantes en embriones de ratón para generar quimeras.
Puede utilizarse un gran número de sistemas de selección para seleccionar células huésped transformadas. En particular, el vector puede contener ciertos marcadores detectables o seleccionables. Otros métodos de selección incluyen, pero no se limitan a seleccionar para otro marcador tal como: genes del virus herpes simplex timidina quinasa, de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, y de adenina fosforribosiltransferasa que se pueden emplear en células tk, hgprt o aprt células, respectivamente. También, la resistencia a antimetabolitos se puede usar como base de selección para los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al
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aminoglicósido G-418; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al, 1984, Gene 30:. 147).
Los animales no humanos transgénicos de la invención pueden obtenerse por cualquier método de transgénesis conocido por la persona experta en la técnica que comprende introducir el vector anteriormente descrita en el genoma de la célula, tales como microinyección, electroporación, bombardeo de partículas, transformación celular seguido por clonación (los núcleos de las células transformadas con éxito se transfieren a óvulos enucleados y se implantan en hembras receptoras), la transformación de gametos (introducir genes en oocitos o espermatocitos y el uso de los gametos transformados para la fecundación, generando un animal completo) y/o microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
En una realización particular del método, la secuencia de nucleótidos se expresa en el hipocampo y/o en el neocórtex.
En otra realización particular, el animal no humano es un mamífero, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en mono, cerdo, rata y ratón.
Una vez que los ratones transgénicos han sido generados pueden ser criados y mantenidos utilizando métodos bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, los ratones pueden ser alojados en una instalación de ambiente controlado mantenida en un ciclo de 10 horas de oscuridad y de 14 horas de luz, o con otro ciclo de luz apropiada. Los ratones pueden aparearse cuando están sexualmente maduros (de 6 a 8 semanas de edad). En ciertas realizaciones, los fundadores transgénicos se aparean con un animal no modificado (es decir, un animal que no tiene células que contienen el transgén), por ejemplo, a ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories).
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto ordinario en la técnica a la que esta invención pertenece.
Todas las composiciones y métodos descritos y reivindicados en el presente documento pueden realizarse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la
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técnica que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos y en las etapas o en la secuencia de los pasos del método descritos la presente sin apartarse del alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en este documento, mientras que los mismos o similares resultados se logran.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Generación de los ratones con sobre-expresión de GluK4 en el cerebro anterior, a, esquema que muestra la disposición del transgén GRIK4. b, respuestas electrofisiológicas inducidas por glutamato (1 mM) y ATPA (0.1 mM) en células HEK293 que expresan el constructo más subunidades GluK2. La respuesta a ATPA revela la formación de receptores GluK2/K4 heteroméricos funcionales. Las barras de calibración verticales son 100 pA (respuesta superior) y 20 pA (parte inferior). La barra horizontal es de 200 ms. c, hibridación in situ en ratones normales (GluK4+/+) y ratones que sobreexpresan GluK4. d, la detección del GluK4 transcrito a partir del transgén por el anticuerpo anti-myc. e, procesamiento glucolítico normal de la proteína GluK4 exógena en ratones GluK4over.
Figura 2A-2G. Los ratones GluK4over muestran mayor expresión de la proteína GluK4 y presentan déficits en la interacción social. Figura 2a, cuantificación mediante Western blot (parte superior) de la proteína endógena (GluK4) y la proteína transgénica derivada (myc-GluK4) en el hipocampo (HPC) y el neocórtex (Ncx) tanto de ratones transgénicos (Tg) como de sus compañeros de camada que no llevan el transgén (WT). Los histogramas de la parte inferior representan la media ± SEM de mediciones de 4 (Tg) y 3 (WT) muestras independientes realizadas por duplicado. Figura 2b, los niveles de expresión de otras subunidades del receptor de kainato (GluK5 y GluK2/3) y subunidades del receptor de AMPA (GluA2/3) en los ratones transgénicos GluK4over y sus compañeros de camada de tipo salvaje en la corteza cerebral y el hipocampo. Los histogramas de la parte inferior reflejan la media ± SEM de mediciones en 4 (Tg) y 3 (WT) animales realizadas por duplicado (*p <0,05, prueba t de Student). Figuras 2c, 2d y 2e, se muestra en la parte superior la representación esquemática del dispositivo de tres cámaras con ejemplos representativos superpuestos de los trayectos realizados por ratones GluK4over y ratones normales en la prueba de interacción social. Los histogramas de la parte inferior son
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cuantificaciones de datos a partir de 11 ratones de cada genotipo. Los ratones GluK4over discriminan bien entre un objeto inanimado y un congénere (Figura 2c), pero al contrario de lo que ocurre en los ratones normales (Figura 2d), los ratones GluK4over pasaron un tiempo similar en las zonas ocupadas por el ratón nuevo y el familiar, respectivamente, lo que indica alteración de la interacción social (Figura 2e). Los ratones GluK4over permanecieron más tiempo en la cámara ocupada por animales familiares, pero lejos de ellos (círculo en la figura 2e) (n=11 ratones de cada genotipo, *** p<0,001, prueba t de Student). Figura 2f, los ratones GluK4over mostraron anhedonia: su preferencia por el agua con sacarosa fue menor que la de los ratones normales (n=22, p<0,001, prueba t de Student). Figura 2g, en la prueba de natación forzada, los ratones GluK4over permanecieron inmóviles durante más tiempo que los ratones normales, lo que es compatible con un estado depresivo. Este comportamiento se invirtió en los ratones deficientes para GluK4 (n=9 ratones de cada genotipo, p<0,001, prueba t de Student).
Figura 3. Prueba de la interacción social en ratones GluK4over. a, trayectorias representantivas de un ratón que sobreexpresa GluK4 en el aparato de tres cámaras. El animal explora ambas cámaras, incluyendo donde se encuentra un ratón nuevo (rojo) y un ratón familiar (gris). La exploración termina con el ratón descansando en la cámara ocupada por el ratón familiar pero lejos de él (flecha), b, cuantificación (n=11 ratones de cada genotipo) del tiempo pasado por los ratones normales y los que sobreexpresan GluK4 en cada cámara excluyendo la interacción directa con los congéneres. * p <0,05; **p <0,01, prueba t de Student.
Figura 4. Los ratones que sobreexpresan GluK4 muestran indicios graves de ansiedad, a-c, trayectos representativos (arriba) de los ratones normales y GluK4over durante la exploración de un laberinto en cruz elevado (a) (líneas más gruesas denotan los brazos cerrados), una arena abierta (b) y la caja de luz-oscuridad (c). El área sombreada en b denota el área no considerada como centro del escenario, que aparece como un cuadro claro. Los histogramas de la parte inferior son cuantificaciones (media±SEM) de varios parámetros de cada prueba de comportamiento a partir de 9 (a, b) y 11 animales (c) de cada fenotipo, p <0,001, test t de Student.
Figura 5. a, los ratones que sobreexpresan GluK4 pasaron más tiempo inactivos que sus compañeros de camada normales (n = 9 ratones de cada genotipo, p <0,001,
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prueba t de Student). b, los ratones transgénicos y sus hermanos de camada control realizan igualmente bien la prueba del rotarod a largo de los días, y no muestran ninguna indicación de impedimento locomotor. Los puntos son media±SEM de 10 experimentos en cada caso.
Figura 6. La transferencia sinóptica a través del circuito trisináptico del hipocampo está alterada en ratones GluK4over. El recuadro en la mitad de la figura muestra la disposición de los electrodos de registro y estimulación en el hipocampo in vivo de animales normales y GluK4over. a, curva de estímulo-respuesta para fEPSP registrado por los electrodos en el estrato molecular del giro dentado (DG) en ratones normales (gris) y que sobreexpresan GluK4 (negro), b, las curvas de estímulo-respuesta para la espiga poblacional registrada justo por debajo de la capa de células granulares del DG. Se aplica el mismo código de color, c, Curva de estímulo-respuesta para el fEPSP evocado trisinápticamente en el estrato radiado de CA1, donde termina la vía de las colaterales de Schaffer. Las curvas son significativamente diferentes (ANOVA de dos vías, p=0,002). Los insertos en a-c son ejemplos ilustrativos de espuestas promediadas (n=9 para GluK4+/+ y 8 para GluK4over). d, La curva de entrada-salida se construyó teniendo en cuenta las amplitudes de la espiga poblacional registrada en el DG como la entrada y la amplitud del EPSP trisináptico de CA1 como la salida del circuito. Las pendientes diferentes en la recta de regresión denotan un cambio en la ganancia del circuito.
Figura 7. La transmisión sinóptica de las fibras musgosas a las células piramidales de CA3 muestra un aumento de ganancia en ratones que sobreexpresan GluK4. A, esquema del hipocampo con los electrodos de registro (Rec) y estimulación (STIM) (MF, fibras musgosas; DG, giro dentado). B-c, EPSCs espontáneas mediadas por KAR en las células piramidales de CA3 registradas a -60 mV de potencial de membrana alineadas y superpuestas (líneas grises). El promedio resultante de todas las respuestas se presenta en línea gruesa. Los valores medios de la amplitud (b, derecha) y tiempos de deactivacción (c) de estas respuestas se muestran para cada genotipo (n=28 y 29 neuronas a partir de 3 ratones GluK4over y GluK4+/+, respectivamente, p <0,001, prueba t de Student). d, mEPSCs mediadas por el receptor de AMPA (Vm=-60 mV) en cada genotipo (arriba) y cuantificación de su frecuencia y amplitud (parte inferior) a partir de 22 neuronas (2 ratones) y 20 neuronas (2 ratones) de ratones GluK4over y GluK4+/+, respectivamente; (p <0,001, prueba t de Student). e, EPSCs producidas por fibras musgosas en neuronas de la CA3 (arriba) y
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su cuantificación (abajo) para cada genotipo (10 neuronas de 5 ratones GluK4over y 13 neuronas a partir de 5 ratones GluK4+/+, p <0,001, prueba t de Student). f, facilitación por pares de pulsos de las respuestas sinópticas de CA3 a varios intervalos para cada genotipo. Los puntos son la mediaiSEM de 22 células (12 ratones GluK40Ve') y 32 células (11 ratones GluK4+/+) (ANOVA de dos vías y post-hoc de test Bonferroni, *** p <0,001; **p <0,01, *p <0,05).
Figura 8. Efecto de la fluoxetina y tianeptina en el modelo de depresión GluK4over. La fluoxetina (un inhibidor de la recaptación de serotonina, ISRS) (10 mg/kg) y tianeptina (8 mg/kg) se inyectaron i.p. durante 30 días y después los animales se sometieron a pruebas de natación forzada. La acción de estos tratamientos sobre la depresión se evaluó anotando el tiempo de inmovilidad. Como puede verse, la tianeptina pero no la fluoxetina, suprime los signos de depresión en ratones GluK4over. Número de animales evaluados: 7 WT y 6 GluK4over de solución salina; 5 WT y 8 GluK4over para la fluoxetina; 9 WT y 10 GluK4over para tianeptina. Los valores son la mediaiSEM. Prueba de ANOVA ** p<0,01, *** p <0,001.
Figura 9. Efecto de la fluoxetina y tianeptina en el modelo de ASD GluK4over. La fluoxetina (10 mg/kg) y tianeptina (8 mg/kg) se inyectaron i.p. a los ratones durante 30 días tras lo cual se les presentó una solución de 3% de sacarosa en agua potable. La acción de estos tratamientos sobre la anhedonia fue evaluada al anotar el consumo de sacarosa en ratones GluK4over y sus hermanos (GluK4+/+) como controles. Como se puede ver, la tianeptina pero no la fluoxetina normaliza la anhedonia en ratones GluK4over. Número de animales evaluados: 7 WT y 6 GluK4over de solución salina; 5 WT y 8 GluK4over para la fluoxetina; 9 WT y 10 GluK4over para la tianeptina. Los valores son la mediaiSEM. Prueba de ANOVA * p <0,05.
Figura 10. Efecto de la tianeptina en el modelo de ansiedad GluK4over. La tianeptina (8 mg/kg) se inyectó por vía intraperitoneal a ratones durante 30 días y después se sometieron al test del laberinto elevado (A) o al test de campo abierto (B). La acción de este tratamiento sobre la ansiedad se evaluó al anotar las entradas en los brazos abiertos (A) o el tiempo pasado en el centro de la arena (B). Como puede verse la tianeptina no tiene acción sobre estos dos parámetros, pero normaliza la actividad locomotora en ratones GluK4over. Número de animales evaluados: 7 WT y 6 GluK4over de solución salina; 9 WT y 10 GluK4over para la tianeptina. Los valores son la mediaiSEM. Prueba de ANOVA ** p <0,01.
Figura 11. Efecto de la fluoxetina en el modelo de ansiedad GluK4over. La fluoxetina (10 mg/kg) se inyectó a los ratones por vía intraperitoneal durante 30 días y después fueron sometidos a la prueba de campo abierto. La acción del tratamiento sobre la 5 ansiedad se evaluó al anotar el tiempo pasado por los ratones en el centro del campo. El inhibidor de la recaptación de serotonina, fluoxetina, no tiene acción sobre el grado de ansiedad en ratones GluK4over. Mas por el contrario, este antidepresivo induce ansiedad en ratones normales y aumenta los signos de ansiedad en ratones GluK4over. La fluoxetina tampoco mejoró la locomoción. Número de animales evaluados: 7 WT y 10 6 GluK4over de solución salina; 5 WT y 8 GluK4over para la fluoxetina. Los valores son la
media±SEM. Prueba de ANOVA * p <0,05, ** p <0,01.
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Ejemplo 1
Modelo animal no humano para los trastornos del espectro autista, ansiedad v/o
depresión
MATERIAL Y MÉTODOS
Los ratones que sobreexpresan GluK4 (ratones GluK4over) utilizados en este estudio fueron generados mediante la introducción de 5 etiquetas Myc en pauta con el codón de inicio GRIK4 bajo el control del promotor de CaMKII. La expresión génica se evaluó mediante hibridación in situ, los niveles de proteína por inmunocitoquímica y en Western blot con anticuerpos de ratón anti-myc y de conejo anti-GluK4. Se utilizaron muestras de tejido del hipocampo y neocórtex de los ratones adultos, y con los Western blot se emplearon adicionalmente anticuerpos contra GluK2/3, GluK5 y GluA2/3. Los ratones GluK4over fueron evaluados en una serie de pruebas de comportamiento, incluyendo paradigmas de interacción social, pruebas de natación forzada para la depresión, el laberinto elevado en cruz, escenario de campo abierto y la caja de luz oscura para la ansiedad. La actividad de la red neuronal se evaluó en el hipocampo in vivo utilizando un tipo de matriz de electrodos Michigan para registrar electrofisiológicamente los potenciales de campo de los subcampos en las áreas CA1 y giro dentado. Los shocks eléctricos aplicados a la vía perforante activan el circuito hipocampo trisináptico y sirven para evaluar las curvas de entrada-salida. La transmisión sináptica de las fibras musgosas al CA3 se estudió con más detalle por grabaciones de patch clamp en rodajas de hipocampo (300 pm) a partir de P19-21 ratones. La transmisión sináptica mediada por receptores KAR y AMPA se evaluó en ratones transgénicos y sus compañeros control de camada en un ensayo ciego. Todo el mantenimiento de los animales y el manejo de acuerdo con la normativa española y de la UE (Directiva 2010/63/UE).
Animales
Los procedimientos experimentales que involucran el uso de ratones vivos se llevaron a cabo de acuerdo con la normativa española y de la UE (2010/63/UE), y fueron aprobados por el Comité de Bioética interno del Instituto de Neurociencias y del CSIC. Los animales se alojaron en jaulas ventiladas en un ambiente SPF de temperatura controlada, (23° C), a una humedad entre 40% y 60%, y en un ciclo de 12 horas de
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luz/oscuridad. Los ratones tenían acceso acf libitum a la comida y el agua y las jaulas se cambiaron semanalmente.
Generación de líneas de ratón
Una etiqueta que contiene 5 epítopos Myc fue añadida al ADNc de rata grikA, justo después del péptido señal (primeros 20 aminoácidos). La funcionalidad del plásmido pcDNA3 myc grikA se ensayó a través de grabaciones electrofisiológicas cuando se expresa en células HEK293. El constructo Myc-grikA para generar los ratones transgénicos se clonó en dos etapas consecutivas. En primer lugar, Myc-grikA se clonó como un fragmento Eco RV-Sma I en el plásmido pNN265 que contiene una secuencia intrónica necesaria para el correcto funcionamiento del promotor de CaMKII (Figura 1). Posteriormente, un fragmento Not I que contiene Myc-grikA y la secuencia intrónica se introdujo en el plásmido PMM403 que tiene el promotor CaMKII insertado en pBluescript (Mayford, M., et al.1996. Transgene Science 274, 1678-1683). La construcción se cortó con la enzima de restricción Sfi I para eliminar la estructura de pBluescript y se inyectó en el pronúcleo de huevos fertilizados (realizado en la Unitat Animáis Transgénics -UAT-CBATEG-, Centre de Biotecnología Animal i Terápia Génica, Universitat Autónoma de Barcelona).
De los nueve fundadores obtenidos, uno se descartó debido a la integración en el cromosoma Y. Se analizaron los niveles de expresión de Myc-grikA en la generación F1 por hibridación in situ, inmunohistoquímica y en Western blots. Dos líneas diferentes con similares niveles de expresión fueron elegidas para estudios posteriores.
Western blots
Lisados de proteínas de hipocampo y corticales se analizaron en Western blots que se testaron con los siguientes anticuerpos primarios: ratón anti-alfa-tubulina (1:1000, Abcam), ratón anti-Myc (1:500, Santa Cruz), de conejo anti-GluR6/7 y de conejo anti- KA2 (1:1000, Millipore), conejo anti-GluR2/3 (1:1000, Novus Biological) y de conejo anti-KA1 (1:1000: un generoso regalo del doctor Melanie Darstein) (Darstein, M., et al. 2003. J. Neurosci. 23, 8013-8019). La unión de anticuerpos fue detectada mediante un analizador de imágenes luminiscentes (LAS-1000plus; Fuji) y se cuantificó con Quantity One 1D Analysis Software (Bio-Rad Laboratories). Para cuantificaciones, todas las densidades se normalizaron a la señal de la tubulina respectiva.
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La prueba de campo abierto se llevó a cabo en un escenario de 50 cm x 50 cm de largo durante 30 minutos, anotando el comportamiento con un sistema de seguimiento de vídeo (Panlab, España). Las diferencias en la distancia recorrida, el tiempo de descanso, y el tiempo en el centro y la periferia del escenario, se calculó para ratones GluK4+/+ y GluK4over en relación con el tiempo total.
Laberinto elevado en cruz
Un laberinto de metal elevado 50 centímetros por encima del suelo que contenía dos brazos oscuros y cerrados, y los dos brazos abiertos y con luz, se utilizó para examinar los comportamientos similares a la ansiedad. Los brazos eran 50x10 centímetros de tamaño con una zona central 10x10 centímetros, y las paredes de los brazos cerrados eran 30 centímetros de alto. Los ratones individuales se colocaron en el centro del laberinto, fueron seguidos durante 10 minutos con una cámara de vídeo y luego volvieron a su jaula de alojamiento. El laberinto elevado fue limpiado entre los ensayos con una solución de alcohol al 70%. El tiempo y la frecuencia de las visitas a las diferentes zonas del laberinto fue evaluado utilizando el Smart Video Tracking System (Panlab, Spain).
Prueba de natación forzada
Cilindros de plexiglás transparente, 50 centímetros de alto y con un diámetro de 25 centímetros, se llenaron hasta aproximadamente a 25 centímetros con agua del grifo a 22-24°C, de tal modo que los ratones no fueron capaces de tocar el suelo o escapar. Los ratones individuales se colocan en el agua para una sesión de 6 minutos y se grabaron en vídeo para su posterior análisis. Al final de cada sesión, los ratones se secaron con una toalla de papel y regresaron a su jaula, y el agua se sustituyó para el siguiente ensayo. El tiempo de inmovilidad, definido como una falta de natación activa, fue anotado.
Prueba de luz/oscuridad
El aparato de prueba consistía en dos cajas rectangulares de plexiglás (20x20x20 centímetros) conectadas por un pequeño pasillo (6 centímetros). Uno era abierto e iluminado, mientras que el otro compartimento estaba oscuro. Cada ratón se colocó en el compartimento oscuro y se mantiene en la arena durante 10 minutos. El tiempo en el que dejó el compartimiento oscuro por primera vez y el tiempo pasado en el compartimento iluminado fue medido por la grabación de vídeo y el análisis utilizando Smart software (Panlab, Spain).
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Prueba de ingesta de sacarosa
La anhedonia fue evaluada mediante el control de la ingesta de sacarosa. Durante una semana, a los animales se les proporcionó dos botellas de agua potable, una con agua del grifo y otra con una solución al 2% de sacarosa. Después de esta aclimatación, los ratones podían elegir beber de cualquiera de las soluciones, de sacarosa o de agua del grifo durante un período de 4 días. Se midió la ingesta de agua y solución de sacarosa diariamente, y se cambió la posición de las dos botellas diariamente para reducir el sesgo lateral. La preferencia por la sacarosa se calculó como un porcentaje del volumen de la ingesta de sacarosa sobre el volumen total de ingesta de líquidos y promedio durante los 4 días de pruebas.
RotaRod
Utilizamos el RotaRod de Ugo Basile (Italia) para la prueba de la coordinación motora. Un día antes de la prueba, los animales fueron entrenados en el set RotaRod a 16 rpm hasta que pudieran permanecer en él durante 30 s. Para las pruebas, el RotaRod se estableció para que acelerara de 4 rpm a 40 rpm en el transcurso de 5 minutos, y la latencia para caer de la varilla fue registrada. La prueba se realizó en 4 días consecutivos, tres veces al día.
Prueba de interacción social de las tres cámaras
Esta prueba se llevó a cabo como se ha descrito previamente (Yang M., et al. 2011. Curr. Protoc. Neurosci. 56, 8.26.1-8.26.16; Smith SE1, et al. 2011. Sci Transí Mecí 3, 103ra97). Brevemente, el aparato social consiste en una caja rectangular de tres cámaras, cada cámara de medición 20 centímetros de largo x 40,5 centímetros de ancho x 22 centímetros de alto. Las paredes divisorias eran de plexiglás transparentes, con pequeñas aberturas (10x5 centímetros) que permitien el acceso a cada cámara. La prueba consistió en cuatro fases: fase I, un periodo de habituación de 5 minutos, donde el ratón se movía libremente en la cámara central; fase II consistió en habituar a los ratones a las tres cámaras durante 5 minutos con dos cilindros de cuadrícula redondas vacías situados en la esquina de cada una de las salas laterales; En la fase III la sociabilidad ratón se determinó durante 5 minutos midiendo el tiempo dedicado por el ratón con libertad de movimientos en la proximidad y en la cámara de la carcasa de la caja de rejilla que contenía un primer ratón extraño; y, finalmente, la fase IV fue la prueba de preferencia por la novedad social, cuando un segundo ratón novel se colocó en el interior del cilindro de rejilla previamente vacío mientras que el primer ratón novedoso se mantuvo dentro de su cilindro de rejilla. La
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preferencia por la novedad social se definió como el tiempo en la cámara con el ratón nuevo y el tiempo de inhalación del ratón novel en comparación con el ratón familiar. Las trayectorias fueron grabadas y analizadas con Smart software.
Registros electrofisiológicos
Los cortes de hipocampo se prepararon a partir de ratones de 14 a 16 días de edad, como se describe en detalle en otros trabajos (Christiansen et al., 2004, J. Neurosci. 24, 8986-8993). En pocas palabras, todo el cerebro que contiene ambos hipocampos se colocó en el escenario de una máquina de cortar vibratome y se cortó para obtener cortes de cerebro sagital de 300 nm de grosor, y que se mantuvieron oxigenados continuamente durante al menos 1 hora antes de su uso. Los registros electrofisiológicos se realizaron a partir de neuronas identificadas visualmente por microscopía IR-DIC utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25°C). Los cortes fueron perfundidos continuamente con una solución que consiste en (en mM) 124 NaCI, 2,69 KCI, 1,25 KH2P04, 4 MgCI2, 2 CaCI2, 26 NaHC03y 10 glucosa (pH 7,3; 300 mOsm), suplementado con fármacos (LY303070, APV, picrotoxina) según sea necesario. Los EPSCs fueron provocados por impulsos eléctricos aplicados al giro dentado con un electrodo bipolar. Grabaciones de células completas selladas herméticamente (>1GQ) se obtuvieron a partir del cuerpo celular de las neuronas piramidales CA3. Los parche de electrodos fueron fabricados de cristal de borosilicato y con una resistencia de 5-10 MQ cuando se llena con (en mM): 122 CsCI, 8 NaCI, 10 HEPES, 5 EGTA, 10 TEA (pH 7,3, 287 mOsm), suplementado con 5 mM de QX-314 (Alomone Laboratories, Israel). El potencial de membrana se fijó utilizando un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments). La resistencia de acceso (8-30 MQ) se controló regularmente durante las grabaciones y las células fueron rechazadas si había cambiado más de un 15% durante el experimento. Los datos fueron filtrados a 2 kHz, digitalizados y almacenados en un ordenador con el software pClamp.
En las células HEK293 transfectadas, los experimentos electrofisiológicos se llevaron a cabo 1 día después de la transfección con el plásmido. Las células fueron perfundidas rápidamente usando un conjunto lineal de tubos de vidrio colocado a 200- 300 mieras desde el cuerpo celular accionado por un dispositivo motorizado bajo el control de un ordenador personal.
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El papel desempeñado por los receptores de kainato (KARs) en la fisiología del cerebro está peor entendida que la de otros receptores de glutamato, sin embargo, ahora está claro que juegan un papel importante en la sinapsis y en la maduración de los circuitos neuronales durante el desarrollo. Para evaluar el posible papel desempeñado por la variación en el número de copias (CNVs) de genes que codifican para la subunidad GluK4 en ASDs, se evaluaron las consecuencias fisiológicas y de comportamiento de sobre-expresión de gr¡k4 en el prosencéfalo de ratón bajo el control del promotor de CaMKII (Figura 1). Dos de 9 líneas de ratones en los que los diferentes niveles de expresión gr¡k4 fue evidente (líneas GluK4over) se seleccionaron. En los Western blot la proteína codificada por gr¡k4, GluK4, se-sobreexpresaba en un 40% en el hipocampo y ligeramente más del 100% en el neocórtex. Otras subunidades KAR fueron inducidas, ya sea en la corteza, pero no en el hipocampo (GluK2) o fueron reprimidos en el hipocampo (Figura 2a, 2b), probablemente reflejando un proceso para compensar el exceso de GluK4.
El efecto de la sobre-expresión de GluK4 en la conducta se evaluó mediante una amplia batería de pruebas de comportamiento, lo que demuestra diferencias significativas entre los ratones GluK4over y sus hermanos GluK4+/+. Dado que el diagnóstico del autismo se basa en el déficit en el comportamiento social, las interacciones sociales se miraron primero. En la prueba de interacción social de tres cámaras (Nadler, J. J. etal. 2004. Genes Brain Behav. 3, 303-314), tanto los ratones GluK4over como los de tipo salvaje interactuaron con más fuerza con un ratón que con un objeto, lo que indica un nivel correcto de la discriminación de los congéneres de los objetos inanimados (Figura 2c). Sin embargo, en contraste con los ratones normales, los GluK4over interactuaron con los ratones igualmente nuevos y familiares cuando se enfrentan a un ratón nuevo (Figura 2c, 2d), lo que indica un déficit en sus interacciones sociales, típica de los ASDs. El seguimiento de las trayectorias de los ratones GluK4over revelaron una tendencia a permanecer en la cámara ocupada por los ratones familiares, aunque lejos de ellos (Figura 2c). Además, el tiempo gastado por los GluK4over en la cámara ocupada por cualquiera de los ratones, excluyendo el área en estrecha proximidad, además reveló que los animales transgénicos pasaron significativamente menos tiempo en la cámara ocupada por el nuevo ratón, tendiendo a permanecer en la cámara ocupada por el ratón familiar una vez la exploración se había completado (Figura 3).
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En niños con ASDs se ha demostrado recientemente algún grado de anhedonia (Chevallier, C., et al 2012. J Autism Dev Disord 42, 1504-1509), es decir, la ausencia de experimentar acontecimientos vitales normalmente placenteros como comer. Curiosamente, los ratones GluK4over reflejan un grado significativo de anhedonia en comparación con ratones normales, como fue evaluado por la menor ingesta de sacarosa (Figura 2f). dado que la anhedonia es un síntoma clínico de la depresión sometimos ratones GluK4over a la prueba de natación forzada. Los animales transgénicos demostraron un índice mayor de inmovilidad que los ratones normales en esta prueba (Figura 2g), lo que demuestra el comportamiento depresivo. Para comprobar la participación directa de la proteína GluK4, este estado depresivo se comparó con ratones deficientes para GluK4. Los ratones KO para grík4 pasaron significativamente más tiempo nadando que los controles y los que sobre-expresan el transgen (Figura 2g), esto muestra una clara correlación entre la expresión de grík4 y el estado anhedónico, y sugiere un papel directo para CNV de grik4 en este trastorno de la conducta. También se ha señalado que los ratones GluK4over podrían experimentar ansiedad, ya que evitan las áreas abiertas. La ansiedad se ensayó directamente en tres pruebas independientes empleadas habitualmente para evaluar tal comportamiento en los animales (Lalonde, R. & Strazielle, C. J.2008. Neurosa. Methods 171, 48-52): el laberinto elevado en cruz, el escenario de campo abierto y una caja de oscuridad/luz. En todas estas pruebas, los ratones GluK4over muestran signos de ansiedad. Por ejemplo, pasaron significativamente menos tiempo en los brazos abiertos del laberinto elevado que sus hermanos (Figura 4a), estaban mucho menos dispuestos a explorar el centro de un campo abierto (Figura 4b) y pasaban más tiempo en la zona oscura que en la de luz en el test de luz/oscuridad (Figura 4c). En general, los ratones GluK4over pasaron menos tiempo en movimiento que sus hermanos, recorriendo distancias más cortas en todas las pruebas. Sin embargo, esto no fue debido a cualquier deterioro motor, dado que los animales transgénicos y de tipo salvaje desempeñan igualmente bien en pruebas de rota-rod (Figura 5). Por el contrario, el aumento de los períodos sedentarios de ratones que sobreexpresan GluK4 podría reflejar una falta de motivación.
A la luz de lo anterior, se cuestionó si la sobreexpresión de la subunidad del receptor GluK4 podría influir en la transferencia de información normal en el cerebro. Los KARs neuronales han sido estudiados ampliamente en el campo CA3 del hipocampo, donde se han localizado en posiciones pre-y post-sinápticas. Además de la memoria, el
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hipocampo ha sido asociado con los aspectos del procesamiento emocional, en particular, con la ansiedad. Por lo tanto, el flujo de información a través del circuito se evaluó en el circuito trisináptico del hipocampo, en la obtención de grabaciones in vivo usando un conjunto vertical de electrodos en animales anestesiados. La estimulación eléctrica suministrada a la vía perforante, la entrada en el circuito trisináptico, evocaron respuestas electrofisiológicas similares a través de los genotipos en el nivel de la primera sinapsis del giro dentado (DG). En consecuencia, no se encontraron diferencias en las curvas de entrada/salida medidas a nivel de las dendritas o el soma (Figura 6). Sin embargo, el potencial postsináptico excitatorio de campo (fEPSP) evocado en el CA1 través de la activación trisináptica parece ser significativamente mayor en los ratones GluK4over que en los ratones normales. En efecto, el trazado de la amplitud de pico de población del DG (PS) versus la pendiente de fEPSP en CA1 (es decir, la entrada y la salida al circuito trisináptico, respectivamente) reveló, además, un cambio en la ganancia de este circuito. Posteriormente, se evaluó la transmisión sinóptica de las fibras musgosas a las neuronas piramidales CA3, el segundo relé sinóptico en el circuito trisináptico, donde GluK4 está fuertemente expresado y parece jugar papeles fisiológicos críticos. Las corrientes mediadas por KAR excitatorios postsinápticos (EPSCKAR) en ratones que sobreexpresaban GluK4 ha tenido una amplitud un 39% más grande que en los ratones normales y con tiempos de desactivación un 13% más rápidos (Figura 7a y 7b). Este resultado confirma que el exceso de proteína GluK4 expresada participa en los KARs funcionales. El análisis de las mEPSC mediadas por receptores AMPA en esta sinapsis, reveló una frecuencia mayor y la amplitud de mEPSCs en ratones GluK4over (Figura 7d), y los EPSCs evocados también fueron consistentemente más grandes (Figura 7e). Por el contrario, la facilitación por pares de pulsos, una clase de plasticidad a corto plazo que es una característica de estas sinapsis, se vió afectado significativamente (Figura 7f). En conjunto, estos datos implican que la transferencia de información en estas sinapsis críticos se altera en ratones que sobreexpresan la subunidad GluK4 de los KARs.
El fenotipo de los ratones GluK40Ver sugiere que esta proteína puede estar implicada en la patogénesis de trastornos del espectro autista, proporcionando un modelo para la investigación mecanicista de la enfermedad. Es importante destacar que, en el presente estudio se demuestra que un aumento moderado en los niveles de proteína (30-50%) en los animales que la sobreexpresan sin embargo se asocia a una penetrancia funcional profunda, alterando la transferencia de información y la
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integración en una red robusta del hipocampo. El autismo se considera una enfermedad del desarrollo cerebral y hay fuerte evidencia que indica que los KARs influyen en el desarrollo de las redes neuronales. Por ejemplo, la actividad de la red inmadura parece influir en el desarrollo de la conectividad sinóptica y los KARS juegan un papel crítico en la actividad de la red de estimulación en ambos del hipocampo en el desarrollo y adultos. Además, la actividad tónica de los KAR influye en la maduración y la elongación de neuritas. Por lo tanto, es concebible que la transmisión sinóptica alterada a través de redes neuronales generalizadas surge como consecuencia del exceso de GluK4 en sinapsis glutamatérgicas particulares durante la formación y maduración de la red, lo que conduce a un cambio permanente en la ganancia sinóptica.
Actualmente, los ASDs se cree que representan un continuo de la misma enfermedad con diferentes grados de severidad, y que hay superposición genética entre los ASDs y otros endofenotipos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos. Por ejemplo, los ASDs están asociados con indicaciones clínicas de la ansiedad. Por lo tanto, es bastante notable que los CNV de un solo gen puedan reproducir algunos endofenotipos vistos en el autismo, y de alguna manera imitar la situación en los seres humanos con un ASD. Tales alteraciones a la expresión de genes en ratones reflejan uno de los mecanismos moleculares que subyacen a los comportamientos anormales en los seres humanos. Por lo tanto, es posible utilizar este ratón para probar directamente tratamientos específicos de comportamientos relacionados con el autismo.
Dadas los claros fenotipos de depresión, ansiedad y anhedonia que estos ratones presentan, se ha querido comprobar si un antidepresivo bien conocido y/o ansiolíticos serían eficaces en estos fenotipos como una prueba de concepto en el uso de este modelo de ratón en la búsqueda de nuevos fármacos terapéuticos. Se decidió probar la fluoxetina y la tiapentina. La fluoxetina también se conoce por los nombres comerciales Prozac, Sarafem, Ladose y Fontex, entre otros, y es un antidepresivo de la clase del inhibidor de la recaptación de serotonina (SSRI) y se utiliza para el tratamiento del trastorno depresivo mayor (incluyendo la depresión pediátrica), trastorno obsesivo -compulsivo (en adultos y niños), la bulimia nerviosa y el trastorno de pánico. La tianeptina, que los nombres de marca son Stablon, Coaxil, Tatinol y Tianeurax, es un medicamento que se usa principalmente para el tratamiento de los principales trastornos depresivos; Químicamente es un antidepresivo tricíclico (TCA), pero tiene diferentes propiedades farmacológicas. Aunque puede servir como un
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promotor de la recaptación de serotonina, la investigación más reciente indica que tianeptina produce sus efectos antidepresivos a través de la alteración indirecta de la actividad de los receptores de glutamato AMPA y NMDA (McEwen, BS et al., 2010, Molecular Psychiatry 15: 237-49; Zhang H. Et al., 2013, Molecular Psychiatry 8, 471484).
Los ratones tipo salvaje y GluK4over fueron inyectados con dosis equivalentes a las de su uso en seres humanos y el efecto sobre los síntomas de la anhedonia, ansiedad y depresión evaluados después de 30 días de tratamiento. La fluoxetina no tenía acción sobre la depresión en el modelo animal GluK4 de depresión según la evaluación de la prueba de natación forzada (Figura 8). Sin embargo, la tianeptina tuvo un fuerte efecto antidepresivo en estos ratones, restableciendo los valores de control de inmovilidad en este ensayo (Figura 8). Del mismo modo, la fluoxetina empeoró la anhedonia en ratones WT, un comportamiento fácilmente detectado en el autismo. Por otro lado, la tianeptina restauró los valores de control de la ingesta de sacarosa en ratones GluK4over, lo que indica una fuerte acción inhibidora de la anhedonia en este modelo de autismo (Figura 9). El efecto sobre la ansiedad se evaluó mediante la prueba de laberinto elevado en cruz y la prueba de campo abierto. La tianeptina no tenía efecto alguno en el tiempo pasado por los animales GluK4over en el centro del campo abierto o en el número de entradas en el brazo abierto del laberinto elevado, lo que indica falta de efecto ansiolítico. Sin embargo, la tianeptina normalizó la actividad locomotora depresiva en ratones GluK4over (Figura 10), lo que indica algún valor terapéutico en este modelo de ratón. En la prueba de campo abierto, la fluoxetina no sólo agravó la ansiedad en ratones GluK4over ansiosos, sino que también produjo un poco de ansiedad en ratones normales (Figura 11). Todos estos datos indican la disparidad de acción de los antidepresivos conocidos y las drogas ansiolíticas dependiendo de la etiología de estas enfermedades, lo que indica que la búsqueda de fármacos nuevos y más adecuados debe continuar para tratar estos trastornos en una forma más afinada.
Claims (27)
- 51015202530351. Un animal transgénico no humano que comprende integrada de manera estable en su genoma una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4, en el que dicha secuencia de nucleótidos se expresa en el cerebro anterior del animal.
- 2. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 1, en donde la proteína GluK4 comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 95% a la SEQ ID NO: 1.
- 3. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 2, en el que la proteína GluK4 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
- 4. Un animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2.
- 5. Un animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína GluK4 es la proteína GluK4 de rata.
- 6. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos se expresa en el hipocampo y/o en el neocórtex.
- 7. Un animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 está unida operativamente a una secuencia reguladora de la expresión.
- 8. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 8, en el que la secuencia reguladora de la expresión es un promotor y/o un potenciador.
- 9. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 9, en el que el promotor es un promotor específico del Sistema Nervioso Central.
- 10. Un animal transgénico no humano según la reivindicación 10, en el que el promotor es el promotor CaMKII alfa o el promotor del gen gr¡k4.5101520253035
- 11. Un animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende al menos 2 copias de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4.
- 12. Un animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el animal es un mamífero, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en mono, cerdo, rata y ratón.
- 13. Un método para la detección, descubrimiento, identificación, evaluación y/o validación de un compuesto para el tratamiento de un trastorno del espectro autista, la ansiedad y/o la depresión, que comprende (a) administrar un compuesto candidato a un animal transgénico no humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y (b) determinar el efecto del compuesto de ensayo sobre el comportamiento de dicho animal transgénico no humano o, alternativamente, la determinación del nivel de expresión de la proteína GluK4.
- 14. Uso de un animal transgénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el cribado, descubrimiento, identificación, evaluación y/o validación de un compuesto o terapia para tratar trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
- 15. Uso del animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como un modelo animal para trastornos del espectro autista, ansiedad y/o depresión.
- 16. Un método de producción de un modelo animal no humano de autismo que comprende la expresión en el cerebro anterior del animal de una de secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4, en el que la secuencia de nucleótidos heteróloga se integra de forma estable en el genoma del animal no humano.
- 17. Método según la reivindicación 16, en donde la proteína comprende GluK4 secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90% a la SEQ ID NO: 1.5101520253035
- 18. Método según la reivindicación 17, en donde la proteína GluK4 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.
- 19. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína GluK4 comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2.
- 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde la proteína GluK4 es la proteína GluK4 de rata.
- 21. Método según la reivindicación 20, en el que la secuencia de nucleótidos se sobreexpresa en el hipocampo y/o en el neocórtex.
- 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 está unida operativamente a una secuencia reguladora de la expresión.
- 23. Método según la reivindicación 22, en el que la secuencia reguladora de la expresión es un promotor y/o un potenciador.
- 24. Método según la reivindicación 23, en el que el promotor es un promotor específico del Sistema Nervioso Central.
- 25. Método según la reivindicación 24, en el que el promotor es el promotor CaMKII alfa o el promotor del gen grik4.
- 26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, que comprende introducir al menos 2 copias de la secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica la proteína GluK4 en el genoma del animal no humano.
- 27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, en el que el animal es un mamífero, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en mono, cerdo, rata y ratón.
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| WO2011009107A2 (en) * | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Children's Memorial Hospital | Animal models of neurological disorders |
| WO2013016279A1 (en) * | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Animal model of autism |
| US20140041062A1 (en) * | 2012-08-03 | 2014-02-06 | Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University | Genetically engineered mouse model for autism spectrum disorder having deletion of shank2 gene and use thereof |
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-
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-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2083267A1 (en) * | 2006-11-15 | 2009-07-29 | National University Corporation Kanazawa University | Diagnosis and treatment of autism using cd38 |
| US20100077493A1 (en) * | 2008-09-19 | 2010-03-25 | Guoping Feng | Genes and pathways involved in bipolar disorder |
| WO2011009107A2 (en) * | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Children's Memorial Hospital | Animal models of neurological disorders |
| WO2013016279A1 (en) * | 2011-07-25 | 2013-01-31 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Animal model of autism |
| US20140041062A1 (en) * | 2012-08-03 | 2014-02-06 | Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University | Genetically engineered mouse model for autism spectrum disorder having deletion of shank2 gene and use thereof |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GRISWOLD ANTHONY J et al. Evaluation of copy number variations reveals novel candidate genes in autism spectrum disorder-associated pathways.Human Molecular Genetics AUG 1 2012 00/08/2012 VOL: 21 No: 15 Pags: 3513-3523 Doi: doi:10.1093/hmg/dds164, todo el documento, en particular Tabla 5. Citado en la solicitud. * |
| POOT MARTIN et al. Recurrent copy number changes in mentally retarded children harbour genes involved in cellular localization and the glutamate receptor complex..European journal of human genetics : EJHG England Jan 2010 00/01/2010 VOL: 18 No: 1 Pags: 39 - 46 Doi: doi:10.1038/ejhg.2009.120 pubmed:19623214, todo el documento. * |
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