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ES2560209T3 - Expresión genética en células individuales para el diagnóstico, pronóstico e identificación de dianas farmacológicas - Google Patents

Expresión genética en células individuales para el diagnóstico, pronóstico e identificación de dianas farmacológicas Download PDF

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ES2560209T3
ES2560209T3 ES10733816.2T ES10733816T ES2560209T3 ES 2560209 T3 ES2560209 T3 ES 2560209T3 ES 10733816 T ES10733816 T ES 10733816T ES 2560209 T3 ES2560209 T3 ES 2560209T3
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cell
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expression
cancer
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Michael F. Clarke
Stephen R. Quake
Piero D. Dalerba
Huiping Liu
Anne Leyrat
Tomer Kalisky
Maximillian Diehn
Jianbin Wang
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Original Assignee
Leland Stanford Junior University
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Abstract

Un procedimiento de identificación de diferentes poblaciones celulares en una muestra celular heterogénea que se toma de un tumor sólido heterogéneo, que comprende: separar las células individuales de dicha muestra celular en localizaciones separadas de un dispositivo de clasificación celular microfluídico; identificar ciertas células separadas individualmente en las localizaciones separadas utilizando uno o más marcadores de superficie; clasificar las ciertas células separadas individualmente de las localizaciones separadas utilizando el dispositivo de clasificación celular microfluídico; llevar a cabo el análisis del transcriptoma sobre una pluralidad de genes de las células recolectadas individualmente de las localizaciones separadas; y llevar a cabo el análisis del agrupamiento para identificar las poblaciones celulares diferentes.

Description

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DESCRIPCION
Expresion genetica en celulas individuales para el diagnostico, pronostico e identificacion de dianas farmacologicas Referencia cruzada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. N° 61/205.485, presentada el 20 de enero de 2009.
Derechos gubernamentales
Esta invencion se hizo con el apoyo del Gobierno bajo las subvenciones federales U54 CA 126524 otorgadas por el Instituto Nacional del Cancer. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invencion.
Antecedentes de la invencion
En anos recientes, el analisis de los patrones de expresion genetica ha proporcionado una via para mejorar el diagnostico y la estratificacion del riesgo de muchas enfermedades. Por ejemplo, el analisis sin supervision de patrones de expresion genetica global ha identificado subtipos de cancer molecularmente distintos, que se distinguen por grandes diferencias de la expresion genetica, en enfermedades que se consideraban homogeneas basandose en los procedimientos de diagnostico clasicos. Tales subtipos moleculares a menudo se asocian con resultados clmicos diferentes. El patron de expresion genetica global se puede examinar tambien por caractensticas que se correlacionan con el comportamiento clmico para crear marcas pronosticas.
El cancer, como muchas enfermedades, frecuentemente no es el resultado de una causa unica, bien definida, sino que mas bien se puede ver como varias enfermedades, que estan causadas cada una por aberraciones diferentes de la rutas de informacion, lo que en ultimo termino dan como resultado fenotipos patologicos aparentemente similares. La identificacion de los polinucleotidos que se expresan en celulas cancerosas, precancerosas, o de poco potencial metastatico con respecto a las celulas normales del mismo tipo tisular pueden proporcionar la base para herramientas de diagnostico, facilitar el descubrimiento de farmacos proporcionando dianas para agentes candidatos, y sirve ademas para identificar dianas terapeuticas para terapias del cancer que estan hechas mas a medida del cancer que se va a tratar.
La identificacion de los productos geneticos que se expresan diferencialmente tambien profundiza en el entendimiento de la progresion y naturaleza de enfermedades complejas, y es clave para identificar los factores geneticos que son responsables de los fenotipos asociados con el desarrollo, por ejemplo, de los fenotipos metastaticos o inflamatorios. La identificacion de los productos geneticos que se expresan diferencialmente en varios estadios, y en varios tipos de celulas, pueden proporcionar ensayos de diagnostico precoz, y servir ademas como agentes terapeuticos. Adicionalmente, el producto de un gen que se expresa diferencialmente puede ser la base de ensayos de exploracion para identificar los agentes quimioterapicos que modulan su actividad (por ejemplo, su expresion, actividad biologica, y similares).
El diagnostico precoz de la enfermedad tiene una importancia capital para detener la progresion de la enfermedad, y reducir la morbilidad. El analisis de muestras de un paciente para identificar los patrones de expresion genetica proporciona la base para terapias de la enfermedad mas espedficas, racionales., que pueden dar como resultado la disminucion de efectos secundarios adversos con respecto a las terapias convencionales. Ademas, la confirmacion de que una lesion posee menos riesgo para el paciente (por ejemplo, que un tumor es benigno) puede evitar terapias innecesarias. En resumen, la identificacion de los patrones de expresion en celulas asociadas con la enfermedad puede proporcionar la base de terapias, diagnosticos, pronosticos, terametrica, y similares.
Como otro ejemplo, las enfermedades infecciosas producen danos en los tejidos y organos que dan lugar a la morbilidad y mortalidad de un organismo particular. En el caso de infecciones por gripe A, la causa mas frecuente de hospitalizacion y muerte es la infeccion del tejido pulmonar. Sin embargo, las celulas precisas que se infectan por gripe, y las celulas que reparan los pulmones danados no se entienden a nivel celular individual. Tal conocimiento podna ayudar a identificar dianas terapeuticas para la intervencion, tal como farmacos nuevos para evitar la infeccion vmca y nuevos tratamientos para mejorar la morbilidad.
Muchos tumores contienen poblaciones mezcladas de celulas cancerosas que se pueden diferenciar con respecto a sus rutas de senalizacion que utilizan para su crecimiento y supervivencia. Aunque estas celulas cancerosas se diferencian con respecto a su respuesta a una terapia particular, la resistencia de una poblacion particular de celulas madre cancerosas contribuye a la recidiva tras la radioterapia y quimioterapia citotoxica. Por tanto, los fallos de tratamiento en la clmica pueden deberse en parte a la resistencia de una poblacion particular de celulas cancerosas a la terapia.
La contraccion inicial de un tumor que se observa a menudo pronto tras el tratamiento puede reflejar solamente la sensibilidad relativa de una sub-poblacion de celulas cancerosas, que podna comprender la masa tumoral, y que puede no ser importante para la supervivencia a largo plazo. Por lo tanto, la variable clmica mas importante para evaluar la respuesta al tratamiento y el pronostico puede no ser el tamano absoluto del tumor sino mas bien el
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numero absoluto de una poblacion particular de celulas cancerosas que permanece tras el tratamiento. Si se pudieran identificar diferencias en las rutas de senalizacion que utilizan estas diferentes poblaciones de celulas cancerosas de un tumor, entonces se podnan disenar terapias que se dirigieran a cada poblacion de celulas. Dirigiendose a todas las poblaciones, se podna eliminar un tumor tratandolo con farmacos que afecten a cada poblacion diferente.
Los procedimientos de la tecnica para determinar la expresion genetica global en celulas individuales emplean, por ejemplo, la RT-PCR (trascripcion inversa de ARN seguido por analisis del ADNc basado en la PCR) o tincion por inmunofluorescencia de marcadores celulares de superficie (Bontoux y col., Lab Chip 2008, 8:443-450 y Fitzpatrick y col., Cancer Diagnostics 2006, 52: 1080-1088, respectivamente).
Como otro ejemplo, la enfermedad intestinal inflamatoria da como resultado la destruccion de la estructura normal del intestino que da como resultado problemas tales como diarrea, sangrado y malabsorcion. Estos problemas estan causados por la destruccion del revestimiento mucoso normal del intestino. El revestimiento mucoso del intestino grueso consiste en criptas donde las celulas globosas, celulas madre y celulas progenitoras estan en la base de la cripta, mientras que las celulas maduras que incluyen enterocitos y celulas globosas residen en la parte superior de la cripta. En la enfermedad intestinal inflamatoria, no esta claro que poblaciones estan danadas y las rutas de senalizacion que se necesitan para reparar la mucosa danada.
Los procedimientos para determinar precisamente el numero y fenotipo de las celulas en las sesiones de enfermedad que utilizan un numero pequeno de celulas son muy interesantes para la identificacion pronostica y diagnostica de las rutas de senalizacion que pueden ser dirigidas por los agentes terapeuticos espedficos, de varias enfermedades, que incluyen la enfermedad intestinal inflamatoria, infecciones, canceres, enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, e infecciones. La presente invencion aborda esta cuestion.
Sumario de la invencion
Se proporcionan composiciones y procedimientos para el uso del analisis del perfil de expresion genetica y/o transcriptoma. Un procedimiento que se proporciona en el presente documento es un procedimiento de identificacion de poblaciones celulares diferentes en una muestra de un tumor solido heterogeneo, que comprende: la particion aleatoria de celulas individuales del tumor en localizaciones separadas; llevar a cabo el analisis del transcriptoma en una pluralidad de genes de las celulas particionadas individualmente en las localizaciones separadas; y llevar a cabo el analisis de agrupamiento para identificar una o mas poblaciones celulares diferentes.
Tambien se proporciona un procedimiento para identificar poblaciones celulares diferentes en una muestra celular heterogenea que se toma de un tumor solido heterogeneo, que comprende:
separar las celulas individuales de dicha muestra celular en localizaciones separadas de un dispositivo de clasificacion celular microflmdico;
identificar ciertas celulas separadas individualmente en las localizaciones separadas utilizando uno o mas marcadores de superficie;
clasificar las ciertas celulas separadas individualmente de las localizaciones separadas utilizando el dispositivo de clasificacion celular microflmdico;
llevar a cabo el analisis del transcriptoma sobre una pluralidad de genes de las celulas recolectadas individualmente de las localizaciones separadas; y
llevar a cabo el analisis de agrupamiento para identificar las poblaciones celulares diferentes.
En algunos casos, las celulas individuales no se enriquecen antes de la particion. El analisis del transcriptoma se puede llevar a cabo sobre al menos 100 celulas individuales simultaneamente. El analisis del transcriptoma se puede llevar a cabo utilizando el analisis del acido nucleico. Las localizaciones separadas pueden estar en un sustrato plano. En algunas realizaciones, la particion aleatoria se lleva a cabo en un sistema de microflmdica. El analisis del transcriptoma puede comprender analizar el ARN expresado, el ARN no expresado, o ambos. El analisis del transcriptoma puede ser un analisis del transcriptoma completo. El analisis del transcriptoma puede comprender la amplificacion del ARN utilizando un unico grupo de pares de cebadores, que en algunas realizaciones no son cebadores anidados. El analisis del transcriptoma puede llevarse a cabo simultaneamente o sustancialmente en tiempo real sobre todas o un subgrupo de las celulas individuales. Las una o mas poblaciones celulares pueden ser celulas madre normales, celulas progenitoras normales, celulas maduras normales, celulas inflamatorias, celulas cancerosas, celulas madre cancerosas o celulas madre no cancerosas.
Ademas se proporciona en el presente documento un procedimiento para analizar una biopsia de un tumor heterogeneo de un sujeto que comprende: hacer una particion aleatoriamente celulas de la biopsia en localizaciones separadas; llevar a cabo el analisis de transcriptoma de al menos 50 genes de las celulas particionadas individualmente; y utilizar los datos del transcriptoma para identificar una o mas caractensticas del tumor. La etapa
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de llevar a cabo el analisis del transcriptoma se puede llevar a cabo sin un enriquecimiento previo de un tipo celular. Una caractenstica que se identifica puede ser la presencia, ausencia, o numero de celulas cancerosas. Una caractenstica que se identifica puede ser tambien la presencia, ausencia o numero de celulas madre, celulas progenitoras precoces, celulas progenitoras diferenciadas iniciales, celulas progenitoras diferenciadas tardfas, o celulas maduras. Una caractenstica que se identifica tambien puede ser la eficacia de un agente terapeutico en la eliminacion de una o mas de las celulas. Una caractenstica que se identifica tambien puede ser la actividad de una ruta de senalizacion, por ejemplo, una ruta espedfica de una celula madre cancerosa, una celula cancerosa diferenciada, una celula cancerosa madura, o una combinacion de las mismas. Un procedimiento desvelado en el presente documento puede comprender ademas la etapa de utilizacion de la caractenstica para diagnosticar un sujeto con cancer o un estadio canceroso.
Otro procedimiento desvelado en el presente documento es un procedimiento (no reivindicado) para identificar una ruta de senalizacion que utiliza una celula en estado de enfermedad, que comprende: hacer aleatoriamente una particion de las celulas a partir de una muestra heterogenea; llevar a cabo el analisis del transcriptoma de las celulas particionadas; utilizar el analisis del transcriptoma para identificar al menos una celula del estado de enfermedad; comparar el analisis del transcriptoma de al menos una celula en estado de enfermedad con el transcriptoma de: a) una celula en estado de no enfermedad; b) una celula en estado de enfermedad diferentes; y c) una celula madre en estado de enfermedad; e identificar una ruta de senalizacion que se expresa en (i) la celula en estado de enfermedad, (ii) la celula madre en estado de enfermedad, y (iii) opcionalmente en la celula en estado de enfermedad diferente, pero no en una celula de no enfermedad, identificando por lo tanto una ruta de senalizacion que utiliza una celula en estado de enfermedad. El estado de enfermedad puede ser cancer, colitis ulcerativa o enfermedad intestinal inflamatoria. En algunas realizaciones, se necesita la ruta de senalizacion para la supervivencia de dicha celula en estado de enfermedad.
La presente divulgacion proporciona tambien un procedimiento para diagnosticar un sujeto con una afeccion que comprende: hacer aleatoriamente una particion de celulas a partir de una muestra heterogenea; llevar a cabo un primer analisis del transcriptoma de las celulas particionadas; utilizar el analisis del transcriptoma para identificar al menos una celula en estado de enfermedad comparando el primer analisis del transcriptoma de al menos una celula en estado de enfermedad con un segundo analisis del transcriptoma de una celula en estado de no enfermedad, diagnosticando de esta manera la presencia o ausencia de una afeccion asociada con la celula en estado de enfermedad de dicho sujeto. El estado de enfermedad puede ser cancer de mama, cancer de colon, colitis ulcerativa o enfermedad intestinal inflamatoria. El analisis del transcriptoma puede comprender el analisis del ARN que se expresa, el ARN que no se expresa, o ambos. El analisis del transcriptoma puede ser un analisis del transcriptoma completo.
Otro procedimiento que se proporciona en el presente documento es un procedimiento para seleccionar un agente terapeutico que comprende: la exposicion de un primer sujeto con celulas en estado de enfermedad a uno o mas agentes de ensayo; la obtencion de una biopsia de un tumor heterogeneo del sujeto a partir de una region de interes; llevar a cabo el analisis del transcriptoma de al menos una celula individual de la biopsia del tumor heterogeneo, en que la biopsia comprende una o mas celulas en estado de enfermedad; y la comparacion del analisis del transcriptoma con un transcriptoma que se deriva de: (i) un segundo sujeto sin celula en estado de enfermedad; o (ii) el primer sujeto antes de dicha etapa de exposicion; e identificar un agente que afecta al transcriptoma de las celulas a partir del area de ensayo que se parezca mas al del segundo sujeto o el primer sujeto antes de la exposicion. La afeccion puede ser cancer de mama, cancer de colon, colitis ulcerativa, o enfermedad intestinal inflamatoria. Un agente terapeutico puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una molecula pequena, un acido nucleico (por ejemplo, un siARN), ARN, ADN, ARN-ADN quimericos, protema, o peptido.
La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento (no reivindicado) para determinar la eficacia potencial de un agente terapeutico contra una enfermedad, que comprende: separar una primera poblacion de celulas en estado de enfermedad en localizaciones individuales, en que las localizaciones individuales comprenden una celula individual; determinar el nivel de expresion de al menos un acido nucleico o protema de al menos una de las celulas individuales, produciendo de esta manera una senal de expresion del estado de enfermedad; exponer una segunda poblacion de celulas en estado de enfermedad a un agente; separar la segunda poblacion de celulas en estado de enfermedad en localizaciones individuales, en que las localizaciones individuales comprenden una celula individual; determinar el nivel de expresion de al menos un acido nucleico o protema de al menos una de las celulas individuales de la segunda poblacion; y comparar el nivel de expresion de la celula individual de la segunda poblacion con la marca de expresion del estado de enfermedad, determinando de esta manera la eficacia del agente contra la enfermedad. La etapa de exposicion se puede llevar a cabo in vivo. En algunos casos, la primera poblacion y la segunda poblacion se afslan de un sujeto, por ejemplo, un ser humano. La enfermedad puede ser cancer, colitis ulcerativa o enfermedad intestinal inflamatoria. El acido nucleico o protema puede ser un marcador celular de cancer, un marcador de celula madre del cancer o ambos. Un nivel de expresion puede ser un nivel de expresion de ARNm. En algunas realizaciones, la determinacion del nivel de expresion de ARNm comprende la deteccion de expresion o falta de expresion de 10 o mas acidos nucleicos. Un nivel de expresion puede ser tambien un nivel de expresion de una protema. Las etapas de separacion pueden comprender la exposicion de la poblacion de celulas a un anticuerpo que se une espedficamente a una protema presente en las celulas individuales.
Ademas se proporciona en el presente documento un procedimiento (no reivindicado) para determinar la
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probabilidad de una respuesta de un sujeto a un agente terapeutico, que comprende: la separacion de una poblacion de celulas de un sujeto en localizaciones individuales, en que las localizaciones individuales comprenden una celula individual y en que al menos una de las celulas individuales es una celula en estado de enfermedad; determinar el nivel de expresion de al menos un acido nucleico o protema de al menos una de las celulas individuales en estado de enfermedad, en que el acido nucleico o protema es una diana del agente terapeutico; y determinar la probabilidad de una respuesta del sujeto basandose en el nivel de expresion el al menos un acido nucleico o protema. Un nivel de expresion puede ser un nivel de expresion de ARNm. En algunas realizaciones, la determinacion del nivel de expresion de ARNm comprende la deteccion de la expresion o falta de expresion de 10 o mas acidos nucleicos. Un nivel de expresion puede ser tambien un nivel de expresion proteico. Las etapas de separacion pueden comprender la exposicion de la poblacion de celulas a un anticuerpo que se une espedficamente a una protema presente en las celulas individuales. El agente terapeutico puede ser un agente anti-cancer.
Otro procedimiento detallado en el presente documento proporciona un procedimiento pronostico o de diagnostico que utiliza la expresion genetica de celulas individuales que comprende las etapas de : separar las celulas de una muestra heterogenea en posiciones que se pueden dirigir separadamente; lisar las celulas individuales, y dividir los lisados resultantes al menos en dos porciones; amplificar el ARNm o ADNc derivado de los mismos de las celulas individuales; determinar los perfiles de expresion genetica de una de las porciones de lisado, en que el perfil de expresion genetica proporciona una informacion de sub-poblacion; y llevar a cabo los analisis de transcriptoma en al menos una celula de una sub-poblacion diana. En algunos procedimientos, se analizan al menos 102 o al menos 103 celulas individuales. Las celulas se pueden clasificar por la expresion de al menos un marcador celular de superficie. Las celulas analizadas por los procedimientos desvelados en el presente documento pueden ser celulas madre, por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas. Las muestras iniciales pueden comprender menos de 106 celulas o menos de l05 celulas. Las celulas se pueden clasificar por la expresion de al menos un marcador celular de superficie. Las celulas se pueden clasificar por la expresion de al menos uno de CD34 y Thy1. En algunas realizaciones, se determina la expresion de al menos uno o al menos (5) genes asociados con celulas madre hematopoyeticas. El analisis del transcriptoma es un analisis de transcriptoma completo.
Ademas se proporciona en el presente documento un procedimiento de clasificacion de una celula madre, que comprende las etapas de: (a) obtener un perfil del transcriptoma de una celula madre a partir de una muestra; y (b) comparar el perfil de transcriptoma que se obtiene con un perfil de transcriptoma de referencia. Un perfil de transcriptoma puede comprender un grupo de datos que se obtiene de al menos 5 protemas asociadas con celulas madre. Las celulas madre analizadas pueden ser celulas madre cancerosas, celulas madre hematopoyeticas, celulas madre intestinales, celulas madre de leucemia, o celulas madre de pulmon. Las muestras analizadas pueden incluir celulas de un cancer, por ejemplo, de un carcinoma de mama, o un carcinoma de colon. El analisis del perfil del transcriptoma puede comprender tambien las etapas adicionales de: extraer el ARNm de una muestra de celulas madre; cuantificar el nivel de una o mas especies de ARNm que corresponden con secuencias espedficas de celulas madre; y comparar el nivel de una o mas especies de ARNm con el nivel de dicha especie de ARNm en una muestra de referencia.
Tambien se proporciona en el presente documento un procedimiento para recolectar los datos correspondientes a un Transcriptoma, que comprende las etapas de: recolectar los datos correspondientes a un transcriptoma utilizando cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento y enviar dichos datos a una computadora. Una computadora se puede conectar a un aparato de secuenciacion. Los datos correspondientes a un transcriptoma se pueden ademas almacenar tras el envfo, por ejemplo, se pueden almacenar los datos en un medio que se puede leer por computadora que se puede extraer de la computadora. Los datos se pueden transmitir desde la computadora a una localizacion remota, por ejemplo, por medio de internet.
Breve descripcion de los dibujos
El documento de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. Las copias de la presente publicacion de patente o solicitud de patente con dibujo(s) en color se pueden proporcionar por la Oficina tras la peticion y pago de la tasa necesaria.
Figura 1. Analisis de expresion genetica de celula unica por PCR en tiempo real de “celulas madre de cancer colorrectal” humanas (EpCAMhig ) purificadas de tejidos de cancer colorrectal humanos xenoinjertados en ratones NOD/SCID (tumor n° 4m6). En el primer experimento (panel A), se analizaron 15 celulas unicas en cuanto a la expresion de 5 genes, llevando a cabo 27 replicas de cada combinacion genetica de celulas; en este experimento, cada preparacion de ARNm de una celula unica individual se utiliza en 3 lmeas consecutivas de la matriz de reaccion, y cada grupo de cebador espedfico del gen se utiliza en 9 columnas consecutivas, con la unica excepcion de las primeras tres en las que no se anadieron cebadores; los niveles de expresion genetica de cada celula individual se puede visualizar como bloques de 3x9 utilizando una escala de color. En el segundo experimento (panel B), se sigue una estrategia similar, aunque se analizaron 16 celulas unicas en cuanto a la expresion de 16 genes, se llevaron a cabo 9 replicas para cada combinacion genetica de celulas; en este segundo caso, cada preparacion de ARNm de una celula se utiliza en 3 filas consecutivas de la matriz de reaccion, y cada grupo de cebadores espedficos del gen se utiliza en 3 columnas consecutivas, de forma que los niveles de la expresion genetica para cada celula individual se pueden visualizar en bloques de 3x3 utilizando una escala de color. En ambos casos, el ensayo presenta un alto nivel de reproductibilidad y consistencia en
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cada grupo de replicas.
Figura 2. Analisis de la expresion genetica de celulas unicas por PCR en tiempo real de “celulas madre de cancer colorrectal” humanas (celulas EpCAMhigh/CD166+, a partir del xenoinjerto n° 8m3). En esta figura cada fila identifica una celula unica y cada columna identifica un gen distinto. La intensidad de la expresion genetica se representa utilizando un codigo de color, en el que el rojo mas oscura indica la intensidad mas fuerte y el verde mas oscuro la intensidad mas debil. El analisis muestra claramente que, en base a su repertorio transcripcional, las celulas tumorales EpCAMhigh/CD166+ se pueden subdividir en subgrupos distintos. De manera mas importante, los subgrupos celulares que muestran la expresion coordinada y simultanea de altos niveles de genes que codifican marcadores de diferenciacion terminal del epitelio del colon (por ejemplo, Citoqueratina 20, CD66a/CEACAM1, anhidrasa carbonica II, MUC2, Factor 3 de la familia Trefoil) no expresan o expresan niveles mas bajo de genes que codifican marcadores candidatos de celulas madre intestinales o genes que se sabe que son necesarios para la funcion de celulas madre (por ejemplo, hTERT, LGR5, Survivina) y viceversa.
Figura 3A-B. a: Purificacion de celulas MTIC 11'ESA+H2K de pulmon de ratones NOD/SCID que albergan tumor de mama. Panel superior celulas del linaje Dapilviable de H2K encuadradas, panel inferior izquierdo celulas ESA+ encuadradas para posterior encuadre de las celulas CD2441' en el panel inferior derecho. b: Analisis PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de HIF1a, Snail2, Zeb2, E-caderina, Vimentina, VEGFC, CCR7, Lox, Cox2 en MTIC y non-TIC.
Figura 4. Valores de CT del analisis PCR en tiempo real en cuanto para los niveles de microARN (miR) que comparan las TIC y MTIC primarias.
Figura 5A-5D. El CD66a como marcador celular no tumorigenico de cancer de mama.
Figura 6. Analisis de variante de numero de copias de 18 muestras celulares para varios cientos de CNV. Varios se pueden asociar con inestabilidad genomica y dan lugar a propiedades alteradas de celulas madre pluripotentes.
Figura 7. Dispositivo de Analisis de celula unica, principio.
Figura 8. Analisis de enriquecimiento de grupo genetico de la expresion de genes ligados a celulas madre. Se analizaron los genes que se expresan por auto-renovacion de las celulas HSC normales, celulas madre de leucemia derivadas de progenitores de Granulocitos/macrofagos (GMP) pero no por auto-renovacion de GMP normales en celulas madre de cancer de mama (CSC) y su progenie no tumorigenica (NTG). Como se habfa previsto, estos genes estaba sobre representados significativamente en la marca de expresion genetica CSC. Se muestra un mapa caliente de genes sobre-expresados.
Figura 9. Clasificacion esquematica “in silicio” para el aislamiento de sub-poblaciones de celulas raras. Las poblaciones celulares, tales como celulas madre hematopoyeticas, se clasifican por FACS en placas de 96 pocillos, que contienen una unica celula. Las celulas se lisan y el lisado se divide en dos fracciones. Una fraccion del lisado se analiza en cuanto a la expresion de un grupo de genes, permitiendo que las celulas se caractericen basandose en la transcripcion, mas que en la expresion de protemas de superficie. Utilizando esta informacion, los lisados seleccionados y/o los lisados agrupados con celulas parecidas se someten al analisis de transcriptoma completo.
Figura 10. Una representacion pictorica de la recoleccion, almacenamiento y transporte de datos por medio de la computadora.
Descripcion detallada
Los procedimientos de la invencion utilizan un perfil de expresion genetica celular unico de celulas primarias para la caracterizacion de poblaciones de celulas para el diagnostico de enfermedades, sensibilidad a una intervencion terapeutica particular, aplicaciones pronosticas, e identificacion de nuevas dianas farmacologicas. Una muestra celular heterogenea se divide en celulas unicas separadas espacialmente, que se clasifican opcionalmente por las propiedades de interes (posiblemente incluyendo marcadores de superficie), luego se lisan y los contenidos se amplifican y analizan individualmente en cuanto a la expresion de genes de interes. Las celulas analizadas de esta manera se clasifican segun las marcas geneticas de celulas individuales. Tal clasificacion permite una evaluacion precisa de la composicion celular de la muestra de ensayo.
Los procedimientos convencionales para analizar celulas unicas para fines diagnosticos incluyen el uso de contadores Coulter y citometna de flujo para contar el numero de celulas de un tipo determinado. Sin embargo, estas mediciones se basan tfpicamente en el uso de anticuerpos contra marcadores de superficie y no ensayan la expresion genetica a nivel del ARNm o la expresion proteica. Existen ejemplos previos de analisis PCR de celulas unicas, pero se llevaron a cabo en un numero de celulas demasiado pequeno y/o genes para proporcionar una informacion diagnostica util o para proporcionar la capacidad de discriminacion fina o de subpoblaciones celulares relacionadas de un tejido. Los procedimientos de tincion tisular que utilizan los patologos sufren inconvenientes similares y dependen fuertemente del juicio cualitativo del patologo. Ademas, estas mediciones se limitan a medir un pequeno numero de parametros. Los procedimientos de la presente invencion, sin embargo, permiten la medicion de al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, o mas parametros diferentes, en que los parametros incluyen la expresion de ARNm, la expresion genetica, la expresion proteica y ademas incluye marcadores celulares de superficie en combinacion con la expresion de ARNm, genetica y/o proteica.
Antes de que se describa el objetivo de la invencion posteriormente, se tiene que entender que la invencion no se limita a las realizaciones particulares de la invencion que se describe posteriormente, ya que se pueden hacer
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variaciones de realizaciones particulares y continuar en el ambito de las reivindicaciones adjuntas. Tambien se tiene que entender que la terminologfa que se emplea es con el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante. En esta especificacion y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen la referencia al plural a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende cada valor que interviene, a la decena de unidad del lfmite inferior a menos de que se indique otra cosa, entre el lfmite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o que interviene en ese intervalo establecido, esta englobado en la invencion. Los lfmites superior e inferior de estos intervalos mas pequenos se pueden incluir independientemente en los intervalos mas pequenos, y tambien se engloban en la invencion, sujeto a cualquier lfmite que se excluya espedficamente del intervalo establecido. Cuando el intervalo establecido incluye uno o ambos lfmites, los intervalos que incluyen cualquiera o ambos de los lfmites incluidos tambien estan incluidos en la invencion.
A menos de que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto habituado en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Aunque algunos procedimientos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento se pueden utilizar en la practica o ensayo de la invencion, se describen ahora procedimientos, dispositivos y materiales ilustrativos.
Identificacion y clasificacion de celulas en poblaciones y subpoblaciones
La presente divulgacion se refiere a procedimientos de clasificacion de poblaciones y subpoblaciones identificadas de celulas y que utiliza poblaciones y/o subpoblaciones para diagnosticar, pronosticar y/o identificar dianas terapeuticas para afecciones tales como las enfermedades. Las enfermedades pueden incluir canceres de cualquier tipo (incluyendo, pero sin limitarse a, tumores solidos, cancer de mama, cancer de colon, cancer de pulmon, leucemia), enfermedad intestinal inflamatoria, colitis ulcerativa, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias y enfermedades infecciosas. La presente divulgacion tambien proporciona reactivos y kits para su uso en la practica de los procedimientos objeto, tales como anticuerpos y sondas de acido nucleico utiles en la deteccion de cualquiera de los biomarcadores descritos en el presente documento, o reactivos que modulan los biomarcadores del presente documento. Los procedimientos pueden determinar tambien un nivel apropiado de tratamiento para un cancer en particular.
Aislamiento de celulas unicas
Se proporciona el perfil de expresion genetico unico para aplicaciones de diagnostico y pronostico de enfermedades, asf como una herramienta de investigacion para identificar nuevas dianas farmacologicas. Las enfermedades de interes incluyen, sin limitacion, disfuncion mediada inmunitariamente, cancer, y similares. En los procedimientos de la invencion, se divide aleatoriamente o en cierto orden una mezcla celular heterogenea, por ejemplo una biopsia tumoral por puncion, una biopsia de lesion inflamatoria, lfquido sinovial, puncion lumbar, etc., en celulas unicas separadas espacialmente, por ejemplo, en una placa multipocillo, micromatriz, dispositivo de microflrndica, o portaobjetos. Las celulas se lisan entonces, y se amplifican los contenidos y se analizan individualmente en cuanto a la expresion de los genes de interes. Las celulas analizadas de esta manera se clasifican de acuerdo con marcas geneticas de celulas individuales. Tal clasificacion permite una evaluacion precisa de la composicion celular de la muestra de ensayo, cuya evaluacion se puede utilizar, por ejemplo, para determinar la identidad y numero de celulas madre cancerosas de la muestra de ensayo; determinar la identidad y numero de celulas asociadas con inmunidad tal como el numero y especificidad de linfocitos T, celulas dendnticas, linfocitos B y similares.
En algunas realizaciones, la muestra celular que se va a analizar es una muestra primaria, que puede ser recientemente aislada, congelada, etc. Sin embargo, las celulas que se van a analizar pueden ser celulas cultivadas. Habitualmente la muestra es una mezcla heterogenea de celulas, que comprenden una pluralidad de distintos tipos celulares, poblaciones distintas, o subpoblaciones distintas, por ejemplos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas tipos celulares, poblaciones, o subpoblaciones. En algunas realizaciones la muestra es una muestra de cancer de un tumor solido, leucemia, linfoma, etc., que puede ser una biopsia, por ejemplo una biopsia por puncion, etc., una muestra de sangre para tumores diseminados y leucemias, y similares. Las muestras se pueden obtener antes del diagnostico, se pueden obtener en el curso de un tratamiento, y similares.
Para el aislamiento de celulas de un tejido, se puede utilizar una solucion adecuada para la dispersion o suspension. Tal solucion sera generalmente una solucion salina equilibrada, por ejemplo, solucion salina normal, PBS, solucion salina equilibrada de Hank, etc., suplementada convenientemente con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, en conjuncion con un tampon aceptable a baja concentracion, en general de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc. Las celulas separadas se pueden recolectar en cualquier medio apropiado que mantiene la viabilidad de las celulas, que tienen habitualmente un cojm de suero en el fondo del tubo de recoleccion. Hay varios medios disponibles en el mercado y se pueden utilizar de acuerdo con la naturaleza de las celulas, que incluyen dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, medium de Iscove, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal bovino.
En algunas realizaciones, las celulas de una muestra se separan en una micromatriz. Por ejemplo, un sistema de
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micromatriz de celulas vivas altamente integrado puede utilizar micropocillos cada uno de los cuales es lo suficientemente grande para ajustarse a una unica celula (vease Tokimitsu y col. (2007) Cytometry Part A 71k 1003:1010; y Yamamura y col. (2005) Analytical Chemistry 77:8050). El enriquecimiento previo de las celulas de interes - tal como por FACS u otra clasificacion - es opcional y en algunas realizaciones, las celulas de una muestra se dividen en localizaciones separadas si ninguna clasificacion o enriquecimiento previo. Por ejemplo, las celulas de una muestra (p9or ejemplo, una muestra de sangre, biopsia, tumor solido) se pueden aislar individualmente en posiciones distintas. Tfpicamente, para las muestras de tejido solido, las muestras se separan mecanica, qmmica y/o enzimaticamente (por ejemplo, por tratamiento con tripsina o sonicacion). Las celulas de una muestra se pueden colocar en cualquier dispositivo de clasificacion (por ejemplo, un clasificador celular de microflmdica) tal que se afslen las celulas individuales, tal como en una posicion dirigible de una superficie plana. Las superficies planas pueden tener escotaduras, barreras u otras caractensticas que aseguren el aislamiento de celulas individuales. Las celulas aisladas se pueden analizar entonces de acuerdo con los procedimientos del presente documento. Preferentemente, las celulas se separan en posiciones distintas en que cada posicion contenga 1 o 0 celulas.
Las celulas se clasifican opcionalmente, por ejemplo, por citometna de flujo, antes de la separacion. Por ejemplo se puede utilizar clasificacion por FACS o clasificacion diferencial por tamano, para aumentar la concentracion inicial de las celulas de interes al menos 1.000, 10.000, 100.000, o mas veces, de acuerdo con uno o mas marcadores presentes en la superficie celular. Tales celulas se clasifican opcionalmente de acuerdo con la presencia o ausencia de marcadores celulares de superficie particularmente marcadores de una poblacion o subpoblacion de interes.
Cuando se afslan las celulas en distintas posiciones para el analisis, se pueden clasificar las celulas con un clasificador de microflmdica, por citometna de flujo, microscopfa, etc. Se describe un clasificador celular activado por fluorescencia microfabricado por Fu y col. (1999) Nature Biotechnology 17: 1109 y Fu y col. (2002) Anal. Chem. 74:2451-2457. Una muestra se puede clasificar con clasificador celular microfabricado integrado utilizando litograffa blanda multicapa. Este clasificador celular integrado puede incorporar varias funcionalidades de microflmdica, incluyendo bombas peristalticas, amortiguadores, valvulas de cambio, y pocillos de entrada y salida, para llevar a cabo la clasificacion celular de una manera coordinada y automatica. El volumen activo de una valvula accionada en este clasificador celular integrado puede ser pequeno como de 1 pl, y el volumen de interrogacion optica pequeno como de 100 fl. En comparacion con las maquinas de FACS convencionales, los FACS de microflmdica proporcionan una sensibilidad mas alta, sin contaminacion cruzada, y coste mas bajo.
Las celulas individuales se pueden aislar en posiciones distintas (por ejemplo, una placa de 96 pocillos o direccion de micromatriz) para posteriores analisis y/o manipulacion. Por ejemplo, se clasifica un poblacion celular que contiene celulas madre hematopoyeticas (HSC) por analisis FACS utilizando anticuerpos capaces de distinguir HSC de celulas maduras. Las celulas se clasifican en placas de 96 pocillos, se lisan por procedimientos apropiados y los lisados se analizan por qPCR, analisis de micromatrices, y/o secuenciacion.
Los dispositivos para el aislamiento de celulas unicas incluyen un clasificador celular de microflmdica, que afsla celulas vivas de los desechos celulares y clasifica celulas de una suspension de celulas unicas. Los dispositivos de microflmdica se puede utilizar en combinacion con senales fluorescentes (por ejemplo, anticuerpos marcados para marcar una poblacion o subpoblacion diana) de 1,2, 3, 4, 5 o mas marcadores de superficie diferentes, y se colocan en sitios diferentes para los estudios geneticos posteriores. Se pueden incorporar otras etapas corriente arriba tal como la digestion del tumor o cultivo celular para obtener una suspension celular y tenir las celulas con marcadores de superficie fluorescentes en este sistema. El numero de celulas que se va a analizar depende de la heterogeneidad de la muestra, y la frecuencia esperada de celulas de interes en la muestra. Habitualmente se analizan al menos aproximadamente 102 celulas, al menos aproximadamente 103, se analizan al menos 5 x 103, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107 al menos aproximadamente 108 al menos aproximadamente 109 al menos aproximadamente 1010, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 1012, al menos
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aproximadamente 10 , al menos aproximadamente 10 , al menos aproximadamente 10 , o mas celulas.
En algunos casos, un dispositivo de analisis de celulas unicas (SCAD) es modular y puede llevar a cabo las siguientes etapas de una manera integrada, completamente automatica 1) digestion del tejido. El tejido se coloca en el puerto de entrada del dispositivo. Se introducen las enzimas apropiadas en el dispositivo y se hacen fluir para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular con el fin de obtener una suspension celular. 2) Separacion de las celulas vivas de los desechos, por ejemplo haciendo fluir una suspension de la muestra digerida a traves de un “metamaterial” de microflmdica, que permite dividir el flujo flmdico segun el tamano de las partfculas. 3) Tincion. La suspension de celulas unicas filtrada opcionalmente se tine utilizando marcadores de superficie apropiados en un compartimento del dispositivo de microflmdica. Puede ser util la tincion con hasta cinco marcadores diferentes para obtener una poblacion de celulas cancerosas de alta pureza. 4) Clasificacion. La suspension de celulas unicas tenidas se hace fluir al siguiente compartimento del dispositivo de microflmdica para separar las celulas cancerosas del resto de las celulas. Se describen en los Ejemplos varias realizaciones de clasificadores.
Perfil de expresion
Las celulas clasificadas se pueden lisar individualmente para llevar a cabo el analisis de la composicion genetica (ARN, ADN) y/o proteica de las celulas. Se puede capturar el ARNm en una columna de perlas oligo-dT,
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transcribirse inversamente en perlas, procesarse en chip, transferirse a un pocillo macroscopico, etc. Opcionalmente, el ADN o ARN se preamplifica antes del analisis. La preamplificacion puede ser del genoma o transcriptoma completo, o de una porcion del mismo (por ejemplo, de los genes/ transcripciones de interes). Una muestra de polinucleotido se puede transferir a un chip para el analisis (por ejemplo, por qRT-PCR) y determinacion de un perfil de expresion.
La expresion “perfil de expresion” se utiliza ampliamente para incluir protemas que se expresan y/o acidos nucleicos que se expresan. Una muestra de acido nucleico incluye una pluralidad o poblacion de acidos nucleicos distintos que pueden incluir la informacion de la expresion de los genes determinantes del fenotipo de interes en la celula individual. Una muestra de acido nucleico puede incluir acidos nucleicos ARN o ADN, por ejemplo, ARNm, ARNc, ADNc, etc. Los perfiles de expresion se pueden generar por cualquier medio conveniente para determinar la expresion genetica diferencial entre dos muestras, por ejemplo, hibridacion cuantitativa de ARNm, ARNm marcado, ARNm, ARNc amplificado, etc., PCR cuantitativa, y similares. Se ensaya una muestra de un sujeto o paciente, por ejemplo, celulas o recolecciones del mismo, por ejemplo, tejidos. Las muestras se recolectan por cualquier procedimiento conveniente, como se sabe en la tecnica. Adicionalmente, las muestras tumorales se pueden recolectar y ensayar para determinar la eficacia relativa de una terapia para producir la muerte diferencial entre las celulas normales y enfermas. Los genes/protemas de interes son genes/protemas que se ha descubierto que son predictivos, incluyendo los genes/protemas proporcionados en el presente documento, en los que el perfil de expresion puede incluir los datos de expresion de 5, 10, 20, 25, 50, 100 o mas (incluyendo todos) los genes/protemas que se enumeran.
La muestra se puede preparar de varias maneras diferentes, como se sabe en la tecnica, por ejemplo, por aislamiento de ARNm a partir de una celula unica, en que el ARNm aislado se utiliza como tal, amplificado, se emplea para preparar ADNc, ARNc, etc., como se sabe en la tecnica de expresion diferencial (por ejemplo, vease Marcus, y col., Anal. Chem. (2006); 78(9): 3084-89). La muestra se puede preparar a partir de cualquier tejido (por ejemplo, una lesion, o tejido tumoral) recolectado de un sujeto. El analisis de las muestras se puede utilizar para cualquier fin (por ejemplo, diagnostico, pronostico, clasificacion, seguimiento y/o terapia en desarrollo). Las celulas se pueden cultivar antes del analisis.
El perfil de expresion se puede generar de la muestra inicial de acido nucleico utilizando cualquier protocolo convencional. Aunque se conoce una variedad de maneras diferentes para generar perfiles de expresion, tal como los que se emplean en el campo de los analisis de expresion genetica diferencial, un tipo de protocolo representativo y conveniente para generar perfiles de expresion es la PCR cuantitativa (QPCR, o QT-PCR). Se puede utilizar cualquier metodologfa para llevar a cabo la QPCR, por ejemplo, como se describe en Valera, y col., J. Neurooncol. (2007) 85(1):1-10.
Tras obtener un perfil de expresion de la muestra que se va a ensayar, el perfil de expresion se puede comparar con un perfil de referencia o control para hacer un diagnostico, pronostico, analisis de la eficacia farmacologica, u otro analisis que se desee. Se proporciona un perfil de referencia o control, o se puede obtener por procedimientos empmcos. Un perfil de expresion que se obtenga se puede comparar con un perfil de reverencia/control unico para obtener la informacion con respecto al fenotipo de la celula/tejido que se va a ensayar. De manera alternativa, el perfil de expresion que se obtiene se puede comparar con dos o mas perfiles de expresion de referencia/control diferentes para obtener una informacion mas en profundidad con respecto al fenotipo de la celula/tejido que se ensaya. Por ejemplo, el perfil de expresion que se obtiene se puede comparar con un perfil de expresion positivo y negativo para obtener una informacion confirmada con respecto a si la celula/tejido tiene el fenotipo de interes.
La determinacion o analisis de los valores de la diferencia, es decir, la diferencia de la expresion entre dos perfiles se pueden llevar a cabo utilizando cualquier metodologfa convencional, cuando una variedad de metodologfa es conocida por los expertos en la tecnica de matrices, por ejemplo, comparando imagenes digitales de los perfiles de expresion, comparando bases de datos de datos de expresion, etc. Las patentes que describen maneras de comparar los perfiles de expresion incluyen, pero no se limitan a, Patentes de EE. UU. Nos 6.308.170 y 6.228.575. Tambien se describen en el presente documento procedimientos para comparar la expresion.
Se puede llevar a cabo entonces una etapa de analisis estadfstico para obtener el peso de la contribucion del grupo de genes. Por ejemplo, se puede aplicar el analisis de centroides contrafdos mas cercanos como se describe en Tibshirani y col. (2002) P.N.A.S. 99:6567-6572 para computar el centroide de cada clase, luego se computa la media de la distancia al cuadrado entre un determinado perfil de expresion y cada centroide, normalizado por la desviacion estandar en la clase.
La clasificacion se puede definir por estadfstica de probabilidades, donde se puede derivar el lfmite empmcamente. En una realizacion de la invencion, se puede utilizar una probabilidad de aproximadamente 0,4 para distinguir entre pacientes inactivos e inducidos, mas habitualmente una probabilidad de aproximadamente 0,5, y se puede utilizar una probabilidad de aproximadamente 0,6 o superior. Una probabilidad “alta” puede ser al menos de aproximadamente 0,75, al menos aproximadamente 0,7, al menos aproximadamente 0,6, o al menos aproximadamente 0,5. Una probabilidad “baja” puede no ser mas de aproximadamente 0,25, no mas de 0,3, o no mas de 0,4. En muchas realizaciones, la informacion que se obtiene anteriormente acerca de la celula/tejido que se ensaya se emplea para predecir si un huesped, sujeto o paciente debena tratarse con una terapia de interes y para
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optimizar la dosis de esta.
Caracterizacion de las poblaciones celulares y subpoblaciones
En algunas realizaciones de la invencion, por ejemplo en los canceres epiteliales, incluyendo, sin limitacion, el cancer de mama y el cancer de colon, la caracterizacion de las celulas madre segun la expresion de un marcador de celula madre cancerosa (por ejemplo, CD66a) permite la identificacion de CSC. Hay una subpoblacion de celulas cancerosas tumorigenicas con ambas capacidades de auto-renovacion y diferenciacion. Estas celulas tumorigenicas son responsables del mantenimiento del tumor, y tambien dan lugar a grandes cantidades de progenie diferenciada anormalmente que no es tumorigenica, por lo tanto que cumplen los criterios celulas madre cancerosas. El potencial tumorigenico esta contenido en una subpoblacion de celulas cancerosas que expresan diferencialmente los marcadores de la presente invencion. Como se muestra en el presente documento, en la poblacion de celulas que expresan positivamente marcadores de celulas madre cancerosas, hay heterogeneidad, por ejemplo, cuando las celulas que son negativas a CD66 (CD66"), estan enriquecidas en celulas madre cancerosas (tumorigenicas), mientras que las celulas CD66a+ no son tumorigenicas. La deteccion de tal heterogeneidad en las poblaciones permite la determinacion de subpoblaciones.
Un experto en la tecnica reconocera que se pueden analizar multiples secuencias - que representan genes, transcripciones y/o protemas. Tales secuencias pueden permitir la determinacion y/o diferenciacion de los fenotipos de las celulas de una muestra.
Los marcadores, o paneles de marcadores, se pueden escoger basandose en multiples aspectos de una poblacion o subpoblacion diana de una muestra, por ejemplo, una fuente de tejido (por ejemplo, neuronal frente a epitelial) o estado de enfermedad (por ejemplo, cancerosa frente a no cancerosa). Otras secuencias utiles para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo celula madre cancerosa de celula normal) se pueden determinar utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, tal como por la deteccion de cambios (por ejemplo, la regulacion positiva o negativa) de los genes de las poblaciones diana.
Los acidos nucleicos que son utiles en la distincion de una poblacion de otra poblacion se pueden regular positivamente o negativamente al comparar entre las poblaciones. Por ejemplo, la expresion de algunos acidos nucleicos estan regulados positivamente o negativamente en el cancer frente a las celulas normales, celulas madre frente a celulas diferenciadas, y celulas madre cancerosas frente a celulas cancerosas diferenciadas. En algunos casos, la regulacion positiva o negativa de los genes se puede utilizar para distinguir sub-poblaciones en poblacion mayores. Por ejemplo, algunos acidos nucleicos se expresan solo en celulas normales, celulas normales y celulas madre cancerosas, o solo en celulas madre cancerosas.
Los acidos nucleicos se pueden regular positivamente o negativamente en comparacion con otra poblacion o subpoblacion, un acido nucleico con un nivel de expresion conocido, o un nivel de expresion convencional. De manera alternativa, cuando se analiza la expresion de multiples genes, se puede crear un mapa caliente restando la media y dividiendo por la desviacion estandar para cada gen independientemente y se asignan valores numericos pasandose en el grado de desviacion de la media. Por ejemplo valores de +/-1 pueden representar 2,5-3 desviaciones estandar de la media. Tales analisis se pueden refinar mas, tal que los genes en el intervalo “+/-3” se pueden utilizar para agrupar diferentes tipos de poblaciones (por ejemplo, se determina para el cancer el valor “+3” y se determina el valor del tejido normal en “-3” tal que un algoritmo de agrupamiento pueda discernir entre ellos). Un gen regulado positivamente puede ser un valor “+”.
En algunos casos, se pueden utilizar combinaciones de acidos nucleicos expresados diferencialmente como perfiles de una poblacion o subpoblacion particular. Los perfiles pueden comprender cualquier numero de acidos nucleicos y/o protemas que se expresan diferencialmente, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas acidos nucleicos y/o protemas. En algunos casos, un acido nucleico que se utiliza para identificar una poblacion o subpoblacion diana puede expresarse de manera similar en una poblacion diana y no diana o subpoblacion no diana. Tales acidos nucleicos que se expresan de manera similar se utilizaran generalmente en combinacion con otros acidos nucleicos expresados diferencialmente para identificar una poblacion o subpoblacion diana.
Los procedimientos escritos en el presente documento se pueden utilizar para analizar una poblacion celular heterogenea a partir de cualquier fuente (por ejemplo, una biopsia, tejido normal, tumor solido, etc.). Tales procedimientos se pueden utilizar para aislar y analizar cualquier poblacion celular, por ejemplo, una poblacion diana en la poblacion o subpoblacion heterogenea mas grande, una poblacion o subpoblacion heterogenea en cuanto a la presencia de una celula, cancerosa u otras celulas madre diana, o una poblacion heterogenea completa.
Descubrimiento de biomarcadores
Los procedimientos desvelados en el presente documento permiten la determinacion de nuevos marcadores que se asocian con una poblacion o subpoblacion celular (por ejemplo, celulas normales, celulas cancerosas, celulas en estado de enfermedad). Los marcadores incluyen cualquier biomarcador que incluyen, pero no se limitan a ADN, ARN y protemas. En algunos casos, un marcador de una poblacion celular es un gen o ARNm que no se expresa normalmente en una celula determinada (por ejemplo, la expresion de un gen de celula madre por una celula
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progenitora o una celula que expresa marcadores de diferenciacion o la expresion de genes de proliferacion por celulas que expresan tambien marcadores de diferenciacion). Tfpicamente se evaluan mas de un marcador, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o mas marcadores. Cuando los marcadores son ARN expresados, se puede determinar cualquier parte de un transcriptoma, incluyendo hasta el transcriptoma completo.
El analisis de los patrones de expresion de acidos nucleicos en ciertas poblaciones o subpoblaciones celulares diana puede dar lugar a la identificacion de nuevos biomarcadores que distinguen la poblacion o subpoblacion diana de otras. Por ejemplo, cuando se expresa un marcador de superficie unico en una poblacion o subpoblacion diana, se puede desarrollar un anticuerpo que se una a ese marcador para su uso en el aislamiento y/o identificacion de celulas de esa poblacion o subpoblacion en los mismos u otros individuos (por ejemplo, por FACS). La identificacion de los biomarcadores espedficos de una poblacion o subpoblacion incluye la ausencia de ciertos marcadores de las poblaciones o subpoblaciones celulares que permitinan una seleccion negativa. La presencia de marcadores en una poblacion o subpoblacion se puede determinar los procedimientos descritos en el presente documento y se pueden utilizar para definir una poblacion celular. Los ARNm de poblaciones o subpoblaciones celulares que se analizaron han demostrado que ciertos genes se expresan diferencialmente en celulas normales y cancerosas. La expresion diferencial puede incluir aumentos o descensos del nivel de transcripcion, falta de transcripcion, y/o regulacion de la expresion alterada (por ejemplo, un patron de expresion diferente en respuesta a un estimulo). Los ARNm u otros marcadores que funcionan como marcadores de una poblacion o subpoblacion celular pueden comprender tambien mutaciones que estan presentes en esa poblacion o subpoblacion celular (por ejemplo, celulas cancerosas y celulas madre cancerosas, pero no en celulas normales). Un experto en la tecnica reconocera que tales marcadores pueden representar una poblacion celular a partir de un individuo unico que se ensaya y/o puede representar marcadores para muchos individuos. En algunos casos, los ARNm que se expresan se traducen en protemas que se pueden detectar por cualquiera de una amplia matriz de procedimientos de deteccion proteica (por ejemplo, inmunoensayos, transferencia de Western, etc.).
Se pueden detectar otros marcadores incluyendo microARN. En algunos casos, los niveles de expresion de microARN sirven como un marcador para una poblacion celular cuando aumenta o disminuye la expresion de un microARN particular en aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 o mas veces en comparacion con una poblacion celular similar.
Determinacion de transcriptomas en poblaciones y subpoblaciones celulares
Para conseguir mas informacion con respecto a las celulas aisladas por cualquiera de los procedimientos de la presente invencion (por ejemplo separacion por FACS de celulas de una poblacion, seguido por el analisis transcripcional parcial), puede ser ventajoso analizar adicionalmente las celulas. En algunos casos, las celulas individuales aisladas de una muestra (por ejemplo, por aislamiento de celulas individuales, con o sin enriquecimiento previo), se lisan y se recolectan los acidos nucleicos de interes (por ejemplo, ADN genomico, ARNm, etc.). Como se describe en el presente documento, el analisis transcripcional de un ge o panel de genes se puede utilizar para categorizar las celulas aisladas en grupos que muestran similitudes en sus perfiles de expresion (por ejemplo celulas madre cancerosas frente a celulas no madre). Sin estar ligados por teona alguna, tal informacion puede sugerir diferencias funcionales ya que los genes que se transcriben en una celula estan fuertemente asociados con su funcion. Una vez que las celulas se organizan en grupos celulares similares (por ejemplo, las celulas que demuestran perfiles transcripcionales identicos o similares), lisados de celulas individuales y/o lisados que comprende acidos nucleicos agrupados de celulas similares se pueden analizar adicionalmente a nivel de transcriptoma. En algunos casos, los lisados (por ejemplo, grupos de celulas unicas o celulas similares) se someten a metodologfas (por ejemplo, secuenciacion de alto rendimiento) para definir una parte del transcriptoma de cada celulas y/o grupos de celulas similares. La informacion del transcriptoma de celulas individuales se puede analizar a nivel de poblacion comparando y/o combinando los resultados de celulas individuales con los resultados de otras celulas similares. La informacion del transcriptoma de grupos de celulas similares se puede utilizar tambien para definir las caractensticas transcripcionales de tales grupos.
Se puede estudiar cualquier poblacion celular de tal manera, por ejemplo, las poblaciones celulares que comprenden celulas madre. En algunas realizaciones, las celulas incluyen celulas madre, incluyendo celulas madre embrionarias, celulas madre de adulto - que incluyen, pero no se limitan a celulas madre cancerosas, celulas madre hematopoyeticas (HSC) y celulas madre mesenquimaticas - y celulas madre pluripotentes inducidas. En general, una poblacion celular es una poblacion heterologa (por ejemplo, un especimen clmico). Las sub-poblaciones de interes de una poblacion celular mayor se pueden aislar por cualquier procedimiento del presente documento (por ejemplo, clasificacion por FACS) de acuerdo con cualquiera de los criterios relevantes (por ejemplo, la expresion de una protema de superficie). En algunas realizaciones, tales celulas clasificadas se distribuyen en compartimentos tal que cada poblacion clasificada comprende 10 o menos celulas, 5 o menos celulas, 4 celulas, 3 celulas, 2 celulas o 1 celula.
En algunas realizaciones, las celulas se lisan y separan en dos o mas porciones. Una porcion del lisado se analiza adicionalmente (por ejemplo, analisis de un panel de genes para detectar la expresion) para detectar y/o diferenciar sub-poblaciones en la poblacion heterologa mayor. Los lisados de las celulas que indica que estan en la subpoblacion de interes (por ejemplo, celulas madre hematopoyeticas) se analizan adicionalmente. Los lisados de
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celulas individuales, o se pueden analizar los lisados agrupados de celulas similares. La determinacion de poblaciones de “celulas similares” se puede basar en similitudes en la expresion de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o mas genes.
Las celulas y poblaciones o subpoblaciones celulares de interes se pueden analizar adicionalmente. Las poblaciones o subpoblaciones celulares pueden comprender celulas que comprenden una parte de la muestra original, por ejemplo celulas que comprenden un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o mas de la muestra original. Utilizando los procedimientos descritos en el presente documento, las poblaciones o subpoblaciones de interes se pueden aislar de muestras heterologas tal que las poblaciones o subpoblaciones aisladas pueden estar un 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o el 100% libres de celulas que no sean miembros de la poblacion o subpoblacion diana. Como los lisados se preparan a partir de celulas que se afslan de la poblacion original, se puede conseguir el estudio de poblaciones de celulas similares agrupando lisados de celulas similares.
Los analisis adicionales de las celulas, poblaciones y/o subpoblaciones pueden incluir analisis del transcriptoma completo. En algunos casos, los lisados comprenderan ARNm que se puede amplificar (por ejemplo, ADNc) para el analisis, o se analizan directamente (por ejemplo, por secuenciacion de ARNm, analisis de micromatrices). La amplificacion de ARNm se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento conocido en la tecnica (por ejemplo, transcripcion in vitro, amplificacion de ADNc por ligadura con PCR). En algunas realizaciones, la amplificacion de ARNm se puede llevar a cabo en, o con el uso de, un dispositivo de microflmdica. El analisis del transcriptoma completo se puede llevar a cabo por plataformas de secuenciacion, tal como los disponibles en el mercado en Illumina (ARN-Sec) y Helicos (Expresion Genetica Digital o “DGE”). En algunas realizaciones, se secuencian polinucleotidos de interes. Los acidos nucleicos diana se pueden secuenciar por procedimientos basados en electroforesis en gel convencionales, por ejemplo, secuenciacion tipo Sanger. De manera alternativa, la secuenciacion se puede conseguir por el uso de varios procedimientos de “nueva generacion”. Tales procedimientos de secuenciacion de “nueva generacion” incluyen, pero no se limitan a los comercializados por: 1) 454/Roche Lifesciences que incluyen pero no se limitan a los procedimientos y aparatos descritos en Margulies y col., Nature (2005) 437:376-380 (2005); y Patentes de EE. UU. Nos 7.244.559; 7.335.762; 7.211.390; 7.244.567; 7.264.929; 7.323.305; 2) Helicos BioSciences Corporation (Cambridge, MA) como se describe en las Patentes de EE. UU. Nos 7501245; 7491498; 7.276.720; y Publicaciones de Solicitudes de Patente de EE. UU. US20090061439; US20080087826; US20060286566; US20060024711; US20060024678; US20080213770; y US20080103058; 3) Applied Biosystems (por ejemplo, secuenciacion SOLiD); 4) Dover Systems (por ejemplo, secuenciacion Polonator G.007); 5) Illumina como se describe en las Patentes de EE. UU. Nos 5.750.341; 6.306.597; y 5.969.119; y 6) Pacific Biosciences como se describe en las Patentes de EE. UU. Nos 7.462.452; 7.476.504; 7.405.281; 7.170.050; 7.462.468; 7.476.503; 7.315.019; 7.302.146; 7.313.308; y Publicaciones de Solicitud de EE. UU. US20090029385; US20090068655; US20090024331; y US20080206764. Tales procedimientos y aparatos se proporcionan en el presente documento a manera de ejemplo y no se pretende que sea limitante.
El analisis del transcriptoma completo se puede llevar a cabo por multiples razones que permitan la caracterizacion adicional de sub-poblaciones celulares diferentes, que incluyen pero no se limitan a: 1) detectar la actividad de genes que pueden revelar propiedades biologicas unicas de subpoblaciones y/o factores de transcripcion que controlan su desarrollo; 2) localizar y/o caracterizar marcadores de superficie que se pueden utilizar para purificar las sub-poblaciones (por ejemplo, por clasificacion por FACS); y 3) detectar y/o caracterizar genes celulares y/o productos geneticos como dianas farmacologicas potenciales para la enfermedad que distingan la sub-poblacion de la poblacion general (por ejemplo, celulas madre cancerosas frente a tejidos normales).
El analisis de las poblaciones y/o subpoblaciones (por ejemplo, por analisis del transcriptoma) puede permitir el refinamiento de tecnicas para aislar celulas que pertenecen a la sub-poblacion. Por ejemplo, cuando los procedimientos revelan un antfgeno de superficie espedfico de una sub-poblacion, se pueden utilizar anticuerpos desarrollados por cualquier procedimiento de smtesis de anticuerpos disponible para aislar tales celulas de una poblacion heterologa (por ejemplo, la muestra de un paciente). De manera adicional, los perfiles del transcriptoma se pueden utilizar para desarrollar paneles de expresion genetica que se pueden utilizar para identificar celulas de otras poblaciones (por ejemplo, muestras del mismo o diferentes pacientes).
Diagnostico y pronostico
La invencion tiene utilidad en la prevencion, tratamiento, deteccion o investigacion en cualquier afeccion, incluyendo el cancer, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias e infecciones. Ejemplos de cancer incluyen canceres de prostata, pancreas, colon, cerebro, pulmon, mama, hueso, y de piel. Ejemplos de afecciones inflamatorias incluyen el smdrome de colon irritable y colitis ulcerativa. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen la enfermedad de Crohn, lupus, y enfermedad de Graves. Por ejemplo, la invencion tiene utilidad en la prevencion, tratamiento, deteccion de o la investigacion en canceres gastrointestinales, tales como el cancer de ano, colon, esofago, vesfcula, estomago, Idgado y recto; canceres genitourinarios tales como el cancer de pene, prostata y testfculos; canceres ginecologicos, tales como el cancer de ovarios, cuello del utero, endometrio, utero, trompas de Falopio, vagina, y vulva; canceres de cabeza y cuello, tales como los canceres hipofarmgeos, larmgeos,
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orofarmgeos, canceres de labios, boca y orales, cancer de glandulas salivares, cancer del tracto digestivo y cancer de senos; cancer metastatico; sarcomas; cancer de piel; canceres del tracto urinario que incluyen canceres de la vejiga, rinon y canceres de uretra; canceres del sistema endocrino, tales como canceres de tiroides, pituitaria, y glandulas adrenales y de los islotes pancreaticos; y canceres pediatricos.
Los procedimientos se proporcionan tambien para optimizar la terapia, por la clasificacion primaria de celulas individuales de una muestra, y basandose en esa informacion de clasificacion, seleccionando la terapia, dosis, modalidad de tratamiento, etc. adecuados que optimice la diferenciacion entre el suministro de un tratamiento anti- proliferativo para las celulas diana indeseables, mientras que se minimiza la toxicidad indeseable. El tratamiento se optimiza por la seleccion de un tratamiento que minimiza la toxicidad indeseable, mientras que se proporciona una actividad anti-proliferativa eficaz. El tratamiento se puede seleccionar para que afecte solo un subgrupo de celulas de una muestra. En algunos casos se selecciona una terapia que afecta menos de aproximadamente un 5%, menos de aproximadamente un 1%, menos de aproximadamente un 0,5%, menos de aproximadamente un 0,2%, menos de aproximadamente un 0,1%, menos de aproximadamente un 0,05%, menos de aproximadamente un 0,02%, menos de aproximadamente un 0,01%, o menos de las celulas de la muestra.
Una marca de una afeccion se puede referir a un patron de expresion de uno o mas genes o protemas en una celula unica que indica la presencia de una afeccion. Una marca de celula madre cancerosa se puede referir a un patron de expresion de uno o mas genes y/o protemas cuya expresion es indicativa de un fenotipo de celula madre cancerosa. Una marca de celula inflamatoria o autoinmunitaria se refiere a genes y/o protemas cuya expresion es indicativa de una marca de celula inflamatoria o autoinmunitaria. Una marca se puede obtener de todo o una parte del grupo de datos, habitualmente una marca comprendera informacion de la expresion genetica y/o proteica a partir de al menos aproximadamente 5 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 10 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 15 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 20 genes y/o protemas, al menos
aproximadamente 25 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 50 genes y/o protemas, al menos
aproximadamente 75 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 100 genes y/o protemas, al menos
aproximadamente 150 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 200 genes y/o protemas, al menos
aproximadamente 300 genes y/o protemas, al menos aproximadamente 400 genes y/o protemas, al menos
aproximadamente 500 genes y/o protemas, o mas genes y/o protemas. Cuando se utiliza un subgrupo del grupo de datos, el subgrupo puede comprender genes regulados positivamente, genes regulados negativamente, o una combinacion de los mismos.
Analisis de muestras del paciente para aplicaciones clmicas
Aunque la descripcion posterior se enfoca en las celulas madre cancerosas, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden utilizar para aislar y/o analizar cualquier poblacion celular, incluyendo pero sin limitarse a celulas normales de cualquier tejido (por ejemplo, celulas madre normales, celulas progenitoras normales, y celulas maduras normales), celulas infectadas vmcamente, celulas inflamatorias, celulas progenitoras, celulas cancerosas (por ejemplo, celulas tumorigenicas, celulas no tumorigenicas, celulas madre cancerosas, y celulas cancerosas diferenciadas)., celulas en estado enfermo (por ejemplo, celulas cancerosas, celulas de enfermedad intestinal inflamatoria, celulas de colitis ulcerativa, etc.), celulas microbianas (bacterianas, fungicas, protistas), etc. Por lo tanto, los detalles proporcionados utilizando celulas madre cancerosas (CSC) son ilustrativos del analisis y que se pueden caracterizar para cualquier estado de enfermedad o afeccion.
En algunas realizaciones de la invencion, el numero de CSC en una muestra del paciente se puede determinar con respecto al numero total de celulas cancerosas. Por ejemplo, las celulas de una muestra de biopsia se afslan y analizan en cuanto a la expresion de uno o mas ARNm y/o protemas indicativas de una celula cancerosa y se cuantifican las celulas que muestran el fenotipo CSC. De manera alternativa, los datos recolectados de poblaciones o subpoblaciones particulares de CSC se pueden utilizar para desarrollar exploraciones por afinidad (por ejemplo anticuerpos) para la poblacion o subpoblacion y tales exploraciones por afinidad se pueden utilizar para cuantificar el numero de celulas. Tfpicamente, un porcentaje mayor de CSC es indicativo del potencial de auto-renovacion continua de celulas con el fenotipo canceroso. La cuantificacion de las CSC en una muestra de un paciente se puede comparar con una muestra de referencia positiva y/o negativa, por ejemplo, una muestra de un paciente tal como una muestra de sangre, una muestra de un paciente en remision, etc. En algunas realizaciones, la cuantificacion de CSC se lleva a cabo durante el curso de un tratamiento, en que el numero de celulas cancerosas y el porcentaje de tales celulas que son CSC se cuantifica antes, durante y en el seguimiento del curso de una terapia. Deseablemente, la terapia dirigida contra las celulas madre cancerosas da como resultado la disminucion del numero total, y/o el porcentaje de CSC en un paciente.
Las CSC se pueden identificar por su fenotipo con respecto a marcadores particulares, y/o por su fenotipo funcional. En algunas realizaciones, las CSWC se identifican y/o asilan por union a la celula con reactivos espedficos para los marcadores de interes. Las celulas que se analizan pueden ser celulas viables, o pueden ser celulas fijadas o embebidas.
La presencia de una CSC en una muestra de un paciente tambien puede ser indicativa del estadio del cancer (por ejemplo, leucemia, cancer de mama, cancer de prostata). Ademas, la deteccion de CSC se puede utilizar para controlar la respuesta a la terapia y para ayudar al pronostico. La presencia de CSC se puede determinar
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cuantificando las celulas que tienen el fenotipo de la celula madre. Ademas del fenotipado de la superficie celular, puede ser util cuantificar las celulas en una muestra que tienen caractensticas de “celula madre”, que se pueden determinar por criterios funcionales, tales como la capacidad para auto-renovarse, para dar lugar a tumores in vivo, por ejemplo, en un modelo de xenoinjerto, y similares.
Las muestras clmicas para su uso en los procedimientos de la invencion se pueden obtener a partir de una variedad de fuentes, particularmente sangre, aunque en algunos casos se pueden utilizar muestras tales como medula osea, linfa, lfquido cefalorraqmdeo, Kquido sinovial, y similares. Las muestras pueden incluir biopsias, u otros espedmenes clmicos que contienen celulas. Algunas muestras comprenden tumores solidos o partes de los mismos. En casos en los que se van a ensayar masas celulares, tales masas se pueden disociar por cualquier medio apropiado que se conoce en la tecnica (por ejemplo, digestion enzimatica, separacion ffsica). Tales muestras se pueden separar por centrifugacion, elutriacion, separacion por gradiente de densidad, aferesis, seleccion por afinidad, seleccion, FACS, centrifugacion con Hypaque, etc. antes del analisis, y habitualmente se utiliza una fraccion mononuclear (PBMC). De esta manera, las celulas individuales de una muestra (por ejemplo, un tumor solido) se pueden analizar en cuanto a la expresion genetica diferencial y/o analisis del transcriptoma como se describe en el presente documento.
Una vez que se obtiene una muestra, se puede utilizar directamente, congelada, o se mantiene en un medio de cultivo apropiado durante cortos periodos de tiempo. Se pueden emplear varios medios para mantener las celulas. Las muestras se pueden obtener por cualquier procedimiento conveniente, tal como la biopsia, la extraccion de sangre, venopuncion, o similar. En algunas realizaciones, una muestra comprendera al menos aproximadamente 102 celulas, mas habitualmente al menos 103, 104, 105 o mas celulas. Tfpicamente, las muestras son de pacientes humanos, aunque pueden ser utiles modelos animales, por ejemplo, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, roedores, por ejemplo, ratones, ratas, hamsteres, primates, etc.
Se puede utilizar una solucion apropiada para la dispersion o suspension de una muestra celular. Tal solucion generalmente sera una solucion salina equilibrada, por ejemplo, solucion salina normal, PBS, solucion salina equilibrada de Hank, convenientemente suplementada con suero fetal bovino u otros factores de origen natural, en conjuncion con un tampon aceptable a baja concentracion, generalmente a partir de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones fosfato, tampones lactato, etc.
El analisis de tincion celular se puede llevar a cabo utilizando procedimientos convencionales. Las tecnicas que proporcionan una enumeracion precisa incluye los clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener varios grados de sofisticacion, tal como canales de multiples colores, canales que detectan la dispersion de la luz de angulo bajo y obtuso, canales de impedancia, etc. Las celulas se pueden seleccionar contra celulas muestras empleando colorantes asociados con celulas muertas (por ejemplo, yoduro de propidio).
Los reactivos de afinidad pueden ser receptores espedficos o ligandos para las moleculas de superficie indicadas anteriormente. Ademas de los reactivos anticuerpos, se pueden utilizar parejas peptido-antfgeno MHC y receptores de linfocitos T; ligandos peptfdicos y receptores; moleculas efectoras y receptoras, y similares. Los anticuerpos y receptores de linfocitos T pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden producir en animales transgenicos, animales inmunizados, linfocitos B humanos o animales inmortalizadas, celulas transfectadas con vectores ADN que codifican el anticuerpo o el receptor de linfocitos T, etc. Los detalles de la preparacion de anticuerpos y su idoneidad para su uso como miembros de union espedfica se conocen bien por los expertos en la tecnica.
Una estrategia es el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. De manera conveniente, estos anticuerpos se pueden conjugar con un marcador para su uso en la separacion. Los marcadores incluyen cualquier marcador conocido en la tecnica incluyendo, pero sin limitarse a perlas magneticas, que permiten la separacion directa, biotina, que se puede retirar con avidina o estreptavidina unida a un soporte, fluorocromos, que se pueden utilizar con un clasificador celular activado por fluorescencia, o similares, para permitir la separacion facil del tipo celular en particular. Los fluorocromos que pueden tener utilidad incluyen ficobiliprotemas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluorescema y rojo Texas. Frecuentemente cada anticuerpo esta marcado con un fluorocromo diferente, para permitir la clasificacion independiente por cada marcador.
Se pueden anadir anticuerpos a una suspension de celulas, e incubarse durante un periodo de tiempo suficiente para unirse a los antfgenos de superficie celular disponibles. La incubacion sera habitualmente de al menos aproximadamente 5 minutos y habitualmente menos de aproximadamente 30 minutos. Es deseable que haya una concentracion suficiente de anticuerpos en la mezcla de reaccion, tal que la eficacia de la separacion no se limite por la falta de anticuerpos. La concentracion apropiada se determina por titulacion. El medio en el que las celulas se separan es cualquier medio que mantenga la viabilidad de las celulas. Un medio que se puede utilizar es solucion salina de fosfato tamponada que contiene de un 0,1 a un 0,5% de BSA. Hay varios medios disponibles en el mercado y se pueden utilizar segun la naturaleza de las celulas, que incluyen el Medio Eagle modificado de Dulbecco (dMEM), solucion salina basica de Hank (HESS), solucion salina fosfato tamponada de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove, PBS con 5 mM de EDTA, etc., frecuentemente suplementado con suero fetal bovino, BSA, HSA, etc. Las celulas marcadas se pueden cuantificar por la expresion de marcadores de superficie celular como se ha descrito anteriormente.
La comparacion de un analisis diferencial de progenitores que se obtienen de una muestra de un paciente, y un
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analisis diferencial de progenitores de referencia se puede conseguir por el uso de protocolos de deduccion adecuados, sistemas Ai, comparaciones estad^sticas, etc. Una comparacion con un analisis diferencial de progenitores de celulas normales, celulas de tejido enfermo similar, y similares, pueden proporcionar una indicacion del estado de enfermedad. Se puede recopilar una base de datos de analisis diferencial de progenitores de referencia. Un analisis de interes particular hace el seguimiento de un paciente, por ejemplo, de enfermedades en estadios cronicos y pre-leucemicos, tal que la aceleracion de la enfermedad se observa en un estadio temprano. Los procedimientos de la invencion proporcionan la deteccion de la aceleracion antes de la aparicion de los smtomas clmicos, y por tanto permiten la intervencion terapeutica precoz, por ejemplo, el inicio de quimioterapia, el aumento de la dosis de quimioterapia, el cambio de seleccion de un farmaco quimioterapico, y similares.
Clasificacion tumoral y estratificacion de los pacientes
Los procedimientos tambien se proporcionan para optimizar la terapia, por la clasificacion primaria, y basandose en esta informacion, seleccionando la terapia apropiada, dosis, modalidad de tratamiento, etc. que optimiza el diferencial entre el suministro de un tratamiento anti-proliferativo para las celulas diana indeseables, mientras que se proporciona una actividad anti-proliferativa eficaz.
En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de clasificacion de lesiones, por ejemplo, lesiones tumorales, muestras de trastornos inmunitarios, y similares, y por lo tanto agrupando o “estratificando” pacientes, de acuerdo con la marca de expresion genetica de una celula unica (incluyendo CSC). Por ejemplo, los tumores que se clasifican como que tienen un alto porcentaje de celulas madre cancerosas conllevan un alto riesgo de metastasis y muerte, y por lo tanto se pueden tratar mas agresivamente que los tumores de un tipo mas benigno. Por lo tanto, el analisis de poblaciones o subpoblaciones presentes en una muestra del paciente se pueden utilizar para caracterizar el estado de una enfermedad, controlar los regfmenes de tratamiento y/o desarrollar estrategias terapeuticas.
La muestra de cada paciente en un grupo de pacientes potenciales para un ensayo clmico se puede clasificar como se ha descrito anteriormente. Los pacientes que tienen lesiones clasificadas como similares se pueden entonces seleccionar para la participacion en un ensayo clmico o de investigacion de un agente terapeutico cuando se desea una poblacion de pacientes homogenea. La clasificacion de un paciente tambien se puede utilizar en la evaluacion de la eficacia de un agente terapeutico en una poblacion de pacientes heterogenea. Por lo tanto, la comparacion de un perfil de expresion de un individuo con el perfil de la poblacion para la clasificacion de una enfermedad permite la seleccion o diseno de farmacos u otros regfmenes terapeuticos que se espera que sean seguros y eficaces para un paciente particular o una poblacion de pacientes (es decir, un grupo de pacientes que tienen el mismo tipo de cancer). La clasificacion se puede basar en la expresion (o falta de la misma) de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o mas acidos nucleicos y/o protemas.
Diagnostico, pronostico, evaluacion de la terapia (terametrica), y manejo de trastornos
Los procedimientos de clasificacion descritos en el presente documento, asf como sus productos geneticos y genes correspondientes y productos geneticos, son de particular interes como marcadores geneticos o bioqmmicos (por ejemplo, en la sangre o tejidos) que detectaran los cambios mas tempranos a lo largo de una ruta de enfermedad (por ejemplo, una ruta de carcinogenesis, una ruta inflamatoria, etc.), y/o para controlar la eficacia de varias terapias e intervenciones preventivas.
La estadificacion es un proceso utilizado por los medicos para describir como de avanzado esta el estado canceroso en un paciente. La estadificacion ayuda al medico a determinar el pronostico, planear el tratamiento y evaluar los resultados de tal tratamiento. Los sistemas de estadificacion vanan con los tipos de cancer, pero generalmente implican el siguiente sistema “TNM”: el tipo de tumor, indicado por T; si el cancer ha metastatizado a los ganglios linfaticos cercanos, indicado por N; y si el cancer ha metastatizado a partes mas distantes del cuerpo, indicado por M. En general, si un cancer solo es detectable en el area de la lesion primaria sin que se haya dispersado a cualquiera de los ganglios linfaticos se llama Estadio I. Si solo se ha dispersado a los ganglios linfaticos mas cercanos, se llama Estadio II. En el Estadio III, el cancer en general se ha dispersado a los ganglios linfaticos mas proximos al sitio de la lesion primaria. Los canceres que se han diseminados a una parte distante del cuerpo, tal como el tngado, huesos, cerebro u otro sitio, estan en Estadio IV, el estadio mas avanzado.
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden facilitar el ajuste del proceso de estadificacion identificando la agresividad de un cancer, por ejemplo, el potencial metastatico, asf como la presencia en diferentes areas del cuerpo. Por lo tanto, un cancer en Estadio II con una clasificacion que signifique un cancer con alto potencial metastatico se puede utilizar para cambiar a tumor en Estadio II en la lmea lfmite con un tumor en Estadio III, que justifica una terapia mas agresiva. Por el contrario, la presencia de un polinucleotido que significa un potencial metastatico mas bajo permite una estadificacion mas conservadora de un tumor.
Por ejemplo, una biopsia de un cancer de mama de un paciente en Estadio II se analiza por los procedimientos descritos anteriormente. El cancer de mama se puede clasificar como que tienen un alto potencial metastatico dependiendo del perfil de expresion determinado a partir de las celulas del paciente. Por lo tanto, un medico puede utilizar tal informacion para tratar mas agresivamente al paciente que si no tuviera la clasificacion adicional. La determinacion de la expresion de marcadores particulares puede proporcionar informacion de dianas potenciales
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para la terapia farmacologica (por ejemplo, en celulas tumorigenicas de un paciente que expresan una diana farmacologica).
Desarrollo e identificacion de agentes terapeuticos
Los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento se pueden utilizar para el desarrollo o identificacion de nuevos agentes terapeuticos y/o ajustar las terapias existentes. Por ejemplo, utilizando el analisis de celulas unicas, los perfiles de expresion de poblaciones celulares diana (por ejemplo, celulas madre cancerosas, celulas madre cancerosas y celulas cancerosas diferenciadas, o celulas cancerosas diferenciadas) se pueden analizar para detectar dianas potenciales para agentes terapeuticos. Las dianas potenciales incluyen, sin limitacion, biomarcadores particulares y rutas mal reguladas. Las dianas de interes pueden incluir marcadores o rutas espedficas para poblaciones celulares de interes.
En un caso, las celulas de una poblacion o subpoblacion diana se pueden analizar en cuanto a la expresion de acidos nucleicos como se describe en el presente documento para detectar nuevos biomarcadores que se pueden dirigir para el tratamiento. Por ejemplo, una molecula de superficie celular particular que se expresa exclusivamente en celulas madre cancerosas y/o celulas cancerosas diferenciadas se pueden investigar como una diana para un agente terapeutico potencial (por ejemplo, un anticuerpo u otro resto de union - conjugado potencialmente con una toxina u otro efector - con especificidad para la molecula de superficie). En otros casos, las poblaciones celulares diana se pueden analizar en cuanto a la mala regulacion de las rutas implicadas en los procesos de enfermedad (por ejemplo, la perdida de control de la maquinaria del ciclo celular en las celulas cancerosas). Las rutas pueden incluir, sin limitacion, activadores y/o represores de la expresion genetica, la expresion de genes particulares o grupos de genes, y rutas mas complejas, globales. Los agentes terapeuticos que se dirigen a tal mala regulacion pueden afectar potencialmente las celulas diana para alterar la expresion de acido nucleicos asociados con las celulas diana. La expresion alterada que se induce por los agentes terapeuticos puede dar como resultado la regulacion positiva o negativa del acido nucleico. En algunos casos, el tratamiento de las celulas y/o un sujeto con uno o mas agentes terapeuticos puede dar como resultado la expresion de acidos nucleicos que imitan la expresion de celulas en estado no de enfermedad (por ejemplo, el tratamiento da como resultado la expresion de genes relacionados con el ciclo celular similares a los de las celulas no cancerosas).
Utilizando los procedimientos y composiciones que se describen en el presente documento, se pueden analizar las poblaciones celulares diana en cuanto a la expresion alterada de uno o mas acidos nucleicos. El desarrollo de agentes terapeuticos nuevos y/o refinados puede implicar el analisis de una poblacion celular diana (por ejemplo, celulas madre del cancer de colon, celulas del cancer de mama, etc.) para determinar los acidos nucleicos que muestran perfiles de expresion alterados en comparacion con las celulas “normales”. Tales celulas se pueden utilizar para explorar los efectos de agentes terapeuticos potenciales sobre la expresion de estos y otros acidos nucleicos exponiendo celulas aisladas de la poblacion diana a agentes candidatos y ensayando la expresion alterada de los genes despues de la exposicion.
Los procedimientos desvelados en el presente documento se pueden utilizar tambien para analizar los efectos de los compuestos que afectan a ciertos fenotipos celulares, que incluyen pero no se limitan a, la expresion genetica, el funcionamiento de rutas (por ejemplo, el ciclo celular, la ruta TERT, rutas de tension oxidativa), y/o tipo celular o morfologfa. Por lo tanto, los compuestos que afectan tales caractensticas fenotfpicas se pueden analizar adicionalmente o en lugar de analizar el potencial de un compuesto como agente terapeutico. Por ejemplo, se puede llevar a cabo el analisis de los cambios de la expresion genetica en una poblacion diana (por ejemplo, celulas de colon normales, celulas normales de mama, celulas cancerosas, celulas madre, celulas madre cancerosas, etc.) que se exponen a uno o mas compuestos de ensayo para analizar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la expresion genetica u otros fenotipos deseados (por ejemplo, expresion de marcadores, viabilidad celular). Tales analisis pueden ser utiles para multiples fines, por ejemplo, investigacion del ciclo celular o analisis de rutas conocidas o desconocidas.
Los agentes que se van a analizar en cuanto al valor terapeutico potencial puede ser cualquier compuesto, molecula pequena, protema, lfpido, carbohidrato, acido nucleico u otro agentes apropiado para su uso terapeutico. Las celulas aisladas de una poblacion diana pueden exponerse a bibliotecas de agentes terapeuticos (por ejemplo, bibliotecas de anticuerpos, bibliotecas de moleculas pequenas) para determinar los efectos sobre la expresion genetica y/o la viabilidad celular. En algunos casos un agente terapeutico candidato se dirigira espedficamente a la poblacion celular de interes. Por ejemplo, si se revela con el analisis de celulas unicas la existencia de una mutacion que esta presente en las celulas diana (por ejemplo, celulas madre cancerosas y/o celulas cancerosas diferenciadas), un agente terapeutico candidato se puede dirigir a la mutacion. En algunos casos, las celulas tratadas se pueden exponer a analisis de celulas unicas para determinar los efectos del agente(s) terapeutico candidato sobre la expresion de uno o mas genes de interes y/o los efectos sobre el transcriptoma.
En otras realizaciones de la invencion, los agentes se dirigen a una poblacion o subpoblacion celular en estado de enfermedad uniendose espedficamente a un marcador o combinacion de marcadores presentes en la poblacion o subpoblacion diana. En algunas realizaciones, los agentes incluyen anticuerpos o derivados de union al antfgeno de los mismos espedficos para un marcador o combinacion de marcadores, que se conjugan opcionalmente a un resto citotoxico. Tales estrategias se pueden utilizar para agotar la poblacion o subpoblacion diana en un paciente (por
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ejemplo, agotar las poblaciones de celulas madre cancerosas).
Ensayos de exploracion de agentes terapeuticos
Las celulas (por ejemplo, las celulas en estado de enfermedad) que expresan un marcador o combinacion de marcadores son utiles tambien para ensayos in vitro y exploracion para detectar factores y agentes quimioterapicos que son activos en celulas cancerosas diferenciadas y/o celulas madre cancerosas. Son de particular interes los ensayos de exploracion de agentes con son activos en celulas humanas. Se puede utilizar una variedad de ensayos para este fin, incluyendo inmunoensayos de union proteica; determinacion del crecimiento celular, diferenciacion y actividad funcional; produccion de factores; y similares (vease, por ejemplo, Balis, (2002) J. Nat'l Cancer Inst. 94:2; 78). En otras realizaciones, los polipeptidos aislados que corresponden a un marcador o combinacion de marcadores de la presente invencion son utiles en los ensayos de exploracion de farmacos.
En los ensayos de exploracion de agentes biologicamente activos, farmacos anti-proliferativos, etc. se pone en contacto un marcador o una composicion de celulas diana con el agente de interes, y se evalua el efecto del agente observando parametros resultantes sobre las celulas, tales como la expresion de marcadores, viabilidad celular, y similares; o la eficacia de union o el efecto sobre la actividad enzimatica o de receptor de los polipeptidos. Por ejemplo, una composicion celular de cancer de mama que se sabe que tiene un perfil de expresion de “celulas madre cancerosas” se expone a un agente de ensayo y se analizan individualmente las celulas expuestas como se describe en el presente documento para determinar si el agente de ensayo altera el perfil de expresion en comparacion con las celulas no tratadas. Cualquier poblacion celular aislada descrita en el presente documento o producidas por procedimientos que se describen en el presente documento pueden ser aisladas recientemente, cultivadas, alteradas geneticamente, y similares. Las celulas pueden ser variantes inducidas ambientalmente en cultivos clonicos: por ejemplo, que se separan en cultivos independientes y se cultivan bajo condiciones distintas, por ejemplo con o sin farmacos; en presencia o ausencia de citocinas o en combinaciones de las mismas. La manera en que las celulas responden a un agente (por ejemplo, un peptido, siARN, molecula pequena, etc.), particularmente un agente farmacologico, que incluye el tiempo de las respuestas, es un reflejo importante del estado fisiologico de la celula.
Los parametros son componentes cuantificables de las celulas, particularmente componentes que se pueden medir con precision, por ejemplo en un sistema de alto rendimiento. Un parametro puede ser cualquier componente celular o producto celular incluyendo determinantes, receptores, protemas de la superficie celular o modificaciones conformacionales o post-traduccionales de los mismos, lfpidos, carbohidratos, moleculas organicas o inorganicas, acidos nucleicos, por ejemplo, ARNm, ADN, etc. o una porcion derivada de tales componentes celulares o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en una realizacion, las celulas aisladas que se describen en el presente documento se punen en contacto con uno o mas agentes y se determina el nivel de expresion de un acido nucleico de interes. Los agentes que alteran la expresion de los acidos nucleicos detectados, por ejemplo, cuando las celulas muestran un patron de expresion mas similar a una celula en estado de no enfermedad, se puede analizar adicionalmente en cuanto a su potencial terapeutico. Aunque la mayona de los parametros (or ejemplo, el ARNm o la expresion proteica) proporcionara una lectura cuantitativa, en algunos casos se acepta un resultado semi- cuantitativo o cualitativo. Las lecturas pueden incluir un valor determinado unico, o pueden incluir la media, el valor de la mediana o la varianza, etc. De manera caractenstica se obtiene un intervalo de valores de lectura de un parametro para cada parametro a partir de una multiplicidad de los mismos ensayos. Se espera una variabilidad y se obtiene un intervalo de valores para cada uno de los grupos de parametros de ensayo utilizando procedimientos estadfsticos convencionales con el uso de un procedimiento estadfstico comun para proporcionar valores unicos.
Los agentes de interes para la exploracion incluyen compuestos conocidos y desconocidos que engloban numerosas clases qmmicas, primariamente moleculas organicas, que pueden incluir moleculas organometalicas, secuencias geneticas, etc. Un aspecto importante de la invencion es evaluar los farmacos candidatos, que incluye el ensayo de toxicidad; y similares.
Ademas de agentes biologicos complejos los agentes candidatos incluyen moleculas organicas que comprenden grupos funcionales necesarios para interacciones estructurales, particularmente con uniones hidrogeno, y que incluyen tfpicamente al menos una grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, frecuentemente al menos dos de los grupos qrnmicos funcionales. Los agentes candidatos pueden comprender estructuras de carbono cfclico o heterodclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas con uno o mas de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos se pueden encontrar tambien entre biomoleculas, que incluyen peptidos, polinucleotidos, sacaridos, acidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, analogos estructurales o combinaciones de los mismos. En algunos casos, los compuestos de ensayo pueden tener funciones conocidas (por ejemplo, alivio de la tension oxidativa), pero pueden actuar a traves de un mecanismo desconocidos o actuar sobre una diana desconocida.
Se incluyen farmacos farmacologicamente activas, moleculas genetica activas, etc. Los compuestos de interes incluyen agentes quimioterapicos, hormonas o antagonistas de hormonas, etc. Ejemplos de agentes farmaceuticos adecuados para la presente invencion son los que se describen en, "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman y Gilman, McGraw-Hill, New York, New York, (1996), novena edicion, bajo las secciones: Water, Salts and Ions; Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism; Drugs Affecting Gastrointestinal Function;
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Chemotherapy of Microbial Diseases; Chemotherapy of Neoplastic Diseases; Drugs Acting on Blood-Forming organs; Hormones and Hormone Antagonists; Vitamins, Dermatology; and Toxicology. Tambien se incluyen toxinas, y agentes de guerra qmmica y biologica, por ejemplo vease Somani, S.M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992).
Los compuestos de ensayo incluyen todas las clases de moleculas descritos anteriormente, y pueden comprender ademas muestras de contenido desconocido. Son de interes las mezclas complejas de compuestos de origen natural derivadas de fuentes naturales tales como plantas, hongos, bacterias, protistas o animales. Aunque muchas muestras comprenderan compuestos en solucion, se pueden ensayar tambien muestras solidas que se pueden disolver en una disolvente adecuado. Las muestras de interes incluyen muestras ambientales, por ejemplo aguas subterraneas, agua marina, residuos de minena, etc., muestras biologicas, por ejemplo, lisados preparados de cultivos, muestras de tejidos, etc.; muestras fabricadas, por ejemplo, en el transcurso de la preparacion de agentes farmaceuticos; asf como bibliotecas de compuestos preparados para el analisis; y similares (por ejemplo, compuestos que se evaluan para su valor terapeutico potencial, es decir, farmacos candidatos).
Las muestras o compuestos incluyen tambien componentes adicionales, por ejemplo, componentes que afectan la fuerza ionica, pH, concentracion proteica total, etc. Ademas, las muestras se pueden tratar para conseguir al menos un fraccionamiento o concentracion parcial. Las muestras biologicas pueden almacenarse si se tiene cuidado de reducir la degradacion del compuesto, por ejemplo bajo nitrogeno, congelarse, o una combinacion de los mismos. El volumen de la muestra que se utiliza es suficiente para permitir una deteccion medible, por ejemplo, pueden ser suficientes desde aproximadamente 0,1 ml a 1 ml de una muestra biologica.
Los compuestos, que incluyen los agentes candidatos, se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, estan disponibles numerosos medios para la smtesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos organicos, que incluyen biomoleculas, que incluye la expresion de oligonucleotidos y oligopeptidos aleatorizados. De manera alternativa, estan disponibles o se producen facilmente bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fungicos vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos producidos natural o sinteticamente se modifican facilmente por medio de los medios qmmicos, ffsicos y bioqmmicos convencionales, y se pueden utilizar para producir bibliotecas combinatorias. Se pueden someter los agentes farmacologicos conocidos a modificaciones qmmicas dirigidas o aleatorias, tales como acilacion, alquilacion, esterificacion, amidacion, etc. para producir analogos estructurales.
Los agentes se seleccionan por su actividad biologica anadiendo el agente a al menos una y habitualmente una pluralidad de muestras celulares, habitualmente en conjuncion con celulas que carecen del agente. El cambio en los parametros como respuesta al agente se mide, y el resultado se evalua por comparacion con cultivos de referencia, por ejemplo, en presencia y ausencia del agente, que se obtiene con otros agentes, etc.
Los agentes se pueden anadir en solucion, o en forma facilmente soluble, al medio de celulas en cultivo. Los agentes se pueden anadir en un sistema de flujo continuo, como una corriente, intermitente o continua, o de manera alternativa, anadiendo una embolada del compuesto, unica o de manera incremental, a una solucion de otra manera estatica. En un sistema de flujo continuo, se utilizan dos fluidos, en que uno es una solucion neutra fisiologicamente, y la otra es la misma solucion con el compuesto de ensayo anadido. El primer fluido se pasa por encima de las celulas seguido por el segundo. En un procedimiento de solucion unica, se anade una embolada del compuesto de ensayo al volumen de medio que rodea las celulas. Las concentraciones totales de los componentes del medio de cultivo no debenan cambiar significativamente con la adicion de la embolada, o entre las dos soluciones en un procedimiento de flujo continuo.
Algunas formulaciones del agente no incluyen componentes adicionales, tales como conservantes, que pueden tener un efecto significativo sobre la formulacion total. Por lo tanto, tales formulaciones consisten esencialmente en un compuesto biologicamente activo y un vehfculo fisiologicamente aceptable, por ejemplo, agua, etanol, DMSO, etc. Sin embargo, si un compuesto es lfquido sin disolvente, la formulacion puede consistir esencialmente en el compuesto en sf mismo.
Se pueden ejecutar una pluralidad de ensayos en paralelo con concentraciones de agentes diferentes para obtener una respuesta diferencial a varias concentraciones. Como se conoce en la tecnica, la determinacion de la concentracion eficaz de un agente utiliza tfpicamente un intervalo de concentraciones que resulta de diluciones 1:10, u otra escala logantmica. Las concentraciones se pueden afinar mas con una segunda serie de diluciones, si fuera necesario. Tfpicamente, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, concentracion cero o por debajo del nivel de deteccion del agente o en o debajo de la concentracion de agente que no da un cambio detectable en el fenotipo.
Se pueden utilizar varios procedimientos para cuantificar la presencia de los marcadores seleccionados. Para medir la cantidad de una molecula que esta presente, un procedimiento conveniente es marcar una molecula con un resto detectable, que puede ser fluorescente, luminiscente, radioactivo, activo enzimaticamente, etc., particularmente una molecula espedfica para la union al parametro con alta afinidad. Los restos fluorescentes estan disponibles facilmente para marcar virtualmente cualquier molecula, estructura, o tipo celular.
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Los restos inmunofluorescentes pueden dirigirse para que se unan no solo a protemas espedficas sino tambien a conformaciones espedficas, productos de escision, o modificaciones de sitio como la fosforilacion. Los peptidos y protemas individuals se pueden modificar para que tengan autofluorescencia, por ejemplo, expresandolos como quimeras proteicas fluorescentes dentro de las celulas (para una revision vease Jones et. al. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81). Por lo tanto, se pueden modificar geneticamente los anticuerpos para proporcionar un colorante fluorescente como parte de su estructura. Dependiendo del marcador escogido, se pueden medir los parametros utilizando marcadores distintos de los fluorescentes, utilizando tales tecnicas de inmunoensayo como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA)., inmunoensayos enzimaticos homogeneos, y tecnicas no enzimaticas relacionadas. La cuantificacion de acidos nucleicos, especialmente los ARN mensajeros, tambien tienen interes como parametros. Estos se pueden medir por tecnicas de hibridacion que dependen de la secuencia de nucleotidos del acido nucleico. Las tecnicas incluyen procedimientos de reaccion en cadena de polimerasa asf como tecnicas de matriz genetica. Vease Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds, John Wiley & Sons, New York, NY, 2000; Freeman y col. (1999) Biotechniques 26(1):112-225; Kawamoto at al. (1999) Genome Res 9(12):1305-12; y Chen y col. (1998) Genomics 51(3):313-24, como ejemplos.
Bases de datos de perfiles de expresion y analisis de los datos
Tambien se proporcionan bases de datos de perfiles de expresion genetica de celulas madre cancerosas y otros tipos celulares y usos de las mismas. Tales bases de datos comprenderan tfpicamente los perfiles de expresion que se derivan de varias subpoblaciones celulares, tales como celulas madre cancerosas, celulas no madre cancerosas, equivalentes normales de celulas cancerosas, celulas en estado de enfermedad (por ejemplo, celulas intestinales inflamatorias, celulas de colitis ulcerativa), celulas infectadas vmcamente, celulas progenitoras precoces, celulas progenitoras diferenciadas inicialmente, celulas progenitoras diferenciadas tardfamente, y celulas maduras. Los perfiles de expresion y las bases de datos de los mismos se pueden proporcionar en una variedad de medios para facilitar su uso. “Medios” se refiere a una fabricacion que contiene la informacion del perfil de expresion de la presente invencion. Las bases de datos de la presente invencion se pueden grabar en un medio lefble por computadora, por ejemplo, cualquier medio que se puede leer y accederse a el directamente por una computadora. Tales medios incluyen pero no se limitan a: medios de almacenamiento magneticos, tales como disquetes, medios de almacenamiento en disco duro, y cintas magneticas; medios de almacenamiento opticos tales como CD-ROM; medios de almacenamiento electrico tales como RAM y ROM; e tnbridos de estas categonas tales como medios de almacenamiento magneticos/opticos. Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente como se pueden utilizar cualquiera de los medios lefbles por computadora conocidos en el presente para crear una fabricacion que comprende una grabacion de la presente informacion de la base de datos. “Grabado” se refiere a un proceso de almacenamiento de la informacion en un medio lefble por computadora, utilizando cualquiera de los procedimientos que se conocen en la tecnica. Se puede escoger cualquier estructura de almacenamiento de datos conveniente, que se base en los medios utilizados para acceder a la informacion almacenada. Se pueden utilizar una variedad de programas y formatos de proceso de datos para el almacenamiento, por ejemplo, un archivo proceso de texto Word, un formato de base de datos, etc.
Como se utiliza en el presente documento, “un sistema basado en computadora” se refiere a los medios de hardware, medios de software, y medios de almacenamiento de datos que se utilizan para analizar la informacion de la presente invencion. El hardware mmimo de los sistemas basados en computadora de la presente invencion comprende una unidad de proceso central (CPU), medios de entrada, medios de salida, y medios de almacenamiento. Un experto en la tecnica puede apreciar facilmente que uno cualquiera de los sistemas basados en computadora disponibles actualmente es adecuado para su uso en la presente invencion. Los medios de almacenamiento de datos puede comprender cualquier fabricacion que comprende una grabacion de la presente informacion como se ha descrito anteriormente, o un medio de acceso a la memoria al que se puede acceder tal como una fabricacion.
Se puede utilizar una variedad de formatos estructurales para los medios de entrada y salida para introducir y obtener la informacion en los sistemas basados den computadora de la presente invencion. Tal presentacion proporciona al experto una variedad de similitudes e identifica el grado de similitud contenido en el perfil de expresion.
Se pueden utilizar varios procedimientos para el analisis de un grupo de datos. En una realizacion, los datos de la expresion se someten a transformacion y normalizacion. Por ejemplo, se generan relaciones por centrado de la media de los datos de expresion para cada gen (dividiendo la medicion de la intensidad de cada gen en una determinada matriz por la intensidad media del gen a traves de todas las matrices), (2) luego se transforman logantmicamente (base 2) las relaciones resultantes, y (3) luego se centran en la mediana los datos de expresion a lo largo de matrices y luego a lo largo de los genes.
Paras los datos de la micromatriz de ADNc, los genes con senales de hibridacion fluorescentes de al menos 1,5 veces mayores que la senal fluorescente de fondo local en el canal de referencia se consideran que estan medidos adecuadamente. Los genes se centran por el valor de la media en cada grupo de datos, y se lleva a cabo el agrupamiento ligado a la media.
Tambien puede tomarse una estrategia a escala del analisis de datos. Por ejemplo, una correlacion de Pearson de
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los valores de expresion de los genes puede proporcionar una puntuacion cuantitativa que refleja la marca de cada CSC. Cuanto mayor es el valor de correlacion, mayor se parece la muestra a un fenotipo CSC de referencia. Una correlacion similar se puede hacer para cada tipo celular, que incluye celulas normales, celulas progenitores, celulas de fenotipo autoinmunitario, celulas de fenotipo inflamatorio, celulas infectadas, celulas cancerosas diferenciadas, celulas madre normales, celulas maduras normales, etc. Un valor de correlacion negativo indica el comportamiento contrario. El umbral de la clasificacion se puede desplazar hacia arriba o abajo de cero dependiendo de la meta clmica. Por ejemplo, se puede calcular la sensibilidad y especificidad para predecir la metastasis como primer evento de recurrencia para cada umbral entre -1 y +1 para la puntuacion de correlacion en incrementos de 0,05, y se puede seleccionar el valor del umbral que de una sensibilidad deseada, por ejemplo, un 80%, 90%, 95%, etc. para la prediccion de metastasis.
Para proporcionar el orden de significancia, se puede determinar la tasa de descubrimiento falsa (FDR). Primero, se genera un grupo de distribuciones nulas o valores de no similitud. En una realizacion, los valores de los perfiles que se observan se permutan para crear una secuencia de distribuciones de coeficientes de correlacion que se obtienen fuera de oportunidad, creando de esta manera un grupo apropiado de distribuciones nulas de coeficientes de correlacion (vease Tusher y col. (2001) PNAS 98, 5118-21). El grupo de distribucion nula se obtiene: permutando los valores de cada perfil para todos los perfiles disponibles; calculando la correlacion de coeficientes en parejas para todos los perfiles; calculando la funcion de probabilidad de densidad de los coeficientes de correlacion para esta permutacion; y repitiendo el procedimiento N veces, donde N es un numero alto, habitualmente 300. Utilizando las N distribuciones, se calcula una medicion apropiada (media, mediana, etc.) del recuento de los valores del coeficiente de correlacion en que sus valores exceden el valor (de similitud) que se obtiene a partir de la distribucion de los valores de similitud observados experimentalmente a un nivel de significancia.
La FDR es la relacion del numero de correlaciones significativas esperadas falsamente (estimada a partir de las correlaciones mayores que esta correlacion Pearson seleccionada en el grupo de datos aleatorizados) respecto al numero de correlaciones mayores que esta correlacion Pearson seleccionada en los datos empmcos (correlaciones significativas). Este valor de correlacion lfmite se puede aplicar a las correlaciones entre perfiles experimentales.
Utilizando la distribucion mencionada anteriormente, se elige un nivel de confianza para la significancia. Esto se utiliza para determinar el valor mas bajo del coeficiente de correlacion que excede el resultado que se habna obtenido por oportunidad. Utilizando este procedimiento, se obtienen umbrales para la correlacion positiva, la correlacion negativa o ambas. Utilizando este umbral(es), el usuario puede filtrar los valores observados de la correlacion de coeficientes por parejas y eliminar los que no exceden el umbral(es). Ademas, se puede obtener una estimacion de la tasa falsa positiva para un determinado umbral. Para cada una de las distribuciones de “correlacion aleatoria” individuales, se puede encontrar cuantas observaciones se encuentran fuera del intervalo de umbrales. Este procedimiento proporciona una secuencia de recuentos. La media y la desviacion estandar de la secuencia proporciona el numero medio de falsos positivos potenciales y su desviacion estandar.
Los datos se pueden someter a un agrupamiento jerarquico no supervisado para revelar relaciones entre los perfiles. Por ejemplo, se puede llevar a cabo un agrupamiento jerarquico, en que se emplea la correlacion de Pearson como metrica de agrupamiento. El agrupamiento de la matriz de correlacion, por ejemplo, utilizando un escalado multidimensional, se aumenta la visualizacion de similitudes y no similitudes de homologfa funcional. El escalado multidimensional (MDS) se puede aplicar en una, dos o tres dimensiones.
El analisis se puede implementar en hardware o software, o en una combinacion de ambos. En una realizacion de la invencion, se proporciona un medio de almacenamiento lefble por la maquina, un medio que comprende un material de almacenamiento que se codifica con datos lefbles por la maquina que, cuando se utiliza una maquina programada con instrucciones para utilizar dichos datos, es capaz de presentar uno cualquiera de los grupos de datos y comparaciones de datos de la presente invencion. Tales datos se pueden utilizar para una variedad de fines, tales como descubrimiento de farmacos, analisis de las interacciones entre los componentes celulares, y similares. En algunas realizaciones, la invencion se implementa en programas de computadora que se ejecutan en computadoras programables, que comprenden un procesador, un sistema de almacenaje de datos (incluyendo memoria volatil y no volatil y/o elementos de almacenamiento), al menos un dispositivo de entrada, y al menos un dispositivo de salida. El codigo del programa se aplica a los datos de entrada para llevar a cabo las funciones que se describen anteriormente y generar la informacion de salida. La informacion de salida se aplica a uno o mas dispositivos de salida, de una manera conocida. La computadora puede ser, por ejemplo, una computadora personal, microcomputadora, o una estacion de trabajo con diseno convencional.
Cada programa se puede implementar en un procedimiento u objeto de alto nivel orientado a lenguaje de programacion, si se desea. En cualquier caso, el lenguaje puede ser un lenguaje recopilado o interpretado. Cada tal programa de computadora se puede almacenar en un medio o dispositivo de almacenamiento (por ejemplo, ROM o disquete magnetico) lefble por una computadora programable con fines generales o especiales, para configurar y operar la computadora cuando el medio o dispositivo de almacenamiento es lefdo por la computadora para llevar a cabo los procedimientos descritos en el presente documento. El sistema puede tambien considerarse para ser implementado como un medio de almacenamiento lefble por computadora, que se configura con un programa de computadora, en el que el medio de almacenamiento asf configurado produce que la computadora funcione de una maneara espedfica y predefinida para llevar a cabo las funciones descritas en el presente documento.
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Se puede utilizar una variedad de formatos estructurales para los medios de entrada y salida para introducir y extraer la informacion en los sistemas basados en computadora de la presente invencion. Un formato para un medio de salida ensaya grupos de datos que poseen varios grados de similitud con un perfil de confianza. Tal presentacion proporciona a un experto una variedad de similitudes e identifica el grado de similitud contenido en el patron de ensayo.
Almacenamiento y transmision de datos
Se proporciona ademas en el presente documento un procedimiento de almacenamiento y/o transmision, por medio de computadora, secuencias, y otros datos recolectados por los procedimientos desvelados en el presente documento. Se pueden utilizar cualquier computadora o accesorio de computadora incluyendo, pero sin limitarse a software y dispositivos de almacenamiento, para la practica de la presente invencion. La secuencia u otros datos (por ejemplo, datos del transcriptoma), se pueden introducir en una computadora por un usuario bien directa o indirectamente. Adicionalmente, se puede unir cualquiera de los dispositivos que se pueden utilizar para secuenciar ADN o analizar ADN o analizar datos del transcriptoma, tal que los datos se transfieran a una computadora y/o dispositivo de almacenamiento compatible con la computadora. Los datos se pueden almacenar en una computadora o dispositivo de almacenamiento (por ejemplo, un CD). Los datos se pueden enviar desde una computadora a otra computadora o un punto de recoleccion de datos por medio de procedimientos bien conocidos en la tecnica (por ejemplo, internet, correo terrestre, correo aereo). Por lo tanto, los datos recolectados por los procedimientos que se describen en el presente documento se pueden recolectar en cualquier punto o localizacion geografica y enviare a cualquier otra localizacion geografica.
Se ilustra un procedimiento ejemplar en la Figura 10. En este ejemplo, un usuario proporciona una muestra a un aparato de secuenciacion. Los datos se recolectan y/o analizan por el aparato de secuenciacion que esta conectado a una computadora. El software de la computadora permite la recoleccion de datos y/o el analisis. Los datos se pueden almacenar, presentar (por medio de un monitor u otro dispositivo similar), y/o enviarlos a otra localizacion. Como se muestra en la Figura 10, la computadora esta conectada a internet que se utiliza para transmitir los datos a una dispositivo portatil utilizado por un usuario remoto (or ejemplo, un medico, cientffico o analista). Se entiende que los datos se pueden almacenar y/o analizar antes de la transmision. En algunas realizaciones, se pueden recolectar los datos en bruto y enviarlos a un usuario remoto que analizara y/o almacenara los datos. La transmision se puede producir, como se muestra en la Figura 10, por medio de internet, pero tambien puede producirse por via satelite u otra conexion. DE manera alternativa, los datos se pueden almacenar en un medio lefble por computadora (por ejemplo, un CD, un dispositivo de almacenamiento de memoria) y el medio se puede enviar a un usuario final (por ejemplo, por correo). El usuario remoto puede estar en la misma o una localizacion geografica diferente que incluye, pero no se limita a un edificio, ciudad, estado, pafs o continente.
Reactivos y kits
Tambien se proporcionan reactivos y kits de los mismos para la practica de uno o mas de los procedimientos descritos anteriormente. Los reactivos objeto y kits de los mismos vanan mucho. Los reactivos de interes incluyen reactivos disenados espedficamente para su uso en la produccion de los perfiles de expresion descritos anteriormente de genes determinantes del fenotipo. Por ejemplo, los reactivos pueden incluir grupos de cebadores para genes conocidos que se expresan diferencialmente en una poblacion o subpoblacion diana (por ejemplo, los reactivos para detectar celulas de cancer de mama tumorigenicas pueden incluir cebadores y sondas para expandir y detectar la expresion de CD49f, CD24, y/o EPCAM).
Un tipo de reactivo que se hace a medida espedficamente para generar perfiles de expresion de poblaciones y subpoblaciones celulares diana es una coleccion de cebadores geneticos espedficos que se disenan para amplificar selectivamente tales genes, para su uso en una PCR cuantitativa y otros procedimientos de cuantificacion. Los cebadores geneticos espedficos y los procedimientos para utilizar los mismos se describen en la Patente de EE. UU. N° 5.994.076. Son de particular interes las colecciones de cebadores geneticos espedficos que tienen cebadores para al menos 5 de los genes, a menudo una pluralidad de estos genes, por ejemplo, al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 genes o mas. Las colecciones de cebadores geneticos espedficos pueden incluir solo cebadores para genes asociados con una poblacion o subpoblacion diana (por ejemplo, mutaciones, genes mal regulados conocidos, etc.), o pueden incluir cebadores de genes adicionales (por ejemplo, genes constitutivos, controles).
Los kits de la invencion objeto pueden incluir las colecciones de cebadores geneticos espedficos descritos anteriormente. Los kits pueden incluir ademas un paquete de software para analisis estadfsticos de uno o mas fenotipos, y pueden incluir una base de datos de referencia para calcular la probabilidad o susceptibilidad. El kit puede incluir reactivos que se emplean en varios procedimientos, tales como cebadores para generar acidos nucleicos diana, dNTPs y/o rNTPs, que pueden estar o bien premezclados o separados, uno o mas dNTPs y/o rNTPs marcados unicamente, tal como biotinilados o dNTPs marcados con Cy3 o Cy5, partfculas de oro o plata con diferentes espectros de dispersion, u otro reactivo marcado post-smtesis, tal como derivados qmmicamente activos o colorantes fluorescentes, enzimas, tales como transcriptasas inversas, ADN polimerasas, ARN polimerasas, y similares, varios medios tampon, por ejemplo, tampones de hibridacion y lavado, matrices con sondas prefabricadas, reactivos y componentes de purificacion de sondas marcadas, columnas tipo giratorio, etc., reactivos de generacion
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y deteccion de senal, por ejemplo conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina, sustrato quimiofluorescente o quimioluminiscente, y similares.
Ademas de los componentes anteriores, los kits objeto incluiran ademas instrucciones para la practica de los procedimientos objeto. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits objetos en una variedad de formas, una o mas de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como una informacion impresa en un medio o soporte adecuado, por ejemplo, un trozo o trozos de papel en los que se imprime la informacion, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Otro medio sena una medio iefble por computadora, por ejemplo un disquete, CD, etc., en el que la informacion se ha grabado. Otro medio que puede estar presente es una direccion de internet que se puede utilizar por internet para acceder a la informacion en un sitio reubicado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Los procedimientos analfticos descritos anteriormente se pueden incorporar como un programa de instrucciones ejecutables por una computadora para llevar a cabo los aspectos diferentes de la invencion. Cualquiera de las tecnicas descritas anteriormente se puede llevar a cabo por medio de componentes de software cargados en una computadora u otro aparato de informacion o dispositivo digital. Cuando esta capacitado, la computadora, aparato o dispositivo puede llevar a cabo entonces las tecnicas descritas anteriormente para ayudar al analisis de los grupos de valores asociados con una pluralidad de genes de la manera que se ha descrito anteriormente, o para comparar tales valores asociados. El componente de software se puede cargar desde un medio fijo o se puede acceder a traves de un medio de comunicacion tal como internet u otro tipo de red de computadora. Las caractensticas anteriores que se incorporan en uno o mas programas de computadora se pueden llevar a cabo por una o mas computadoras que ejecutan tales programas.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.
Ejemplo 1: Analisis de la expresion genetica en celulas unicas
Una fraccion de CSC de mama murinas contienen niveles relativamente bajos de ROS, y asf se hizo la hipotesis de que estas celulas pueden expresar niveles aumentados de defensas ROS en comparacion con sus equivalentes NTC.
Analisis de expresion genetica de celulas unicas. Para los experimentos de expresion genetica en celulas unicas, los inventores utilizaron chips de microflmdica DynamicArray qPCR (Fluidigm). Se clasificaron celulas unicas enriquecidas en CSC MMTV-Wnt-1 Thy1+CD24+Lin (TG) y celulas no tumorigenicas (NTG) "Not Thy1+CD24+" Lin" por FACS en placas de 96 pocillos que conteman mezcla PCR (CellsDirect, Invitrogen) y un inhibidor de RNasa (Superaseln, Invitrogen). Tras la lisis hipotonica los inventores anadieron las enzimas RT-qPCR (SuperScript III RT/Platinum Taq, Invitrogen), y una mezcla que contema un grupo de ensayos de baja concentracion (cebadores/sondas) para los genes de interes (Gclm- Mm00514996_m1, Gss-Mm00515065_m 1, Foxol- Mm00490672_m1, Foxo4- Mm00840140_g1, H ifla Mm00468875_m1, Epasl- Mm00438717_m1). La transcripcion inversa (15 minutos a 50 °C, 2 minutos a 95 °C) se siguio con la pre-amplificacion con 22 ciclos de PCR (cada ciclo: 15 seg a 95 °C, 4 minutos a 60 °C). Se ejecutaron en paralelo los controles de ARN total. El ADNc amplificado resultante de cada una de las celulas se inserto en las entradas de muestra del chip con una mezcla qPCR Taqman (Applied Biosystems). Los ensayos individuales (cebadores/sondas) se insertaron en las entradas de ensayo del chip (2 replicas para cada uno). El chip se cargo durante una hora en un cargador de chip (Nanoflex, Fluidigm) y se transfirio entonces a un lector (Biomark, Fluidigm) para termociclado y cuantificacion fluorescente. Para retirar ensayos geneticos de baja calidad, los inventores desecharon los ensayos geneticos cuyas curvas de qPCR no mostraban aumentos exponenciales. Para retirar las celulas de baja calidad (por ejemplo, celulas muertas) los inventores desechaban las celulas que no expresaban los genes constitutivos Actb (beta-actina) y Hprtl (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa 1). Esto resultaba en un grupo de datos de expresion genetica de celula unica que consistfa en 248 celulas (109 tumorigenicas y 139 no tumorigenicas) de un total de 7 ejecuciones de chip. Se calculo una estadfstica de Kolmogorov-Smirnov (K-S) de dos muestras para ensayar si los genes se expresaban diferencialmente en las dos poblaciones. Los inventores generaron los valores p permutando los marcadores de las muestras (es decir TG frente a NTG) y comparando la estadfstica K-S actual con las de la distribucion nula derivada de la permutacion. Los valores de p se corrigieron adicionalmente por la correccion de Bonferroni para ajustarse a multiples ensayos de hipotesis.
Ejemplo 2: Analisis y cuantificacion de “celulas madre cancerosas de cancer colorrectal” (Co-CSC) utilizando SINCE-PCR, un nuevo procedimiento basado en “analisis de expresion genetica de celula unica”
El procedimiento SINCE-PCR permite la identificacion, caracterizacion y cuantificacion de “celulas madre cancerosas” en tejidos de cancer colorrectal humanos, con un grado de pureza y resolucion que no se habfa alcanzado previamente. Las celulas madre cancerosas, que pueden ser celulas tumorigenicas o iniciales de tumor, son una subpoblacion de celulas cancerosas que pueden tener la capacidad para formar tumores cuando se trasplantan en ratones inmunodeficientes. Las poblaciones de celulas madre cancerosas se han identificado actualmente en cancer de mama, cerebro, cabeza y cuello, pancreatico y de colon. La definicion funcional precisa y
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la cuantificacion de “celulas madre cancerosas” tiene varias implicaciones importantes para el diagnostico, pronostico, clasificacion y direccion terapeutica de canceres humanos.
Los inventores han descrito un nuevo procedimiento para la identificacion, analisis y cuantificacion de “celulas madre cancerosas” en tejidos de cancer colorrectal humano, basandose en el analisis de la expresion genetica de celulas unicas por reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR de tiempo real). Los inventores han identificado un nuevo grupo de genes cuya expresion coordinada y diferencial se puede utilizar como una “marca” para identificar subgrupos celulares de cancer distintos en el mismo tejido tumoral. Este nuevo grupo de genes incluye genes constitutivos comunes a todas las celulas epiteliales (EpCAM, beta-Actina, GAPDH), genes relacionadas con biologfa de celulas madre (hTERT, LGR5, Survivina) y genes implicados en las rutas de diferenciacion espedfica de tejido relacionadas con los distintos linajes celulares (Anhidrasa Carbonica II, MUC2, Factor 3 de la familia Trefoil) y estadios de diferenciacion (Citoqueratina 20, CD66a/CEACAM1) del epitelio normal del colon. Basandose en el patron de expresion de este grupo de genes, las celulas purificadas de tejidos de cancer colorrectal humano y analizadas individualmente como celulas unicas se pueden “clasificar” y agrupar en grupos distintos, que corresponden con estadios mas o menos avanzados de diferenciacion (por ejemplo, celulas diferenciadas terminalmente en la parte superior de las criptas del colon humano frente a celulas mas inmaduras localizadas en el fondo de la cripta del colon humano) y para distinguir linajes de diferenciacion del epitelio del colon (por ejemplo, celulas globosas, enterocitos, celulas inmaduras). Cada grupo se puede cuantificar como un porcentaje de la poblacion total. Los inventores han llamado a esta estrategia y metodologfa de analisis de la composicion celular de tejidos biologicos “SINCE-PCR” (Reaccion en cadena de la polimerasa de Expresion de celulas unicas).
El descubrimiento se basa en varias observaciones. Las “celulas madre de cancer colorrectal” enriquecidas por citometna de flujo directamente a partir de tejidos de tumores solidos recolectados recientemente pueden analizarse de manera reproducible y robustamente a nivel de celula unica (Figura 1).
En los xenoinjertos de cancer de colon humanos, los analisis de expresion genetica de celulas unicas por PCR en tiempo real indican que ambas celulas cancerosas EpCAM-/CD44+ y EpCAM-/VCD166+, que se conocen por enriquecerse en la poblacion de “celulas madre de cancer colorrectal”, se pueden subdividir adicionalmente en subgrupos celulares diferentes que se caracterizan por la expresion diferencial y coordinada de distintos grupos de genes implicados en los procesos de la biologfa y diferenciacion de celulas madre. De manera mas interesante, los subgrupos de celulas que presentan altos niveles de genes que codifican los marcadores de diferenciacion terminal epiteliales del colon (por ejemplo, Citoqueratina 20, CD66a/CEACAM1, Anhidrasa Carbonica II, MUC2, Factor 3 de la familia Trefoil) no expresan o expresan bajos niveles de genes que codifican marcadores de celulas madre intestinales candidatos o genes que se sabe que son necesarios para la funcion de celulas madre (por ejemplo, hTERT, LGR5, Survivina) y viceversa. Esto sugiere que las celulas cancerosas EpCAM/CD44+/CD166+ contienen subgrupos celulares distintos que se caracterizan por diferentes estadios de diferenciacion (Figura 2).
Cuando se purifican por medio de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) y se reinyectan en ratones NOD/SCID inmunodeficientes, las celulas CD44+/CD66a+ y CD44+/CD66anew1" presentan propiedades tumorigenicas sustancialmente diferentes, comportandose la poblacion CD44+/CD66aneglow como la dotada con la mayor capacidad tumorigenica (Tabla 4). Esto indica que, en la poblacion celular EpCAM/CD44+, el subgrupo celular que se caracteriza por altos niveles de expresion de genes que codifican marcadores de diferenciacion tales como CD66a/CEACAMI (es decir, el subgrupo celular mas “maduro”) esta frecuentemente relativamente agotado de capacidad tumorigenica. Por otro lado, el subgrupo celular que se caracteriza por la ausencia o bajos niveles de expresion de marcadores de diferenciacion tale como CD66a/CEACAMI (es decir, el subgrupo celular mas “inmaduro”) esta enriquecido en contenido de “celulas madre de cancer colorrectal”.
Tabla 1. Propiedades tumorigenicas de celulas del cancer de colon humano basandose en la expresion de CD66a/CEACAMI, en combinacion con EpCAM y/o CD44.
Exp.
Fuente del tumora Poblaciones clasificadasb Linneg Dosis celular Agarre turmoralc Codigo del experimento
1)
UM n° 4 m4 CD44neg 10.000 2/10 PD69-
CD44+/CD66a+ 450 1/3
CD44+/CD66aneg"baja 250 2/3
2)
UM n° 4 m6 CD44neg 10.000 1/5 PD85
CD44+/CD66a+ 500 0/2
CD44+/CD66aneg"baja 1.000 3/3
3)
UM n° 4 m4 CD44neg 10.000 0/5 PD107
CD44+/CD66a+ 1.000 0/1
CD44+/CD66aneg"baja 1.000 3/4
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(continuacion)
Exp.
Fuente del tumora Poblaciones clasificadasb Linneg Dosis celular Agarre turmoralc Codigo del experimento
4)
SU29 ml CD44neg 7.000 0/5 PD88-
CD44+/CD66a+ 1.000 0/5
CD44+/CD66aneg'baja 2.000 1/5
1.000 0/5
5)
SU43 primario EpCAM+/CD44neg 12.000 0/5 PD79
EpCAM+/CD44+/CD66a+ 300 0/1
EpCAM+/CD44+/CD66aneg-baja 1.000 1/3
a Para cada experimento, el paso en serie in vivo del xenoinjerto tumoral utilizado con fuente para la purificacion celular del cancer se expone como sigue: ml indica la primera ronda de tumores que se obtienen del primer injerto tumoral, m2 la segunda ronda de tumores que se obtienen del injerto de ml, m3 la tercera ronda de tumores que se obtienen del injerto de m2, y asf progresivamente; primario indica un tumor primario, recolectado directamente de un especimen quirurgico. bTodas las poblaciones clasificadas se van a considerar negativas para marcadores de linaje (Linneg), que incluyen CD45 de raton y H2-Kd de raton en el caso de xenoinjertos de tumores humanos establecidos en ratones NOD/SCID, y CD3 y CD45 humanos en el caso de tumores primarios humanos (en este caso EpCAM sirve como un marcador de seleccion epitelial positivo) cAgarre del tumor se expone como: numero de tumores o tumores obtenidos/numero de inyecciones; el agarre del tumor se considera insatisfactorio cuando no es visible una masa tumoral tras 5 meses de seguimiento.__________________________________________________________
Ejemplo 2: Generacion e imagen de modelos de xenoinjerto de cancer de mama humano con metastasis pulmonar.
Se trasplantaron ortotopicamente espedmenes de cancer de mama derivados de pacientes (trozos o TIC) en las almohadillas grasas mamarias de ratones NOD-SCID. Se generaron seis modelos de xenoinjertos tumorales (1 ER+, 1 Her2+ y 4 triple negativos ER-PRHer2-). Los cuatro xenoinjertos triple negativos desarrollaron micrometastasis de pulmon espontaneas, demostradas por tinciones IHC, es decir, H/E, tinciones por marcador de proliferacion Ki67 y Vimentina (Vin). Estos datos sugieren que con la implantacion en ratones inmunodeficientes, las celulas de tumor de mama o TIC son capaces de adaptarse al microambiente del raton y reasumir el crecimiento y progresion del tumor humano con metastasis pulmonar espontanea.
Para facilitar la imagen dinamica y semicuantitativa del cancer de mama humano y la metastasis en ratones, las TIC de mama se transducen con un gen de fusion luciferasa de luciernaga-EGFP por medio de un lentivirus pHRuKFG (moi 50) 4 dfas despues del implante, las TIC en el sitio primario eran detectables por senales bioluminiscentes debiles. Y un mes mas tarde, tanto los tumores primarios (en las almohadillas de grasa mamaria de L4 y R2) y las metastasis pulmonares se detectaron y se diagnosticaron por imagen con un sistema Xenogen IVIS 200 en el Centro de diagnostico por imagen de pequenos animales de Stanford. Los inventores observaron que el tamano del tumor o el numero de celulas se correlacionaba bien con la intensidad de la senal. La generacion e imagen bioluminiscente de xenoinjertos tumorales con metastasis les proporcionaron la fiabilidad de validacion de las funciones de los miARN en MTIC de cancer de mama humano in vivo en esta proposicion.
Ejemplo 3: Analisis de micromatrices y PCR en tiempo real de MITC de mama humanas
Las celulas iniciales primarias de un tumor de mama humano (TIC) o TIC metastaticas (MTIC) (linaje CD44+CD24" /bajoESA+) se aislaron a partir del sitio primario del cancer de mama o de derrames pleurales. Una vez que las metastasis pulmonares se detectaron en los modelos de xenoinjerto, se disociaron los pulmones con blenzyme (Roche) y las celulas se tineron con H2K de raton y CD44, CD24 y ESA humanos para purificar las poblaciones de MTIC (CD44+CD24"/baj°ESA+H2K-, Figura 8a), con crecimiento ortotopico de tumores con una relacion de 5/8 con 200-1000 celulas clasificadas, tras trasplantarse en las almohadillas grasas mamarias
Se demostro por analisis de micromatrices y PCR en tiempo real que los genes diana regulados HIF1a y HIF1 se expresaban diferencialmente en MTIC en comparacion con celulas tumorales no tumorigenicas, que incluyen Snail, Zeb2, Vimentina, E-caderina, Lox, Cox2, VEGF, etc. (Figura 8B). Se confirmo la co-localizacion de HIF1a, Vimentina y CD44 por tincion inmunohistoqmmica.
Ejemplo 4: Analisis de microARN
Se identificaron por exploracion de microARN, los perfiles de expresion diferencial de celulas madre de cancer de mama parentales y celulas de cancer metastaticas asiladas de los pulmones. Por ejemplo, mayor expresion de miR- 10a y menores niveles de miR-490, miR-199a, etc. en MITC de pulmon que los de TIC de mama primario. Como se demuestra por PCR en tiempo real por triplicado de la Figura 4, la comparacion de la media de los valores de CT de las MTIC de pulmon frente a las TIC primarias: miR-10a (-7.9), miR-490 (+3.0) y miR-199a (+12.9). Se utilizo NR3 como un control interno. Los datos indicaban que el miR-10a estaba regulado positivamente hasta 27,9 veces, y el miR-199a regulado negativamente en 212-9 veces en las MTIC que en TIC primarias del cancer de pulmon.
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Ejemplo 5: El CD66a como marcador celular de cancer no tumorigenico de cancer de mama
Se clasificaron las celulas de cancer de mama basandose en CD44 y CD66a mientras que la mayona de las celulas eran CD244bw. Las celulas se implantaron entonces en las almohadillas grasas mamarias de ratones NOD/SCID y se controlo el crecimiento tumoral. Las celulas CD44/CD66a- mostraron una tasa mayor de trasplante asf como una tasa de crecimiento mayor por imagen bioluminiscente como se muestra en la Figura 5. Las celulas CD66+ mostraban una tasa menor y retrasada del crecimiento tumoral, el tamano del tumor es mucho menor y presenta perfiles de flujo muy similares en comparacion con los tumores derivados de CD66-.
En la Figura 5a, el perfil de flujo se demostro basandose en marcadores CD44 y CD66a. Las celulas CD66- CD44+ y CD66+CD44+ se clasificaron por analisis tumorigenicos in vivo (100 celulas o 1000 celulas implantados a Zid o 4lh de las almohadillas grasas mamarias de ratones NOD/SLID). Como se indica en 10b, 5 de 8 implantes de 100 celulas CD66- credan en tumores mientras que 2 de 8 de 100 celulas CD66+ credan. Para 1000 celulas, 8 de 8 de las inyecciones de celulas CD66- crecieron pero solo 3 de 8 de celulas CD66+ credan en tumores. Comparando la tasa de crecimiento de tumores palpables, las CD66+ tienen tamanos mucho menores y mas pequenos que los que se derivan de celulas CD66- (Figura 5c). En la Figura 5d, 100K celulas CD66-CD44+ o CD66+CD44+ se infectaron con lentivirus luciferasa de luciernaga-EGFP antes de la inyeccion. Las senales bioluminiscentes de las celulas CD66+ eran mayores que las de las celulas CD66- desde el principio (dfa 13). Pero tras 1 mes o 2 meses, las celulas CD66- mostraban senales bioluminiscentes dominantes y crecimiento de tumores palpables al final (dfa 68).
Ejemplo 6: Optimizacion del listado genetico utilizado para identificar y medir la frecuencia de celulas madre cancerosas
La mayona de los marcadores que se utilizan en esta momento para identificar tanto las celulas madre normales como las celulas madre cancerosas no estan ligados a una funcion de celula madre esencial. Su expresion se liga al microambiente particular en el que reside la celula madre en el momento del aislamiento. Por lo tanto, la utilidad de marcadores comunes que se utilizan para utilizar celulas madre puede variar con el sitio en que se recolectan.
La estrategia de los inventores ha sido identificar marcadores de funciones cnticas de celulas madre. Aunque la auto-renovacion es la propiedad esencial de la celula madre, los inventores enfocaron sus esfuerzos en las rutas de renovacion. Los inventores han identificado multiples genes que se expresan altamente por HSC normales, celulas madre de leucemia que se originan a partir de celulas progenitoras, y celulas madre del cancer epitelial humano, pero no por celulas que no se auto-renuevan en cada tejido respectivo. El analisis genomico descrito en los resultados preliminares identifica varios genes que se han unido previamente a la auto-renovacion de celulas madre. De manera similar, los inventores identificaron microARN candidates que se expresan diferencialmente por celulas madre del cancer de mama y celulas del cancer no tumorigenicas. Las pruebas demuestran que varios de estos genes y microARN tienen funciones cnticas de celula madre y la funcion de estos genes tambien es cntica para auto-renovacion y mantenimiento de hESC e iPSC.
Para producir un dispositivo capaz de medir la frecuencia de celulas madre cancerosas en una poblacion celular de un tumor, es deseable optimizar el listado genetico utilizado para identificar celulas madre cancerosas. Como se muestra en la Figura 1B, los inventores han hecho un gran progreso en hacerlo, identificando la telomerasa como un marcador de celula madre cancerosa asf como varios genes ligados al proceso de auto-renovacion. El componente TERT de telomerasa solo se expresa en las celulas del cancer de colon con un fenotipo inmaduro. Ademas, el TERT no esta regulado negativamente eficazmente con diferenciacion de algunas lmeas hESC e iPSC.
Tanto las celulas epiteliales de colon cancerosas y normales se analizan por la expresion de genes ligados con la maduracion de las celulas de las criptas y la auto-renovacion. El listado genetico de auto-renovacion se expande mas alla de TERT para maximizar la confianza de que una celula es una celula madre. Se mide la expresion de genes identificados en el analisis de celulas normales y celulas madre cancerosas. Debido a que las celulas madre cancerosas pueden aparecer potencialmente de o bien una celula madre que ha escapado a las restricciones o a la expansion de celulas progenitoras que han escapado a los mecanismos de recuento que limitan el numero de mitosis a las que se pueden someter, los genes candidatos son los que se expresan en HSC murinas normales, celulas madre de leucemia murina que se derivaron de una celula progenitora, y celulas madre de cancer de mama. Los mejores candidatos de los genes que se identifican en esta lista, todos los cuales se han ligado con el mantenimiento de celulas madre, incluyen BMI1,-IDI, IGFBP3, los miembros de la familia HOX HOXA3, HOXA5, MEIS1, ETS1, ETS2, RUNX2 y STAT3. Los inventores validaran cuales de estos genes estan ligados con la auto- renovacion de celulas madre cancerosas. Para hacer esto, los inventores ensayan sistematicamente los genes candidatos por un papel en la auto-renovacion de celulas madre cancerosas utilizando tecnicas in vitro e in vivo.
La expresion de los genes que regulan la auto-renovacion esta ligada a la expresion de genes espedficos de celulas epiteliales, que incluyen marcadores de maduracion, tales como queratinas y mucinas intestinales. Esto confirmara que una celula en el analisis no es una celula normal contaminante en la biopsia. Las mutaciones de genes supresores de tumores cuya expresion esta regulada negativamente por el gen BMI I de auto-renovacion que capacitan a las celulas progenitoras precoces para que se auto-renueven. Estos genes estan mutados frecuentemente en el cancer de colon, por lo tanto la auto-renovacion de las celulas madre de cancer de colon aparecera tanto de celulas madre normales como de celulas progenitoras de colon tempranas. Ademas, las
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mutaciones oncogenicas alteraran la expresion genetica por las celulas de cancer de colon. Por lo tanto puede haber diferencias en la expresion de al menos algunos genes ligados a la maduracion celular temprana de las criptas entre celulas madre epiteliales de colon normales y su equivalente maligno que haran posible distinguir estas 2 auto- renovaciones de poblaciones celulares entre ellas.
Los inventores identificaron 37 miARN que se expresaban diferencialmente en celulas madre cancerosas y celulas cancerosas no tumorigenicas. Varios grupos de miARN estaban regulados negativamente en celulas madre de tejidos normales pero no en celulas madre cancerosas; ademas, la expresion de algunos miARN, tales como miR- 200c y miR-183 supriirnan el crecimiento de celulas de carcinoma embrionario in vitro, abolfan su capacidad de formar tumores in vivo, e inhidan la clonogenicidad de celulas de cancer de mama in vitro. Se identificaron estos miARN, y los otros grupos, proporcionan una union molecular que conecta la biologfa de las celulas madre de cancer de mama y celulas madre normales. La expresion de estos microARN; que estaban consistentemente regulados positivamente o negativamente en celulas tumorigenicas, se ha probado en celulas unicas de hESC e iPSC no diferenciadas y diferenciadas. Esencialmente, las celulas no diferenciadas se clasifican por marcadores de superficie celular distintas de celulas madre pluripotentes tales como los subtipos Tra y SSEA y se evaluaron por la expresion de miARN, eficacia en placas y parametros de la poblacion in vivo (resultado de ensayos de teratoma en terminos de carcinoma embrionario, carcinoma embrionario mixto/mdice celular diferenciado (% de CE frente a diferenciado), y celulas diferenciadas). Las poblaciones de celulas madre diferenciadas se obtienen por produccion de cuerpos embrioides y se clasifican por medio de seleccion positiva y negativa por marcadores SSENTRA, tras diferenciacion de 28 dfas. Los inventores examinaran celulas unicas en las poblaciones clasificadas por: 1) perfiles de microARN indicativos de celulas madre cancerosas 2) perfil de expresion genetica (posteriormente), y 3) resultado de los ensayos de trasplante/teratoma. Los inventores esperan que las celulas “resistentes a la diferenciacion” en estas poblaciones formaran derivados de carcinoma embrionario maligno y co-expresaran marcadores de celulas diferenciadas y no diferenciadas en celulas unicas.
Ejemplo 7: Perfil de expresion genetica a nivel de celula unica
En poblaciones de celulas pluripotentes, incluso tras la diferenciacion durante 21 dfas, los inventores observaron lmeas que fallan en la regulacion negativa de marcadores clave de tumorigenicidad tales como TERT (vease la Figura 6). Ademas, los inventores han observado que aproximadamente el 50% de las lmeas iPSC fallan en regular negativamente ambos marcadores de pluripotencia exogenos y endogenos, en el estado diferenciado. Esencialmente, esto sugiere una “guerra molecular” entre la diferenciacion y la auto-renovacion que los inventores pueden predecir un resultado de tendencia a la tumorigenesis. Los inventores optimizaran el listado genetico para la identificacion de celulas malignas en cultivos celulares hESC e iPSC por: 1) ensayo de los genes que se sobre- expresan en celulas de CE (carcinoma embrionario) con respecto a hESC e iPSC no diferenciadas, y blastomeros embrionarios humanos, 2) referencia cruzada del listado de los genes para incluir los de Aim 1 (para identificacion de celulas madre cancerosas), y 3) anadir genes de linajes celulares somaticos diferenciados y germinales (los ultimos permanecen como celulas madre pluripotentes resistentes a la diferenciacion). Los inventores utilizaran entonces ensayos con ratones inmunodeficientes para evaluar el potencial tumorigenicos de subpoblaciones que se diagnostican de acuerdo al potencial maligno basado en la expresion genetica basal de celulas unicas.
Analisis CNV. Las variantes cromosomicas estan unidas a la inestabilidad en las poblaciones de celulas madre humanas, observandose frecuentemente perdida y ganancia cromosomica. Sin embargo, unos pocos estudios se dirigen a la estructura mas fina, procedimientos de alto rendimiento para evaluar el numero de copias en multiples loci. Los inventores proponen adaptar su tecnologfa para evaluar un numero CNV amplio del genoma en lmeas de celulas madre pluripotentes derivadas independientemente; los cambios en las CNV reflejaran inestabilidad subcromosomica. Inicialmente, los inventores pueden disenar grupos de sondas espedficas para la adicion a su listado genetico/de loci que reconozcan duplicaciones a lo largo del genoma, incluyendo las observadas previamente en su laboratorio (Figura 6). El SCAD puede acomodar analisis de hasta 1000 marcadores, en su diseno inicial. Los ensayos de CNV estan disponibles en el mercado y se pueden correlacionar con la inestabilidad genomica en hESCsIiPSCs.
Ejemplo 8: Construccion de un dispositivo automatico para identificar y cuantificar celulas madre cancerosas
Se disena un dispositivo automatico para identificar celulas madre cancerosas y calcular su frecuencia en tumores basandose en una combinacion de fenotipo de superficie celular y expresion genetica. Utilizando el analisis optimizado de marcador/genetico descrito en el presente documento, se utiliza una estrategia similar para identificar celulas con potencial de malignidad, que se pasa en la co-expresion de marcadores de las celulas unicas en estado diferenciado y no diferenciado. Este dispositivo fabricara una suspension de celulas unica de cuerpos embrioides o biopsias por puncion de un tumor, aislara las subpoblaciones celulares (epitelial, diferenciada, no diferenciada) y luego hara una qRT-PCR de cientos o miles de celulas unicas y se medira el contenido de celulas madre en un tumor o cultivo celular pluripotente. Tal dispositivo totalmente automatico se eliminaran las etapas de trabajo intenso que se necesitan actualmente para la clasificacion por citometna de flujo de celulas madre cancerosas, y permite una herramienta verdaderamente sin intervencion de cabecera que necesita menos de 100.000 para aislar suficientes celulas cancerosas para los ensayos de PCR para cuantificar celulas madre cancerosas. La operacion automatica, la eficacia y el bajo coste asociado con la tecnologfa de chip de microflmdica haran posible el
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diagnostico genetico rapido, individualizado.
El corazon de este sistema es un clasificador celular de microflmdica. Este dispositivo a^sla celulas vivas (celulas epiteliales o celulas pluripotentes cultivadas o sus productos) a partir de residuos (celulas necroticas y otras partfculas), clasifica las celulas a partir de una solucion de celulas unicas utilizando senales fluorescentes de hasta cinco marcadores de superficie diferentes, y colocarlos en contenedores individuales para estudios geneticos posteriores. Otras etapas corriente arriba tales como la digestion del tumor o el cultivo celular para obtener una suspension celular y la tincion de las celulas con marcadores de superficie fluorescentes se pueden incorporar en este sistema. Como utilizar el sistema para el analisis tumoral se ilustra aqm: una vez que la biopsia se obtiene, el medico fijara los parametros necesarios y la clasificacion y el analisis genetico tal como el numero y tipo de marcadores de superficie, el numero de ciclos de PCR necesarios, etc., y el sistema permitira un rendimiento de clasificacion de al menos 30 celulas/segundo.
Un dispositivo de analisis de celulas unicas (SCAD) puede ser modular (Fig. 7) y llevara a cabo las siguientes etapas de una manera integrada, totalmente automatica: 1) Digestion del tejido: El tejido se coloca en la entrada del dispositivo. Se introducen las enzimas adecuadas en el dispositivo y fluyen para llevar a cabo la digestion de la matriz extracelular con el fin de obtener una suspension celular. 2) Separacion de celulas vivas de los residuos: la suspension contiene tfpicamente celulas vivas con un tamano medio de 10 a 15 micrometres, y el material de desecho con un tamano medio de alrededor de 5 micrometros. La cantidad de material muerto a veces es relativamente alto en comparacion con las celulas vivas, por lo tanto es cntico filtrar el material muerto para el aislamiento eficaz de las celulas. Los inventores consiguen esto haciendo fluir la suspension de tejido digerido a traves de “metamaterial” de microflmdica, que permite la separacion del flujo flmdico de acuerdo con el tamano de las partfculas. 3) Tincion: La suspension de celulas unicas filtrada se tine utilizando marcadores de superficie apropiados en un compartimento diferente del dispositivo de microflmdica. La tincion con hasta cinco marcadores diferentes puede ser util para obtener una poblacion de celulas cancerosas de alta pureza. 4) Clasificacion: La suspension de celulas unicas tenida se hace fluir al siguiente compartimento del dispositivo de microflmdica para clasificar las celulas cancerosas del resto de las celulas. Las estadfsticas de Poisson y las simulaciones Monte Carlo indican que solo se necesitan 2.000-20.000 celulas cancerosas para clasificarse con el fin de que sean capaz de detectar cambios de dos veces en las celulas madre cancerosas, con un nivel de confianza del 99%. Tal pequeno numero de celulas actualmente no se pueden clasificar eficazmente utilizando citometna de flujo, ya que el tamano inicial de muestra necesario para FACS es alrededor de un millon de celulas. Los inventores han conseguido esto utilizando la clasificacion basada en microflmdica por el ciclado de la suspension celular indefinidamente en un ambiente a tension de aire, aislado de pequeno volumen que no desperdiciara celulas.
Clasificador celular de microflmdica basado en el flujo: Se ha demostrado un clasificador celular de microflmdica con un rendimiento de cerca de 50 celulas/segundo, en que las celulas se hacen fluir a alta velocidad a traves de un rayo laser (vease Di Carlo y col. Lab Chip 2006; 6:1445-1449), y la luz dispersada se detecta y se analiza. La electronica mas rapida y el equipo de imagen mas eficaz permiten una mejona del resultado en un orden de magnitud, que bajara el tiempo de clasificacion a menos de diez minutos.
Clasificacion paralela: un clasificador celular se ha desarrollado basando en la captura de las celulas en unas camaras de microflmdica en una matriz densa de 2D que se pueden dirigir individualmente (Figuras 7B y 7C arriba). Las celulas se hacen fluir en una matriz de clasificacion y se capturan en cestas microfabricadas. Tales cestas demostraron previamente que teman mas del 50% de eficacia de captura de celulas unicas en una suspension de flujo libre (Di Carlo y col., supra). Tras llenarse todas las cestas, se cierran las valvulas de microflmdica, y se procesa la matriz por imagen utilizando opticas controladas por computadora, disenadas a medida en los 5 colores fluorescentes necesarios para identificar las celulas tumorigenicas. Este nuevo chip tambien permite imagenes de contraste de fase, que puede ser util para estudiar la morfologfa celular. Las celulas tumorigenicas identificadas se hacen fluir en el siguiente modulo para la lisis, mientras que el resto de celulas se hacen fluir fuera del chip. Este nuevo clasificador celular trabaja con un numero de celulas inicial extremadamente pequeno, ya que las celulas se pueden ciclar muchas veces y por lo tanto no se desperdician. La tecnologfa de chip de microflmdica actual permite colocar cerca de 10.000 de estos elementos en un area de 3x3 cm, que se puede interrogar rapidamente (tiro unico) utilizando aparatos de imagen del estado de la tecnica, tal como el que se usa en el sistema Fluidigm Biomark. Este clasificador celular tendra un rendimiento de cerca de 30 celulas/segundo. Una ventaja de utilizar un dispositivo de clasificacion paralelo como opuesto al clasificador celular basado en el flujo es que la trata la imagen durante la clasificacion y se puede llevar a cabo la PCR por el mismo procesador de imagenes, permitiendo de esta manera relacionar los datos de fluorescencia y de morfologfa con los datos geneticos de celulas individuales.
Lisis celular y captura de ARNm: Las celulas madre cancerosas clasificadas se hacen fluir al proximo modulo para la lisis en camaras individuales. El ARNm se puede capturar en una columna de perlas oligo-dT, transcribirse inversamente en las perlas como ya se ha demostrado (Marcus y col. Anal Chem 2006; 78:3084-3089) y se procesa en el chip por medio de un nuevo protocolo de secuenciacion genetica desarrollado por Heliscope, o se puede transferir a un pocillo macroscopico (en el intervalo de microlitros) y se mezcla con: reactivos para pre-amplificar un grupo de genes seguido por los protocolos actuales. Las muestras preamplificadas se transfieren a un modulo similar al chip de matriz Fluidigm Dynamic para la qRT-PCR y la determinacion del contenido real de celulas madre cancerosas.
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Basandose en el analisis de celulas madre de sangre y mama normal asf como de celulas madre de cancer de colon, cabeza y cuello y mama, los inventores han identificado un nuevo ensayo de celulas unicas que por primera vez hace posible identificar precisa e inequvocamente y contar celulas madre cancerosas en espedmenes de biopsia y poblaciones de celulas madre pluripotentes cultivadas. Como una prueba del principio, los inventores aplicaron este ensayo a un analisis de celulas unicas de cancer de colon. Para hacerlo, los inventores utilizaron FACS para clasificar celulas de cancer de colon del linaje CD66+CD44 de xenoinjertos de pasajes precoces establecidos a partir de 2 pacientes diferentes. Estos marcadores permiten un enriquecimiento de aproximadamente 3-5 veces de celulas madre de cancer de colon (CoCSC) en un tumor. Los inventores sospechaban que las celulas cancerosas aisladas con estos marcadores estaban solo parcialmente enriquecidas para CoCSC. Los analisis de expresion genetica de celulas unicas y los estudios de tumorigenicidad posteriores demuestran que ademas las celulas del linaje CD66+CD44+ son una mezcla de CoCSC y celulas no tumorigenicas y que este ensayo se puede utilizar para identificar mas precisamente la frecuencia de CoCSC en un especimen de biopsia. El analisis de celula unica revela una estructura de desarrollo jerarquico de celulas de cancer de colon que es reminiscencia de una cripta del colon normal. Notablemente, los inventores encontraron que las celulas mas inmaduras del tumor de colon expresan TERT, un componente del complejo de telomerasa que es cntica para el mantenimiento a largo plazo del tumor. La expresion de LGR5, que marca las celulas madre de colon normal, tambien se limita a celulas inmaduras. Por el contrario, los genes que se expresan por celulas de las criptas del colon que incluyen MUC2,'CK20, CA-2, y especialmente CD66a se expresa por celulas que no co-expresan marcadores de celula inmadura, mas notablemente TERT. Esto sugiere que estas celulas, como las celulas de las criptas epiteliales maduras normales, tienen limitaciones en su capacidad para someterse a mitosis extensivas. Ademas, los inventores han trasplantado celulas de cancer de colon CD66a+ (celulas de cancer de colon diferenciadas) y CD66a"' en ratones inmunodeficientes. Las celulas CD66a' formaban tumores (5 de 6 inyecciones) mientras que las celulas CD66+ no (0 de 5 inyecciones). De manera similar, en 2 tumores de cancer de mama humano que se ensayaron las celulas CD66ew se enriquecieron en cuanto a celulas madre cancerosas cuando se ensayaron en modelo de raton inmunodeficiente. Estos resultados demuestran que los analisis de expresion genetica de celula unica hacen posible la identificacion y cuantificacion de celulas madre cancerosas en biopsias y cultivos.
Ejemplo 9: Una marca de expresion genetica compartida por celulas madre normales y celulas madre cancerosas, tanto en sangre como en tejidos epiteliales mamarios.
Se ha vuelto evidente en anos recientes que las celulas madre cancerosas pueden aparecer en diferentes compartimentos celulares. Algunas probablemente aparecen de una celula madre mutante que ha perdido las restricciones: expansion del grupo de celulas madre. Otras aparecen de una celula progenitora temprana mas diferenciada que ha perdido el mecanismo de recuento que restringe normalmente el numero de mitosis que pueden experimentar. Por supuesto, muchos de los marcadores de celulas madre de leucemia o cancer que aparecen de una celula madre o una celula progenitora son diferentes. Independientemente del origen de la celula, sin embargo, las celulas madre mantendran la capacidad de auto-renovarse. los inventores razonan que es probable que algunas rutas que regulan la auto-renovacion en celulas madre cancerosas aparecen del compartimento de celulas madre o una progenie parcialmente diferenciada se comparten entre ellas y con HSC normales. Para ensayar esta hipotesis, los inventores analizaron si los genes expresados por HSC de raton normales y celulas madre de leucemia murina que aparecen de celulas progenitoras (es decir poblaciones auto-renovadas) pero no celulas progenitoras normales (es decir poblacion no de auto-renovacion) se expresan tambien en celulas madre de cancer de mama humano pero no sus equivalentes no tumorigenicos. Sorprendentemente, las celulas madre cancerosas humanas, pero no sus equivalentes no tumorigenicos, sobre expresan estos genes (Fig. 8). Los inventores han generado tambien dos listados geneticos distintos para identificar otros candidatos potenciales: i) genes que se expresan por celulas madre del cancer de mama y celulas madre de mama normales, pero no por celulas cancerosas no tumorigenicas o celulas progenitoras epiteliales de mama maduras, ii) genes que se expresan por HSC humanas normales y celulas madre del cancer de mama humano pero no celulas progenitoras de sangre humana o celulas de mama no tumorigenicas.
Muchos de estos genes se han ligado a auto-renovacion y cancer. Estos incluyen la pareja de union al factor de crecimiento insulmico IGFBP3, los miembros de la familia HOX HOXA3, HOXA5, ME1S1 asf como factores de transcripcion como ETS1, ETS2, RUNX2 y STAT3. Se ensayo si el factor de transcripcion STAT3 es un regulador de celula madre cancerosa fiable. El STAT3 tiene un papel en el mantenimiento de celulas ES y HSC. Los analisis genomicos de celulas madre de cancer de mama tanto de raton como humano revelo que muchas transcripciones STAT3 estaban sobre-expresadas por las celulas madre cancerosas. Luego, cuando los inventores examinaron los analisis inmunoqmmicos de tumores de mama las celulas positivas a STAT3 tienen a concentrarse el extremo invasivo del cancer y la protema no se vefa en las celulas que paredan mas diferenciadas en las partes interiores del tumor. Finalmente, hay inhibidores de molecula pequena de STAT3. Tales inhibidores se pueden ensayar en modelos de celulas madre. Se ensayo el efecto del inhibidor STAT3 cucurbitacina sobre la capacidad clonogenica de las celulas madre de cancer de mama murino. Una exposicion corta, de 24 horas al inhibidor reduda el numero de colonias en ~ 50% (p < 0,02, t test). Estos resultados sugieren que el STAT3 tiene un papel cntico en al menos algunas celulas madre del cancer de mama.
Un segundo gen de interes es MEIS1. El MEIS1 se expresaba preferentemente en las celulas de sangre normales y madre de mama, celulas madre de leucemia, y celulas madre del cancer de mama. Los estudios geneticos han demostrado que la expresion de MEIS1 se necesita total mente para la auto-renovacion y mantenimiento tanto de
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celulas madre normales de sangre como de sus equivalentes leucemicos. El MEIS1 puede regular la renovacion celular de celulas madre del cancer de mama.
Candidates de genes particularmente interesantes que se expresan por celulas madre cancerosas y normales incluyen CAV1, GAS1, MAP4K4 (cinasa) MYLK (cinasa), PTK2 (cinasa), DAPK1 (cinasa), LATS (cinasa), FOSL2, AKT3 (cinasa), PTPRC (tirosina fosfatasa), MAFF (oncogen), RrAs2 (relacionado con RAS), NFKB, ROBOl, IL6ST (activa STAT3), CR1M1, PLS3, SOX2, CXCL14, ETS1, ETS2, MEIS1 y STAT3, asf como CD47. Los genes candidatos interesantes que se sobre-expresan por las celulas madre cancerosas pero no celulas madre normales incluyen RGS4, CAV2, MAF (oncogen) WT1 (oncogen), SNAI2, FGFR2, MEIS2, 101,103, ID4 y FOXC1.
Ejemplo 10: Analisis del transcriptoma completo de celulas madre hematopoyeticas
En este ejemplo, los inventores buscaban el uso del analisis del transcriptoma de celulas madre hematopoyeticas. Un resumen general de esta realizacion se muestra en la Figura 9. En el presente ejemplo se afsla una poblacion de celulas sospechosas de comprender celulas madre hematopoyeticas a partir de un sujeto de ensayo. Las celulas se preparan entonces por analisis FACS exponiendo la poblacion celular a anticuerpos fluorescentes para marcadores madres hematopoyeticos conocidos (por ejemplo, CD34, Thy1, etc.). Las celulas se clasifican en placas de 96 pocillos, tal que cada pocillo contiene no mas que una unica celula.
Las celulas unicas aisladas se lisan y los lisados se dividen en dos partes. La primera parte se somete a analisis de expresion genetica de celula unica por PCR en tiempo real, esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, utilizando una seleccion de genes que permiten distinguir entre HSC y no HSC, por el nivel o presencia de expresion (por ejemplo, CD34+, CD19-, CD17-). Tras identificar las HSC en los lisados de la poblacion de las celulas unicas identificadas como que eran HSC se agrupan. Se crea una biblioteca de ADNc amplificando el ARNm total utilizando procedimientos convencionales. El ADNc se secuencia entonces utilizando entonces utilizando un procedimiento de “proxima generacion” tal como cualquiera de los que se describen en el presente documento. El transcriptoma secuenciado se analiza entonces para determinar si estan presentes genes unicos y marcadores de superficie.
Siguiendo la identificacion de un marcador de superficie unico para HSC, se preparan anticuerpos que se unen espedficamente a los marcadores de superficie por tecnicas disponibles en el comercio. La especificidad y eficacia de los anticuerpos se confirman (por ejemplo, uniendose a protemas aisladas y/o recombinantes). Los anticuerpos entonces se marcan con un resto fluorescente. Se puede llevar a cabo entonces el analisis y/o clasificacion por FACS sobre otras poblaciones de celulas (por ejemplo, del mismo o sujetos diferentes) que utilizan los anticuerpos para los antfgenos de superficie recien descubiertos.
Ejemplo 11. Analisis de agentes terapeuticos
En este ejemplo, se lleva a cabo la seleccion de agentes terapeuticos candidatos. Las celulas diana, por ejemplo, celulas madre del cancer de colon y celulas de cancer de colon (diferenciadas) se afslan y analizan a nivel de celula unica como se ha descrito anteriormente. Las celulas diana se separan de un especimen de biopsia utilizando marcadores espedficos de celulas diana (por ejemplo, separacion por FACS utilizando anticuerpos espedficos de celulas diana y/o marcado fluorescente de acidos nucleicos espedficos de celulas diana) identificados previamente.
Las celulas diana se separan en posiciones dirigibles que comprenden una unica celula. Las celulas aisladas entonces se exponen a una biblioteca de agentes terapeuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, anticuerpos conjugados a toxinas, moleculas pequenas). Las celulas se recolectan entonces y se analizan en cuanto a los patrones de expresion genetica y/o viabilidad celular. Los agentes terapeuticos candidatos satisfactorios pueden ser los que se dirigen a las celulas para su muerte. De manera alternativa, los agentes terapeuticos candidatos pueden alterar la expresion de genes conocidos por estar mal reglados (por ejemplo regulados positiva o negativamente) en comparacion con los patrones de expresion de celulas en estado de no enfermedad. La exposicion de una celula diana a un agente terapeutico candidato puede dar como resultado la alteracion del patron(es) de expresion de acido nucleico que se parecen mas estrechamente a los patrones de celulas normales (es decir en estado de no enfermedad). Los agentes terapeuticos candidatos que muestran la promesa de eliminar o alterar las celulas diana se exponen entonces a las celulas normales para determinar su uso potencial como agente terapeutico (por ejemplo, si el agente candidato elimina celulas diana y celulas normales, se puede excluir como un agente posiblemente util).

Claims (12)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de identificacion de diferentes poblaciones celulares en una muestra celular heterogenea que se toma de un tumor solido heterogeneo, que comprende:
    separar las celulas individuals de dicha muestra celular en localizaciones separadas de un dispositivo de clasificacion celular microflmdico;
    identificar ciertas celulas separadas individualmente en las localizaciones separadas utilizando uno o mas marcadores de superficie;
    clasificar las ciertas celulas separadas individualmente de las localizaciones separadas utilizando el dispositivo de clasificacion celular microflmdico;
    llevar a cabo el analisis del transcriptoma sobre una pluralidad de genes de las celulas recolectadas individualmente de las localizaciones separadas; y
    llevar a cabo el analisis del agrupamiento para identificar las poblaciones celulares diferentes.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dichas celulas individuales no estan enriquecidas antes de dicha separacion.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma se lleva a cabo al menos en 1000 celulas individuales en paralelo.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma se lleva a cabo utilizando el analisis de acido nucleico.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dichas localizaciones separadas estan en una micromatriz.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma comprende el analisis del ARN que se expresa, el ARN que no se expresa, o ambos.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma es un analisis del transcriptoma completo.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma comprende la amplificacion del ARN utilizando un grupo de al menos cinco pares de cebadores.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que dichos pares de cebadores no son cebadores anidados.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho analisis del transcriptoma se lleva a cabo simultanea o sustancialmente en tiempo real en todas o en un subgrupo de dichas celulas individuales.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha una o mas poblaciones celulares son celulas madre no cancerosas, celulas progenitoras no cancerosas, celulas maduras no cancerosas, celulas inflamatorias, celulas cancerosas, celulas madre cancerosas o celulas madre no tumorigenicas.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la utilizacion de dichas poblaciones celulares diferentes para diagnosticar un sujeto con cancer o un estadio de cancer.
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