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ES2559670T3 - Agentes citotóxicos mejorados que comprenden nuevos maitansinoides - Google Patents

Agentes citotóxicos mejorados que comprenden nuevos maitansinoides Download PDF

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ES2559670T3
ES2559670T3 ES04750945.0T ES04750945T ES2559670T3 ES 2559670 T3 ES2559670 T3 ES 2559670T3 ES 04750945 T ES04750945 T ES 04750945T ES 2559670 T3 ES2559670 T3 ES 2559670T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
compound
methyl
methyldithio
alanine
maitansinoid
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES04750945.0T
Other languages
English (en)
Inventor
Wayne C. Widdison
Ravi V. J. Chari
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunogen Inc
Original Assignee
Immunogen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
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Application filed by Immunogen Inc filed Critical Immunogen Inc
Application granted granted Critical
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Abstract

compuesto de fórmula 4: **Fórmula** en donde Y es (CH2)2CR1R2SZ, en donde: R1 es metilo y R2 es H o R1 y R2 son metilo; y Z es H o -SCH3.

Description

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DESCRIPCION
Agentes citotoxicos mejorados que comprenden nuevos maitansinoides
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional n° 60/471.739, presentada el 20 de mayo, 2003.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para preparar conjugados citotoxicos mejorados que comprenden maitansinoides y agentes de union a celulas. Estos conjugados tienen uso terapeutico cuando son suministrados a una poblacion celular especlfica de una forma dirigida. La presente invencion se refiere tambien a un metodo para preparar maitansinoides que tienen un resto tiol, que se pueden usar en la preparacion de conjugados citotoxicos. La presente invencion se refiere ademas a nuevos maitansinoides y a nuevos compuestos intermedios en la slntesis de los nuevos maitansinoides.
Antecedentes de la invencion
Han aparecido muchos informes sobre los intentos de localizacion especlfica de celulas tumorales con conjugados de anticuerpo monoclonal-farmaco (Sela et al. in Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al, en Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol et al, en Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). Farmacos citotoxicos tales como el metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, y clorambucilo, se han conjugado con una variedad de anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moleculas de farmaco se unieron a moleculas de anticuerpo mediante una molecula vehlculo intermedia tal como albumina de suero (Garnett et al. Cancer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa et al. Cancer Immunol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo et al. Cancer Res. 47:1076-1080 (1980)), dextrano (Hurwitz et al. Appl. Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi et al. Biochem. Pharmacol. 34:289-291 (1985); Dillman et al. Cancer Res. 46:4886-4891 (1986); Shoval et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8276-8280 (1988)), o acido poliglutamico (Tsukada et al. J. Natl. Canc. Inst. 73:721-729 (1984); Kato et al. J. Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada et al. Br. J. Cancer 52:111-116 (1985)).
Se ha usado una gran variedad de tecnologlas de conectores para preparar dichos inmunoconjugados, y se han investigado conectores tanto escindibles como no escindibles. En la mayorla de los casos, el potencial citotoxico completo de los farmacos solo podia verse, sin embargo, si las moleculas de farmaco podlan ser liberadas de los conjugados en forma sin modificar en el sitio diana.
Uno de los conectores escindibles que se ha usado para preparar conjugados de anticuerpo-farmaco es un conector labil frente a acidos basado en el acido cis-aconltico que aprovecha el entorno acido de diferentes compartimentos intracelulares tales como los endosomas encontrados durante la endocitosis mediada por receptor y los lisosomas. Shen y Ryser introdujeron este metodo para preparar conjugados de daunorubicina con vehlculos macromoleculares (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld usaron la misma teconologla para conjugar daunorubicina a un anticuerpo antimelanoma (J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). Recientemente, Dillman et al. tambien usaron un conector labil frente a acidos de una forma similar para preparar conjugados de daunorubicina con un anticuerpo anti-linfocitos T (Cancer Res. 48:6097-6102 (1988)).
Un procedimiento alternativo, explorado por Trouet et al. implicaba unir daunorubicina a un anticuerpo mediante un brazo espaciador peptldico (Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629 (1982)). Esto se hizo bajo la premisa de que el farmaco libre podrla liberarse de dicho conjugado por accion de peptidasas lisosomicas.
Sin embargo, los ensayos citotoxicos in vitro han puesto de manifiesto que los conjugados de anticuerpo-farmaco raramente logran la misma potencia citotoxica que los farmacos no conjugados libres. Esto sugerla que los mecanismos mediante los cuales las moleculas de farmaco son liberadas de los anticuerpos son muy ineficaces. En el campo de las inmunotoxinas, se mostro que los conjugados formados por puentes disulfuro entre anticuerpos monoclonales y toxinas protelnas catallticamente activas, eran mas citotoxicos que los conjugados que contenlan otros conectores. Vease, Lambert et al. J. Biol. Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert et al. en Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al. Cancer Res. 48:2610-2617 (1988). Esto se atribuyo a la alta concentracion intracelular de glutation que contribula a la escision eficaz del enlace disulfuro entre una molecula de anticuerpo y una toxina. A pesar de esto, solo hay unos pocos ejemplos descritos del uso de enlaces disulfuro para la preparacion de conjugados entre farmacos y macromoleculas. Shen et al. describieron la conversion del metotrexato en un derivado de mercaptoetilamida, seguido de conjugacion con poli-D-lisina mediante un enlace disulfuro (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985)). Ademas, unos pocos informes describlan la preparacion de conjugados del farmaco toxico clicheamicina que contiene trisulfuro con anticuerpo (Hinman et al, 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993), Hamann et al., Bioconjugate Chem. 13, 40-46 (2002), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 47-58 (2002)).
Una razon para la falta de conjugados de anticuerpo-farmaco unidos por disulfuro es la falta de disponibilidad de farmacos citotoxicos que lleven un resto que contenga atomo de azufre, que se pueda usar facilmente para unir el
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farmaco a un anticuerpo por un enlace disulfuro. Ademas, la modificacion qulmica de farmacos existentes es diflcil sin disminuir su potencial citotoxico.
Los maitansinoides son farmacos altamente toxicos. La maitansina fue aislada por primera vez por Kupchan et al. del arbusto del este de Africa Maytenus serrataand y se mostro que era de 100 a 1000 veces mas citotoxica que los agentes quimioterapeuticos del cancer convencionales tales como el metotrexato, daunorubicina, y vincristina (patente de EE.UU. n° 3.896.111). Posteriormente se descubrio que algunos microbios tambien producen maitansinoides, tales como maitansinol y esteres en C-3 del maitansinol (patente de EE.UU. n° 4.151.042). Tambien se han descrito esteres en C-3 sinteticos del maitansinol y analogos del maitansinol (Kupchan et al. J. Med. Chem. 21:31-37 (1978); Higashide et al. Nature 270:721-722 (1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984)). Los ejemplos de analogos del maitansinol a partir de los cuales se han preparado esteres en C-3 incluyen maitansinol con modificaciones en el anillo aromatico (p. ej., descloro) o en C-9, C-14 (p. ej., grupo metilo hidroxilado), C-15, C-18, C-20 y C-4,5.
Los esteres en C-3 del maitansinol naturales y sinteticos se pueden clasificar en dos grupos:
(a) esteres en C-3 con acidos carboxllicos simples (patentes de EE.UU. n° 4.248.870; 4.265.814; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.317.821; 4.322.348; y 4.331.598), y
(b) esteres en C-3 con derivados de N-metil-L-alanina (patentes de EE.UU. n° 4.137.230; 4.260.608; 5.208.020; y Chem. Pharm. Bull. 12:3441 (1984)).
Se encontro que los esteres del grupo (b) eran mucho mas citotoxicos que los esteres del grupo (a).
La maitansina es un inhibidor mitotico. Se ha descrito que el tratamiento de celulas L1210 in vivo con maitansina produce mitosis en 67% de las celulas que se acumulan. Se describio que las celulas de control no tratadas demostraban un Indice mitotico en el intervalo de entre 3,2 a 5,8% (Sieber et al. 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)). Los experimentos con huevos de erizo de mar y huevos de almeja, han sugerido que la maitansina inhibe la mitosis por interferencia con la formacion de microtubulos a traves de la inhibicion de la polimerizacion de la protelna de microtubulo, tubulina (Remillard et al. Science 189:1002-1005 (1975)).
Se ha encontrado que in vitro, las suspensiones de celulas de leucemia murina P388, L1210, y LY5178 eran inhibidas por la maitansina en dosis de 10'3 a 10'1 pg/pl, siendo la llnea celular P388 la mas sensible. Tambien se ha mostrado que la maitansina es un inhibidor activo del crecimiento in vitro de las celulas de carcinoma nasofarlngeo humano, y se describio que la llnea de leucemia linfoblastica aguda humana CEM era inhibida en concentraciones tan bajas como 10'7 mg/ml (Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975)).
Se ha mostrado que la maitansina in vivo tambien es activa. Se mostro que el crecimiento tumoral en el sistema de leucemia linfocltica P388 era inhibida a lo largo de un intervalo de dosis de 50 a 100 veces, lo que sugerla un Indice terapeutico alto; tambien se podia demostrar actividad inhibidora significativa con el sistema de leucemia de raton L1210, el sistema de carcinoma de pulmon de Lewis humano y el sistema de melanocarcinoma B-16 humano (Kupchan, Ped. Proc. 33:2288-2295 (1974)). Los maitansinoides usados en conjugados con agentes de union a celulas se describen en las patentes de EE.UU. n° 5.208.020 y 5.416.064 y en Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131 (1992) y Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 8618-8623 (1996). En estos conjugados, el agente de union a celulas esta unido al maitansinoide DM1 [N2-desacetil-N-2(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, 1, numero CAS: 139504-500, FIG. 1]
En las patentes anteriores, los farmacos maitansinoides que llevan cadenas laterales de N-metil-L-alanina acetilada tiene la formula 2a,b:
imagen1
En la formula 2a, 1 representa un numero entero de 1 a 10. Por lo tanto, los maitansinoides de formula 2a tienen el atomo de azufre conectado a un grupo metileno no sustituido (-CH2-S-). Se dice que un grupo sulfhidrilo en dicho
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compuesto maitansinoide o un grupo disulfuro en un conjugado de agente de union a celulas-maitansinoide unido por disulfuro con dicho maitansinoide no esta "impedido" puesto que no hay sustituyentes voluminosos en el carbono a al lado del grupo sulfhidrilo o disulfuro, que produzcan impedimento esterico. En la formula 2b, m representa 0, 1, 2 o 3. Por lo tanto, los maitansinoides de la formula 2b tambien tienen el atomo de azufre conectado a un grupo metileno no sustituido, excepto en el caso donde m = 0, y R2 = CH3 o CH2CH3. Si m = 0, entonces el maitansinoide lleva un sustituyente en el carbono que lleva el grupo funcional tiol o un grupo funcional disulfuro despues de conjugacion con un agente de union a celulas mediante un enlace disulfuro. Sin embargo, debido a que en este caso el atomo de azufre esta en posicion p respecto a un grupo carbonilo, se encuentra que estos maitansinoides y conjugados de dichos maitansinoides con agentes de union a celulas mediante un enlace disulfuro, son inestables debido a su tendencia a sufrir una eliminacion p.
Compendio de la invencion
La presente invencion se basa en el descubrimiento inesperado de que la union de maitansinoides, que llevan un grupo tiol con impedimento esterico (que tienen uno o dos sustituyentes en el carbono a que lleva el grupo funcional tiol), con agentes de union a celulas, da conjugados que tienen actividad antitumoral ampliamente mejorada in vivo comparado con los conjugados preparados con los maitansinoides previamente descritos que no tienen un sustituyente en el atomo de carbono a que lleva el enlace disulfuro. Otro descubrimiento inesperado era que se obtiene actividad biologica mejorada cuando el impedimento esterico esta de forma optima en el lado del maitansinoide del enlace disulfuro en los conjugados. Ademas, el grupo acilo de la cadena lateral del aminoacido acilado del maitansinoide que lleva el grupo sulfhidrilo tiene que tener una longitud de cadena lineal de al menos tres atomos de carbono entre el grupo carbonilo de la amida y el atomo de azufre.
Estos descubrimientos muestran que los conjugados de agente de union a celulas-maitansinoide unidos por disulfuro, se pueden construir de forma que dichas sustituciones en los dos atomos de carbono a que llevan el enlace disulfuro pueden conducir a diferentes grados de impedimento esterico en cualquiera de los lados del enlace disulfuro.
Por consiguiente, la presente invencion describe la slntesis de nuevos maitansinoides que contienen disulfuro y tiol con impedimento esterico, que llevan uno o dos sustituyentes alquilo en el atomo de carbono a que lleva el atomo de azufre. Ademas, el grupo acilo de la cadena lateral del aminoacido acilado tiene una longitud de cadena lineal de al menos tres atomos de carbono entre el grupo carbonilo de la amida y el atomo de azufre
Tambien se describe la preparacion y evaluacion biologica de los conjugados de agente de union a celulas de estos nuevos maitansinoides.
En una realizacion de la invencion, se describen nuevos maitansinoides que contienen tiol y disulfuro que llevan una sustitucion de mono o di-alquilo en el atomo de carbono que lleva el atomo de azufre.
En una segunda realizacion, la presente invencion describe metodos para la slntesis de estos nuevos maitansinoides.
En una tercera realizacion, se describen metodos para la union de estos nuevos maitansinoides a los agentes que se unen a celulas. Estos conjugados son utiles como agentes terapeuticos, que son suministrados especlficamente en las celulas diana y son citotoxicos. Estos conjugados presentan eficacia terapeuticamente ampliamente mejorada en modelos de tumores animales comparado con los agentes previamente descritos.
Mas especlficamente, la presente invencion proporciona:
Un compuesto representado por la formula 4:
imagen2
en donde:
Y es como se define en la reivindicacion 1.
El compuesto de formula 4, en donde R1 es metilo; R2 es H; y Z es H;
El compuesto de formula 4, en donde R1 y R2 son metilo; y Z es H;
El compuesto de formula 4, en donde Ri es metilo, R2 es H, y Z es -SCH3;
5 El compuesto de formula 4, en donde Ri y R2 son metilo, y Z es -SCH3;
Un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas que comprende al menos un maitansinoide unido al agente de union a celulas, en donde el maitansinoide es cualquiera de los compuestos descritos antes;
Cualquiera de los conjugados de maitansinoide-agente de union a celulas descritos antes, en donde el agente de union a celulas comprende al menos un sitio de union de un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo MY9 10 humanizado o recubierto, anti-B4 humanizado o recubierto, o C242 humanizado o recubierto;
Una composition farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de cualquiera de los conjugados de
maitansinoide-agente de union a celulas descritos antes, una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables,
y un vehlculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable;
Un metodo de esterification de maitansinol para dar un maitansinoide de formula 42:
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comprendiendo dicho metodo hacer reaccionar el maitansinol de la estructura 11:
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en donde:
Y2 es como se define en la reivindicacion 9.
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar el maitansinoide de formula 4a, en donde el compuesto de formula (III) se representa por la formula (III-L);
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4a, en donde dicho compuesto de formula (III-L) es el compuesto 15a(S,S), 15b(S,R) o una mezcla de 15a(S,S) y 15b(S,R);
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4a, en donde dicho compuesto de formula (III-D,L) es la N-metilalanina acilada con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S para dar los compuestos de estructura 15;
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4a, en donde la mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R) se hace por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida 14;
(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metil-L-alanina para dar la mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R);
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol, en donde dicho compuesto 15a(S,S) se hace por un metodo que comprende:
(1) convertir el (R)-1,3-butanodiol en acido (S)-4-(metilditio)pentanoico 19;
(2) convertir el compuesto 19 en su ester de N-hidroxisuccinimida (20); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 20 con N-metil-L-alanina para dar el compuesto 15a(S,S).
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol, en donde dicho compuesto 15b(S,R) se hace por un metodo que comprende:
(1) convertir el (S)-1,3-butanodiol en acido (R)-4-(metilditio)pentanoico 24;
(2) convertir el compuesto 24 en su ester de N-hidroxisuccinimida (25); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 25 con N-metil-L-alanina para dar el compuesto 15b(S,R);
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4a, en donde la N- metilalanina acilada racemica, con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar los compuestos de estructura 15, se hace por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida 14;
(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metilalanina racemica para dar la N-metilalanina acilada racemica con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S para dar los compuestos de estructura 15.
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4b, en donde dicho compuesto de formula (III-L) es el compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina;
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4b, en donde dicho compuesto de formula (III-D,L) es el compuesto 10 que contiene N-metilalanina racemica;
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol para dar maitansinoides de formula 4b, en donde el compuesto 10 contiene N-metil-L-alanina o la N-metilalanina racemica, se hace por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar sulfuro de isobutileno (5) con el anion de acetonitrilo para dar el compuesto 6;
(2) hidrolizar el compuesto 6 para dar el acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (7);
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(3) convertir el compuesto 7 en el disulfuro 8 por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo;
(4) convertir el compuesto 8 en su ester de N-hidroxisuccinimida 9; y
(5) hacer reaccionar el compuesto 9 con N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica para dar el compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica;
El metodo descrito antes de esterificacion del maitansinol con el compuesto 10 seguido de separacion de los diastereoisomeros, si estan presentes, y purification del maitansinoide por HPLC en sllice ciano-boridada, que ademas comprende la reduction del enlace disulfuro, para dar maitansinoides de formula 4b;
Un metodo para hacer un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas que comprende hacer un maitansinoide purificado mediante cualquiera de los metodos de esterificacion del maitansinol descritos antes para dar maitansinoides de formula 4b, y hacer reaccionar el maitansinoide con un agente de union a celulas que comprende un grupo ditio reactivo, preferiblemente un grupo ditiopiridilo o un grupo ditiopiridilo sustituido;
Compuestos de formula (III):
imagen6
como se define en la revindication 9.
Compuestos 10 (S) o racemico 10;
Un metodo para hacer el compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica, que comprende:
(1) hacer reaccionar sulfuro de isobutileno (5) con el anion de acetonitrilo para dar el compuesto 6;
(2) hidrolizar el compuesto 6 para dar el acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (7);
(3) convertir el compuesto 7 en el disulfuro 8 por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo;
(4) convertir el compuesto 8 en su ester de N-hidroxisuccinimida 9; y
(5) hacer reaccionar el compuesto 9 con N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica para dar dicho compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica;
Una mezcla de los compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R);
Un metodo para hacer una mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R), que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida (14); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metil-L-alanina para dar dicha mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R);
La N-metilalanina acilada racemica con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar compuestos de la estructura 15.
Un metodo para hacer la N-metilalanina acilada racemica con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar compuestos de la estructura 15, que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida 14;
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(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metilalanina racemica para dar la N-metilalanina acilada racemica con un grupo carboxilico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S para dar los compuestos de estructura 15.
Compuesto 15a(S,S);
Compuesto 15b(S,R);
Un metodo para hacer el compuesto 15a(S,S) que comprende:
(1) convertir el (R)-1,3-butanodiol en acido (S)-4-(metilditio)pentanoico 19;
(2) convertir el compuesto 19 en su ester de N-hidroxisuccinimida (20); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 20 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15a(S,S);
Un metodo para hacer el compuesto 15b(S,R) que comprende:
(1) convertir el (S)-1,3-butanodiol en acido (R)-4-(metilditio)pentanoico 24;
(2) convertir el compuesto 24 en su ester de N-hidroxisuccinimida (25); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 25 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15b(S,R);
Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de cualquiera de los conjugados de compuestos maitansinoides descritos antes, una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, y un vehiculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable;
La composicion farmaceutica descrita antes que comprende un compuesto maitansinoide, que ademas comprende un anticuerpo.
Un metodo para inducir la muerte celular en poblaciones de celulas seleccionadas in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto celulas diana o tejido que contiene las celulas diana, con una cantidad eficaz de cualquiera de los maitansinoides-agentes de union a celulas descritos antes, sus sales o solvatos.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 muestra las estructuras de maitansinoides descritos previamente.
La figura 2 muestra las estructuras de algunos de los maitansinoides de la presente invencion.
Las figuras 3a-d muestran esquemas para la sintesis de maitansinoides representativos de la presente invencion.
Las figuras 4a,b son graficas que muestran la potencia in vitro de nuevos maitansinoides de la presente invencion.
Las figuras 4c,d son graficas que comparan la potencia in vitro de nuevos maitansinoides de la presente invencion con los descritos previamente.
Las figuras 5a-d muestran esquemas para preparar conjugados de agentes de union a celulas con maitansinoides de la presente invencion.
La figura 6 es una grafica que muestra la potencia in vitro de conjugados de agente de union a celulas-maitansinoide de la presente invencion.
La figura 7 es una grafica que compara la eficacia antitumoral in vivo de huC242-maitansinoides de la presente invencion con conjugados de huC42 de maitansinoides previamente descritos, contra xenoinjertos de tumor de colon humano HT-29.
La figura 8 es una grafica que compara la eficacia antitumoral in vivo de huC242-maitansinoides de la presente invencion con conjugados de huC242 de maitansinoides previamente descritos, contra xenoinjertos de tumor de colon humano CoLo 205.
La figura 9 es una grafica que compara la eficacia antitumoral in vivo de MY9-6-maitansinoides de la presente invencion con conjugados de MY9-6 de maitansinoides previamente descritos, contra xenoinjertos de leucemia mieloide promielocitica HL60.
La figura 10 muestra el resultado de la evaluacion de citotoxicidad in vitro del conjugado huMy9-6-DM4 con celulas diana HL-60 y celulas Namalwa no diana.
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La figura 11 muestra la evaluacion de eficacia in vivo del conjugado huMy9-6-DM4 contra tumores de xenoinjerto humano HL-60 en ratones SCID y la compara con la de un conjugado huMy9-6 de un maitansinoide previamente descrito (huMy9-6-DMI).
La figura 12 muestra el resultado de la evaluacion de citotoxicidad in vitro del conjugado huB4-DM4 con celulas diana Ramos y celulas Colo 205 no diana.
La figura 13a muestra la evaluacion de eficacia in vivo del conjugado huB4-DM4 contra tumores de xenoinjerto Ramos humanos en ratones SCID, y la figura 13b muestra los cambios en los pesos corporales de los animales durante el periodo de ensayo.
Descripcion detallada de la invencion
Esta invencion describe nuevos maitansinoides que contienen disulfuro y tiol con impedimento esterico, en los que el atomo de carbono a que lleva el atomo de azufre lleva uno o dos sustituyentes alquilo. La invencion tambien describe un procedimiento para la slntesis de estos nuevos maitansinoides. Se describen ademas nuevos compuestos que son utiles como compuestos intermedios en la slntesis de nuevos maitansinoides. Ademas, esta invencion describe la preparation de conjugados de estos nuevos maitansinoides con agentes de union a celulas.
La tecnica pone de manifiesto que es extremadamente diflcil modificar farmacos existentes sin disminuir su potencial citotoxico. La invencion descrita supera este problema ensenando un metodo de slntesis de nuevas moleculas de maitansinoide que contienen un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico. Los nuevos maitansinoides descritos conservan, y en algunos casos incluso potencian, la potencia citotoxica de los maitansinoides previamente descritos.
Los conjugados de maitansinoide-agente de union a celulas permiten la medicion completa de la action citotoxica de los maitansinoides que se van a aplicar de una forma dirigida solo contra celulas no deseadas, evitando as! efectos secundarios debidos al dano a celulas sanas a las que no van dirigidos. Por lo tanto, la invencion proporciona agentes utiles, y metodos nuevos para hacerlos, para la elimination de celulas enfermas o anomalas que van a matar o lisar, tales como celulas tumorales (en particular celulas de tumores solidos), celulas infectadas por virus, celulas infectadas por microorganismos, celulas infectadas por parasitos, celulas autoinmunes (celulas que producen anticuerpos), celulas activadas (las implicadas en el rechazo de injerto o enfermedad de injerto contra huesped), o cualquier otro tipo de celulas enfermas o anomalas, mientras que presentan efectos secundarios mlnimos.
Por lo tanto, esta invencion ensena un metodo para producir conjugados citotoxicos mejorados que comprenden nuevos agentes maitansinoides y agentes de union a celulas, con actividad biologica ampliamente mejorada, comparado con maitansinoides y agentes de union a celulas previamente descritos. La invencion ensena ademas un metodo para la slntesis de derivados de maitansinoide que tienen un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico, que permite la union qulmica de un agente de union a celulas, mientras que presenta una alta citotoxicidad sea en forma unida o en forma liberada o en ambos estados. El conjugado citotoxico de acuerdo con la presente invencion, comprende uno o mas maitansinoides unidos a un agente de union a celulas. Con el fin de unir el maitansinoide al agente de union a celulas, el maitansinoide primero debe modificarse.
Los maitansinoides que se pueden usar en la presente invencion para producir los maitansinoides que son capaces de unirse a un agente de union a celulas, son bien conocidos en la tecnica y se pueden aislar de fuentes naturales de acuerdo con metodos conocidos o preparar de forma sintetica de acuerdo con metodos conocidos.
Los ejemplos de maitansinoides adecuados incluyen el maitansinol.
Con el fin de unir el maitansinoide al agente de union a celulas, el maitansinoide comprende un resto conector. El resto conector contiene un enlace qulmico que permite la liberation de los maitansinoides completamente activos en un sitio particular. Los enlaces qulmicos adecuados son bien conocidos en la tecnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces labiles frente acidos, enlaces fotolabiles, enlaces labiles frente a peptidasa y enlaces labiles frente a esterasas. Son preferidos los enlaces disulfuro.
La descripcion de la patente de EE.UU. n° 5.208.020 ensena la production de maitansinoides que llevan dichos enlaces.
De acuerdo con la presente invencion, el resto conector comprende un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico.
Los maitansinoides que comprende un resto conector que contiene un grupo qulmico reactivo de acuerdo con la invencion, son esteres en C-3 del maitansinol donde el resto conector contiene un enlace tiol o disulfuro con impedimento esterico.
Ademas, aunque la slntesis de los esteres de maitansinol que tienen un resto conector se describe a continuation en terminos de restos conectores que contienen un enlace disulfuro en la position C-3, un experto en la tecnica entendera que tambien se pueden usar restos conectores con otros enlaces qulmicos, como se ha descrito antes, con la presente invencion.
Las estructuras de los diferentes maitansinoides de la presente invention se representan en la figura 2. La slntesis de los maitansinoides que tienen un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico se puede describir con referencia a la figura 3. Muchos de los metodos ilustrados a continuation usan los maitansinoides que contienen tiol N2- desacetil-N-2(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (denominado DM3) y N2-desacetil-N-2(4-metil-4-mercapto-1- 5 oxopentil)-maitansina (denominado DM4). DM3 (4a) y DM4 (4b) se representan mediante las siguientes formulas estructurales:
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La citotoxicidad in vitro de los nuevos maitansinoides que contienen tiol y disulfuro con impedimento esterico de la invencion, se pueden evaluar por su capacidad de suprimir la proliferation de diferentes llneas celulares no 10 deseadas in vitro (figura 4). Por ejemplo, llneas celulares tales como la llnea de carcinoma de mama humano SK-Br- 3, o la llnea celular de carcinoma epidermoide KB, se pueden usar para evaluar la citotoxicidad de estos nuevos maitansinoides. Las celulas evaluadas se pueden exponer a los compuestos durante 72 horas, y se pueden medir las fracciones de celulas que sobreviven en ensayos directos por metodos conocidos. Despues se pueden calcular los calores de CI50 a partir de los resultados de los ensayos.
15 Produccion de maitansinoides que tienen un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico
El maitansinoide de acuerdo con la invencion es el ester en C-3, que es un compuesto representado por la formula 4:
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en donde los sustituyentes son como se definen en la revindication 1.
20 Son especialmente preferidos cualquiera de los compuestos descritos antes, en donde R1 es H, R2 es metilo, R5, Ra, R7 y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es H; los compuestos en donde R1 y R2 son metilo, R5, Ra, R7, R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es H; los compuestos en donde R1 es H, R2 es metilo, R5, Ra, R7, y R8 son cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3; y los compuestos donde R1 y R2 son metilo, R5, Ra, R7, R8 son cada uno H, I y m es 1, n es 0, y Z es -SCH3. Ademas, se usa el estereoisomero L-alanina ya que el el mas 25 util para los conjugados de la invencion.
Las realizaciones preferidas de la formula 4 incluyen DM3 y DM4, es decir, el maitansinoide de formula 4 donde Z es H, R1 es H, R2 es metilo, R5, Ra, R7, y R8 son cada uno H, y I y m son 1, y n es 0 (DM3, compuesto 4a); el maitansinoide de formula 4 donde Z es H, R1 y R2 son ambos metilo, R5, Ra, R7, y R8 son cada uno H, l y m son 1, y n es 0 (DM4, compuesto 4b); el maitansinoide de formula 4 en donde R1 es H, R2 es metilo, R5, Ra, R7, y R8 son 30 cada uno H, l y m son cada uno 1, n es 0, y Z es -SCH3; y el maitansinoide de formula 4 en donde R1 y R2 son metilo, R5, Ra, R7, y R8 son cada uno H, l y m son 1, n es 0, y Z es -SCH3.
Los ejemplos de alquilos o alquenilos lineales que tienen de 1 a 10 atomos de carbono incluyen, pero no se limitan a metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, propenilo, butenilo y hexenilo.
Los ejemplos de alquilos o alquenilos ramificados que tienen de 3 a 10 atomos de carbono incluyen, pero no se limitan a isopropilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopentilo, 1-etil-propilo, isobutenilo e isopentenilo.
5 Los ejemplos de alquilos o alquenilos clclicos que tienen de 3 a 10 atomos de carbono incluyen, pero no se limitan a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentenilo y ciclohexenilo.
Los arilos simples incluyen arilos que tienen de 6 a 10 atomos de carbono, y los arilos sustituidos incluyen arilos que tienen de 6 a 10 atomos de carbono que llevan al menos un sustituyente alquilo que contiene de 1 a 4 atomos de carbono, o sustituyentes alcoxi tal como metoxi, etoxi, o un sustituyente halogeno o un sustituyente nitro.
10 Los ejemplos de arilo simple que contiene de 6 a 10 atomos de carbono incluyen fenilo y naftilo.
Los ejemplos de arilo sustituido incluyen nitrofenilo, dinitrofenilo.
Los radicales aromaticos heteroclclicos incluyen grupos que tienen un anillo de 3 a 10 miembros que contiene uno o dos heteroatomos seleccionados de N, O o S.
Los radicales heteroclclicos incluyen compuestos clclicos, que comprenden sistemas de anillo de 3 a 10 miembros, 15 que contienen uno o dos heteroatomos, seleccionados de N, O o S.
Los ejemplos de radicales aromaticos heteroclclicos incluyen piridilo, nitro-piridilo, pirolilo, oxazolilo, tienilo, tiazolilo y furilo.
Los ejemplos de radicales heteroalquilo incluyen dihidrofurilo, tetrahidrofurilo, tetrahidropirolilo, piperidinilo, piperazinilo y morfolino.
20 Los nuevos maitansinoides que tienen un resto tiol o disulfuro con impedimento esterico se pueden preparar por los siguientes metodos recien descritos:
Slntesis de maitansinoides
La figura 3a muestra las etapas de la slntesis del maitansinoide DM4 (4b). Se hace reaccionar el sulfuro de isobutileno (5) con el anion del acetonitrilo para dar el compuesto mercapto 6. La hidrolisis del compuesto 6 con 25 base proporciono el acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (7). La conversion del compuesto 7 en el disulfuro 8 se lleva a cabo por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo (MeSSO2Me). La conversion del compuesto 8 en el ester de N-hidroxisuccinimida 9 seguido de reaccion con N-metil-L-alanina proporciono el acido carboxllico 10, que se purifico por cromatografla en columna en gel de sllice. La reaccion del compuesto 10 con maitansinol (11) en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y cloruro de cinc dio la mezcla del N-acil-N-metil-L-alanil-maitansinoide L- 30 DM4SMe, (4e) y el N-acil-N-metil-D-alanil-maitansinoide D-DM4SMe (4f). La mezcla de diastereoisomeros se separo por HPLC, usando una columna con ciano unido. El isomero que contiene el L-aminoacido 4e deseado se recogio y se redujo con ditiotreitol para dar el L-aminoacil-maitansinoide que contiene tiol DM4 (4b), que se purifico de nuevo por HPLC usando una columna con ciano unido.
La figura 3b muestra las etapas de la slntesis del maitansinoide DM3 (4a). El acido 4-mercaptopentanoico (12) se 35 convirtio en el metildisulfuro por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13. La conversion del compuesto 13 en el ester de N-hidroxisuccinimida 14 seguido de reaccion con N-metil-L-alanina proporciono el acido carboxllico 15, que se purifico por cromatografla en columna en gel de sllice. La reaccion del compuesto 15 con maitansinol (11) en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y cloruro de cinc dio la mezcla del N-acil- N-metil-L-alanil-maitansinoide L-DM3SSMe, (4c) y el N-acil-N-metil-D-alanil-maitansinoide D-DM3SSMe (4d). La 40 mezcla de diastereoisomeros se separo por HPLC, usando una columna con ciano unido. El isomero que contiene el L-aminoacido deseado se recogio y se redujo con ditiotreitol para dar el maitansinoide que contiene mercapto-L- aminoacido DM3 (4a), que de nuevo se purifico por HPLC, usando una columna con ciano unido.
Las figuras 3c y d muestran la slntesis de DM3 que lleva el resto (S)-4-metilditio-1-oxopentilo o el resto (R)-4- metilditio-1-oxo-pentilo. La conversion del (R)-1,3-butanodiol (16) en su ditosilato 17, seguido de reaccion secuencial 45 con cianuro de sodio y etil-xantato de potasio dio el nitrilo 18 (Fig. 3c). La hidrolisis con base, seguido de intercambio de disulfuro dio el acido (S)-4-metilditio-pentanoico 19. La conversion del compuesto 19 en el ester de succinimidilo 20, seguido de reaccion con N-metil-L-alanina dio la N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15a). La reaccion con maitansinol, como se ha descrito antes para el compuesto 15, dio los dos diastereoisomeros de L- DM3SMe 4g y 4h. Igualmente, el (S)-1,3-butanodiol (21) se convirtio en el acido (R)-4-metilditio-pentanoico 24 y 50 despues en el compuesto 15b. La reaccion con maitansinol, como se ha descrito antes, dio los dos diastereoisomeros de DM3SMe, 4k y 4l.
Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo de esterificacion del maitansinol para dar un maitansinoide de formula 42:
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imagen9
Dicho metodo comprende hacer reaccionar el maitansinol en el C-3 con un compuesto de formula (III-L) o (III-D, L):
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en donde:
Y2 es como se define en la reivindicacion 9.
Preferiblemente, el compuesto representado por la formula (III) es el estereoisomero L.
Cuando se hace DM3, el compuesto de formula (III-L) es 15a(S,S),15b(S,R) o una mezcla de 15a(S,S) y 15b(S,R); y el compuesto de formula (III-D,L) es la N-metilalanina racemica acilada con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar los compuestos de estructura 15.
La mezcla de los compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R) se puede hacer por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida 14;
(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metil-L-alanina para dar la mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R);
La N-metilalanina racemica acilada con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar compuestos de la estructura 15, se puede hacer por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el compuesto 13;
(2) convertir el compuesto 13 en su ester de N-hidroxisuccinimida 14;
(3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metilalanina racemica para dar dicha N-metilalanina racemica acilada con un grupo carboxllico que lleva un grupo funcional tiol protegido, en el que el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, para dar los compuestos de estructura 15.
El compuesto 15a(S,S) se puede hacer por un procedimiento que comprende:
(1) convertir el (R)-1,3-butanodiol en acido (S)-4-(metilditio)pentanoico 19;
(2) convertir el compuesto 19 en su ester de N-hidroxisuccinimida (20); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 20 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15a(S,S);
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El compuesto 15b(S,R) se puede hacer por un procedimiento que comprende:
(1) convertir el (S)-1,3-butanodiol en acido (R)-4-(metilditio)pentanoico 24;
(2) convertir el compuesto 24 en su ester de N-hidroxisuccinimida (25); y
(3) hacer reaccionar el compuesto 25 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15b(S,R).
Cuando se hace DM4, el compuesto de formula (III-L) es un compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina, y el compuesto de formula (III-D,L) es el compuesto 10 que contiene N-metilalanina racemica.
El compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica se hace por un procedimiento que comprende:
(1) hacer reaccionar sulfuro de isobutileno (5) con el anion de acetonitrilo para dar el compuesto 6;
(2) hidrolizar el compuesto 6 para dar el acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (7);
(3) convertir el compuesto 7 en el disulfuro 8 por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo;
(4) convertir el compuesto 8 en su ester de N-hidroxisuccinimida 9; y
(5) hacer reaccionar el compuesto 9 con N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica para dar el compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica.
De acuerdo con la presente invencion, los compuestos de formula III tambien son nuevos:
imagen11
en donde:
Y2 es como se define en la reivindicacion 9.
Los compuestos de formula III los puede hacer facilmente el experto en la tecnica por metodos analogos a los descritos en la presente memoria para hacer los compuestos 10 y 15.
Citotoxicidad in vitro de maitansinoides
La citotoxicidad in vitro de los maitansinoides de la presente invencion se muestra en la figura 4. Los nuevos maitansinoides (4c, 4e) que llevan un enlace disulfuro impedido son muy potentes contra las llneas celulares ensayadas. Por lo tanto el compuesto 4c mata celulas A-375 y celulas SK-Br-3 con valores de CI50 de 1,5 x 10'11 M y 7,0 x 10'12 M respectivamente. Igualmente, el maitansinoide 4e tambien es muy potente con valores de CI50 de 3,2 x 10'11 M y 9,0 x 10'12 M contra celulas A-375 y SK-Br-3 respectivamente. La comparacion de la potencia in vitro del maitansinoide que contiene tiol impedido 4a de la presente invencion, con el maitansinoide 1 previamente descrito (Fig. 4c,d), indica que los nuevos maitansinoides son de 20 a 50 veces mas potentes que los descritos previamente.
Preparacion de agentes de union a celulas
La eficacia de los compuestos de la invencion como agentes terapeuticos depende de la selection cuidadosa de un agente de union a celulas adecuado. Los agentes de union a celulas pueden ser de cualquier clase actualmente conocida, o que se de a conocer, e incluye peptidos y no peptidos. En general, estos pueden ser anticuerpos (en especial anticuerpos monoclonales), linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moleculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molecula o sustancia de union a celulas.
Los ejemplos mas especlficos de agentes de union a celulas que se pueden usar incluyen:
anticuerpos policlonales;
anticuerpos monoclonales;
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fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', y F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1060));
- interferones (p. ej., alfa, beta, gamma);
linfoquinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
hormonas tales como insulina, TRH (hormona liberadora de tirotropina), MSH (hormona estimulante de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como androgenos y estrogenos;
factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));
transferrina (O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); y
vitaminas, tales como folato.
Las tecnicas de anticuerpos monoclonales permiten la produccion de agentes de union a celulas extremadamente especlficos en forma de anticuerpos monoclonales especlficos. Se conocen particularmente bien en la materia las tecnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por inmunizacion de ratones, ratas, hamsteres o cualquier otro mamlferos, con el antlgeno de interes tal como celulas diana intactas, antlgenos aislados de la celula diana, virus enteros, virus entero atenuado, y protelnas vlricas tales como protelnas de recubrimiento vlricas. Tambien se pueden usar celulas humanas sensibilizadas. Otra forma de crear anticuerpos monoclonales es el uso de bibliotecas en fagos de scFv (region variable monocatenaria), especlficamente scFv humano (vease, p. ej., Griffiths et al., patentes de EE.UU. n° 5.885.793 y 5.969.108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Ademas, tambien se pueden usar anticuerpos recubiertos descritos en la patente de EE.UU. n° 5.639.641, as! como anticuerpos humanizados.
La seleccion del agente de union a celulas adecuado es una cuestion de eleccion que depende de la poblacion de celulas particular a la que va a dirigirse, pero en general se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, si hay uno adecuado disponible.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especlficamente al antlgeno CD33 {J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y se puede usar si las celulas diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia mieloide aguda (LMA). Igualmente, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina, que se une al antlgeno CD19 en los linfocitos B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y se puede usar si las celulas diana son celulas B o celulas enfermas que expresan este antlgeno, tal como en el linfoma de no Hodgkin o leucemia linfoblastica cronica. Igualmente, el anticuerpo monoclonal, C242, que se une al antlgeno CanAg, (patente de EE.UU. n° 5.552.293) se puede usar para tratar tumores que expresan CanAg, tales como canceres colorrectal, pancreatico y gastrico.
Ademas, el GM-CSF, que se une a celulas mieloides se puede usar como un agente de union a celulas para celulas enfermas de leucemia mieloide aguda. La IL-2 que se une a linfocitos T activados se puede usar para prevenir el rechazo de injerto de trasplante, para tratamiento y prevencion de enfermedades de injerto contra huesped, y para el tratamiento de leucemia de linfocitos T aguda. mSh, que se une a melanocitos, se pueden usar para el tratamiento de melanoma. El acido folico se puede usar para dirigirse al receptor de folato expresado en tumores de ovario y otros tumores. El factor de crecimiento epidermico se puede usar para dirigirse a canceres escamosos tales como de pulmon y cabeza y cuello. La somatostatina se puede usar para dirigirse a neuroblastomas y otros tipo de tumores.
Los canceres de mama y testlculos son abordados con exito con estrogenos (o analogos de estrogenos) o androgenos (o analogos de androgenos) respectivamente, como agentes de union a celulas.
Produccion de conjugados de citoquinas
La presente invencion proporciona tambien un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas, en donde el maitansinoide se representa por la formula 41:
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en donde los sustituyentes son como se definen en la reivindicacion 6.
Los conjugados citotoxicos representativos de la invencion son anticuerpo/maitansinoide, fragmento de anticuerpo/maitansinoide, factor de crecimiento epidermico (EGF)/maitansinoide, hormona estimuladora de melanocitos (MSH)/maitansinoide, hormona estimuladora de tiroides (TSH)/maitansinoide, somatostatina/maitansinoide, folato/maitansinoide, estrogeno/maitansinoide, analogo de estrogeno/maitansinoide, androgeno/maitansinoide, y analogo de androgeno/maitansinoide.
El maitansinoide que contiene tiol se hace reaccionar con un agente de union a celulas modificado de forma adecuada para producir conjugados citotoxicos. Estos conjugados se pueden purificar por filtracion en gel, cromatografla de intercambio ionico o por HPLC.
Los esquemas para preparar conjugados a partir de maitansinoides que contienen grupo sulfhidrilo se muestran en la figura 5. Especlficamente Mote (Fig. 5a, b), una solucion de un anticuerpo en tampon acuoso, se puede incubar con un exceso molar de un agente modificador de anticuerpo tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP, 3a) para introducir grupos ditiopiridilo (Fig 5a), o con N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SpDb, 3b) para introducir grupos ditiopiridilo (Fig 5b). Despues, el anticuerpo modificado se hace reaccionar con maitansinoides que contienen tiol (tal como 4a o 4b) para producir un conjugado de anticuerpo-maitansinoide unido por disulfuro. El conjugado de maitansinoide-anticuerpo se puede purificar despues por filtracion en gel.
Alternativamente, el anticuerpo se puede incubar con un exceso molar de un agente modificador de anticuerpo tal como 2-iminotiolano para introducir grupos sulfhidrilo. Despues, el anticuerpo modificado se hace reaccionar con los maitansinoides que contienen disulfuro adecuados para producir un conjugado de anticuerpo-maitansinoide unido por disulfuro. El conjugado de maitansinoide-anticuerpo se puede purificar despues por filtracion en gel.
El numero de moleculas de maitansinoide (indicado con w en las figuras 5a a 5d) unidas por molecula de anticuerpo, se puede determinar midiendo por espectrofotometrla la relacion de la absorbancia a 252 nm y 280 nm. Por este metodo se pueden unir una media de 1-10 moleculas de maitansinoide/anticuerpo. El numero medio preferido de moleculas de maitansinoide unidas por molecula de anticuerpo es 2-5, y lo mas preferido es 3-4,5.
Alternativamente, se puede incubar una solucion de un anticuerpo en tampon acuoso con un exceso molar de anticuerpo-agente modificador tal como 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo (SMCC, 26) para introducir grupos maleimido (Fig. 5c), o con 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB, 27) para introducir grupos yodoacetilo (Fig. 5d). Despues, el anticuerpo modificado se hace reaccionar con maitansinoides que contienen tiol (tal como 4a o 4b) para producir un conjugado de anticuerpo-maitansinoide unido por tioeter. El conjugado de maitansinoide-anticuerpo se puede purificar despues por filtracion en gel.
El numero de moleculas de maitansinoide unidas por molecula de anticuerpo se puede determinar por analisis espectrofotometrico como se ha descrito antes.
Por lo tanto, la presente descripcion proporciona un metodo para hacer un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas, que comprende hacer un maitansinoide purificado por uno de los metodos descritos antes, y hacer reaccionar el maitansinoide purificado con un agente de union a celulas que comprende un grupo ditio o un sulfhidrilo reactivo. Preferiblemente, el grupo ditio reactivo es un grupo ditiopiridilo o un grupo ditiopiridilo sustituido. En especial preferiblemente, el grupo ditio reactivo comprende un grupo nitropiridilditio o dinitropiridilditio.
En otro metodo, el maitansinoide purificado se hace reaccionar con un agente de union a celulas que comprende un grupo maleimido o un grupo halogenoacetilo.
Los conjugados de agentes de union a celulas con farmacos maitansinoides de la invencion, se pueden evaluar por su capacidad para suprimir la proliferacion de diferentes llneas celulares no deseadas in vitro (Fig. 6). Por ejemplo, se pueden usar llneas celulares tales como la llnea de carcinoma de colon humano COLO 205, la llnea celular de
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melanoma humano A-375, la llnea de celular de leucemia mieloide humana HL60, para evaluar la citotoxicidad de estos conjugados. Las celulas evaluadas se pueden exponer a los compuestos durante 24 horas, y se pueden medir las fracciones de celulas que sobreviven en ensayos directos por metodos conocidos. Despues se pueden calcular los valores de CI50 a partir de los resultados de los ensayos.
La potencia y especificidad de diana in vitro de los conjugados de anticuerpo-maitansinoide de la presente invencion se muestran en las figuras 6, 10 y 12. Por lo tanto, la figura 6 muestra que tanto huC242-DM3 como huC242-DM4 son muy potentes para matar celulas COLO 205 positivas para el antlgeno, con valores de CI50 de 1,3 x 10-11 M y 1,1 x 10-11 M respectivamente. En cambio, las celulas A-375 negativas para el antlgeno son aproximadamente 500 veces menos sensibles, demostrando que los conjugados de maitansinoides de la presente invencion son muy potentes y especlficos. Igualmente, las figuras 10 y 12 demuestran la alta potencia y especificidad de diana de conjugados de maitansinoides de la presente invencion, con anticuerpos MY9-6 y anti-B4, respectivamente.
Se comparo la eficacia antitumoral in vivo de conjugados de anticuerpos con los maitansinoides que contienen tiol impedido de la presente invencion, con los conjugados de maitansinoides descritos previamente, en diferentes modelos de tumores humanos en ratones. En el primer modelo (Fig. 7), ratones SCID que llevaban xenoinjertos de tumor de colon humano HT-29 subcutaneos establecidos, se trataron con el conjugado de anticuerpo (huC242-DM1) del maitansinoide DM1 previamente descrito, o con los dos nuevos conjugados de maitansinoides (huC242-DM3, huC242-DM4). El tratamiento con huC242-DM1 produjo un retraso del crecimiento tumoral de 18 dlas. En cambio, los nuevos agentes eran significativamente mas eficaces, con retrasos del crecimiento tumoral de 28 dlas para huC242-DM3 y de 36 dlas para huC242-DM4.
En el segundo modelo (figura 8), ratones que llevaban xenoinjertos de tumor de colon humano COLO 205 subcutaneos establecidos, se trataron con el conjugado de anticuerpo (huC242-DM1) del maitansinoide DM1 previamente descrito, o con los dos nuevos conjugados de maitansinoides (huC242-DM3, huC242-DM4). El tratamiento con huC242-DM1 no produjo remision tumoral y produjo un retraso del crecimiento tumoral de 20 dlas. En cambio, los nuevos agentes eran significativamente mas eficaces. Se logro una remision tumoral completa que duraba 45 dlas en el grupo tratado con huC242-DM3. huC242-DM4 era incluso mas eficaz dando como resultado el curado de todos los ratones tratados.
En el tercer modelo (figura 9), ratones que llevaban xenoinjertos de leucemia mieloide humana HL60 subcutaneos establecidos, se trataron con el conjugado de anticuerpo (MY-9-6-DM1) del maitansinoide DM1 previamente descrito, o con los dos nuevos conjugados de maitansinoide (MY9-6-DM3, MY9-6-DM4). El tratamiento con MY9-6- DM1 no produjo remision tumoral y produjo un retraso del crecimiento tumoral de 5 dlas. En cambio, los nuevos agentes eran significativamente mas eficaces. Dieron como resultado la remision tumoral. Tanto MY9-6-DM3 como MY-9-6-DM4 produjeron retrasos del crecimiento tumoral mayores de 20 dlas.
En el cuarto modelo (figura 11), se comparo directamente un maitansinoide de la presente invencion (huMY9-6-DM4) con el de un conjugado del maitansinoide previamente descrito (huMY9-6-DM1) en un modelo de xenoinjerto subcutaneo, establecido con celulas HL-60. Con una dosis equivalente, el tratamiento con el conjugado de la presente invencion, MY9-6-DM4, dio como resultado la remision tumoral completa que duraba 85 dlas. En cambio, el conjugado del maitansinoide previamente descrito es mucho menos eficaz con un retraso del crecimiento tumoral de solo aproximadamente 48 dlas.
En el quinto modelo (figura 13a), un conjugado de un maitansinoide de la presente invencion con el anticuerpo huB4 muestra alta actividad antitumoral de una forma dependiente de la dosis en un modelo de tumor Ramos subcutaneo. Las remisiones tumorales completas y los curados se logran con dosis que no son toxicas (figuras 13a,b).
Los resultados de los cinco experimentos de eficacia anteriores demuestran que los maitansinoides que contienen tiol con impedimento esterico de la presente invencion, dan conjugados de agente de union a celulas con actividad antitumoral enormemente mejorada comparados con los conjugados de maitansinoide-agente de union a celulas previamente descritos.
Composiciones y metodos de uso
La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas que comprenden una cantidad eficaz de cualquiera de los maitansinoides-agentes de union a celulas de la presente invencion, una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, y un vehlculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Igualmente, la presente descripcion proporciona un metodo para inducir la muerte celular en poblaciones de celulas seleccionadas, que comprende poner en contacto celulas diana o tejidos que contienen celulas diana, con una cantidad eficaz de un agente citotoxico que comprende cualquiera de los maitansinoides-agentes de union a celulas de la presente invencion, o una de sus sales o solvatos. Las celulas diana son celulas a las que se pueden unir los agentes de union a celulas.
Si se desea, se pueden administrar otros agentes, tales como otros agentes antitumorales, junto con el conjugado.
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Los vehlcuios, diluyentes y excipientes farmaceuticamente aceptables son bien conocidos, y los pueden determinar por expertos en la tecnica como justifique la situacion cilnica.
Los ejemplos de vehlculos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) solucion salina tamponada con fosfato Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene o no contiene aproximadamente de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina de suero humana, (2) solucion salina al 0,9% (NaCl al 0,9% en p/v), y (3) dextrosa al 5% (p/v); y tambien pueden contener un antioxidante tal como triptamina y un agente estabilizante tal como Tween 20.
El metodo para inducir la muerte celular en poblaciones de celulas seleccionadas se puede poner en practica in vitro, in vivo o ex vivo.
Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamiento de medula osea autologa antes de su trasplante al mismo paciente con el fin de matar celulas enfermas o malignas: tratamientos de la medula osea antes de su trasplante con el fin de matar linfocitos T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra huesped (GVHD); tratamientos de cultivos celulares con el fin de matar todas las celulas excepto las variantes deseadas que no expresan el antlgeno diana; o matar variantes que expresan el antlgeno no deseado.
Las condiciones de uso in vitro no cllnico son determinadas facilmente por un experto en la tecnica.
Los ejemplos de uso ex vivo cllnico son separar las celulas tumorales o celulas linfoides de la medula osea antes del trasplante autologo en el tratamiento del cancer o en el tratamiento de enfermedad autoinmunitaria, o separar linfocitos T y otras celulas linfoides de la medula osea autologa o alogenica o tejido antes de trasplante con el fin de prevenir la GVHD. El tratamiento se puede llevar a cabo como sigue. Se recoge medula osea del paciente u otro individuo y despues se incuba en medio que contiene suero al que se anade agente citotoxico de la invencion, las concentraciones estan en el intervalo de 10 pM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentracion y tiempo de incubacion, es decir, la dosis, son determinadas facilmente por un experto en la tecnica. Despues de incubacion, las celulas de la medula osea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por via intravenosa de acuerdo con metodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como durante el transcurso de quimioterapia ablativa o irradiacion total del cuerpo entre el momento de recogida de la medula y la reinfusion de las celulas tratadas, las celulas de la medula osea tratadas se almacenan congeladas en nitrogeno llquido usando equipamiento medico convencional.
Para uso in vivo cllnico, el agente citotoxico de la invencion se suministrara como una solucion o un polvo liofilizado en los que se examina la esterilidad y los niveles de endotoxinas. Los ejemplos de protocolos adecuados de administracion de conjugados son como sigue. Los conjugados se administran semanalmente durante 4 semanas como un bolo intravenoso cada semana. Las dosis de bolos se administran en 50 a 1000 ml de solucion salina normal a la que se pueden anadir de 5 a 10 ml de albumina de suero humana. Las dosificaciones seran de 10 pg a 2000 mg por administracion, intravenosa (en el intervalo de 100 ng a 20 mg/kg diarios). Despues de cuatro semanas de tratamiento, el paciente puede continuar recibiendo tratamiento semanalmente. Los protocolos cllnicos especlficos con relacion a la via de administracion, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., los puede determinar el experto en la tecnica segun justifique la situacion cllnica.
Los ejemplos de afecciones medicas que se puede tratar de acuerdo con los metodos in vivo o ex vivo de induccion de muerte celular en poblaciones de celulas seleccionadas incluyen tumores malignos de cualquier tipo, incluyendo, por ejemplo, cancer de pulmon, mama, colon, prostata, rinon, pancreas, ovario y organos linfaticos; enfermedades autoinmunitarias, tales como lupus sistemico, artritis reumatoide y esclerosis multiple; rechazos de injerto, tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante de hlgado, rechazo de trasplante de pulmon, rechazo de trasplante cardiaco, y rechazo de medula osea; enfermedad de injerto contra huesped; infecciones vlricas, tales como infeccion por CMV, infeccion por VIH, SIDA, etc.; e infecciones parasitarias, tales como giardiasis, amoebiasis, esquistosomiasis, y otras determinadas por el experto en la tecnica.
EJEMPLOS
La invencion ahora se ilustrara por referencia a ejemplos no limitantes. Salvo que se exponga lo contrario, todos los porcentajes, proporciones, partes etc. son en peso.
Todos los reactivos se adquirieron en Aldrich Chemical Co., New Jersey, u otras fuentes comerciales. El maitansinol (11) se preparo como se ha descrito previamente (patente de EE.UU. n° 6.333.410). Los espectros de resonancia magnetica nuclear (RMN 1H) se adquirieron en un instrumento Bruker de 400 MHz y los espectros de masas se adquirieron en un instrumento Bruker Daltonics Esquire 3000 usando ionizacion por electropulverizacion.
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EJEMPLO 1
Sintesis del maitansinoide 4b
Acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (7): Un matraz de 500 ml se equipo con una barra agitadora y un embudo de adicion de 150 ml. El sistema se puso en una atmosfera de argon. Se anadieron 150 ml de tetrahidrofurano anhidro (THF) y 75 ml de n-BuLi 2,5 M en hexanos (18,7 mmol) mediante una canula y la solucion se enfrio en un bano de hielo seco/acetona a -78°C. Se anadio gota a gota acetonitrilo (7,3 g, 9,4 ml, 18 mmol) mediante una jeringa a lo largo de aproximadamente 5 min. La reaccion se agito durante 30 min, mientras se formaba un precipitado de litio- acetonitrilo blanco. Se disolvio sulfuro de isobutileno (15 g, 17 mmol) en 100 ml de THF anhidro y se anadio gota a gota a lo largo de aproximadamente 30 min mediante el embudo de adicion. El bano de enfriamiento se retiro y la reaccion se dejo agitar durante 3 horas. El matraz se enfrio en un bano de hielo/agua mientras se anadlan gota a gota 38 ml de HCl 0,5 M. Se retuvo la capa de THF y la capa acuosa se lavo dos veces con 75 ml de acetato de etilo. Las capas de THF y acetato de etilo se combinaron, se secaron sobre aproximadamente 20 g de sulfato sodico anhidro y se transfirieron a un matraz de 250 ml. Se separo el disolvente por evaporacion en rotavapor con vaclo para dar el compuesto bruto 6. Se anadieron etanol (30 ml) y una barra agitadora. El contenido se agito mientras se anadla lentamente una solucion de 8,0 g de NaOH en 30 ml de agua desionizada. El matraz se equipo con un refrigerante de reflujo y se puso en una atmosfera de argon. La reaccion se calento a reflujo durante la noche y despues se enfrio a temperatura ambiente. Se anadio agua desionizada (60 ml) y la mezcla se extrajo dos veces con porciones de 25 ml de una mezcla 2:1 de acetato de etilo y hexano. La capa acuosa se acidifico a pH 2 con HCl concentrado y despues se extrajo 3 veces con porciones de 75 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se separo por evaporacion en rotavapor con vaclo para dar 10 g del producto 7 (39% de rendimiento). El material se uso sin mas purificacion. RMN 1H (CDCb): 5 1,38 (6H, s), 1,87-1,93 (2H, m), 2,08 (1H, s), 2,51-2,57 (2H, m).
Acido 4-metil-4-(metilditio)pentanoico (8): Una solucion de acido mercaptopentanoico 7 (6,0 ml, 40 mmol) se disolvio en 50 ml de agua desionizada en un matraz de 250 ml. La solucion se agito con agitador magnetico mientras se anadla carbonato sodico (6,4 g, 60 mmol) al acido a una velocidad que no produjera espuma excesiva. El matraz se equipo con un embudo de adicion de 100 ml, que se cargo con una solucion de metanotiolsulfonato de metilo (7,5 g, 60 mmol) disuelto en 30 ml de etanol al 100% destilado en vidrio. El matraz se enfrio en un bano de hielo/agua y el sistema se mantuvo en una atmosfera de argon. Se anadio gota a gota metanotiolsulfonato de metilo al matraz tan rapidamente como fuera posible sin producir espuma excesiva. Se retiro el bano de enfriamiento y la mezcla de reaccion se dejo agitar durante 3 horas adicionales. El disolvente se separo por evaporacion en rotavapor a vaclo, hasta que quedaban aproximadamente 20 ml. Despues de lo cual se anadieron 10 ml de solucion saturada de bicarbonato sodico y 30 ml de agua desionizada. La mezcla se lavo tres veces con porciones de 25 ml de acetato de etilo en un embudo de separacion. La capa acuosa se ajusto a aproximadamente pH 2 con HCl 5 M y se extrajo dos veces con porciones de 120 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con 20 ml de una solucion compuesta de solucion saturada de NaCl y HCl 1 M en una relacion 4:1. Despues, la capa organica se seco sobre 14 g de sulfato sodico anhidro y el disolvente se separo por evaporacion en rotavapor a vaclo para dar
5,4 g del producto 8 (70% de rendimiento). El material se puede llevar a la siguiente etapa sin mas purificacion. RMN 1H (CDCla): 5 1,54 (6H, s), 2,15-2,21 (2H, m), 2,64 (3H, s), 2,69-2,72 (2H, m). MS (M + Na+) calc.: 217,0, encontrado:
217.1
4-Metil-4-(metilditio)pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (9): Se disolvio el acido metilditiopentanoico 8 (3,0 g, 15 mmol) en 20 ml de cloruro de metileno y se agito con agitador magnetico mientras se anadla W-hidroxisuccinimida (2,65 g, 23 mmol) seguido de hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC, 4,4 g, 23 mmol). La mezcla se agito en atmosfera de argon durante 2 horas. La mezcla de reaccion se vertio en un embudo de separacion de 125 ml, se anadieron 40 ml de acetato de etilo y la solucion se lavo dos veces con porciones de 20 ml de tampon de fosfato sodico 50 mM, pH 6,0, y una vez con 12 ml de solucion saturada de cloruro sodico. La capa organica se seco sobre 14 g de Na2SO4 anhidro y el disolvente se separo por evaporacion en rotavapor con vaclo para dar 4,0 g del producto 9 (90% de rendimiento), que se uso sin mas purificacion. RMN 1H (CDCb): 5 1,30 (6H, s), 2,00-2,05 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,68-2,72 (2H, m), 2,73-2,83 (4H, m). MS (M + Na+) calc.: 314,0, encontrado:
314.1
N-metil-N-(4-metil-4-metilditio-1-oxopentil)-L-alanina (10): Se disolvio W-Metil-L-alanina (2,85 g, 18,0 mmol) en 50 ml de una solucion de dimetoxietano y agua desionizada 1:1 en un matraz de 125 ml equipado con una barra agitadora magnetica. Se anadio trietilamina (6,9 g, 36 mmol) y la solucion se agito energicamente mientras se anadla gota a gota el compuesto 9 (5,44 g, 18 mmol) disuelto en 40 ml de la misma mezcla de disolventes, a lo largo de aproximadamente 5 min. Despues de 2 horas, la mezcla de reaccion se concentro a aproximadamente 40 ml por evaporacion en rotavapor con vaclo, y despues se anadieron 10 ml de agua desionizada y HCl 1 M, para dar un pH de aproximadamente 2. La mezcla se vertio en un embudo de separacion y se extrajo dos veces con porciones de 50 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y despues se lavaron con 7 ml de solucion saturada de cloruro sodico. La capa organica se seco sobre 8,0 g de Na2SO4 anhidro y el disolvente se separo por evaporacion en rotavapor a vaclo. El residuo se recogio en un volumen mlnimo de acetato de etilo y se purifico por cromatografla en sllice (sllice: calidad ultrarrapida de 40 micrometres, lecho de sllice: 24 x 3,0 cm, fase movil: hexanos:acetato de etilo:acido acetico 50:48:2). Se combinaron las fracciones que contenlan el producto deseado y el disolvente se separo a vaclo. El acido acetico residual se separo disolviendo el residuo en un volumen mlnimo de
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acetato de etilo y precipitando el producto por la adicion rapida pero gota a gota de hexano, con agitacion. Se anadio hexano hasta que ya no se detecto producto en el llquido sobrenadante por analisis de TLC. El precipitado se seco a vaclo durante 4 horas para dar 2,2 g del producto 10 (51% de rendimiento). RMN 1H (CDCb): 5 1,32 (6H, s), 1,42 (3H, d, J = 7 Hz), 1,90-97 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,42-2,49 (2H, m), 2,9 (3H, s), 5,15 (1H, q, J= 7 Hz). MS (M + Na+) calc.: 302,1, encontrado: 302,0.
N2,-Desacetil-N2,-(4-metil-4-metilditio-1-oxopentil)maitansina (L-DM4-SMe, 4e). Una solucion de maitansinol (11, 25 mg, 0,44 mmol) y N-metil-N-(4-metil-4-metilditio-1-oxopentil)-L-alanina (10, 42,0 mg, 0,177 mmol) en 3 ml de diclorometano se agito con agitador magnetico en una atmosfera de argon mientras se anadla una solucion de diciclohexilcarbodiimida (DCC, 57,1 mg, 0,277 mmol) en 0,67 ml de diclorometano. Despues de 1 min se anadio una solucion de ZnCl2 1 M en eter dietllico (0,03 ml, 0,03 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y despues se anadieron 5 ml de acetato de etilo y la mezcla se filtro a vaclo a traves de un papel de filtro grueso. El filtrado se lavo con 2 ml de solucion saturada de bicarbonato sodico, seguido de 1 ml de solucion saturada de cloruro sodico. La capa organica se seco sobre 2 g de sulfato sodico anhidro. El disolvente se separo a vaclo y el residuo se purifico por cromatografla en sllice usando una mezcla de diclorometano y metanol para separar el maitansinol sin reaccionar. Se combinaron fracciones que contenlan el producto deseado y el disolvente se separo a vaclo para dar una mezcla de diastereoisomeros 4e y 4f. El residuo se recogio en un volumen mlnimo de acetato de etilo y se purifico en una columna de 50 cm por 250 cm, 10 micrometros Diazem™ CN usando como fase movil una mezcla de hexano, 2-propanol y acetato de etilo en una relacion 68:8:24. El caudal era 118 ml/min. En estas condiciones, el producto deseado 4e eluyo con un tiempo de retencion de 11 min y el diastereoisomero no deseado 4f tenia un tiempo de retencion de 19 min. Las fracciones que contenian el producto deseado se combinaron y el disolvente se separo a vacio para dar 12,0 mg del producto 4e (36% de rendimiento). RMN 1H (CDCb): 5 0,80 (3H, s), 1:28-1,36 (13H, m), 1,42-1,46 (2H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,75-1,85 (1H, m), 1,90-2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz y 14 Hz), 2,31 (3H, s), 2,40-2,49 (1H, m), 2,50-2,65 (1H, m), 2,85 (3H, s),
3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1 H,d,J=11 Hz), 3,23 (3H,s), 3,35 (3H,s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J=12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz y 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd, J=9 Hz y 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J=11 Hz y 15 Hz), 6,65 (1H, d, J=1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=11 Hz), 6,81 (1H, d, J=1,5 Hz). MS de alta resolucion (M + H+) calc.: 826,3174, encontrado: 826,3150.
N2'-Desacetil-N2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)maitansina (L-DM4, 4b). El disulfuro 4e anterior (12 mg, 0,015 mmol) se disolvio en 1,0 ml de acetato de etilo:metanol 1:1. Despues se anadio una solucion de ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) en 0,50 ml de tampon de fosfato 50 mM, pH 7,5. La solucion se agito con agitador magnetico en una atmosfera de argon durante 3 horas, despues se anadio 1 ml de tampon de fosfato 200 mM, pH 6,0, y la mezcla se extrajo tres veces con porciones de 2 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con 1 ml de solucion saturada de cloruro sodico, despues se secaron sobre 1 g de sulfato sodico anhidro. El disolvente se separo a vacio y el residuo se recogio en una cantidad minima de acetato de etilo y se purifico en una columna de 50 cm x 250 cm, 10 micrometros Diazem™ CN usando una fase movil de hexano, 2-propanol y acetato de etilo en una proporcion de 70:8:22. El caudal era 22 ml/min. El producto deseado 4b eluyo con un tiempo de retencion de 10 min. Se combinaron las fracciones que contenian el compuesto 4b puro y el disolvente se separo a vaclo para dar
11 mg del compuesto 4b (97% de rendimiento). RMN 1H (CDCb): 5 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H,m), 1,28-1,36 (12H, m), 1,42-1,46(2H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,75-1,85 (1H, m), 1,90-2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz y 14 Hz), 2,40-2,49 (1H, m), 2,50-2,65 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J=11 Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J=12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz y
12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd J=9 Hz y 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J=11 Hz y 15 Hz), 6,65 (1H, d, J=1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=11 Hz), 6,81 (1H, d, J=1,5 Hz). MS de alta resolucion (M + Na+) calc.: 502,3101, encontrado: 802,3116.
Ejemplo 2
Sfntesis del maitansinoide 4a
Acido 4-metilditio-pentanoico (13): Una solucion de acido 4-mercaptopentanoico (12, 16,6 g, 124 mmol) se disolvio en 350 ml de agua desionizada en un matraz de 500 ml. La solucion se agito con agitador magnetico mientras se anadla carbonato sodico (19,7 g, 186 mmol) al acido a una velocidad que no produjera espuma excesiva. El matraz se equipo con un embudo de adicion de 250 ml, que se cargo con una solucion de metanotiolsulfonato de metilo (23,4 g, 186 mmol) disuelto en 220 ml de etanol al 100% destilado en vidrio. El matraz se enfrio en un bano de hielo/agua y el sistema se mantuvo en una atmosfera de argon. La solucion de metanotiolsulfonato de metilo se anadio gota a gota al matraz tan rapido como fuera posible, pero a una velocidad que se previniera la espuma excesiva. Se retiro el bano de enfriamiento y la mezcla de reaccion se dejo agitar durante 2 horas adicionales. El disolvente se separo por evaporacion en rotavapor a vacio, hasta que quedaban aproximadamente 250 ml. Despues de lo cual se anadieron 30 ml de solucion saturada de bicarbonato sodico y 50 ml de agua desionizada. La mezcla se lavo tres veces con porciones de 200 ml de acetato de etilo en un embudo de separacion. La capa acuosa se ajusto a aproximadamente pH 2 con HCl 5 M y se extrajo dos veces con porciones de 400 ml de acetato de etilo. Las capas organica se combinaron, se lavaron con 60 ml de una mezcla de solucion saturada de NaCl y HCl 1 M 4:1, despues se secaron sobre 50 g de sulfato sodico anhidro, y finalmente el disolvente se separo por evaporacion en rotavapor a vacio para dar 10,2 g del producto 13 (45% de rendimiento). El material se
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uso en la siguiente reaccion sin mas purificacion. RMN H1 5 1,36 (3H, d, J = 7 Hz), 1,84-1,95 (H, m), 1,85-2,56 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,53 (2H, t, J = 7 Hz), 2,85-2,95 (1H, m), MS (M + Na+) calc.: 203,3, encontrado: 203,2.
4-Metilditio-pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (14): Se disolvio acido 4-metilditio-pentanoico (13, 0,75 g, 4,16 mmol) en 7,0 ml de cloruro de metileno y se agito con agitador magnetico mientras se anadla N-hidroxisuccinimida (0,526 g, 4,57 mmol) seguido de hidrocloruro de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (0,877 g, 4,57 mmol). La mezcla se agito en una atmosfera de argon durante 2,5 horas, y despues se vertio en un embudo de separation de 60 ml que contenla 20 ml de acetato de etilo. La solution resultante se lavo dos veces con porciones de 15 ml de tampon de fosfato potasico 50 mM, a pH 6,0, y una vez con 5 ml de solucion saturada de cloruro sodico. La capa organica se seco sobre 8 g de Na2SO4 anhidro, y el disolvente se separo por evaporation en rotavapor con vaclo para dar 1,15 g del producto 14 (87% de rendimiento), que se uso para la siguiente reaccion sin mas purificacion. RMN H1 5 1,48 (3H, d, J = 7), 2,06 (1H, m), 2,17 (1H, m), 2,55 (3H, s), 2,93 (2H, t, J= 7), 2,98 (4H, s), 3,15 (1H, m). MS (M + Na+) calc.: 304,1, encontrado: 304,0.
N-Metil-N-(4-metilditio-1-oxopentil)-L-alanina (15): Se disolvio N-Metil-L-alanina (0,64 g, 6,2 mmol) en 8 ml de una mezcla de dimetoxietano y agua desionizada 1:1 en un matraz de 125 ml equipado con una barra agitadora magnetica. Se anadio trietilamina (0,841 g, 8,3 mmol) y el matraz se agito energicamente mientras se anadla gota a gota una solucion del compuesto 14 (1,0 g, 3.6 mmol) disuelto en 8 ml de la misma mezcla de disolventes, a lo largo de aproximadamente 5 min. Despues de 2 horas, la mezcla de reaccion se concentre a aproximadamente 3 ml por evaporacion en rotavapor a vaclo, y despues se anadieron 15 ml de agua desionizada y HCl 1 M, para dar un pH de aproximadamente 2. La mezcla se vertio en un embudo de separacion de 60 ml y se extrajo dos veces con porciones de 15 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron, se lavaron con 3 ml de solucion saturada de cloruro sodico, despues se secaron sobre 8,0 g de Na2SO4 anhidro, y finalmente se separo el disolvente por evaporacion en rotavapor con vaclo. El residuo se recogio en un volumen mlnimo de acetato de etilo y se purifico por cromatografla en sllice (sllice: calidad ultrarrapida de 40 micrometres, lecho de sllice 24 x 3,0 cm, fase movil hexanos:acetato de etilo:acido acetico 50:48:2). Se combinaron las fracciones que contenlan el producto 15 deseado y el disolvente se separo a vaclo. El acido acetico residual se separo disolviendo el residuo en un volumen mlnimo de acetato de etilo y precipitando el producto por la adicion rapida pero gota a gota de hexano, con agitation. Se anadio hexano hasta que ya no se detecto producto en el llquido sobrenadante por analisis de TLC. El precipitado se seco a vaclo para dar 0,60 g del producto 15 (62% de rendimiento). RMN H1 5 1,35(3H, d, J = 7), 1,41 (3H,d,J = 7), 1,94-2,03 (2H,m), 2,43(3H,s), 2,50-2,55 (2H,m), 2,83-2,93 (1H,m), 2,98 (3H,s), 5,14(1H, q, J= 7). MS (M + Na+) calc.: 288,1, encontrado: 288,1.
N2-Desacetil-N2-(4-metilditio-1-oxopentil)maitansina (L-DM3-SMe, 4c): Una solucion de maitansinol (25 mg, 0,44 mmol) y el compuesto 15 (42,0, 0,177 mmol) en 3 ml de diclorometano se agito con agitador magnetico en una atmosfera de argon mientras se anadla una solucion de diciclohexilcarbodiimida (DCC, 57,1 mg, 0,277 mmol) en 0,67 ml de diclorometano. Despues de 1 min, se anadio una solucion de ZnCl2 1 M en eter dietllico (0,03 ml, 0,03 mmol). La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 horas y despues se anadieron 5 ml de acetato de etilo y la mezcla se filtro a vaclo a traves de un papel de filtro grueso. El filtrado se lavo con 2 ml de solucion saturada de bicarbonato sodico, seguido de 1 ml de solucion saturada de cloruro sodico. La capa organica se seco sobre 2 g de sulfato sodico anhidro, y despues se separo el disolvente a vaclo. El residuo se purifico por cromatografla en sllice usando una mezcla de diclorometano y metanol para separar el maitansinol sin reaccionar. Se combinaron las fracciones que contenlan el producto deseado y el disolvente se separo a vaclo para dar una mezcla de los diastereoisomeros 4c y 4d. El residuo se recogio en un volumen mlnimo de acetato de etilo y se purifico en una columna de 50 cm por 250 cm, 10 micrometres Diazem™ CN usando como fase movil una mezcla de hexano, 2- propanol y acetato de etilo 68:8:24. El caudal era 118 ml/min. El producto deseado 4c elula con un tiempo de retention de 11 min, el diastereoisomero no deseado 4d tenia un tiempo de retention de 19 min. Las fracciones que contenian el producto deseado se combinaron y se separo el disolvente con vacio para dar 12,0 mg del producto 4c (36% de rendimiento). RMN 1H (CDCla): 5 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H,m), 1,28-1,36 (9H, m), 1,42-1,46 (1H, m), 1,531,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80-1,89 (1H, m), 1,90-2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3 Hz y 14 Hz), 2,32 (3H, s), 2,332,42 (1H, m), 2,49-2,62 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9 Hz), 3,11 (1H, d, J=11 Hz), 3,23 (3H,s), 3,35 (3H,s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J=12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz y 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd J=9 Hz y 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J=11 Hz y 15 Hz), 6,65 (1H, d, J=1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=11 Hz), 6,81 (1H, d, J=1,5 Hz). MS (M + Na+) calc.: 834,3, encontrado: 834,3.
N2-Desacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (L-DM3, 4a): Se disolvio L-DM3-SMe (4c, 12 mg, 0,015 mmol) en 1,0 ml de una mezcla de acetato de etilo y metanol 1:1. Despues se anadio una solucion de ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) en 0,50 ml de tampon de fosfato 50 mM, pH 7,5. La solucion de la reaccion se agito con agitador magnetico en una atmosfera de argon durante 3 horas, despues se anadio 1 ml de tampon de fosfato 200 mM, pH 6,0, y la mezcla se extrajo tres veces con porciones de 2 ml de acetato de etilo. Las capas organicas se combinaron y se lavaron con 1 ml de solucion saturada de cloruro sodico, despues se secaron sobre 1 g de sulfato sodico anhidro. El disolvente se separo a vacio y el residuo se recogio en una cantidad minima de acetato de etilo y se purifico en una columna de 50 cm x 250 cm, 10 micrometres Diazem™ CN usando como fase movil una mezcla de hexano, 2-propanol y acetato de etilo 70:8:22. El caudal era 22 ml/min. El producto deseado eluia con un tiempo de retencion de 10 min. Se combinaron las fracciones que contenian producto puro y el disolvente se separo a vacio para dar 11 mg del producto 4a (97% de rendimiento). RMN 1H (CDCla): 5 0,80 (3H, s), 1,19-1,23 (1H,m), 1,28-1,36 (9H, m), 1,42-1,46 (1H, m), 1,53-1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80-1,89 (1H, m), 1,90-2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J=3
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Hz y 14 Hz), 2,33-2,42 (1H, m), 2,499-2,62 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J=9.Hz), 3,11 (H, d, J=11 Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J=9 Hz), 3,63 (1H, d, J=12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J=10 Hz), 4,79 (1H, dd, J=3 Hz y 12 Hz), 5,41 (1H, q, J=7 Hz), 5,66 (1H, dd J=9 Hz y 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J=11 Hz y 15 Hz), 6,65 (1H, d, J=1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J=11 Hz), 6,81 (1H, d, J=1,5 Hz). MS: (M + Na+) calc.: 788,3, encontrado: 788,3.
EJEMPLO 3
Sintesis del maitansinoide 4g,h (FIG. 3c).
R-1,3-Di-O-p-toluenosulfonil-butano (17): Una solucion de R-(-)-1,3-butanodiol (16, 2 ,00 g, 22,22 mmol) en una mezcla de piridina seca (40 ml) y tolueno seco (60 ml), se trato con cloruro de p-toluenosulfonilo (12,70 g, 66,84 mmol) en atmosfera de argon a 0°C. Despues de agitar a 0°C durante 5 min, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla se evaporo a vaclo, se volvio a disolver en acetato de etilo y se lavo con solucion acuosa de NaHCO3 0,1 M, seguido de solucion saturada de NaCl. La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo el disolvente. La purificacion por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con acetato de etilo/hexano 1:2 (v/v) dio 6,51 g (74%) del producto del tltulo 17. Rf = 0,40 (1:1 EtOAc/hexano); RMN 1H (CDCla) 7,76 (dd, 4H, J = 1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J = 0,4, 8,0 +8,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J = 6,3 Hz); RMN 13C 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06; MS: 420,99 (M + Na)+, 421,93 (M+1+Na)+.
S-4-O-Etilxantico-pentanonitrilo (18): Una solucion de R-1,3-di-O-p-toluenosulfonil-butano (17, 4,80 g, 12,06 mmol) en DMSO seco (50 ml) se trato con NaCN (0,65). Despues de agitar a t.a. en atmosfera de argon durante 18 h, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo, se lavo sucesivamente con NaH2PO4 1,0 M frlo a pH 7,5, agua y NaH2PO4 1,0 M a pH 4,0. La capa organica se separo y se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo para dar 2,63 g de R-3-O-p-toluenosulfonil-pentanonitrilo bruto. MS 275,80 (M + Na)+, 276,75 (M +1 +Na)+. El producto se uso directamente sin mas purificacion.
A la solucion de R-3-O-p-toluenosulfonil-pentanonitrilo bruto (2,63 g) en etanol (15 ml) se anadio O-etilxantato de potasio (4,55 g) en etanol (50 ml). Despues de agitar en atmosfera de argon durante la noche, la mezcla se concentro, se diluyo con acetato de etilo, y se filtro a traves de una columna corta de sllice. El eluyente se concentro y se purifico por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con EtOAc/hexano 1:4 (v/v), para dar 1,54 g (63%, 2 etapas) del producto del tltulo 18. Rf = 0,40 (EtAc/hexano 1:4). RMN 1H (CDCla) 4,67 (dd, 2H, J = 7,1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J = 7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H J = 7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H); RMN 13C 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M + Na)+, 242,51 (M + K)+.
Acido S-(+)-4-metilditio-pentanoico (19): A una solucion de S-4-O-etilxantico-pentanonitrilo (18, 1,95 g (9,61 mmol) en una mezcla de etanol (10 ml) y agua (150 ml) se anadieron 5,0 g de NaOH. La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante la noche en atmosfera de argon. La mezcla se enfrio a temperatura ambiente y se diluyo con agua (150 ml) y se extrajo con EtOAc/hexano 1:1 (2 x 100 ml). La capa acuosa se acidifico con H3PO4 hasta pH
2,5 ~ 3,0 y se extrajo con EtOAc (6 x 75 ml). Las capas organicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad para dar el acido S-4-mercaptopentanoico bruto. Este producto bruto se uso directamente para la siguiente etapa sin mas purificacion.
A una solucion del acido S-4-mercaptopentanoico bruto (1,2 g) en una mezcla de etanol (50 ml) y NaH2PO3 0,5 M, pH 7,0 (75 ml), se anadio gota a gota metanotiolsulfonato de metilo (1,47 g, 11,65 mmol) en 5 de THF seco (5 ml) a lo largo de 45 min a 0°C. Despues de agitar en atmosfera de argon a 0°C durante 30 min, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla se concentro y se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). La capa acuosa se acidifico con H3PO4 hasta pH 2,5 ~ 3,0 y se extrajo con EtOAc (4 x 100 ml). Las capas organicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purifico por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con (HOAc/EtOAc/hexano 1:100:400) para dar 1,43 g (83%) del producto del tltulo 19. Rf = 0,32 (HOAc/EtAc/hexano 1:100:400); RMN 1H (CDCla) 2,91 (ddd, 1H, J = 6,8, 13,7, 20,5 Hz), 2,53 (t, 2H, J = 7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,94 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz); RMN 13C 179,18, 45,35, 31,58, 30,73, 24,70, 21,05; MS: 202,92 (M+Na)+, 203,91 (M+1+Na)+; [a] = 41,35 (c = 2, CH3OH).
N-Metil-N-[4-fS)-metilditio-1-oxopentil]-S-alanina (15a): El acido S-(+)-4-(metilditio)-pentanoico (19) se convirtio en el ester de N-hidroxisuccinimdilo 20, por el metodo descrito antes para el compuesto 14. La reaccion con N-metil- L-alanina por el procedimiento descrito antes para el compuesto 15 dio el compuesto 15a, (62% de rendimiento). RMN H1 5 1,36 (3H, d, J = 7), 1,42 (3H,d,J = 7), 1,93-1,98 (2H,m), 2,40(3H,s), 2,50-2,53 (2H,m), 2,90-2,95 (1H,m), 2,99 (3H,s), 5,14 (1H, q, J= 7), MS: (M + Na) calc.: 288,1, encontrado: 288,1
N2'-Desacetil-N2'-(4-(S)-metilditio-1-oxopentil)maitansina (DM3-SMe, 4g,h): El maitansinol (11) se acoplo con el compuesto 15a, usando DCC y cloruro de cinc en diclorometano, como se ha descrito antes, para la sintesis del compuesto 4c. Se obtuvo una mezcla de 2 diastereoisomeros que llevan el resto N-metil-S-alanilo (4g, S,S) y el resto N-metil-R-alanilo (4h,R,S). Los diastereoisomeros se separaron por HPLC con una columna ciano Kromasil (4,6 mm x 250 mm), usando una elucion isocratica con un caudal de 1 ml/min, con hexano:acetato de etilo:2- propanol (68:24:8, v/v/v). En estas condiciones, el isomero 4g (S,S) eluyo a 24,5 min. Espectro de masas: m/z 834,2 (M + Na)+. El pico para el otro isomero 4h (R,S) se separo bien y eluyo a 34,6 min. MS: m/z 834,2 (M + Na)+.
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EJEMPLO 4
Sintesis del maitansinoide 4k,I (FIG. 3d)
S-1,3-Di-O-p-toluenosulfonil-butano 22: Una solucion de S-(-)-1,3-butanodiol (21,2,00 g, 22,22 mmol) en una mezcla de piridina seca (40 ml) y tolueno seco (60 ml) se trato con cloruro de p-toluenosulfonilo (12,70 g, 66,84 mmol) en atmosfera de argon a 0°C. Despues de agitar a 0°C durante 5 min, seguido de agitacion a temperatura ambiente durante 2 h, la mezcla se evaporo a vaclo. El residuo se volvio a disolver en acetato de etilo, se lavo con solucion acuosa de NaHCO3 0,1 M y solucion saturada de NaCl. La capa organica se separo, se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo. El residuo se purifico por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con acetato de etilo/hexano 1:2 para dar 6,25 g (71%) del producto del tltulo 22 Rf = 0,40 (EtOAc/hexano 1:1); RMN 1H (CDCb) 7,76 (dd, 4H, J = 1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J = 0,4, 8,0 +8,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J = 6,3 Hz); RMN 13C 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06; MS: 420,99 (M + Na)+.
R-4-O-etilxantico-pentanonitrilo (23): Una solucion de S-1,3-di-O-p-toluenosulfonil-butano (22, 6,25 g, 15,70 mmol) en 60 de DMSO seco (50 ml) se trato con NaCN (0,85 g). La mezcla de reaccion se agito en atmosfera de argon durante 18 h a t.a. Despues, la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo, se lavo secuencialmente con NaH2PO4 1,0 M frlo a pH 7,5, agua, NaH2PO4 1,0 M a pH 4,0. La capa organica se seco sobre MgSO4, se filtro y se evaporo para dar 3,62 g de S-3-O-p-toluenosulfonil-pentanonitrilo bruto. El producto se uso directamente sin mas purificacion.
A una solucion de S-3-O-p-toluenosulfonil-pentanonitrilo bruto (3,62 g) en etanol (50 ml) se anadio O-etilxantato de potasio (5,72 g) en etanol (100 ml). Despues de agitar en atmosfera de argon durante la noche, la mezcla se concentro, se diluyo con acetato de etilo, y se filtro a traves de una columna corta de gel de sllice. El eluyente se concentro y el residuo se purifico por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con EtOAc/hexano 1:4, para dar 2,0 g (62%, 2 etapas) del producto del tltulo 23. Rf = 0,40 (EtAc/hexano1:4). RMN 1H (CDCla) 4,67 (dd, 2H, J = 7,1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J = 7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H J = 7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H); RMN 13C 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M + Na)+, 242,51 (M + K)+.
Acido R-(-)-4-metilditio-pentanoico (24): Una solucion de R-4-O-etilxantico-pentanonitrilo (23, 2,0 g, 9,85 mmol) en una mezcla de etanol (10 ml) y 200 ml de agua se trato con NaOH (6,0 g). La mezcla de reaccion se calento a reflujo durante la noche en atmosfera de argon. La mezcla se diluyo con agua (150 ml) y se extrajo con EtOAc/hexano 1:1 (2 x 100 ml). La capa acuosa se acidifico con H3PO4 hasta pH 2,5 ~ 3,0 y se extrajo con EtOAc (6 x 75 ml). Las capas organicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad para dar el acido R-4-mercaptopentanoico bruto. Este producto bruto se uso directamente para la siguiente etapa sin mas purificacion.
A una solucion de 1,60 g del acido R-4-mercaptopentanoico bruto en una mezcla de etanol (50 ml) y NaH2PO4 0,5 M, a pH 7,0 (75 ml), se anadio gota a gota metanotiolsulfonato de metilo (1,96 g, 15,53 mmol) en THF seco (7 ml) a lo largo de 45 min a 0°C. La mezcla de reaccion se agito en atmosfera de argon a 0°C durante 30 min y despues a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se concentro y se extrajo con diclorometano (2 x 50 ml). La capa acuosa se acidifico con H3PO4 hasta pH 2,5 ~ 3,0 y se extrajo con EtOAc (4 x 100 ml). Las capas organicas se combinaron, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se evaporaron. El residuo se purifico por cromatografla en gel de sllice, eluyendo con HOAc/EtOAc/hexano 1:100:400 para dar 1,65 g (93%) del producto del tltulo 24. Rf = 0,32 (HOAc/EtOAc/hexano 1:100:400); RMN 1H (CDCla) 2,91 (ddd, 1H, J = 6,8, 13,7, 20,4 Hz), 2,53 (t, 2H, J = 7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,96 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz); RMN 13C 179,46, 45,67, 31,91, 31,07, 25,02, 21,36; MS: 202,9 (M+Na)+, 203,9 (M+1+Na)+; [a] = -39,16 (c = 2, CH3OH).
N-Metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxopentil]-S-alanina (15b): El acido R-(+)-4-metilditio-pentanoico (24) se convirtio en el ester de N-hidroxisuccinimdilo 25, por el metodo descrito antes para el compuesto 14. La reaccion con N-metil-L- alanina por el procedimiento descrito antes para el compuesto 15 dio el compuesto 15b. MS: m/z (M + Na): calc.: 288,1, encontrado: 288,1
N2'-Desacetil-N2'-(4-(R)-metilditio-1-oxopentil)maitansina (DM3-SMe, 4k,l): El maitansinol (11) se acoplo con el compuesto 15b, usando DCC y cloruro de cinc en diclorometano, como se ha descrito antes para la sintesis del compuesto 4c. Se obtuvo una mezcla de 2 diastereoisomeros que llevan el resto N-metil-S-alanilo (4k, S,R) y el resto N-metil-R-alanilo (41, R,R). Los diastereoisomeros se separaron por HPLC con una columna ciano Kromasil (4,6 mm x 250 mm), usando una elucion isocratica con un caudal de 1 ml/min, con hexano:acetato de etilo:2- propanol (68:24:8, v/v/v). En estas condiciones, el isomero 4k (S,R) eluyo a 23,9 min. Espectro de masas: m/z 834,2 (M + Na)+. El pico para el otro isomero 4l (R,R) se separo bien y eluyo a 33,7 min. MS: m/z 834,2 (M + Na)+.
EJEMPLO 5a
Citotoxicidad in vitro de maitansinoides y conjugados de anticuerpo-maitansinoide
La linea celular KB (ATCC CCl-17) es de origen epitelial humano. La linea celular SK-BR-3 (ATCC HTB-30) se establecio a partir de un adenocarcinoma de mama humano. Las lineas celulares de tumor de colon humano COLO
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205 (ATCC CCL-222) y HT-29 (ATCC HTB 38), la ilnea celular de melanoma humano A-375 (ATCC CRL 1619), la llnea de celulas de linfoma de Burkitt Ramos (ATCC CRL-1596) y la llnea celular de leucemia mieloide humana HL- 60 (ATCC CCL-240) se obtuvieron todas de ATCC, Maryland. Las llneas celulares se desarrollaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Biowhittaker, Walkersville, MD) con L-glutamina complementado con suero bovino fetal al 10% (Hyclone, Logan, Utah) y sulfato de gentamicina 50 pg/ml (Life Technologies, Rockville, MD). Las celulas se mantuvieron a 36-37,5°C en una atmosfera humidificada que contenla CO2 al 6%.
El estudio de citotoxicidad llevado a cabo usaba un ensayo clonogenico. Las llneas celulares de ensayo se sembraron en discos de cultivo de 6 pocillos con un numero constante de 1000 celulas por pocillo. Las celulas se incubaron con diferentes concentraciones (de 0 a 3 nM) de diferentes maitansinoides (libres o conjugados con anticuerpos) durante 72 horas. Despues el medio se aspiro de las placas y se reemplazo por medio de nueva aportacion. Los cultivos se dejaron crecer y formar colonias, durante un total de 7-10 dlas despues de la siembra. Despues los cultivos se fijaron y tineron con violeta cristal al 0,2% en formalina/PBS al 10% y se contaron las colonias. La eficacia de la siembra de celulas no tratadas (medio solo) se determino dividiendo el numero de colonias contadas entre el numero de celulas sembradas. La fraccion de supervivencia de las celulas expuestas a los farmacos se determino dividiendo el numero de colonias en pocillos que se expusieron al farmaco entre el numero de colonias en los pocillos de control.
Los resultados de las mediciones de citotoxicidad in vitro de los nuevos maitansinoides de la presente invention se muestran en la figura 4. Los nuevos maitansinoides 4c,e que llevan enlaces disulfuro impedidos son muy citotoxicos contra las llneas celulares ensayadas, SK-BR-3 y A-375, con valores de CI50 en el intervalo de 7 x 10-12 M a 2,5 x 1011 M. Por lo tanto, la incorporation de los sustituyentes alquilo en el carbono que lleva el resto disulfuro ha conservado una alta potencia citotoxica. El maitansinoide que contiene tiol con impedimento esterico 4a de la presente invencion es de 30 a 50 veces mas potente que el correspondiente maitansinoide no impedido 1 descrito previamente. Por lo tanto, la incorporacion de sustituyentes alquilo en el atomo de carbono que lleva el resto tiol aumenta mucho la potencia.
Los resultados de los ensayos in vitro de los conjugados de anticuerpo de los maitansinoides de la presente invencion se muestran en las figuras 4c y 4d. La union de los dos nuevos maitansinoides, 4a o 4b, al anticuerpo huC242 dirigido contra tumores de colon humano, produjo la muerte especlfica de antlgeno de las celulas diana. Por lo tanto, los conjugados son muy potentes frente a celulas COLO 205 positivas para el antlgeno, con valores de CI50 en el intervalo de 1,1 a 1,3 x 10-11 M. En cambio, los conjugados son de 100 a 200 veces menos citotoxicos frente a celulas A-375 negativas para el antlgeno, demostrando que los nuevos maitansinoides de la presente invencion producen conjugados que tienen enlaces disulfuro con impedimento esterico, y presentan alta citotoxicidad especlfica de la diana.
EJEMPLO 5b
Preparacion de conjugados citotoxicos del anticuerpo huC242 usando los maitansinoides 4a o 4b (Metodo A, FIG. 5 a,b)
Una solution del anticuerpo huC242 (8 mg/ml) en tampon acuoso (fosfato potasico 50 mM, cloruro sodico 50 mM, sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico 2 mM), pH 6,5, se incubo durante 2 h con un exceso molar de 7 a 10 veces de SPDP [3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo, 3a), o con 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB, 3b). La mezcla de reaction se purifico por paso a traves de una columna de filtration de gel Sephadex G25. La concentration del anticuerpo se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo £280nm = 217.560 M-1cm-1.
El anticuerpo modificado se diluyo a 2,5 mg/ml en tampon acuoso (fosfato potasico 50 mM, cloruro sodico 50 mM, sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico 2 mM), pH 6,5, y despues se trato con un exceso molar de 1,5 a 2,5 veces de DM3 o DM4 en dimetilacetamida (la concentracion final de DMA era 3% en v/v). La mezcla de reaccion se incubo durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se purifico por paso a traves de una columna de filtracion de gel Sephadex G25. La concentracion del conjugado se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo £280nm = 217.560 M-1 cm' y £252nm = 80.062 M'1cm'1; para DM3 o DM4, £280nm = 5.700 M-1cm-1 y £252nM = 26.790 M-1cm-1. El conjugado resultante era monomero y contenla, como media, 3,2-3,5 moleculas de DM3 o DM4 unidas por molecula de anticuerpo.
EJEMPLO 5c
Preparacion de conjugados citotoxicos del anticuerpo huC242 usando los maitansinoides 4a o 4b (Metodo B, FIG. 5c)
Una solucion del anticuerpo huC242 (8 mg/ml) en tampon acuoso (fosfato potasico 50 mM, cloruro sodico 50 mM, sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico 2 mM), pH 6,5, se incubo durante 2 h con un exceso molar de 7 a 10 veces de SMCC [4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, 26). La mezcla de reaccion se purifico por paso a traves de una columna de filtracion de gel Sephadex G25. La concentracion del anticuerpo se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo £280nm = 217.560 M-1cm-1.
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El anticuerpo modificado se diluyo a 2,5 mg/ml en tampon acuoso (fosfato potasico 50 mM, cloruro sodico 50 mM, sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico 2 mM), pH 6,5, y despues se trato con un exceso molar de 1,5 a 2,5 veces de DM3 o DM4 en dimetilacetamida (la concentracion final de DMA era 3% en v/v). La mezcla de reaccion se incubo durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se purifico por paso a traves de una columna de filtracion de gel Sephadex G25. La concentracion del conjugado se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos (para el anticuerpo £280nm = 217.560 M-1 cm' y £252nm = 80.062 M'1cm'1; para DM3 o DM4, £280nm = 5.700 M 1cm 1 y £252nM = 26.790 M 1cm 1). El conjugado resultante era monomero y contenla, como media, 3,2-3,5 moleculas de DM3 o DM4 unidas por molecula de anticuerpo.
EJEMPLO 5d
Preparacion de conjugados citotoxicos del anticuerpo huC242 usando los maitansinoides 4a o 4b (Metodo C, FIG. 5d)
Una solucion del anticuerpo huC242 (8 mg/ml) en tampon acuoso (fosfato potasico 50 mM, cloruro sodico 50 mM, sal disodica del acido etilendiaminotetraacetico 2 mM), pH 6,5, se incubo durante 2 h con un exceso molar de 7 a 10 veces con SIAB [(4-yodoacetil)aminobenzoato de N-succinimidilo, 27). La mezcla de reaccion se purifico por paso a traves de una columna de filtracion de gel Sephadex G25. La concentracion del anticuerpo se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo £280nm = 217.560 M-1cm-1.
EJEMPLO 6
Eficacia in vivo de conjugados de huC242-maitansinoide contra xenoinjertos de HT-29.
Se inoculo en ratones SCID hembra de 5 semanas de edad (20 animales) por via subcutanea en el costado derecho, celulas de carcinoma de colon humano HT-29 (1,5 x 106 celulas/raton) en 0,1 ml de medio exento de suero. Los tumores se desarrollaron durante 11 dlas hasta un tamano medio de 100 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (5 animales por grupo). El primer grupo recibio el conjugado huC242-DM1 (DM1 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El segundo grupo recibio el conjugado huC242- DM3 (DM3 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El tercero recibio el conjugado huC242-DM4 (DM4 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5), mientras que un cuarto grupo de animales servla como control y recibio PBS usando el mismo esquema de tratamiento que en los grupos 1-3.
Los tamanos de los tumores se midieron dos veces por semana y los volumenes tumorales se calcularon con la siguiente formula: volumen tumoral = ^(longitud x anchura x altura). El peso de los animales tambien se midio dos veces por semana. Los resultados se muestran en la figura 7. Los tumores en el grupo de control de ratones crecieron hasta un tamano de cerca de 1000 mm3 en 35 dlas. El tratamiento con huC242-DM1 produjo un retraso del crecimiento tumoral de 18 dlas, mientras que los conjugados hechos con los maitansinoides 4a y 4b de la presente invencion eran significativamente mas eficaces y prolongaron el retraso del crecimiento tumoral a 28 dlas y 36 dlas, respectivamente.
EJEMPLO 7
Eficacia in vivo de conjugados de huC242-maitansinoide contra xenoinjertos de COLO 205.
Se inoculo en ratones SCID hembra de 5 semanas de edad (20 animales) por via subcutanea en el costado derecho, celulas de carcinoma de colon humano COLO 205 (1,5 x 106 celulas/raton) en 0,1 ml de medio exento de suero. Los tumores se desarrollaron durante 11 dlas hasta un tamano medio de 100 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (5 animales por grupo). El primer grupo recibio el conjugado huC242-DM1 (DM1 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El segundo grupo recibio el conjugado huC242- DM3 (DM3 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El tercer grupo recibio el conjugado huC242-DM4 (DM4 dosis de 75 pg/kg, una vez al dla x 5), mientras que un cuarto grupo de animales servla como control y recibio PBS usando el mismo esquema de tratamiento que en los grupos 1-3.
Los tamanos de los tumores se midieron dos veces por semana y los volumenes tumorales se calcularon con la siguiente formula: volumen tumoral = ^(longitud x anchura x altura). El peso de los animales tambien se midio dos veces por semana. Los resultados se muestran en la Figura 8. Los tumores en el grupo de control de ratones crecieron hasta un tamano de cerca de 900 mm3 en 24 dlas. El tratamiento con huC242-DM1 produjo un retraso del crecimiento tumoral de 20 dlas, mientras que el conjugado hecho con el maitansinoide 4a de la presente invencion era considerablemente mas eficaz y produjo remisiones tumorales completas que duraban 45 dlas. El tratamiento con el conjugado hecho con el maitansinoide 4b de la presente invencion era incluso mas eficaz, produciendo curas de todos los animales tratados.
EJEMPLO 8
Eficacia in vivo de conjugados de MY9-6-maitansinoide contra xenoinjertos de HL-60
Se inoculo en ratones SCID hembra de 5 semanas de edad (20 animales) por via subcutanea en el costado derecho, celulas de leucemia mieloide humana HL-60 (1,5 x 106 celulas/raton) en 0,1 ml de medio exento de suero. 5 Los tumores se desarrollaron durante 12 dlas hasta un tamano medio de 100 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (5 animales por grupo). El primer grupo recibio el conjugado MY9-6-DM1 (DM1 dosis de 200 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El segundo grupo recibio el conjugado MY9-6-DM3 (DM3 dosis de 200 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa. El tercer grupo recibio el conjugado MY9-6-DM4 (DM4 dosis de 200 pg/kg, una vez al dla x 5) administrado por via intravenosa, mientras que un cuarto 10 grupo de animales servla como control y recibio PBS usando el mismo esquema de tratamiento que en los grupos 13.
Los tamanos de los tumores se midieron dos veces por semana y los volumenes tumorales se calcularon con la siguiente formula: volumen tumoral = ^(longitud x anchura x altura). El peso de los animales tambien se midio dos veces por semana. Los resultados se muestran en la Figura 9. Los tumores en el grupo de control de ratones 15 crecieron rapidamente hasta un tamano de cerca de 1600 mm3 en 21 dlas. El tratamiento con MY9-6-DM1 produjo un retraso del crecimiento tumoral de aproximadamente 5 dlas, mientras que los conjugados hechos con los maitansinoides 4a y 4b de la presente invencion eran significativamente mas eficaces prolongando el retraso del crecimiento tumoral a mas de 20 dlas.
EJEMPLO 9
20 Preparacion de un conjugado citotoxico de anticuerpo huMy9-6 usando el maitansinoide DM4 (4b).
Una solucion del anticuerpo huMy9-6 en una concentracion de 8 mg/ml se incubo durante 2 h con un exceso molar de 6,5 veces de SSNPB [4-(5'-nitro-2'-piridilditio)butirato de sulfosuccinimidilo] en tampon de fosfato potasico 50 mM, pH 6,5, que contenla acido etilendiaminotetraacetico 2 mM (tampon A) con 5% de etanol. El anticuerpo modificado se purifico por paso a traves de una columna de filtracion en gel Sephadex G25 equilbrada en tampon A y la 25 concentracion del anticuerpo purificado se determino por espectrofotometrla usando el coeficiente de extincion para el anticuerpo a 280 nm. El anticuerpo modificado se diluyo a 4,9 mg/ml con tampon A y se incubo durante 18 h a temperatura ambiente con un exceso molar de 1,7 veces de DM4, que se anadio a la mezcla de reaccion como una solucion madre en dimetilacetamida (la concentracion final de la dimetilacetamida era 3% en v/v). El conjugado de anticuerpo-farmaco se purifico por paso a traves de una columna Sephadex G25 equilibrada en PBS, a pH 6,5. La 30 concentracion del conjugado se determino espectrofotometricamente usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo y DM4 (para el anticuerpo, £280nm = 206.460 M'1cm'1, £252nm = 72.261 M'1cm'1; para DM4, £280nm = 5.700 M'1cm_1, £252nM = 26.790 M'1cm_1). El conjugado de anticuerpo-farmaco resultante contenla una media de 3,6 moleculas de DM4 por molecula de anticuerpo. El analisis bioqulmico demostro que el anticuerpo permanecla mas de 94% monomerico despues de conjugacion y tenia una afinidad de union comparable al anticuerpo no modificado, 35 determinado por citometria de flujo. La cantidad de farmaco asociada con el anticuerpo que no se habia unido de forma covalente (farmaco libre) se determino por analisis de HPLC y se encontro que era menos de 1% del farmaco total unido.
EJEMPLO 10
Selectividad y eficacia in vitro del conjugado huMy9-6-DM4
40 La citotoxicidad de huMy9-6-DM4 contra celulas que expresan CD33 (HL-60) y celulas Namalwa negativas para CD33 se ensayo usando un ensayo clonogenico, donde la actividad citolitica se determina cuantificando el numero de colonias que pueden crecer despues de tratamiento. huMy9-6-DM4 presenta potente actividad citolitica contra celulas tumorales humanas HL-60 positivas para CD33 (figura 10). No se observo toxicidad significativa contra celulas Namalwa humanas negativas para CD33, indicando que la citotoxicidad dependiente de CD33 era debida a 45 la localizacion especifica por el anticuerpo anti-CD33, huMy9-6 del conjugado.
EJEMPLO 11
Eficacia in vivo de conjugados huMy9-6-DM4 contra xenoinjertos de tumor humano HL60 en ratones SCID
La eficacia de huMy9-6-DM4 in vivo se determino en ratones SCID que llevaban xenoinjertos de tumor HL-60 humano. Se inyectaron celulas HL-60 por via subcutanea y se dejo que los tumores crecieran hasta un tamano 50 medio de 100 mm3. El conjugado HuMy9-6-DM4 se suministro por via i.v. una vez al dia durante 5 dias con la dosis indicada en la figura 11. La dosis se expresa como pg de DM4 en el conjugado, que corresponde a una dosis de anticuerpo de aproximadamente 67 pg por pg de DM4. El volumen tumoral se midio como una indicacion de la eficacia del tratamiento y se vigilo el peso corporal de los ratones para indicar la toxicidad debida al tratamiento. huMy9-6-DM4 induce retraso del crecimiento tumoral prolongado de xenoinjertos de celulas HL-60 humanas con 55 dosis que producen poca toxicidad (figura 11). La eficacia de huMy9-6-DM4 tambien se comparo con la de huMy9-6- DM1. Inesperadamente se encontro que huMy9-6-DM4 era mas eficaz que huMy9-6-DM1. HuMy9-6-DM4 mantuvo a
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los animales en remision completa (RC) durante casi sesenta dlas, mientras que los animales tratados con huMy9-6- DM1 recayeron despues de aproximadamente 20 dlas en RC.
EJEMPLO 12
Preparacion de un conjugado citotoxico de anticuerpo huB4 usando el maitansinoide DM4 (4b).
Una solucion del anticuerpo huB4 en una concentracion de 20 mg/ml se incubo durante 1,5 h con un exceso molar de 8 veces de SSNPB [4-(5'-nitro-2'-piridilditio)butirato de sulfosuccinimidilo] en tampon de fosfato potasico 50 mM, a pH 6,5, que contenla acido etilendiaminotetraacetico 2 mM (tampon A) con 5% de dimetiacetamida. El anticuerpo modificado se purifico por paso a traves de una columna de filtracion en gel Sephadex G25 equilibrada en tampon A y la concentracion del anticuerpo purificado se determino por espectrofotometrla usando el coeficiente de extincion para el anticuerpo a 280 nm (199.560 M'1cm_1). El anticuerpo modificado se diluyo a 8 mg/ml con tampon A y se incubo durante 3 h a temperatura ambiente con un exceso molar de 1,7 veces de DM4, que se anadio a la mezcla de reaccion como una solucion madre en dimetilacetamida (la concentracion final de la dimetilacetamida era 3% en v/v). El conjugado de anticuerpo-farmaco se purifico por paso a traves de una columna Sephadex G25 y una columna Sephadex S300, ambas equilibradas en tampon de PBS, pH 6,5. La concentracion del conjugado se determino por espectrofotometrla usando los coeficientes de extincion conocidos para el anticuerpo (£280nm: 199.560 M'1cm'1; £252nm: 67.850 M'1cm'1) y DM4 (£280nm = 5.700 M'1cm'1, £252nM = 26.790 M'1cm'1). El conjugado de anticuerpo- farmaco resultante contenla una media de 4,0 moleculas de DM4 por molecula de anticuerpo. El analisis bioqulmico demostro que el anticuerpo permanecla mas de 98% monomerico despues de conjugacion y tenia una afinidad de union comparable al anticuerpo no modificado, determinado por citometria de flujo. La cantidad de farmaco asociada con el anticuerpo que no se habia unido de forma covalente (farmaco libre) se determino por analisis de HPLC y era aproximadamente 2% del farmaco total unido.
EJEMPLO 13
Selectividad y eficacia del conjugado huB4-DM4 in vitro
La citotoxicidad de huB4-DM4 contra celulas que expresan CD19 (Ramos) comparado con una linea celular negativa para CD19 (Colo 205) se ensayo usando un ensayo basado en MTT, donde la actividad citolitica se determina cuantificando el numero de celulas viables que permanecen despues de tratamiento con conjugado. El numero de celulas viables se determina por cuantificacion espectrofotometrica despues de incubacion de las celulas con colorante vital MTT. HuB4-DM4 presenta una potente actividad citolitica contra celulas tumorales humanas Ramos positivas para CD19 in vitro (figura 12). No se observo una toxicidad significativa contra celulas negativas para CD19, indicando que la citotoxicidad dependiente de CD19 se debia a la localization especifica por el anticuerpo anti-CD19, huB4.
EJEMPLO 14
Eficacia in vivo del conjugado huB4-DM4 contra xenoinjertos de tumores humanos Ramos en ratones SCID
La eficacia de huB-DM4 in vivo se determino usando ratones SCID que llevaban xenoinjertos de tumores Ramos humanos establecidos. Se inyectaron celulas Ramos por via subcutanea y se dejo que los tumores crecieran hasta un tamano medio de 100 mm3. El conjugado HuB4-DM4 se suministro por via i.v. como una sola inyeccion con la dosis indicada en la figura 13a. La dosis se expresa como pg de DM4 en el conjugado, que corresponde a una dosis de anticuerpo de aproximadamente 44 pg por pg de DM4. El volumen tumoral se midio como una indication de la eficacia del tratamiento y se vigilo el peso corporal para indicar toxicidad debida al tratamiento. Con dosis superiores a 50 pg/kg, HuB4-DM4 produce remision completa de los tumores en todos los animales. Los animales permanecieron sin enfermedad medible durante aproximadamente 35 dlas en el grupo de tratamiento de 100 mg/kg, y durante mas de 55 dlas en los dos grupos de dosis mayores. Estos tratamientos produjeron muy poca toxicidad, si produjeron alguna (figura 13b) considerado por cambios en el peso corporal de los animales tratados.

Claims (42)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula 4:
    imagen1
    en donde Y es (CH2)2CRiR2SZ, en donde:
    5 R1 es metilo y R2 es H o R1 y R2 son metilo; y Z es H o -SCHs.
  2. 2. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde Ri es metilo, R2 es H y Z es H.
  3. 3. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde R1 y R2 son metilo y Z es H.
  4. 4. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde R1 es metilo, R2 es H y Z es -SCH3.
    10 5. El compuesto de la reivindicacion 1, en donde R1 y R2 son metilo y Z es -SCH3.
  5. 6. Un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas, en donde el maitansinoide se representa por la formula 4i:
    imagen2
    en donde:
    15 Y1 representa (CH2)2CR1R2S-,
    en donde R1 y R2 son como se definen en la reivindicacion 1.
  6. 7. El conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas de la reivindicacion 6, en donde
  7. 8. El conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas de la reivindicacion 6, en donde
  8. 9. Un metodo de esterificacion de maitansinol para dar un maitansinoide de formula 42:
    R1 es metilo y R2 es H. R1 y R2 son metilo.
    5
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    15
    imagen3
    comprendiendo dicho metodo hacer reaccionar el maitansinol de la estructura 11 en el C-3:
    imagen4
    con un compuesto de formula (III-L) o (III-D,L):
    imagen5
    en donde:
    Y2 representa (CH2)2CRiR2SZ2, en donde:
    Ri es metilo y R2 es H o Ri y R2 son metilo; y
    Z2 es SR o -COR, en donde R es alquilo o alquenilo lineal que tiene de 1 a 10 atomos de carbono, alquilo o alquenilo ramificado o clclico que tiene de 3 a 10 atomos de carbono, o arilo simple o sustituido o radical aromatico heteroclclico o heterocicloalquilo.
  9. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en donde el compuesto de formula (III) se representa por la formula (III-L).
  10. 11. El metodo de la reivindicacion 9, en donde R1 es metilo y R2 es H.
  11. 12. El metodo de la reivindicacion 9, en donde dicho compuesto de formula (III-L) es N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1- oxo-pentil]-S-alanina (15a(S,S)), N-metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15b(S,R)) o una mezcla de 15a(S,S) y 15b(S,R).
  12. 13. El metodo de la reivindicacion 9, en donde el compuesto de formula (III-D,L) es la N-metil-N-[4-metilditio-1-oxo- pentil]-alanina (15), en donde la N-metilalanina es racemica y en donde el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S.
  13. 14. El metodo de la reivindicacion 12, en donde dicha mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R) se hace por un procedimiento que comprende:
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    (1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el acido 4- metilditio-pentanoico (compuesto 13);
    (2) convertir el compuesto 13 en 4-metilditio-pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (compuesto 14); y
    (3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metil-L-alanina para dar dicha mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R).
  14. 15. El metodo de la reivindicacion 12, en donde dicho compuesto 15a(S,S) se hace por un metodo que comprende:
    (1) convertir el (R)-1,3-butanodiol en acido (S)-4-(metilditio)pentanoico 19;
    (2) convertir el compuesto 19 en (S)-4-(metilditio)pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (compuesto 20); y
    (3) hacer reaccionar el compuesto 20 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15a(S,S).
  15. 16. El metodo de la reivindicacion 12, en donde dicho compuesto 15b(S,R) se hace por un metodo que comprende:
    (1) convertir el (S)-1,3-butanodiol en acido (R)-4-(metilditio)pentanoico 24;
    (2) convertir el compuesto 24 en (R)-4-(metilditio)pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (compuesto 25); y
    (3) hacer reaccionar el compuesto 25 con N-metil-L-alanina para dar dicho compuesto 15b(S,R).
  16. 17. El metodo de la reivindicacion 13, en donde dicho compuesto de formula (III-D,L) se hace por un procedimiento que comprende:
    (1) hacer reaccionar el acido 4-mercaptopentanoico (12) con metanotiolsulfonato de metilo para dar el acido 4- metilditio-pentanoico (compuesto 13);
    (2) convertir el compuesto 13 en 4-metilditio-pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (compuesto 14);
    (3) hacer reaccionar el compuesto 14 con N-metilalanina racemica para dar dicho compuesto de formula (III-D,L).
  17. 18. El metodo de la reivindicacion 9, en donde R1 y R2 son metilo.
  18. 19. El metodo de la reivindicacion 9, en donde dicho compuesto de formula (III-L) es la N-metil-N-(4-metil-4- metilditio-1-oxo-pentil)-L-alanina (compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina).
  19. 20. El metodo de la reivindicacion 9, en donde dicho compuesto de formula (III-D,L) es la N-metil N-(4-metil-4- metilditio-1-oxo-pentil)-D,L-alanina (compuesto 10 que contiene N-metil-alanina racemica).
  20. 21. El metodo de una cualquiera de la reivindicacion 19 o reivindicacion 20, en donde dicho compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica se hace por un procedimiento que comprende:
    (1) hacer reaccionar el sulfuro de isobutileno (5) con el anion del acetonitrilo para dar el 4-mercapto-4-metil- pentanonitrilo (compuesto 6);
    (2) hidrolizar el compuesto 6 para dar el acido 4-mercapto-4-metilpentanoico (compuesto 7);
    (3) convertir el compuesto 7 en acido 4-metil-4-(metilditio)pentanoico (compuesto 8) por reaccion con metanotiolsulfonato de metilo;
    (4) convertir el compuesto 8 en 4-metil-4-(metilditio)pentanoato de N-hidroxisuccinimidilo (compuesto 9); y
    (5) hacer reaccionar el compuesto 9 con N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica para dar dicho compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica.
  21. 22. El metodo para hacer un maitansinoide de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 20, que ademas comprende separar los diastereoisomeros, si estan presentes, y purificar el maitansinoide por HPLC en sllice con ciano unido.
  22. 23. Un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para usar en un metodo de tratamiento que comprende administrar a un sujeto que necesite tratamiento, una cantidad eficaz de dicho conjugado, o una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables.
  23. 24. Un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para usar en un metodo para tratar un tumor maligno, una enfermedad autoinmunitaria, un rechazo de injerto, enfermedad de injerto contra huesped, una infeccion vlrica o una infeccion parasitaria.
  24. 25. El conjugado para usar de la reivindicacion 24, en donde el metodo es de tratamiento de un tumor.
  25. 26. El conjugado para usar de la reivindicacion 24, en donde el metodo es de tratamiento de cancer de pulmon, mama, colon, prostata, rinon, pancreas, ovario u organos linfati cos.
  26. 27. Uso de un conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la fabricacion de un medicamento para usar en un metodo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26.
  27. 28. Un compuesto de formula (III-L) o (III-D,L) como se define en la reivindicacion 9.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  28. 29. El compuesto de la reivindicacion 28, que es la N-metil-N-(4-metil-4-metilditio-1-oxo-pentil)-L-alanina (10 (S)) o N-metil-N-(4-metil-4-metilditio-1-oxo-pentil)-D,L-alanina (racemica 10).
  29. 30. El compuesto de la reivindicacion 28, que es una mezcla de N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina y N-metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R)).
  30. 31. El compuesto de la reivindicacion 28, que es la N-metil-N-[4-metilditio-1-oxo-pentil]-alanina (15), en donde la N- metilalanina es racemica y en donde el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S.
  31. 32. El compuesto de la reivindicacion 28, que es la N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15a(S,S)).
  32. 33. El compuesto de la reivindicacion 28, que es la N-metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15b(S,R)).
  33. 34. Un metodo para hacer el compuesto 10 que contiene N-metil-L-alanina o N-metilalanina racemica, como se define en la reivindicacion 19 o reivindicacion 20, por un procedimiento como se define en la reivindicacion 21.
  34. 35. Un metodo para hacer una mezcla de compuestos 15a(S,S) y 15b(S,R), como se define en la reivindicacion 12, por un procedimiento como se define en la reivindicacion 14.
  35. 36. Un metodo para hacer la N-metil-N-[4-metilditio-1-oxo-pentil]-alanina (15), en donde la N-metilalanina es racemica y en donde el centro de carbono que lleva el atomo de azufre es racemico o de quiralidad R o S, por un procedimiento como se define en la reivindicacion 17.
  36. 37. Un metodo para hacer la N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15a(S,S)) por un procedimiento como se define en la reivindicacion 15.
  37. 38. Un metodo para hacer la N-metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxo-pentil]-S-alanina (15b(S,R)) por un procedimiento como se define en la reivindicacion 16.
  38. 39. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, una de sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, y un vehlculo, diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable.
  39. 40. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 39, que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que ademas comprende un anticuerpo.
  40. 41. Un metodo para inducir la muerte celular en poblaciones de celulas seleccionadas in vitro o ex vivo, que comprende poner en contacto celulas diana o tejido que contiene celulas diana con una cantidad eficaz del conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
  41. 42. El metodo de la reivindicacion 41, en donde el conjugado se representa por la siguiente formula:
    imagen6
    en donde w es una media de 1-10.
  42. 43. Un metodo para hacer un conjugado de maitansinoide-agente de union a celulas, comprendiendo dicho metodo hacer reaccionar un maitansinoide purificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con un agente de union a celulas, en donde dicho agente de union a celulas comprende un grupo ditio reactivo.
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