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ES2558987T3 - Insulinas prolongadas con péptidos - Google Patents

Insulinas prolongadas con péptidos Download PDF

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ES2558987T3
ES2558987T3 ES07847083.8T ES07847083T ES2558987T3 ES 2558987 T3 ES2558987 T3 ES 2558987T3 ES 07847083 T ES07847083 T ES 07847083T ES 2558987 T3 ES2558987 T3 ES 2558987T3
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ES
Spain
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insulin
prolonged
amino acid
formulation
human insulin
Prior art date
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Active
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ES07847083.8T
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English (en)
Inventor
Thomas HØEG-JENSEN
Thomas Børglum KJELDSEN
Jan Markussen
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract

Una insulina prolongada en donde una insulina se fija a uno o a varios residuos de oligómero de aminoácidos que contienen al menos 5 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos 10 residuos de aminoácidos y no más de 800 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 300 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 50 residuos de aminoácidos, mediante un enlace amida, preferiblemente a través de un enlace peptídico.

Description

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ción en la solución del nebulizador. Dispositivos tales como los inhaladores dosificadores pueden producir concentraciones de aerosol más elevadas, y pueden actuar durante períodos más cortos para administrar la cantidad deseada de una insulina prolongada de esta invención. Dispositivos tales como inhaladores de polvos, administran el agente activo hasta que una carga dada de agente es expulsada del dispositivo. En este tipo de inhalador, la cantidad de una insulina prolongada de esta invención en una cantidad dada de polvo, determina la dosis administrada en una sola administración.
El tamaño de partícula de una insulina prolongada de esta invención en la formulación suministrada por el dispositivo de inhalación, es decisivo con respecto a la capacidad de la insulina para llegar a los pulmones, y preferentemente a las vías respiratorias inferiores o alveolos. Preferiblemente, la insulina prolongada de esta invención se formula de manera que al menos aproximadamente 10% de la insulina de esta invención administrada se deposite en el pulmón, preferiblemente aproximadamente 10 a aproximadamente 20% o más. Se sabe que la eficacia máxima del depósito pulmonar para los seres humanos con respiración por la boca se obtiene con tamaños de partícula de aproximadamente 2 µm a aproximadamente 3 µm. Cuando los tamaños de partícula son superiores a aproximadamente 5 µm, el depósito pulmonar disminuye sustancialmente. Los tamaños de partícula inferiores a aproximadamente 1 µm causan una disminución del depósito pulmonar, y se vuelve difícil administrar partículas con masa suficiente para que sean terapéuticamente eficaces. Por lo tanto, las partículas de una insulina prolongada de esta invención administradas por inhalación tienen un tamaño de partícula preferiblemente inferior a aproximadamente 10 µm, más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 5 µm. La formulación de una insulina prolongada de esta invención se selecciona para obtener el tamaño de partícula deseado en el dispositivo de inhalación elegido.
Ventajosamente para la administración como polvo seco, los compuestos de esta invención se preparan en forma de partículas con un tamaño de partícula de menos de aproximadamente 10 µm, preferiblemente de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 5 µm. El tamaño de partícula preferido es eficaz para la administración en los alvéolos de los pulmones del paciente. Preferiblemente, el polvo seco está compuesto en gran parte de partículas producidas de modo que una mayoría de las partículas tengan un tamaño en el intervalo deseado. Ventajosamente, al menos aproximadamente 50% del polvo seco está formado a base de partículas que tienen un diámetro menor de aproximadamente 10 µm. Tales formulaciones se pueden conseguir por secado con pulverización, molienda o condensación del punto crítico de una solución que contiene una insulina prolongada de esta invención y otros ingredientes deseados. Otros métodos también adecuados para generar partículas útiles en la presente invención, son conocidos en la técnica.
Las partículas normalmente se separan de una formulación de polvo seco en un recipiente y después se transportan al pulmón de un paciente a través de una corriente de aire portador. Típicamente, en los inhaladores de polvo seco actuales, la fuerza para separar el sólido es suministrada exclusivamente por la inhalación del paciente. Un inhalador de polvo seco adecuado es el Turbohaler® fabricado por Astra (Sødertalje, Suecia). En otro tipo de inhalador, el flujo de aire generado por la inhalación del paciente activa un motor impulsor que desaglomera las partículas de análogo de insulina monomérica. El inhalador Dura Spiros® es un dispositivo de este tipo.
Las formulaciones de una insulina prolongada de esta invención para la administración desde un inhalador de polvo seco incluyen típicamente un polvo seco finamente dividido que contiene una insulina prolongada de esta invención, pero el polvo también pueden incluir un agente de carga, un vehículo, un excipiente, otro aditivo o similares. Los aditivos pueden incluirse en una formulación de polvo seco de una insulina prolongada de esta invención, por ejemplo, para diluir el polvo según sea necesario para la administración desde el inhalador de polvo particular, para facilitar el procesamiento de la formulación, para proporcionar propiedades ventajosas del polvo a la formulación, para facilitar la dispersión del polvo desde el dispositivo de inhalación, para estabilizar la formulación (por ejemplo, antioxidantes o tampones), para proporcionar sabor a la formulación o similares. Ventajosamente, el aditivo no afecta negativamente a las vías respiratorias del paciente. La insulina de esta invención se puede mezclar con un aditivo a nivel molecular o la formulación sólida puede incluir partículas de una insulina prolongada de esta invención, mezcladas o recubiertas sobre las partículas del aditivo. Los aditivos típicos incluyen monosacáridos, disacáridos y polisacáridos; alcoholes de azúcar y otros polioles, tales como, por ejemplo, lactosa, glucosa, rafinosa, melecitosa, lactitol, maltitol, trehalosa, sacarosa, manitol, almidón o combinaciones de los mismos; tensioactivos, tales como sorbitoles, difosfatidilcolina o lecitina; o similares. Típicamente un aditivo, tal como un agente de carga, está presente en una cantidad eficaz para un fin descrito anteriormente, con frecuencia en aproximadamente 50% a aproximadamente 90% en peso de la formulación. Agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína, tal como una proteína de análogo de insulina, también se pueden incluir en la formulación.
Un pulverizador que incluye una insulina prolongada de esta invención se puede producir impulsando una suspensión o solución de una insulina prolongada de esta invención a través de una boquilla a baja presión. El tamaño de la boquilla y la configuración, la presión aplicada y la tasa de alimentación de líquido se pueden seleccionar para lograr la salida y el tamaño de partícula deseados. Un electropulverizador se puede producir, por ejemplo, con un campo eléctrico en conexión con una alimentación capilar o por boquilla. Ventajosamente, las partículas de una insulina prolongada de esta invención administradas con un pulverizador tienen un tamaño de partícula inferior a aproximadamente 10 µm, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1 µm a aproximadamente 5 µm.
Las formulaciones de una insulina prolongada de esta invención adecuadas para uso con un pulverizador, incluyen
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seleccionar para estabilizar la insulina prolongada de esta invención como una suspensión en el propelente, para proteger el agente activo frente a la degradación química y similares. Los tensioactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán, lecitina de soja, ácido oleico o similares. En algunos casos, se prefieren aerosoles en solución que emplean disolventes tales como etanol. Agentes adicionales conocidos en la técnica para la formulación de una proteína tal como una proteína del análogo de insulina, también se pueden incluir en la formulación.
Un experto en la técnica reconocerá que los métodos de la presente invención pueden lograrse mediante una administración pulmonar de una insulina prolongada de esta invención a través de dispositivos no descritos en el presente documento.
La presente invención también describe una composición farmacéutica o una formulación que incluye una insulina prolongada de esta invención y que es adecuada para la administración por inhalación. De acuerdo con la invención, una insulina prolongada de esta invención se puede utilizar para la preparación de una formulación o un medicamento adecuado para la administración por inhalación. La invención también describe métodos para la preparación de formulaciones que incluyen una insulina prolongada de esta invención en una forma que es adecuada para la administración por inhalación. Por ejemplo, una formulación en polvo seco se puede preparar de varias maneras, usando técnicas convencionales. Las partículas en el intervalo de tamaño apropiado para un depósito máximo en el tracto respiratorio inferior, se pueden obtener mediante micronización, molienda, secado por pulverización o similares. Y una formulación líquida se puede preparar disolviendo una insulina prolongada de esta invención en un disolvente adecuado, tal como agua, a un pH apropiado, incluyendo tampones u otros excipientes.
Por lo tanto, en una realización, esta invención describe un método para administrar una insulina prolongada de esta invención que comprende administrar una cantidad eficaz de dicho compuesto a un paciente que lo requiere, por medios pulmonares; y, preferiblemente, dicho compuesto es inhalado por la boca de dicho paciente.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende una insulina prolongada de acuerdo con la presente invención que está presente en una concentración de 0,1 mg/ml a 500 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender además uno o varios inhibidores de proteasas, un sistema de tampón, conservantes, agentes de tonicidad, agentes quelantes, estabilizadores y tensioactivos. En una realización de la invención, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Tal formulación es normalmente una solución o una suspensión. En una realización adicional de la invención, la formulación farmacéutica es una solución acuosa. La expresión "formulación acuosa" se define como una formulación que comprende al menos 50% (peso/peso) de agua. Asimismo, la expresión "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos 50% (peso/peso) de agua, y la expresión "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos 50% (peso/peso) de agua.
En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden disolventes y/o diluyentes antes del uso.
En otra realización, la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, seca por congelación o seca por aspersión) lista para el uso sin ninguna disolución previa.
En un aspecto adicional, la invención describe una formulación farmacéutica que comprende una solución acuosa de una insulina prolongada de la presente invención y un tampón, en donde dicha insulina prolongada está presente en una concentración de 0,1 mg/ml o superior, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.
Las formulaciones destinadas a uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido, y tales formulaciones pueden contener uno o varios agentes seleccionados a partir del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elaboradas y agradables al paladar. Los comprimidos pueden contener el ingrediente activo en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la preparación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como manitol, maltodextrina, caolín, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina, polímeros o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración o la liberación del polipéptido terapéuticamente activo.
Las formulaciones administrables por vía oral de la presente invención se pueden preparar y administrar de acuerdo con métodos bien conocidos en la química farmacéutica, véase Remington Pharmaceutical Sciences, 17ª ed. (A. Osol compilador, 1985).
En un aspecto de la invención, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por medio de formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. Los comprimidos se pueden preparar mediante granulación en húmedo, mediante granulación en seco, por compresión directa o granulación por fusión.
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Para ser más precisos, esta invención también describe las siguientes realizaciones:
a) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la insulina prolongada de esta invención se administra a las vías respiratorias inferiores del paciente.
b) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la insulina prolongada de esta invención se deposita en los alvéolos.
c) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la insulina prolongada de esta invención se administra como una formulación farmacéutica que comprende la insulina prolongada de esta invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
d) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación se selecciona a partir del grupo que consiste en una solución en un medio acuoso y una suspensión en un medio no acuoso.
e) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación se administra en forma de aerosol.
f) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación está en forma de un polvo seco.
g) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación tiene un tamaño de partícula de menos de aproximadamente 10 micras.
h) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 micras.
i) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la formulación tiene un tamaño de partícula de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 micras.
j) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que al menos aproximadamente 10% de la insulina prolongada de esta invención administrada, se deposita en el pulmón.
k) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la insulina prolongada de esta invención se administra desde un dispositivo de inhalación adecuado para la administración pulmonar y es capaz de depositar el análogo de insulina en los pulmones del paciente.
l) El método tal y como se describe en esta memoria, en donde el dispositivo se selecciona a partir del grupo que consiste en un nebulizador, un inhalador dosificador, un inhalador de polvo seco y un pulverizador.
m) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que el dispositivo es un inhalador de polvo seco.
n) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que el dispositivo es un nebulizador.
o) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que el dispositivo es un inhalador dosificador.
p) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que el dispositivo es un pulverizador.
q) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que el accionamiento del dispositivo administra desde aproximadamente 3 µg/kg a aproximadamente 20 µg/kg de una insulina prolongada de esta invención, preferiblemente desde aproximadamente 7 µg/kg a aproximadamente 14 µg/kg de una insulina prolongada de esta invención.
r) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que dicha insulina prolongada de esta invención es cualquiera de los compuestos mencionados específicamente en cualquiera de los ejemplos de esta memoria.
s) Un método tal y como se describe en esta memoria, para tratar la diabetes que comprende administrar una dosis eficaz de una insulina prolongada de esta invención a un paciente que requiere la misma, por medios pulmonares.
t) El método tal y como se describe en esta memoria, en el que la insulina prolongada de esta invención es cualquiera de las insulinas prolongadas específicas de esta invención, mencionadas específicamente en este documento, especialmente en los ejemplos específicos de este documento.
A pesar de que las realizaciones anteriores se describen en esta memoria específicamente en relación con un método, se aplican análogamente al producto o a la formulación que se va a utilizar.
Características preferidas de esta invención
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Resumiendo, las características de esta invención son las siguientes:
1.
Una insulina prolongada que es un residuo de insulina (como se ha definido anteriormente) fijado a uno o a varios residuos de oligómeros de aminoácidos que contienen al menos 5 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos y no más de 800 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 300 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 100 residuos de aminoácidos, preferiblemente no más de 50 residuos de aminoácidos, mediante un enlace amida, preferiblemente mediante un enlace peptídico.
2.
La insulina prolongada del párrafo anterior, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos se compone de residuos de aminoácidos codificables.
3.
La insulina prolongada del párrafo anterior, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos no contiene un residuo de lisina.
4.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos se compone de residuos de aminoácidos elegidos entre el grupo que consiste en los residuos Gly, Glu, Pro y Ser. Estos residuos de aminoácidos pueden ser iguales o diferentes y pueden estar dispuestos en cualquier orden.
5.
La insulina prolongada del párrafo anterior, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos se compone de residuos Gly.
6.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde la cantidad de residuos Gly en el residuo de oligómero de aminoácidos es de al menos un 80% (peso/peso).
7.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde la cantidad de residuos Gly en el residuo de oligómero de aminoácidos es de al menos un 80% (en número).
8.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde la cantidad de residuos Gly en el oligómero de aminoácidos es de al menos un 85% (en número).
9.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde la cantidad de residuos Gly en el residuo de oligómero de aminoácidos es de al menos un 90% (en número).
10.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde la cantidad de residuos Gly en el residuo de oligómero de aminoácidos es de al menos un 95% (en número).
11.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos es (Gly)n, (Gly-Pro-Pro)n, (Pro-Pro-Gly)n, (Gly-Ser)n, (Ser-Gly)n, (Gly-Glu)n o (Glu-Gly)n, en donde n es un número entero que indica el número apropiado de residuos de aminoácidos.
12.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos está fijado a un residuo de aminoácido en una de las posiciones B1, A21, B29 o B30 de la insulina, siempre que dicho aminoácido esté en una posición terminal antes de la fijación del residuo de oligómero. Si el aminoácido en dicha posición B1, A21, B29 o B30 no está en una posición terminal, el residuo de oligómero de aminoácidos se fija a un residuo de aminoácido en una de las posiciones B0, B(-1), A22, A23, B31 o B32 de la insulina.
13.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde cualquier oligómero fijado al extremo C-terminal de la cadena B termina con un residuo de arginina.
14.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de oligómero de aminoácidos está fijado a un residuo de aminoácido en una de las posiciones B29 o B30 de la insulina, con la condición de que dicho aminoácido esté en una posición terminal antes de la fijación del oligómero y en donde dicho oligómero termina con un residuo de arginina.
15.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de insulina contiene no más de 51 residuos de aminoácidos.
16.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de insulina es insulina humana que tiene una o varias de las siguientes modificaciones opcionales: A14: E o D; A21: G, A
o Q; B3: Q, S o T; B25: H; B28: D o E; B30: des (es decir, desB30).
17.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde el residuo de insulina es un residuo de insulina humana, insulina humana desB30, insulina aspart, insulina humana A21 Gly, insulina humana A21 Gly desB30, Lispro o glulisina.
18.
La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, en donde solamente se fija un
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solo residuo de oligómero al residuo de insulina.
19. La insulina prolongada de cualquiera de los párrafos anteriores posibles, excepto el último, en donde se fijan exactamente dos residuos de oligómero al residuo de insulina.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, pero no como una limitación.
Procedimientos generales:
Construcción de vectores de expresión, transformación de las células de levadura y expresión de los precursores de insulina de la invención
Todos los plásmidos de expresión son del tipo C-POT, similares a los descritos en el documento EP 171142, que se caracterizan porque contienen el gen de la triosa fosfato isomerasa (POT) de Schizosaccharomyces pombe con el fin de seleccionar y estabilizar plásmidos en S. cerevisiae. Los plásmidos también contienen el promotor y terminador de la triosa fosfato isomerasa de S. cerevisiae. Estas secuencias son similares a las secuencias correspondientes en el plásmido pKFN1003 (descrito en el documento WO 90/10075) ya que todas son secuencias, excepto la secuencia del fragmento EcoRI-XbaI, que codifican la proteína de fusión del líder y el producto de insulina. Con el fin de expresar diferentes proteínas de fusión, el fragmento EcoRI-XbaI de pKFN1003 se sustituye simplemente por un fragmento EcoRI-XbaI que codifica la fusión líder-insulina de interés. Tales fragmentos EcoRI-XbaI se pueden sintetizar usando oligonucleótidos sintéticos y PCR según técnicas convencionales.
Los transformantes de levadura se prepararon por transformación de la cepa hospedadora de S. cerevisiae MT663 (MATa/MATα pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+). La cepa de levadura MT663 se depositó en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen” en conexión con la presentación del documento WO 92/11378 y recibió el número de depósito DSM 6278.
MT663 creció sobre YPGaL (1% de extracto de levadura Bacto, 2% de Bacto peptona, 2% de galactosa, 1% de lactato) hasta una D.O. a 600 nm de 0,6. Se recogieron 100 ml de cultivo mediante centrifugación, se lavaron con 10 ml de agua, se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en 10 ml de una solución que contenía sorbitol 1,2 M, Na2EDTA 25 mM pH = 8,0 y 6,7 mg/ml de ditiotreitol. La suspensión se incubó a 30°C durante 15 minutos, se centrifugó y las células se resuspendieron en 10 ml de una solución que contenía sorbitol 1,2 M, Na2EDTA 10 mM, citrato de sodio 0,1 M, pH 0 5,8, y 2 mg de Novozym®234. La suspensión se incubó a 30°C durante 30 minutos, las células se recogieron por centrifugación, se lavaron en 10 ml de sorbitol 1,2 M y 10 ml de CAS (sorbitol 1,2 M, CaCl210 mM, Tris HCl 10 mM (pH = 7,5) y se resuspendieron en 2 ml de CAS. Para la transformación, 1 ml de células suspendidas en CAS se mezcló con aprox. 0,1 mg de ADN de plásmido y se dejó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió 1 ml de (20% de polietilenglicol 4000, CaCl2 10 mM, Tris HCl 10 mM, pH = 7,5) y se dejó la mezcla durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugó y el sedimento se resuspendió en 0,1 ml de SOS (sorbitol 1,2 M, 33% v/v de YPD, CaCl2 6,7 mM) y se incubó a 30°C durante 2 horas. A continuación, la suspensión se centrifugó y el sedimento se resuspendió en 0,5 ml de sorbitol 1,2 M. A continuación, se añadieron 6 ml de agar superior (el medio SC de Sherman et al. (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory) que contenían sorbitol 1,2 M más 2,5% de agar) a 52°C y la suspensión se vertió en la parte superior de placas que contenían el mismo medio de agar solidificado, que contenía sorbitol. La cepa MT663 de S. cerevisiae transformada con los plásmidos de expresión, se cultivó en YPD durante 72 horas a 30°C.
Los precursores de insulina prolongada (precursores de cadena sencilla) tienen la siguiente prolongación del extremo N-terminal de la cadena B: EEAEAEAPK y contienen el siguiente péptido C: DGK.
El precursor de insulina prolongada se convirtió en el análogo correspondiente de insulina desB30 de cadena doble, a través de una proteasa específica de lisina (ALP) de Achromobacter lyticus, inmovilizada sobre Sefarosa (EC 3.4.21.50). Para cada precursor de análogo de insulina, se transfirieron 3 ml de material sobrenadante del cultivo de levadura a un nuevo tubo y se añadieron 666 µl de ALP, disueltos en NaHCO3 0,2 M pH 9,1. La solución tenía un valor de pH de aproximadamente 8,1, que está dentro del intervalo de pH óptimo para la enzima y la mezcla se incubó durante 1,5 h bajo agitación suave.
Producción, purificación y caracterización de las insulinas prolongadas de la invención
Se produjeron una variedad de precursores de insulina tal y como se ha descrito anteriormente y se aislaron del medio de cultivo y se purificaron.
Estas insulinas prolongadas se sometieron a ensayo para estudiar la actividad biológica de la insulina tal y como se mide mediante la afinidad de la unión al receptor de insulina humana con respecto a la de la insulina humana, tal y como se describe a continuación. Puede ser una ventaja evaluar las afinidades de unión de las insulinas antes de la purificación. Esto se puede realizar sometiendo a ensayo los sobrenadantes del cultivo.
Las insulinas prolongadas de esta invención se pueden purificar mediante el empleo de uno o varios de los siguientes procedimientos que son típicos en la técnica. Estos procedimientos -si es necesario -pueden estar modificados con respecto a los gradientes, pH, sales, concentraciones, flujo, columnas y así sucesivamente. Dependiendo de
factores tales como el perfil de impurezas, la solubilidad de las insulinas en cuestión, etcétera, estas modificaciones pueden ser fácilmente reconocidas y realizadas por una persona experta en la técnica.
Después de la HPLC ácida o el desalado, los compuestos se aíslan por liofilización de las fracciones puras.
Después de la HPLC neutra o la cromatografía de intercambio aniónico, los compuestos se desalan, se precipitan a 5 pH isoeléctrico o se purifican mediante HPLC ácida.
Procedimientos de purificación típicos:
El sistema de HPLC es un sistema Gilson que consiste en lo siguiente: Modelo 215 Liquid Handler, bomba modelo 322-H2 y detector modelo 155 UV. La detección se realiza típicamente a 210 nm y 280 nm.
El sistema FPLC purificador Äkta (Amersham Biosciences) consiste en lo siguiente: bomba modelo P-900, detector
10 modelo UV-900 UV, modelo de pH pH/C-900 y detector de la conductividad, colector de fracciones modelo Frac-950. La detección de UV se realiza típicamente a 214 nm, 254 nm y 276 nm.
HPLC ácida:
Columna: Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
Caudal: 8 ml/min,
Tampón A: 0,1% de TFA en acetonitrilo Tampón B: 0,1% de TFA en agua.
15 Gradiente: 0,0 -5,0 min: 10% de A
5,00 -30,0 min: 10% de A hasta 90% A
30,0-35,0 min: 90% de A
35,0-40,0 min: 100% de A
HPLC neutra:
Columna: Phenomenex, Jupiter, C4 5 μm 250 x 10,00 mm, 300 Å
Caudal: 6 ml/min
Tampón A: TRIS 5 mM, (NH4)2SO4 7,5 mM, pH = 7,3, 20% de CH3CN Tampón B: 60% de CH3CN, 40% de agua Gradiente: 0-5 min: 10% de B,
5-35 minutos: 10-60% de B
35-39 min: 60% de B,
39-40 min: 70% de B
40-43,5 min: 70% de B
20 Cromatografía de intercambio aniónico:
Columna: RessourceQ, 6 ml
Caudal: 6 ml/min
Tampón A: 0,09% de NH4HCO3, 0,25% de NH4OAc, 42,5% de etanol pH 8,4 Tampón B: 0,09% de NH4HCO3, 2,5% de NH4OAc, 42,5% de etanol pH 8,4 Gradiente: 100% de A hasta 100% de B durante 30 volúmenes de columna
Desalación:
Columna:
HiPrep 26/10
Caudal:
10 ml/min, 6 volúmenes/columna
Tampón:
NH4HCO3 10 mM
Las siguientes insulinas de la invención se han preparado como se ha descrito anteriormente:
Ejemplo 1.
Insulina humana A22-27G desB30
imagen8
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 6048,8, Calculado: 6050.
Ejemplo 2.
Insulina humana A22-33G desB30
imagen9
10 Precursor de cadena sencilla DGK: MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7628, Calculado: 7629. Ejemplo 3. Insulina humana A22-39G desB30
imagen10
15 MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 6765, Calculado: 6734.
Ejemplo 4.
Insulina humana A22-45G desB30
imagen11
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7074, Calculado: 7075. 20 Ejemplo 5.
Insulina humana A21Q A22-39[GPP]6 desB30
imagen12
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7228, Calculado: 7228.
Ejemplo 6.
Insulina humana A21Q A22-39[GS]9 desB30
imagen13
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7017, Calculado: 7017.
Ejemplo 7.
Insulina humana A21Q A22-39[GE]9 desB30
imagen14
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7394, Calculado: 7395. 10 Ejemplo 8.
Insulina humana A21Q, A22-A45G, desB30
imagen15
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7060, Calculado: 7090.
Ejemplo 9.
15 Insulina humana A21Q, A22-A51G, desB30
imagen16
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7433, Calculado: 7432.
Ejemplo 10.
Insulina humana A21Q, A22-A57G, desB30
imagen17
MALDI-MS (matriz: ácido sinapínico); m/z: 7774, Calculado: 7774.
Ejemplo 11.
Insulina humana A21Q, A22-A45G, B(-6)-(-1G), desB30
imagen18
imagen19
5
15
25
35
45
55
insulina humana A21 Q A22-51G desB30 insulina humana A21 Q A22-57G desB30 insulina humana A21 Q A22-61G desB30
insulina humana A14E A21 G A22-27G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-33G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-39G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-45G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-51G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-57G B25H desB30 insulina humana A14E A21 G A22-61G B25H desB30
insulina humana A14E A21 Q A22-27G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-33G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-39G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-45G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-51G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-57G B25H desB30 insulina humana A14E A21 Q A22-61G B25H desB30
insulina humana A21G A22-39[GPP]6 desB30 insulina humana A14E, A21 G A22-39[GPP]6 B25H, desB30 insulina humana A21G A22-39[GPP]9 desB30 insulina humana A14E, A21 G A22-39[GPP]9 B25H, desB30 insulina humana A21G A22-39[GS]9 desB30
insulina humana A14E, A21 G A22-39[GS]9 B25H, desB30 insulina humana A21G A22-39[GE]9 desB30 insulina humana A14E, A21 G A22-39[GE]9 B25H, desB30 insulina humana A14E, A21Q, A22-39[GPP]6 B25H, desB30 insulina humana A21Q, A22-39[GPP]9 desB30 insulina humana A14E, A21Q A22-39[GPP]9 B25H, desB30 insulina humana A21Q, A22-39[GS]9 desB30 insulina humana A14E, A21Q, A22-39[GS]9 B25H, desB30 insulina humana A21Q, A22-39[GE]9 desB30 insulina humana A14E, A21Q, A22-39[GE]9 B25H, desB30
Ejemplo 21.
El resultado de la instilación intratraqueal en ratas de gotas de insulina del ejemplo 8 anterior, se proporciona en la Fig. 1.
Métodos farmacológicos
Ensayo (I)
Unión al receptor de insulina de las insulinas de la invención.
La afinidad de las insulinas de la invención hacia el receptor de la insulina humana se puede determinar mediante un ensayo de captura de anticuerpos en placa de microtitulación con ensayo SPA (ensayo de proximidad del centelleo). Se mezclan perlas que se unen a anticuerpo SPA-PVT, reactivo anti-ratón (Amersham Biosciences, nº de Cat. PRNQ0017) con 25 ml de tampón de unión (HEPES 100 mM pH 7,8; cloruro de sodio 100 mM, MgSO4 10 mM, 0,025% de Tween-20). La mezcla de reactivos para una sola Optiplaca de Packard (Packard nº 6005190) se compone de 2,4 µl de un receptor de insulina humana recombinante purificado, diluido 1:5000 -(menos) exón 11, una cantidad de una solución madre de insulina humana A14 Tyr[125I] correspondiente a 5000 cpm por cada 100 µl de mezcla de reactivos, 12 µl de una dilución 1:1000 de anticuerpo F12, 3 ml de perlas de SPA y tampón de unión hasta un total de 12 ml. A continuación se añade un total de 100 µl y se realiza una serie de diluciones a partir de muestras apropiadas. A la serie de diluciones se añaden entonces 100 µl de mezcla de reactivos y las muestras se incuban durante 16 horas con agitación suave. Las fases se separan después por centrifugación durante 1 min y se hace un recuento de las placas en un Top-counter. Los datos de la unión se ajustan utilizando el algoritmo de regresión no lineal en GraphPad Prism 2.01 (programa informático GraphPad, San Diego, CA).
Nº de Ejemplo
Unión relativa al receptor de insulina
1
44%
2
41%
Nº de Ejemplo
Unión relativa al receptor de insulina
3
30%
4
25%
8
14%
9
17%
10
20%
11
14%
12
16%
13
13%
14
10%
15
11%
16
7,2%
17
12%
18
12%
19
14%
20
2%
Ensayo (II)
Potencia de las insulinas de la invención con relación a la insulina humana.
Ratas Wistar se utilizan para someter a ensayo la eficacia de la reducción de la glucosa en sangre de las insulinas 5 de la invención, después de una administración en bolo i.v. Después de la administración de cualquiera de las insulinas de la invención o la insulina humana, se controla la concentración de glucosa en la sangre
Ensayo (III)
Determinación en cerdos del T50% de las insulinas de la invención.
T50% es el tiempo transcurrido hasta que desaparece el 50% de un derivado de insulina que se va a someter a ensa10 yo, marcado con A14 Tyr(125I), desde el sitio de la inyección, tal como se mide con un contador γ externo
Se siguen los principios de cuidado de animales de laboratorio, se emplean cerdos hembra no diabéticos, LYYD exentos de patógenos, específicos, cruce de razas Landrace Danesa, Yorkshire y Duroc (Holmenlund, Haarloev, Dinamarca) para estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos. Los cerdos están conscientes, tienen 4-5 meses de edad y pesan de 70-95 kg. Los animales se mantienen en ayunas durante una noche, 18 h antes del experimento.
15 Las preparaciones formuladas de insulinas prolongadas marcadas en TyrA14 con 125I se inyectan por vía sc. en cerdos tal y como se ha descrito anteriormente (Ribel, U., Jørgensen, K, Brange, J, y Henriksen, U. The pig as a model for subcutaneous insulin absorption in man. Serrano-Rios, M y Lefèbvre, P. J. 891-896. 1985. Amsterdam; Nueva York; Oxford, Elsevier Science Publishers. 1985 (Conference Proceeding)).
Al principio de los experimentos, se inyecta una dosis 60 nmol de la insulina prolongada de acuerdo con la invención
20 (compuesto de prueba) y una dosis 60 nmol de insulina (ambas marcadas con 125I en TyrA14) en dos sitios distintos en el cuello de cada cerdo.
La desaparición del marcador radiactivo del sitio de la inyección sc. se controla usando una modificación del método de recuento gamma externo tradicional (Ribel, U. Subcutaneous absorption of insulin analogues. Berger, M. y Gries,
F. A. 70-77 (1993). Stuttgart; Nueva York, Georg Thime Verlag (Conference Proceeding)). Con este método modifi
25 cado es posible medir continuamente la desaparición de la radiactividad de un depósito subcutáneo durante varios días, utilizando un dispositivo portátil inalámbrico (Scancys Laboratorieteknik, Værløse, DK-3500, Dinamarca). Las mediciones se realizan a intervalos de 1 min, y el recuento de valores se corrige para la actividad de fondo.
Ensayo (IV)
Administración pulmonar de insulinas prolongadas a ratas
30 La sustancia del ensayo se administrará en una dosis por vía pulmonar a través del método de instilación de gotas.

Claims (1)

  1. imagen1
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