ES2557577T3 - Preparación de polímeros con impronta molecular - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación de un polímero con impronta molecular ("MIP") en forma de solución o suspensión coloidal de partículas de MIP, que comprende las etapas de: (a) suministro de una sustancia de soporte que tiene un material molde inmovilizado sobre la misma para que quede expuesto a una superficie; (b) suministro de una composición polimerizable en contacto con dicha superficie; (c) realización de una polimerización controlada de dicha composición polimerizable en contacto con dicha superficie, terminándose dicha polimerización cuando se hayan formado partículas de MIP capaces de formar una solución o una suspensión coloidal; y (d) separación de dichas partículas de MIP de dicha superficie.
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DESCRIPCION
Preparacion de pollmeros con impronta molecular Campo tecnico
La presente invencion se refiere al campo de la slntesis organica y de la qulmica de pollmeros, y en particular al area relacionada con la metodologla para la preparacion de moleculas organicas mediante slntesis dirigida por molde y polimerizacion por molde.
Antecedentes en la tecnica
El termino "slntesis dirigida por molde" incluye la formacion de una nueva sustancia mediante modificacion qulmica de un sustrato, o mediante el acoplamiento de dos o mas moleculas en presencia de un molde que sirve como patron para la formacion de una nueva estructura. El ejemplo mas conocido de este proceso es la transcripcion genica. Un ejemplo particular de slntesis dirigida por molde es la polimerizacion por molde, en la que se produce la formacion de un receptor polimerico (replica) en presencia de otro pollmero o sustancia organica de bajo peso molecular (molde). Antes de iniciar la polimerizacion, y durante la polimerizacion, los monomeros se distribuyen espacialmente (proceso de auto-ensamblaje) en torno a las moleculas del molde segun el tamano, la polaridad y funcionalidad del molde. Los monomeros se polimerizan en cadenas lineales o redes tridimensionales rlgidas. Un ejemplo especlfico de polimerizacion por molde es la impronta molecular, basada en la polimerizacion de monomeros vinllicos o acrllicos en presencia de un molde (vease referencia 1, 2). El enfoque tradicional supone la produccion de pollmeros con impronta muy reticulados, que son insolubles en disolventes acuosos y organicos. Debido a su insolubilidad inherente, se restringe la posibilidad de usar pollmeros con impronta molecular (MIP) en farmacologla y medicina.
Recientemente, se han acometido varios intentos para desarrollar protocolos para la preparacion de pollmeros con impronta con pesos moleculares relativamente bajos que pudieran existir en formas solubles o al menos coloidales. Este formato permitira el uso de pollmeros como moleculas biologicamente activas (farmacos, efectores, moduladores, inhibidores) en farmacologla y medicina, en forma de "anticuerpos plasticos", sustituyendo moleculas biologicas en sensores y en la separacion por afinidad y como catalizadores con propiedades de tipo enzimatica.
En uno de esos ejemplos, se sintetizaron moleculas de MIP mediante policondensacion de aminoacidos y nucleotidos en torno a un receptor biologico, enzima, acido nucleico, celula, virus, microorganismo, muestra de tejido o farmaco (vease patente de Estados Unidos 6.852.818). En otro ejemplo, se usaron diferentes metodos para producir MIP polimericos y oligomericos (vease patente de Estados Unidos 6.127.154). La mayorla de los ejemplos de la tecnica anterior describen la preparacion de pollmeros reticulados de alto peso molecular que requieren su hidrolisis para proporcionar partlculas solubles o coloidales estables en solucion. En uno de esos ejemplos (vease patente de Estados Unidos 6.127.154) los investigadores usaron compuestos disenados especlficamente que contienen grupos fotoactivos de perfluorofenilazido capaces de acoplarse despues de iluminarlos. En este caso se podrlan sintetizar ligandos de afinidad en forma de partlculas solubles. En todos estos casos, los compuestos sintetizados comprenden una serie de fracciones con tamanos y propiedades mal controlados. Otros enfoques para la slntesis de moleculas con actividad biologica se describen en los documentos WO 96/40822 y en la patente de Estados Unidos 5.630.978, en los que se prepararon compuestos qulmicos en presencia de un pollmero con impronta por molde, que a su vez se preparo en presencia de otro molde, normalmente un farmaco tal como heparina. La replica resultante es una molecula ligando que no tiene afinidad por el molde y en lugar de eso se asemeja a la estructura de la propia molecula del farmaco original.
Una de las formas de producir nanopartlculas es mediante el uso de condensacion controlada o polimerizacion "viva" de radicales aditivos. Las tecnicas de polimerizacion viva de radicales libres, tales como la polimerizacion con iniferter, polimerizacion radicalaria mediada por nitroxido, polimerizacion radicalaria por transferencia de atomos (ATRP) y polimerizacion por transferencia de cadena mediante adicion-fragmentacion reversible (RAFT), abren nuevas vlas para la slntesis de pollmeros con pesos moleculares bajos relativamente controlados (veanse referencias 3-9). Las tecnicas de polimerizacion controlada/viva se basan en un equilibrio delicado entre las especies durmientes y activas que reduce eficazmente la concentracion de unidades de propagacion en el sistema y minimiza el grado de terminacion. La polimerizacion viva podrla estar libre de reacciones secundarias tales como terminacion y transferencia de cadena, y as! puede generar pollmeros con distribuciones de pesos moleculares y estructuras bien definidas. Se puede aplicar el mismo enfoque a la formacion de copollmeros, posibilitando as! la produccion de copollmeros en bloque mediante polimerizacion con radicales libres mediante la secuenciacion correcta de las adiciones monomericas. La polimerizacion viva se ha usado anteriormente en la produccion de MIP injertados en bruto (veanse referencias 10, 11). Tambien se produjeron pollmeros solubles mediante polimerizacion viva y se usaron posteriormente en la produccion de MIP (vease referencia 12). Recientemente se ha usado la polimerizacion viva controlada para la preparacion de nanopartlculas de MIP (13).
Una de las complicaciones en la slntesis de MIP es la necesidad frecuente de usar moldes que son caros y/o diflciles de obtener, tales como protelnas, ciertas toxinas, etc., que son diflciles de recuperar despues de la
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polimerizacion y limitan la cantidad de MIP que se pueden obtener. Idealmente, el molde se debe poder reciclar para superar estas limitaciones. La forma optima de conseguir esto es mediante el uso del molde en forma inmovilizada. El molde inmovilizado se ha usado con anterioridad (vease patente de Estados Unidos 7.393.909). En este caso, el molde se inmovilizo sobre una superficie de sllice y se formo pollmero en los poros en torno a el. Al disolver el soporte de sllice y retirar el molde, se obtienen MIP de diversas morfologlas. En todos los ejemplos desvelados en la patente de Estados Unidos 7.393.909, durante el proceso de disolucion, se pierde la superficie que lleva el molde inmovilizado y no se puede reciclar. En otros ejemplos, se usaron moldes inmovilizados para la produccion de superficies con impronta (patentes de Estados Unidos 6.127.154; Estados Unidos 6.458.599; Estados Unidos 7.288.415). Potencialmente, las superficies que llevan los moldes desveladas en estos documentos se pueden regenerar y usar varias veces mas. Estos enfoques se pueden usar para la produccion de sensores o matrices, pero serla diflcil adaptarlos para la produccion de nanopartlculas o moleculas solubles pequenas.
Otro problema importante adicional asociado a los MIP es la heterogeneidad de los sitios de union producidos, que en general es responsable de los altos niveles de uniones no especlficas. Este problema se ha rectificado mediante la separacion por afinidad de nanopartlculas de MIP producidas por separado en una columna con un molde inmovilizado (13). Es evidente que para que la separacion por afinidad sea posible, los MIP deben estar en una forma adecuada, preferentemente en forma de nanopartlculas.
La presente invencion aborda todos estos problemas relativos al desarrollo de nanopartlculas de MIP reticuladas de alto rendimiento al proponer la combinacion de dos tecnicas: (i) realizar una polimerizacion controlada, opcionalmente una polimerizacion radicalaria controlada, en presencia de una superficie o superficies que llevan un molde inmovilizado para formar nanopartlculas con impronta y (ii) retener las nanopartlculas mediante interaccion por afinidad con el molde inmovilizado para su seleccion y purificacion.
El material de los antecedentes se puede encontrar en las siguientes referencias.
1. Wulff, G. Makromol. Chem. Macromol. Symp., 1993, 70/71,285.
2. Vlatakis, G.; et al. Nature, 1993, 361, 645.
3. Moad, G.; Rizzardo E.; Solomon, D.H. Macromolecules 1982, 15, 909;
4. Matyjaszewski, K.; Xia, J. Chem. Rev. 2001, 101, 2921.
5. Kamigaito, M.; Ando, T.; Sawamoto, M. Chem. Rev. 2001, 101, 3689.
6. Hawker, C: J.; Bosman, A. W.; Harth, E. Chem. Rev. 2001, 101, 3661.
7. Fischer, H. Chem. Rev. 2001, 101, 3581.
8. Otsu, T.; Matsumoto, A. Adv. Polym. Sci. 1998, 136, 75-137.
9. Moad, G.; et al. Polym. Int. 2000, 49, 993-1001.
10. Ruckert, B.; Hall, A. J.; Sellergren B. J. Mater. Sci. 2002, 12, 2275.
11. Hattori, K.; et al. J. Membr. Sci. 2004, 233, 169.
12. Li, Z.; Day, M.; Ding, J. F.; Faid, K. Macromolecules. 2005, 38, 2620.
13. Guerreiro A. R., Chianella I., Piletska E., Whitcombe M. J., Piletsky S. A. (2009). Biosens. Bioelectron., 24, 2740-2743.
14. Jagur-Grodzinski, J. Reactive & Functional Polymers. 2001, 1, 1.
15. Shim, S.E. et al. Macromolecules. 2003, 36, 7994-8000.
16. Yu, Q.; Zeng, F.; Zhu S. Macromolecules. 2005, 34, 1612.
17. Patente de Estados Unidos 7.019.072 - Method of preparing latex for coating paper, 2006.
Patentes citadas
- N.° de patente
- Territorio Fecha de expedicion Tltulo
- US6.852.818
- US 08-Feb-2005 MOLECULARLY IMPRINTED POLYMERS PRODUCED BY TEMPLATE POLYMERIZATION
- US6.127.154
- US 03-Oct-2000 METHODS FOR DIRECT SYNTHESIS OF COMPOUNDS HAVING COMPLEMENTARY STRUCTURE TO A DESIRED MOLECULAR ENTITY AND USE THEREOF
- WO96/40822
- PCT 19-Dic-1996 PREPARATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES BY MOLECULAR IMPRINTING
- US5.630.978
- US 20-May-1997 PREPARATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES BY MOLECULAR IMPRINTING
- US7.393.909
- US 01-Jul-2008 POROUS, MOLECULARLY IMPRINTED POLYMER AND A PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF
- US6.458.599
- US 01-Oct-2002 COMPOSITIONS AND METHODS FOR CAPTURING ISOLATING DETECTING ANALYZING AND QUANTIFYING MACROMOLECULES
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- US7.288.415
- US 30-Oct-2007 COMPOSITIONS AND METHODS FOR CAPTURING
- ISOLATING DETECTING ANALYZING AND QUANTIFYING
- MACROMOLECULES
Divulgacion de la invencion
De acuerdo con la presente invencion se proporciona un proceso para la preparacion de un pollmero con impronta molecular ("MIP") en forma de solucion o suspension coloidal de partlculas de MIP, que comprende las etapas de: (a) suministro de una sustancia de soporte que tiene un material molde inmovilizado sobre la misma para que quede expuesto a una superficie; (b) suministro de una composicion polimerizable en contacto con dicha superficie; (c) realizacion de una polimerizacion controlada de dicha composicion polimerizable en contacto con dicha superficie, dicha polimerizacion que se termina cuando se hayan conformado partlculas de MIP capaces de formar una solucion o suspension coloidal; y (d) separacion de dichas partlculas de MIP de dicha superficie. La suspension coloidal de forma deseable es estable. De forma deseable consta de partlculas finas, por debajo de 1 pm.
La presente invencion supone la aplicacion de una polimerizacion controlada, opcionalmente una polimerizacion radicalaria controlada, realizada en presencia de un molde inmovilizado (convexo) para la produccion de partlculas de MIP reticuladas solubles o coloidales.
Las realizaciones preferidas de la invencion pueden proporcionar uno o mas de los siguientes beneficios:
1. Las nanopartlculas de MIP se pueden sintetizar usando un protocolo automatico (a maquina).
2. Los MIP sintetizados no contienen molde, que permanece unido a la superficie solida.
3. Es posible usar cualquier disolvente durante la preparacion de MIP.
4. El proceso de slntesis, separacion y purificacion de MIP es muy rapido (de minutos a unas pocas horas).
5. El molde no se desperdicia y el proceso de slntesis de MIP se puede repetir varias veces (lo que reduce el coste de preparacion de MIP para moldes caros).
6. Existe la posibilidad de anadir etapas adicionales cuando las partlculas sintetizadas que aun se encuentran sobre el molde inmovilizado se deban funcionalizar adicionalmente, por ejemplo, con la adicion de un marcador fluorescente, o un revestimiento no adhesivo.
7. Existe la posibilidad de controlar el tamano de las partlculas sintetizadas.
8. Existe la posibilidad de fraccionar las nanopartlculas sintetizadas y recoger las fracciones con diferentes afinidades.
En el metodo descrito en el presente documento, los MIP se producen en presencia de un molde inmovilizado usando tecnicas de polimerizacion controlada, opcionalmente polimerizacion radicalaria controlada. Los especialistas familiarizados con la materia conocen diversas tecnicas utiles para la produccion de nanopartlculas mediante polimerizacion controlada. La reaccion de polimerizacion se termina cuando se alcanza la fase en la que el tamano de las moleculas es relativamente pequeno. El producto de dicho proceso puede existir en forma soluble o coloidal estable en solucion o en suspension. Las suspensiones o soluciones coloidales de MIP de acuerdo con esta invencion pueden ser en llquidos acuosos u organicos.
Las moleculas sintetizadas tienen una estructura complementaria a la del molde original y tienen la capacidad de unirse con una afinidad razonablemente elevada. Con el fin de clarificar, en la presente invencion MIP de "alta afinidad" y "alto rendimiento" se definen como aquellos pollmeros con una afinidad que supera la afinidad de los pollmeros blancos correspondientes habituales en al menos tres, preferentemente al menos cinco veces, la designacion de pollmero "blanco" que se refiere al producto del proceso de polimerizacion usado para formar el MIP, realizado en ausencia del molde. Estas moleculas de slntesis (pollmeros y oligomeros) tienen afinidades y especificidades predeterminadas, una actividad superior a pollmeros sintetizados aleatoriamente y se pueden preparar mucho mas facilmente que las estructuras organicas discretas disenadas especlficamente. El proceso de polimerizacion para formar MIP, como se describe en el presente documento, puede ser imperfecto y dar lugar a la formacion tanto de partlculas de alta afinidad como de baja afinidad (formadas, por ejemplo, en solucion en la que el molde no esta presente). Las partlculas de alta afinidad se pueden unir selectivamente (y recuperarse posteriormente) a superficies con el molde inmovilizado, permitiendo que se separen de las partlculas de baja afinidad. Las superficies con el molde inmovilizado pueden ser las mismas superficies que las que se usan en la formacion de los MIP o pueden ser superficies distintas (por ejemplo, contenidas dentro de una columna aparte) con molde inmovilizado. Las superficies mencionadas en el presente documento pueden ser superficies de columnas de afinidad, dispositivos sensores, dispositivos microfluidos, microchips, reactores, cuentas, fibras, pocillos, microplacas, membranas, filtros, colectores, nanoestructuras, veslculas, capsulas, etc. La superficie puede ser solida, semi-solida o llquida o fluida (como en el caso de micelas o interfases). Opcionalmente, las partlculas se pueden seleccionar adicionalmente usando una columna o columnas adicionales, para seleccionar una subfraccion de las partlculas que no posean afinidad por un posible compuesto interferente. Se puede emplear un enfoque similar para seleccionar (una) subfraccion(es) de partlculas que ademas tengan afinidad por uno o mas analogos del molde para producir aglutinantes "selectivos de clase".
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Las moleculas sintetizadas como se describe en esta invencion (dlmeros, oligomeros, pollmeros, y sus mezclas) se pueden usar como farmacos en farmacologla y medicina, como ligandos especlficos de receptor en qulmica analltica (sensores, ensayos), para su separacion en las industrias de biotecnologla, farmaceuticas y alimentarias y como catalizadores en slntesis o como sustitutos para enzimas en ensayos, sensores y otras aplicaciones tales como polvos de lavado. Los esfuerzos previos en el diseno de farmacos normalmente se han basado en la investigation tediosa de relaciones de estructuracion-actividad de un gran numero de estructuras qulmicas. La presente invencion describe un metodo mas simple y mas directo -polimerizacion controlada, opcionalmente polimerizacion radicalaria controlada, para la formation de nanopartlculas de MIP reticuladas en presencia de un molde inmovilizado para disenar una sustancia biologicamente activa, que debe tener un gran beneficio (en comparacion con los metodos de diseno y descubrimiento de farmacos tradicionales) as! como ligandos utiles para la separacion por afinidad, sensores y catalisis.
Aspectos importantes de la invencion incluyen:
(1) . Slntesis de nanopartlculas de MIP reticuladas mediante polimerizacion controlada, opcionalmente polimerizacion radicalaria controlada, en presencia de un molde inmovilizado que puede ser un receptor biologico, un acido nucleico, una celula, espora, virus, microorganismo, muestra de tejido, carbohidrato, oligosacarido, polisacarido, peptido, nucleoprotelna, mucoprotelna, lipoprotelna, protelna sintetica, glicoprotelna, glucosaminoglicano, esteroide, inmunosupresor, hormona, heparina, antibiotico, vitamina, biomarcador de un estado patologico o una enfermedad, toxina, pesticida, herbicida, explosivo, agente nervioso, contaminante, compuesto de alteration endocrina, nucleotido, nucleosido, oligonucleotido, metabolito, metabolito secundario, metabolito farmacologico, farmaco o intermedio de farmaco. No se pretende que esta lista sea limitante sino mas bien representativa de ciertas posibles clases de molde, cuya extension completa entenderan los expertos en la materia.
(2) . Optimization de las condiciones de reaction para generar partlculas con un tamano relativamente pequeno.
(3) . Slntesis de moleculas, incluyendo moleculas biologicamente activas, a partir de monomeros funcionales, que pueden incluir uno o mas de: monomeros vinllicos, monomeros alllicos, acetilenos, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, cloroacrilatos, itaconatos, trifluorometilacrilatos, derivados de aminoacidos, nucleosidos, nucleotidos, y carbohidratos.
(4) . Retention de las partlculas de alta afinidad sintetizadas mediante interacciones de afinidad que tienen lugar sobre la misma superficie con el molde inmovilizado usado para la preparation de MIP o sobre superficies diferentes, que tambien contienen el molde inmovilizado o un analogo del molde.
(5) . Polimerizacion secuencial cuando las partlculas polimericas con impronta retenidas sobre la superficie con el molde inmovilizado se modifican con otros tipos de moleculas para variar las propiedades o funciones de las moleculas sintetizadas.
(6) . La aplicacion de las moleculas sintetizadas como farmacos en farmacologla y medicina, como ligandos especlficos de receptor en qulmica analltica (sensores, ensayos), para la separacion en las industrias de biotecnologla, farmaceuticas y alimentarias o como catalizadores.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 representa un cromatograma de partlculas blancas (control) inyectadas sobre una columna de HPLC empaquetada con partlculas revestidas con molde inmovilizado.
La Figura 2 representa un cromatograma de partlculas de MIP inyectadas sobre una columna de HPLC empaquetada con partlculas revestidas con molde inmovilizado.
La Figura 3 representa la distribution de tamanos de nanopartlculas de MIP por impronta con melamina. Descripcion detallada
Los pollmeros preparados como se describe en la presente invencion se asemejan a efectores (activador, inhibidor o sustrato) del molde, y como tales pueden tener actividad biologica si el molde esta involucrado en un proceso fisiologico o un analogo efectivo de dicha molecula o estructura. Dichos pollmeros se pueden usar, por ejemplo, como farmacos en farmacologla y medicina. Los beneficios derivados de este enfoque son numerosos, e incluyen la posibilidad de reutilizar el molde inmovilizado para la slntesis de MIP, la posibilidad de fraccionar los MIP con partlculas de alta afinidad a partir de partlculas de baja afinidad y monomeros sin reaccionar, la extraction sencilla de los MIP sintetizados a partir del molde, la capacidad de funcionalizar posteriormente los MIP unidos al molde inmovilizado, la capacidad de automatizar completa o parcialmente el proceso de fabrication, etc. Otros beneficios de la invencion seran evidentes para los expertos en la materia.
Especlficamente, en un aspecto la presente invencion se refiere a la slntesis de MIP reticulados mediante polimerizacion controlada, opcionalmente polimerizacion radicalaria viva controlada (LRP); o polimerizacion anionica viva; polimerizacion cationica viva; y policondensacion controlada en presencia de un molde inmovilizado que puede ser un receptor biologico, un acido nucleico, una celula, espora, virus, microorganismo, muestra de tejido, carbohidrato, oligosacarido, polisacarido, peptido, nucleoprotelna, mucoprotelna, lipoprotelna, protelna sintetica, glicoprotelna, glucosaminoglicano, esteroide, hormona, inmunosupresor, heparina, antibiotico, vitamina, biomarcador de un estado patologico o una enfermedad, toxina, pesticida, herbicida, explosivo, agente nervioso, contaminante,
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compuesto de alteracion endocrina, nucleotido, nucleosido, oligonucleotido, metabolito, metabolito secundario, metabolito farmacologico, farmaco o intermedio de farmaco u otra clase de molde conocido por los expertos en la materia. El molde se puede inmovilizar sobre superficies polimericas, de polisacarido o de vidrio, por ejemplo en forma de cuentas, gula de onda, fibras, membranas, o capilares o cualquier otra superficie adecuada para una aplicacion prevista, como saben los expertos en la materia.
La polimerizacion se puede iniciar, por ejemplo, mediante calentamiento, aplicacion de corriente (electropolimerizacion) mediante la adicion de catalizador(es) redox, persulfato o peroxidos, mediante irradiacion, que incluye radiacion gamma y radiacion de microondas o preferentemente mediante irradiacion con luz UV o visible y que normalmente requiere minutos u horas dependiendo de la reactividad de las especies.
La presente invention cubre varias formas diferentes de polimerizacion controlada. Todas ellas se basan en la capacidad para controlar la reaction de adicion o de condensation a un nivel tal que predominantemente se formen nanopartlculas solubles en lugar de capas o redes polimericas continuas. En el ejemplo de iniciadores de la polimerizacion por radicales libres, las moleculas se someten a transformaciones reversibles mediante estlmulos termicos, qulmicos, o fotoqulmicos, transformando reversiblemente las especies durmientes en radicales libres o iones reactivos que pueden actuar como propagadores de la cadena. Para que se aplique esta condition, las constantes de equilibrio de las reacciones deben favorecer la formation de las especies durmientes y deben permitir un intercambio rapido entre las especies durmientes y de propagation. Asl, las concentraciones de las especies de propagation seran muy bajas y su tiempo de residencia sera muy corto, lo que reduce la probabilidad de reacciones secundarias que den lugar a la termination de la cadena polimerica en crecimiento. Algunos ejemplos de polimerizacion viva incluyen, pero en ningun modo estan limitados a: polimerizacion mediada por nitroxido (NMP), polimerizacion radicalaria por transferencia de atomos (ATPR) y polimerizacion por transferencia de cadena mediante adicion-fragmentacion reversible (RAFT). La polimerizacion RAFT se basa en un equilibrio de transferencia de cadena mediante adicion-fragmentacion reversible en el que existe un intercambio entre las especies activas y durmientes. Los radicales generados en la etapa de initiation se propagaran mediante la adicion de monomeros hasta que se encuentre una molecula, capaz de actuar como agente de transferencia de cadena, y a la cual se pueden anadir de forma reversible. En general, el proceso de polimerizacion viva permite el uso de iniferter (iniciador, agente de transferencia, terminador), que opcionalmente se pueden preparar junto con iniciadores convencionales para conferir una naturaleza viva a la polimerizacion. Los iniferter pueden ser foto-iniferter que llevan un grupo ditiocarbamilo o grupos carbono-carbono o azo que llevan iniferter termicos (vease, por ejemplo, referencia 14) u otros tipos de compuestos conocidos por los expertos en la materia. El tipo de iniferter preferidos son aquellos que proporcionan diferentes radicales, un radical carbonados que es reactivo y otro radical menos reactivo, por ejemplo, un radical de ditiocarbamilo. El radical carbonado, que normalmente es un radical bencllico, puede reaccionar con un monomero insaturado para iniciar la polimerizacion. El radical menos reactivo, por ejemplo, radical ditiocarbamilo, puede terminar la polimerizacion al recombinarse con una cadena polimerica en crecimiento, aunque el producto de terminacion se puede disociar adicionalmente en un nuevo radical de propagacion y un terminador en respuesta a la aplicacion continuada del estlmulo, por ejemplo, irradiacion UV (vease, por ejemplo, referencia 15).
Otros compuestos que se pueden usar como iniciadores para diferentes tipos de polimerizacion viva (transferencia atomica, anionica, cationica, etc.), cubiertos por el ambito de la presente invencion incluyen, pero no estan limitados a: 2-bromopropionitrilo con Cu(I)Br complejado con N,N,N',N",N"-pentametildietilentriamina, macroiniciador de bromo poliestireno con Cu(I)Cl/PMDETA; 2-bromoisobutirato de etilo con CuCl/bipiridina; dibromuro de 1,4-bis(2,6- diisopropilfenil)acenaftendiimino nlquel (II); 2,2-dimetoxi-2-fenilacefenona en combination con disulfuro de tetraetiltiouram; tetrafenil bifosfina; peroxidos terciarios tales como peroxido de di-ter-butilo; SmMe(C5Me5)2(THF); epoxidos a base de estireno junto con TiCL; tetramero disodico de metilestireno; MoOCL-n-BuSn-EtOH; HCl/ZnCL; p-toluensulfonato de metilo; 2,10,15,20-tetrafenilporfinato de metilaluminio; 3-metil-1, 1 -difenilpentil litio; butil litio en THF; compuestos de alquilidinmolibdeno; organolantanidos (III) bifuncionales; Mo(CH-t-Bu)(NAr)(OCMe3)2 y Mo(CHCPhMe2)(NAr)(OCMe(CF3)2)2; Hl/h; complejos de Zr, Ti y Hf combinados con metilaluminoxano o boratos de fenilo; complejos de diimida de Pd, Ni, Fe o Co; complejos homogeneos de carbeno de Ta, Ti, Mo, W; complejos metalicos de las tierras raras compuestos de complejos de tipo metaloceno o de tipo no metaloceno; complejos de acetamidato cationico de monociclopentadienil circonio; telomeros fluorados esterificados con uno o dos grupos hidroxilo como iniciadores para la polimerizacion viva mediada por cobre; Yb[C(SiMe3)3]2.
Una ventaja de la polimerizacion viva en contraste con la polimerizacion radicalaria tradicional es que la primera se produce a una baja velocidad y sin autoaceleracion observable, mientras que esta ultima con frecuencia se produce con una fuerte autoaceleracion (vease, por ejemplo, referencia 16). La presente invencion se aprovecha de esto realizando una polimerizacion viva en condiciones que favorecen la formacion de pollmeros con un peso molecular relativamente bajo. Normalmente, la reaccion se detiene en una fase temprana para producir pollmeros con pesos moleculares de entre 500 y 1.000.000 Da.
Se pueden optimizar las condiciones de la reaccion para generar partlculas con un tamano relativamente pequeno. Una parte importante del proceso es la selection de un iniciador vivo apropiado y la optimization de las condiciones de la reaccion de polimerizacion. Como alternativa, la velocidad de formacion y propagacion de los radicales se puede controlar mediante la adicion de inhibidores de la reaccion o de agentes de transferencia de cadena tales como derivados mercapto (17).
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Los iniciadores de la polimerizacion radicalaria viva se pueden preparar a partir de moleculas organicas discretas o a partir de macromoleculas. La mayorla de compuestos que contienen un grupo hidroxilo, carboxllico o amino se pueden convertir en iniciador, y as! se pueden incorporar facilmente al pollmero. Esto se puede realizar en el extremo terminal del pollmero en el caso de un iniciador monofuncional, o en el medio del pollmero en el caso de un iniciador multifuncional.
Las condiciones de reaccion que favorecen la formacion de pollmeros de peso molecular relativamente bajo incluyen, pero no estan limitadas a: (i) el uso de una relacion estequiometrica entre el iniciador y los monomeros; (ii) el enfriamiento de la reaccion o la extraccion de la fuente de luz UV u otra fuente de radiacion, que detendra la formacion de nuevas especies de propagacion en una fase temprana de la reaccion; (iii) la extraccion de los monomeros en contacto con la cadena polimerica en crecimiento, por ejemplo, mediante filtracion o cromatografla; (iv) la adicion de inhibidores a la reaccion; (v) la realizacion de la polimerizacion en una solucion muy diluida; (vi) la adicion de agentes de transferencia de cadena. La opcion preferible serla la eliminacion de la fuente de radiacion o su interrupcion. Como alternativa, los monomeros y otros reactivos se pueden extraer de los MIP en crecimiento unidos al molde inmovilizado mediante elucion. Como consecuencia de la polimerizacion viva controlada, se pueden formar partlculas de MIP dentro de un intervalo de tamanos de 500-1.000.000 Da, que pueden existir en forma soluble o como partlculas mas grandes (pero por debajo de 1 pm) que pueden existir en forma de coloides finos que son estables en solucion y compatibles con las condiciones de la cromatografla de afinidad.
Los monomeros que se pueden usar para la preparacion de MIP, incluyen: monomeros vinllicos, monomeros alllicos, acetilenos, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, cloroacrilatos, itaconatos, trifluorometilacrilatos, derivados de aminoacidos (por ejemplo, esteres o amidas), nucleosidos, nucleotidos, y carbohidratos. En otro aspecto de la invencion propuesta, la polimerizacion se realiza en presencia de o sobre la superficie de partlculas que contienen dobles enlaces. Se usan monomeros de reticulacion para fijar o estabilizar la estructura de la molecula replica resultante, de manera que permanezca complementaria a la del molde. Ejemplos tlpicos de agentes de reticulacion adecuados para los MIP incluyen, pero no esta limitados a, dimetacrilato de etilenglicol, trimetacrilato de trimetilolpropano, divinilbenceno, metilenbisacrilamida, etilenbisacrilamida y N,N'- bisacriloilpiperazina. La funcion de los agentes de reticulacion se puede realizar mediante partlculas o pollmeros precursores que contengan dobles enlaces, o partlculas o pollmeros con varias funciones unidas que se pueden unir a monomeros funcionales. Los expertos en la materia pueden seleccionar monomeros y agentes de reticulacion adecuados para un sistema particular. Como alternativa, para ayudar en esta seleccion se pueden usar diferentes metodos combinatorios y computacionales.
Las nanopartlculas sintetizadas tienen una mayor afinidad por el molde inmovilizado que los monomeros, oligomeros no especlficos y pollmeros de baja afinidad (por ejemplo, los formados en el volumen en bruto en ausencia de molde). Asl, en un aspecto de la invencion propuesta el material unido debilmente se extrae de las nanopartlculas unidas al molde inmovilizado mediante lavado. La separacion de nanopartlculas de alta afinidad del molde inmovilizado se consigue mediante calentamiento, que interrumpe la formacion de complejo, mediante la modificacion del pH de la solucion, mediante la modificacion de la concentracion ionica, y mediante la adicion de urea, guanidina, o una sustancia que interactue con el molde con mas fuerza de lo que lo hacen los MIP.
Las nanopartlculas de MIP sintetizadas por afinidad se pueden purificar adicionalmente mediante cromatografla, filtracion y/o electroforesis. La separacion del pollmero sintetizado se puede conseguir mediante cromatografla de afinidad, o elucion selectiva, cuando se usa el mismo molde inmovilizado o uno similar para la purificacion de la fraccion polimerica con la afinidad mas alta por el molde, y/o mediante cromatografla de permeacion de gel que separa las fracciones polimericas con diferentes tamanos. El fraccionamiento, separacion y purificacion se pueden conseguir usando tampones con diferentes pH, concentraciones ionicas, o mediante la adicion de urea, guanidina, o sustancias que interaccionen con el molde con mas fuerza de lo que lo hace el pollmero. Como alternativa, el fraccionamiento de las partlculas con una alta afinidad se puede conseguir mediante filtracion, electroforesis, separacion cromatografica, lavado, centrifugacion o dialisis. La cromatografla de afinidad es una herramienta particularmente util, y se prefiere en especial, debido a que permite la preparacion de MIP con una distribucion estrecha de afinidades por el molde.
Las cadenas polimericas en crecimiento se pueden modificar con otro pollmero o grupo funcional con la intencion de introducir una propiedad especlfica a los MIP, lo que facilitarla su extraccion u otra forma de separacion. Un ejemplo de esto de nuevo puede ser un pollmero con una cola hidrofila que permitirla, por ejemplo, la extraccion del pollmero en solucion acuosa mediante un disolvente organico. Serla posible introducir un grupo de union especlfico, por ejemplo, biotina, lo que permitirla la extraccion selectiva del pollmero mediante un adsorbente de afinidad. Los expertos en la materia estaran familiarizados con la riqueza de protocolos experimentales que permiten llevar a cabo esta modificacion y su separacion correspondiente. La modificacion se puede conseguir directamente sobre la superficie mientras el pollmero se encuentra unido al molde inmovilizado o por separado.
Asl, la presente invencion puede emplear polimerizacion secuencial, cuando el pollmero con impronta se modifica con otros tipos de moleculas para modificar las propiedades o funciones de las moleculas sintetizadas. Ya se ha mencionado que la cadena polimerica en crecimiento se puede modificar con otro pollmero o grupo funcional para facilitar su separacion. Una propiedad importante de la polimerizacion viva es la capacidad de detener una reaccion
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y proseguir con ella posteriormente simplemente deteniendo, por ejemplo, la irradiacion con luz UV de la mezcla de reaccion. El extremo de la cadena polimerica en crecimiento contiene un iniciador que se puede volver a activar para iniciar una nueva ronda de polimerizacion. Asl, la cadena polimerica en crecimiento se podrla exponer a otro monomero y se podrla proseguir con la polimerizacion, dando lugar a la formation de copollmeros en bloque. El nuevo monomero podrla introducir una nueva funcion en el pollmero. Asl, ademas de afinidad por el primer molde, suministrado por el primer MIP, se podrla producir un pollmero extendido con afinidad por un segundo molde introducido en el sistema. El pollmero en bloque extendido podrla tener marcadores fluorescentes unidos a los grupos terminales que serlan utiles en el diagnostico. Tambien son posibles otros tipos de modification, para introducir otras funciones tales como la capacidad de generar especies activas con propiedades biocidas, grupos catallticos, marcadores isotopicos, grupos utiles para inmovilizacion, para sensores y para obtencion de imagenes (por ejemplo, agentes de contraste), etc. Estas funciones tambien se podrlan introducir en el pollmero mediante el uso del iniciador funcionalizado correspondiente. La modificacion se puede conseguir directamente sobre la superficie mientras la partlcula se encuentra unida al molde inmovilizado o por separado.
En un aspecto, la presente invention se refiere a aplicaciones de las moleculas sintetizadas como farmacos en farmacologla y medicina, como ligandos especlficos de receptores en qulmica analltica (sensores, ensayos), para separaciones en las industrias de biotecnologla, farmaceuticas y alimentarias y como catalizadores. La naturaleza soluble de los pollmeros sintetizados los convierte en candidatos ideales para su uso como farmacos. La union selectiva a una enzima, receptor u otra molecula biologica se podrla usar para modificar las funciones biologicas de estas moleculas. Asl, los MIP sintetizados mediante polimerizacion viva se podrlan usar in vivo para la formulation de procesos biologicos. Cuando se encuentran unidos a isotopos o marcadores fluorescentes, los MIP se pueden usar como agentes de contraste selectivos o en otras formas de diagnostico. Los MIP integrados con ligandos que se pueden producir en ciertas condiciones, por ejemplo, oxlgeno molecular singlete, se podrlan usar como agentes biocidas selectivos. Los expertos en la materia pueden proponer varias modificaciones diferentes para introducir propiedades antibioticas en los MIP preparados mediante polimerizacion viva.
Los MIP sintetizados se podrlan usar como sustitutos de anticuerpos o receptores naturales en diferentes formas de ensayos y sensores. Diversas caracterlsticas de los MIP preparados mediante polimerizacion viva los hacen objetos particularmente atractivos para su aplicacion en sensores. Asl, las moleculas de MIP sintetizadas aun contienen iniciador que se puede usar para unir covalentemente pollmeros a las superficies solidas. Por tanto, la simple irradiacion de luz UV podrla ser suficiente para unir MIP a superficies cubiertas con dobles enlaces.
La capacidad de usar cromatografla de afinidad para separar los ligandos de MIP en diversas fracciones con afinidades diferentes podrla ser ventajosa para la preparation de sensores/ensayos con intervalos de detection variables. Para ciertas aplicaciones, tambien se podrlan usar pollmeros blancos preparados mediante polimerizacion viva en ausencia de molde. No obstante, serla necesario preparar dichos pollmeros usando monomeros que posean cierta afinidad u otras propiedades necesarias para esta aplicacion particular. Los expertos en la materia saben como seleccionar esos monomeros usando, por ejemplo, estrategias computacionales o combinatorias. Es necesario aclarar que el uso tanto de MIP como de pollmeros blancos preparados de la forma descrita en las realizaciones correspondientes esta cubierto por el ambito de la presente invencion.
Ahora se describira en detalle la presente invencion en particular con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Slntesis de partlculas de MIP con afinidad por la melamina
Una mezcla de 1,17 g de acetonitrilo, 0,32 g de acido metacrllico, 0,36 g de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM), 0,36 g de dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA), 0,087 g de ester bencllico del acido dietilditiocarbamico (iniciador vivo) y 0,02 g de tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol (agente de transferencia de cadena) se purgo con nitrogeno y se polimerizo bajo radiation de luz UV (fuente de luz UV UVAPRINT 100 CVI con una intensidad de 0,163 W/cm2, Dr. Honle) durante 3 min en el interior de una columna de vidrio (70 * 4 mm) empaquetada con cuentas de vidrio (9-13 pm de diametro) derivatizadas con melamina. Las partlculas de blanco (control) se sintetizaron de la misma manera pero la columna estaba empaquetada con cuentas de vidrio desnudas del mismo tamano. Despues de la polimerizacion la columna se lavo con 1 ml de acetonitrilo para eluir las nanopartlculas y los monomeros sin reaccionar. Las nanopartlculas con impronta solubles resultantes tenlan un diametro medio de 60 nm, calculado mediante dispersion de luz dinamica en un Nanosizer (Malvern Instruments). Las distribuciones de tamano de 3 experimentos diferentes se muestran en la Fig. 3.
Ejemplo 2. Separation por afinidad de pollmero sintetizado.
a) Preparacion de adsorbente de afinidad - inmovilizacion del molde
Se activaron cuentas de vidrio por ebullition en NaOH 4 M durante 10 min, se lavo con agua desionizada y acetona y a continuation se seco a 80 °C durante 2 horas. Las cuentas se incubaron en tolueno con el 2 % en v/v de (3-
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aminopropil) trimetoxisilano durante 3 horas, se lavaron con acetona y se colocaron en PBS, pH 7.2 con el 7 % en v/v de glutaraldehido durante 30 min y despues se lavo con agua. A continuacion, el molde (melamina) se inmovilizo sobre la superficie de las cuentas mediante incubacion en una solucion de PBS a pH 7,2 con N-metil-2-pirrolidona (10 % en v/v) y 0,1 g/ml de melamina durante 4 horas.
Las particulas de melamina recubiertas se usaron para la sintesis de nanoparticulas con impronta y para la cromatografia de afinidad.
b) Cromatografia de afinidad
La muestra eluida de la columna de vidrio en el Ejemplo 1 se filtro con un filtro de jeringa de PTFE con un tamano de poro de 0,22 pm a fin de eliminar cualquier agregado de polimero grande. Para eliminar los monomeros sin reaccionar el filtrado se coloco en un cartucho de filtro de centrifuga con un punto de corte de 10.000 Da y se centrifugo a 3000 g durante 4 horas. Las particulas se resuspendieron en acetonitrilo y se sometieron a ensayo en HPLC con una columna (100 x 4,6 mm) empaquetada con el adsorbente de afinidad preparado como se ha descrito anteriormente (Ejemplo 2a) utilizando un aparato de HPLC de la serie Agilent 1100. El volumen de inyeccion fue de 40 pl, la fase movil usada fue acetonitrilo a 1 ml/min y la deteccion se realizo a 210 nm. Para evitar el uso de acidos y ayudar a la elucion, se realizo un analisis a 80 °C. Tanto los polimeros MIP como de control se prepararon de la misma manera. Los cromatogramas tanto de las particulas de blanco como con impronta sobre la fase de afinidad se representan a continuacion en Figura 1 y 2.
Ejemplo 3 - Preparacion de nanoparticulas para la melamina
Cuentas de vidrio (75 pm de diametro) se activaron por ebullicion en NaOH 4 M durante 10 minutos, se lavaron a fondo con agua destilada dos veces y acetona y se secaron a 80 °C durante 2 horas. Las cuentas se incubaron en solucion al 2 % en v/v de 3-aminopropiltrimetiloxisilano (APTMS) en tolueno durante toda la noche, se lavaron con acetona y se incubaron en 25 ml de una solucion al 5 % en v/v de glutaraldehido (GA) en tampon PBS a pH 7,2 durante 1 horas, y se enjuagaron con agua destilada dos veces. El molde se inmovilizo incubando las cuentas en 0,01 g/ml de solucion de melamina en PBS a pH 7,2 con N-metil-2-pirrolidona (NMP) (10 % en v/v) durante 4 horas. El exceso de melamina adsorbida fisicamente se elimino lavando con agua destilada dos veces y metanol. Las cuentas de vidrio derivatizadas se secaron al vacio y se empaquetaron en una columna de cuarzo (6,4 mm de diametro exterior con 1,5 mm de pared, 150 mm de longitud). Se mezclaron 0,32 g de acido metacrilico (MAA), 0,36 g de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM), 0,36 g de dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA), 0,087 g de ester bencilico del acido N,N'-dietilditiocarbamico y 0,02 g de tetraquis(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol (CTA) en 1,17 g de acetonitrilo (ACN) y se purgo con N2 durante 2 minutos. A continuacion se inyectaron 500 pl en la columna empaquetada con los medios de afinidad, y se polimerizo con radiacion UV a 366 nm (lampara HB 171/A con 4 x 15 W de potencia, PHILIPS) durante 2 minutos. Despues de la polimerizacion la columna se conecta al sistema de HPLC (HPLC Serie Agilent 1100). La elucion se realizo a un caudal de 1 ml/min, con deteccion UV a 220 nm. Durante los primeros 90 minutos se uso ACN como fase movil, mientras que la columna se mantenia en un bano de hielo a 0 °C. A continuacion durante 45 minutos se cambio la fase movil a ACN con acido formico (10 mM) y la temperatura se elevo a 25 °C. Por ultimo, durante 35 minutos se realizo la elucion de las fracciones de alta afinidad de las nanoparticulas a 60 °C. Las nanoparticulas de blanco se prepararon como se ha descrito anteriormente pero se fabricaron usando cuentas de vidrio no derivatizadas. El tamano de las nanoparticulas sintetizadas en diferentes fracciones variaba entre 120 y 460 nm, calculado mediante dispersion de luz dinamica en un Nanosizer (Malvern Instruments).
Ejemplo 4 - Preparacion de nanoparticulas para peptido
Cuentas de vidrio (75 pm de diametro) se sometieron a ebullicion en NaOH 4 M durante 10 minutos, se lavaron con agua destilada dos veces y acetona y se secaron a 80 °C durante 2 horas. Las cuentas se incubaron en solucion al 2 % en v/v de 3-aminopropiltrimetiloxisilano (APTMS) en tolueno durante toda la noche, a continuacion se lavaron con acetona y se incubaron en 25 ml de una solucion del 7 % en v/v de glutaraldehido (GA) en PBS a pH 7,2 durante 1 hora, se enjuagaron con agua destilada dos veces y se incubaron en 0,05 mg/ml de solucion de peptido (TATTSVLG-NH2) en PBS a pH 7,2 durante 4 horas. Las cuentas derivatizadas se lavaron con agua destilada dos veces y se usaron para la preparacion de nanoparticulas de MIP. Se disolvieron 19,5 mg de N-isopropilacrilamida (NIPAm), 1 mg de N,N'-metilenbisacrilamida (BIS), 16,5 mg de N-terc-butilacrilamida (TBAm) y 1,11 pl de acido acnlico (AAc) en 50 ml de H2O, que contiene 10 mg de dodecilsulfato sodico (SDS). La solucion se sometio a ultrasonidos durante 10 minutos y se purgo con N2 durante 30 minutos. Se pusieron 10 ml de esta solucion en un vial de 20 ml de tapon de rosca que contiene 4 g de cuentas de vidrio derivatizadas. La polimerizacion se inicio mediante la adicion de 100 pl de 60 mg/ml de persulfato de amonio (APS) y 3 pl de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) y se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 22 horas. La botella que contiene el producto de MIP y los medios de afinidad se mantuvo en hielo a 0 °C durante 10 minutos, y a continuacion se vertio en los cartuchos de SPE para separar las cuentas de vidrio con nanoparticulas unidas de los otros componentes. Se llevaron a cabo cinco etapas de lavado, cada una con 10 ml de agua fria destilada dos veces, para eliminar el material con baja o ninguna afinidad. La elucion de las fracciones de nanoparticulas de alta afinidad se realizo con PBS a pH 7,2 a 60 °C. Las nanoparticulas en blanco se prepararon como se ha descrito anteriormente pero se fabricaron usando cuentas de
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vidrio no derivatizadas. El tamano de las nanopartlculas sintetizadas en diferentes fracciones variaba entre 30 y 130 nm, calculado mediante dispersion de luz dinamica en un Nanosizer (Malvern Instruments).
Analisis de la afinidad de las nanopartlculas sintetizadas
Chips recubiertos con Au (SIA Kit Au) se limpiaron por inmersion en una solucion Piranha (H2SO4/H2O2, 3:1 en v/v) durante 5 minutos. A continuacion se aclararon bien con agua destilada dos veces y etanol. Se realizo la inmovilizacion del derivado tiolado del molde de peptido con un espaciador de glicina (CGGGGTATTSVLG-NH2) y el peptido de referencia a-tiolado (CQLPELKQKSS-NH2) y se registro en llnea usando Biacore 3000 SPR mediante la inyeccion de 100 pl de una solucion de peptido de 0,1 mg/ml en PBS a pH 7,4 sobre un chip de oro limpio con un caudal de 15 pl/min a 25 °C. Se inyectaron 100 pl de nanopartlculas diluidas a 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:80 y 1:100 en PBS a pH 7,4 (caudal: 15 pl/min), y la respuesta del sensor se analizo durante 2 minutos usando el software Biacore. Se obtuvo una constante de disociacion aparente Kd = 2,5 pM para la interaccion entre las nanopartlculas de MIP y el peptido molde (CGGGGTATTSVLG-NH2). La constante de disociacion aparente registrada para el peptido de referencia (CQLPELKQKSS-NH2) fue de Kd = 3,3 nM lo que demuestra que las nanopartlculas de MIP son aproximadamente 1000 veces mas especlficas para el peptido molde.
Ejemplo 5 - Preparacion de nanopartlculas para la vancomicina
Cuentas de vidrio (75 pm de diametro) se sometieron a ebullicion en NaOH 4 M durante 10 minutos, se lavaron con agua destilada dos veces y acetona y se secaron a 80 °C durante 2 horas. Las cuentas se incubaron en una solucion al 2 % en v/v de (3-aminopropil)trimetoxisilano durante toda la noche, se lavaron con acetona y se pusieron en tampon PBS a pH 7,2 con el 7 % en v/v de glutaraldehldo durante 1 hora, se enjuagaron con agua destilada dos veces y se incubaron con 0,5 mg/ml de HCl de vancomicina en PBS a pH 7,2 durante 4 horas. Las cuentas derivatizadas se lavaron con agua destilada dos veces y se usaron para la preparacion de nanopartlculas de MIP. Se disolvieron 19,5 mg de N-isopropilacrilamida (NIPAM), 1 mg de N,N'-metilenbisacrilamida (BIS), 16,5 mg de N- ter-butilacrilamida (TBAM) y 1,11 pl de acido acrllico (AAc) en 50 ml de H2O, que contiene 10 mg de dodecilsulfato sodico (SDS). La solucion se sometio a ultrasonidos durante 10 minutos y se purgo con N2 durante 30 minutos. Se pusieron 50 ml de esta solucion en un vial de 100 ml de tapon de rosca que contiene 20 g de cuentas de vidrio derivatizadas. La polimerizacion se inicio mediante la adicion de 500 pl de 60 mg/ml de persulfato de amonio (APS) y 3 pl de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED) y se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 22 horas. La botella que contiene el producto de MIP y los medios de afinidad se mantuvo en hielo a 0 °C durante 10 minutos, y a continuacion se vertio en los cartuchos de SPE para separar las cuentas de vidrio con nanopartlculas unidas de los otros componentes. Se realizaron cinco etapas de lavado, cada una con 20 ml de agua frla destilada dos veces, para eliminar el material con baja o ninguna afinidad. A continuacion, las nanopartlculas de alta afinidad se separaron de los medios de afinidad mediante el paso de 5 fracciones de 20 ml de PBS a pH 7,2 a 60 °C. Las nanopartlculas sin impronta se han preparado de la misma manera pero utilizando las cuentas de vidrio derivatizadas con clorotrimetilsilano. Las nanopartlculas con impronta solubles resultantes tenlan un diametro medio de 228 nm, segun los calculos de dispersion de luz dinamica (DLS) utilizando un Zetasizer Nano (Nano-S) de Malvern Instruments Ltd (Malvern, Reino Unido).
Analisis de la afinidad de las nanopartlculas sintetizadas
Chips recubiertos con Au (SIA Kit Au) adquiridos en Biacore se limpiaron por inmersion en una solucion Piranha (H2SO4/H2O2, 3:1 en v/v) durante 5 minutos. A continuacion se aclararon bien con agua destilada dos veces y etanol y se incubaron en una solucion de 0,2 mg/ml de 4-aminotiofenol en etanol durante 24 horas a 4 °C. Despues de esto los chips se enjuagaron con agua destilada dos veces y se incubaron en 2,5 ml de una solucion al 7 % en v/v de GA en PBS a pH 7,2 a temperatura ambiente durante 1 hora. Los chips se lavaron adicionalmente con agua destilada dos veces y se incubaron en una solucion de 1,2 mg/ml de vancomicina en PBS a pH 7:2 a temperatura ambiente durante 24 horas y se anclaron a Biacore 3000. Se inyectaron 100 pl de nanopartlculas y nanopartlculas diluidas a 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 en PBS a pH 7,4 (caudal 15 pl/min) a 30 °C. La respuesta del sensor se analizo usando el software Biacore. La constante de disociacion aparente Kd de la vancomicina para las nanopartlculas de MIP fue de 0,9 nM.
Claims (16)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un proceso para la preparacion de un pollmero con impronta molecular ("MIP") en forma de solucion o suspension coloidal de partlculas de MIP, que comprende las etapas de:(a) suministro de una sustancia de soporte que tiene un material molde inmovilizado sobre la misma para que quede expuesto a una superficie;(b) suministro de una composicion polimerizable en contacto con dicha superficie;(c) realizacion de una polimerizacion controlada de dicha composicion polimerizable en contacto con dicha superficie, terminandose dicha polimerizacion cuando se hayan formado partlculas de MIP capaces de formar una solucion o una suspension coloidal; y(d) separacion de dichas partlculas de MIP de dicha superficie.
- 2. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que, despues de dicha etapa de separacion de dichas partlculas de MIP de dicha superficie, dicha sustancia de soporte con dicho material molde inmovilizado sobre la misma se reutiliza en las etapas (b), (c) y (d).
- 3. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 en el que dicha sustancia de soporte es una resina polimerica, un polisacarido, un vidrio o una superficie metalica; y/o dicha sustancia de soporte esta en forma de cuentas, la superficie de guias de ondas, fibras, incluyendo fibras opticas, membranas o capilares.
- 4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que ademas incluye, despues de dicha etapa de separacion de dichas partlculas de MIP de dicha superficie, una etapa de purificacion (e) en la que (i) una solucion o una suspension que contienen dichas partlculas de MIP separadas se ponen en contacto con una sustancia de soporte que tiene dicho material molde inmovilizado sobre la misma para que quede expuesto en una superficie, de modo que dichas partlculas de MIP se unen a dicho material molde inmovilizado, (ii) el material no unido se separa de dicha sustancia de soporte; y posteriormente (iii) las partlculas de MIP se recuperan del material molde inmovilizado para formar una solucion o una suspension coloidal purificadas.
- 5. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 4 en el que dicha sustancia de soporte usada en la etapa (e) es como se define en la reivindicacion 3 o la reivindicacion 4, y es igual o diferente de la sustancia de soporte usada en la etapa (c).
- 6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicha polimerizacion controlada se selecciona entre polimerizacion radicalaria tal como polimerizacion radicalaria viva opcionalmente controlada (LRP); polimerizacion anionica viva; polimerizacion cationica viva; y policondensacion controlada, preferentemente seleccionada entre polimerizacion mediada por iniferter, polimerizacion mediada por nitroxido (NMP), polimerizacion radicalaria por transferencia de atomos (ATRP) y polimerizacion de transferencia de cadena por adicion- fragmentacion reversible (RAFT).
- 7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que en la etapa (c), la polimerizacion se termina para producir partlculas de MIP solubles con masas moleculares en el intervalo de 500-1.000.000 Dalton, o partlculas coloidales con tamanos de particula < 1 pm y que son estables en solucion.
- 8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha composicion polimerizable contiene uno o mas monomeros seleccionados entre monomeros vinilicos, monomeros alilicos, acetilenos, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, cloroacrilatos, itaconatos, trifluorometilacrilatos, derivados de aminoacidos, nucleosidos, nucleotidos y carbohidratos.
- 9. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 8 en el que dicha composicion polimerizable tambien contiene al menos un agente de reticulacion.
- 10. Un proceso de acuerdo con la reivindicacion 9 en el que dicho al menos un agente de reticulacion se selecciona entre dimetacrilato de etilenglicol, trimetacrilato de trimetilolpropano, divinilbenceno, metilenbisacrilamida, etilenbisacrilamida y N,N'-bisacriloilpiperazina.
- 11. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que dicha etapa (d) de separacion de dichas partlculas de MIP de dicha superficie se efectua por medio de calentamiento, modification del pH de la solucion, modificacion de la concentration ionica o por medio de la adicion de urea, guanidina o una sustancia que interactue con el molde con mas fuerza de lo que lo hace el MIP.
- 12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que dicha etapa (c) de realizacion de la polimerizacion controlada emplea polimerizacion secuencial en la que dicha composicion de polimerizacion proporcionada en la etapa (b) se usa para una primera etapa de polimerizacion, tras la cual se proporciona una composicion polimerizable diferente y se realiza una etapa de polimerizacion adicional para producir partlculas de MIP modificadas que todavia son capaces de formar una solucion o una suspension coloidal.
- 13. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que, despues de la etapa (c), los materiales mal consolidados y de baja afinidad se retiran mediante lavado de dicho material molde inmovilizado, tras lo cual, en la etapa (d), se aplican condiciones de elucion mas fuertes para la elucion y la recoleccion de partlculas de alta afinidad.5
- 14. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la etapa (c) emplea condiciones de polimerizacion que favorecen la formacion de partlculas coloidales solubles y finas que comprenden una o mas de: dilucion de la mezcla de monomeros, realizacion de la polimerizacion a baja temperatura, adicion de agentes de termination de cadena o adicion de inhibidores.10
- 15. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que en la etapa (c), la polimerizacion se inicia mediante calentamiento, irradiation de luz UV o visible, irradiation de microondas, electropolimerizacion, oxidation o adicion de catalizador.15 16. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluye una etapa adicional de usode dichas partlculas de MIP separadas (a) como ligandos especlficos del receptor en qulmica analltica; (b) como ligandos especlficos del receptor para llevar a cabo la separation en las industrias de biotecnologla, farmaceuticas o alimentarias; (c) como catalizador; (d) en sensores; o (e) en el que dichas partlculas de MIP estan unidas a isotopos o marcadores fluorescentes y se usan como agentes de contraste selectivos.20
- 17. Partlculas de MIP separadas como las producidas por el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso como medicamento.
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