ES2555659T3

ES2555659T3 - Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y un procedimiento de producción de las mismas

Info

Publication number: ES2555659T3
Application number: ES06819308.5T
Authority: ES
Inventors: Ana Isabel Sanz Molinero; Christophe Reuzeau; Yves Hatzfeld; Veronique Boudolf; Lieven De Veylder; Dirk Inze; Vladimir Mironov
Original assignee: CropDesign NV
Current assignee: CropDesign NV
Priority date: 2005-11-07
Filing date: 2006-11-07
Publication date: 2016-01-07
Anticipated expiration: 2026-11-07
Also published as: CN102925455A; WO2007051866A2; EP2333089A1; RU2008122542A; AR057884A1; EP2327770A1; BRPI0618328A2; EP1948807A2; EP1948807B1; WO2007051866A3; AU2006310495B2; AU2006310495A1

Abstract

Procedimiento para aumentar el rendimiento de las plantas, en plantas cultivadas en condiciones sin estrés, en relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes, que comprende introducir y sobreexpresar en una planta, un ácido nucleico de hox5 de HDZip de clase I que codifica un polipéptido de hox5 de cremallera de leucina de homeodominio (HDZip) de SEC ID Nº: 2, y seleccionar plantas que tienen rendimiento aumentado, en el que dicho rendimiento aumentado se selecciona entre uno o más de: número aumentado de semillas cargadas, número total de semillas aumentado, rendimiento total de semillas aumentado, aumento de la tasa de carga de semillas, aumento del índice de cosecha (IC), aumento del peso de mil granos (PMG), aumento de la biomasa de la raíz, cada uno en relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes.

Description

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De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo, tal como soja, girasol, canola, alfalfa, colza, algodón, tomate, patata o tabaco. De manera preferentemente adicional, la planta es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar. Más preferentemente la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avena.

Polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I y homólogos de los mismos, y ácidos nucleicos/genes de hox5 de HDZip de clase I útiles en los procedimientos de la invención

La expresión "polipéptido de hox5 de HDZip de clase I u homólogo del mismo", tal como se define en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende de N-terminal a C-terminal: (i) una caja ácida; y (ii) un homeodominio de clase I; y (iii) una cremallera de leucina con más de 5 héptadas.

Además, el polipéptido de hox5 de HDZip de clase I o un homólogo del mismo puede comprender uno cualquiera o ambos de los siguientes: (a) una cola de Trp; y (b) el motivo de aminoácidos RPFF, donde R es Arg, P es Pro y F es Phe. Dentro de este motivo, se permiten uno o más cambios conservativos en cualquier posición, y uno o dos cambios no conservativos en cualquier posición. El motivo de (b) precede a la caja ácida, cuando se examina la proteína desde N-terminal hasta C-terminal.

Un ejemplo de un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I, tal como se define anteriormente, que comprende de N-terminal a C-terminal: (i) una caja ácida; y (ii) un homeodominio de clase I; y (iii) una cremallera de leucina con más de 5 héptadas; y que comprende además: (a) una cola de Trp; y (b) el motivo de aminoácidos RPFF, donde R es Arg, P es Pro y F es Phe, se representa como SEC ID Nº: 2. Además, dichos ejemplos se proporcionan en la tabla A del ejemplo 1 en el presente documento.

Un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I o un homólogo del mismo está codificado por un ácido nucleico/gen de hox5 de HDZip de clase I. Por lo tanto, la expresión "ácido nucleico/gen de hox5 de HDZip de clase I", tal como se define en el presente documento, es cualquier ácido nucleico/gen que codifica un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I o un homólogo del mismo tal como se define anteriormente en el presente documento.

Los polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I u homólogos de los mismos pueden identificarse fácilmente usando técnicas rutinarias bien conocidas en la materia, tal como mediante alineamiento de secuencias. Los procedimientos para el alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica, incluyendo dichos métodos GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para hallar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul y col., (1990) J Mol Biol 215: 403-10) calcula el porcentaje de identidad de secuencia y efectúa un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El programa informático para efectuar un análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Centre for Biotechnology Information. Los homólogos de hox5 de HDZip de clase I que comprenden un homeodominio de clase I y una cremallera de leucina con más de 5 héptadas pueden identificarse fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineamiento de múltiples secuencias ClustalW (versión 1.83) disponible en http://clustalw.genome.jp/sit-bin/nph-ClustalW, con los parámetros de alineamiento por pares por defecto, y un procedimiento de puntuación en porcentaje. Puede efectuarse una edición manual menor para optimizar el alineamiento entre motivos conservados, tal como será evidente para un experto en la materia.

Los diversos dominios estructurales en una proteína hox5 de HDZip de clase I, tales como el homeodominio y la cremallera de leucina, pueden identificarse usando bases de datos especializadas, por ejemplo, SMART (Schultz y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic y col. (2002) Nucleic Acids Res 30, 242-244; http://smart.embl-heidelberg.de/), InterPro (Mulder y col., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318; http://www.ebi.ac.uk/interpro/), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., págs 53-61, AAAIPress, Menlo Park; Hulo y col., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004), http://www.expasy.org/prosite/) o Pfam (Bateman y col., Nucleic Acids Research 30(1):276-280 (2002), http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/). La predicción de la cremallera de leucina y la identificación de la héptada puede efectuarse usando programas informáticos especializados, tales como 2ZIP, que combina un algoritmo convencional de predicción hélices superenrolladas con una búsqueda aproximada para la repetición de leucina característica (Bornberg-Bauter y col., (1998) Computational Approaches to Identify Leucine Zippers, Nucleic Acids Res., 26(11): 2740-2746, http://2zip.molgen.mpg.de).

Además, también puede identificarse fácilmente la presencia de una caja ácida. Puede calcularse la composición primaria de aminoácidos (en %) para determinar si un dominio de polipéptido es rico en aminoácidos específicos usando programas informáticos del servidor ExPASy, en particular la herramienta ProtParam (Gasteiger E y col., (2003) ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788). Entonces puede compararse la composición de la proteína de interés con la composición media de aminoácidos (en %) en el banco de datos de secuencias de proteínas Swiss-Prot. En este banco de datos, el contenido medio de Asp

(D) y de Glu (E) son del 5,3 % y del 6,6 %, respectivamente, siendo la media combinada del 11,9 %. Como ejemplo, la caja ácida de SEC ID Nº: 2 contiene un 9,1 % de D y un 54,5 % de E, siendo la media combinada del 63,6 %. Tal como

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se define en el presente documento, una caja rica en ácido tiene un contenido combinado de Asp (D) y de Glu (E) (en términos de %) por encima del encontrado en la composición de aminoácidos media (en términos de %) de las proteínas en la base de datos de secuencias de proteínas Swiss-Prot. Una caja ácida puede ser parte de un dominio de activación de la transcripción. Los dominios de activación de la transcripción de eucariotas se han clasificado de acuerdo con su contenido de aminoácidos, y las categorías principales incluyen dominios de activación ácidos, ricos en glutamina y ricos en prolina (Rutherford y col., (2005) Plant J. 43(5):769-88, y las referencias citadas en el mismo).

Un número seleccionado de proteínas entre los polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I u homólogos de los mismos comprenden además el motivo de aminoácidos RPFF, donde R es Arg, P es Pro y F es Phe. Dentro de este motivo, se permiten uno o más cambios conservativos en cualquier posición, y uno o dos cambios no conservativos en cualquier posición. Este motivo precede a la caja ácida, cuando se examina la proteína desde N-terminal hasta C-terminal (véase la figura 2). La presencia del RPFF puede identificarse usando procedimientos para el alineamiento de secuencias para comparación tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. En algunos casos, pueden ajustarse los parámetros por defecto para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, usando BLAST, puede aumentarse el umbral de significación estadística (denominado valor de "expectativa") para comunicar coincidencias contra secuencias de la base de datos para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, pueden identificarse coincidencias cortas prácticamente exactas.

Un número seleccionado de proteínas entre los polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I u homólogos de los mismos pueden comprender además una cola de Trp. Una cola de Trp, tal como se define en el presente documento es los últimos 10 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína que comprende al menos un resto de Trp (véase la figura 2).

Los ejemplos de polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I u homólogos de los mismos (codificados por el número de referencia de secuencia entre paréntesis) se proporcionan en la tabla A. Las SEC ID Nº: 3 a 32, 34 a 51 se muestran con fines ilustrativos.

Debe entenderse que las secuencias que se encuentran dentro de la definición de "polipéptido de hox5 de HDZip de clase I u homólogo del mismo" no deben limitarse a las secuencias proporcionadas en la tabla A, sino que cualquier polipéptido que comprende desde N-terminal hasta C-terminal: (i) una caja ácida; y (ii) un homeodominio de clase I; y

(iii) una cremallera de leucina con más de 5 héptadas, puede ser adecuado para su uso en la ejecución de los procedimientos de la divulgación.

Los polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I u homólogos de los mismos tienen actividad de unión a ADN, preferentemente a semisitios de 5 pb que se solapan en una posición central, CAA(A/T)ATTG, tal como se detecta en ensayos de un híbrido de levadura (Meijer y col., (2000) Mol Gen Genet 263:12-21). En ensayos transitorios en suspensiones de células de arroz, el bombardeo conjunto de un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I con el gen indicador GUS dio como resultado un aumento en el número de puntos teñidos, que también tenían un color más intenso (Meijer y col., anteriormente citado). Este ensayo es útil para demostrar la función activadora de los polipéptidos u homólogos de hox5 de HDZip de clase I.

Las secuencias útiles en los procedimientos de la divulgación no están limitadas a los ácidos nucleicos y polipéptidos de hox5 de homeodominio de cremallera de leucina (HDZip) de clase I anteriormente mencionados. Los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación también pueden llevarse a cabo usando variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de hox5 de homeodominio de cremallera de leucina (HDZip) de clase I u homólogos de los mismos.

Los ejemplos de dichas variantes incluyen porciones, secuencias hibridantes, variantes alélicas, variantes de corte y empalme y variantes obtenidas mediante reordenamiento génico.

Puede prepararse una porción, por ejemplo, produciendo una o más eliminaciones en un ácido nucleico. Las porciones pueden usarse en forma aislada o pueden fusionarse a otras secuencias codificantes (o no codificantes) para, por ejemplo, producir una proteína que combine varias actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido tras la traducción puede ser mayor que aquel predicho para la porción.

En los casos donde la secuencia útil en los procedimientos de la divulgación sea un hox5 de HDZip de clase I, la porción codifica un polipéptido que comprende desde N-terminal hasta C-terminal: (i) una caja ácida; y (ii) un homeodominio de clase I; y (iii) una cremallera de leucina con más de 5 héptadas. Preferentemente, la porción es una porción de uno de los ácidos nucleicos proporcionados en la tabla A. Más preferentemente, la porción es una porción de un ácido nucleico tal como se representa por la SEC ID Nº: 1.

Por lo tanto, la divulgación proporciona un procedimiento para mejorar características de crecimiento de plantas que comprende modular la expresión en una planta o una parte de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hox5 de homeodominio de cremallera de leucina (HDZip) de clase I o un homólogo del mismo.

Otra variante de ácido nucleico es un ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones de rigurosidad reducida, preferentemente en condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un ácido nucleico/gen de hox5 de HDZip de clase I u homólogo del mismo.

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El término "hibridación", tal como se define en el presente documento, es un procedimiento en el que las secuencias nucleotídicas complementarias sustancialmente homólogas hibridan entre sí. El procedimiento de hibridación puede suceder completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios se encuentran en solución. El procedimiento de hibridación también puede suceder con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a una matriz, tal como perlas magnéticas, perlas de sefarosa o cualquier otra resina. El procedimiento de hibridación puede suceder además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados a un soporte sólido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizados mediante por ejemplo fotolitografía a, por ejemplo, un soporte de vidrio silícico (este último conocido como matrices o micromatrices de ácidos nucleicos o como placas de ácidos nucleicos). Para permitir que tenga lugar la hibridación, las moléculas de ácido nucleico se desnaturalizan generalmente de manera térmica o química para separar una doble hebra en dos hebras individuales y/o para eliminar horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal, la fuerza iónica y la composición del tampón de hibridación.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y las "condiciones de lavado de hibridación rigurosas" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridaciones de Southern y de Northern son dependientes de la secuencia y son diferentes con parámetros ambientales diferentes. El experto en la materia será consciente de diversos parámetros que pueden alterarse durante la hibridación y el lavado y que bien mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad.

La Tf es la temperatura a una fuerza iónica y pH definidos, a la cual el 50 % de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tf depende de las condiciones de solución y de la composición base y longitud de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas hibridan específicamente a temperaturas mayores. La velocidad máxima de hibridación se obtiene desde aproximadamente 16 °C hasta 32 °C por debajo de la Tf. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras de ácido nucleico, promoviendo de este modo la formación de híbridos; este efecto es visible para concentraciones de sodio de hasta 0,4 M. La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN en 0,6 a 0,7 °C para cada porcentaje de formamida, y la adición de formamida al 50 % permite que se efectúe la hibridación a 30 a 45 °C, aunque disminuirá la velocidad de hibridación. Los emparejamientos erróneos de pares de bases reducen la velocidad de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. De media y para todas las sondas, la Tf disminuye aproximadamente 1 °C por % de emparejamiento erróneo de bases. La Tf puede calcularse usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de los tipos de híbridos:

1.: híbridos de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):

Tf 81,5 °C + 16,6 x log[Na+]a + 0,41 x %[G/Cb] -500 x [Lc]-1 -0,61,x,% de formamida

2.: Híbridos de ADN-ARN o de ARN-ARN:

Tf= 79,8 + 18,5 (log10[Na+]a) + 0,58 (%G/Cb) + 11,8 (%G/Cb)2 -820/Lc

3.: Híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd:

Para < 20 nucleótidos: Tf 2 (In)

Para 20-35 nucleótidos: Tf= 22 + 1,46 (In)

a o para otro catión monovalente, pero solo preciso en el intervalo de 0,01-0,4 M. b solo preciso para %GC en el intervalo del 30 % al 75 %. c L = Longitud del dúplex en pares de bases.d Oligo, oligonucleótido; In, longitud eficaz del cebador = 2 x (n.º de G/C) + (n.º de A/T). Nota: para cada 1 % de formamida, la Tf se reduce en aproximadamente 0,6 a 0,7 °C, mientras que la presencia de urea 6 M reduce la Tf en aproximadamente 30 °C.

La especificidad de la hibridación es típicamente la función de los lavados post-hibridación. Para eliminar el fondo resultante de la unión no específica, las muestras se lavan con soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de dichos lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: cuanto más baja sea la concentración de sal y mayor sea la temperatura de lavado, mayor será la rigurosidad del lavado. Las condiciones de lavado se llevan a cabo típicamente a, o por debajo de, la rigurosidad de la hibridación. En general, las condiciones rigurosas adecuadas para ensayos de hibridación de ácido nucleico o procedimientos de detección de la amplificación génica son tal como se han expuesto anteriormente. También pueden seleccionarse condiciones de mayor o menor rigurosidad. En general, las condiciones de rigurosidad baja se seleccionan para que sean aproximadamente 50 °C menores que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigurosidad media se producen cuando la temperatura es 20 °C menor que la Tf, y las condiciones de rigurosidad alta se producen cuando la temperatura es 10 °C menor que la Tf. Por ejemplo, son condiciones rigurosas aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-L; y las condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones M-R. La unión no específica puede controlarse usando una cualquiera o una serie de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contienen proteína, adiciones de ARN, ADN heterólogo y SDS al tampón de

hibridación, y tratamiento con RNasa. Los ejemplos de condiciones de lavado e hibridación se enumeran en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Ejemplos de condiciones de hibridación y lavado

Condición de rigurosidad: Híbrido de polinucleótido± Longitud de híbrido (pb)‡ Temperatura y tampón de hibridación† Temperatura y tampón de lavado†

A: ADN:ADN > o igual a 50 65 °C SSC 1X; o 42 °C, SSC 1X y formamida al 50 % 65 °C; SSC 0,3X

B: ADN:ADN <50 Tb*; SSC 1X Tb*; SSC 1X

C: ADN:ARN > o igual a 50 67 °C 1XSSC; o 45 °C, SSC 1X y formamida al 50 % 67 °C; 0,3XSSC

D: ADN:ARN <50 Td*; SSC 1X Td*; SSC 1X

E: ARN:ARN > o igual a 50 70 °C 1XSSC; o 50 °C, SSC 1X y formamida al 50 % 70 °C; 0,3XSSC

F: ARN:ARN <50 Tf*; SSC 1X Tf*; SSC 1X

G: ADN:ADN > o igual a 50 65 °C 4XSSC; o 45 °C, SSC 4X y formamida al 50 % 65 °C; SSC 1X

H: ADN:ADN <50 Th*; SSC 4X Th*; SSC 4X

I: ADN:ARN > o igual a 50 67 °C 4XSSC; o 45 °C, SSC 4X y formamida al 50 % 67 °C; SSC 1X

J: ADN:ARN <50 Tj*; SSC 4X Tj*; SSC 4X

K: ARN:ARN > o igual a 50 70 °C 4XSSC; o 40 °C, SSC 6X y formamida al 50 % 67 °C; SSC 1X

L: ARN:ARN <50 T1, SSC 2X T1, SSC 2X

M: ADN:ADN > o igual a 50 50 °C 4XSSC; o 40 °C, SSC 6X y formamida al 50 % 50 °C; SSC 2X

N: ADN:ADN <50 Tn*; SSC 6X Tn*; SSC 6X

O: ADN:ARN > o igual a 50 55 °C 4XSSC; o 42 °C, SSC 6X y formamida al 50 % 55 °C; SSC 2X

P: ADN:ARN <50 Tp*; SSC 6X Tp*; SSC 6X

Q: ARN:ARN > o igual a 50 60 °C 4XSSC; o 45 °C, SSC 6X y formamida al 50 % 60 °C.; SSC 2X

R: ARN:ARN <50 Tr*; SSC 4X Tr*; SSC 4X

‡ La "longitud del híbrido" es la longitud anticipada para el ácido nucleico hibridante. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas en el presente documento.† SSPE (SSPE 1X es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM, y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituirse con SSC (SSC 1x es NaCl 0,15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se llevan a cabo 15 minutos después de completar la hibridación. Las hibridaciones y lavados pueden incluir adicionalmente reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0,5 -1,0 %, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, pirofosfato de sodio al 0,5 %, y formamida hasta el 50 %. * Tb-Tr: La temperatura de hibridación para los híbridos que se anticipa que tienen menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5-10 °C menos que la temperatura de fusión Tf de los híbridos; la Tf se determina de acuerdo con las ecuaciones anteriormente mencionadas. ± La presente invención abarca la sustitución de uno cualquiera o más de los compañeros híbridos de ADN o ARN con bien un APN o un ácido nucleico modificado.

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aminoácidos RPFF, donde R es Arg, P es Pro y F es Phe. Dentro de este motivo, se permiten uno o más cambios conservativos en cualquier posición, y uno o dos cambios no conservativos en cualquier posición. El motivo de (b) precede a la caja ácida, cuando se examina la proteína desde N-terminal hasta C-terminal. Además se prefieren variantes de corte y empalme de secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la tabla A. Lo más preferido es una variante de corte y empalme de una secuencia de ácido nucleico como la representada por la SEC ID Nº: 1.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar las características de crecimiento de plantas que comprende modular la expresión en una planta de una variante de corte y empalme alternativo de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hox5 de cremallera de leucina de homeodominio (HDZip) o un homólogo del mismo.

La expresión "variante de corte y empalme alternativo", tal como se usa en el presente documento, abarca variantes de una secuencia de ácido nucleico en la que se han cortado, reemplazado o añadido intrones y/o exones seleccionados,

o en la que se han acortado o alargado intrones. Dichas variantes serán aquellas en las que se mantenga la actividad biológica de la proteína, lo que puede lograrse manteniendo de manera selectiva segmentos funcionales de la proteína. Dichas variantes de corte y empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden producirse por el hombre. Los procedimientos para producir dichas variantes de corte y empalme se conocen bien en la técnica.

El homólogo también puede estar codificado por una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I o un homólogo del mismo.

En los casos donde la secuencia útil en los procedimientos de la divulgación sea un ácido nucleico que codifica a un polipéptido de hox5 de HDZip de clase I o un homólogo del mismo, la variante alélica codifica un polipéptido que comprende desde el N-terminal hasta el C-terminal: (i) una caja ácida; y (ii) un homeodominio de clase I; y (iii) una cremallera de leucina con más de 5 héptadas. Además, el polipéptido de hox5 de HDZip de clase I, o un homólogo del mismo, puede comprender cualquiera o ambos de los siguientes: (a) una cola de Trp; y (b) el motivo de aminoácidos RPFF, donde R es Arg, P es Pro y F es Phe. Dentro de este motivo, se permiten uno o más cambios conservativos en cualquier posición, y uno o dos cambios no conservativos en cualquier posición. El motivo de (b) precede a la caja ácida, cuando se examina la proteína desde el N-terminal hasta el C-terminal. Además se prefieren variantes alélicas de secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la tabla A. Lo más preferido es una variante alélica de una secuencia de ácido nucleico como la representada por la SEC ID Nº: 1.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para mejorar características de crecimiento de plantas que comprende modular la expresión en una planta o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hox5 de homeodominio de cremallera de leucina (HDZip) de clase I o un homólogo del mismo.

Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está abarcado en los procedimientos de la presente divulgación. Las variantes alélicas abarcan polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP), así como polimorfismos de inserción/eliminación pequeña (INDEL). El tamaño de los INDEL es normalmente menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman el mayor conjunto de variantes de secuencias en cepas polimórficas de origen natural de la mayoría de organismos.

De acuerdo con la presente divulgación, se contempla la expresión modulada del ácido nucleico o variante del mismo. En la técnica se documentan bien procedimientos para aumentar la expresión de genes o productos génicos e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión conducida por promotores apropiados, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotores o elementos potenciadores pueden introducirse en una posición apropiada (típicamente cadena arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular positivamente la expresión del ácido nucleico o variante del mismo. Por ejemplo, pueden alterarse promotores in vivo por mutación, deleción, y/o sustitución (véase, Kmiec, la Patente de Estados Unidos No. 5,565,350; Zarling y col., PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula de planta en la orientación y distancia apropiada de un gen de la presente divulgación para controlar la expresión del gen.

En la técnica se documentan bien procedimientos para reducir la expresión de genes o productos génicos.

Si se desea la expresión del polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3’ de una región codificante polinucleotídica. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o de ADN-T. La secuencia de extremo 3’ a añadir puede proceder, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o como alternativa de otro gen de planta, o de cualquier otro gen eucariota.

También puede añadirse una secuencia intrónica a la región no traducida (UTR, untranslated region) 5’ o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha observado que la inclusión de un intrón de corte y empalme en la unidad de transcripción en construcciones de expresión tanto de plantas como de animales aumenta la expresión génica tanto a nivel de proteína como de ARNm hasta 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis y col., (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Dicha potenciación intrónica de la expresión génica es típicamente mayor cuando se pone cerca del extremo 5’ de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz, el intrón Adh1-S, 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1. Para una información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y

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(continuación)

Fuente del Gen: Referencia

Ciclofilina de arroz: Buchholz y col., Plant Mol Biol. 25(5): 837-43, 1994

Histona H3 de maíz: Lepetit y col, Mol. Gen. Genet. 231:276-285, 1992

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34S FMV: Sanger y col., Plant. Mol. Biol., 14, 1990: 433-443

Subunidad pequeña Rubisco: US 4.962.028;

OCS: Leisner (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553

SAD1: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

SAD2: Jain y col., Crop Science, 39 (6), 1999: 1696

Nos: Shaw y col. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20):7831-7846

V-ATPasa: WO 01/14572,

Súper promotor: WO 95/14098,

Proteínas de la caja G: WO 94/12015

Un promotor específico de semilla es uno que es transcripcionalmente activo predominantemente en tejidos de semilla. Un promotor específico de semilla también puede tener alguna actividad residual en otras partes. Preferentemente, el promotor específico de semilla es un promotor específico de endospermo y/o de aleurona, lo que significa que el promotor es transcripcionalmente activo predominantemente en tejido de endospermo y/o en las capas de aleurona de una semilla, aunque puede haber alguna actividad residual o expresión débil en alguna otra parte.

Tabla 6: Ejemplos de promotores específicos de semilla

Fuente del Gen: Patrón de expresión Referencia

genes específicos de semilla: semilla Simon, y col., Plant Mol. Biol. 5: 191, 1985; Scofield, y col., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987.; Baszczynski, y col., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990.

albúmina de Nuez del Brasil: semilla Pearson, y col., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992.

Legumina: semilla Ellis, y col., Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988.

Glutelina (arroz): semilla Takaiwa, y col., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, y col., FEBS Lett. 221: 43-47, 1987.

Zeína: semilla Matzke y col Plant Mol Biol, 14(3):323-32 (1990)

napA: semilla Stalberg, y col, Planta 199: 515-519, 1996.

Gluteína-1 de BPM y APM de trigo: endospermo Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2, 1989

SPA de trigo: semilla Albani y col, Plant Cell, 9: 171-184, 1997

α, β, γ gliadinas de trigo: endospermo EMBO 3:1409-15, 1984

Promotor Itr1 de cebada: endospermo

Hordeína B1, C, D de cebada: endospermo Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996

DOF de cebada: endospermo Mena y col, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998

(continuación)

Fuente del Gen: Patrón de expresión Referencia

promotor sintético: endospermo Vicente-Carbajosa y col., Plant J. 13: 629-640, 1998.

Prolamina NRP33 de arroz: endospermo Wu y col., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998

globulina Glb-1 de arroz: endospermo Wu y col., Plant Cell Physiology

39(8) 885-889, 1998

OSH1 de arroz: embrión Sato y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122, 1996

D globulina REB/OHP-1 de arroz: endospermo Nakase y col. Plant Mol. Biol. 33: 513-522, 1997

ADP-glucosa PP de arroz: endospermo Trans Res 6:157-68, 1997

familia del gen ESR de maíz: endospermo Plant J 12:235-46, 1997

-kafirina de sorgo: endospermo PMB 32:1029-35,1996

KNOX: embrión Postma-Haarsma y col, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999

Oleosina de arroz: embrión y aleurona Wu y col, J. Biochem, 123:386, 1998

Oleosina de girasol: semilla (embrión y semilla seca) Cummins, y col., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992

Supuesta proteína ribosomal 40S de arroz: débil en endospermo

alfa-globulina de arroz: fuerte en endospermo

alanina aminotransferasa de arroz: débil en endospermo

inhibidor de tripsina ITR1 (cebada): débil en endospermo

WSI18 de arroz: embrión + estrés

RAB21 de arroz: embrión + estrés

Oleosina de arroz de 18kd: aleurona + embrión

Para la identificación de promotores funcionalmente equivalentes, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato pueden analizarse, por ejemplo, uniendo operativamente el promotor a un gen indicador y evaluando el nivel de expresión y el patrón del gen indicador en diversos tejidos de la planta. Los genes indicadores 5 bien conocidos adecuados incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La actividad del promotor se evalúa midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden después compararse con la de un promotor de referencia (tal como el que se usa en los procedimientos de la presente invención). Como alternativa, la fuerza del promotor puede evaluarse cuantificando niveles de ARNm o comparando niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los procedimientos de la presente 10 invención, con niveles de ARNm de genes constitutivos tal como ARNr 18S, usando procedimientos bien conocidos

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mutagénico. Se describen procedimientos adecuados, por ejemplo, en los documentos US 5.565.350 o WO 00/15815.

Más específicamente, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la producción de plantas transgénicas que tienen características de crecimiento mejoradas (particularmente rendimiento aumentado) cuyo procedimiento comprende:

(i): introducir y expresar en una planta, en una parte de la planta o en una célula de planta, un ácido nucleico de hox5 de HDZip de clase I o una variante del mismo; y

(ii): cultivar la célula de planta en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.

El ácido nucleico puede introducirse directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de una planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente divulgación, el ácido nucleico se introduce preferentemente en una planta por transformación.

El término “transformación” como se denomina en el presente documento incluye la transferencia de un polinucleótido exógeno en un célula hospedadora, independientemente del procedimiento usado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal posterior, mediante organogénesis o embriogénesis, puede transformarse con una construcción genética y a partir de la misma regenerarse una planta completa. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonales disponibles para, y mejor adaptados a, la especie particular que se va a transformar. Las dianas tisulares ejemplares incluyen discos foliares, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledones, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristemo apical, brotes axilares, y meristemos radiculares), e inducen tejido meristemático (por ejemplo, meristemo de cotiledón y meristemo de hipocotiledón). El polinucleótido puede introducirse de manera estable o transitoria en una célula huésped y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Como alternativa, éste puede integrarse en el genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede después usarse para regenerar una planta transformada de una manera conocida por los expertos en la técnica.

La transformación de especies plantas es actualmente una técnica muy habitual. Ventajosamente, cualquiera de los diversos procedimientos de trasformación puede usarse para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos de transformación también incluyen el uso de liposomas, electroporación, productos químicos que aumentan la captación de ADN libre, inyección del ADN directamente en la planta, pistola de bombardeo de partículas, transformación usando virus o polen y microproyección. Pueden seleccionarse procedimientos entre el procedimiento de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. y col. (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I y col. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y col. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en el material de planta (Crossway A y col. (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas revestido con ADN o ARN (Klein TM y col., (1987) Nature 327: 70) infección con virus (no integrantes) y similares. Las plantas transgénicas de arroz, se producen preferentemente mediante transformación mediada por Agrobacterium usando cualquiera de los procedimientos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de las siguientes referencias: solicitud de patente europea publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei y col. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994. En el caso de la transformación del maíz, el procedimiento preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o en Frame y col. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002.

Generalmente, después de la transformación, las células o grupos de células de planta se seleccionan para detectar la presencia de uno o más marcadores que están codificados por genes que pueden expresarse en plantas co-transferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta completa.

Después de la transferencia y regeneración de ADN, las plantas supuestamente transformadas pueden evaluarse, usando, por ejemplo, análisis de Southern, para determinar la presencia del gen de interés, número de copias y/u organización genómica. Como alternativa o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido pueden supervisarse usando análisis de Northern y/o Western, o PCR cuantitativa; siendo todas estas técnicas bien conocidas por los expertos habituales en la materia.

Las plantas transformadas generadas pueden propagarse mediante diversos medios, tales como mediante técnicas clásicas de propagación clonal o de reproducción. Por ejemplo, una primera generación (o T1) de plantas transformadas puede reproducirse asexualmente para dar transformantes de segunda generación (o T2) homocigotos y después las plantas T2 pueden propagarse adicionalmente a través de técnicas de reproducción clásicas.

Los organismos transformados generados pueden adoptar diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no trasformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas que contengan el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, una planta madre transformada injertada a un vástago no transformado).

La presente divulgación se amplía claramente a cualquier célula de planta o planta producida mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, y a todas las partes de la planta y propágulos de la misma. La presente invención se amplía adicionalmente para incluir la progenie de una célula, tejido u órgano primario transformado o transfectado o la planta completa que se ha producido mediante cualquiera de los procedimientos

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procedimientos actuales del mapeo HISF favorecen el uso de clones grandes (de varios kb a varios cientos de kb; véase Laan y col. (1995) Genome Res. 5: 13-20), mejoras en sensibilidad pueden permitir la realización de mapeo HISF usando sondas más cortas.

Usando los ácidos nucleicos pueden realizarse diversos procedimientos basados en amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico. Como ejemplos se incluyen la amplificación específica de alelo (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11: 95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield y col. (1993) Genomics 16: 325-332), el ligamiento específico de alelo (Landegren y col. (1988) Science 241: 1077-1080), las reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), el Mapeo Híbrido por Radiación (Walter y col. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) y el Mapeo Happy (por las siglas en inglés mapping based on the analysis of approximately HAPloid DNA samples using the PolYmerase chain reaction) (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos procedimientos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para su uso en la reacción de amplificación o en reacciones de extensión con cebador. El diseño de dichos cebadores es muy conocido por los expertos en la técnica. En los procedimientos que emplean mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar diferencias de secuencias de ADN entre los padres del cruce del mapeo en la región correspondiente a la secuencia de ácido nucleico instantánea. Sin embargo, generalmente esto no es necesario para procedimientos de mapeo.

Los procedimientos de acuerdo con la presente invención dan como resultado plantas que tienen características de crecimiento mejoradas, como se expone en las reivindicaciones. Estas características de crecimiento mejoradas también pueden combinarse con otros rasgos ventajosos desde el punto de vista económico, tales como rasgos que potencian adicionalmente el rendimiento, la tolerancia a diversos estreses abióticos y bióticos, rasgos que modifican diversas características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras

La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras, en las que:

La Fig.1 muestra un alineamiento múltiple de homeodominios HDZip de clase I de diferentes fuentes de plantas, usando un programa de alineamiento múltiple VNTI AlignX, basado en un algoritmo ClustalW modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.infor-maxinc.com), con parámetros determinados de penalización por apertura de hueco de 10 y una extensión de hueco de 0,05. Los aminoácidos invariantes L16, W48, F49, N51 y R53, del homeodominio, se indican en un cuadro vertical. Los aminoácidos preferidos A46 y W56 de HDZip de Clase I también se indican en un cuadro vertical. Las tres hélices necesarias para la unión al ADN se marcan como cajas negras encima del alineamiento. Las seis héptadas se separan con una línea vertical. Las siete posiciones dentro de cada héptada se denominan a, b, c, d, e, f y g. La Leu ocupa la posición d dentro de cada héptada, y se indica en un cuadro vertical.

La Fig. 2 muestra un alineamiento múltiple de polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I de diversas plantas, usando un programa de alineamiento múltiple VNTI AlignX, basado en un algoritmo ClustalW modificado (InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con parámetros determinados de penalización por apertura de hueco de 10 y una extensión de hueco de 0,05). Los tres dominios principales caracterizados, desde el extremo N al extremo C, están fuertemente empaquetados y se identifican como la caja ácida, el homeodominio de clase I y la cremallera de leucina de seis héptadas. Además, la cola de Trp y el motivo de aminoácidos RPFF están ligeramente empaquetados.

La figura 3 muestra un vector binario para la expresión en Oryza sativa de un hox5 de HDZip de clase I de Oryza sativa bajo el control de un promotor de GOS2.

La figura 4 detalla ejemplos de secuencias de hox5 de cremallera de leucina de homeodominio de clase I (HDZip). Se obtienen como resultado varias secuencias a partir de ensamblajes EST públicos (véase la tabla A), con una menor calidad de secuenciación. Como consecuencia, pueden esperarse algunas sustituciones de ácidos nucleicos. Los codones de inicio (ATG) y de parada delimitan las secuencias de ácido nucleico.

Ejemplos

A menos que se afirme lo contrario, las técnicas de ADN recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos convencionales descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y procedimientos convencionales para el trabajo molecular con plantas se describen en Plan Molecular Biology Labfase (1993) por R.D.D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (R.U.) y Blackwell Scientific Publications (R.U.).

EJEMPLOS -Polipéptidos de hox5 de HDZip de clase I y secuencias codificantes

Ejemplo 1: Identificación de secuencias relacionadas con la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 2

Las secuencias (ADNc de longitud completa, EST o genómico) se identificaron de entre aquellas mantenidas en la base de datos Entrez Nucleotides en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la Basic Local Alignment Tool (BLAST) (Altschul y col., (1990)

J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usó para

5 encontrar regiones de similitud local entre secuencias comparando secuencias de ácido nucleico o polipeptídicas con bases de datos de secuencias y calculando la significación estadística de las coincidencias. Por ejemplo, el polipéptido codificado por el ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 se usó para el algoritmo TBLASTN, con configuraciones por defecto y el filtro para ignorar el conjunto de secuencias de baja complejidad. La salida del análisis se visualizó mediante comparación por pares, y se clasificó de acuerdo con la puntuación de probabilidad (valor de E), donde la puntuación

10 refleja la probabilidad de que suceda un alineamiento particular por casualidad (cuanto más bajo sea el valor de E, más significativa será la coincidencia). Además de los valores de E, las comparaciones también se puntuaron por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se refiere al número de nucleótidos idénticos (o de aminoácidos) entre las dos secuencias de ácido nucleico (o polipeptídicas) comparadas sobre una longitud concreta. En algunos casos, pueden ajustarse los parámetros por defecto para modificar la rigurosidad de la búsqueda. Por ejemplo, el valor

15 de E puede aumentarse para mostrar coincidencias menos rigurosas. De este modo, pueden identificarse coincidencias cortas prácticamente exactas.

A continuación, en la tabla A se proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº: 1.

Tabla A: Ejemplos de secuencias relacionadas con la secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID Nº: 1

Nombre: Número de referencia del NCBI del nucleótido SEC ID Nº del nucleótido SEC ID Nº del polipéptido traducido Fuente

Orysa_hox5: XM_482406 1 2 Oryza sativa

Orysa_hox16: XM_467603 3 4 Oryza sativa

Zeama_hox5*: CO458693 DV024016 5 6 Zea mays

Zeama_hox16: AY105265 7 8 Zea mays

Sacof_hox5*: CA088615 CA115362 CA142506 9 10 Saccharum officinarum

Sorbi_hox5*: BE363386 CD432381 11 12 Sorghum bicolor

Triae_hox16*: DR735359 DR741379 CD916488 13 14 Triticum aestivum

Arath_ATHB1: X58821 15 16 Arabidopsis thaliana

Dauca_CHB3**: D26575 17 18 Daucus carota

Glyma_HD157**: AF184278 19 20 Glycine max

CrapI_CPHB-5: AF443621 21 22 Craterostigma plantagineum

Goshi_hox5*: DT465649 CD486134 23 24 Gossypium hirsutum

Lyces_hox5: BT014213.1 25 26 Lycopersicon esculentum

Lyces_VaHOX1: X94947 27 28 Lycopersicon esculentum

Medsa_hox16*: CB892061 CA858059 29 30 Medicago sativa

Aqufo_hox5: DT758247 31 32 Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens

Poptr_hox16_1: scaff_XV.439 40 41 Populus tremuloides

Poptr_hox16_2: scaff_XII.649 42 43 Populus tremuloides

Poptr_hox16_3: lcl|scaff_VI II.1839 44 45 Populus tremuloides

Medtr_hox16_1: CR954197.2 46 47 Medicago truncatula

Phavu_hox16: AF402605 48 49 Phaseolus vulgaris

Lotco_hox16: AP006364 50 51 Lotus corniculatus

*Cóntigo compilado a partir de varias referencias de EST (se muestran las principales); Siendo la calidad de secuenciación EST normalmente menor, pueden esperarse algunas sustituciones de ácidos nucleicos. **Las secuencias de Daucus carota y de Glycine max se han corregido en comparación con su número de referencia.

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Ejemplo 2: Alineamiento de secuencias polipeptídicas de hox5 de HDZip de clase I

Se usó AlignX a partir del vector NTI (Invitrogen) basado en el popular algoritmo Clustal de alineamiento progresivo (Thompson y col. (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna y col. (2003). Nucleic Acids Res 31:3497-3500). Puede construirse un árbol filogenético usando un algoritmo de agrupamiento del vecino más próximo. Los valores por defecto son para la penalización por hueco abierto de 10, para la penalización por extensión de hueco de 0,1 y la matriz de ponderación seleccionada es Blosum 62 (en caso de alinear polipéptidos).

El resultado de los múltiples alineamientos de secuencia se muestra en la figura 2. Los tres dominios principales caracterizados, desde el extremo N al extremo C, están fuertemente empaquetados y se identifican como la caja ácida, el homeodominio de clase I y la cremallera de leucina de seis héptadas. El "dominio conservado" comprende estos tres dominios. Además, la cola de Trp y el motivo de aminoácidos RPFF están ligeramente empaquetados.

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre secuencias polipeptídicas de hox5 de HDZip de clase I

Los porcentajes de similitud e identidad globales entre las secuencias polipeptídicas de hox5 de HDZip de clase I se determinaron usando el programa informático Matrix Global Alignment Tool (MatGAT) (BMC Bioinformatics. 2003 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa alojado por Ledion Bitincka). El programa MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteína sin la necesidad del alineamiento previo de los datos. El programa efectúa una serie de alineamientos por parejas usando el algoritmo de alineamiento global de Myers y Miller (con una penalización por hueco abierto de 12, y una penalización por extensión de hueco de 2), calcula la similitud y la identidad usando, por ejemplo Blosum 62 (para polipéptidos), y después sitúa los resultados en una matriz de distancia. La similitud de secuencia se muestra en la mitad inferior de la línea divisoria y la identidad de secuencia se muestra en la mitad superior de la línea divisoria diagonal.

Los parámetros usados en la comparación fueron:

Matriz de puntuación: Blosum62

Primer hueco: 12 Hueco extendido: 2

Los resultados del análisis del programa informático se muestran en la tabla B 1 para la similitud e identidad global sobre la longitud completa de las secuencias polipeptídicas (excluyendo las secuencias de polipéptidos parciales). El porcentaje de identidad se proporciona sobre la diagonal y el porcentaje de similitud se proporciona por debajo de la diagonal.

El porcentaje de identidad entre las secuencias polipeptídicas mostradas puede ser tan bajo como el 29 % de identidad de aminoácidos en comparación con SEC ID Nº: 2.

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